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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
MODALIDAD INVESTIGACIÓN
TEMA:
ACCIÓN ANTIMICROBIANA DE SOLUCIONES FORMADORAS DE
RECUBRIMIENTOS COMESTIBLES A BASE DE QUITOSANO Y
EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DE JENGIBRE (ZINGIBER
OFFICINALE) FRENTE ALGUNOS MICROORGANISMOS
DE INTERÉS SANITARIO.
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO
PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICA Y FARMACÉUTICA.
AUTORA:
JESIKA IVONNE CEVALLOS WONG
TUTORA:
DRA. CELESTE JACQUELINE CARRILLO TOMALÁ
CO – TUTOR:
ING. RAÚL DÍAZ TORRES PHD.
GUAYAQUIL – ECUADOR
2015
II
III
IV
V
VI
AGRADECIMIENTO
Agradezco a Dios, por haberme permitido llegar hasta este punto y haberme
dado salud para lograr mis objetivos, además de su infinita bondad y amor.
A mi madre, que con su demostración de una madre ejemplar me ha
enseñado a no desfallecer ni rendirme ante nada y siempre perseverar a través
de sus sabios consejos.
A Stuard, por acompañarme durante todo este arduo camino y compartir
conmigo alegrías.
A mis tutores Dra. Celeste Carrillo y Dr. Raúl Díaz que por su apoyo
incondicional, así como también haberme tenido toda la paciencia del mundo
para guiarme durante todo el desarrollo del trabajo de titulación.
A los doctores Oswaldo Pesantes, Adonis Bello y demás docentes de la
Facultad de Ciencias Químicas por su colaboración y su interés en dirigir esta
investigación, además, agradezco su calidez y su valiosa amistad.
A las diferentes instituciones que han colaborado con la realización de esta
tesis, Instituto Nacional de Pesca, a la Q.F Mery Ramírez de la Universidad
Estatal Península de Santa Elena, a la Ing. Isabel de la Facultad de Ingeniería
Química de la Universidad de Guayaquil.
A mis amigos Cristhian y Yoly porque cada uno con sus valiosas aportaciones
hicieron posible este proyecto y por la calidad humana que me han demostrado
con su amistad.
Son muchas las personas que han formado parte de mi vida profesional a las
que me encantaría agradecerles su amistad, consejos, apoyo, ánimo y compañía
en los momentos más difíciles de mi vida. Algunas están aquí conmigo y otras en
mis recuerdos y en mi corazón, sin importar en donde estén quiero darles las
gracias por formar parte de mí, por todo lo que me han brindado y por todas sus
bendiciones.
VII
DEDICATORIA
A mi madre Narcisa y padre Walter, por haberme apoyado en todo momento,
por sus consejos, sus valores, comprensión y por la motivación constante que
me ha permitido ser una persona de bien, pero más que nada, por su amor.
A mi hermano Walther, que con su amor me ha enseñado a salir adelante.
Gracias por estar en otro momento importante en mi vida.
VIII
ÍNDICE GENERAL
CARTA DE AUTORÍA DEL TRABAJO DE TITULACIÓN .................................... IV
AGRADECIMIENTO ........................................................................................... VI
DEDICATORIA .................................................................................................. VII
ÍNDICE DE FIGURAS ......................................................................................... XI
ÍNDICE DE GRÁFICOS ...................................................................................... XI
ÍNDICE DE TABLAS .......................................................................................... XII
RESUMEN EJECUTIVO ................................................................................... XIII
ABSTRACT ..................................................................................................... XIV
INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 1
ANTECEDENTES ................................................................................................ 3
ESTADO DEL ARTE ........................................................................................... 7
JUSTIFICACIÓN................................................................................................ 10
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................ 12
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA .................................................................... 14
OBJETIVOS ...................................................................................................... 15
Objetivo General ............................................................................................ 15
Objetivos Específicos ..................................................................................... 15
HIPÓTESIS ....................................................................................................... 16
VARIABLES ....................................................................................................... 16
CAPITULO I ....................................................................................................... 18
MARCO TEÓRICO ..................................................................................... 18
1.1. Alimento .............................................................................................. 18
1.2. Enfermedades transmitidas por alimentos ........................................... 19
1.3. Microorganismos de interés sanitario .................................................. 20
1.3.1. Escherichia coli............................................................................. 20
1.3.2. Salmonella .................................................................................... 21
1.3.3. Staphyloccocus aureus ................................................................ 22
1.3.4. Listeria monocytogenes ................................................................ 23
1.4. Recubrimientos comestibles ................................................................ 23
1.5. Quitosano ............................................................................................ 24
1.6. Aceite esencial .................................................................................... 26
1.6.1. Composición química ................................................................... 26
IX
1.7. Fenoles ................................................................................................ 27
1.8. Jengibre ............................................................................................... 28
1.8.1. Clasificación taxonómica .............................................................. 28
1.8.2. Composición química del jengibre ................................................ 28
GLOSARIO DE TÉRMINOS .............................................................................. 30
CAPÍTULO II ...................................................................................................... 34
METODOLOGÍA ................................................................................................ 34
2.1. MÉTODOS CIENTÍFICOS EMPLEADOS EN LA INVESTIGACIÓN .... 34
MÉTODO CIENTÍFICO: ..................................................................................... 34
MÉTODOS EMPÍRICOS: ............................................................................... 34
MÉTODOS ESTADÍSTICOS .......................................................................... 35
2.2. METODOLOGÍA .................................................................................. 36
2.3. TIPO DE INVESTIGACIÓN ................................................................. 37
2.4. DISEÑO EXPERIMENTAL DE LA INVESTIGACIÓN ........................... 37
2.5. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS ........................................... 37
PROCEDIMIENTOS....................................................................................... 39
2.6. RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL ......... 39
2.7. TÉCNICA DE EXTRACCIÓN POR PERCOLACIÓN, MACERACION Y SOXHLET CON ETANOL A TRES CONCENTRACIONES DIFERENTES (50%, 70%, 90%) ........................................................................................... 39
2.7.1. Extracción por Percolación ........................................................... 39
2.7.2. Extracción por Maceración ........................................................... 40
2.7.3. Extracción Soxhlet ........................................................................ 40
2.7.4. Concentración en Rotaevaporador ............................................... 41
2.8. Pruebas de Identificación de Fenoles Totales por método de Folin Ciocalteu ........................................................................................................ 41
Preparación de la curva de calibración. ...................................................... 42
2.9. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA ....................... 42
2.9.1. Técnica de difusión de disco en agar ............................................ 42
2.10. PREPARACIÓN DE LA SOLUCION FORMADORA DE RECUBRIMIENTOS COMESTIBLES. ............................................................ 43
CAPÍTULO III ..................................................................................................... 44
RECOLECCIÓN DE DATOS. ............................................................... 44
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS ........................................ 45
CONCLUSIONES .......................................................................................... 55
RECOMENDACIONES .................................................................................. 56
X
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 57
ANEXOS ........................................................................................................... 65
XI
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura I. Estructura química del quitosano ............................................................. 25
Figura II. Estructura química de gingerol y shogaol ............................................. 29
Figura III. EXTRACCIÓN POR SOXHLET ................................................................. 65
Figura IV. EXTRACCIÓN POR MACERACIÓN ......................................................... 66
Figura V. EXTRACCIÓN POR PERCOLACIÓN ........................................................ 66
Figura VI. ROTAEVAPORACIÓN .............................................................................. 67
Figura VII. REACTVO DE FOLIN- CIOCALTEU ........................................................ 67
Figura VIII. PRUEBA DE FOLIN-CIOCALTEU .......................................................... 68
Figura IX. LECTURA ESPECTROFOTOMETRICA A 760NM ................................... 68
Figura X. E. Coli ........................................................................................................ 69
Figura XI. Salmonella typhimurium ......................................................................... 70
Figura XII. Staphylococcus aureus .......................................................................... 70
Figura XIII. Listeria monocytogenes ........................................................................ 71
Figura XIV. PREPARACIÓN DEL QUITOSANO ....................................................... 71
Figura XV. INOCULACIÓN DEL MICROORGANISMO ............................................. 72
Figura XVI. INCORPORACIÓN DE SOLUCIONES FORMADORAS ......................... 73
Figura XVII. E. coli .................................................................................................... 73
Figura XVIII. S. typhimurium .................................................................................... 74
Figura XIX. S. aureus ................................................................................................ 74
Figura XX. L. monocytogenes .................................................................................. 75
Figura XXI. SEGUNDA ETAPA DE CONCURSO “GALARDONES NACIONALES 2015” PROMOVIDO POR LA SENECYT. ......................................... 76
Figura XXII. TERCERA ETAPA DE CONCURSO FINALES DE “GALARDONES NACIONALES 2015” PROMOVIDO POR LA SENECYT. .............. 78
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico I. Curva de calibración para fenoles totales .............................................. 45
Gráfico II. Compuestos fenólicos ............................................................................ 48
XII
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I. Cepas de E. coli causantes de diarrea ...................................................... 20
Tabla II. Especies y Subespecies de Salmonella .................................................... 21
Tabla III. Composición química del jengibre ........................................................... 29
Tabla IV. Curva patrón de ácido gálico ................................................................... 45
Tabla V. Promedios y desviaciones estándares de los métodos de extracción con sus concentraciones hidroalcohólicas. ........................................ 46
Tabla VI Análisis de varianza para efecto de dos factores .................................... 46
Tabla VII. Comparación de medias por test de Duncan para distintos métodos de extracción ............................................................................................. 47
Tabla VIII. Pruebas de comparación por test de Duncan para las distintas concentraciones de extractos hidroalcohólicos .................................................... 47
Tabla IX Códigos de las concentraciones de extracto hidroalcohólico ................ 49
Tabla X. Tamaño de halo de inhibición (mm) del extracto de jengibre ................. 49
Tabla XI. Análisis de varianza para E. coli frente al extracto hidroalcohólico Maceración 90º .......................................................................................................... 50
Tabla XII Códigos de las concentraciones de extracto hidroalcohólico ............... 51
Tabla XIII. Tamaño del halo de inhibición (mm) de la solución formadora de recubrimiento. ........................................................................................................... 51
Tabla XIV. Análisis de varianza para E. coli ............................................................ 51
Tabla XVI. Análisis de varianza para Listeria Monocytogenes .............................. 52
Tabla XVII. Análisis de varianza para Salmonella typhimurium ............................ 53
Tabla XIX. Análisis de varianza para Staphylococcus aureus ............................... 53
XIII
RESUMEN EJECUTIVO
El presente trabajo se realizó en los laboratorios de la facultad de Ciencias
Químicas de la Universidad de Guayaquil, su objetivo primordial fue evaluar la
posible actividad antimicrobiana de una solución formadora de recubrimiento
comestible a base de extracto hidroalcohólico de jengibre mas quitosano, frente
a Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus y Listeria
monocytogenes. El jengibre obtenido de un supermercado de consumo masivo
al norte de la ciudad de Guayaquil, fue lavado para quitar de su superficie
partículas extrañas como polvo, tierra y restos de raíces, pelado y por ultimo
triturado para realizar la extracción hidroalcohólica utilizando tres métodos
diferentes: Soxhlet, Maceración y Percolación, siendo seleccionado el método de
Maceración. La actividad antimicrobiana se determinó utilizando la técnica de
difusión de disco en agar, inoculando los microorganismos en medio agar
Mueller Hinton, las placas fueron incubadas a 37°C durante 24 horas, después
de lo cual se realizaron las lecturas de los halos de inhibición de todas las placas
preparadas para los diferentes microorganismos y con las diferentes posibles
mezclas de formulación final de solución de recubrimiento comestible. Se
concluye que existió una inhibición del crecimiento de Escherichia coli ATCC
25922 al utilizar tanto el extracto hidroalcohólico como la solución formadora de
recubrimiento comestible preparada a base de extracto hidroalcohólico de
jengibre más quitosano.
