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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
UNIDAD DE TITULACIÓN
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
RELACIÓN DEL PERFIL DE RIESGO CORONARIO Y LA
PRESENCIA DEL POLIMORFISMO RS9939609
(DEL GEN FATSO) EN MUESTRAS DE
MUJERES OBESAS (45 A 65 AÑOS)
DE LA CIUDAD DE
GUAYAQUIL,
2014
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN
DEL GRADO EN QUÍMICA Y FARMACIA
AUTOR: JASSON AMADEUS ESPINOZA CAICEDO
TUTOR ACADÉMICO: Q.F GINA JOHNSON M.Sc.
2015
GUAYAQUIL, MARZO
INDICE GENERAL pág.
Certificado del Tribunal i
Certificado del Tutor ii
Certificado Anti-Plagio iii
Carta de autoría iv
Dedicatoria v
Agradecimiento vi
RESUMEN vii
ABSTRAC viii
INTRODUCCIÓN 1
1.EL PROBLEMA 2
1.1. Planteamiento del problema 2
1.2. Formulación del problema 3
1.3. Objetivos 3
1.3.1. Objetivo General 3
1.3.2. Objetivos Específicos 4
1.4. Justificación e importancia 4
1.5. Variables 5
1.5.1.Variable Independiente 5
1.5.2. Variable Dependiente 5
2.MARCO TEÓRICO 6
2.1. Antecedentes 6
2.2. Fundamentación Teórica Cientifica 7
2.2.1. Perfil De Riesgo Coronario 7
2.2.1.1. Colesterol Total 7
2.2.1.2. Lipoproteinas HDL, LDL y VLDL 8
2.2.1.3. Colesterol de Alta Densidad HDL-c 8
2.2.1.4. Triglicéridos 8
2.2.1.5. Glucosa 9
2.2.2. Polimorfismos Genéticos 9
2.2.3. Tipos De Polimorfismos 10
2.2.3.1. Polimorfismos De Nucleótidos Sencillos 10
2.2.3.2. Polimorfismos De Secuencias Repetidas 10
2.2.4. Bases Moleculares Y Genética De La Obesidad 10
2.2.5. Generalidades del Gen FTO y el Polimorfismo rs9939609 11
3. METODOLOGÍA 12
3.1. Tipo De Investigación 12
3.2. Población Y Muestra 12
3.3. Criterios De Inclusión 12
3.4. Criterios De Exclusión 13
3.5. Materiales Y Equipos 13
3.5.1. Materiales 13
3.5.2. Reactivos 13
3.5.3. Equipos 14
3.6. Procedimiento 14
3.6.1. Amplificación Para Determinar El Polimorfismo Del Gen FTO 15
3.6.2. Determinación de Colesterol HDL-, Triglicéridos y Glucosa 16
3.7. Resultados (Tablas, Gráficos) 16
4. PROPUESTA 25
4.1. Análisis De Resultados 25
4.2. Conclusiones 26
5. BIBLIOGRAFÍA 28
6. ANEXOS 31
6.1. Anexo 1. Foto de Gel de Agarosa 31
6.2. Anexo 2. Protocolo de Extracción QIAGEN 32
6.3. Anexo 3. Base de Datos Relación del Polimorfismo
Del Gen FTO 33
INDICE DE TABLAS pág.
Tabla 1. Porcentaje de pacientes con sobrepeso y obesidad 16
Tabla 2. Comportamiento de los marcadores bioquímicos en la
población 17
Tabla.3. Comportamiento de los Marcadores Bioquímicos en la
población con sobrepeso y obesidad 18
Tabla 4. Comportamiento de los polimorfismos genéticos en la
población 19
Tabla 5. Presencia del polimorfismo del gen FTO en pacientes
con sobrepeso 20
Tabla 6. Presencia del polimorfismo FTO en pacientes con Obesidad 21
Tabla 7.Polimorfismo / sobrepeso y obesidad 22
Tabla 8.HDLc< 50 / Mutación del gen FTO 23
Tabla 9.Triglicéridos / Mutación del gen FTO 23
Tabla 10. Glucosa / Mutación del gen FTO 23
Tabla 11. Interpretación de IMC 24
Tabla 12. Master Mix de PCR 15
INDICE DE GRÁFICOS pág.
Gráfico 1. Porcentaje de pacientes con sobrepeso y obesidad 16
Gráfico 2. Comportamiento de marcadores bioquímicos en la población 17
Gráfico 3.Comportamiento de los Marcadores Bioquímicos en la
población con sobrepeso y obesidad 18
Gráfico 4. Comportamiento del polimorfismo genético rs9939609
del gen FTO en la población 19
Gráfico 5.Presencia de polimorfismo del gen FTO en pacientes
con sobrepeso 20
Gráfico 6.Presencia del polimorfismo FTO en pacientes con Obesidad 21
Gráfico 7.Polimorfismo sobrepeso y obesidad 22
i
CERTIFICADO DEL TRIBUNAL
Acta de registro de la Sustentación Final
El tribunal de sustentación del trabajo de titulación del SR. JASSON AMADEUS
ESPINOZA CAICEDO, después de ser examinado en su presentación, memoria
científica, defensa oral, da por aprobado el trabajo de titulación
________________________
Q.F Héctor Nuñez A. M.Sc.
Decano Presidente
Blgo. Saúl Escobar V. M.Sc.
Docente Miembro del Tribunal
__________________________
Q.F Jeanine Naranjo M.Sc.
Docente Miembro del Tribunal
_________________________
Ing. Nancy Vivar C.
Secretaria
ii
CERTIFICADO DEL TUTOR
En calidad de tutora del trabajo de titulación, Certifico: que he asesorado, guiado
y revisado el trabajo de titulación en la modalidad de PROYECTO DE
INVESTIGACIÓN cuyo título es “RELACIÓN DEL PERFIL DE RIESGO
CORONARIO Y LA PRESENCIA DELPOLIMORFISMO RS9939609 (DEL GEN
FTO) EN MUESTRAS DE MUJERES OBESAS (45 A 65 AÑOS) DE LA CIUDAD DE
GUAYAQUIL, 2014” presentado por el Sr. JASSON AMADEUS ESPINOZA
CAICEDO con cédula de ciudadanía #0928100379, previo a la obtención del título de
Químico y Farmacéutico.
