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UNIVERSIDAD DE GUANAJUATO CAMPUS GUANAJUATO
DIVISIÓN DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
“SISTEMA MULTIVALENTE PARA TERAPIA DE
LINFOMAS NO-HODKING BASADO EN Anti-CD20
CONJUGADO A NANOPARTÍCULAS DE ORO”
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:
QUÍMICO
PRESENTA:
ROSALBA MONTSERRAT MIRANDA OLVERA
ASESOR EXTERNO:
DRA. EN C. BLANCA ELÍ OCAMPO GARCÍA
ASESOR INTERNO:
DRA. YOLANDA ALCARAZ CONTRERAS
GUANAJUATO, GTO. JUNIO DEL 2014.
“SISTEMA MULTIVALENTE PARA TERAPIA DE LINFOMAS NO-HODKING BASADO EN
Anti-CD20 CONJUGADO A NANOPARTÍCULAS DE ORO”
El presente trabajo fue desarrollado en el Laboratorio de Investigación y desarrollo
de Radiofármacos, adscrito a la Gerencia de Aplicaciones Nucleares en la Salud
del Departamento de Materiales Radiactivos con financiamiento de los
proyectos: AS-101 y AS-402
Miembros del Jurado del Examen Profesional que para obtener el título de
químico presenta la C. Rosalba Montserrat Miranda Olvera, con el trabajo
titulado:
“SISTEMA MULTIVALENTE PARA TERAPIA DE LINFOMAS NO-HODKING BASADO EN
Anti-CD20 CONJUGADO A NANOPARTÍCULAS DE ORO”
_______________________________
Dr. Juvencio Robles García
Presidente
_______________________________
Dr. Miguel Ángel Vázquez Guevara
Secretario
_______________________________
Dra. Minerva Martínez Alfaro
Vocal
Guanajuato, Gto., Junio del 2014.
“La paciencia es un árbol de raíz amarga pero de frutos muy
dulces”
- Proverbio Persa
Dedicado con todo mi cariño y amor:
A la memoria de mi padre J. Asunción Miranda (†),
a mi madre: Rosa María Olvera y a mis hermanos:
Macrina, Alma, Hilda, Horacio, Janet.
AGRADECIMIENTOS
Cualquiera que hayan sido nuestros logros, alguien nos ayudó siempre a alcanzarlos.
Althea Gibson
Agradezco de una manera muy especial y sincera a la Dra. Blanca Ocampo por
aceptarme para realizar mi trabajo de tesis de licenciatura bajo su dirección. Su apoyo,
disponibilidad, orientación y conocimiento han sido un aporte invaluable, no solamente
en el trabajo que hemos realizado juntas, sino también en mi formación profesional.
Asimismo, agradezco a la Dra. Guillermina Ferro, por haber permitido mi incorporación a
su excelente grupo de trabajo y por su importante aporte y participación activa en el
desarrollo de la tesis, no cabe duda que su participación ha enriquecido el trabajo
realizado. A la Dra. Leticia Santos por haber participado con oportunos consejos y ayuda
en el desarrollo de la tesis. Y por supuesto agradezco a la Dra. Erika Azorín, Myrna, Noé,
Lidia, Fátima, Lili, Mauricio y Nayelli, por todas sus aportaciones ya sea leyendo, opinando,
dando ánimo, acompañándome en los momentos de crisis y en los momentos de
felicidad. En general a todo el grupo del laboratorio de investigación y desarrollo de
radiofármacos, muchas gracias por su amistad y compañerismo, son excelentes personas.
También quiero expresar un sincero agradecimiento a mi asesora en la División de
Ciencias Naturales, la Dra. Yolanda Alcaraz, por el apoyo incondicional que me brindó
desde el momento de ser mi asesora. A mis sinodales, Dr. Juvencio Robles, Dr. Miguel
Ángel Vázquez y la Dra. Minerva Martínez, por si disponibilidad y oportunas correcciones y
aportaciones.
A mi alma máter, la Universidad de Guanajuato, por albergarme por cinco años
nutriéndome de conocimientos y consolidando los valores que fundamentan mi
crecimiento personal y profesional.
Y finalmente agradezco a las personas que más amo, mi familia. Papá, yo sé que
también estás disfrutando de este logro, con tu ejemplo me enseñaste que todo se puede
obtener con perseverancia, trabajo y responsabilidad. Mamá, con tu incondicional
amistad, cariño, consejos y amor has hecho mi camino más fácil de lo que realmente es.
Alma Delia, a ti hermana, no encuentro palabras para agradecerte todo lo que has
aportado a mi formación personal y académica, solo me queda decirte que toda la vida
estaré agradecida contigo. Mis hermanos y mejores amigos Macrina, Hilda, Horacio, Janet
y Nacho, les agradezco todo su apoyo, yo siendo la más joven soy afortunada por tener
hermanos tan trabajadores, inteligentes y con una filosofía de vida tan alegre. Christopher,
gracias por tu amor, amistad, comprensión, consejos y por estar incondicionalmente a mi
lado en los buenos y malos momentos. Este logro también es de ustedes, los amo mucho.
ABSTRACT
ABSTRACT
In recent publications [1] has been reported that gold nanoparticles have an effect
in reducing the expression of the oncogene Bcl -2 and have a high biocompatibility , this is
the importance for using gold nanoparticles for this work. The antibody CD20 is an antibody
that specifically binds to that overexpressed CD20 antigen on the cell membrane of B
lymphoma cell non- Hodgkin (cell line Raji) behold the importance of combining this
biomolecule to gold nanoparticles since they have a high specificity with CD20 positive
cells , also to carry out the antigen- antibody immunological reactions triggered mediating
cell lysis, possibly by cytotoxicity and apoptosis. Therefore, this system must have
characteristics of both components to eliminate B cell non- Hodgkin lymphoma.
In this work it was studied a multivalent system composed of gold nanoparticles and
anti-CD20 antibody, the term multivalency refers to the number of biomolecules attached
to the surface of the gold nanoparticle. The synthesis and characterization of the gold
nanoparticles and the multivalent system was performed and the effect of the multivalent
system on the expression of oncogene Bcl-2 (group of proteins associated with the
apoptotic pathway) was evaluated.
Characterization of raw materials and the multivalent system was performed using
spectroscopic and microscopic techniques, this to verify structural changes in raw
materials and thus confirm the formation of CD20 binding to the surface of the
nanoparticle gold by the bond between gold and sulfur in the cysteines of CD20. Taking
advantage that the metal nanoparticles have the optical property of surface plasmon
resonance, the absorption of gold nanoparticles was measured on the UV-Vis as it is
affected by the surface molecules bind to it, showing a bathochromic displacement
effected. The hydrodynamic diameter of the gold nanoparticles was measured to verify
that the antibody is bound to the surface; this evidence was complemented by
micrographs obtained by transmission electron microscopy.
RESUMEN
RESUMEN
En recientes publicaciones se ha reportado que las nanopartículas de oro tienen
un efecto en la disminución de la expresión del oncogen Bcl-2 [1] y presentan una alta
biocompatibilidad; ésta es la importancia de utilizar nanopartículas de oro para este
trabajo. El anticuerpo antiCD20, es un anticuerpo que se une específicamente al antígeno
CD20 que se sobre-expresa en la membrana celular de células B de linfoma no-Hodking
(línea celular Raji); he aquí la importancia de conjugar ésta biomolécula a las
nanopartículas de oro, ya que tienen una alta especificidad con células CD20 positivas,
asimismo al llevar a cabo la reacción antígeno-anticuerpo desencadena reacciones
inmunológicas mediadoras de la lisis celular; posiblemente mediante citotoxicidad y
apoptosis. Por lo tanto, este sistema debe presentar características de ambos
componentes para erradicar las células B de linfoma no-Hodking.
En este trabajo se estudió un sistema multivalente compuesto por nanopartículas
de oro y el anticuerpo antiCD20, cabe aclarar que el término de multivalencia empleado
se refiere al número de biomoléculas acopladas a la superficie de la nanopartícula de
oro. Se realizó la síntesis y caracterización de las nanopartículas de oro, así como del
sistema multivalente, finalmente se evaluó el efecto que tiene el sistema multivalente
sobre la expresión del oncogen Bcl-2 (grupo de proteínas asociadas con la ruta
apoptótica).
La caracterización de las materias primas y del sistema multivalente se realizó
haciendo uso de técnicas espectroscópicas y microscópicas, ésto para verificar cambios
estructurales en las materias primas y así confirmar la formación de la unión del antiCD20
a la superficie de la nanopartícula de oro mediante el enlace entre el oro y el azufre
presente en las cisteínas del antiCD20; asimismo, aprovechando que las nanopartículas
metálicas poseen la propiedad óptica de resonancia del plasmón de superficie, se midió
la absorción de las nanopartículas de oro en la región UV-Vis, ya que se ve afectada al
introducir moléculas a su superficie efectuándose un desplazamiento batocrómico. El
diámetro hidrodinámico de las nanopartículas de oro se midió para comprobar que el
anticuerpo se encuentra unido a la superficie, complementando esta evidencia con
micrografías obtenidas por microscopia electrónica de transmisión.
CONTENIDO
CONTENIDO
ABSTRACT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
RESUMEN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
CONTENIDO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
ÍNDICE DE FIGURAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
ÍNDICE DE TABLAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
ABREVIACIONES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
INTRODUCCIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
OBJETIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1. MARCO TEÓRICO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.1 CÁNCER. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.1.1 Patología. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.2 LINFOMA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.2.1 Linfoma no Hodking. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.2.1.1 Principales tipos de Linfoma no Hodking. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.2.1.2 Síntomas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.2.1.3 Tratamiento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.3 LÍNEA CELULAR RAJI. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
1.3.1 Bcl-2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
1.4 AntiCD20 (anti cluster differentiation 20) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
1.4.1 Anticuerpo monoclonal quimérico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
1.4.2 Monografía del anticuerpo monoclonal antiCD20 Mabthera ®. . . . . . . . . . . . . 23
1.4.3 Propiedades y efectos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
1.4.3 Mecanismo de acción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1.5 NANOPARTÍCULAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1.5.1 Propiedades fisicoquímicas del oro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
1.5.2 Estabilidad química de las nanopartículas de oro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
1.5.3 Propiedades ópticas de las nanopartículas de oro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
1.5.4 Síntesis de nanopartículas de oro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
1.5.5 Nanopartículas de oro y sus aplicaciones biológicas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
1.5.6 Mecanismos de captación de nanopartículas de oro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
1.5.6.1 Captación pasiva por aumento en la permeación y retención (EPR) . . 31
1.5.6.2 Captación activa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
1.5.6.3 Toxicidad de nanopartículas de oro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
1.5.7 Caracterización de nanopartículas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
1.5.7.1 Espectrofotometría de UV-Vis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
1.5.7.2 Espectroscopía de infrarrojo por transformada de Fourier. . . . . . . . . . . . 35
CONTENIDO
1.5.7.3 Microscopía electrónica de transmisión (TEM). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
1.5.7.4 Espectroscopía de correlación de fotones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
1.6 SISTEMAS MULTIVALENTES COMO TERAPIA DE BLANCOS MOLECULARES. . . . 38
1.7 RADIOMARCADO DE BIOMOLÉCULAS CON METALES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
1.7.1 Marcaje Directo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
1.7.2 Marcaje Indirecto. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
1.7.3 Cromatografía. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
1.7.3.1 Cromatografía de líquidos de alta resolución. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2 MARCO METODOLÓGICO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.1 EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.1.1 Equipo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.1.2 Materiales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.1.3 Reactivos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.1.4 Material biológico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.2 SÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS DE ORO DE GRADO FARMACÉUTICO. . . . . . . 44
2.3 FUNCIONALIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE ORO CON AntiCD20. . . . . . . 45
2.4 CARACTERIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE ORO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
2.4.1 Espectrofotometría UV-Vis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
2.4.2 Espectroscopía de Infrarrojo por transformada de Fourier (FT-IR) . . . . . . . . . . . . 46
2.4.3 Microscopía electrónica de transmisión. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.4.4 Análisis de tamaño de partícula y potencial Z. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.4.5 Cuantificación de grupos sulfhidrilo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.4.6 Cuantificación de proteína. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
2.5 RADIOMARCADO DEL COMPLEJO AuNP-AntiCD20 CON 99mTc. . . . . . . . . . . . 48
2.6 ESTUDIOS in vitro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.6.1 Prueba de estabilidad en suero. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.6.2 Cultivo celular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 2.6.3 Efecto del complejo AuNP-AntiCD20 sobre la expresión del gen Bcl-2
humano. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
3.1 SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE ORO GRADO
FARMACÉUTICO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
3.2 COMPARACIÓN DE AuNP (Sintetizadas y Comerciales). . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.2.1 Espectrofotometría UV-Vis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.2.2 Espectroscopía de IR por transformada de Fourier (FT-IR). . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.2.3 Microscopía electrónica de transmisión (TEM). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
3.3 FUNCIONALIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE ORO CON AntiCD20. . . . . . . 60
3.4 ANÁLISIS DE LOS NANOCONJUGADOS AuNP-AntiCD20. . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3.4.1 Parámetro de agregación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
3.4.2 Espectroscopía de correlación de fotones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
3.4.3 Microscopía electrónica de transmisión (TEM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
CONTENIDO
3.4.4 Cuantificación de proteína. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
3.4.5 Cuantificación de grupos sulfhidrilo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
3.5 RADIOMARCADO DEL COMPLEJO AuNP-AntiCD20 CON 99mTc. . . . . . . . . . . 80
3.6 ESTUDIOS in vitro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
3.6.1 Prueba de estabilidad en suero. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 3.6.2 Efecto del complejo AuNP-AntiCD20 sobre la expresión del gen Bcl-2
humano. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
4 CONCLUSIONES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
5 TRABAJO FUTURO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
6 REFERENCIAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
7 ANEXOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
CONTENIDO
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Esquema de la resonancia del plasmón de superficie en nanopartículas metálicas. . . 27
Figura 2. Ilustración del complejo de especies acuosas y dicarboxicetona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
Figura 3. Mecanismo activo y pasivo de nanopartículas en el tejido tumoral. . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Figura 4. Modelo de mecanismos de endocitosis y transporte intracelular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
Figura 5. Marcaje directo anticuerpos con 99mTc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
Figura 6. Síntesis de nanopartículas de oro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
Figura 7. Esquema de funcionalización de AuNP para la preparación de AuNP-AntiCD20. . . . . . 45
Figura 8. Espectro de absorción UV-Vis de nanopartículas de oro sintetizadas. . . . . . . . . . . . . . . . 51
Figura 9. Espectro de FT-IR medio de AuNP-citrato (sintetizadas) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
Figura 10. a) Micrografía obtenida por microscopía electrónica de transmisión (TEM). b)
Distribución de tamaño de partícula obtenida por DLS de nanopartículas de oro
sintetizadas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
Figura 11. Espectros de absorción UV-Vis de las AuNP sintetizadas, comerciales A y B. . . . . . . . . . . 54
Figura 12. Espectro de FTIR medio de AuNP (comerciales A) obtenido de 4000-400 cm-1. . . . . . . . 55
Figura 13. Espectros de absorción IR medio de AuNP (comerciales B). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
Figura 14. Imágenes de microscopía de Nanopartículas de oro de 20 nm. a) Comerciales B
b) Comerciales A c) Sintetizadas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
Figura 15. Espectros de FT-IR de AuNP sintetizadas a) medio y b) lejano. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
Figura 16. Espectros de FT-IR de AuNP Comerciales A a) medio y b) lejano. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
Figura 17. Espectros de FT-IR de AuNP Comerciales B a) medio y b) lejano. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
Figura 18. Curvas de respuesta espectral del parámetro de agregación; a) AuNP-AntiCD20
(Comerciales B). b) AuNP-AntiCD20 (sintetizadas). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
Figura 19. Parámetro de agregación del complejo de AuNP-AntiCD20 (Sintetizadas). . . . . . . . . . . 71
Figura 20. Parámetro de agregación del complejo de AuNP-AntiCD20 (Comerciales B). . . . . . . . 71
Figura 21. Estabilidad del tamaño del complejo AuNP-AntiCD20 respecto al tiempo. . . . . . . . . . . 73
CONTENIDO
Figura 22. Gráficas de distribución del tamaño de partícula. a), b) y c) medidas al tiempo cero,
d), e) y f) medidas después de 60 minutos postpreparadas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
Figura 23. Micrografías de las nanopartículas de oro funcionalizadas a) Comerciales B,
b) Comerciales A y c) Sintetizadas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
Figura 24. Reacciones que revelan la presencia de proteína. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
Figura 25. Reacción de reducción del reactivo de Ellman para la determinación de grupos
sulfhidrilo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
Figura 26. Determinación de pureza radioquímica por HPLC/SEC (λ= 280 nm) de 99mTc/EDDA/HYNIC/OCTREOTIDO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
Figura 27. Estructura del péptido radiomarcado 99mTc/EDDA/HYNIC/OCTREOTIDO. . . . . . . . . . . . . 81
Figura 28. Estructura del sistema multivalente 99mTc/EDDA/HYNIC/octreótido-AuNP-AntiCD20. . . 82
Figura 29. Cromatograma y espectro de absorción UV-Vis asociado al tiempo de retención de
AntiCD20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
Figura 30. Cromatograma y espectro de absorción UV-Vis asociado al tiempo de retención del
sistema 99mTc-EDDA/HYNIC-Octreótido. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
Figura 31. Cromatogramas de radiación que muestran la estabilidad en suero humano del
sistema multivalente 99mTc/EDDA/HYNIC/octreótido-AuNP-AntiCD20 a diferentes
tiempos después del contacto con el suero humano. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
85
Figura 32. Representación gráfica de la concentración de Bcl-2 presente en la línea celular Raji
después de someterse a diferentes tratamientos con AuNP y AntiCD20. a) AuNP
comerciales A y b) Sintetizadas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
87
Figura 33.
Concentración de Bcl-2 en la línea celular Raji (LNH) expuestas a diferentes
tratamientos con AuNP sintetizadas. * Diferencia estadísticamente significativa (p
<0.05) comparado con AntiCD20, **Diferencia estadísticamente significativa (p
<0.05) comparada con el grupo sin tratamiento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
88
CONTENIDO
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Tipos de linfoma no Hodking. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Tabla 2. Métodos de síntesis de nanopartículas de oro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Tabla 3. Tratamientos empleados para la línea celular Raji. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
Tabla 4. Asignación de bandas con los grupos funcionales más probables de los
espectros de FT-IR de AuNP-citrato (sintetizadas) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
Tabla 5. Asignación de bandas con los grupos funcionales más probables de los
espectros de FT-IR de las AuNP (comerciales B). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
Tabla 6. Comparación de propiedades físicas y químicas de AuNP. . . . . . . . . . . . . . . . 59
Tabla 7. Funcionalización de AuNP con AntiCD20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
Tabla 8. Asignación de bandas vibracionales características del espectro FT-IR de
las AuNP y el complejo AuNP-AntiCD20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
Tabla 9. Diámetro hidrodinámico de los nanoconjugados AuNP-AntiCD20. . . . . . . . . . 73
Tabla 10. Concentración de proteína presente en los nanoconjugados. . . . . . . . . . . . . 77
Tabla 11. Secuencia de aminoácidos del antiCD20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
Tabla 12. Grupos sulfhidrilo presentes en el nanoconjugado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
Tabla 13. Tratamientos empleados para la línea célular Raji . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
Tabla 14. Concentración y porcentaje de disminución de Bcl-2 presente en la línea
celular Raji después de ser sometida a diferentes tratamientos con AuNP y
AntiCD20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
CONTENIDO
ABREVIACIONES
µL Microlitro
µM Micromolar
99mTc Tecnecio 99 metaestable
AntiCD20 Anticuerpo del grupo de diferenciación 20
ATR Reflectancia total atenuada
AuNP Nanopartículas de oro
BCA Ácido Bicinconínico
EDDA ácido etilendiamin-N,N’-diacético
EDTA Etilendiamintetracético
FT-IR Infrarrojo por transformada de Fourier
HPLC Cromatografía de líquidos de alta resolución
HYNIC ácido 6-hidrazinilnicotínico
LH Linfoma de Hodking
LNH Linfoma no Hodking
mCi MiliCuri
PBS Disolución de buffer de fosfatos (pH 7.0)
SRP Resonancia del plasmón de superficie
TEM Microscopía electrónica de transmisión
TOC Octreótido
UV-Vis Ultravioleta-Visible
INTRODUCCIÓN
17
INTRODUCCIÓN
Las nanopartículas de oro (AuNP) han sido ampliamente exploradas para la
liberación de fármacos en un sitio específico, diagnóstico médico e imagen, y en el
seguimiento del tratamiento del cáncer debido a su estabilidad química inherente,
biocompatibilidad, y sus propiedades ópticas sorprendentes en la escala nanométrica.