Palabras Clave: Recubrimiento Comestible, Jengibre, Quitosano, Inhibición
Microbiana
XIV
ABSTRACT
This work was done in the laboratories of the Faculty of Chemistry of the
University of Guayaquil, its primary objective was to evaluate the possible
antimicrobial activity of an edible coating forming solution based hydroalcoholic
ginger extract more chitosan, against Escherichia coli , Salmonella typhimurium,
Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes. Ginger obtained from a
supermarket consumer north of the city of Guayaquil, was washed to remove
foreign particles from its surface as dust, dirt and debris root, peeled and crushed
to finally make the alcoholic extraction using three different methods: Soxhlet,
maceration and percolation, being selected the method of maceration. The
antimicrobial activity was determined using the technique disk diffusion agar,
inoculating microorganisms in Mueller Hinton Agar, the plates were incubated at
37 ° C for 24 hours after which readings inhibition halos were performed All the
plates prepared for different microorganisms and the various possible mixtures
final formulation of edible coating solution. It was concluded that growth inhibition
of Escherichia coli ATCC 25922 by using both the hydroalcoholic extract and
edible coating forming solution prepared from hydroalcoholic ginger extract plus
chitosan.
Keywords: Edible coating, Ginger, Chitosan, Microbial Inhibition
1
INTRODUCCIÓN
El consumo de alimentos como frutas y hortalizas representa en la actualidad
una tendencia mundial en favor de la salud de sus consumidores. Los productos
con estas características requieren la generación y evaluación de procesos
tecnológicos que garanticen la calidad e inocuidad de los mismos. Los productos
vegetales tienen un tiempo de vida útil o en percha corto debido a la degradación
por acción de factores físicos y por la acción de los microorganismos y otros
factores involucrados en el proceso que afectan la inocuidad del producto.
Según la OMS (Organización Mundial de la Salud), 2015, las enfermedades
transmitidas por los alimentos suponen una importante carga para la salud.
Millones de personas enferman y muchas mueren por consumir alimentos
insalubres.
Con el fin de incrementar la vida útil de los alimentos y especialmente de
aquellos de origen vegetal se han desarrollado los recubrimientos comestibles
que van a usarse para retardar la migración de humedad y lípidos o el transporte
de gases y solutos. Éstos, deben poseer propiedades mecánicas que garanticen
la adecuada adhesividad a los alimentos (Famá et al., 2004; Figueroa, Salcedo,
Aguas, Olivero, & Narváez, 2011).
Las coberturas comestibles fueron creadas como una estrategia para reducir
los efectos perjudiciales en los tejidos vegetales funcionando como una barrera
artificial semipermeable, contribuyen a la extensión de la vida útil del producto al
reducir la migración de humedad y de solutos, el intercambio de gases, la
respiración y otras reacciones oxidativas, disminuyendo así los desórdenes
fisiológicos. Estas coberturas comestibles pueden servir como soporte de
algunos aditivos alimentarios, tales como antioxidantes, antimicrobianos,
colorantes, saborizantes y nutrientes (Figueroa et al., 2011).
2
Viña et al. (2007), definieron a las películas y recubrimientos comestibles
como matrices o soportes que pueden ser formadas por lípidos, polisacáridos y
proteínas. Estos otorgan al alimento al que van adheridos la posibilidad de
aumentar su calidad mediante el control de migración de la humedad, grasas,
oxígeno y compuestos responsables del sabor, color y aroma. Logrando así
mantener en buenas condiciones al producto alimenticio por largos periodos de
almacenamiento.
En la elaboración de los recubrimientos comestibles se pueden incorporar
productos naturales con actividad antimicrobiana procedentes de plantas en
sustitución al uso de productos químicos.
El rizoma del jengibre tanto fresco como seco es una especie vegetal utilizada
en la preparación de alimentos y goza de una amplia reputación por sus
propiedades medicinales en la medicina tradicional en China por más de 2 500
años (Funk et al., 2009; Gómez et al., 2013).
En el jengibre, además de los compuestos volátiles que aportan el olor típico
de este rizoma, existe un grupo de compuestos no volátiles que aportan
propiedades farmacológicas importantes (Mahady, Pendland, Yun, Lu, & Stoia,
2003). Además contiene compuestos polifenólicos que le aportan una alta
actividad antioxidante (Stoilova, Krastanov, Stoyanova, Denev, & Gargova,
2007).
Este estudio va a comprobar el efecto de un recubrimiento comestible a base
de Jengibre (Zingiber officinale), junto a la acción del Quitosano que en conjunto
podría tener un efecto inhibitorio frente a varios microorganismos de interés
sanitario y podría ser una alternativa a los problemas de pérdidas de alimentos y
preservación de los mismos.
3
ANTECEDENTES
Jengibre
El jengibre cuyo nombre científico es “Zingiber officinale”, es originario de
zonas tropicales de Asia, la parte utilizada tradicionalmente es el rizoma,
empleado como especia hace más de 2.000 años (Stoilova, Krastanov,
Stoyanova, Denev, & Gargova, 2007).
El jengibre posee un grupo de compuestos no volátiles que aportan
propiedades farmacológicas importantes, presentando propiedades para
tratamiento de enfermedades gastrointestinales, es un antiemético (Mahady,
Pendland, Yun, Lu, & Stoia, 2003), estimulante circulatorio, utilizándose cuando
hay mala circulación y calambres, afecciones respiratorias, como expectorante,
y antiséptico (ABIES, s.f.).
Las oleorresinas del jengibre se obtienen mediante la extracción de los
compuestos aromáticos de las especias deshidratadas con solventes orgánicos.
Sus raíces y los extractos obtenidos contienen compuestos de polifenol (6-
gingerol y sus derivados), que tienen una alta actividad antioxidante (Stoilova,
Krastanov, Stoyanova, Denev, & Gargova, 2007) incluso mayor que la del alfa-
tocoferol (vitamina E) (Craig, 2006).
Alonso (2004), recopiló información importante, donde indicó que
las oleorresinas se producen mediante la extracción de los
compuestos aromáticos de las especias deshidratadas con
solventes orgánicos. El conjunto de sesquiterpenos de la
oleorresina, en especial el B-sesquifelandreno, demostró in vitro
actividad inhibitoria frente al rinovirus (Denyer C.et al., 1994). El
extracto dicloro-metano y metanólico de la raíz de jengibre ha
exhibido actividad bactericida (in vitro) frente a gérmenes Gram
4
positivos y negativos. En ese sentido el extracto alcohólico al 80%
del rizoma resulto ser activo en dosis de 500 ug/disco frente a
Bacillus antracis, Bacillus subtilis, Escherichia coli (cepas 7075 y
BB), Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella
typhi, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus hemolyticus. En la misma dosis, pero extraído en
alcohol de 90% resulto activo frente a B. subtilis, E. coli y
Streptococcus faecalis (Mascolo N. et al., 1989). Por su parte, el
extracto metanólico de la raíz demostró actividad inhibitoria in vitro
frente a Bacillus cereus (Alzoeky N. et al., 2003).
Quitosano
El quitosano es un polisacárido obtenido mediante la desacetilación parcial de
la quitina contenida en el exoesqueleto de crustáceos. (Feepons, 1991; Ramos
et al., 2010).
Las películas de quitosano han sido utilizadas en el control de Penicillium
Italicum en manzanas, asimismo ha sido probada en rodajas de mango y en
fresones, mejorando algunas propiedades físico-químicas del fruto, y
disminuyendo la deshidratación (Sánchez, Vargas, González, Cháfer, & Chiralt,
2008), e induciendo la resistencia de la fruta además de inhibir el crecimiento del
patógeno. (Cruañes & Locaso, 2011)
Dependiendo de la concentración usada, factores inherentes al quitosano, su
preparación, y del microorganismo a controlar, el quitosano generará una
inhibición o disminución de la carga microbiana.
Wang (1992) observó que una concentración alta de quitosano (1-
1.5% p/v) se requiere para la inactivación completa de
Staphylococcus aureus después de dos días de incubación a pH
5
5,5. Para un efecto bactericida de Bacillus cereus requiere una
concentración de quitosano del orden de 0,02% p/v. Escherichia
coli y Proteus vulgaris mostraron crecimiento mínimo en
soluciones de quitosano al 0,005%, y una inhibición completa a >
0,0075% de quitosano (Valenzuela & Arias, 2012).