Este trabajo ha sido aprobado en su totalidad y se adjunta el informe de Anti-plagio
del programa URKUND. Lo certifico.
____________________
Q.F. GINA JOHNSON M.Sc.
TUTOR DE TESIS
Guayaquil, miércoles 30 de marzo del 2015
iii
CERTIFICADO DEL TUTOR
INFORME DE ANTI-PLAGIO DEL PROGRAMA URKUND.
Por la presente certifico que el Proyecto de Investigación cuyo tema es“RELACIÓN
DEL PERFIL DE RIESGO CORONARIO Y LA PRESENCIA DEL POLIMORFISMO
RS9939609 (DEL GEN FTO) EN MUESTRAS DE MUJERES OBESAS (45 A 65
AÑOS) DE LA CIUDAD DE GUAYAQUIL, 2014”, correspondiente al Sr. JASSON
AMADEUS ESPINOZA CAICEDO, con C.I.: 0928100379, ha sido subido al
programa URKUND y revisado, arrojando un porcentaje de similitud del 3% el cual
se encuentra dentro de los límites aceptables.
____________________
Q.F. GINA JOHNSON M.Sc
TUTOR DE TESIS
Guayaquil, miércoles 30 de marzo del 2015
iv
CARTA DE AUTORÍA DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
Yo, JASSON AMADEUS ESPINOZA CAICEDO autor de este trabajo declaro ante
las autoridades de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil,
que la responsabilidad del contenido de este TRABAJO DE TITULACIÓN, me
corresponde exclusivamente; y el patrimonio intelectual de la misma a la Facultad de
Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil.
Declaro también que todo el material escrito me pertenece, salvo el que está
debidamente referenciado en el texto. Además ratifico que este trabajo no ha sido
parcial ni totalmente presentado para la obtención de un título, ni en la universidad
nacional, ni en una extranjera.
Guayaquil, miércoles 30 de marzo del 2015
_________________________________
JASSON AMADEUS ESPINOZA CAICEDO
CI: 0928100379
v
DEDICATORIA
Dedico este Trabajo al ser que me brinda la motivación necesaria para poder triunfar
día a día, mi hijo Matías Sebastián Espinoza Veliz, a mis padres que con su
esfuerzo, consejos y sacrificios lograron formar la persona que soy en la actualidad y
a mis hermanos que con sus cualidades y virtudes me han enseñado que nunca hay
que rendirse en la vida.
“Siempre se Agradecido con las personas que un día te ayudaron a crecer”
vi
AGRADECIMIENTO
Agradezco a mi Tutora la M.Sc. Gina Johnson por haberme guiado a lo largo de
este proceso de titulación, a los miembros del Instituto de Biomedicina de la
Universidad Católica de Santiago de Guayaquil por brindarme su apoyo para realizar
los análisis y la tabulación de datos del presente trabajo.
Ph.D. Peter Chedraui Álvarez, Director del Instituto de Biomedicina de la
Universidad Católica de Santiago de Guayaquil.
M.Sc. Gustavo Escobar Valdivieso, Coordinador Administrativo/Jefe De
Laboratorio del Instituto de Biomedicina de la Universidad Católica Santiago de
Guayaquil.
“No Hay Triunfo Sin Sacrificio”
“Nuestra Existencia se Basa en Evidenciar Nuestro Trabajo” P. Chedraui.
vii
RESUMEN
INTRODUCCIÓN: la obesidad se ha descrito como un problema de salud pública que
se ha incrementado vertiginosamente, esta enfermedad esta modulada por diversos
factores, entre los más importantes tenemos los genéticos y medioambientales que
inducen muchas veces a desencadenar varias patologías de mayor cuidado. Entre
los indicadores que ayudan al diagnóstico de la obesidad tenemos el índice de masa
corporal, marcadores bioquímicos que nos permiten diagnosticar la obesidad
mórbida y actualmente la determinación de polimorfismos genéticos pueden ayudar a
dilucidar diversos aspectos sobre esta enfermedad. OBJETIVOS:el objetivo de este
trabajo fue determinar qué relación existe entre Colesterol HDL, Triglicéridos,
Glucosa y la presencia del polimorfismo rs9939609 del gen FTO en muestras de
mujeres obesas de edad entre 45 a 65 años. METODOLOGÍA: se realizó un estudio
correlacional, descriptivo y de cohorte transversal, la determinación de los
marcadores bioquímicos se la realizó mediante reacción colorimétrica, la
determinación del polimorfismo fue mediante PCR en el Instituto de Biomedicina de
la Universidad Católica de Santiago de Guayaquil. RESULTADOS Y
CONCLUSIONES:se evidencio mediante prueba estadística una correlación
significativa entre la presencia de la mutación rs9939609 del gen FTO y la baja
concentración de colesterol HDL en pacientes que padecen de Obesidad 65.8%
(48).Por otro lado los triglicéridos elevados se encontraron en mayor porcentaje en la
población con sobrepeso representando un 54.9% (39), Mientras que en pacientes
con obesidad se evidencio un mayor porcentaje de glucosa elevada 27.4% (20).
Palabras Clave: Obesidad, Polimorfismos, Marcadores Bioquímicos.
viii
ABSTRAC
INTRODUCTION: obesity has become a public health problem that has increased
dramatically; this disease is modulated by genetic and environmental factors that
induce trigger various pathologies for this reason have to be more careful.Between
indicators that help in the diagnosis of obesity have BMI, but it is also known that
there are biochemical markers for the diagnosis of this disease, Currently
Determining genetic polymorphisms May help elucidate on obesity. OBJECTIVE:the
objective of this work was to determine the relationship between HDL cholesterol,
triglycerides, glucose and the presence of polymorphism rs9939609 FTO gene in
samples of obese women aged 45-65 years.METHODS: a correlational, descriptive,
cross-sectional cohort study was conducted, biochemical markers were determined
by colorimetric reaction, to determine the polymorphism was performed a PCR at the
Institute of Biomedicine of theCatholic University of Santiago of Guayaquil. RESULTS
AND CONCLUSIONS:the Statistical test demonstrated a significant correlation
between the presence of the rs9939609 gene mutation FTO and low concentration of
HDL cholesterol in patients suffering from obesity 65.8% (48 patients). On the other
hand elevated triglycerides were found in highest percentage in the overweight
population representing 54.9% (39 patients), whereas in patients with obesity a higher
percentage of high glucose 27.4% (20 patients) was evidenced.