Estas pueden ser fácilmente funcionalizadas con una amplia variedad de fármacos
mediante la modificación de la superficie a un nivel molecular. Como muchos
medicamentos tienen carga neta negativa en solución, las AuNPs cargadas
positivamente son particularmente útiles para permitir la conjugación de fármacos en la
superficie de las partículas a través de la atracción electrostática, sin embargo para
moléculas con actividad biológica que contengan en su estructura grupos funcionales
con gran afinidad hacia el oro se puede llevar a cabo la formación de enlaces de
carácter covalente, como es el caso de las proteínas, ya que contienen grupos tiol y estos
tienen una alta afinidad química debida a que el tiol es una base blanda y el oro (metal
noble) un ácido blando. Por otra parte, la dimensión nanométrica de las partículas de oro
hace que sea posible la internalización en los tejidos dañados así como su captación
celular a través de la membrana celular, la captación también puede ser incrementada si
se funcionaliza con una biomolécula de reconocimiento específico, es decir, un
anticuerpo que esté involucrado en el proceso de daño celular y que además el
antígeno correspondiente esté presente en la membrana celular. Claramente, las
nanopartículas de oro pueden servir como un magnífico vehículo multifuncional para
diversas aplicaciones biomédicas, sin mencionar su amplio rango en otras aplicaciones.
En este trabajo se preparó un sistema multivalente compuesto por nanopartículas de oro y
el anticuerpo AntiCD20, utilizado en el tratamiento de linfomas CD20 positivos; esto para
su uso como un sistema multivalente para terapia dirigida hacia blancos moleculares en la
erradicación de linfomas no-Hodking.
OBJETIVOS
18
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Preparar y caracterizar un sistema multivalente basado en un anticuerpo
monoclonal anti-CD20, conjugado a nanopartículas de oro para el tratamiento de
linfomas CD20 positivos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Sintetizar y caracterizar nanopartículas de oro de 20 nm estabilizadas con citrato.
b) Preparar el sistema multivalente compuesto por nanopartículas de oro (AuNP) de
20nm y el anticuerpo monoclonal anti-CD20 (Rituximab, Mabthera®); con diferentes
relaciones entre AuNP y moléculas de anti-CD20. Esto para determinar el sistema más
estable.
c) Determinar la estabilidad del sistema mediante un parámetro de agregación.
d) Caracterizar el sistema más estable mediante el uso de las siguientes técnicas:
Espectrofotometría de ultravioleta-visible.
Espectroscopia de Infrarrojo.
Espectroscopia de correlación de fotones.
Microscopía electrónica de transmisión.
e) Evaluar el efecto del sistema, realizando un ensayo inmunoenzimático para la
detección cuantitativa de la expresión del gen Bcl-2 humano (activador de la
apoptosis) en células CD20 positivas (línea celular Raji) con los siguientes tratamientos:
1. Anti-CD20
2. AuNP
3. AuNP-AntiCD20
MARCO TEÓRICO
19
1
MARCO TEÓRICO
1.1 CÁNCER
1.1.1 Patología
El cáncer es un grupo genérico de enfermedades que pueden afectar a
diferentes partes del cuerpo. De acuerdo a la Organización Mundial de la Salud, el
cáncer causó 7.6 millones de muertes en el 2008 (13% de todas las muertes), y se espera
que esta cifra aumente a 12 millones para el 2030 [2]. El cáncer se produce debido a
mutaciones en los genes que controlan los ciclos celulares. Las principales características
de las células del cáncer son cuatro, el crecimiento incontrolado (división incontrolada), la
invasión de tejidos adyacentes, metástasis (propagación a otras partes del cuerpo) y la
inmortalidad (protección contra la muerte celular programada) [3].
Prácticamente todas las células cancerosas muestran irregularidades en el control
celular. Cuando un tumor ha crecido más de 1-2 mm, se desarrollan nuevos vasos
sanguíneos (angiogénesis) por estimulación de sustancias liberadas en el ambiente
tumoral. Los vasos tumorales anormales, presentan espacios entre las células endoteliales
e interrupción en la membrana basal, no presentan músculo liso dentro de las paredes de
los capilares. Estos factores hacen que los capilares sean más permeables que los vasos
normales, lo que permite que las sustancias pasen fácilmente desde el ambiente
circundante hacia el espacio tumoral. La permeabilidad depende del tipo de tumor y de
los órganos dentro de los cuales esté situado [3,4].
MARCO TEÓRICO
20
1.2 LINFOMA
El linfoma es el cáncer que comienza en las células del sistema inmune. Hay dos
categorías básicas de linfomas. Una categoría es el linfoma de Hodgkin (LH), que se
caracteriza por la presencia de un tipo de células llamadas Reed-Sternberg. La otra
categoría es linfoma no Hodgkin (LNH), que incluye un grupo grande y diverso de
cánceres de las células del sistema inmune. Tanto los linfomas de Hodgkin y no Hodgkin se
pueden presentar en niños y adultos, el pronóstico y tratamiento dependen de la etapa y
el tipo de linfoma [5].
1.2.1 Linfoma no Hodking
Los linfomas no Hodgkin (LNH) pueden ser de linaje linfoide T o B, afectan a un
amplio rango de edad, pero es mucho más común en personas de edad avanzada, y
puede comenzar en los ganglios linfáticos o sitios extraganglionares como el estómago,
tiroides o las glándulas salivales. Hay un gran número de enfermedades incluidas en el
término de linfoma no Hodking que van desde enfermedades incurables, pero indolentes
a las que son rápidamente progresivas, pero potencialmente curables en algunos
pacientes [6].
1.2.1.1 Principales tipos de Linfoma no Hodking
Los LNH pueden clasificarse aún más, en cánceres que tienen un curso indolente
(de bajo grado o crecimiento lento) y los que tienen un curso agresivo (de alto grado o
crecimiento rápido). Estos subtipos se comportan y responden al tratamiento de manera
diferente [6]. Dentro de la clasificación de los LNH indolentes y agresivos se encuentran
muchos tipos de linfoma (Tabla 1), su determinación se basa en los siguientes criterios [7]:
El tipo de células anormales que contienen linfocitos B o T. Los linfomas con
células anormales T son mucho menos frecuentes que los de células B, 15%
y 85% respectivamente.
El aspecto de los ganglios afectados.
Los tipos de proteínas presentes en las células anormales.
MARCO TEÓRICO
21
Tabla 1. Tipos de linfoma no Hodking.
Linfoma No-Hodking indolente Linfoma No-Hodking agresivo
Linfoma Folicular
Linfoma difuso de células hendidas
Linfoma Malt
Linfoma linfocítico de células pequeñas
Macroglobulemia de Walderson
Linfoma difuso o de células B grandes
Linfoma de células del Manto
Linfoma linfoblástico de adultos
Linfoma primario mediastínico de células grandes
Linfoma de Burkitt
1.2.1.2 Síntomas
Los síntomas del LNH pueden parecerse a los de otros trastornos de la sangre o
problemas médicos, tales como la influenza u otras infecciones. Cada individuo puede
experimentarlos de una forma diferente. A continuación se mencionan algunos:
Hinchazón sin dolor en los nódulos linfáticos del cuello, axila y la ingle.
Fiebre
Sudoración nocturna
Fatiga
Pérdida de peso sin razón aparente
Comezón en la piel
Infecciones recurrentes
1.2.1.3 Tratamiento
Existen diferentes tipos de tratamiento que pueden ser usados contra el LNH. Las
opciones de tratamiento dependen del tipo de linfoma y de su etapa (extensión), así
como de otros factores tales como:
Edad, estado general de salud e historia clínica del paciente
Tolerancia a determinados medicamentos, procedimientos o terapias
Expectativas para la trayectoria de la enfermedad
Opinión o preferencia del paciente al elegir el tratamiento
MARCO TEÓRICO
22
El tratamiento puede incluir:
Radioterapia
Quimioterapia
Terapia biológica (inmunoglobulinas)
Cirugía
Quimioterapia en dosis elevadas con trasplante de médula ósea
1.3 LÍNEA CELULAR RAJI
Raji es la primera línea celular humana continua de origen hematopoyético [8],
esta se derivó hace 40 años de un paciente nigeriano con el linfoma de Burkitt (BL) [9].
Estudios posteriores revelaron translocaciones cromosómicas específicas en las biopsias y
en las líneas celulares de origen BL [10]. Estas células presentan receptores para
moléculas plasmáticas implicadas en distintas cascadas bioquímicas, cuyas funciones son
potenciar la respuesta inflamatoria, facilitar la fagocitosis y dirigir la
lisis de células incluyendo la apoptosis (C1q, C3b, C3d y la porción Fc de la IgG), por esta
razón se ha implementado en una amplia variedad de investigaciones contra la leucemia
y linfoma [11,12].
1.3.1. Bcl-2
Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) es una familia de proteínas consideradas como anti-
apoptóticas, codificadas por un gen del mismo nombre clasificado como un oncogen,
esta familia de proteínas formada por alrededor de 25 miembros regulan el proceso de
permeabilización mitocondrial y constituyen un punto clave en la vía intrínseca
de apoptosis celular. Fue descubierto por primera vez debido a su implicación en
translocaciones cromosómicas que se encuentran comúnmente en los linfomas y se ha
detectado su presencia en una amplia gama de células hematopoyéticas, epitelios no
neoplásicos y tumores malignos epiteliales, sin embargo en células endoteliales normales
existen niveles indetectables de esta proteína [13].
MARCO TEÓRICO
23
Como anteriormente se mencionó, el Bcl-2 tiene la función de bloquear la muerte
celular programada, esto mediante la interrupción en la producción de citocromo C, el
cual desencadena el proceso de apoptosis. Por lo tanto juega un papel crítico en la
oncogénesis, ya que una sobre-expresión previene la apoptosis en células que están
dañadas llevando a una división continua de las líneas de células mutadas y
eventualmente al cáncer. Se ha aplicado la expresión de esta proteína para pronosticar
tumores como el LNH (células CD20 positivas), carcinomas de células escamosas,
carcinoma de mama, carcinoma de vesícula biliar y el timoma [13,14,15].
1.4 AntiCD20 (anti cluster differentiation 20)
1.4.1 Anticuerpo monoclonal quimérico
Un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo homogéneo, es decir, es producido
por una célula híbrida, la cual es producto de la fusión de un clon de linfocitos B
descendiente de una sola y única célula madre y una célula plasmática tumoral. Este tipo
de anticuerpo es altamente específico para un antígeno en particular. El término
quimérico se refiere a la segunda generación de anticuerpos monoclonales obtenidos por
ingeniería genética, basada en la humanización de los anticuerpos para evitar el rechazo
del sistema inmune al ser introducidos en el organismo [16].
1.4.2 Monografía del anticuerpo monoclonal antiCD20 Mabthera®
El Rituximab (anti-CD20, Mabthera®) es un anticuerpo monoclonal específico para
los receptores de superficie CD20 de los linfocitos B humanos. Esta indicado en el
tratamiento de linfomas no-Hodking de células B que hayan recaído o sean refractarios a
otros tratamientos y es el único anticuerpo monoclonal anti-CD20 comercialmente
disponible y aprobado por la FDA para su uso en humanos [17].
1.4.3 Propiedades y efectos
El Rituximab es un anticuerpo monoclonal quimérico de ratón/humano que se une
específicamente al antígeno CD20 transmembranal. Este antígeno está localizado en los
MARCO TEÓRICO
24
linfocitos pre-B y B maduros, pero no en las células madre hematopoyéticas, linfocitos pro-
B, células plasmáticas normales u otros tejidos normales. El antígeno se expresa en más
del 95% de todos los linfocitos B de los pacientes con linfomas no Hodking (LNHs) y actúan
como receptores moleculares del antígeno Bp35; proteína fosforilada responsable de la
restricción de la diferenciación de los linfocitos B que es expresada durante las fases más
precoces. Posteriormente a la unión a los anticuerpos, el CD20 no es internalizado o
proyectado de la membrana celular al medio ambiente. El CD20 no circula en el plasma
como un antígeno libre y por lo tanto, no compite por la unión al anticuerpo [17].
1.4.4 Mecanismo de acción
El Rituximab se une al antígeno CD20 de los linfocitos B y desencadena las
reacciones inmunológicas mediadoras de la lisis de los linfocitos B. Los mecanismos
posibles de la lisis celular son la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) como
resultado de la unión de C1q, citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC)
mediada por uno o más receptores Fc de la superficie de los granulocitos, macrófagos y
células NK (natural killer) e inducción a la apoptosis. Finalmente los estudios in vitro han
demostrado que Rituximab sensibiliza a las líneas de linfocitos B del linfoma humano
resistentes a fármacos, contra los efectos citotóxicos de algunos efectos
quimioterapéuticos [17].
1.5 NANOPARTÍCULAS
Las nanopartículas se pueden definir como partículas de cualquier material que
tenga dimensiones de 100 nm o menos con propiedades que los distinguen de los
materiales a macroescala debido a los efectos del tamaño y de la superficie, y que se
pueden preparar como sistemas estables, homogéneos, y bien caracterizados en forma y
tamaño [18].
MARCO TEÓRICO
25
1.5.1 Propiedades fisicoquímicas del oro
El oro (Au) es un elemento metálico de transición con número atómico 79,
pertenece al grupo 11, bloque d de la tabla periódica; su configuración electrónica
kernel es: 79Au : [Xe] 4f14, 5d10, 6s1. Es químicamente estable y resistente a la oxidación, sin
embargo, de sus dos estados de oxidación; +1,+3 el que predomina es +1. Presenta una
anomalía muy interesante de periodicidad, respecto a su afinidad electrónica que suele
llamarse aurofilicidad, el cual describe la tendencia general de los átomos metálicos
(incluyendo los de oro) a presentar valencias mayores de lo esperado hacia átomos de
Au (I); aparentemente se debe al hecho de que los electrones 5d10 del oro no actúan
como electrones internos “típicos”, sino que se mezclan con estados excitados que se
encuentran en bajas energías, es decir, se puede considerar la promoción de electrones
de la configuración 5d10 y su participación en el enlace Au (I)-Au (I). Se ha estimado que
la energía de interacción entre los dos átomos de Au (I) es aproximadamente de 30
KJmol-1, lo que equivale al orden de magnitud de un enlace de hidrógeno [19,20,21].
1.5.2 Estabilidad química de las nanopartículas de oro
El oro sólido es químicamente estable y es resistente a la oxidación de su superficie,
estas propiedades junto con la alta relación de superficie y volumen determina que las
nanopartículas de oro son de los nanomateriales más importantes que se utilizan como
plataformas de reacción o como nanocatalizadores en muchas reacciones químicas.
Debe ser notado que otros materiales tales como la plata y el platino pueden tener
propiedades catalíticas similares, pero la plata es mucho más reactiva para ser usada y el
platino es más costoso que el oro. Debido a la alta estabilidad química, las nanopartículas
de oro han sido usadas en la oxidación del CO bajo condiciones ácidas. Las propiedades
de las nanopartículas de oro se pueden ver afectadas si se administran sin funcionalizar
con un agente estable en condiciones biológicas, ya que, en un sistema biológico,
donde coexisten proteínas, enzimas, sales y otras biomoléculas se genera un ambiente
corrosivo que puede provocar cambios en las propiedades mencionadas [22].
MARCO TEÓRICO
26
1.5.3 Propiedades ópticas de las nanopartículas de oro
Las propiedades ópticas de las nanopartículas de oro (AuNP) están determinadas
por la interacción de la luz incidente que puede producir dos fenómenos fotofísicos: la
fluorescencia y/o la resonancia del plasmón de superficie (SRP).
La fluorescencia se ve favorecida para AuNP de un tamaño entre 0.5 a 3 nm
(nanopartículas moleculares), ya que estas presentan propiedades cuánticas del átomo
de oro, es decir, los electrones de valencia pueden ser promovidos a niveles energéticos
más altos cuando se incide una radiación electromagnética con la energía necesaria
para provocar esta promoción (535<λ<587 nm). El rendimiento cuántico de la
fluorescencia aumenta para las nanopartículas moleculares más pequeñas ya que los
electrones de valencia tienen más libertad de llevar a cabo transiciones electrónicas, así
mismo, también se ve afectado por el número de valencia del átomo metálico [23].
La resonancia del plasmón de superficie es un fenómeno fotofísico único para
nanopartículas metálicas de un tamaño entre 3 a 30 nm y se ve reflejado en el color
intenso de la suspensión. Se produce cuando una nanopartícula metálica de 3 a 30 nm se
expone a la luz, el campo electromagnético oscilante de la luz induce una oscilación
coherente colectiva de los electrones de valencia de la superficie (electrones de banda
de conducción) del metal. Esta oscilación de electrones alrededor de la superficie de las
partículas produce un dipolo oscilante a lo largo de la dirección del campo eléctrico de
la luz. La amplitud de la oscilación alcanza el máximo a una frecuencia específica,
llamada resonancia de plasmón de superficie (SRP). En la Figura 1 se observa el
desplazamiento de la nube de electrones que forma la banda de conducción, producida
por el desplazamiento relativo de los electrones respecto al núcleo y las fuerzas de
Coulomb que tratan de restablecer el desplazamiento, induciendo el fenómeno de
oscilación colectiva [24,25].
La banda SRP es mucho más fuerte para las nanopartículas plasmónicas (metal
noble, especialmente Au y Ag) que para los otros metales. La intensidad de la banda de
SRP y la longitud de onda dependen de factores que afectan a la densidad de electrones
de la superficie de la partícula, tales como el tipo de metal, tamaño de partícula, forma,
estructura, composición y la constante dieléctrica del medio circundante, como lo
describe teóricamente la teoría de Mie [26]. Las AuNPs de 20nm muestran la banda de
MARCO TEÓRICO
27
absorción del SRP alrededor de 520 nm en la región visible, esta absorción es afectada
por los factores anteriormente mencionados. La SRP provoca que las propiedades
químicas de la superficie de la AuNP sean fácilmente controlables permitiendo gran
versatilidad en la adición de grupos funcionales [27,28].
Figura 1. Esquema de la resonancia del plasmón de superficie en nanopartículas metálicas.
1.5.4 Síntesis de nanopartículas de oro
Se han reportado diversos métodos para la síntesis de AuNP (Tabla 2), entre los
métodos más comunes de síntesis se encuentra la reducción de derivados de oro (III). El
método más usado es la reducción con citrato de sodio en medio acuoso introducido por
Turkevitch en 1951 [29], el cual permite obtener nanopartículas de aproximadamente 20
nm. En 1973 Frens reportó un método para obtener nanopartículas de entre 16 y 147 nm
dependiendo de la relación entre el reductor y el agente estabilizador (oro/citrato de
sodio) [30]. Otras referencias indican que con el método de Turkevitch y Frens se pueden
obtener nanopartículas en un intervalo de 9 a 120 nm con una distribución definida
[31,32].
MARCO TEÓRICO
28
El proceso por el cual se forman las nanopartículas de oro aún se desconoce, sin
embargo, existen varios planteamientos por los cuales se lleva a cabo la formación de
estas; entre ellos se encuentra la siguiente propuesta de reacciones químicas para la
formación de nanopartículas de oro mediante el método de citrato [33].