Recubrimiento comestible
Los recubrimientos comestibles datan de los siglos XII y XIII en China donde
se efectuaban en cítricos la inmersión en cera, que usaban para retrasar la
pérdida de agua (Kaplan, 1986; Greener y Fennema, 1994; Bósquez-Molina,
2003).
Al recubrimiento comestible se lo detalla como una capa delgada constituida
por materiales poliméricos, como lípidos, proteínas o polisacáridos en solución,
que son comestibles y colocadas sobre la superficie del alimento con la intención
de extender su vida útil y proporcionar una efectiva barrera (Restrepo &
Aristizábal, 2010), disminuyendo los índices de respiración y transpiración a
través de la superficie de las frutas y así retrasando el crecimiento microbiológico
y los cambios de color, mejorando asimismo la textura y calidad de la fruta
(Cruañes & Locaso, 2011), igualmente mejora la integridad estructural y
propiedades de manipulación mecánica de los alimentos, (Cordeiro de Azeredo,
2012) dando un efecto sinérgico de los componentes sobre la vida de anaquel
de dichos alimentos.
Moncayo et al., (2013) realizaron un estudio utilizando como recubrimiento
comestible un biopolímero tipo dextrana, en fresas (Fragaria × ananassa L), las
que presentaron una disminución en la pérdida de peso, y deterioro
microbiológico, conservando las propiedades mecánicas del producto.
6
Figueroa et al., 2011 realizaron recubrimientos comestibles a base de
propóleo para la conservación de mango y aguacate, las que redujo la pérdida
de peso, la velocidad de respiración y la maduración, con la finalidad de
extender la vida comercial del producto, mejorando su apariencia.
El polisacárido más utilizado para la formulación de los recubrimientos
comestibles es el quitosano, reduciendo el crecimiento de hongos y bacterias
(Ramos-García, et al., 2010).
Durango et al. (2006) desarrollaron recubrimientos a base de
almidón de ñame (Dioscorea sp.) y quitosano, preparados por
termo-gelatinización usando suspensiones de 4% de almidón de
ñame (w/w) y 2% de glicerol (w/w). El quitosano fue agregado en
concentraciones de 0.5% y 1.5% (w/w). La máxima actividad
antimicrobiana se obtuvo en el RC que contenía 1.5% (w/w) de
quitosano y fue totalmente eficiente sobre el crecimiento de
mohos y levaduras. A esta concentración el conteo de este grupo
de microorganismos se redujo en 2.5 ciclos logarítmicos en los
trozos de zanahoria (Daucus carota L.) que se almacenaron
durante 15 días. El recubrimiento con una concentración de 0.5%
(w/w) de quitosano controló el desarrollo de mohos y levaduras
durante los primeros 5 días de almacenamiento. Después de este
tiempo las muestras evaluadas (Quintero, Falguera, & Muñoz,
2010).
7
ESTADO DEL ARTE
Los productos hortofrutícolas están expuestos a pérdidas, en cantidad y
calidad en el período de recolección, manipulación y traslado. Actualmente hay
un creciente interés por el desarrollo de materiales que puedan mejorar la vida
útil de los alimentos y también por la seguridad microbiológica que se les da
(Arce- Alfonso, 2011).
Se han implementado para prolongar la vida útil en los productos
hortofrutícolas diferentes tecnologías, entre ellas el almacenamiento a bajas
temperaturas, la aplicación de tratamientos hidrotérmicos, irradiación
(Quezada et al., 2003), recubrimientos y películas comestible (Ramos-García, et
al., 2010).
No obstante a que los términos películas comestibles y recubrimientos
comestibles se refieren a veces como sinónimos, hay una diferencia,
las películas están preformadas por separado y después se aplican a la
superficie de los alimentos o sellados en bolsas comestibles, mientras que los
recubrimientos se forman directamente sobre las superficies de los
alimentos. (Cordeiro de Azeredo, 2012)
Malu, Obochi, Tawo y Nyong (2009), comprobaron la actividad antibacteriana
de extractos del jengibre obtenidos por diferentes métodos. Ellos utilizaron
diferentes métodos de extracción empleando agua, n- hexano, acetato de etilo y
extracción por un aparato soxhlet usando como solvente el etanol. Los
resultados de los extractos mostraron que tienen actividad antibacteriana sobre
Bacillus colliform, Staphylococcus epidermidis y Streptococcus viridians, excepto
el extracto acuoso que no presenta inhibición de la actividad bacteriana. (Malu,
Obochi, Tawo, & Nyong, 2009)
8
Habsah et al., (2000), investigaron sobre los hongos causantes de
micosis humanas, y ningún extracto del jengibre ha presentado un
resultado activo. Al contrario frente a hongos fitopatógenos ellos
poseen efectividad para Drechslera oryzae, Rhizoctonia solani,
Sclerotium oryzae y Sclerotum rolfsii (Caceres A., 1997). El
extracto al 10% de la raíz de jengibre evidencio actividad fungicida
in vitro e in vivo frente a Fusarium udum, hongo causante del
deterioro de cultivos de gandul (Cajanus cajan) (Singh R. & Rai
B., 2000). El 6-gingerol combinado con piperonil-butóxido
demostró poseer actividad molusquicida sobre Lymnaea
acuminata (Singh K. & Singh D., 2000). Por último, el extracto etil-
acético del rizoma de jengibre ha demostrado ser eficaz frente al
desarrollo de Schistosoma mansoni (macho y hembra adultos)
tanto in vivo como in vitro (Sanderson et al., 2002).
Parzanese (2012), indica que el quitosano en los últimos años se ha
convertido en el aditivo de alimentos de origen biológico preferido, debido a su
abundancia en la naturaleza y a su capacidad para formar películas. El
quitosano posee propiedades tales como actividad antimicrobiana, no es tóxico
y tiene afinidad notable a las proteínas, presentando características
biofuncionales (Ramos-García, et al., 2010), por lo que podría ser una opción
factible para elaborar recubrimientos comestibles y así sustituir los métodos de
control de microorganismos tradicionales utilizándose sin problemas (González–
Aguilar, Monroy–García, Goycoolea–Valencia, Díaz–Cinco, & Ayala–Zavala.,
2005), siendo aplicadas en muchos productos, principalmente frutas y hortalizas
como fresas (Moncayo-Martinez, Buitrago-Hurtado, & Perilla, 2013), pimientos
(Bautista-Baños, Hernández-Lauzardo, Valle, Bosquez-Molina, & Sánchez,
2005), pepinos (Galletti, Berger, Drouilly, & Lizana, 2006), arándanos (Cruañes
& Locaso, 2011), peras (Chatterjee et al., 2004), mango y aguacate (Figueroa et
al, 2011) con el objetivo de preservar su calidad y actuar como agente
antimicrobiano.
9
Los recubrimientos con quitosano se distinguen de otros polisacáridos por ser
transparentes, formando una cubierta semipermeable (Bautista-Baños,
Hernández-Lauzardo, Valle, Bosquez-Molina, & Sánchez, 2005) en la superficie
de los frutos, que actúa como una barrera mecánica frente al O2 (Ramos et al.,
2010), ocasionando cambios físico-químicos favorables en el metabolismo de las
frutas u hortalizas alargando su vida de anaquel (Bautista et al., 2005) y
reduciendo el desarrollo de pudriciones durante el almacenamiento causadas
por hongos, como Rizophus stolonifer, Botrytis cinerea , y Alternaria alternata
entre otras (Ramos et al., 2010). Además presenta un amplio espectro
antimicrobiano, que ha sido expuesto a través de varios mecanismos de acción,
contra microorganismos patógenos tales como Escherichia coli, Listeria
monocytogenes, Pseudomonas spp, Salmonella, Staphylococcus aureus, (Mead,
1999; Huang et al., 2012; Valenzuela & Arias, 2012)
10
JUSTIFICACIÓN
Según la FAO (2000), los microorganismos son los causantes de la mayoría
de pérdidas de los alimentos producidos a nivel mundial. Esto le da vital
importancia el envasado y almacenamiento de los alimentos. Así en los últimos
años, la industria agroalimentaria ha priorizado la sustitución de los aditivos
químicos convencionales por compuestos naturales como respuesta a la
demanda creciente de los consumidores de una alimentación más sana y
segura.
El diseño de formulaciones formadoras de recubrimiento a base de
biopolímeros biodegradables como el quitosano combinados con antimicrobianos
naturales representan una técnica innovadora que puede garantizar la seguridad
y prolongar la vida útil de los alimentos. (Sánchez Gonzáles, 2010)
Rodríguez (2011), indicó que para la industria alimentaria se ha vuelto de
gran interés el estudio de los extractos y aceites esenciales derivados de las
plantas debido a su propiedad de controlar el crecimiento de microorganismos
patógenos de manera natural, evitando así las enfermedades producidas por los
alimentos y/o descomposición de los mismos.
En este sentido, numerosas investigaciones destacan el amplio espectro de
estos extractos y aceites esenciales frente a diferentes cepas de hongos,
levaduras, virus y bacterias. (Sánchez Gonzáles, 2010)
Investigaciones realizadas in vitro donde se demuestran
las propiedades antimicrobianas de Z. officinale, atribuidos a los
componentes 6-gingerol y zingerona. Se ha demostrado in vitro
que extractos de jengibre bloquean la unión entre la enterotoxina
11
termolábil de la Escherichia coli al receptor de la superficie celular
GM1 por medio de zingerona (vanillil acetona) (Chen et al., 2007).
Realizar un estudio utilizando el Jengibre (Zingiber officinale), junto a la
acción del quitosano podría resultar una solución a los problemas de pérdidas de
alimentos, así como una alternativa más eficaz para la preservación de los
mismos.
12
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Un alimento alterado es aquel que presenta cambios que limitan su
aprovechamiento. El alimento alterado tiene modificadas sus características
organolépticas y no es apto para el consumo, sin que ello suponga siempre que
sea peligroso para la salud.