Keywords: Obesity, Polymorphisms, Biochemical Markers.
1
INTRODUCCIÓN
La Obesidad es un estado de exceso de masa de tejido adiposo esto
ocurre debido a varios factores que intervienen para que la energía en exceso se
deposite en nuestro cuerpo en forma de masa grasa, más aun cuando los
nutrientes en la dieta diaria son abundantes y la forma de vida es sedentaria (Flier
et. al, 2012).
El método más utilizado para determinar la obesidad es el índice de masa
corporal (IMC), aunque no es una medida directa de adiposidad puede dar una
primera impresión diagnóstica del paciente, también se utiliza la antropometría,
densitometría, la resonancia magnética y la impedancia eléctrica (Flier et. al,
2012).
Un incremento vertiginoso de la obesidad a más de verse influenciado por
aspectos genéticos y medioambientales obedece a factores subyacentes entre los
que citamos: cambios relevantes en los patrones alimentarios; reducción en la
actividad física y aspectos socioculturales. Las enfermedades crónicas no
transmisibles (ECNT) actualmente son las responsables de una gran cantidad de
muertes alrededor del mundo, por esta razón la prevención de la obesidad como
desencadenante de este tipo de patologías sería de gran importancia para
controlar esta epidemia (Peña & Bacallao, 2001).
Canizales-Quinteros, (2008) expresa que aspectos genéticos se relacionan
con obesidad mórbida e índice de masa corporal. Pero muy pocos asocian estas
variantes con la concentración de parámetros bioquímicos como colesterol total,
HDLc, LDLc, triglicéridos y glucosa que pueden considerarse como factores de
riesgo para ECNT (Muñoz et at, 2013).
2
CAPÍTULO I
1. EL PROBLEMA
1.1. Planteamiento del Problema
La obesidad es una enfermedad multifactorial crónica y de gran
trascendencia a nivel mundial, considerada como un problema de salud pública
asociada con problemas cardiovasculares, cerebrovasculares, diabetes tipo 2,
síndrome metabólico entre otros. En la actualidad estas enfermedades
pertenecen a las principales causas de muerte en el mundo.
Es de conocimiento público que la obesidad se ha incrementado en los
últimos 40-50 años, este crecimiento dio lugar para que en 1997 se considere
como problema de salud pública. Desde entonces se ha concluido mediante
diversos estudios que los factores genéticos y medioambientales cumplen un
papel causal asociado al aumento de la obesidad (Yepez et al, 2008).
Un indicador aceptado para determinar la obesidad es el índice de masa
corporal (IMC) y marcadores bioquímicos como colesterol total, colesterol de alta
densidad (HDL), colesterol de baja densidad (LDL), triglicéridos que ayudan en el
diagnóstico de esta enfermedad. Y en los últimos años se ha informado que la
diabetes tipo 2 se asocia con la prevalencia de obesidad y síndrome metabólico.
Actualmente mediante análisis genético se puede demostrar una
predisposición del paciente a padecer una obesidad mórbida, por esta razón
varios estudios han reportado que la presencia de variantes génicas entre ellos
del gen FATSO guarda relación con la obesidad y se han asociado con pruebas
bioquímicas. El polimorfismo rs9939609 del gen FTO ha sido asociado con un
mayor riesgo de padecer obesidad y diabetes tipo 2 (De Luis et al 2012).
3
Debido a que en nuestro país los estudios sobre estos temas son escasos
se quiere responder a la interrogante de como los factores genéticos entre ellos el
polimorfismo rs9939609 se asocia con la obesidad en mujeres de edad entre 45 y
50 años.
Demostrar una relación directa o indirecta entre el polimorfismo rs9939609
del gen FTO y niveles bioquímicos elevados daría una idea más concreta de la
utilidad de marcadores genéticos en el diagnóstico de enfermedades, de este
modo la determinación de mutaciones génicas en edad temprana podría dar al
paciente una predisposición de padecer enfermedades en un futuro.
1.2. Formulación del Problema
¿Qué relación existe entre los marcadores bioquímicos colesterol HDL,
Triglicéridos, Glucosa y la presencia del polimorfismo rs9939609 (del gen FTO) en
muestras de mujeres obesas (45 a 65 años) de la Ciudad de Guayaquil?
1.3. Objetivos
1.3.1. Objetivos General
Establecer la relación entre los marcadores bioquímicos colesterol HDlc,
Triglicéridos, Glucosa y la presencia del polimorfismo rs9939609 (del gen FTO) en
muestras crio-conservadas de mujeres obesas (45 a 65 años) de la ciudad de
Guayaquil.
4
1.3.2. Objetivos Específicos
1. Analizar la asociación de los niveles del perfil de riesgo coronario y el
índice de masa corporal de las mujeres obesas.
2. Determinar la presencia del polimorfismo rs9939609 (del GEN FTO) en las
muestras crio-conservadas de mujeres obesa.
3. Relacionar los niveles de Colesterol HDL, Triglicéridos y Glucosa con la
presencia del polimorfismo rs9939609 (del GEN FTO) en las muestras crio-
conservadas de mujeres obesa.
1.4. Justificación E Importancia
La obesidad es considerada una epidemia mundial, la Organización
Mundial de la Salud (OMS) estima que 25 millones de personas en el mundo
mueren anualmente debido a problemas de obesidad y sobrepeso, en EEUU se
reportan 300.000 muertes y en Europa 220.000 (González-Carpio, 2013). En
Latinoamérica estudios reportan una prevalencia de la obesidad infantojuvenil de
2.1% en Nicaragua y 10.3% en Chile (Castro Burbano et al, 2003).
La preocupación aumenta ya que cada vez son más numerosos los niños,
adolescentes y jóvenes que padecen de sobrepeso y obesidad
independientemente de su condición social (Yepez et al, 2008). un estudio
realizado en Ecuador en 1997 denominado Mejoramiento de las Prácticas
Alimentarias y Nutricionales de Adolescentes Ecuatorianos (MEPRADE), reportó
que el sobrepeso basado en índice de masa corporal se encontraba el 12 y 15%
en las mujeres y entre 8 y 10% en los varones de zonas urbanas, mientras tanto
que en el área rural el porcentaje era del 2% en ambos sexos (Castro Burbano et
al, 2003).