1. El proceso inicia con la oxidación del citrato, formándose una dicarboxicetona,
liberando 2 electrones.
C
CH2COO
CH2COO
OH
OOC
C
O
OOCH2C CH2COO
+ CO2 + H+ + 2 e-
2. La siguiente reacción es la reducción de cloruro áurico a cloruro auroso con los
electrones liberados de la reacción anterior.
AuCl3 + 2 e- AuCl + 2 Cl-
3. Finalmente, la reducción de los átomos de oro que conduce a la formación de
las nanopartículas de oro mediante una aglomeración progresiva mediada por los
aniones de la dicarboxicetona.
3AuCl 2 Au0 + AuCl3
Esta última reducción requiere que se combinen tres moléculas de cloruro auroso.
En este paso, la dicarboxicetona juega un papel importante debido a que forma un
complejo con las tres moléculas de cloruro auroso [34], el cual es representado en la
Figura 2, donde tres átomos de Au (I) pueden estar teniendo interacciones con un mínimo
de dos moléculas de dicarboxicetona. Este tipo de reacciones es dependiente de las
MARCO TEÓRICO
29
concentraciones de los precursores, la tasa de adición, la velocidad de mezclado,
formación de dicarboxicetona y relación de concentraciones [33].
AuCl
AuCl
O
OC
C
O
O
Ac
AuCl
O
OC
C
O
O
Ac
AuCl
O
O
C
CO
O
Ac
C
H2C
H2C
OAc
Figura 2. Ilustración del complejo de especies aurosas y dicarboxicetona.
Al comenzar a formarse las AuNP se inicia un proceso de aglutinación progresiva
debido a las interacciones entre los átomos de oro provocadas por su aurofilicidad que
provocaría la precipitación de macropartículas. Para evitarlo, el agente estabilizador evita
su crecimiento excesivo, obteniéndose una suspensión estable de partículas coloidales.
Como estabilizadores se emplean generalmente moléculas orgánicas con grupos tiol (-
SH), debido a la gran afinidad química de este grupo (base blanda) por los metales
nobles (ácidos blandos) de acuerdo al principio de Pearson de ácidos y bases duros y
blandos [35]. Se han empleado una gran variedad de alcanotioles para originar
nanopartículas en disolución. El ión citrato en concentraciones altas permite la
estabilización de nanopartículas pequeñas, mientras que en concentraciones pequeñas
la cubierta de las nanopartículas es incompleta y existe agregación originando partículas
mayores [31].
MARCO TEÓRICO
30
Tabla 2. Métodos de síntesis de nanopartículas de oro.
Método de síntesis Precursor/Agente
reductor Mecanismo de formación [referencias]
Reducción de Au(III) HAuCl4/ Citrato de
sodio
Reducción en presencia de un agente
estabilizador, que al adsorberse
químicamente evita el crecimiento
excesivo. Se obtiene una suspensión
estable de partículas coloidales [30,31].
Métodos con
surfactantes para síntesis
directa de AuNP-Péptidos
Au(III)/ NaBH4,
CTAB, DDBA, TTTAB
El surfactante forma micelas que
estabilizan las AuNP [36].
Síntesis asistida por
microondas HAuCl4/ Hidrazina
Irradiación de micelas con microondas.
Existe un calentamiento uniforme del
medio para producir NP con una
distribución de tamaño estrecha [37].
Síntesis sonoquímica Au(III)/ Radical H
Generación de radicales de H y OH.
Los radicales H se usan como agente
reductor [38,39].
Ablación por láser Au(III)
Las AuNP se forman a partir de la
irradiación con láser (532 nm) de una
placa de oro en dodecilsulfato de
sodio (DDS) [40].
1.5.5 Nanopartículas de oro y sus aplicaciones biológicas
En las últimas décadas las nanopartículas inorgánicas han sido de especial
importancia por sus propiedades físicas, químicas y biológicas. Tienen un gran potencial
para llevar a cabo procesos específicos y selectivos, principalmente en aplicaciones
biológicas y farmacéuticas. Las nanopartículas se han investigado para la detección
temprana, el diagnóstico y tratamiento de enfermedades, sin embargo, aunque las
propiedades de las nanopartículas (NP) están bien estudiadas, sus propiedades biológicas
permanecen aún inexploradas [4,18,41,42,43].
MARCO TEÓRICO
31
Se han funcionalizado AuNPs mediante la adsorción de moléculas con grupos tiol
y/o aminas, los estabilizadores orgánicos basados en grupos tiol se han usado
ampliamente como agentes estabilizadores de nanopartículas. Levy y cols. [44]
desarrollaron los péptidos CALNN que incrementan la estabilidad de la AuNP ya que el
grupo tiol en la cadena lateral de la cisteína N-terminal puede enlazarse covalentemente
a la superficie de oro [4].
Las nanopartículas se pueden diseñar como sistemas multiméricos para producir
efectos multivalentes. Las propiedades fisicoquímicas de las nanopartículas desempeñan
un papel importante en la determinación de las interacciones partícula-célula,
mecanismos de transporte celular, biodistribución, farmacocinética y propiedades ópticas
[41,45,46,47].
1.5.6 Mecanismos de captación de nanopartículas de oro
1.5.6.1 Captación pasiva por aumento en la permeación y retención (EPR)
El mecanismo de captación pasiva (Figura 3) de nanopartículas se debe a sus
propiedades farmacocinéticas únicas incluyendo su mínima depuración renal y el efecto
de aumento en la permeación y retención “Enhanced Permeation Retention”. La rápida
vascularización del tumor produce inevitablemente una arquitectura permeable y
defectuosa del endotelio vascular que produce “perforaciones” de 600 a 800 nm. Las
nanopartículas pueden llegar al tumor a través de estas perforaciones en la vasculatura
angiogénica y ser retenidos en el tejido tumoral. Se ha demostrado por un lado, la
acumulación no específica o captación pasiva de nanopartículas de 10 a 500 nm como
resultado del incremento del EPR. Por otro lado, las nanopartículas pequeñas (20-30 nm)
pueden pasar fácilmente a través de los capilares perforados en el tumor pero pueden
regresar rápidamente a la circulación sanguínea por difusión. Las nanopartículas
pequeñas tienen buena permeabilidad pero poca retención, sin embargo después de la
conjugación con biomoléculas dirigidas hacia blancos moleculares su retención en el
tumor puede mejorar significativamente [48,49].
MARCO TEÓRICO
32
Figura 3. Mecanismo activo y pasivo de nanopartículas en el tejido tumoral.
1.5.6.2 Captación activa
Se puede llegar a blancos moleculares uniendo las nanopartículas a biomoléculas
específicas de reconocimiento por los receptores de la célula (Figura 3). Los ligantes
pueden ser moléculas pequeñas, péptidos, proteínas o una combinación de varios tipos
de biomoléculas específicas. El mecanismo de captación activa aumenta por el efecto
EPR mejorándose así el tiempo de residencia en los tejidos de interés como los tumorales
[50,51,52].
La sobre-expresión de receptores o antígenos permite una captación específica
vía endocitosis mediada por receptores (ingestión celular). En general, las AuNP entran a
la célula por un proceso no específico de endocitosis y se concentran en endosomas. Las
evidencias indican que no atraviesan el núcleo a menos que sean específicamente
funcionalizadas para este fin. El tamaño, la forma, concentración y tiempos de incubación
influyen de manera importante en la cinética de captación de nanobarras y nanoesferas
de distintos tamaños en células HeLa. Las AuNP de 50 nm mostraron captación más rápida
y no hubo evidencia de toxicidad asociada con las AuNP [53,54,52].
Se ha reportado que las nanopartículas de 20-50 nm se internalizan a la célula más
rápidamente que las NP menores o mayores. Es de esperarse que las NP tomadas por las
células se encuentren principalmente en los endosomas o lisosomas. En la Figura 4 se
observa nanopartículas (puntos verdes) que son tomadas por endocitosis y confinadas en
MARCO TEÓRICO
33
endosomas tempranos (ET), fagosomas o micropinosomas (MP). De forma alternativa las
nanopartículas se pueden transportar de regreso a la superficie celular desde ET o a través
del reciclaje de endosomas (RE). El pH desciende gradualmente desde la superficie
celular a los lisosomas donde el pH es 4.0-4.5. Los lisosomas contienen proteasas y otras
enzimas que degradan la mayoría de las sustancias captadas por la célula [55,56,57].
Figura 4. Modelo de mecanismos de endocitosis y transporte intracelular.
1.5.6.3 Toxicidad de nanopartículas de oro
Las AuNP tienen propiedades únicas y son adecuadas para un gran número de
aplicaciones biológicas como liberación de fármacos, tratamiento de cáncer e imagen
molecular. El oro es un metal noble, por lo tanto se espera que no tenga efectos
citotóxicos, sin embargo se ha reportado que AuNPs de tamaños muy pequeños (4-5 nm)
pueden inducir toxicidad por la penetración al compartimento nuclear y su unión al ADN.
Las AuNP de 1.4 nm poseen un fuerte potencial tóxico sobre el ADN. Sabella y Colls (2011),
observó que las AuNP de éste tamaño estabilizadas con citrato son tóxicas in vivo e in vitro
mientras que la funcionalización de éstas con proteínas o polímeros previene de manera
significativa los efectos tóxicos [58,59,60].
De forma general, se supone que las nanopartículas de oro de 18-20 nm son
seguras a las concentraciones usadas en estudios de diagnóstico y se han realizado varios
MARCO TEÓRICO
34
estudios de toxicología humana e implicaciones a la salud. Se espera que las
nanopartículas de Au sean inocuas en organismos vivos. Por ejemplo Shukla y
colaboradores sugirieron que las nanoesferas de oro no tienen efectos citotóxicos hasta
una concentración de 100 µM después de su incubación en células de macrófagos
[61,62].
Una condición para extrapolar las concentraciones de un fármaco en plasma o en
tejido después de la administración de una microdosis (no más de 100 µg del fármaco o la
centésima parte de la dosis farmacológica) es que las concentraciones en plasma y tejido
incrementen en forma lineal, lo que se ha comprobado con varios fármacos, sin embargo
la linearidad de la dosis aún se considera como un inconveniente para el concepto
microdosificación [63,64,65].
1.5.7 Caracterización de nanopartículas
Para la caracterización de nanopartículas se han empleado técnicas
espectroscópicas que permiten evaluar cualitativa y/o cuantitativamente la radiación
electromagnética absorbida, emitida o dispersada por estas partículas de escala
nanométrica.
1.5.7.1 Espectrofotometría de UV-Vis
La espectrofotometría Ultravioleta-Visible es una técnica para medir transiciones
electrónicas en esta región del espectro electromagnético. Con esta técnica se mide la
energía requerida para promover electrones a un nivel energético más alto [42].
El origen físico de la absorción de la luz por nanopartículas metálicas es la
oscilación coherente de los electrones en la banda de conducción inducidos por la
interacción con campos electromagnéticos. La banda de absorción resulta cuando la
frecuencia del fotón incidente es resonante con la oscilación colectiva de los electrones
de la banda de conducción (SPR). La frecuencia de resonancia de este SPR depende del
tamaño, forma y propiedades dieléctricas del ambiente local de las nanopartículas. La
excitación del plasmón de superficie por un campo eléctrico a una longitud de onda
MARCO TEÓRICO
35
produce una fuerte dispersión de luz, lo que resulta en una banda intensa de absorción y
es característica del tipo de material. El color rojo intenso de las nanopartículas de oro
coloidales es una manifestación real o tangible del plasmón de superficie [32,66,67].
Usando esta técnica se puede realizar una evaluación preliminar de la
conjugación de la AuNP a la biomolécula (AntiCD20), siendo la fuente de absorción
óptica la Resonancia del Plasmón de Superficie (SRP). Como resultado de cambios en las
propiedades dieléctricas del medio en el cual se encuentran las nanopartículas o la
presencia de material adsorbido en la superficie, ocurren desplazamientos pequeños en
la posición de la longitud de onda del pico de absorción del SPR [42,54].
1.5.7.2 Espectroscopia de infrarrojo por transformada de Fourier
La técnica de Espectroscopía de infrarrojo permite la identificación de los grupos
funcionales de un compuesto. Esto debido a que cuando una molécula absorbe
radiación infrarroja, la vibración intramolecular que tiene la misma frecuencia que la
radiación de incidencia aumenta su intensidad, lo que genera señales con frecuencias
que corresponden a la vibración de un enlace específico. La región infrarroja se divide en
tres zonas denominadas, infrarrojo cercano (NIR, 14000-4000 cm-1), infrarrojo medio (MIR,
4000-670 cm-1) e infrarrojo lejano (FIR, 670-30 cm-1). Los espectros que se obtienen de cada
una de estas zonas muestran las bandas de los grupos funcionales según la energía de los
enlaces que contienen dichos grupos [68].
El ATR (Reflexión Total Atenuada) es una técnica de muestreo utilizada en el IR, la
cual se produce cuando una radiación infrarroja entra en un cristal ATR transmisor de alto
índice de refracción. El cristal está diseñado para permitir una reflexión interna total que
crea una onda evanescente sobre la superficie del cristal. Esta onda se extiende a la
muestra que se mantiene en contacto íntimo con el cristal, registrándose el espectro de
infrarrojo del analito [68].
La espectroscopia de infrarrojo por transformada de Fourier (FT-IR) emplea un
dispositivo óptico (interferómetro) que produce una gráfica de intensidades contra
tiempo que se llama interferograma y contiene toda la información de la radiación
absorbida por la muestra para todas las frecuencias del haz inicial. Como el espectro de
MARCO TEÓRICO
36
IR está dado por la intensidad de la luz transmitida por la muestra en función de la
frecuencia, la decodificación del interferograma se realiza a través de las transformadas
de Fourier. FT-IR permite la obtención de espectros de forma rápida, precisa y con
relaciones Señal/Ruido (S/N) elevadas [68,69].
Esta técnica vibracional es útil por un lado, para la identificación de los grupos
funcionales de un sistema y por el otro, el efecto que se produce en el analito al formarse
nuevos enlaces químicos; de modo que su importancia en el estudio de nanopartículas
funcionalizadas con proteínas radica en que permite conocer la existencia de cambios
espectrales y el tipo de interacciones que ocurren en la superficie de la AuNP con las
biomoléculas involucradas [70,71,72].
1.5.7.3 Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
El microscopio electrónico utiliza un haz de electrones acelerados para irradiar una
muestra delgada, dando una imagen formada por los electrones que emergen,
magnificada de 100 a aproximadamente 1,000,000 veces. Un microscopio electrónico de
transmisión está constituido por la óptica electrónica (columna), el sistema de vacío,
sistemas de enfriamiento, corrientes de alimentación y sus controles y dispositivos de
registro de la imagen. Los electrones se obtienen por emisión termoiónica a partir de un
filamento de tungsteno, una lente magnética proyecta el haz de electrones sobre una
pantalla fluorescente donde se realiza la observación de la imagen.
La resolución de la imagen depende de la fuente de energía usada y está dada
por:
Donde N.A. es la apertura numérica y está definida como:
Donde es el ángulo de apertura y n es el índice refractivo del medio.
MARCO TEÓRICO
37
La apertura numérica define el máximo cono de luz que una lente puede tomar
de un punto en la muestra. La apertura angular es el ángulo que forman los lentes en el
cual la mayoría de los rayos divergentes pueden pasar y formar una imagen [73].
Esta técnica permite la determinación del tamaño, forma y estado de agregación
de los conjugados. También se puede obtener la distribución del tamaño y forma de las
nanopartículas y sus conjugados. La conjugación de la proteína a la nanopartícula se
puede observar por TEM como una baja densidad electrónica en torno de la
nanopartícula de oro [42,74].
1.5.7.4 Espectroscopía de correlación de fotones
El análisis del tamaño de partícula trata de describir éste mediante una cantidad,
como el diámetro, volúmen o área superficial. La distribución del tamaño de partícula es
una gráfica del número de partículas que tiene un valor único de la cantidad elegida, o
bien, una distribución acumulada que representa la fracción de partículas mas grandes o
más pequeñas que un tamaño característico; sin embargo esta descripción tridimensional
basada en una cantidad solo se puede realizar con una esfera [75].
Una de las técnicas empleadas en los equipos, para determinar el tamaño de
partícula, es la dispersión dinámica de luz (DSL), también conocida como espectroscopía
de correlación de fotones o dispersión de luz casi elástica. A diferencia de la dispersión de
luz elástica, la DSL, no considera la dependencia del ángulo de dispersión, sino la
variación de la intensidad de la luz incidente (usualmente luz láser a una sola longitud de
onda) con respecto al tiempo, es decir, esta técnica requiere mediciones del efecto
Doppler de la luz dispersada como resultado del movimiento browniano de las partículas.
Dado que la posición relativa de las moléculas varía constantemente, son producidas
condiciones de interferencia e intensidad de la dispersión, si las partículas se mueven muy
rápido (pequeñas) se acelera esta variación; por el contrario, si las partículas se mueven
muy lentamente (grandes) la variación de la dispersión de la luz es más lenta. La luz
dispersada entonces, llega al detector como una gran combinación mezclada de varias
fases y frecuencias, es decir, se tienen fluctuaciones de intensidad debidas a las
interferencias constructivas y destructivas, esta señal se puede procesar con un ordenador
MARCO TEÓRICO
38
empleando a la transformada de Fourier y así obtener un espectro de poder (intensidad
vs frecuencia), el cual puede ser resuelto a una distribución de tamaño de partícula a
través de la aplicación de algunos algoritmos y puede ser corregida empleando el
cálculo del menor error [75,76].
1.6 SISTEMAS MULTIVALENTES COMO TERAPIA DE BLANCOS MOLECULARES
Se han descrito nuevas formulaciones de Rituximab debido a que aumentan el
grado de apoptosis en poblaciones de células blanco, supuestamente como un resultado
de una mayor captación de CD20. Tales formulaciones consisten en sistemas multiméricos
del anticuerpo Rituximab, construido para incrementar la captación comparado con el
monomérico o el Rituximab bivalente. Hasta ahora se están investigando los sistemas
como perlas recubiertas con Rituximab, polímeros de Rituximab-dextrán y liposomas con
injertos de anticuerpo Rituximab. En todos los casos en los que se aplicó el sistema
multimérico se ha incrementado significativamente la actividad terapéutica del
anticuerpo comparado con el anticuerpo libre. Este interesante fenómeno puede ser
fácilmente aplicado con nanopartículas de oro, con el potencial valioso para
aplicaciones clínicas [77,78].
1.7 RADIOMARCADO DE BIOMOLÉCULAS CON METALES
El marcado radioisotópico de biomoléculas es una técnica que tiene como
finalidad seguir el paso de la biomolécula ya sea para propósitos de diagnóstico (in vivo)
o investigación (in vitro). La biomolécula es marcada al incluir un radioisótopo en su
composición química, cuando estos decaen, su presencia puede ser determinada al
detectar la radiación emitida por ellos. Las técnicas utilizadas para marcar pueden ser
directas o indirectas (quelante).
1.7.1 Marcaje Directo
Este método consiste en unir el elemento radiactivo a grupos funcionales que
actúen como ligantes, tal es el caso de los grupos tiol (-SH) de las cisteínas pertenecientes
MARCO TEÓRICO
39
a la biomolécula. Sin embargo este método presenta las siguientes desventajas; difícil de
controlar, los detalles de su química no son muy conocidos, la biomolécula sufre cambios
en su estructura y generalmente el complejo presenta una baja estabilidad y
especificidad. Por lo anterior este procedimiento se utiliza pocas veces con 99mTc.
Figura 5. Marcaje directo de anticuerpos con 99mTc.
1.7.2 Marcaje Indirecto
El método de marcaje indirecto, también llamado quelante, es aquel que utiliza
ligantes bifuncionales los cuales tienen la función de formar puentes para unir el
radioisótopo y la biomolécula. El agente quelante bifuncional une por medio de un
enlace covalente a la biomolécula y por otro lado se coordina con el radionúclido.