Existen varios tipos de agentes causantes de la alteración de los alimentos:
los de origen biológico, entre los que se pueden diferenciar, los intrínsecos,
como las enzimas y los extrínsecos, como parásitos o microorganismos y
también los de origen físico como la temperatura, luz, entre otros. Pero sin duda
los que producen las transformaciones más indeseadas y abundantes son las
alteraciones causadas por agentes biológicos. En algunos casos pueden
suponer riesgos para la salud de las personas, siendo las infecciones
microbianas el problema más grave de la alimentación humana, después del
hambre y la sobrealimentación. (Juliarena y Gratton, 2012).
Según la FAO (2011), cada año se estima que 1,3 millones de toneladas,
aproximadamente un tercio de los alimentos producidos para el consumo
humano en todo el mundo, se pierden. De esta cantidad una gran parte de la
pérdida es producida por acción de los microorganismos.
Actualmente una de las alternativas con más futuro en este campo es la
tecnología de recubrimientos comestibles ya que cumple con las exigencias de
los consumidores actuales: productos saludables, mínimamente procesados, sin
agregado de agentes químicos, y de producción sustentable. Una funcionalidad
importante de los recubrimientos y películas comestibles es su habilidad para
13
incorporar ingredientes activos, ya que pueden servir como soporte de aditivos
capaces de conservar y mejorar la calidad del producto. (Parzanese, 2012)
La necesidad del mercado productor de alimentos de que sus productos sean
comercializados evitando el deterioro o putrefacción de los mismos por acción de
diversos microorganismos tales como hongos y bacterias que aceleran el
proceso enzimático y por ende la maduración del alimento hasta su
descomposición, ha llevado a los investigadores a observar y evaluar las
aplicaciones que se les atribuyen a extractos de plantas entre los cuales se
destacan los extractos hidroalcohólicos que a diferentes concentraciones tienen
actividad anti fúngica y antibacteriana.
Un biopolímero como el quitosano puede ejercer un efecto sinérgico a la
actividad antimicrobiana del extracto hidroalcohólico, dando como resultado una
acción inhibitoria más efectiva contra muchos microorganismos de interés
sanitario, lo cual permitiría evitar la pérdida de alimentos producidos, mayor vida
útil de estos y mayores ganancias para los productores y para el país.
14
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
¿Tendrán las soluciones formadoras de recubrimiento comestible a base de
quitosano y extracto hidroalcohólico de Jengibre (Zingiber officinale) un efecto
inhibitorio frente a ciertos microorganismos de interés sanitario?
15
OBJETIVOS
Objetivo General
1. Evaluar la actividad antimicrobiana de soluciones formadoras de
recubrimiento comestible a base de quitosano y extracto hidroalcohólico
de Jengibre (Zingiber officinale) frente a ciertos microorganismos de
interés sanitario.
Objetivos Específicos
1. Seleccionar el método de obtención del extracto hidroalcohólico.
2. Determinar la cantidad de compuestos fenólicos presentes en
todos los métodos de extracción empleados.
3. Analizar la actividad antimicrobiana de las soluciones formadoras
de recubrimientos comestibles elaboradas con quitosano y
Jengibre (Zingiber officinale) frente a microorganismos
seleccionados.
16
HIPÓTESIS
El recubrimiento comestible a base de quitosano y extracto hidroalcohólico de
Jengibre (Zingiber officinale) presenta actividad antimicrobiana.
VARIABLES
Variable Independiente
Concentración de alcohol en la solución extractora
Método de obtención del extracto hidroalcohólico
Concentración de extracto hidroalcohólico en la disolución formadora de
recubrimiento comestible.
Concentración de quitosano en la disolución formadora de recubrimiento
comestible.
Variable Dependiente
Concentración de compuestos fenólicos
Diámetro del halo de inhibición.
17
VARIABLE CONCEPTUALIZACION INDICADOR - MEDICIONES
Dependiente
Diámetro del halo de inhibición
Es la zona alrededor de un disco de antibiótico en un antibiograma en el
que no se produce crecimiento bacteriano en una placa de agar
inoculada.
mm
Independiente
Concentración de alcohol en la solución
extractora
Porcentaje de alcohol en la solución extractora
O
(Grado alcohólico)
Concentración de extracto
hidroalcohólico en la disolución formadora
de recubrimiento comestible.
Proporción de extracto hidroalcohólico en la solución final
del recubrimiento comestible
%
Concentración de compuestos fenólicos
Cantidad de compuestos con capacidad antioxidante capaz de
ejercer acción antimicrobiana.
ppm
Concentración de quitosano en la
disolución formadora de recubrimiento
comestible.
Proporción de extracto solución de quitosano en la solución final del
recubrimiento comestible
%
18
CAPITULO I
MARCO TEÓRICO
1.1. Alimento
La FAO (s.f.), define al alimento como un producto natural o procesado,
conformado por nutrientes como proteínas, vitaminas, minerales, carbohidratos,
grasas y agua, que poseen características organolépticas (sabor, color, aroma y
textura), fundamental para la sobrevivencia del hombre.
Un alimento sano se caracteriza por aportar energía y nutrientes que el
organismo necesita. El alimento seguro o inocuo es aquel que está libre de
contaminación (bacterias, virus, parásitos, etc.) (FAO , 2014).
Un alimento contaminado se presenta por la aparición de material extraño
reduciendo la calidad para el consumo humano. Existen dos tipos de alimento
contaminado: contaminación biológica y contaminación química. La
contaminación biológica son los que presentan microorganismos como las
bacterias, los parásitos y los hongos. En la contaminación química existe la
presencia de sustancias extrañas (tierra, pelos, etc.) o tóxicos tales como
detergentes, insecticidas, plaguicidas (ELIKA, 2014).
Los alimentos alterados son aquellos que por numerosas causas ha
presentado un deterioro, (FAO , 2014) es decir muestran cambios que limitan su
utilización, variando sus características organolépticas y no son idóneos para el
consumo humano. (ELIKA, 2014). Los agentes principales que ocasionan
alteración al alimento, son: agente físicos, agentes biológicos y agentes
químicos. Los agentes físicos son los que conllevan a variaciones en la
estructura, tales como humedad, actividad del agua, la temperatura y el tiempo,
los agentes químicos crean compuestos debido a reacciones químicas o
enzimáticas, como: el oxígeno del aire y la luz, que provocan fenómenos de
oxidación, el pH y la acidez, sin embargo los agentes biológicos son propios de
19
la composición del alimento, como puede ser el caso de las enzimas propias del
producto y las procedentes de las bacterias, levaduras y mohos.
Los alimentos intervienen como vehículos de transmisión de agentes
patógenos y sustancias tóxicas, (Barón, Chávez, & Sauceda, 2013)
habitualmente se produce la contaminación de los alimentos durante la
manipulación, ya que se pueden introducir microorganismos perjudiciales para la
salud del consumidor.
La OMS (2015) estima que 2 millones de personas al año, en su mayoría
niños mueren por alimentos insalubres, los alimentos que contienen bacterias,
virus, parásitos o sustancias químicas nocivas causan más de 200
enfermedades, que van desde la diarrea hasta el cáncer.
1.2. Enfermedades transmitidas por alimentos
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAS) son aquellas
enfermedades de carácter infeccioso o toxico que se originan por la ingestión de
microorganismos patógenos (bacterias, parásitos o virus) o sustancias que
penetran al organismo, tomando como vehículo al alimento, afectando sobre
todo a grupos sociales de bajo recursos (Kopper, Calderón, Schneider,
Domínguez, & Gutiérrez, 2009).
Una diversidad de microorganismos conduce el deterioro de los alimentos
que es una de las preocupaciones más importantes de la industria alimentaria.
(Norajit, Laohakunjit, & Kerdchoechuen, 2007). Los microorganismos causantes
de ETAs comprenden coliformes fecales, Escherichia coli, Clostridium botulinum,
C. perfringens, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus tipo emético, Vibrio
cholerae, V. parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica, Shigella sp., Salmonella
sp., Listeria monocytogenes, entre otras. De la misma forma existen
enfermedades producidas por parásitos como la amibiasis, giardiasis, triquinosis,
cisticercosis, y con menor frecuencia enfermedades virales como la hepatitis y
20
otras que pueden ser causadas por rotavirus, asimismo las intoxicaciones
causadas por toxinas de origen fúngico (aflatoxinas). (Kopper, Calderón,
Schneider, Domínguez, & Gutiérrez, 2009).
1.3. Microorganismos de interés sanitario
1.3.1. Escherichia coli
Escherichia coli (E. coli) es un bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo de
la familia Enterobacteriaceae, microorganismo indicador de la contaminación
fecal, se encuentra ampliamente distribuida en el intestino de los seres humanos
y animales de sangre caliente, predominante en el intestino y parte de la
microbiota intestinal esencial que mantiene la fisiología del huésped sano (Feng,
Weagant, Grant, & Burkhardt, 2002), pero existen cepas que pueden ser
patógenas como la E. coli enterotoxigénica (ETEC), enteroinvasiva (EIEC) y
enteropatógena (EPEC). enteroagregativa (EAEC) y de adherencia difusa
(DAEC), produciendo diferentes cuadros clínicos, entre ellos diarrea. (Rodríguez-
Angeles, 2002). [TABLA I]
Tabla I. Cepas de E. coli causantes de diarrea
Grupos Síntomas Epidemiologia
ETEC Diarrea aguda acuosa Niños menores de dos
años y diarrea del viajero
EHEC Síndrome Urémico
Hemolítico (SUH), Colitis
Hemorrágica (CH), diarrea
sin sangre, dolor
abdominal, fiebre, vómito
Niños y adultos que la
adquieren por comer carne
cruda o mal cocida
EIEC Diarrea con moco y sangre
o diarrea acuosa, también
se presenta cuadro
disentérico
Niños menores de seis
meses
21
EPEC Diarrea aguda, dolor
abdominal, vómito, fiebre
baja
Niños menores de seis
meses hasta dos años
EAEC Diarrea liquida, verde con
moco, sin sangre, diarrea
persistente hasta 20 días
Recién nacidos y niños
menores de dos años
DAEC Diarrea acuosa sin sangre Niños de 1 a 5 años
Fuente: (Rodríguez-Angeles, 2002)
El medio de contagio de la E. coli se debe al consumo de alimentos
contaminados, como carne molida cruda o mal cocida, leche cruda y productos
frescos, originada por la contaminación fecal de los alimentos y del agua,
también a través de la contaminación cruzada o por contacto humano directo
durante la preparación de los alimentos. La E. coli patógena transmitida por los
alimentos contradictoriamente ha aparecido en sociedades con un mejor
progreso sanitario e higiénico (FAO, 2004).