5
Los niveles de marcadores bioquímicos juegan un papel primordial en el
diagnóstico de este tipo de enfermedades, gracias a nuevas tecnologías se ha
podido describir diversos polimorfismos que intervienen en el desarrollo de las
enfermedades asociadas con la obesidad (Gil, 2002). En 1962 el científico Neel
expuso su hipótesis del “genotipo ahorrador” que expresa que en la actualidad los
genes que están asociados a la obesidad pudieron haber tenido una ventaja en
grupos de poblaciones que sufrían de hambre (Canizales-Quinteros, 2008).
La determinación temprana de estos defectos genéticos que influyen en la
masa grasa y sobrepeso podrían ayudar en un diagnóstico de predisposición de
enfermedades asociadas al sobrepeso, para tomar medidas de cuidado como una
dieta nutricional estricta en bajas calorías y/o ejercicio frecuente con el objetivo de
disminuir el índice de masa corporal para el desarrollo de futuras enfermedades
como: hipertensión arterial, diabetes tipo 2, riesgo coronario, problemas
cerebrovasculares (Canizales-Quinteros, 2008).
1.5. Variables
1.5.1. Variable Independiente
Colesterol de Alta Densidad, Triglicéridos, Glucosa y polimorfismo
rs9939609 (del gen FTO)
1.5.2. Variable Dependiente
Mujeres obesas
6
CAPITULO II
2. MARCO TEÓRICO
2.1. Antecedentes
Se ha descrito a la obesidad como un problema de salud pública en países
industrializados, actualmente se ha demostrado que la obesidad en la infancia y la
adolescencia pronostica una obesidad en el adulto, el índice de masa corporal es
vital para diagnosticar la enfermedad que puede darse en tres periodos: el
prenatal, de los 5 a 7 años que es cuando se produce el “rebote adiposo” o
incremento marcado del tejido adiposo y el de la adolescencia (Castro Burbano,
2003).
Mediante estudios se ha indicado que el sobrepeso predomina en mayor
porcentaje en familias de nivel socioeconomico alto, pero tambien se manifiesta
en poblaciones de bajos recursos economicos especialmente en las mujeres por
este motivo se ha concluido que la obesidad guarda un relación inversa con el
estrato social (Castro Burbano, 2003).
La obesidad se encuentra intimamente asociada a enfermedades como
hipertension arterial, diabetes tipo 2, problemas cardiovasculares, Síndrome
metabólico debido a que comparten algunos factores causales y subyacentes
comunes, como alimentacion inapropiada y el sedentarismo, en ese caso al
identificar sujetos con obesidad mórbida se esta tomando en consideración
personas que tienen un riesgo alto de padecer enfermedades crónicas no
transmisibles (ECNT) (Peña & Bacallao, 2001).
7
Prevenir la obesidad promoviendo estilos de vida saludables resultaria de
vital importancia ya que de esta manera disminuiria el riesgo de sufrir
complicaciones y reduciria el efecto mediador que tiene la obesidad en relacion
con otros factores de riesgo (Peña & Bacallao, 2001).
Hernández & Ruiz, (2007) expresan que existe un predisposición genética
al desarrollo de la obesidad, la cual se incluye dentro del campo de la
nutrigenetica y nutrigenomica temas de gran importancia para el desarrollo de
esta enfermedad.
2.2. Fundamentación Teórica Científica
2.2.1. Perfil De Riesgo Coronario
El perfil de riesgo coronario constituye un grupo de examenes de
laboratorio que ayudan en el diagnóstico de cardiopatías, consiste en medir la
concentración de Colesterol, Colesterol de alta densidad, colesterol de baja
densidad y triglicéridos que se encuentran en la sangre.
2.2.1.1. Colesterol Total
El colesterol cumple un papel importante como productor de esteroides, la
síntesis de hormonas femeninas, también forma parte de la bilis, interviene en la
producción de andrógenos y forma parte de las membranas celulares (Ángel,
2005).
La dosificación de colesterol es un relevante valor diagnostico para poder
pronosticar infarto agudo de miocardio, su valor puede depender de la edad del
paciente. Esta constituida por tres lípoproteinas denominadas según su densidad;
8
VLDL Very Low Density Lipoprotein, LDL Low Density Lipoprotein y HDL High
Density Lipoprotein (Ángel, 2005).
2.2.1.2. Lipoproteinas HDL, LDL y VLDL
Son fraciones lipoideas que se unen a proteínas que les sirve como
vehículo para poder cumplir sus funciones, el conjunto de las Lipoproteinas VLDL
(Very Low Density Lipoprotein) estan contituidas por quilomicrones son las más
grandes y menos densas, esta formada por un 81.2% de triglicéridos exógenosy
forman parte de la materia prima para forma las Low Density Lipoprotein (LDL) y
las High Density Lipoprotein son liberadas por el hígado. (Ángel, 2009)
Estas lipoproteinas integran la molécula de colesterol en la siguiente
proporción VLDL: 13%, LDL: 70%, HDL 17%. El estudio de estas lipoproteinas
son primordiales en la valoración y el diagnóstico de la Obesidad y por ende del
riesgo cardiovascular. (Ángel, 2005).
2.2.1.3. Colesterol de alta densidad HDL-c
El colesterol de Alta densidad HDL-c es una lipoproteina que juega un
papel importante ya que guarda un a relacion inversa con la incidencia de
enfermedades cardiovasculares, es decir que mientras el HDL-c se encuentre
entre los valores de referencia o levemente aumentado sera menor el riesgo de
sufrir enfermedades cardiovasculares (Terrés-Speaziale, 2000).
2.2.1.4. Triglicéridos
Forman parte de las lipoproteinas y se dividen en endógenos y exógenos,
son materia prima para producir por hidrólisis la LDL, los triglicéridos son nocivos
9
para la capa íntima arterial ya que estrecha la luz de las arterias y puede producir
infartos, su exceso se manifiesta por depositarse en la región abdominal del
hombre y glútea.pectoral en la mujer, los triglicéridos se los deben mantener
siempre entre los límites normales ya que su exceso puede resultar fatal (Ángel,
2005.