Dentro de este método existen dos métodos de marcaje.
Método de Premarcaje: consiste en la marcación con el elemento radiactivo de
un ligante bifuncional con la subsiguiente activación y conjugación del complejo formado
a través de enlaces covalentes a la biomolécula. Los pasos del marcaje y conjugación se
realizan de forma separada, lo cual garantiza que el isótopo radiactivo se une
directamente al ligante. La purificación del complejo es complicada y consume tiempo,
por tanto no es conveniente cuando se utilizan sistemas con tiempos de vida media cortos
[79,80,81].
Método de Postmarcaje: es la más popular en la síntesis de radiofármacos, ya que
primero se sintetiza el ligante unido a la biomolécula y después se une al radionúclido, en
este método el ligante se une a un N-terminal de un péptido/proteína o a los grupos tioles
y alcoholes que se encuentran en la biomolécula [82].
MARCO TEÓRICO
40
1.7.3 Cromatografía
La cromatografía agrupa un conjunto importante y diverso de métodos, que
permite a los científicos separar componentes estrechamente relacionados en mezclas
complejas. En todas las separaciones cromatográficas, la muestra se desplaza en una fase
móvil que puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico. Esta fase móvil se hace
pasar por una fase estacionaria con la que es inmiscible, y que se fija a una columna o a
una superficie sólida. Las dos fases se eligen de tal forma, que los componentes de la
muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos
componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven
lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario, los componentes que se unen
débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la
distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas
que pueden analizarse cualitativamente y/o cuantitativamente.
1.7.3.1 Cromatografía de líquidos de alta resolución
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés) es ahora
una de las herramientas más poderosas en la química analítica. Tiene la capacidad de
separar, identificar y cuantificar los compuestos que están presentes en cualquier muestra
que se puede disolver en un líquido. Hoy en día, compuestos en concentraciones traza
tan bajos como partes por billón [ppb] pueden ser fácilmente identificados. HPLC puede
ser, y se ha aplicado a casi cualquier muestra, tales como productos farmacéuticos,
alimentos, cosméticos, matrices ambientales, muestras forenses, y productos químicos
industriales [75].
La técnica de HPLC por exclusión de tamaño, también denominada
cromatografía de penetrabilidad sobre geles o de filtración sobre geles, se aplica
particularmente a especies de elevado peso molecular. Los rellenos para la
cromatografía de exclusión molecular están constituidos por pequeñas partículas
poliméricas o de sílice que contienen una red de poros uniforme en los que pueden
difundir las moléculas del soluto y el disolvente. Las moléculas son atrapadas eficazmente
en los poros y eliminadas del flujo de la fase móvil. Las moléculas que son más grandes
que el tamaño medio de los poros del relleno son excluidas y de esta forma,
MARCO TEÓRICO
41
esencialmente no se retienen y, por tanto, son las primeras que eluyen. Las moléculas que
tienen diámetros que son significativamente menores que los poros, pueden penetrar a
través del laberinto de poros y así resultan atrapadas durante más tiempo; estas son las
últimas en eluir. Entre estos dos extremos, están las moléculas de tamaño intermedio cuya
penetración media en los poros depende de su diámetro.
El fundamento de la técnica de HPLC de fase reversa consiste en una fase
estacionaria apolar y una fase móvil de polaridad moderada. El tiempo de retención
aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la
introducción de disolventes más hidrofóbicos. Se basa en el principio de las interacciones
hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión entre un disolvente relativamente
polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La fuerza
conductora en la unión del compuesto a la fase estacionaria es la disminución del área
del segmento apolar del analito expuesto al disolvente. El efecto hidrofóbico disminuye
con la adición de disolvente apolar a la fase móvil. Esto modifica el coeficiente de
partición de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye.
Los detectores de HPLC son de dos tipos básicos, los detectores que se basan en la
medida de una propiedad de la disolución responden a una propiedad del efluente, tal
como el índice de refracción, la constante dieléctrica, o la densidad, que se modifica por
la presencia de los analitos. Por el contrario, los detectores basados en una propiedad del
soluto responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia en el UV,
fluorescencia, radiactividad, o corriente límite que no son inherentes a la fase móvil.
MARCO
METODOLÓGICO
42
2
MARCO METODOLÓGICO
2.1 EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS
2.1.1. Equipo
Analizador de tamaño de partícula y potencial Z (Nano Wave, Nanotrac)
Equipo de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) con
detectores de UV-Vis y de radiación conectados en serie (Waters)
Espectrofotómetro de infrarrojo con divisores de haz de bromuro de potasio
y polietileno (Spectrum 400, Perkin Elmer)
Espectrofotómetro para microplacas (Epoch, BioTek)
Espectrofotómetro UV-Vis (lamda XLS, Perkin Elmer)
Espectrofotómetro UV-Vis (Perkin Elmer Lamda-Bio)
Microscopio Electrónico de Transmisión (Jeol JEM 2010 HT)
2.1.2. Materiales
Agitador tipo vórtex (Science Med)
Balanza Analítica con precisión de 0.1mg (Sartorius BP 221S)
Bomba de vacío
Calibrador de dosis (CII CRC55tR, capintec)
Campana de flujo laminar (Veco)
Celdas de cuarzo de 1cm de paso de luz
Centrífuga (Biofuge Primo, Thermoscientific)
Columna PD-10 (GE Healthcare, Bio-Sciences)
MARCO
METODOLÓGICO
43
Columna protein Pac SEC 300SW (10μm, 7.8mm x 300mm, Waters)
Jeringas para HPLC
Liofilizadora (Hull)
Micropipetas automáticas con puntas estériles 10 μl, 200 μl, 1000 μl y 5 ml
Microplaca de 96 pozos
Parrilla de agitación magnética (VWR)
Placa de 96 pozos
Plataforma ATR de diamante (GladiATR, Pike Technologies)
Puntas para Micropipetas
Sistema purificador de agua tipo I, inyectable (Simplicity UV)
Termoagitador (MBI00-2A, Thermo-Shaker)
Tubos de 50 ml
Tubos ependorf (2 ml)
Vasos de precipitados de 10 ml
Vasos de precipitados de 50 ml
Vial de vidrio de 10 ml
2.1.3. Reactivos
2 mercaptoetanol (Sigma-Aldrich)
Ácido clorhídrico (Fermont)
Ácido tetracloroaurico (Sigma-Aldrich)
Agua grado inyectable (Pisa)
Agua Tipo I (inyectable)
Citrato de sodio (J.T. Baker)
Clorhidrato de cisteína monohidratada (Thermo Scientific)
Cloruro estanoso (Sigma-Aldrich)
EDDA/Tricina
Etanol (Fermont)
HYNIC-octreótido (pi-Chem)
Kit de ensayo inmunoenzimatico para la detección cuantitativa de Bcl-2
humano (Human Bcl-2 Platinum ELISA, BMS244/3, e-Bioscience)
Kit de ensayo para proteína con ácido bicinconínico (BCA) (Sigma-Aldrich)
Kit II de proliferación celular, XTT (Roche)
MARCO
METODOLÓGICO
44
Pertecnato de sodio (GETEC-ININ)
Reactivo de Ellman (Sigma-Aldrich)
Rituximab (antiCD20, Mabthera®) 500 mg/50 ml (Roche)
Suspensión coloidal de Nanopartículas de oro de 20nm (A)*
Suspensión coloidal de Nanopartículas de oro de 20nm (B)*
Medio RPMI
2.1.4. Material Biológico
Suero humano
Suero fetal bobino
Linea celular Raji (células CD20 positivas)
2.2 SÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS DE GRADO FARMACÉUTICO
La síntesis de nanopartículas (figura 6), se realizó basada en la metodología
introducida por Turkevitch en 1951 [29]. Una solución 1.7 mM de citrato de sodio se llevó a
ebullición y agitación constante (340 rpm). Cuando la solución llegó a ese punto se
adicionó 1mL de ácido tetracloroáurico; la mezcla se dejó reaccionar durante 10 minutos
hasta observar el cambio de coloración de la solución de amarillo a rojo. Posteriormente,
la solución se llevó a un proceso de diálisis para eliminar los iones en exceso que no
contribuyen a la estabilidad de la nanopartícula. La diálisis se llevó a cabo de la siguiente
manera: la suspensión coloidal se introdujo en un tubo de diálisis compuesto por celulosa,
a su vez está se colocó dentro de un litro de agua tipo I (inyectable), cambiando el
líquido cada 30 minutos durante 1.5 horas en agitación constante.
Figura 6. Síntesis de nanopartículas de oro.
* A y B se refiere a suspensiones coloidales de nanopartículas de oro comerciales de distinta procedencia.
MARCO
METODOLÓGICO
45
2.3 FUNCIONALIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE ORO CON AntiCD20
La funcionalización de las nanopartículas de oro (AuNP) se realizó mediante la
adición de una determinada cantidad de antiCD20 (1 μM) a 1 ml de suspensión coloidal
de nanopartículas de oro (sintetizadas, comerciales A y B). La solución de AntiCD20 1 μM
se agregó en diferentes volúmenes (ver sección 3.3), para modificar la relación de
moléculas de anti-CD20 por cada AuNP y así determinar el sistema más estable. La figura
7 muestra el desplazamiento de los aniones citrato al adsorberse el anti-CD20 a la
nanopartícula de oro mediante el enlace oro- azufre.
Figura 7. Esquema de funcionalización de AuNP para la preparación de AuNP-AntiCD20.
2.4 CARACTERIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE ORO
2.4.1. Espectrofotometría UV-Vis
Los espectros de absorción fueron adquiridos en un espectrofotómetro UV-Vis
Perkin-Elmer Lamda Bio en un intervalo de 200 a 800 nm y 400 a 800. Las soluciones de
nanopartículas de oro sintetizadas, Comerciales A y B se analizaron mediante está técnica
para verificar la absorción del SRP (resonancia del plasmón de superficie). Para los
conjugados recién preparados se siguió el corrimiento de la banda del SRP para
determinar la estabilidad del complejo y así construir un parámetro de agregación
(cinética de agregación) calculado mediante la siguiente relación PA = (A –A0) / A0;
donde A0 es la absorbancia integrada entre 600 y 700 nm al tiempo cero y A es la
absorbancia integrada de 600 a 700 nm de la muestra en un momento dado.
MARCO
METODOLÓGICO
46
2.4.2. Espectroscopía de infrarrojo por transformada de Fourier (FT-IR)
Los espectros de infrarrojo de las muestras liofilizadas (secado por 24 horas al alto
vacío) se adquirieron en un equipo Perkin Elmer (Spectrum 400) con una plataforma de
ATR (GladiATR, Pike Thecnologies) con punta de diamante. Los rangos de los espectros de
infrarrojo medio fueron de 4000-500 cm-1 y del lejano de 700-200cm-1, utilizando ventanas
de divisores de haz de bromuro de potasio y polietileno respectivamente; realizando 200
barridos por lectura.
2.4.3. Microscopía electrónica de Transmisión
Las imágenes se obtuvieron con un microscopio JEM 2010 HT operado a 200kV.
Cada una de las muestras se preparó colocando una gota la dilución (1:10, v/v) de la
suspensión coloidal original de las AuNPs y de los conjugados AuNP-AntiCD20 en rejillas de
cobre recubiertas con carbono malla 300 (spd) para microscopía. La magnificación
empleada para observar las nanopartículas de oro sin funcionalizar y funcionalizadas se
ajustó para visualizar la capa de recubrimiento a 300000x.
2.4.4. Análisis de tamaño de partícula y potencial Z
Las distribuciones de tamaño del diámetro hidrodinámico de las nanopartículas y
potencial Z se adquirieron por dispersión dinámica de luz utilizando un equipo analizador
de tamaño de partícula y potencial Z (Nano Wave, Nanotrac). Las soluciones coloidales
de los nanoconjugados se midieron inmediatamente después de ser preparada, 15
minutos, 30 minutos y 1 hora después de ser preparada.
2.4.5. Cuantificación de grupos sulfhidrilo
Los grupos sulfhidrilo por molécula se calcularon haciendo uso de un ensayo
con el reactivo de Ellman (5,5’-Ditio-bis-(2-ácido nitrobenzóico)); el cual reacciona con los
grupos sulfhidrilo presentes en la muestra dando como producto una solución de color
amarillo (ver sección 3.4.5). El procedimiento se realizó como sigue:
MARCO
METODOLÓGICO
47
a) A cada tubo se adicionó 50 µl de una solución 0.01 M de Reactivo de Ellman y
2.5 ml de Buffer de fosfatos 0.1 M con EDTA 1mM a pH=8.
b) Posteriormente se agregó 250 µl del nanoconjugado. Para completar la
reacción se mezcló y se dejó a temperatura ambiente durante 15 minutos.
c) Se tomaron las lecturas de absorbancia a 412 nm.
Con los resultados de absorbancia obtenidos se calculó los grupos sulfhidrilo
presentes en cada molécula de antiCD20, considerando el coeficiente de extinción molar
del Reactivo de Ellman y la concentración de anticuerpo adicionado a cada
nanoconjugado.
2.4.6. Cuantificación de proteína
Para la cuantificación de proteína presente en los nanoconjugados se utilizó un kit
de ensayo de proteínas con ácido Bicinconínico (BCA, Sigma-Aldrich). El protocolo
seguido se muestra a continuación:
a) A los pozos previamente etiquetados se adicionó 50 μl de cada solución del
estándar a diferentes concentraciones para la curva. Así mismo, para las
muestras se adicionaron 50 μl de los nanoconjugados en los pozos
correspondientes. Para todos los pozos se añadió 1ml de reactivo AB (sal de
cobre) en cada uno de los pozos.
b) Posteriormente se incubaron a 60°C por 15 minútos en una incubadora para
microplacas; pasando el tiempo requerido se dejaron reposar a temperatura
ambiente por 5 minutos.
c) Se tomaron las lecturas a 540 nm en un espectrofotómetro de microplacas
Epoch Biotek.
d) Usando la curva estándar de 8 puntos (250 μl a 0 μl) se determinaron las
concentraciones de proteína en cada uno de los conjugados.
Es importante hacer mención que para los nanoconjugados se tomó como blanco
las nanopartículas de oro sin funcionalizar, es decir, estabilizadas con citrato para corregir
la absorción de éstas y así obtener la concentración real de la muestra.
MARCO
METODOLÓGICO
48
2.5 RADIOMARCADO DEL COMPLEJO AUNP-ANTICD20 CON 99mTc
El complejo AuNP-AntiCD20 se radiomarcó con 99mTc mediante un método
indirecto. Se adicionó 20 μl de una solución acuosa (1 mg/ml) del péptido HYNIC/TOC
(ácido 6-hidrazinilnicotínico/octreótido) a 1 ml del complejo seguido de 500 μl de EDDA-
TRICINA (ácido etilendiamin-N,N’-diacético/N-tris-[hidroximetil]-metilglicina), 500 μl de una
solución de pertecnato de sodio (Na99mTcO4) , con una actividad de 210.9 MBq y 20 μl de
una solución de cloruro estanoso (1 mg/ml) en ácido clorhídrico 10 mM. Posteriormente se
incubó a 96°C durante 20 minutos. La pureza radioquímica se determinó utilizando el
equipo de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) con detectores de UV-Vis y
de radiación conectados en serie (Waters).
2.6 ESTUDIOS in vitro
2.6.1. Prueba de estabilidad en suero
Los estudios de estabilidad del radiofármaco en suero humano son necesarios
antes de su evaluación in vivo, por lo tanto, la estabilidad en suero del complejo 99mTc-
EDDA/HYNIC-octreótido-AuNP-AntiCD20 se determinó mediante la siguiente técnica. Se
diluyó una muestra de suero humano 1:10 (v:v) con agua tipo I (inyectable),
posteriormente se agregó 200 μl del complejo a 800 μl de suero diluido. Las muestras se
incubaron a 37°C y fueron inyectadas en el equipo HPLC de exclusión molecular
empleando una columna Protein Pac SEC 300W (waters) y las siguientes condiciones en el
sistema: Fase móvil: Agua grado inyectable, Flujo: 1 mL /min, detector de arreglo de
diodos (longitud de onda variable) y detector de radiactividad conectados en serie, para
dar seguimiento al pico de radiación asociado a las nanopartículas las inyecciones se
realizaron al tiempo 0, 4 y 24 horas.
2.6.2. Cultivo celular
La línea celular Raji de linfoma no-Hodking con receptores CD20 en su membrana
celular se obtuvo inicialmente del American Type Culture Colection (ATCC). Las células se
incubaron a 37°C bajo atmósfera de CO2 (5%) y 85% de humedad en medio RPMI (sistema
MARCO
METODOLÓGICO
49
amortiguador de bicarbonato con aminoácidos y vitaminas) suplementado con suero
fetal bovino (10%) y una mezcla de antibiótico penicilina/estreptomicina (1%).
2.6.3. Efecto del complejo AuNP-AntiCD20 sobre la expresión del gen Bcl-2 humano
El Efecto del complejo AuNP-AntiCD20 sobre la expresión del gen Bcl-2 humano se
evaluó tratando células CD20 positivas (línea celular Raji), 2.5 x 106 células/ml, con los
siguientes tratamientos:
Tabla 3. Tratamientos empleados para la línea celular Raji.
TRATAMIENTOS CONCENTRACIÓN
AntiCD20 13 μg/ml
AuNP (comerciales A) 6.58x1011 nps/ml
AuNP (Sintetizadas) 6.54x1011 nps/ml
AuNP-AntiCD20 (comerciales A) 6.58x1011 nps • 13 μg /ml
AuNP-AntiCD20 (Sintetizadas) 6.54x1011 nps • 13 μg /ml
PBS (control) ---
En la tabla 3 se exponen las concentraciones empleadas para cada tratamiento;
este se dejó actuar durante 22 horas en incubación a 37°C bajo atmósfera de CO2 (5%) y
85% de humedad en medio RPMI suplementado con suero fetal bovino (10%) y una
mezcla de antibiótico penicilina/esptreptomicina (1%).
Posteriormente las células se lisaron para obtener el extracto celular y siguiendo el
protocolo del ensayo inmunoenzimático para la detección cuantitativa del gen Bcl-2
humano (Human Bcl-2 Platinum ELISA, BMS244/3, e-Bioscience) se determinó la expresión
del gen Bcl-2.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
50
3
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE ORO GRADO
FARMACÉUTICO
La síntesis de nanopartículas de oro (AuNP) se efectuó mediante la reacción de
reducción del Au3+ (HAuCl4) a Au+1 en medio acuoso. El resultado obtenido fue una
suspensión coloidal color rojo con una concentración aproximada de 1.116 x 1012
nanopartículas de oro por ml, calculado mediante la relación que existe entre la densidad
óptica y concentración [83]; después de dializar la suspensión coloidal se reporta un pH
ácido de 5.65.
En el espectro de absorción en UV-Vis de la suspensión coloidal dializada y diluida
(1/1; v/v) se observa un máximo en la función de absorción a 519.09 nm con una
densidad óptica de 0.897 u.a. (figura 8); esto da otro indicio de que el producto obtenido
de la síntesis son nanopartículas de oro, ya que esta absorción es característica en
suspensiones coloidales de AuNP debido a la excitación óptica de los electrones de
superficie [25], por lo tanto, se asevera que a esta longitud de onda la amplitud de
oscilación electrónica de superficie producida por el efecto de resonancia del plasmón
de superficie (SRP) alcanzó su máximo.
Como está reportado en la bibliografía, las nanopartículas de oro de un tamaño
de 20 nm, absorben a una longitud de onda de 520 nm [74]. Por lo tanto, el resultado
obtenido indica que se logró obtener una suspensión coloidal con nanopartículas de oro
de un tamaño aproximado a 20 nm.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
51
400 600 8000.0
0.5
1.0
AB
SO
RB
AN
CIA
(u
.a.)