1.3.2. Salmonella
Es la principal bacteria relacionada con las infecciones transmitidas por
alimentos en los países industrializados. La Salmonella es un bacilo Gram
negativo, anaerobio facultativo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae,
dividida en dos especies: Salmonella entérica responsables de infecciones en el
hombre y animales de sangre caliente; y Salmonella bongori de la cual se
encuentran más de 20 serotipos que producen casos espontáneos de enteritis
en humanos probablemente al ingresar en contacto con reptiles y aves
migratorias. (Rivera Calderón, et al., 2012). [Tabla II]
Tabla II. Especies y Subespecies de Salmonella
Especie Subespecie
Salmonella entérica I enterica II salamae
22
IIIa arizonae IIIb diarizonae IV houtenae
VI indica Salmonella bongori
Fuente: (Rivera Calderón, et al., 2012)
La bacteria Salmonella puede causar una infección gastrointestinal conocida
como salmonelosis, no forma parte de la microbiota del humano y se transmite
de manera menos frecuente de una fuente animal, excepto la S. typhi; su medio
de contagio es de persona a persona, debido a la manipulación de los alimentos
afectando el sistema digestivo y produciendo diarrea aguda, (Murray et al. 2006;
Rivera-Calderón, et al., 2012) es de importancia en la salud pública debido a
que no siempre se cuenta con las condiciones de saneamiento e higiene
adecuados (Gutiérrez-Cogco, Montiel-Vázquez, Aguilera-Pérez, & González-
Andrade, 2000).
1.3.3. Staphyloccocus aureus
Staphyloccocus aureus (S. Aureus) son cocos Gram positivos, catalasa y
coagulasa positivos, inmóviles, facultativamente anaerobios, no formadores de
esporas, presentes en la piel y mucosas (Chams, 2013).
S. Aureus puede causar una intoxicación alimentaria grave, siendo
reconocido como el agente causal en muchos brotes y es probablemente
responsable de más casos, incluso en individuos y grupos familiares que los
mostrados en los registros (Bennett & Lancette, 2001).
Los S. aureus son vulnerables a la destrucción por tratamiento térmico y otros
agentes, casi todos desinfectantes. Consecuentemente, la presencia de esta
bacteria o sus enterotoxinas en los alimentos procesados o en equipos de
procesamiento de alimentos es en general una indicación de la falta de
saneamiento o una inadecuada manipulación (Bennett & Lancette, 2001).
23
1.3.4. Listeria monocytogenes
Se trata de una bacteria Gram positiva, patógeno oportunista, causante de
varios brotes de enfermedades transmitidas por alimentos, está ampliamente
dispersa en el medio ambiente y alimentos, el patógeno puede crecer en un
número significativo a temperaturas de refrigeración cuando se le da el tiempo
suficiente (Nuvolosi, Pedonese, D'Ascenzi, & Rindi, 2006).
La listeriosis transmitida por los alimentos es una enfermedad grave, con
altas tasas de mortalidad (20-30%) en comparación con otros patógenos
microbianos transmitidos por los alimentos, como Salmonella (Nuvolosi,
Pedonese, D'Ascenzi, & Rindi, 2006). Con mayor frecuencia afecta a mujeres
embarazadas, fetos y personas inmunodeprimidas, provocando abortos, muertes
neonatal, septicemia y meningitis (OMS, 2014).
1.4. Recubrimientos comestibles
El recubrimiento comestible es una capa delgada formada por biopolímeros,
(lípidos, proteínas o polisacáridos), que se emplea sobre la superficie del
alimento constituyendo una barrera semipermeable a los gases y al vapor de
agua (Restrepo & Aristizábal, 2010) retrasando el crecimiento microbiológico y
los cambios de color, mejorando asimismo la textura y calidad de la fruta
(Cruañes & Locaso, 2011) con el propósito de extender su vida útil.
Los recubrimientos comestibles tienen la capacidad para incorporar agentes
antimicrobianos y ofrecer estabilidad microbiológica a los alimentos,
disminuyendo el riesgo de crecimiento de patógenos (Marsh & Bugusu, 2007).
Los recubrimientos comestibles deben presentar características como:
transparencia, estabilidad para distintas formas de almacenamiento,
homogeneidad, y estar exentos de sabores y olores extraños, asimismo como de
24
cualquier sustancia nociva (Campos, 2014). Dependiendo del tipo de compuesto
a incorporarse se dividen en tres grupos:
1.4.1. Hidrocoloides: Presentan una buena barrera mecánica contra gases con
excepción el vapor de agua, esto se debe a la naturaleza hidrófila, dentro
de ellos se encuentran los polisacáridos (Kester y Fennema, 1986;
Gennadios y Weller, 1990; Campos 2014).
1.4.2. Lípidos: Tienen la ventaja de ser una barrera contra la humedad
reduciendo la deshidratación y transpiración, pues están constituidos por
compuestos hidrofóbicos y no poliméricos; pero presentan dificultad para
formar películas (Figueroa, Salcedo, Aguas, Olivero, & Narváez, 2011).
1.4.3. Compuestos: Formados a partir de combinaciones de hidrocoloides y
lípidos, para aprovechar los beneficios de ambos tipos y reducir sus
inconvenientes (Greener y Fennema, 1994; Campos 2014).
1.5. Quitosano
El quitosano es un polímero natural, su fórmula química es poli[β-(1-4)-2-
amino-2-desoxi-D-gucopiranosa] (Pastor de Abram & Higuera, 2004)(ver Figura
1), se obtiene por la desacetilación alcalina de la quitina (Ying-chien, et al.,
2004). Estructuralmente se logran diferenciar dos tipos de quitosano (Q)
principalmente α-Q presente en la cutícula de los crustáceos y las paredes
celulares de ciertos hongos; y β-Q obtenida en la pluma cartilaginosa interna del
exoesqueleto de calamares (Valenzuela & Arias, 2012).
25
Figura I. Estructura química del quitosano Fuente: (Goy, Britto, & Assis, 2009)
El quitosano es una base débil e insoluble en agua, pero soluble en
soluciones ácidas acuosas diluidas por debajo de su pKa (~ 6,3), se diferencia
de otros polisacáridos por ser transparentes y formar cubiertas. (Goy, Britto, &
Assis, 2009). El quitosano es biodegradable in vivo debido a la capacidad de
recibir el efecto de la hidrólisis enzimática de los enlaces β (1→4) intervenida por
la enzima lisozima, presente en el organismo humano (Sashiwa et al., 1990;
Shigemasa et al., 1994; Valenzuela & Arias, 2012).
El quitosano es considerado un material biofuncional, posee propiedades
tales como la actividad antimicrobiana, presentando una baja toxicidad DL50= 16
ml/kg se encuentra ubicado en un nivel equivalente al azúcar y menos tóxico que
la sal (Romanazzi, et al, 2002; Valenzuela & Arias, 2012); teniendo afinidad
notable a las proteínas (Ramos-García, et al., 2010), por lo que podría ser una
opción factible para elaborar recubrimientos comestibles y así sustituir
parcialmente los métodos de control de microorganismos (González–Aguilar,
Monroy–García, Goycoolea–Valencia, Díaz–Cinco, & Ayala–Zavala., 2005),
prolongando la vida útil y preservando la calidad de los alimentos frescos.
Goy, Brito & Assis, (2009) destacan las propiedades del quitosano como son
su inocuidad, biodegradabilidad, actividad antimicrobiana, propiedades
emulgentes y acción antipardeante.
26
Los recubrimientos de quitosano presentan un amplio espectro contra
microorganismos patógenos asociados con enfermedades alimentarias que
frecuentemente contaminan alimentos como bacterias del tipo Escherichia coli,
Salmonella, Pseudomonas spp, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus,
entre la primordiales (Mead, 1999; Huang et al., 2012; Valenzuela & Arias,
2012).
1.6. Aceite esencial
Los aceites esenciales también llamados aceites volátiles, son líquidos
oleosos aromáticos obtenidos a partir de material vegetal (Bautista-Baños,
Hernández-Lauzardo, Valle, Bosquez-Molina, & Sánchez, 2005), los que suelen
presentar un aroma agradable, son ampliamente empleados en la industria
alimentaria como saborizantes y condimentos, y en la industrias farmacéutica y
cosmetológica como perfumes y esencias (Ramírez et al., 2009; Ochoa,
Paredes, Bejarano & Silva, 2012), además presentan actividad antimicrobiana y
pueden ser utilizados para controlar el deterioro de los alimentos y el crecimiento
de las bacterias patógenas (Wen-Xian, Avena-Bustillos, Sui Sheng T., &
McHugh, 2011).
Los aceites esenciales son líquidos a temperatura ambiente, insolubles en
agua, solubles en disolventes orgánicos apolares (hexano, éter, etc.), y en
alcoholes de alta graduación. Habitualmente son menos densos que el agua con
excepciones como la esencias de clavo de olor y canela (Kuklinski, 2003).
1.6.1. Composición química
La clasificación de los compuestos de los aceites esenciales son: (Kuklinski,
2003)
Terpenoides: Provienen de la condensación del isopreno
(C5), pueden o no tener oxígeno.
27
o Monoterpenos y sesquiterpenos son hidrocarburos
carentes de oxígeno, son aromáticos o alifáticos.
o Terpenos presentan oxigeno con función alcohol,
fenol, aldehídos, cetonas, éter, ester o peróxido.
No terpenoides:
o Sustancias volátiles alifáticas
o Sustancias volátiles aromáticas
o Sustancias nitrogenadas
o Sustancias con azufre
La actividad antimicrobiana de los aceites esenciales se deben a los
compuestos terpenoides y fenólicos (Wen-Xian, Avena-Bustillos, Sui Sheng T., &
McHugh, 2011) asimismo se le atribuye actividad antifúngica, antiparasitaria, e
incluso insecticida (Arce- Alfonso, 2011).