2.2.1.5. Glucosa
La concentracion de glucosa en la sangre regularmente es un factor
constante con pequeños cambios en aumento y disminucion, de acuerdo a la
ingesta de los alimentos consumidos, regularmente el organismo luego de ingerir
alimentos libera una carga de insulina que se encarga de normalizar los niveles
de glicemia basal, sus cifras de normalidad se encuentran entre 70 a 110 mg/dL,
2.2.2. Polimorfismos Genéticos
Se conoce que el 99.9% de la secuencia del acido desoxirribonucleico
(ADN) de dos personas diferentes es la misma, las variaciones génicas,
diferencias fenotípicas y/o suceptibilidades a ciertas patologías pertenecen al
0.1% restante, esto es lo que se conoce como polimorfismo genético (Checa,
2007).
En palabras mas simples un polimorfismo genético se refiere a cambios
que ocurren en la secuencia del ADN, en diversos estudios estos polimorfismos
sirven como indicadores epidemiológicos y en otros casos cumplen un papel
importante en mecanismos fisiopatológicos de algunas enfermedades (Gómez et
al, 2011).
10
2.2.3. Tipos de polimorfismos
Existen diversos tipos de polimorfismos entre los cuales resaltan los
polimorfismos de nucleotidos sencillo del ingles Single NucleotidePolymorphism
(SNP),y los polimorfismos de secuencias repetidas del ingles Variable Number
Tandem Repetition (VNTR) (Herráez, 2012).
2.2.3.1. Polimorfismos de Nucleotidos Sencillos
Resulta cuando se presenta en forma de nucleótidos alternativos dando
como resultado que un individuo pueda tener uno de tres genotipos Homocigoto
para el alelo mas frecuente, Heterocigoto, y Homocigoto para el alelo menos
frecuente (Herráez, 2012).
2.2.3.2. Polimorfismos de secuencias repetidas
Tienen una gran aplicabilidad en el diagnóstico genético tambien conocidos
como VNTR (variable number of tándem repeats) Minisatelites y STRs (short
tándemrepeat) microsatelites en estos casos presentan un número variable de
repeticiones en tandem polimorfismos genéticos importancia y aplicaciones.
2.2.4. Bases Moleculares y Genética de la Obesidad
Un aumento de la masa adiposa se debe a un incremento de adipocitos,
los adipocitos son celulas endocrinas que liberan múltiples moléculas de forma
regular entre ellas la leptina que cumple la función de regular el balance de
energía, las citocinas como el factor de necrosis tumoral (TNF) e interleucina 6, la
adiponectina y la proteina de unión retiniana (Flier & Maratos 2012).
11
El organismo cumple funciones fisiológicas que estan dictadas
estrictamente por la información genética contenida en el acido
desoxirribonucleico, el ADN esta constituido por millones de genes que en
constitución forman el genoma y establecen el fenotipo y genotipo de un individuo
(Oltehua, 2012).
En la actualidad se han identificado genes que guardan relación con la obesidad,
mutaciones relacionadas con alteraciones de peso y polimorfismos que
intervienen en la regulación fisiopatológica del organismo, estos cambios a nivel
genético pudieron haber tenido su origen debido a una evolución progresiva
inducida por el medio ambiente (Oltehua, 2012).
2.2.5. Generalidades del gen FTO y El polimorfismo rs9939609
Inicialmente el gen FTO (Fatso) fue estudiado en ratones y se identifico por
medio de procesos de clonación posicional, el nombre se debe a su relación con
la masa grasa demostrada en varias publicacionesy que han sido el inicio de una
extensa investigación para determinar de que manera este gen influye en el
fenotipo de las personas que sufren de obesidad mórbida (Lima, 2009).
Este gen se encuentra en la región genómica del brazo largo del
cromosoma 16 especificamente 16q12.2, posee 9 exones y 8 intrones, el
polimorfismo rs9939609 se encuentra en el intrón 1 y esta constituido por dos
alelos el A y el T. el alelo A esta directamente relacionado con la acumulación de
masa grasa. La mutación es evidente cuando existe un cambio de una timina por
una adenina en el primer intrón de este gen y en palabras concretas
principalmente cuando se presenta en forma de homocigoto AA (Lima, 2009).
12
CAPITULO III
3. METODOLOGÍA
3.1. Tipo de Investigación
La presente investigación fue de tipo, correlacional debido a que se mostró
una relación entre resultado de variables, en este caso se quiso demostrar una
correlación entre el perfil de riesgo coronario y la presencia del polimorfismo del
gen FTO, descriptiva porque se describió los pasos a seguir para llevar a cabo
cada uno de nuestros objetivos específicos y de cohorte transversal ya que se
tomaron datos de los pacientes con obesidad solamente en una única
oportunidad.
3.2. Población y muestra
La población que se consideró en el presente estudio fue de 205 muestras
de sangre periférica de mujeres con obesidad mórbida crio-conservadas en el
Instituto de Biomedicina de la Universidad Católica Santiago de Guayaquil. De las
cuales solo 144 cumplieron con los criterios de inclusión y formaron parte del
estudio
3.3. Criterios de inclusión
1. Muestras de sangre periférica crio-conservadas en el Instituto de
Biomedicina.
2. Muestras en buen estado.
3. Muestras de pacientes que cumplan con los siguientes criterios:
Mujeres de entre 45 a 65 años de edad
IMC ≥ 25.00Kg/𝐦𝟐
13
Muestras de AND con una Concentración mayor a 20 ng/uL
3.4. Criterios de Exclusión
1. Muestras de sangre periférica no crio-conservadas en el Instituto de
Biomedicina
2. Muestras en mal estado
3. Muestras de mujeres que cumplan los siguientes criterios:
Mujeres que no tengan una edad entre 45 a 65 años
IMC ≤ 25.00
Muestras de AND con una Concentración menor a 20 ng/uL
3.5. Materiales y Equipos
3.5.1. Materiales
Tubos Eppendor de 1.5 y 0.6 mL
Puntas de plástico para pipetas automáticas de 0.1-2.0, 2-20 y de 100-
1000 uL
Kit para extracción de ADN Genómico de la Casa Comercial Qiagen
Matraces de 50 ml
3.5.2. Reactivos
Agarosa Ultra Pura
Buffer TAE (Tris Ácido Acético) 1 X
GoTaqMix de PCR
Saber Safe
Blue Juice 4 X
Etanol 100%
14
3.5.3. Equipos
Termociclador LABNET
Cabina de Flujo Laminar
Pipetas automáticas de 10 uL, 200 uL y 1000 uL
Cámara de Electroforesis LABNET
Fotodocumentador BIORAD
Microcentrifuga
Vortex
Nanodrop 2000
3.6. Procedimiento
Se trabajó con 144 muestras crio-conservadas en el instituto de
Biomedicina de la Universidad Católica de Santiago de Guayaquil.