LONGITUD DE ONDA (nm)
519.09 Absorción del SRP
Figura 8. Espectro de absorción UV-Vis de AuNP sintetizadas.
La suspensión coloidal concentrada de las nanopartículas de oro se sometió a un
proceso de liofilización al alto vacío durante 24 horas. Se obtuvo un sólido obscuro, a partir
de éste se adquirió el espectro de infrarrojo medio, representado en la figura 9.
Para el espectro de infrarrojo por transformada de Fourier (FT-IR) de las
nanopartículas de oro estabilizadas con aniones citrato, se asignaron las bandas
correspondientes a los grupos funcionales presentes en la molécula; éstos grupos
funcionales son: carboxilato, hidroxilo y metileno. El perfil espectral presenta una banda
ancha de vibración de tensión del grupo hidroxilo (–OH) a 3308 cm-1; el ensanchamiento
de la banda demuestra la existencia de interacciones intermoleculares entre los grupo
hidroxilo mediante enlaces de hidrógeno. El ión carboxilato comúnmente muestra bandas
a modo de vibración de tensión asimétrica y simétrica a 1580 y 1440 cm-1
respectivamente, sin embargo, como influencia de la interacción con la nanopartícula de
oro estas se desplazan a números de onda de menor y mayor energía, es por esto que se
asignaron las bandas observadas a frecuencias de 1586 y 1393 cm-1. Las señales de
vibración asimétrica y simétrica de los grupos metileno se observan a 2935, 2880 cm-1
respectivamente [84].
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
52
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
20
40
60
80
100TR
AN
SM
ITA
NC
IA (
%)
NÚMERO DE ONDA (cm-1)
Figura 9. Espectro de FT-IR medio de AuNP-citrato (sintetizadas).
Tabla 4. Asignación de bandas de los grupos funcionales más probables del espectro de FT-IR de
AuNP-citrato (sintetizadas).
Grupo funcional Número de onda (cm-1) Intensidad
Hidroxilo (-OH) 3308 Fuerte
Metileno s (-CH2-); as(-CH2-)
2880, 2935
Media
Carboxilato s (-COO-); as(-COO-) 1393, 1586
Fuerte
: Vibración de estiramiento, puede ser simétrica (s) o asimétrica (as).
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
53
La figura 10 a) es una micrografía obtenida de la muestra de nanopartículas de
oro sintetizadas estabilizadas con aniones citrato, en la imagen se observa la morfología
de cuerpos esféricos de un tamaño aproximado de 20 nm, cabe señalar que éstas
comienzan a coalescer debido a la ausencia de un estabilizador que al contacto con el
haz de electrones se evaporó; por esta razón al quedar las nanopartículas de oro en
contacto directo comienzan aglomerarse. b) corresponde a una gráfica de distribución
del tamaño de partícula, obtenida por dispersión dinámica de luz (DLS), respecto a esta
distribución podemos señalar que el tamaño de partícula que se ve favorecido se
encuentra en un rango de 19.95 ± 1.57 nm. Por lo tanto, estos resultados son evidencia
suficiente para respaldar la propuesta que se mencionó anteriormente sobre que el
tamaño de partícula obtenido a partir de la síntesis es de aproximadamente 20 nm.
-
10 100 1000
10
20
30
Tamaño (nm)
%C
ha
nn
el
0
20
40
60
80
100
%P
ass
ing
Figura 10. a) Micrografía obtenida por Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM).b) Distribución
de tamaño de partícula obtenida por DLS de Nanopartículas de oro sintetizadas.
Por otra parte, se sabe que el potencial Z es un magnitud muy importante para
poder determinar la estabilidad de un sistema coloidal como lo son las suspensiones de
nanopartículas de oro, por esta razón se midió el potencial Z de la suspensión coloidal
sintetizada dando como resultado -149.10 ± 1.57 mV para una concentración de 1.116 x
1011 nanopartículas de oro por ml; el signo negativo es congruente con el sistema
empleado, ya que estas AuNP se encuentran estabilizadas con aniones citrato. Está
reportado que a valores mayores de ± 30 mV las suspensiones coloidales de AuNP suelen
tener una excelente estabilidad [85], por lo tanto, se asegura que el coloide AuNP-citrato
obtenido posee una la excelente estabilidad.
a) b)
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
54
3.2. COMPARACIÓN DE AuNP (sintetizadas y comerciales)
Esta comparación se realizó para verificar las propiedades químicas y físicas de
cada suspensión coloidal y así predecir cuál será su comportamiento al ser
funcionalizadas con el anticuerpo. Las nanopartículas de oro comerciales se
denominarán: comerciales A y comerciales B.
3.2.1. Espectrofotometría UV-Vis
Las curvas espectrales obtenidas en la región ultravioleta-visible de las distintas
soluciones coloidales de AuNP de 20 nm (Figura 11) muestran un máximo de absorbancia
muy semejante. Cabe señalar que las nanopartículas de oro comerciales A y las
sintetizadas tienen una absorción a la misma longitud de onda (519.09 nm), esto debido a
que ambos coloides están estabilizados mediante atracciones electrostáticas producidas
por los aniones fosfatos y citratos, respectivamente. Para las nanopartículas de oro
comerciales B se desconoce el agente que estabiliza la dispersión coloidal, sin embargo,
por su absorción a mayor longitud de onda (menor energía) podemos deducir que se
trata de una molécula voluminosa, ya que este desplazamiento ocurre porque la
oscilación coherente de electrones de la superficie de la nanopartícula de oro se ve
afectada por la adición de moléculas a la superficie [86].
400 500 600 700 8000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 519.69
519.09
AB
SO
RB
AN
CIA
(u
.a.)
LONGITUD DE ONDA (nm)
Sintetizadas
Sigma-Aldrich
Nanopartz519.09
Figura 11. Espectros de absorción UV-Vis de las AuNP sintetizadas y comerciales A y B.
Sintetizadas
Comerciales A
Comerciales B
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
55
3.2.2. Espectroscopía de IR por transformada de Fourier (FT-IR)
a) AuNP comerciales A
En lo que corresponde al espectro de absorción en la región media del infrarrojo
de las nanopartículas de oro comerciales A estabilizadas con un buffer de fosfatos
(PBS)(figura 12), resalta que el patrón espectral en la región media del infrarrojo se
observan señales correspondientes a la del hidroxilo a 3367 cm-1 debidas al hidroxilo
presente en los aniones fosfatos ([H2PO4]- y [HPO4]2-), esta señal al igual que en el espectro
de las nanopartículas de oro sintetizadas se observa ancha debido a las interacciones por
enlaces de hidrogeno intermoleculares. Asimismo se observa una banda a 1636 cm-1 la
cual se atribuye al enlace formado entre el oxígeno y el fosforo, así como las señales de
menor energía observadas a 1077 y 989 cm-1 asignadas para la interacción de resonancia
entre el fosforo y dos oxígenos.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
20
40
60
80
100
TRA
NSM
ITA
NC
IA (
%)
NÚMERO DE ONDA (cm-1)
Figura 12. Espectro de FTIR medio de AuNP (comerciales A) obtenido de 4000-400 cm-1.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
56
b) AuNP comerciales B
El perfil espectral de absorción infrarroja en la región media y lejana de las
nanopartículas de oro comerciales B (Figura 13), revela la presencia de grupos funcionales
incluidos en los aminoácidos, como es el caso del grupo amida (presente en los enlaces
peptídicos); esto nos lleva a proponer que la suspensión coloidal se encuentra estabilizada
con un péptido o proteína. En la Tabla 5 se describe la asignación más probable en
relación de absorción y grupo funcional.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
20
40
60
80
100
TRA
NSM
ITA
NC
IA (
%)
NÚMERO DE ONDA (cm-1)
Figura 13. Espectros de absorción IR medio de AuNP (comerciales B)
Las bandas características de los enlaces N-H, C=O y C-N de la amida se
presentan a 3280, 3088, 1638, 1558 y 1435 cm-1, estas absorciones se atribuyen a la
vibración de estiramiento en los enlaces peptídicos formados en el péptido o proteína.
Asimismo para las bandas que aparecen a 1281 y 2981 cm-1, se asignaron para las
vibraciones de estiramiento simétrico y asimétrico de los enlaces C-C, presentes en la
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
57
cadena de aminoácidos. Las bandas también localizadas son de grupos funcionales
aromáticos contenidos en los aminoácidos tales como el indol proveniente del triptófano
(Trp) y el fenilo de la fenilalanina (Phe).
Tabla 5. Asignación de bandas con los grupos funcionales más probables de los espectros de FT-IR
de las nanopartículas de oro comerciales B.
Grupo funcional
Número de onda Intensidad
Amida I s(N-H) 3280 Media
Sobretono de Amida II (N-H) 3088 Débil
Metilenos s (-CH2-); as(-CH2-) 3016,2981 Débil
Amida I (C=O) 1636 Fuerte
Amida II (N-H) 1558 Fuerte
Amida III (C-N) 1435 Media
Hidrocarburos (C-C) 1281 Media
Fenilo s(C-H); ip(C-H) (Fenilalanina) 1054 Media
Indol (C-N-H) (Triptofano) 989 Media
C-S (C-S)
(Cisteína y Metionina)
659
Media
Disulfuro (S-S) 527 Media
: Vibración de estiramiento, puede ser simétrica (s) o asimétrica (as).
: Vibración de torsión, puede ser en el plano ( ip) o fuera del plano ( oop)
3.2.3. Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
La figura 14 muestra la comparación en la morfología de los tres tipos de
nanopartículas de oro obtenidas del microscopio electrónico de transmisión. Éstas
imágenes revelan que las nanopartículas de oro comerciales B se encuentran
estabilizadas con un compuesto muy estable, ya que no es volátil al paso del haz de
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
58
electrones y permite ver las nanopartículas de oro sin coalescer, además de que se
visualiza la capa de estabilizante; en la figura 14 inciso a) se observa cómo está recubierta
con una capa densa a pesar del previo proceso de secado. Las nanopartículas de oro
comerciales A y las sintetizadas, nuevamente muestran un comportamiento similar, ya que
la morfología de ambas comprende de cuerpos esféricos que comienzan a coalescer
debido a la ausencia de la fase dispersante (Figura 14, b) y c)).
Figura 14. Imágenes de microscopía de Nanopartículas de oro de 20nm. a) Comerciales B
b) Comerciales A c) Sintetizadas.
Las micrografías fueron tomadas a diferentes aumentos, a) Comerciales B, a una
ampliación de 1 990 000 x, b) tomada a 1 500 000 x y c) 1 370 000 x.
En la tabla 6 se resumen las propiedades químicas y físicas de las suspensiones de
nanopartículas de oro que posteriormente se utilizaran para probar la funcionalización
con el anticuerpo antiCD20. Las propiedades de las tres suspensiones coloidales indican
que son buenos candidatos para ser funcionalizadas; especialmente las AuNP sintetizadas
y comerciales A debido a que como se mencionó anteriormente, ambas se encuentran
estabilizadas con aniones, por lo tanto, se sabe que la interacción entre estos aniones y
la nanopartícula de oro es muy lábil al competir con grupos tiol, es así como de deduce
que la formación del enlace de carácter covalente entre el azufre y la nanopartícula de
oro se verá favorecido, además de que poseen una excelente estabilidad coloidal. Para
las AuNP comerciales B no se puede deducir el comportamiento que tendrá, ya que en la
descripción de su perfil espectral de absorción en el infrarrojo lejano, se identificó un
enlace entre el oro y el azufre, lo que nos llevó a pensar que tal vez se encuentre
a) b) c)
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
59
estabilizado con ese tipo de enlace, así que cuando adicionemos el anticuerpo se
desconoce qué cantidad de antiCD20 se adicionará para formar el sistema multivalente
o si se llevará a cabo la formación de este.
Tabla 6. Comparación de propiedades físicas y químicas de AuNP.
Propiedad
Unidades
Nanopartículas de oro esféricas
Sintetizadas Comerciales A Comerciales B
Diámetro
nm 19.95 ± 1.57 26.30 ± 3.54 23.81 ± 7.60
Densidad
óptica del SRP
u.a.
0.897 ± 0.001
0.861 ± 0.001
0.930 ± 0.005
Longitud de
onda de SRP
nm
519.09 ± 0.1
519.09 ± 0.1
519.69 ± 0.1
ph
No aplica 5.65 ± 0.01 6.89 ± 0.01 7.01 ± 0.01
Potencial Z
mV -149.10 ± 1.57 -94.0 ± 3.54 -22.30 ± 2.87
Concentración
nps/ml 6.58 x 10 11 ± 7.34 x 10 8 6.31 x 10 11 ± 7.33 x 10 8 6.82 x10 11 ± 3.67 x 10 9
Estabilizador
No aplica Aniones citrato Aniones fosfato (PBS) Desconocido
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
60
3.3. FUNCIONALIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE ORO CON Anti-CD20
La funcionalización se realizó con los tres tipos de nanopartículas de oro, el
procedimiento se llevó a cabo mediante la adición de una solución de antiCD20 1μM a
1ml de una suspensión coloidal de AuNP en los volúmenes que se especifican en la tabla
7, con agitación constante y a temperatura ambiente. En ésta tabla también se describe
la estabilidad inmediata del conjugado.
Tabla 7. Funcionalización de AuNP con AntiCD20.
AuNP AuNP/ml Volumen mezclado Moléculas de
AntiCD20/
AuNP
*Estabilidad
AuNP (ml) AntiCD20 1μM (μl)
Comerciales
B
6.82 x10 11 ±
3.67 x 10 9
1
2
3
5
7
2
3
5
7
Alta
Alta
Media
Nula
Sintetizadas
6.58 x 10 11 ±
7.34 x 10 8
1
6
8
10
12
6
8
10
12
Alta
Alta
Alta
Media
Comerciales
A
6.31 x 10 11 ±
7.33 x 10 8
1
6
8
10
12
6
8
10
12
Alta
Alta
Alta
Media
*Estabilidad inmediata del complejo tomando en cuenta la desestabilización del coloide al formarse
un precipitado morado; alta: estable por 72 horas, nula: formación del precipitado inmediatamente
después de adicionar el anti-CD20.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
61
El número de moléculas por nanopartícula se calculó tomando en consideración
la concentración del anticuerpo y la concentración de las nanopartículas de oro por
mililitro. El conjugado de las AuNP comerciales B es muy inestable, por lo tanto se espera
que no sea un buen sistema multivalente, sin embargo se optó por elegir el sistema
compuesto por 3 moléculas de antiCD20 por cada nanopartícula para continuar con las
siguientes pruebas. Los nanoconjugados compuestos por nanopartículas de oro
sintetizadas y comerciales A son muy estables con 10 moléculas de anticuerpo por
nanopartícula, por lo tanto este sistema es el seleccionado para seguir realizando las
pruebas de estabilidad y caracterización.
3.4. ANÁLISIS DE LOS NANOCONJUGADOS AuNP-AntiCD20
Una vez que se funcionalizaron cada una de las AuNP de 20 nm de diferente
origen; se procedió a obtener los espectros de absorción en la región infrarroja media y
lejana de cada uno de los siguientes nanoconjugados para identificar cambios
estructurales después de la funcionalización:
1. AuNP-AntiCD20 (Sintetizadas)
2. AuNP-AntiCD20 (Comerciales A)
3. AuNP-AntiCD20 (Comerciales B)
4. AntiCD20
En la tabla 8 se presentan las principales bandas vibracionales representativas de
los grupos funcionales más característicos presentes en las nanopartículas de oro, en el
AntiCD20 y en los nanoconjugados, resultado de analizar los perfiles espectrales de
infrarrojo medio y lejano de las nanopartículas de oro, el antiCD20 y los nanoconjugados,
representados en las figuras 15,16 y 17.
La figura 15 a) y b) muestra la comparación de los espectros de FT-IR medio y
lejano, respectivamente, de las materias primas del nanoconjugado, es decir, el antiCD20
y las nanopartículas de oro sintetizadas. Al analizar esta comparación de los espectros de
FT-IR medio podemos percibir que son similares, sin embargo, se distinguen pequeños
cambios estructurales que pueden ser de gran ayuda para verificar que la
funcionalización se haya llevado a cabo. Tal es el caso de la banda que aparece de 3500
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
62
a 3000 cm-1, que ahora posee una forma más ancha y plana en la forma del pico; según
lo reportado [84] la banda de la amida posee estas características, por lo tanto se sugiere
la presencia de la amida contenida en los aminoácidos. Para la banda de absorción
cercana a 1600 cm-1 es complicado aseverar a qué clase de absorción está
representando, ya que la amida al igual que el carboxilato absorben alrededor de esta
región con una doble banda que simboliza la vibración simétrica y asimétrica.
Asimismo, el espectro de FT-IR lejano 15 b) exhibe información más clara para
poder sacar conclusiones acerca de la funcionalización de las nanopartículas de oro. En
la región comprendida entre 700 y 600 cm-1 del espectro de infrarrojo lejano de las
nanopartículas de oro sin funcionalizar se perciben bandas definidas entre 700 y 600 cm-1
que sugieren la presencia de enlaces intermoleculares entre el hidrógeno y el oxígeno
presentes en el hidroxilo contenidos en el anión citrato, estas bandas de absorción ya no
se presentan en el perfil espectral del nanoconjugado, por lo tanto, se plantea que el
anión citrato ya no se encuentra presente en la muestra analizada. Otra evidencia se
encuentra en la región donde absorben los alcanos de cadena ramificada (570-540 cm-1),
para el espectro de los nanoconjugados si se observa esta absorción, probablemente
debida a las cadenas de alcanos presentes en los aminoácidos. Y finalmente la evidencia
que tiene más importancia en esta parte de la caracterización es la presencia del enlace
formado entre el oro y el azufre (contenido en la cisteína incluido en los aminoácidos del
antiCD20); según los datos reportados en trabajos anteriores [45] este enlace se presenta
a 280 cm-1 aproximadamente, dependiendo del ambiente químico donde se encuentre,
es así, que al analizar los espectros se encuentra que las nanopartículas de oro
estabilizadas con citrato y las funcionalizadas con el antiCD20 presentan una absorción
cercana a esta región, por lo tanto, se estudiaron las posibles causas de esta señal,
llegando a la conclusión de que para las AuNP estabilizadas con citrato las interacciones
entre el oro y el oxígeno para estabilizar las nanopartículas absorben a 281 cm-1, muy
cercano al valor que se espera para cuando se encuentren funcionalizadas, sin embargo,
esto no es de extrañarse ya que el oxígeno tiene propiedades químicas muy similares a las
del azufre; y para el espectro del nanoconjugado esta señal aparece a 287 cm-1, esta
señal es más energética por lo que se atribuye a la interacción entre el oro y el azufre ya
que estos dos elementos tienen una alta compatibilidad y forman un enlace de carácter
covalente, ya que el oro es un ácido blando y el azufre una base blanda, según el
principio de Pearson estos se atraen con gran fuerza [35].
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
63
Para los espectros de las nanopartículas de oro comerciales A (Figura 16), al
compararlos se percibe claramente que existen cambios estructurales después de la
funcionalización para los nanoconjugados. Se observa que el grupo hidroxilo presente en
el espectro de AuNP estabilizadas con buffer de fosfatos a 3367 cm-1 ya no aparece en el
espectro de las nanopartículas funcionalizadas. Asimismo, la señal que se observa
cercana a 1000 cm-1 se atribuye a bandas que se desplazan a menor energía debido a la
formación de policonjugados asociados a los grupos aromáticos del antiCD20 [84]. Otra
evidencia de que ocurrió un cambio estructural se encuentra en el infrarrojo lejano, en
esta zona se exhiben las señales de las interacciones del azufre con otros átomos, tal es el
caso de la interacción que es de gran interés para los fines de este estudio entre el azufre
y el oro, este enlace se presenta a 283 cm-1 con una baja intensidad. Este hecho nos da
los argumentos para aseverar que se llevó a cabo la funcionalización de las
nanopartículas mediante un enlace de carácter covalente entre el oro y el azufre.