1.7. Fenoles
Los fenoles o compuestos fenólicos son metabolitos secundarios
ampliamente distribuidos en el reino vegetal, se encuentra unido a estructuras
aromáticas o alifáticas. Estos compuestos participan de diversas funciones, tales
como la asimilación de nutrientes, la síntesis proteica, la actividad enzimática, la
fotosíntesis, la formación de componentes estructurales, la alelopatía y la
defensa ante los factores adversos del ambiente (OFFARM, 2004).
Los compuestos fenólicos desnaturalizan las proteínas de las células
dañando las membranas celulares, dependiendo de la concentración ejecutan
actividad bactericida o bacteriostática, son altamente fungicidas y su actividad se
reduce a pH alcalino (Gonzalez-Carvajal, 2011).
28
1.8. Jengibre
El jengibre (Zingiber officinale) es una planta de la familia zingiberáceas, la
parte aprovechada es el rizoma, conteniendo compuestos volátiles que concede
el olor típico, y no volátiles que aportan propiedades farmacológicas. (Batista
Carmona, Pino Alea, Rodríguez León, Rodríguez Alfonso, & Padrón Palomar,
2003).
1.8.1. Clasificación taxonómica
Reino: Plantae
Orden: Escitamíneas
Familia: Zingiberaceae
Género: Zingiber
Especie: Officinale
1.8.2. Composición química del jengibre
El jengibre presenta oleorresina, que contiene aceite esencial y resina. El
aceite esencial está compuesto por sesquiterpenos en los que destacan α-
zingibereno, arcurcumeno, β-bisaboleno otorgando el aroma. La resina contiene
[6]-gingerol, [6]- shogaol, [Figura II], zingerona, proporcionando el sabor picante
(Acuña & Torres, 2014), y tienen una actividad antioxidante (Chen, Kuo Wu, y
Ho, 1986; Herrmann, 1994, Çoban, 2013). [Tabla III]
29
Figura II. Estructura química de gingerol y shogaol
Fuente: (Cañigueral, 2003)
Tabla III. Composición química del jengibre Componentes Propiedades Referencias
Ole
orr
esin
as
4-7
.5%
Aceite esencial 1.5-3%
Sesquiterpenos
α-zingibereno,
arcurcumeno,
β-bisaboleno
Proporcionan el aroma
(Acuña & Torres, 2014)
(Gómez-Rodríguez,
Cortés Suárez, & Izquierdo-Sánchez,
2013)
Resina
Gingeroles y los sogaoles
6 gingerol
6shogalol
Zingerona
Otorgan la pungencia Actividad
antioxidante
(Acuña & Torres, 2014) (Cañigueral,
2003)
Vitaminas Tiamina, Riboflavina, Niacina, Priridoxina, Vitamina A,
Vitamina C y Vitamina E
(Al-Nahain, Jahan, &
Rahmatullah, 2014)
Otros componentes
almidón, diterpenos,
ácido 6-gingesulfónico
monoacil digalactosil gliceroles.
diarilheptanoides: difenilheptenonas, difenilheptanonoles, difenilheptanodioles y sus acetatos.
(Cañigueral, 2003)
Fuente: Elaboración propia
30
GLOSARIO DE TÉRMINOS
Alelopatía: Es la influencia directa de un compuesto químico liberado por una
planta sobre el desarrollo y crecimiento de otra planta.
Anaerobio facultativo: Bacteria que puede crecer tanto en presencia de
oxigeno como en ausencia.
Antipardeamiento: Inhibición del ennegrecimiento en la superficie de los
alimentos.
Bactericida: Sustancia que causa muerte a la bacteria.
Bacteriostático: Sustancia que inhibe el crecimiento bacteriano.
Biodegradable: Producto o sustancias que puede descomponerse de manera
natural como sol, agua, bacterias, plantas, animales, preservando el medio
ambiente.
Biopolímeros: Macromoléculas presente en los seres vivos.
Desacetilación: Pérdida del radical acetil de la cadena madre.
31
Descomposición: Alteración de la composición inicial de la materia orgánica por
diversos factores.
DL50: Dosis letal 50 es la cantidad de un material determinado completo de una
sola vez, que provoca la muerte del 50% (una mitad) de un grupo de animales de
prueba. El DL50 es una forma de medir el envenenamiento potencial a corto
plazo (toxicidad aguda) de un material.
Enterotoxina: Toxina producida por algunas bacterias.
Estructura alifático: Estructura molecular orgánica de cadena abierta.
Estructura aromática: Derivado del benceno, cíclico insaturado.
Exoesqueleto: Piel dura que protege y cubre el cuerpo de los invertebrados.
Hidrófobo: Molécula que ejerce repulsión ante el agua.
Hidrófilo: Molécula con afinidad al agua.
Hidrólisis enzimática: Rompimiento de moléculas de agua originado por la
acción de una enzima.
32
Infección: Causado por un agente patógeno, que invade y se multiplica dentro
del organismo.
Intoxicación alimentaria: Es un síndrome que resulta de la ingestión de
alimentos contaminados con micro-organismos, toxinas microbianas o
sustancias químicas.
Micotoxinas: son sustancias producidas por ciertos hongos pertenecientes
principalmente a los géneros Aspergillus, Fusarium y Penicillium. Son altamente
tóxicos, producen mutaciones (mutágenos), producen cáncer (cancerígenos),
malformaciones en los fetos (teratógenos) y disminuyen la inmunidad
(inmunosupresores). Debido a su gran variedad de efectos tóxicos, y sobre todo
a su extrema resistencia al calor (termorresistencia), la presencia de las
micotoxinas en los alimentos es considerada de alto riesgo para la salud humana
y de los animales.
pka: Constante de disociación ácida, es la fuerza que tienen las moléculas de
disociarse.
Polímero: Son macromoléculas orgánicas formadas por la unión de monómeros.
Polisacárido: Son moléculas, formados por la unión de muchas moléculas de
monosacáridos entre sí.
33
Propiedades emulgentes: Es una sustancia que ayuda en la mezcla de dos
sustancias poco miscibles o difíciles de mezclar, originando así una emulsión.
Septicemia: Es una infección sistémica, causa muertes en pacientes
inmunodeprimidos y con enfermedades críticas.
Sinergismo: Aquella interacción que da con resultado efectos combinados con
la administración de dos o más fármacos que resulta ser mayores que aquellos
que podrían haberse alcanzado con la administración de uno solo.
34
CAPÍTULO II
METODOLOGÍA
2.1. MÉTODOS CIENTÍFICOS EMPLEADOS EN LA INVESTIGACIÓN
MÉTODO CIENTÍFICO:
Análisis - Síntesis: El estudio de las bases científicas y técnicas de cada uno
de los materiales y los resultados de los experimentos propuestas en esta
investigación, permitirán escoger las mezclas con mejor actividad antimicrobiana
frente a los microorganismos objeto de este estudio.
Inducción - Deducción: La revisión de los referentes teóricos permitirá al
investigador escoger las concentraciones utilizadas en los experimentos
propuestos en esta investigación. Los datos obtenidos durante la investigación
permitirán deducir cuál o cuáles serán las mejores mezclas de disoluciones
formadoras de coberturas comestibles de quitosano y extractos hidroalcohólico
de jengibre y su aplicación en posteriores procesos productivos.
MÉTODOS EMPÍRICOS:
Observación: para comprobar la presencia visible de crecimiento microbiano
sobre los productos sometidos a la prueba de reto, la presencia de halo de
inhibición y los indicadores sensoriales de deterioro.
35
MÉTODOS ESTADÍSTICOS
A todos los resultados obtenidos se les aplicará la estadística descriptiva para
evaluar media y desviación estándar y cuando sea pertinente se utilizarán
técnicas de correlación, regresión y análisis de varianza (ANOVA).
36
2.2. METODOLOGÍA
Tema de investigación
Planteamiento del tema
Hipótesis
Desarrollo de la metodologia
Recolección y preparación de
muestras
Extracción por percolación,
maceración, soxleth en concentraciones
diferentes
Concentración en rotavapor
Prueba de identificación de
fenoles
Determinación antimicrobiana del
extracto hidroalcohólico
Preparación de Soluciones
formadoras de recubrimientos
comestibles
Demostración de actividad
antimicrobiana de soluciones
formadoras de recubrimientos
comestibles
Tabulación de datos
Revisión de informe final
Entrega de informe final
37
2.3. TIPO DE INVESTIGACIÓN
La investigación es de carácter Exploratoria, Correlacional
2.4. DISEÑO EXPERIMENTAL DE LA INVESTIGACIÓN
Diseños factoriales:
Para la selección del método de extracción se trabajó con un diseño factorial
32 en el cual se utilizaron como variables independientes la concentración de
disolvente, y el método de extracción. Estos aspectos se detallan en el numeral
2.7.
2.5. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS
Materiales
o Fundas estériles.
o Cuchillos estériles.
o Rallador estéril.
o Percoladores
o Aparato de extracción Soxhlet
o Vasos de precipitación
o Soporte universal
o Balones de 500 ml – 250 ml
o Probetas
o Pipetas volumétricas
o Papel filtro Whatman
o Pipetas automáticas
38
o Puntas de 100 ul, 500 ul
o Tubos de ensayo
o Matraz aforado de 100 ml
o Tubos Eppendorf de 50 ml
o Cubeta de cuarzo 10mm
o Cajas Petri desechables
o Asa calibrada
o Mechero Bunsen
o Algodón
o Probetas
Equipos
o Balanza analítica
o Rotaevaporador
o Espectrofotómetro UV-VIS
o Incubadora
o Vortex
Reactivos:
o Agua destilada
o Alcohol 98°
o Carbonato de Sodio [Solución 20%]
o Acido Gálico (QP)
o Reactivo Folin Ciocalteu
o Agua Tipo I
o Agar Muller Hinton
o SO4H2 [Solución al 1%]
o Cl2Ba 1%
39
PROCEDIMIENTOS
2.6. RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL
Se empleó como materia prima el rizoma del jengibre, obtenido en un
supermercado de la ciudad de Guayaquil. Se ejecutaron los siguientes
procedimientos previos, con el propósito de acondicionar la materia prima para el
proceso de extracción.