La extracción del material genético se realizó con el Kit de extracción
QIAGEN luego se realizó la amplificación mediante reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) con los cebadores específicos para determinar la presencia del
polimorfismo rs9939609 del gen FTO.
SM 5´ TTGCGACTGCTGTGAATTTA 3´
SS 5´ TTGCGACTGCTGTGAATTTT 3´
AS 5´ ATGGCTTCAGGGTACCAG 3´
15
3.6.1. Amplificación por PCR para determinar el polimorfismo del gen
FTO
Una vez obtenido el material genético la caracterización se llevó a cabo por
medio de PCR utilizando pares de oligonucleótidos “forward” y “reverse”
específicos para el alelo silvestre o mutado, donde se obtuvo un producto único
del ADN, estos fragmento serán separados mediante la técnica de electroforesis
en un gel de agarosa al 2%, luego fue visualizado en un fotodocumentor para su
respectivo análisis.
Las amplificaciones del DNA in vitro por medio de PCR se realizó
utilizando reactivos de PCR GoTaq Master Mix de PROMEGA, la mix de reacción
para amplificar los fragmentos del gen FTO se preparó mezclando los reactivos
en un volumen final de 20 uL según se muestra en la tabla 12.
Tabla 12. Master Mix GoTaq Master Mix.
Cálculos GoTaq SS (silvestre) y SM (mutado)
GoTaq 10.0 uL
Pss/Psm 1.0 uL
H2O 6.0 uL
ADN 3.0 uL
16
3.6.3. Determinación de Colesterol de alta densidad HDL-c, triglicéridos y
Glucosa
La determinación de la concentración de Colesterol de alta densidad HDL,
triglicéridos y Glucosa mediante reacción colorimétrica en equipo VITROS 4600.
3.7. Resultados (Tablas, gráficos)
Tabla 1. Porcentaje de pacientes con sobrepeso y obesidad
Gráfico 1. Porcentaje de pacientes con sobrepeso y obesidad
49,31%
50,69%
48.5
49.0
49.5
50.0
50.5
51.0
1 2
Sobrepeso y Obesidad/ N
porcentaje sobrepeso % obesos %
pacientes n:144 49,3 50,7
17
Tabla 2. Comportamiento de los marcadores bioquímicos en la población
Gráfico 2. Comportamiento de marcadores bioquímicos en la población
63.9
49.3
24.3
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
HDLc < 50 trigliceridos > 150 glucosa > 110
Marcadores Bioquimico/N
Series1
Población %
N: 144 100
Marcadores Bioq
HDLc< 50 92 63,9%
Trigliceridos> 150 71 49,3%
Glucosa > 110 35 24,3%
18
Tabla.3. Comportamiento de los Marcadores Bioquímicos en la población con sobrepeso y obesidad
Marcadores Bioquímicos
Porcentaje sobrepeso % n:71
obesidad % n: 73
p (value)*
HDLc< 50 44 (62,0%) 48 (65,8%) 0,63
triglicéridos> 150 39 (54,9%) 32 (43,8%) 0,18
Glucosa > 110 15 (21,1%) 20 (27,4%) 0,38
*Valor de p calculado con Chi-Cuadrado Gráfico 3. Comportamiento de los Marcadores Bioquímicos en la población
con sobrepeso y obesidad
62.0
54.9
21.1
65.8
43.8
27.4
HDLc < 50 trigliceridos > 150 glucosa > 110
MARCADORES BIOQUIMICOS/SOBREPESO Y OBESIDAD
sobrepeso % obesidad %
19
Tabla4. Comportamiento del polimorfismo genético rs9939609 del gen FTO
en la población
Polimorfismos/N
N %
144 100
Polimorfismo FTO
rs9939609AA 107 74,3%
rs9939609AT 29 20,1%
rs9939609TT 8 5,6%
Gráfico 4. Comportamiento del polimorfismo genético rs9939609 del gen FTO en la población
74.3
20.1
5.6
rs9939609AA rs9939609AT rs9939609TT
Polimorfismo del Gen FTO/N
20
Tabla 5. Presencia del polimorfismo rs9939609 del gen FTO en pacientes con sobrepeso
Polimorfismo/N sobrepeso
N %
71 100
Polimorfismo FTO
rs9939609AA 50 70,4%
rs9939609AT 17 23,9%
rs9939609TT 4 5,6%
Gráfico 5. Presencia de polimorfismo rs9939609 del gen FTO en pacientes
con sobrepeso
70%
24%
6%
Polimorfismo Gen FTO/ Pacientes Sobrepeso
rs9939609AA rs9939609AT rs9939609TT
21
Tabla 6. Presencia del polimorfismo rs9939609 FTO en pacientes con Obesidad
Polimorfismo/N Obesas
N %
73 100
Polimorfismo FTO
rs9939609AA 57 78,1
rs9939609AT 12 16,4
rs9939609TT 4 5,5
Gráfico 6.Presencia del polimorfismo rs9939609 FTO en pacientes con Obesidad
78%
16%
6%
Polimorfismo Gen FTO/Pacientes Obesidad
rs9939609AA rs9939609AT rs9939609TT
22
Tabla 7. Polimorfismo / sobrepeso y obesidad
Gráfico 7.Polimorfismo sobrepeso y obesidad
Polimorfismo Gen FTO
porcentaje sobrepeso % n: 71 obesidad % n: 73 p (value)
rs9939609AA 50 (70,4) 57 (78,1) 0,29
rs9939609AT 17 (23,9) 12 (16,4) 0,26
rs9939609TT 4 (5,6) 4 (5,5) 0,74
70.4
23.9
5.6
78.1
16.4
5.5
rs9939609AA rs9939609AT rs9939609TT
Polimorfismo Gen FTO/ Sobrepeso y obesidad
23
Tabla 8. HDLc< 50 / Mutación del gen FTO
Tabla 9. Triglicéridos / Mutación del gen FTO
*Prueba exacta de Fisher
Tabla 10. Glucosa / Mutación del gen FTO
N=144
Glucosa> 110
FTO Normal (AA), Homocigoto
FTO Permutado (AT), Heterocigoto
FTO Mutado (TT), Homocigoto
Sobrepeso (≥25.00
kg/m2) n=15 10(14.08%) 3(4.22%) 1(1.40%)
Obesas (≥30.00 kg/m2) n= 20 12(16.43%) 6(8.21%) 2(2.73%)
p (value) 0,72 0,79 *0.61 *Prueba exacta de Fisher
N= 144
HDL < 50
FTO Normal (AA),
Homocigoto
FTO Permutado (AT), Heterocigoto
FTO Mutado (TT), Homocigoto
Sobrepeso + HDLc< 50 n=44 30(68,2%) 9(20,4%) 11(25%)