En los perfiles espectrales de las nanopartículas de oro comerciales B (figura 17) no
se encontraron cambios estructurales significativos, por lo tanto, no se puede confirmar
que se haya efectuado la funcionalización de las mismas, ya que tienen los mismos grupos
funcionales, además de que en éstas ya se había identificado el posible enlace entre el
oro y el azufre a 267 cm-1.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
64
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
NÚMERO DE ONDA (cm-1)
Conjugado AuNP sintetizadas
TRA
NSM
ITA
NC
IA (
%)
AuNP Sintetizadas
AntiCD20
700 600 500 400 300 200
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
700 600 500 400 300 200
NÚMERO DE ONDA (cm-1)
Conjugado AuNP sintetizadas
287
TRA
NSM
ITA
NC
IA (
%)
AuNP Sintetizadas
281
AntiCD20
a)
b)
Figura 15. Espectros de FT-IR de AuNP sintetizadas a) medio y b) lejano.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
65
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
NÚMERO DE ONDA (cm-1)
Conjugado AuNP comerciales A
TRA
NSM
ITA
NC
IA (
%)
AuNP Comerciales A
AntiCD20
700 600 500 400 300 200
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
700 600 500 400 300 200
NÚMERO DE ONDA (cm-1)
Conjugado AuNP Comerciales A
283
TRA
NSM
ITA
NC
IA (
%)
AuNP Comerciales A
AntiCD20
a)
b)
Figura 16. Espectros de FT-IR de AuNP comerciales A a) medio y b) lejano.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
66
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
NÚMERO DE ONDA (cm-1)
Conjugado AuNP comerciales B
TRA
NSM
ITA
NC
IA (
%)
AuNP Comerciales B
AntiCD20
700 600 500 400 300 200
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
700 600 500 400 300 200
NÚMERO DE ONDA (cm-1)
Conjugado AuNP Comerciales B
TRA
NSM
ITA
NC
IA (
%)
AuNP Comerciales B
AntiCD20
a)
b)
Figura 17. Espectros de FT-IR de AuNP comerciales B a) medio y b) lejano.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
67
Grupo funcional AuNP AuNP-AntiCD20 AntiCD20
Sintetizadas Comerciales A Comerciales B Sintetizadas Comerciales A Comerciales B
Hidroxilo (-OH) 3308
3367
Amida I s(N-H)
3280 3307 3630 3275 3267
Sobretono de Amida
II (N-H)
3088 3168 3099 3087 3074
Metilenos s (-CH2-);
as(-CH2-)
2880, 2935
2981, 3016 2940, 2884 2981,2948 3014, 2980 2962, 2934
Amida I (C=O) 1636 1646 1636 1634
Amida II (N-H) 1558 1575 1543 1557 1565
Amida III (C-N) 1435 1436 1436
: Vibración de estiramiento, puede ser simétrica (s) o asimétrica (as).
: Vibración de torsión, puede ser en el plano ( ip) o fuera del plano ( oop)
Tabla 8. Asignación de bandas vibracionales características del espectro FT-IR de las AuNP y el complejo AuNP-AntiCD20.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
68
Grupo funcional AuNP AuNP-AntiCD20 AntiCD20
Sintetizadas Comerciales A Comerciales B Sintetizadas Comerciales A Comerciales B
Anión carboxilato
s(COO-), as (COO-)
1393, 1586 1391
Hidrocarburos (C-C) 1109 1281 1260 1270 1281 1243
Fenilo s(C-H); ip(C-H)
(Fenilalanina)
1054 1040 1047 1053 1077
Indol (C-N-H)
(Triptofano)
989 989
Amida I oop (N-H) 659 664 645 659 645
Disulfuro (S-S) 527 529 542 527 542
C-S-Au (S-Au) 267 287 283 267
: Vibración de estiramiento, puede ser simétrica (s) o asimétrica (as).
: Vibración de torsión, puede ser en el plano ( ip) o fuera del plano ( oop)
Continuación tabla 8. Asignación de bandas vibracionales características del espectro FT-IR de las AuNP y el complejo AuNP-AntiCD20.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
69
3.4.1. Parámetro de agregación
El parámetro de agregación respecto al tiempo o cinética de agregación, se
efectuó siguiendo el valor de la longitud de onda correspondiente al pico de resonancia
del plasmón de superficie de la nanopartícula conjugada. En la figura 18 se sitúan los
espectros del conjugado tomados a diferentes tiempos, de las nanopartículas de oro
comerciales B y las sintetizadas.
Figura 18. Curvas de respuesta espectral del parámetro de agregación;
a) AuNP-AntiCD20 (comerciales B). b) AuNP-AntiCD20 (sintetizadas).
a)
b)
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
70
El comportamiento del SRP del conjugado se siguió para adquirir el parámetro de
estabilidad de los complejos formados. Estos espectros confirman la estabilidad observada
que presentan los conjugados al momento de realizar la funcionalización.
El complejo AuNP-AntiCD20 de AuNP comerciales B tiene una estabilidad muy
baja, como se observa en los espectros, el complejo es estable para menos de 1 hora e
inmediatamente el complejo comienza a desestabilizarse y como consecuencia forma un
precipitado morado proporcionando un máximo de absorción a 560nm. La banda de
absorción es más ancha que para el complejo formado por las AuNP sintetizadas, esto
corresponde a que alrededor de la nanopartícula existe un estabilizante grande. Y, como
es de esperarse, para las AuNP sintetizadas la banda comienza a ensancharse debido a lo
mencionado anteriormente.
Para el conjugado AuNP-AntiCD20 compuesto por las nanopartículas sintetizadas
(estabilizadas con citrato) y 10 moléculas de anti-CD20, la tendencia que sigue es un
cambio batocrómico conforme pasa el tiempo hasta llegar a un máximo de absorción a
la longitud de onda de 528.4 nm, desplazándose aproximadamente 10 nm comparado
con la suspensión original. Como es de esperarse, el cambio que se observo es debido a
un reemplazamiento de ligante (estabilizador) ya que el anticuerpo desplazo a los aniones
citrato formando enlaces de carácter covalente entre los átomos de oro de la superficie
de la AuNP y el azufre de la cisteína contenida en la proteína; el cambio de la absorción
del SRP fue casi inmediato, esto sugiere un rápido reemplazamiento de los iones citrato.
Está reportado en la literatura que las nanopartículas de oro tienen gran afinidad química
por el azufre, esta afinidad se puede explicar mediante la teoría Pearson de ácidos y
bases duras y blandas [19,35]; ya que la nanopartícula de oro es un ácido blando, propio
de un metal noble, y el azufre una base blanda. Éste complejo es estable
aproximadamente por 24 horas.
La agregación de las nanopartículas de oro conduce a una nueva absorción a
longitudes de onda más largas debido al acoplamiento dipolar entre los plasmones de
partículas vecinas que forman los agregantes. Como una medida empírica del proceso
de aglomeración, el parámetro de agregación mide la variación de la absorbancia
integrada entre 600 y 700 nm. Entonces, el parámetro de agregación (PA) se define de la
siguiente manera: . Donde A es la absorbancia integrada entre 600 a 700
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
71
nm de la muestra en un momento dado y A0 es la absorbancia integrada de 600 a 700
nm al momento inicial. La Figura 19 y 20 muestran el parámetro de agregación de los
diferentes complejos, para el complejo AuNP-AntiCD20 (sintetizadas) se observa que la
desestabilización del sistema va incrementando y al llegar a 100 min aproximadamente
comienza a mantenerse estable (figura 19). Para el complejo formado por AuNP
comerciales B se observa que el parámetro de agregación aumenta y no existe un punto
donde se mantenga estable (figura 20).
0 50 100 150 200 250
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
PA
RÁ
METR
O D
E A
GR
EG
AC
IÓN
TIEMPO (min)
Figura 19. Parámetro de agregación del complejo de AuNP-AntiCD20 (Sintetizadas).
0 50 100 150 200 250
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
PA
RÁ
METR
O D
E A
GR
AG
AC
IÓN
TIEMPO (min)
Figura 20. Parámetro de agregación del complejo de AuNP-AntiCD20 (comerciales B).
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
72
3.4.2. Espectroscopía de correlación de fotones
Mediante la espectroscopía de correlación de fotones se determinó el diámetro
hidrodinámico de las nanopartículas de oro funcionalizadas con el antiCD20, éste fue
medido a diferentes tiempos (0, 15, 30 y 60 minutos) después de ser preparadas. Así mismo
se midió el potencial Z para verificar la estabilidad de cada nanoconjugado AuNP-
AntiCD20.
Para los nanoconjugados de AuNP comerciales A, sintetizadas y comerciales B, se
obtuvo un potencial Z de -40.4 ± 1.57 mV, -43.8 ± 3.54 mV y 24.4 ± 2.87 mV
respectivamente. Estos resultados nos proporcionan una idea detallada de la magnitud
de las repulsiones o atracciones electrostáticas entre las nanopartículas funcionalizadas,
es decir, la estabilidad del coloide. Mientras más alto sea el valor del potencial Z,
independientemente de su signo, la estabilidad aumenta y viceversa, por lo tanto, el
sistema más estable es el de las AuNP sintetizadas, seguido de las AuNP comerciales A y
por último las AuNP comerciales B. Respecto a los potenciales iniciales de las suspensiones
de AuNP se observa que la estabilidad disminuyo, sin embargo, se sigue considerando
como buena estabilidad para los sistemas de AuNP comerciales A y las sintetizadas.
En la tabla 9 se muestra que para el nanoconjugado compuesto por las AuNP
comerciales A el diámetro hidrodinámico va incrementando; tomando en cuenta que el
diámetro hidrodinámico de las nanopartículas sin funcionalizar es de 21 nm, éste aumento
10 veces el tamaño original después de 1 hora de haberlas preparado debido a la unión
al anticuerpo y a las interacciones débiles entre los sistemas. Para las nanopartículas
sintetizadas se toma la misma consideración y ocurre un efecto similar, sin embargo, para
estos nanoconjugados el diámetro aumentó 15 veces el tamaño original después de 1
hora de ser preparadas, esto da suficiente evidencia para aseverar que si se llevó a cabo
la unión del anticuerpo a la nanopartícula en cada sistema AuNP-AntiCD20 y se descarta
que se haya llevado un proceso de aglutinación ya que como se mencionó
anteriormente, estas poseen una estabilidad del coloide muy alta derivado de un
potencial Z alto. El diámetro hidrodinámico de las AuNP comerciales B es de 23.8 ± 7.6 nm,
el incremento observado es de 7 veces el tamaño original, sin embargo, el sistema es muy
inestable, lo que lleva a pensar que tal vez este diámetro sea consecuencia de una
aglutinación de estas y no de una funcionalización.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
73
Tabla 9. Diámetro hidrodinámico de los nanoconjugados AuNP-AntiCD20.
Tiempo (min)
Diámetro hidrodinámico del sistema AuNP-AntiCD20
Comerciales A Sintetizadas Comerciales B
Sin funcionalizar
26.30 ± 3.5 19.95 ± 1.6 23.8 ± 7.6
0
137.74 ± 3.7 169.63 ± 10.1 96.7 ± 2.8
15
183.6 ± 13.8 261.4 ± 12.1 113.9 ± 28.2
30
232.7 ± 5.7 266.5 ± 3.8 163.1 ±| 12.4
60
213.32 ± 16.5 303.5 ± 29.3 170.0 ± 4.9
Los datos que se representan en la figura 21 son los obtenidos para verificar el
progreso de los diámetros hidrodinámicos de cada uno de los sistemas respecto al
tiempo. Se observa que los tres sistemas tienen el mismo comportamiento, es decir, van
incrementando como se mencionó anteriormente; es probable que esto se deba al
proceso de la reacción, ya que conforme pasa el tiempo las moléculas de antiCD20 que
tienen un diámetro aproximado de 20 a 40 nm [87] se van incorporando a la AuNP y por
esta razón el diámetro hidrodinámico es muy grande respecto al diámetro inicial.
0 10 20 30 40 50 60
100
150
200
250
300
350
DIÁ
METR
O H
IDR
OD
INÁ
MIC
O (
nm
)
TIEMPO (min)
Comerciales A
Sintetizadas
Comerciales B
Figura 21. Estabilidad del tamaño del complejo AuNP-AntiCD20 respecto al tiempo.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
74
Las gráficas de distribución de tamaño de partícula se muestran en la figura 22.
Esta representación de los datos es muy útil ya que podemos inferir qué tan uniforme se
encuentra el tamaño de la partícula. Los tres sistemas a), b) y c) (tiempo cero) muestran
una distribución uniforme y simétrica inmediatamente después de la funcionalización. En
las gráficas de distribución para las AuNP comerciales A (d)) y las AuNP comerciales B (f))
una hora después de ser preparadas, demuestran que ambas se inclinan hacia un valor
alrededor de 200 nm, sin embargo esta distribución tiende a ser asimétrica, esto
probablemente se deba a que las AuNP aún están buscando un equilibrio y siguen
reaccionando con el antiCD20. La distribución de las AuNP sintetizadas una hora después
de ser funcionalizadas (e)) es una gráfica que tiende a ser uniforme y simétrica, esto se
interpreta como que a este tiempo ya se completó la reacción y el tamaño de la
partícula es más uniforme.
10 100 1000
0
10
20
30
Tamaño (nm)
%C
ha
nn
el
0
20
40
60
80
100
%P
ass
ing
10 100 1000
0
10
20
30
Tamaño (nm)
%C
ha
nn
el
0
20
40
60
80
100
%P
ass
ing
10 100 1000
0
10
20
30
Tamaño (nm)
%C
ha
nn
el
0
20
40
60
80
100
%P
ass
ing
10 100 1000
0
10
20
30
Tamaño (nm)
%C
ha
nn
el
0
20
40
60
80
100
%P
ass
ing
10 100 1000
0
10
20
30
Tamaño (nm)
%C
ha
nn
el
0
20
40
60
80
100
%P
ass
ing
10 100 1000
0
10
20
30
Tamaño (nm)
%C
ha
nn
el
0
20
40
60
80
100
%P
ass
ing
Figura 22. Gráficas de distribución del tamaño de partícula. a), b) y c) medidas al tiempo cero,
d), e) y f) medidas después de 60 minutos postpreparadas.
a) b) c)
d) e) f)
Comerciales A Sintetizadas Comerciales B
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
75
3.4.3. Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
La morfología de las nanopartículas de oro después de ser funcionalizadas con el
anticuerpo antiCD20, se estudió mediante las imágenes obtenidas por microscopía
electrónica de transmisión. Los tres tipos de nanopartículas de oro se sometieron a esta
prueba dando como resultado las micrografías representadas en la figura 23. El inciso a)
muestra la morfología de las AuNP comerciales B, en la parte inferior derecha se observa
una capa translúcida, la cual se deduce que es el material que estabiliza a estas
nanoesferas, cabe señalar que esta no es evidencia suficiente para afirmar que se llevó a
cabo la funcionalización debido a que las micrografías de las AuNP sin funcionalizar
muestran una morfología similar. Inciso b), en esta imagen se observan los cuerpos
esféricos pero, es difícil visualizar la cubierta transparente que se busca, sin embargo, en la
parte inferior de esta micrografía se puede observar una delgada cubierta que no se
observa en las AuNP sin funcionalizar, esto se atribuye al anticuerpo unido a la superficie
de la nanopartícula. Y por último, en el inciso c) se observa claramente que los cuerpos
esféricos se encuentran estabilizados por una capa translúcida que evita que estas
nanopartículas de oro comiencen a coalescer; por lo tanto, esta evidencia física
demuestra que el proceso de funcionalización se llevó a cabo.
Figura 23. Micrografías de las nanopartículas de oro funcionalizadas a) Comerciales B,
b) Comerciales A y c) Sintetizadas.
a) b) c)
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
76
3.4.4. Cuantificación de proteína
La importancia de cuantificar la proteína en los nanoconjugados es para verificar
si el anticuerpo se encuentra presente. Ésta cuantificación se realizó mediante la
metodología de la reacción de Biuret, sin embargo, como la concentración de proteína
en el nanoconjugado es baja se utilizó un compuesto llamado ácido bicinconínico. El
ácido Bicinconínico es utilizado para la determinación de proteínas en baja
concentración; a altas temperaturas (37°C a 60°C), los enlaces peptídicos presentes en las
proteínas reducen el cobre (II) a cobre (I), por lo tanto se producen resultados que
correlacionan la cuantificación de proteínas. Cada ión cobre (I) forma un complejo
(figura 24) con dos moléculas de ácido Bicinconínico, creando un producto coloreado
color púrpura que absorbe radiación electromagnética a 540 nm. Los datos de las
muestras desconocidas se trazan frente a una curva estándar. En la tabla 10 se resumen
los resultados obtenidos.
Proteína + Cu2+ Cu1+
Cu1+ +
N
N
COOH
COOH
2
N
N
COOH
COOH
N
N
HOOC
HOOC
Cu1+
Ácido Bicincinínico (BCA) Complejo Cu1+(BCA)2
Figura 24. Reacciones que revelan la presencia de proteína.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
77
Tabla 10. Concentración de proteína presente en los nanoconjugados.
Nanoconjuagados Concentración de proteína (μg/ml)
AuNP-AntiCD20
(Comerciales A) 54.64 ± 2.74
AuNP-AntiCD20
(Sintetizadas) 74.20 ± 3.14
AuNP-AntiCD20
(Comerciales B) 44.53 ± 8.54
Para los sistemas multivalentes de Comerciales A y sintetizadas en los cuales se
adicionó la misma cantidad de anticuerpo se debería obtener la misma concentración
de proteína, sin embargo, se observa una diferencia entre estas cantidades.
Probablemente esta diferencia se deba a interferencias producidas por las sustancias
usadas como conservadores (azida de sodio y ácido tánico) en las AuNP comerciales A,
esta suposición se establece ya que esta reportado en el protocolo del kit que entre las
sustancias que interfieren se encuentra que la azida de sodio solo es tolerada en una
solución al 0.2 % y en la suspensión de las AuNP comerciales A se tiene un porcentaje de
uno (1%), por esta razón se observa la disminución de la concentración. Para las AuNP
comerciales B se tiene una concentración más alta de lo que se esperaba, ya que se
adicionó solo una tercera parte de antiCD20 respecto a los anteriores nanoconjugados;
este aumento confirma que el estabilizador del coloide es una proteína o un péptido, en
donde sus enlaces peptídicos están contribuyendo al aumento de esta concentración.
3.4.5. Cuantificación de grupos sulfhidrilo
La cuantificación de grupos sulfhidrilo (tiol, -SH) se realizó para determinar los
grupos tiol que están libres y así elucidar cuantos están unidos a la nanopartícula,
recordando que la unión del antiCD20 y la AuNP se efectúa mediante un enlace
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
78
covalente con el azufre. Como bien sabemos, la cisteína y la metionina son aminoácidos
que contienen azufre en su estructura, sin embargo, el azufre de la metionina está unido a
un metileno mediante un enlace covalente y no es posible su disociación para poder
participar en el enlace con la AuNP; mientras tanto, el azufre de la cisteína está unido a
un hidrógeno (grupo tiol) y éste si es posible que se disocie para quedar libre y poder
formar el enlace covalente con la AuNP ya que tiene más afinidad por el oro que por el
hidrógeno. Por esta razón utilizando la secuencia de aminoácidos (tabla 11) presentes en
la molécula de antiCD20 se observó que el número de cisteínas comprendidas en la
estructura proteica es de 32 (16 por cada cadena).
Tabla 11. Secuencia de aminoácidos del antiCD20.
Secuencia de aminoácidos de AntiCD20 (Rituximab)
Rituximab quimérico, cadena pesada
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSY
NQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVS
AASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS
SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY
NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD
ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Rituximab quimérico, cadena ligera
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVR
FSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPS
DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL
SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
79
La reacción que se lleva a cabo entre los grupos tiol y el reactivo de Ellman se
muestra en la figura 25. El TNB (5-tio-2-ácido nitrobenzóico), es una especie coloreada
producto de la reducción del reactivo de Ellman con un coeficiente de extinción molar
alto (14 150 M-1 cm-1) en el rango del visible a 412 nm y a un pH de 8. Los grupos sulfhidrilo
se estimaron usando el coeficiente de extinción molar del TNB.