Limpieza. Se eliminó la tierra adherida o cualquier material extraño, con
abundante agua potable y se utilizaron cuchillos de acero inoxidables con el
objetivo de apartar las escamas que cubren el rizoma.
Cortado. Se desmenuzó el jengibre de manera manual con un rallador, para
facilitar que la solución hidroalcohólica penetrara el tejido del jengibre y extraer
los metabolitos que en él se encuentran.
2.7. TÉCNICA DE EXTRACCIÓN POR PERCOLACIÓN,
MACERACION Y SOXHLET CON ETANOL A TRES
CONCENTRACIONES DIFERENTES (50%, 70%, 90%)
2.7.1. Extracción por Percolación
Se utilizó un percolador con capacidad de 500 ml, en la punta del cual se
colocó un pedazo de algodón, de manera que sirva de filtro, cubierto con un
40
papel de filtro de forma circular, En el interior del percolador se colocaron
aproximadamente 250 g de jengibre los que fueron cubiertos con la
correspondiente solución hidroalcohólica hasta llenar el percolador cuya punta
se tapó con un tapón plástico para evitar la salida del disolvente
Cada percolador fue identificado y se lo dejó en reposo por 24 horas,
después de lo cual se retiraba el tapón de plástico dejando gotear hasta que
saliera todo el disolvente. El disolvente fue reincorporado en el percolador y se
repitió esta operación cuatro veces.
2.7.2. Extracción por Maceración
Se colocaron 250 g del material vegetal en balones de 500 ml a los que se
cubrió con solución hidroalcohólica (50%, 70%, 90%) respectivamente y se selló
con tapón plástico para evitar la evaporación del alcohol, al cabo de cuatro días
se retiró el disolvente con los metabolitos extraídos, para continuar con el
proceso de rotaevaporación.
2.7.3. Extracción Soxhlet
Tres muestras vegetales (20 g), puestas en dedales de papel, fueron
sometidos a extracción por soxhlet durante 2 horas, empleando concentraciones
diferentes de alcohol (50%, 70%, 90%) respectivamente.
41
2.7.4. Concentración en Rotaevaporador
Este aparato proporciona las condiciones adecuadas para eliminar el
disolvente en el proceso de concentración. Se colocaron en el balón del
rotaevaporador los diferentes extractos obtenidos y se procedió a concentrarlos
a la temperatura de 45°C ± 1ºC en baño termostático, empleando presión
reducida de 100 mBar.
2.8. Pruebas de Identificación de Fenoles Totales por método de Folin
Ciocalteu
Se ejecutó la prueba de fenoles totales a los 9 extractos obtenidos, para ellos
se realizó una dilución 1:10 de los extractos alcohólicos para tener una
concentración cuantificable, la dilución se la realizó con agua Tipo I, debido a
que el etanol presentaba interferencia con los reactivos del método de Folin
Ciocalteu creando un precipitado abundante de color blanco que no posibilitaba
la lectura de las muestras a espectrofotómetro.
Se utilizaron 100 μl de cada muestra y de la solución patrón respectivamente,
y se agregan a cada tubo 200 μl de reactivo de Folin Ciocalteu, se agitó y se
dejó reposar por 5 min, adicionando 1000 μl de solución de carbonato de sodio
al 20%. Después de 90 minutos se leyó la absorbancia de cada solución a una
longitud de onda 760 nm y se comparó contra una curva de calibración.
42
Preparación de la curva de calibración.
De una disolución de 1010 ppm de estándar de ácido gálico, se tomaron
alícuotas de 100, 200, 400 y 800 uL llevándolo a volumen final de 10 ml,
obteniendo así concentraciones teóricas de 10,1; 20,2; 40,4 y 80,8 ppm.
2.9. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
Para la determinación antimicrobiana se usaron las bacterias Salmonella
typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 25922, Estafilococo aureus
ATCC 15923, y Listeria monocytogenes ATCC 19118.
2.9.1. Técnica de difusión de disco en agar
Para la evaluación de la actividad antimicrobiana de los distintos extractos
obtenidos, se empleó la técnica de difusión en agar, se inocularon los
microorganismos en tubos con medio agar Mueller Hinton previamente fundido y
mantenido a 45 oC, ajustando las concentraciones a la turbidez 0,5 en la escala
Mc Farland (1.5x106 UFC/m), y se vertió el contenido del tubo en una placa Petri
con Agar Müeller-Hinton.
Posteriormente, los medios de cultivos inoculados se incubaron a 37°C
durante 24 horas, y transcurrido este tiempo se realizaron las lecturas de los
halos de inhibición. Todos los ensayos se realizaron por duplicado.
43
2.10. PREPARACIÓN DE LA SOLUCION FORMADORA DE
RECUBRIMIENTOS COMESTIBLES.
Se preparó la solución de quitosano al 5% (p/v) con agua, homogenizando
por 30 min a 1000 rpm en un homogeneizador. Posteriormente, se adicionó
glicerol (0,75 % v/v) y se homogenizó por 10 min. Con un potenciómetro
calibrado se ajustó a pH 5 con NaOH 0.1N.
Una vez obtenida la solución de quitosano se le incorporó extracto
hidroalcohólico de jengibre para obtener concentraciones del 10%, 15% y 25%
Todos los ensayos se realizaron por duplicado.
44
CAPÍTULO III
RECOLECCIÓN DE DATOS.
La obtención de datos se basó en:
Pruebas de Identificación de Fenoles Totales por método de Folin-
Ciocalteu, utilizada para medir capacidad la antioxidante y en relación a
ella la capacidad antimicrobiana, con el fin de tomar el extracto con
mayor cantidad de recuperación de fenoles.
Análisis Estadísticos a todos los resultados obtenidos para evaluar
media, desviación estándar y análisis de varianza (ANOVA), para
determinar el mejor método de extracción para continuar con el proceso
de determinación de la inhibición microbiana.
Demostración de la actividad antimicrobiana por medio de la técnica de
difusión de disco en agar con cepas ATCC sembrando masivamente en
agar Mueller Hinton para cada microorganismo, logrando así obtener un
dato de la existencia o no de inhibición otorgada por el recubrimiento
comestible frente a las diferentes cepas ATCC utilizadas.
45
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Compuestos fenólicos
Tabla IV. Curva patrón de ácido gálico
Nivel de Calibración
Conc. de ácido gálico (ppm)
Absorbancia
(nm)
1 10,1 0,058
2 20,2 0,126
3 40,4 0,219
4 80,8 0,398
Gráfico I. Curva de calibración para fenoles totales
Fuente: Elaboración propia
En el Gráfico I se observan las concentraciones de ácido gálico en la curva
estándar. Como puede apreciarse el coeficiente de determinación es muy
elevado, indicando que la ecuación obtenida explica más del 99% de los valores
observados.
y = 211,63x - 4,5034 R² = 0,9957
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45
Co
nce
ntr
ació
n (
pp
m)
Absorbancia (nm)
46
Tabla V. Promedios y desviaciones estándares de los métodos de extracción con sus concentraciones hidroalcohólicas.
Nota: Sox: Soxhlet, Mac: Maceración, Per: Percolación. Fuente: Elaboración
propia
Tabla VI Análisis de varianza para efecto de dos factores
Origen Suma de cuadrados
tipo III
gl Media cuadrática
F Sig.
MÉTODO 18308452,139 2 9154226,070 65,982 ,000 CONCENTRACIÓN 9364414,786 2 4682207,393 33,749 ,000 METODO * CONC 6443063,452 4 1610765,863 11,610 ,001
Error 1248641,888 9 138737,988
Total 61007922,417 18
Total corregida 35364572,265 17
Nota: R cuadrado = ,965 (R cuadrado corregida = ,933). Fuente: Elaboración propia
MÉTODO CONC Media Desviación típica N
Sox 90 4448,8350 1032,53854 2
70 2300,8200 ,00000 2
50 935,8150 284,32057 2
Total 2561,8233 1654,85055 6
Mac 90 1888,1400 14,96238 2
70 406,7450 164,60739 2
50 279,7700 194,53922 2
Total 858,2183 807,89895 6
Per 90 216,2850 134,68263 2
70 16,5050 14,96945 2
50 249,2950 134,68263 2
Total 160,6950 141,39649 6
Total 90 2184,4200 1962,76968 6
70 908,0233 1095,37707 6
50 488,2933 384,33807 6
Total 1193,5789 1442,31375 18
47
En la tabla VI se observa que el nivel de significación para los factores
(Método -Concentración hidroalcohólica) y de la interacción es menor a 0.05, es
decir, existen diferencias significativas de las concentraciones de compuestos
fenólicos dependiendo del tipo de método y del grado de concentración
alcohólica.
Tabla VII. Comparación de medias por test de Duncan para distintos métodos de extracción
MÉTODO N Subconjunto
1 2 3 Percolación 6 160,6950
Maceración 6 858,2183
Soxhlet 6 2561,8233
Sig. 1,000 1,000 1,000
Fuente: Elaboración propia
En la tabla VII se muestran las comparaciones de los métodos de extracción
por el test de Duncan, la cual indica que el promedio del método de Soxhlet es
significativamente superior al observado frente a la maceración y percolación, sin
embargo, el método de extracción por maceración presenta un mayor
rendimiento de compuestos fenólicos en comparación con el método por
percolación.
Tabla VIII. Pruebas de comparación por test de Duncan para las distintas
concentraciones de extractos hidroalcohólicos
CONC N Subconjunto 1 2
50º 6 488,2933
70º 6 908,0233
90º 6 2184,4200
Sig. ,083 1,000
Fuente: Elaboración propia
48
La prueba de comparación de medias por el test de Duncan para las
diferentes concentraciones de extracción, demuestra que las
concentraciones de 50 y 60º presentar menor contenido de compuestos
fenólicos, sin embargo las concentraciones al 90º muestran mejor
recuperación de compuestos.