Obesas + HDLc< 50 n= 73 36(75%) 10(20,8%) 2(4,2%)
p (value) 0,46 0,96 0,004
N= 144
Triglicéridos> 150 FTO Normal
(AA), Homocigoto
FTO Permutado (AT), Heterocigoto
FTO Mutado (TT), Homocigoto
Sobrepeso + TG > 150 n=39 28(71,8%) 9(23%) 2(5,1%)
Obesas + TG > 150 n=32 23(71,9%) 9(28,1%) 0(0%)
p (value) 0,99 0,62 *0,49
24
Tabla 11. Interpretación de IMC
25
CAPITULO IV
4. PROPUESTA
4.1. Análisis de Resultados
En la tabla 1. Demostramos que de los144 pacientes que cumplieron con
los criterios de inclusión el 49.31 % (71 mujeres) padecen de sobrepeso mientras
que el 50.69 % (73 mujeres) tienen obesidad.
En la tabla 2. Se pretende indicar el comportamiento de los marcadores
bioquímicos en los pacientes, y tenemos que en la muestra total el Colesterol HDL
se encuentra elevado en 63.89% de los pacientes, los triglicéridos en 49.31% y la
glucosa 24.31%.
En la tabla 3. Se explica el comportamiento de los marcadores bioquímicos
tanto en pacientes con sobrepeso como las que padecen obesidad y se logra
demostrar que de los 71 pacientes con sobrepeso el 61.97% tienen el HDL
elevado, el 54.93 poseen los triglicéridos elevados y el 21.13% la glucosa
elevada, por otro lado de los 73 pacientes con obesidad el 65.75% tienen el HDL
elevado, el 43.84 triglicéridos por encima de 150 mg/dl y el 27.40% glucosa mayor
a 110 mg/dl, dejando claro que en las dos patologías el HDL se encuentra en un
mayor porcentaje seguido de triglicérido y Glucosa. Por otro lado los triglicéridos
elevados predominan en pacientes con sobrepeso, glucosa y HDL es mayor en
pacientes con obesidad.
En la tabla 4. Se demuestra el comportamiento del polimorfismo rs9939609
del Gen FTO en la población estudiada, de los 144 pacientes 5.56% poseen la
mutación, el 20.14% es Heterocigoto y el 74.31 % mantienen la normalidad.
En la tabla 5. Se indica que la presencia de la mutación en los 71 pacientes
con sobrepeso es de 5.63%, el 23,94% corresponde a las pacientes heterocigotos
y el 70,42% las normales.
26
En la tabla 6. Se demuestra que en los pacientes obesos el 5.48% poseen
la mutación, 16.44% son heterocigotos y el 78.08 son normales.
En la tabla 7. Se observa un gráfico comparativo de la presencia del
polimorfismo tanto en pacientes con sobrepeso y obesidad y es claro que la
presencia es levemente mayor en pacientes que padecen sobrepeso.
En la tabla 8. Observamos una tabla comparativa entre el HDLc<50 y el
polimorfismo rs9939609 del gen FTO y podemos expresar que hay significancia o
relación entre la mutación y el HDLc<50
En la Tabla 9. Tenemos un análisis comparativo entre los triglicéridos
elevados y el polimorfismo rs9939609 del gen FTO donde no se haya una
significancia considerable.
En la tabla 10. Tenemos una tabla comparativa entre glucosa elevada y el
polimorfismo rs9939609 del gen FTO y podemos indicar que no se encuentra una
relación significativa.
4.2. Conclusiones y Recomendaciones
Referente a los marcadores bioquímicos podemos concluir que el
porcentaje mayor de HDLc<50 se encontró en la población que padece obesidad
en un 65.8% (48 pacientes) esto podría deberse a una dieta basada en comidas
altas en grasas saturadas que el organismo directamente las convirtió en VLDL y
triglicéridos.
Los triglicéridos elevados se encontraron en mayor porcentaje en la
población con sobrepeso representando un 54.9% (39 pacientes), podría resultar
algo curioso esta conclusión ya que más fácil sería pensar que los triglicéridos se
encontrarían elevados en personas obesas, pero debemos recordar que
generalmente las personas que padecen obesidad se encuentran medicadas con
27
fármacos hipolipemiantes x esta razón se encuentran clínicamente controlados,
en cambio pocos son los pacientes que saben que padecen sobrepeso y toman
medidas adecuadas de cuidado.
Mientras que en pacientes con obesidad se evidencio un mayor porcentaje
de glucosa elevada 27.4% (20 pacientes), podemos pensar que este resultado se
inclina hacia el elevado consumo de carbohidratos y glúcidos de los pacientes con
obesidad.
La investigación nos permitió demostrar que en la población de mujeres
que padecen de obesidad y sobrepeso se encuentra presente la mutación
rs9939609 del gen FTO, y se demostró mediante P-value 0.004 una relación
significativa entre HDLc<50 y la mutación.
Se recomienda realizar investigaciones similares con un mayor número de
pacientes incluyendo mujeres sanas de esta manera se podría demostrar si la
presencia de esta mutación puede predisponer a una obesidad, por otro lado en
esta investigación se demostró que en la población estudiada no se encontró
relación entre triglicéridos y glucosa con la presencia del polimorfismo rs9939609
del gen FTO
28
5. BIBLIOGRAFÍA
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Economía, Humanidades y Ciencias Sociales (3 ed.). Bogotá: PEARSON.