N
O
O
OH
O
S
S N
O
O
O
OH
+ R-S S N
O
O
O
OH
SR
S N
O
O
O
OH
+
Reactivo de Ellman
DTNB2-
5,5'-ditio-bis-(2-ácido nitrobenzóico)
TNB2-Disulfuro mixto
Figura 26. Reacción de reducción del reactivo de Ellman para la determinación de grupos sulfhidrilo.
Los valores estimados para los grupos sulfhidrilo resumidos en la tabla 12, revelan
que para los nanoconjugados de AuNP comerciales A y el de AuNP sintetizadas se tienen
12.58 y 13.84 grupos sulfhidrilo libres respectivamente por cada molécula de antiCD20, por
lo tanto al comparar estos resultados con los 32 de grupos sulfhidrilo que teóricamente
tendría la molécula de antiCD20, se asume que aproximadamente 19 cisteínas se
encuentran unidas, ya sea a la nanopartícula de oro o formando puentes disulfuro. Para
las AuNP comerciales B se obtuvo un valor negativo, probablemente se deba a alguna
interferencia con la prueba o que no existen grupos sulfhidrilo libres en este sistema.
Tabla 12. Grupos sulfhidrilo presentes en el nanoconjugado.
Nanoconjuagados
Grupos sulfhidrilo por molécula de
AntiCD20
AuNP-AntiCD20 (comerciales A) 12.6 ± 5.8
AuNP-AntiCD20 (Sintetizadas) 13.8 ± 5.8
AuNP-AntiCD20 (comerciales B) Negativo
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
80
3.5. RADIOMARCADO DEL COMPLEJO AuNP-AntiCD20 con 99mTc
El proceso para marcar el péptido HYNIC/octreótido, que actúa como ligante,
antes de ser adicionado a las nanopartículas de oro fue evaluado mediante la técnica de
HPLC con una columna de exclusión molecular y con detectores de UV y radiactividad
conectados en serie. El cromatograma obtenido se muestra en la figura 26. Dado que el
tiempo de retención del ión pertecnato es conocido (≈ 4 min), la señal de baja intensidad
observada a 3.8 min se atribuye a la señal del 99mTc libre (no reaccionó), correspondiente
a un 0.7% del radionuclido adicionado. Por otra parte, el pico apreciado a 14.3 min se
asocia al complejo 99mTc/EDDA/HYNIC/octreótido (figura 27), éste tiene una alta
intensidad, lo que nos lleva a considerar evidencia suficiente para aseverar que el
radiomarcado se ha realizado de manera exitosa y que el péptido radiomarcado
99mTc/EDDA/HYNIC/octreótido tiene una pureza radioquímica de 99.3%
0 5 10 15 20 25 30
0
200
400
600
800
1000
mV
TIEMPO (minutos)
Figura 26. Determinación de pureza radioquímica por HPLC/SEC (λ= 280 nm) de
99mTc/EDDA/HYNIC/OCTREOTIDO.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
81
TcO O
N
NN
O
H
O
H
HN N
NH
HN
O
O
O
NH
HN
S
O
OH
N
ONH
HN
O
HO
NH
HN
O
O
S
HO
HO
O
NH2
Figura 27. Estructura del péptido radiomarcado 99mTc/EDDA/HYNIC/OCTREOTIDO.
Cabe señalar que la elección del ligante es muy importante, ya que éste debe
formar enlaces fuertes, tanto con el radionúclido como con el péptido y este a su vez con
las nanopartículas de oro, como es el caso de este trabajo. Al analizar la estructura
mostrada en la figura 27, se observa que la esfera de coordinación formada entre el
HYNIC y el radioisótopo 99mTc es muy estable debido a que es un ligante multifuncional. Así
mismo este ligante se une a la cadena N-terminal del péptido octreótido, éste péptido
contiene en su estructura dos cisteínas, las cuales están formando el puente disulfuro.
Como ya se ha mencionado anteriormente las nanopartículas de oro tienen gran afinidad
por los grupos tiol, por lo tanto, este péptido se unirá a la nanopartícula de oro fácilmente
en cuanto se disocie el enlace disulfuro (S-S). La estructura del sistema multivalente
radiomarcado se muestra en la figura 28.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
82
Figura 28. Estructura del sistema multivalente 99mTc/EDDA/HYNIC/octreótido-AuNP-AntiCD20.
3.6. ESTUDIOS in vitro
3.6.1. Prueba de estabilidad en suero
Para la evaluación de la estabilidad del sistema AuNP-AntiCD20 por cromatografía
de exclusión molecular se requirió marcarlo con 99mTc. El radiomarcado del sistema se
realizó utilizando el método reportado para la preparación de radiofármacos basados en
nanopartículas de oro, que consiste en marcar el péptido HYNIC-Octreótido con 99mTc y su
posterior funcionalización a la superficie de las AuNP a través del puente disulfuro formado
entre las cisteínas de esta secuencia.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
83
El sistema multivalente radiomarcado con 99mTc se sometió a pruebas de
estabilidad en suero humano (1:10, v:v) para garantizar que mantiene su estructura en
este medio, lo cual condicionaría su tiempo de vida media biológico.
Los estudios de estabilidad del radiofármaco en suero humano son necesarios
antes de su evaluación in vivo. El estudio se realizó a diferentes tiempos: tiempo inicial (0
h), 4 h y 24 h por cromatografía de exclusión molecular empleando una columna Protein
Pac SEC 300W (waters) y las siguientes condiciones en el sistema: Fase móvil: Agua grado
inyectable, Flujo: 1 mL /min, detector de arreglo de diodos (longitud de onda variable) y
detector de radiactividad conectados en serie.
En la figura 29 se muestra el cromatograma del AntiCD20 en el sistema descrito
previamente, el tiempo de retención observado fue de 6.91 min y su espectro asociado
muestra un máximo de absorción (0.934) a 277 nm. No se presenta radiocromatograma
puesto que no existe radionúclido en el antiCD20.
0 10 20 30 40
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
200 250 300 350 400
0.0
0.5
1.0 b)Anti-CD20
TR=6.91
u.a
.
Tiempo(min)
a)
276.962, 0.934
u.a
Longitud de onda (nm)
Figura 29. Cromatograma y espectro de absorción UV-Vis asociado al tiempo de retención de
AntiCD20.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
84
Después de la funcionalización de las nanopartículas de oro con 99mTc-
EDDA/HYNIC-Octreótido se obtuvo un tiempo de retención de 4.005 min. En la figura 30 se
muestra el cromatograma obtenido y su espectro de absorción UV-Vis asociado.
0 5 10 15 20
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
300 350 400
0.006
0.007
0.008
0.009
0.010
u.a
.
Tiempo(min)
99mTc-AuNP
TR= 4.005 min
365.019 nm
u.a
.
Longitud de onda (nm)
Figura 30. Cromatograma y espectro de absorción UV-Vis asociado al tiempo de retención del
sistema 99mTc-EDDA/HYNIC-Octreótido.
En el estudio de estabilidad en suero del sistema multivalente 99mTc-EDDA/HYNIC-
Octreótido-AuNP-AntiCD20 (figura 31), se observa un tiempo de retención de 5.3 min. Este
pico tiene asociado el espectro de UV característico del AntiCD-20, lo que confirma que
se formó un solo sistema. Al tiempo 12.2 min se observa un pico correspondiente a 99mTc
transquelado a la cisteína, que a las 24 h se observa un aumento. El sistema multivalente
cambia su tiempo de retención a 6.3 min a las 4 h y a 9 a las 24 h, esto debido a la
interacción del sistema multivalente con las proteínas del suero, sin embargo, a este
tiempo se sigue observando una sola banda del complejo, lo que nos indica que el
sistema se mantiene estable a las 24 h, por lo que podría ser usado en la evaluación in
vivo y permanecer estable de 0 a 24 h.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
85
0 10 20
0
33
66
99
0
33
66
99
0
33
66
99
0 10 20
mV
TIEMPO (min)
t=24horas
mV
t=4horas
mV
t=0
Figura 31.Cromatogramas de radiación que muestran la estabilidad en suero humano del sistema
multivalente 99mTc/EDDA/HYNIC/octreótido-AuNP-AntiCD20 a diferentes tiempos después del
contacto con el suero humano.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
86
3.6.2. Efecto del complejo AuNP-AntiCD20 sobre la expresión del gen Bcl-2 humano
En este estudio se examinó la señalización apoptótica mediante el seguimiento de
la concentración del Bcl-2 en la línea celular de linfoma no-Hodking CD20 positivas (Raji)
después de ser sometidas a tratamientos con antiCD20, AuNP y un sistema multivalente
AuNP-AntiCD20. Los tratamientos a los cuales se sometieron son los siguientes:
Tabla 13. Tratamientos empleados para la línea celular Raji.
TRATAMIENTOS CONCENTRACIÓN
AntiCD20 20 μg/ml
AuNP (Comerciales A) 6.58x1011 nps/ml
AuNP (Sintetizadas) 6.54x1011 nps/ml
AuNP-AntiCD20 (Comerciales A) 6.58x1011 nps • 13 μg /ml
AuNP-AntiCD20 (Sintetizadas) 6.54x1011 nps • 13 μg /ml
PBS (control) ---
Como se mencionó anteriormente, el antiCD20 (Rituximab) está indicado en el
tratamiento de linfomas no-Hodking de células B en pacientes que hayan recaído o que
sean refractarios a otros tratamientos [17]. Por otra parte, se ha reportado que las
nanopartículas de oro muestran actividad pro-apoptótica mediante la disminución de
expresión del gen Bcl-2 en células B de leucemia linfocítica crónica [1]. Por lo tanto en
este experimento se estudia el comportamiento de la combinación de ambos sistemas
que inducen la actividad pro-apoptótica en células CD20 positivas (Línea celular Raji). Los
resultados del efecto sobre la expresión del gen Bcl-2 del sistema multivalente compuesto
por nanopartículas de oro se muestran en la tabla 14 y se representan gráficamente en la
figura 32.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
87
Tabla 14. Concentración y porcentaje de disminución de Bcl-2 presente en la línea celular Raji
después de ser sometidas a diferentes tratamientos con AuNP y AntiCD20.
TRATAMIENTO
CONCENTRACIÓN de Bcl-2
(ng/ml)
DISMINUCIÓN
RESPECTO AL PBS
AntiCD20 19.85 ± 0.63 10.18 %
AuNP (Comerciales A) 14.24 ± 0.08 35.49 %
AuNP (sintetizadas) 14.45 ± 0.32 34.77 %
AuNP-AntiCD20
(Comerciales A) 13.47 ± 0.03
39.05 %
AuNP-AntiCD20
sintetizadas 13.07± 0.02
40.87 %
PBS 22.10 ± 0.13 0
PBS AntiCD20 AuNP AuNP-AntiCD200
5
10
15
20
CO
NC
EN
TRA
CIÓ
N D
E B
cl-2 (
ng
/ml)
PBS AntiCD20 AuNP AuNP-AntiCD200
5
10
15
20
CO
NC
EN
TRA
CIÓ
N D
E B
cl-2 (
ng
/ml)
Figura 32.Representación gráfica de la concentración de Bcl-2 presente en la línea celular Raji
después de someterse a diferentes tratamientos con AuNP y AntiCD20.
a) AuNP Comerciales A y b) AuNP Sintetizadas.
a) b)
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
88
Los resultados de la concentración de Bcl-2 mostrados en la tabla 14 demuestran
que efectivamente todos los tratamientos tienen un efecto en la expresión de esta
proteína sobre la membrana mitocondrial. Los porcentajes de disminución se calcularon
tomando en cuenta que el PBS (control) fue el 100%, por lo tanto, para el antiCD20 se
tiene una disminución del 10.18 %, esta concentración es baja respecto a lo esperado ya
que el antiCD20 es un anticuerpo que induce la apoptosis, esto se debe a que la
inducción a la apoptosis efectuada por el antiCD20 se realiza por vías complejas que
involucran la participación del sistema inmunológico y por esta razón no se observa en
esta prueba in vitro. Para los tratamientos con nanopartículas de oro comerciales A y las
Sintetizadas se observa una disminución considerable respecto al control ya que
disminuyeron un 35.49 % y 34.77 % respectivamente, lo que comprueba que las
nanopartículas de oro de 20 nm si tienen un efecto en la expresión del gen Bcl-2. Para los
sistemas multivalentes la disminución se observa en 39.05 % y 40.87 % respectivamente, es
una buena disminución respecto al control, sin embargo, es muy similar a la que producen
las nanopartículas de oro sin antiCD20.
Sin AntiCD20 AuNP AuNP-AntiCD20
0
5
10
15
20
25
*
**
**
(+ control)
Tratamientos
Co
nc
en
tra
ció
n d
e B
cl-2 (
ng
/ml)
*
tratamiento
Figura 33. Concentración de Bcl-2 en la línea celular Raji (LNH) expuestas a diferentes
tratamientos con AuNP sintetizadas. * Diferencia estadísticamente significativa (p <0.05) comparado
con AntiCD20, **Diferencia estadísticamente significativa (p <0.05) comparada con el grupo sin
tratamiento.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
89
Se realizó un análisis de datos más completo para los resultados arrojados por los
tratamientos que llevan nanopartículas de oro sintetizadas, el análisis demuestra que la
concentración 13.07 ± 0.02 ng / ml del sistema multivalente AuNP-AntiCD20, fue
significativamente menor (P<0.05) en comparación con la del tratamiento con
nanopartículas de oro estabilizadas con citrato (14.45 ± 0.32 ng / ml), así como para el
tratamiento con AntiCD20 (14.45 ± 0.32 ng / ml) (Figura 33). Por lo tanto, se demuestra que
la conjugación de anti-CD20 a nanopartículas de oro de 20 nm mejora forma significativa
la disminución de Bcl-2, mediante un efecto sinérgico.
Se ha reportado, que la terapia combinada que involucra al anticuerpo antiCD20,
ha tenido muy buenos resultados; tal es el caso de la unión entre la inmunoterapia (anti-
CD20, tositumomab) y la radioterapia (radionúclido, 131I) que al igual que los resultados
obtenidos en este trabajo muestra un efecto sinérgico sobre la disminución en la expresión
del gen Bcl-2, realizando sus estudios en pacientes con linfoma folicular que han tenido
una recaída después de la refracción a la quimioterapia [88], sin embargo, la ventaja que
se tiene al utilizar nanopartículas de oro es que al conjugarlas con el anticuerpo, éstas
forman sistemas multivalentes capaces de captar más células cancerígenas, además del
efecto demostrado sobre la disminución de la expresión del gen anti-apoptótico Bcl-2.
CONCLUSIONES
90
4
CONCLUSIONES
En este trabajo se ha demostrado que la ruta sintética basada en la reacciones
redox entre el ácido tetracloroaurico y el citrato de sodio propuesta por Turkevich, es
eficaz para la obtención de nanopartículas de oro de 20 nm estabilizadas con aniones
citrato, los cuales demuestran ser un excelente estabilizador coloidal. Esta aseveración se
realiza debido a que se tienen las evidencias suficientes a partir de la caracterización
mediante técnicas espectroscópicas y microscópicas que demuestran la obtención de
nanopartículas de oro de 20 nm estabilizadas con aniones citrato.
Al funcionalizar las nanopartículas de oro sintetizadas con el anticuerpo antiCD20,
se construyó el sistema multivalente, objetivo de este trabajo; mediante el mismo
procedimiento se llevó a cabo la funcionalización de nanopartículas de oro comerciales
(A y B). Al evaluar los tres sistemas multivalentes se obtuvo que los nanoconjugados más
estables son los constituidos por nanopartículas de oro sintetizadas y las comerciales A,
esta aseveración se efectúa teniendo como respaldo los resultados arrojados por el
parámetro de agregación y valor del potencial Z de las suspensiones coloidales. La
caracterización por espectroscopía de UV-Vis indica que hubo un cambio estructural en
la superficie de la nanopartícula de oro ya que la absorción debida al SRP se desplazó a
una longitud de onda más larga; asimismo los perfiles espectrales de FT-IR demuestran que
existe un cambio estructural al presentarse una absorción debida al enlace entre el oro de
la superficie de la AuNP y el azufre de la cisteína de la proteína, esto para los
nanoconjugados más estables. El diámetro hidrodinámico tuvo un incremento
considerable en las nanopartículas de oro al adicionarse el antiCD20 a la superficie de la
nanopartícula. Otra evidencia se encontró en las micrografías donde se observó una
capa translúcida que también demostró que las nanopartículas de oro fueron
funcionalizadas. En conclusión, estas evidencias indican que la adición del anticuerpo,
CONCLUSIONES
91
antiCD20, a la superficie de la nanopartícula de oro se llevó a cabo mediante la
formación de un enlace de carácter covalente entre el oro y el azufre; y que los sistemas
multivalentes más estables son los constituidos por nanopartículas de oro sintetizadas y las
comerciales A.
Los sistemas multivalentes más estables se evaluaron en la línea celular Raji (células
CD20 positivas), cuantificando la concentración de la expresión del gen Bcl-2 mediante
un ensayo inmunoenzimático, demostrando que todos los tratamientos tienen influencia
sobre la disminución de esta proteína. Las nanopartículas de oro sintetizadas estabilizadas
con aniones citrato, así como las nanopartículas de oro funcionalizadas demostraron
tener un efecto significativo respecto al control y al antiCD20, asimismo, la diferencia
estadísticamente significativa entre las nanopartículas de oro funcionalizadas y las
nanopartículas de oro estabilizadas con citrato permite llegar a la conclusión de que si
existe un efecto sinérgico al unir el anticuerpo, antiCD20, a la nanopartícula de oro. Por lo
tanto, el objetivo de este trabajo se cumplió satisfactoriamente, debido a que el sistema
multivalente podrá tener un enfoque de terapia combinada, es decir, ambos
componentes demuestran trabajar en conjunto para disminuir la concentración de la
expresión del gen anti-apoptótico Bcl-2 en células CD20 positivas, específicamente en la
línea celular Raji. Es así que se puede aseverar que el nanoconjugado es conveniente
para usar como un agente específico de blancos moleculares, útil para el tratamiento del
linfoma no Hodking.
TRABAJO FUTURO
92
5
TRABAJO FUTURO
Como trabajo a futuro se propone realizar pruebas de viabilidad celular, es decir,
una prueba que permita conocer el número de células que sobreviven al tratamiento.
Este tipo de pruebas se deben realizar simultáneamente con las prueba de cuantificación
de Bcl-2 para poder relacionar ambos experimentos, asimismo se sugiere realizar los
experimentos a una mayor exposición con el tratamiento.
Otra propuesta para continuar con este trabajo es realizar sistemas multivalentes
que tengan como núcleo nanopartículas de oro de un diámetro mayor, esto para ver si el
área superficial de la nanopartícula de oro permite la adición de mayor número de
anticuerpos y así incrementar la captación de células dañadas.
Finalmente, se propone realizar pruebas de citotoxicidad con células normales,
para verificar que el sistema multivalente AuNP-AntiCD20, no destruya células sanas y así
comprobar su especificidad para células CD20 positivas. En caso de que se compruebe
que el sistema multivalente no es citotóxicos para células sanas, se puede evaluar el
sistema multivalente en organismos complejos como lo son los modelos murinos.
REFERENCIAS
93
6
REFERENCIAS
1 Mukherjee P., Bhattacharya R., Bone N., K Lee Y., Ranjan Patra C., Wang S., Lu L.,
Secreto C., Banerjee P., Yaszemski M. J., Kay N. E., Mukhopadhyay D. Potential
therapeutic application of gold nanoparticles in B-chronic lymphocytic leukemia
(BCLL): enhancing apoptosis. Journal of Nanobiotechnology, 5 (2007), 11-23.