Gráfico II. Compuestos fenólicos
Fuente: Elaboración propia
El Gráfico II nos indica que el mejor método de extracción es Soxhlet, sin
embargo este no fue seleccionado debido a que la temperatura empleada puede
inducir transformaciones de alguno de los componentes extraídos (degradación
térmica y oxidativa) (Reyes et al, 2011); por lo cual se decidió utilizar el siguiente
mejor método que fue maceración al 90º.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
Soxhlet Maceración Percolación
Co
nce
ntr
ació
n
de
co
mp
ue
sto
s fe
no
lico
s
Concentración hidroalcoholica
Métodos
90
70
50
49
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS
Tabla IX Códigos de las concentraciones de extracto hidroalcohólico
Réplica Concentraciones (% p/v)
0,0 25% 15% 10%
1 J01 J11 J21 J31
2 J02 J12 J22 J32
Fuente: Elaboración propia
Tabla X. Tamaño de halo de inhibición (mm) del extracto de jengibre
Extractos S. aureus E. coli S. typhimurium L. monocytogenes
J01 - 13 11 -
J02 - 12 9 -
J11 - 10 - -
J12 - 10 - -
J21 - 9 - -
J22 - 9 - -
J31 - 6 - -
J32 - 6 - -
Fuente: Elaboración propia
Como se observa en la Tabla X mediante el diámetro de inhibición, el extracto
hidroalcohólico de jengibre presenta mayor efectividad frente a E. coli.
50
Tabla XI. Análisis de varianza para E. coli frente al extracto hidroalcohólico Maceración 90º
Origen Tipo III de suma de
cuadrados
gl Cuadrático promedio
F Sig.
Concentraciones 43,375 3 14,458 115,667 ,000
Error ,500 4 ,125
Total 747,000 8
Total corregido 43,875 7
Nota: R al cuadrado = ,989 (R al cuadrado ajustada = ,980. Fuente: Elaboración propia
La tabla XI muestra que el nivel de significación es menor a 0.05, es decir,
existe diferencia significativa de los halos de inhibición entre la E.coli y el
extracto hidroalcohólico de jengibre por maceración al 90º.
51
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LAS SOLUCIONES FORMADORAS
DE RECUBRIMIENTO
Tabla XII Códigos de las concentraciones de extracto hidroalcohólico
Concentraciones (% p/v)
Extractos de Jengibre
Material Replica 0,0% 25% 15% 10%
Quitosano 5%
1 QJ01 QJ11 QJ21 QJ31
2 QJ02 QJ12 QJ22 QJ32
Fuente: Elaboración propia
Tabla XIII. Tamaño del halo de inhibición (mm) de la solución formadora de recubrimiento.
Extracto+ Quitosano
S. aureus E.coli S. typhimurium L. monocytogenes
QJ01 13 11 14 13 QJ02 13 11 14 14 QJ11 7 6 8 13 QJ12 7 6 6 9 QJ21 7 8 9 12 QJ22 9 8 10 8 QJ31 10 10 12 14 QJ32 10 10 10 10
Fuente: Elaboración propia
Tabla XIV. Análisis de varianza para E. coli
Origen Tipo III de
suma de
cuadrados
gl Cuadrático
promedio
F Sig.
Concentraciones 157,375 3 52,458 419,667 ,000
Error ,500 4 ,125
Total 593,000 8
Total corregido 157,875 7
Nota: R al cuadrado = ,997 (R al cuadrado ajustada = ,994). Fuente: Elaboración propia.
52
La tabla XIV muestra que el nivel de significación es menor a 0.05, es decir,
existe diferencia significativa de los halos de inhibición de crecimiento de la E.coli
para las diferentes soluciones de recubrimiento.
Al realizar la prueba de Rangos Múltiples de Duncan se obtuvieron los
resultados mostrados en la Tabla XV.
Concentraciones N Subconjunto 1 2 3 4
25% 2 6,0000
15% 2 8,0000
10% 2 10,0000 0% 2 11,5000 Sig. 1,000 1,000 1,000 1,000
Fuente: Elaboración propia
Como se puede apreciar el halo de inhibición del crecimiento es mayor a
medida que disminuye la concentración del extracto hidroalcohólico, indicando
que este ejerce una acción contraria al efecto inhibidor el quitosano.
Tabla XVI. Análisis de varianza para Listeria Monocytogenes
Origen Tipo III de suma de
cuadrados
gl Cuadrático promedio
F Sig.
Concentraciones 17,500 3 5,833 ,729 ,586
Error 32,000 4 8,000
Total 1154,000 8
Total corregido 49,500 7
Nota: R al cuadrado = ,354 (R al cuadrado ajustada = -,131). Fuente: Elaboración propia.
La tabla XVI muestra que el nivel de significación es mayor a 0.05, es decir,
no existe diferencia significativa de los halos de inhibición de crecimiento de la
Listeria monocytogenes para las diferentes soluciones de recubrimiento. Es decir
los valores observados no dependen de la adición o no del extracto
hidroalcohólico de jengibre.
53
Tabla XVII. Análisis de varianza para Salmonella typhimurium
Origen Tipo III de suma de cuadrados
gl Cuadrático promedio
F Sig.
Concentraciones 44,500 3 14,833 11,867 ,018
Error 5,000 4 1,250
Total 890,000 8
Total corregido 49,500 7
Nota: R al cuadrado = ,899 (R al cuadrado ajustada = ,823). Fuente:
Elaboración propia
La tabla XVII muestra un efecto significativo de la solución formadora de
recubrimiento sobre el halo de inhibición del crecimiento de Salmonella
typhimurium.
Al realizar la prueba de rangos múltiples de Duncan se encontraron los
resultados que se muestran en la Tabla XVIII.
Concentraciones N Subconjunto
1 2 3
25% 2 7,0000
15% 2 9,5000 9,5000
10% 2 11,0000 11,0000 0% 2 13,5000 Sig. ,089 ,251 ,089
Fuente: Elaboración propia
Estos resultados muestran que a medida que se incrementa la concentración
del extracto hidroalcohólico, disminuye el halo de inhibición del crecimiento.
Tabla XIX. Análisis de varianza para Staphylococcus aureus
Origen Tipo III de
suma de
cuadrados
gl Cuadrático
promedio
F Sig.
Concentraciones 35,375 3 11,792 18,867 ,008
Error 2,500 4 ,625
Total 741,000 8
54
Total corregido 37,875 7
Nota: R al cuadrado = ,934 (R al cuadrado ajustada = ,884).Fuente: Elaboración propia
La tabla XIX muestra un efecto significativo de la concentración de la solución
formadora de recubrimiento sobre el halo de inhibición del crecimiento de S.
aureus.
Al realizar la prueba de rangos múltiples de Duncan se encontraron los
resultados que se muestran en la Tabla XX los que indican que a medida que se
incrementa la concentración del extracto hidroalcohólico, disminuye el halo de
inhibición del crecimiento.
Concentraciones N Subconjunto
1 2 3
25% 2 7,0000
15% 2 8,0000 8,0000
10% 2 10,0000 0% 2 12,5000 Sig. ,275 ,065 1,000
Fuente: Elaboración propia
Los resultados encontrados para Salmonella typhimurium y Staphylococcus
aureus muestran que para estos microorganismos, la incorporación del extracto
hidroalcohólico, equivale a una dilución del quitosano, el cual es el único
responsable de la inhibición del crecimiento observada.
55
CONCLUSIONES
Se eligió el método de Maceración como método de extracción para
obtener el extracto hidroalcohólico a ser usado en la formulación final de
la solución formadora de recubrimiento.
Dentro de las cepas bacterianas estudiadas, el extracto hidroalcohólico
solo fue efectivo para inhibir el crecimiento de la cepa de Escherichia coli
ATCC 25922.
56
RECOMENDACIONES
Para futuros estudios, podrían emplearse otros tipos de solventes como
medio de extracción, para mejorar la recuperación de compuestos
fenólicos del jengibre.
En este estudio se realizaron pruebas con Staphylococcus aureus,
Listeria monocytogenes, E. coli y Salmonella typhimurium; se recomienda
para futuros estudios utilizar otros tipos de bacterias y hongos.
Se debería estudiar el uso de concentraciones diferentes a las utilizadas
en esta investigación, tanto de extracto hidroalcohólico de jengibre como
de quitosano para la formulación final de solución formadora de
recubrimiento comestible.
57
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ANEXOS
ANEXO 1
MÉTODOS DE EXTRACCIÓN
Figura III. EXTRACCIÓN POR SOXHLET
66
Figura IV. EXTRACCIÓN POR MACERACIÓN
Figura V. EXTRACCIÓN POR PERCOLACIÓN
67
ANEXO 2
CONCENTRACIÓN DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO
Figura VI. ROTAEVAPORACIÓN
ANEXO 3
IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS
Figura VII. REACTVO DE FOLIN- CIOCALTEU
68
Figura VIII. PRUEBA DE FOLIN-CIOCALTEU
Figura IX. LECTURA ESPECTROFOTOMETRICA A 760NM
69
ANEXO 4
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS
Figura X. E. Coli
70
Figura XI. Salmonella typhimurium
Figura XII. Staphylococcus aureus
71
Figura XIII. Listeria monocytogenes
ANEXO 5
PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN FORMADORA DE
RECUBRIMIENTO
Figura XIV. PREPARACIÓN DEL QUITOSANO
72
ANEXO 6
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LAS SOLUCIONES FORMADORAS
Figura XV. INOCULACIÓN DEL MICROORGANISMO
73
Figura XVI. INCORPORACIÓN DE SOLUCIONES FORMADORAS
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
Figura XVII. E. coli
74
Figura XVIII. S. typhimurium
Figura XIX. S. aureus
75
Figura XX. L. monocytogenes
76
ANEXO 7
Figura XXI. SEGUNDA ETAPA DE CONCURSO “GALARDONES NACIONALES 2015” PROMOVIDO POR LA SENECYT.
77
78
Figura XXII. TERCERA ETAPA DE CONCURSO FINALES DE “GALARDONES NACIONALES 2015” PROMOVIDO POR LA SENECYT.
79