ISBN: 978-958-699-128-5.
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riesgo de sobrepeso en colegialas de 12 a 19 años en una región
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doi:10.3305/nh.2012.27.4.5851.
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29
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Molecular: Principios y aplicaciones (1 ed.). Colombia: CIB. ISBN: 978-958-
9076-54-5.
10. Herráez, A. (2012). Biología Molecular e ingeniería genética (2 ed.).
Barcelona: ELSEVIER. ISBN: 978-84-8086-647-7.
11. Muñoz, J., Figueroa, L., Cervantes, C., González, C., Villanueva, R. &
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de licenciatura en Biología. Universidad Veracruzana. México.
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intervención nutriológica (2da. ed.). México: Mc Graw Hill. ISBN: 978-607-
15-0656-6.
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18. Terrés-Speziale, M. (2000). El laboratorio clínico y la evaluación del riesgo
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Implicaciones de la genética. RevCubInvBiomed, 26(2) 1-10.
20. Morales, J. (2010). Obesidad, un enfoque multidisciplinario. (1ra ed.).
Hidalgo, México: Universidad Autónoma del estado de Hidalgo.
_____________________________ Jasson Amadeus Espinoza Caicedo ______________________________ Q.F Gina Johnson M.Sc.
31
6. ANEXOS
6.1. Anexo 1. Foto de Gel de Agarosa
32
6.2. Anexo 2. Protocolo de Extracción QIAGEN
1. Etiquetar los tubos con la identidad del paciente.
2. Colocar la muestra en un tubo de 1.5 ml y adicionar 10 ul de proteinasa k y
200 ul de Buffer de lisis AL y mezclar mediante vortex.
3. Incubar a 56 °C por 60 min.
4. Centrifugar con un Spin para bajar las gotas que estuvieran en la tapa y las
paredes del tubo.
5. Adicionar 200 ul de etanol al 100% y mezclar con vortex.
6. Centrifugar nuevamente con leve spin para bajar las gotas que se
encuentran en la tapa y paredes del tubo.
7. Cuidadosamente trasvasar el lisado dentro de una columna previamente
colocada en un tubo recolector de 2 ml tapar el tubo.
8. Centrifugar a 8000 RPM por 1 minuto.
9. Colocar la columna en un nuevo tubo colector de 2 ml y descartar el
anterior con el filtrado.
10. Adicionar 500 ul AW1 Buffer, cerrar el tubo y centrifugar a 8000 RPM por 1
minuto.
11. Colocar la columna en un nuevo tubo colector de 2 ml y descartar el
anterior con el filtrado.
12. Adicionar 500 ul AW2 Buffer, cerrar el tubo y centrifugar a 14000 RPM por
3 minutos.
13. Se recomienda colocar la columna en un nuevo tubo colector de 2ml y
centrifugar nuevamente a 14000 RPM por 1 minuto para eliminar todo el
líquidode la columna.
14. Colocar la columna en un tubo eppendor de 1.5 ml y descartar el anterior
con el filtrado.
15. Adicionar 110 ul de AE Buffer de elución.
16. Incubar la columna a temperatura ambiente por 1 minuto y centrifugar a
8000 RPM por 1 minuto para eluir el ADN atrapado en el filtro de sílice.
17. El DNA ahora esta extraído y debe ser almacenado a una temperatura de -
20 °C.
Cuantificar y posteriormente realizar la reacción en cadena de la polimerasa PCR.
6.3. ANEXO 3. Base de datos
33
CasocodigoEdad Diabetica Hipertensa Peso Talla IMC sobrepeso ≥ 25,00 obesidad ≥ 30,00 Glicemia TG HDLC Glucosa110 TG150 HDL50 METS2 1298AA 1298AC 1298CC rs9939609AA rs9939609AT rs9939609TT
1 1 59 0 1 75 2 25,78 1 0 101 130 35,9 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
2 2 50 0 0 70 2 25,33 1 0 94 119 61,1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0
7 3 55 1 1 56 1 25,92 1 0 124 98 68,6 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0
8 4 60 1 1 79 1 37,06 0 1 110 95 75,9 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0
9 5 64 0 0 76 2 33,78 0 1 101 96 56,2 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0
10 6 56 0 0 83 2 32,42 0 1 111 263 35,7 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0
12 7 60 0 0 68 2 30,22 0 1 90 103 52,0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1
13 8 62 0 1 74 1 33,78 0 1 117 138 41,2 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1
14 9 53 0 0 60 2 25,75 1 0 117 189 26,5 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0
15 10 60 1 1 64 2 25,32 1 0 117 98 40,6 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1
16 11 52 0 0 68 2 27,24 1 0 105 220 48,8 0 1 1 1 0 1 0 1 0 0
17 12 54 0 0 89 2 32,30 0 1 94 76 72,7 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
18 13 60 0 0 64 1 31,74 0 1 107 94 64,5 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0
20 14 46 0 0 75 2 30,04 0 1 121 174 35,5 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0
21 15 47 0 1 88 1 39,64 0 1 93 129 65,1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0
22 16 56 0 0 65 2 27,77 1 0 107 107 66,0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0
23 17 57 0 1 69 1 33,28 0 1 96 174 55,9 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0
24 18 56 0 1 71 2 28,08 1 0 99 315 49,0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0
26 19 54 0 0 65 2 27,77 1 0 90 222 45,5 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0
28 20 50 0 0 83 2 32,99 0 1 94 178 35,2 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0
29 21 59 0 1 65 1 29,67 1 0 102 243 44,5 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0
30 22 46 0 0 85 2 34,72 0 1 87 128 46,0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0
31 23 51 0 0 83 2 32,95 0 1 98 155 45,0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 0
35 24 56 0 0 69 2 30,26 0 1 96 91 47,9 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0
36 25 56 0 1 85 2 34,48 0 1 94 119 47,4 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0
37 26 52 0 0 71 2 28,97 1 0 82 77 39,5 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0
38 27 54 0 0 71 2 29,34 1 0 84 176 36,0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0
39 28 48 0 0 74 2 30,99 0 1 88 100 62,6 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0
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