2 Cancer [página en internet]. Geneva: World Health Organization. Citado Oct 25,
2013.
3 Barreto J. A., O'Malley W., Kubeil M., Graham B., Stephan H. and Spiccia L.
Nanomaterials: Aplications in Cancer Imaging and Therapy. Advanced Healthcare
Materials, I (2011), H18-H40.
4 Olmedo I., Araya E., Sanz F., Medina E., Arbiol J., Toledo P. How Changes in the
secuence of the peptide CLPFFD-NH2 can modify the conjugation and stability of
gold nanoparticles and their affinity for b-amyloid fibrils. Bioconjugate Chemistry, 19
(2008), 1154-1163.
5 [http://www.cancer.gov/dictionary?cdrid=45368]., Tomado de la página web del
“National Cancer Institute at the National Institutes of Health”.
6 J., Knowles M. A. and Selby P. Introduction to the Cellular and Molecular Biology of
Cancer. Oxfrod University Press, Oxford Nueva York, 2005.
7 Sahn D, J.A. Ledbetter, O.W. PressCancer Inmunol, Immunother. Signaling events
involved in anti-CD20-induced apoptosis of malignant human B cells. Cancer
Immunology, Immunotherapy, 48 (2000), 673-683.
8 Drexler H. G., Minowada J. History and classification of human leukemia-lymphoma
cell lines. Leukemia & Lymphoma, 31 (1998), 305–316.
9 J.V., Pulvertaft R. Cytology of Burkitt’s tumour (African lymphoma). Lancet, I (1964),
238–240.
REFERENCIAS
94
10 Klein G. Specific chromosomal translocations and the genesis of B cell-derived tumors
in mice and men. Cell, 32 (1983), 311-315.
11 L., Bennington J. Diccionario enciclopédico del laboratorio clínico. Editorial médica
panamericana, Madrid, España, 2000.
12 Zimonjic DB, Keck-Waggoner C, Popescu NC. Novel genomic imbalances and
chromosome translocations involving c-myc gene in Burkitt’s lymphoma. Leukemia ,
15 (2001), 1582–1588.
13 Lisovsky M., Estrov Z., Zhang X., Consoli U., Sanchez-Williams G., Snell V., Munker R.,
Goodacre A., Savchenko V., Andreeff, M. Flt3 ligand stimulates proliferation and
inhibits apoptosis of acute myeloid leukemia cells: regulation of Bcl-2 and Bax. Blood,
88 (1996), 3987-3997.
14 Massaia M., Borrione P., Attisano C., Barral P., Beggiato E., Montacchini L., Bianchi A.,
Boccadoro M., Pileri A. Dysregulated Fas and Bcl-2 expression leading to enhanced
apoptosis in T cells of multiple myeloma patients. Blood, 85 (1995), 3679-3687.
15 Reed J.C., Miyashita T., Takayama S., Wang H.G., Sato T., Krajewski S., ime-Sempe C.,
Bodrug S., Kitada S., Hanada M. BCL-2 family proteins: regulators of cell death
involved in the pathogenesis of cancer and resistance to therapy. Journal of Cellular
Biochemistry , 60 (1996), 23-32.
16 Saha B., Golpan. Fundamentals of Nuclear Pharmacy. Springer-Velarg, Nueva York,
1998.
17 Roche. Rituximab, Monografía del anticuerpo monoclonal anti-CD20 Mabthera®.
18 Bhattacharya R., Mukherjee P. Biological properties of “naked” metal nanoparticles.
Advanced Drug Delivery Reviews, 60 (2008), 1289–1306.
19 J., Huheey. QUÍMICA INORGÁNICA. Principios de estructura y reactividad. Oxford,
New York, 1997.
20 Jansen, M. Homoatomic d10–d10 Interactions: Their Effects on Structure and
Chemical and Physical Properties. Angewandte Chemie International , 26 (1987),
1098-1110.
21 Md. N. I. Khan, S. Wang, J. P. Fackler,* Jr.. Synthesis and Structural Characterization of
[(n-Bu)4N]2 [Au2(i-MNT)2] (i-MNT=1,1-dicyanoethylene-2,2-dithiolate) and Its
Oxidative-addition Products [Ph4As]2 [Au2(i-MNT)2Cl2], [(n-Bu)4N]2 [Au2(i-MNT)2Br2]
and [(n-Bu)4N][Au(i-MNT)2]. Inorganic Chemistry, 28 (1989), 3579-3588.
REFERENCIAS
95
22 Tsunoyama, H., H. Sakurai, N. Ichikuni, Y. Negishi, and T. Ssukuda. Colloidal gold
nanoparticles as catalyst for carbon-carbon bond formation: Application to aerobic
homocoupling of phenylboronic acid in water. Langmuir, 23 (2004), 11293-11296.
23 Hua H., Chao X. and Jicun R. Nonbleaching Fluorescence of Gold Nanoparticles and
Its Applications in Cancer Cell Imaging. Analytical Chemistry, 80 (2008), 5951–5957.
24 Xiaohua H., Mostafa A. E. Gold nanoparticles: Optical propierties and
implementations in cancer diagnosis and photothermal therapy. Journal of
Advanced Research, 1 (2010), 13-28.
25 Kreibig U., Vollmer M. Optical properties of metal clusters. Springer, 1995.
26 Mie G. A contribution to the optics of turbid media, especially colloidal metallic
suspensions. Annals of Physics, 25 (1908), 377-445.
27 Link S., El-Sayed M. A. Size and temprature denpendence of the plasmon absortion of
colloidal gold nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry B, 21 (1999), 4212-4217.
28 Zhao-Zhin Joanna LIM, Jia-En Jasmine L., Cheng-Teng NG., Lin-Yue Lanry Y., Boon-Huat
B. Gold nanoparticles in cancer therapy. Acta Pharmacologica Sinica, Review, 32
(2011), 983-990.
29 Turkevich J, Garton G, Stevenson PC. The color of colloidal gold. Journal Colloid
Science, 9 (1954), 26-35.
30 Frens G., Kolloid Z. Controlled Nucleation for the Regulation of the Particle Size in
Monodisperse Gold Suspensions. Nature physical science, 241 (1973), 20-22.
31 Kimling J., Maier M., Okenve B. , Kotaidis V., Ballot H., and Plech A. Turkevich Method
for Gold Nanoparticle Synthesis Revisited. The Journal of Physical Chemistry B, 110
(2006), 15700–15707.
32 Didier D., Marie-Christine., Astruc. Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular
Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology,
Catalysis, and Nanotechnology. Chemical Reviews, 104 (2004), 293-346.
33 Sanjeev Kumar, K. S. Ganghi, and R. Kumar. Modeling of Formation of Gold
Nanoparticles by Citrate Method. Industrial & Engineering Chemistry Research, 46
(2007), 3128-3136.
34 P., Abid J. Thesis; Laser induced Synthesis and Nonlinear Optical Properties of Metal
Nanoparticles. Ecole polythecnique Federale de Lausanne, Lausanne, Switzerland,
2003.
REFERENCIAS
96
35 Pearson, Ralph G. Hard and soft acids and bases, HSAB, part 1: Fundamental
principles. Journal Chemical Education, 45 (1968), 581–586.
36 Zhang L. X., Sun X.P., Song Y. H., Jiang X., Dong S. J., Wang E. A.
Didodecyldimethylammonium bromide lipid bilayer-protected gold nanoparticles:
Synthesis, characterization, and self assembly. Langmuir, 22 (2006), 2838–2843.
37 Doolittle J. W., Dutta P. K. Influence of microwave radiation on the growth of AuNPs
and microporous zincophosphates in a reverse micellar system. Langmuir, 22 (2006),
4825–4831.
38 Okitsu K., Ashokkumar M., Grieser M., F. Sonochemical synthesis of AuNPs: Effects of
ultrasound frequency. The Journal of Physical Chemistry B, 109 (2006), 20673–20675.
39 Park J. E., Atobe M., Fuchigami T. Synthesis of multiple shapes of AuNPs with controlled
sizes in aqueous solution using ultrasound. Ultrasonics Sonochemistry, 13 (2006), 237–
241.
40 Mafune F., Kohno J. Y., Takeda Y., Kondow T. Full physical preparation of size-selected
gold nanoparticles in solution: Laser ablation and laser-induced size control. The
Journal of Physical Chemistry B, 106 (2002), 7575–7577.
41 Morales-Avila E., Ferro-Flores G., Ocampo-García B.E., Ramírez de la Cruz F. de M.
Radiolabeled Nanoparticles for Molecular Imaging. In Molecular Imaging; B. Schaller.
2012.
42 Ferro-Flores G., Ocampo-García B.E., Ramírez F. de M., Gutiérrez C. E., Arteaga de
Murphy C., Santos Cuevas C. L. Gold Nanoparticles Conjugated to peptides. In
Fanun. Colloids in Biotechnology. CRC Press Taylor & Francis Group, Estados Unidos de
América., 2011.
43 Hong H., Zhang Y., Sun J., Cai W. Molecular imaging and theraphy of cancer with
radiolabeled nanoparticles. Nanotoday, 4 (2009), 399-413.
44 Levy R., Than N. T. K., Doty R. C., Hussain I., Nichols R. J., Schiffrin D. J., Brust M., Ferning
D. Rational and combinatorial desingn of peptide capping ligands for gold
nanoparticles. Journal of the American Chemical Society , 126 (2004), 10076-10084.
45 Ocampo-García B. E., Ramírez F. de M., Ferro-Flores G., De León-Rodríguez L. M.,
Santos-Cuevas C. L., Morales-Avila E., Arteaga de Murphy C., Pedraza-López M.,
Medina L. A., Camacho-López M. A. 99mTc-labelled gold nanoparticles capped with
HYNIC-peptipeptide/mannose for sentinel lymph node detection. Nuclear Medicine
and Biology, 38 (2011), 1–11.
REFERENCIAS
97
46 Liu., S. Radiolabeled Cyclic RGD Peptides as Integrin alpha v-beta3 Targeted
Radiotracers: Maximizing Binding Affinity via Bivalency. Bioconjugate Chemistry, 29
(2009), 2199-2213.
47 Morales-Avila E., Ferro-Flores G., Ocampo-García B. E., De Leon-Rodríguez L. M.,
Santos-Cuevas C. L., García-Becerra R., Medina L. A., and Gomez-Olivan L. Multimeric
System of 99mTc-Labeled Gold Nanoparticles Conjugated to c[RGDfK(C)] for
Molecular Imaging of Tumor (v)β(3) Expression. Bioconjugate Chemistry, 22 (2011),
913–922.
48 H., Maeda. Vascular permeability in cancer and infection as related to
macromolecular drug delivery, with emphasis on the EPR effect for tumor-selective
drug targeting. Proceedings of the Japan Academy, Ser. B, Physical and Biological
Sciences, 88 (2012), 53-71.
49 Maeda H., Wu J., Sawa T., Matsumura Y., Hori K. Tumor vascular permeability and the
EPR effect in macromolecular therapeutics: A review. Journal of Controlled Release,
65 (2000), 271-284.
50 Ghosh P., Han G., Kyu Kim C., Rotello M.V. Gold Nanoparticles in delivery applications.
Advanced Drug Delivery Reviews, 60 (2008), 1307–1315.
51 Wang J., Sui M , Fan W. Nanoparticles for tumor targeted therapies and their
pharmacokinetics. Current Drug Metabolism, 11 (2010), 129-141.
52 Kim G. J., Nie S. Targeted cancer nanotehrapy. Materials Today, 8 (2005), 28-33.
53 Suna C., Lee J. S. H., Zhang M. Magnetic nanoparticles in MR imaging and drug
delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, 60 (2008), 1252–1265.
54 Chithrani B. D., Ghazani A. A., Chan W. C. W. Determining the Size and Shape
Dependence of Gold Nanoparticle Uptake into Mammalian Cells. Nano Letters, 6
(2006), 662-668.
55 Iversena T. G, Skotlanda T., Sandvig K. Endocytosis and intracellular transport of
nanoparticles: Present knowledge and need for future studies. Nano Today, 6 (2011),
176-185.
56 Krpeti Z., Porta F., E. Caneva,V. Dal Santo, and G. Scar. Phagocytosis of
Biocompatible Gold Nanoparticles. Langmuir, 26 (2010), 14799–14805.
57 Huanga J. G., Leshuka T., Gua F. X. Emerging nanomaterials for targeting subcellular
organelles. Nano Today, 6 (2011), 478-492.
REFERENCIAS
98
58 SabellaS., Brunetti V., Vecchio G., Galeone A., Maiorano G., Cingolani R., Pompa P. P.
Toxicity of citrate-capped AuNPs: an in vitro and in vivo assessment. Journal of
Nanoparticle Research , 13 (2011), 6821-6835.
59 Soenena S.J., Rivera-Gil P., Montenegro J. M., Parak W. J., De Smedta S. C.,
Braeckmans K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and
guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today, 6 (2011), 446-465.
60 Yildirimer L., Thanhb N. T.K., Loizidoua M., Seifalian A. M. Toxicological considerations of
clinically applicable nanoparticles. Nano today, 6 (2011), 585-607.
61 KhlebtsovN., Dykman L. Biodistribution and toxicity and engineered gold
nanoparticles: a review of in vitro and in vivo studies. Chemical Society Reviews, 40
(2011), 1647-1671.
62 Lewinski N., Colvin V., Drezek R. Cytotoxicity of nanoparticles. Small, 4 (2008), 26-49.
63 Verbruggen A., Coenen H. H., Deverre J.R., Guilloteau D., Langstrom B., Salvadori P.
A., Halldin C. Guideline to regulations for radiopharmaceuticals in early phase clinical
trials in the EU. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular, 35 (2008), 2144-
2155.
64 Wagner C. C., LangerO. Approaches using molecular imaging technology use of PET
in clinical microdose studies. Advanced Drug Delivery Reviews, 63 (2011), 539-546.
65 Services., U. S. Department of Health and Human. Food and Drug Administration. In
Guidance for Industry, Investigators, and Reviewers, Exploratory IND Studies. 2006.
66 Sayed E., Link S., M. A. Size and Temperature Dependence of the Plasmon Absorption
of Colloidal Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry B, 103 (1999), 4212-
4217.
67 Hutter E., Fendle J. H. Exploitation of localized Surface Plasmon Resonance.
Advanced Materials, 16 (2004), 1685-1706.
68 Skoog D. A., Crouch S. R., Holler F. J. Principles of instrumental Analysis. Saunders
College Pub, 1998.
69 Cabrejas., M. Levi de. Tomografía en Medicina Nuclear. Argentina : Comité de
instrumentación y garantía de calidad del Alabsmin, 1999.
70 Kogan M.J., Olmedo I., Hosta L., Guerrero A. R., Cruz L. J., Albericio R. Peptides and
metallic nanoparticles for biomedical aplications. Nanomedicine, 2 (2007), 187-306.
REFERENCIAS
99
71 Burt J. L., Gutierrez C., Miki M., and Yacamán M. J. Noble-Metal Nanoparticles Directly
Conjugated to Globular Proteins. Langmuir, 20 (2004), 11778-11783.
72 Aryal B. K. C., Reman N., Dharmaraj N., Bhattarai C.i Hun Kim, H. Yong Kim.
Spectroscopic identification of -S-Au interaction in cysteine capped gold
nanoparticles. Spectrochim Acta Part A, 63 (2006), 160-163.
73 Flegle S., Heckman J., Klomparens K. Scanning and transmisión electron microscopy,
an introduction. 1993.
74 Jillavenkatesa A., Dapkunas S. J., Lin-Sien H. Particle Size Characterization. National
Institute of Standards and Technology (2001), 69-93.
75 Skoog D. A., Holler F. J., and Nieman T. A. Principios de análisis instrumental.
McGrawHill, 2001.
76 Corporation, Microtrac. Nanotrac Wave: User's guide. 2013.
77 Zhang N., Khawli L. A., Hu, P., Epstein A. L. Selection of tumor antigens as targets for
immune attack using immunohistochemistry: protein antigens. Clinical Cancer
Research, 11 (2005), 5971-5980.
78 Chiu G. N. C., Edwards L. A., Kapanen A. I., Malinen M. M., Dragowska W. H.,
Warburton C., Chikh G. G., Fang K. Y. Y., Tan S., Sy J., Tucker C., Waterhouse D. N., and
Klasa R., Bally,M. B. Modulation of cancer cell survival pathways using multivalent
liposomal therapeutic antibody constructs. Molecular Cancer Therapeutics, 6 (2007),
844-855.
79 Shi, C. Q., Sinusas, A. J., Dione, D. P., Singer, M. J., and Young, L.H. et. al. Technetium-
99m-nitroimidazole (BMS181321): a positive imaging agent for detecting myocardial
ischemia. Journal of Nuclear Medicine, 36 (1995), 1078-1086.
80 Ballinger J.R., Kee J. W., Rauth A. M. Journal of Nuclear Medicine, 37 (1996), 1023-1031.
81 Lui S., Edwards D. S. 99mTc-Labeled Small Peptides as Diagnostic
Radiopharmaceuticals. Chemical Review, 99 (1999), 2235-2268.
82 Eisenwiener K. P., Powell, P., Maecke H.R. A convenient synthesis of novel bifunctional
prochelators for coupling to bioactive peptides for radiometal labelling. Bioorganic &
Medicinal Chemistry Letters, 10 (2000), 2133-2135.
83 Wolfgang H., Nguyen T. K., Jenny A., David G. F. Determination of Size and
Concentration of Gold Nanoparticles from UV−Vis Spectra. Analytical Chemistry, 79
(2007), 4215–4221.
REFERENCIAS
100
84 G., Socrates. Infrared and Raman Characteristic Group Frequencies. 1994.
85 Casals E., Pfaller T., Duschl A., Oostingh G. J., and Puntes V. Time Evolution of the
Nanoparticle Protein Corona. ACS Nano, 4 (2010), 3623–3632.
86 Renjis T. Tom, V. Suryanarayanan, P. Ganapati Reddy, S. Baskaran, and T. Pradeep.
Ciprofloxacin-Protected Gold Nanoparticles. Langmuir , 20 (2004), 1909-1914.
87 Yong C., Jiye C., Qingcai X., Zheng W. C. Atomic force bio-analytics of polymerization
and aggregation of phycoerythrin-conjugated immunoglobulin G molecules.
Molecular Immunology, 41 (2004), 1247–1252.
88 Mark S., Kaminski M.D., Melissa Tuck M.A., Judith Estes M.S.N., N.P., Arne Kolstad, M.D.,
Ph.D.,Charles W. Ross, M.D., Kenneth Zasadny, Ph.D., Denise Regan, B.S., Paul Kison,
B.S.,Susan Fisher, B.A., Stewart Kroll, M.A., and Richard L. Wahl, M.D. 131I- Tositumomab
Therapy as Initial Treatment for FollicularLymphoma. The New England Journal of
Medicine, 352 (2005), 441-449.
ANEXO
101
ANEXO
Artículo enviado:
IN VITRO DECREASE OF THE BCL-2 PROTEIN LEVELS IN LYMPHOMA
CELLS INDUCED BY GOLD NANOPARTICLES AND GOLD NANOPARTICLES-
ANTI-CD20
Ocampo García B.E.1, Miranda-Olvera R.M.
1, Santos-Cuevas C.L.
1, García-Becerra R.
2,
Azorín-Vega E.P.1, Ordaz-Rosado D.
2
1Departamento de Materiales Radiactivos Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares,
52750, MEXICO
2Departamento de Endocrinología, Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición
Salvador Zubirán, 14000, MEXICO
*CORRESPONDENCE TO:
Ocampo-García, Blanca Elí
Departamento de Materiales Radiactivos
Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares
Carretera México-Toluca S/N.
La Marquesa, Ocoyoacac, Estado de México.
C.P. 52750, México.
Tel + (52) (55)-53297200 ext. 13871
Fax + (52) (55)-53297306
E-mail: [email protected], [email protected]