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UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO
ANÁLISIS DE LAS MUTACIONES DEL GENE CFTR Y DE LOS MARCADORES
P O L I M ~ R F I C O S ASOCIADOS EN FAMILIAS CON FIBROSIS QU~STICA EN
COSTA RICA
Tesis soinetida a la consideración de la Comisión del Progr~ina de Estudios de Posgrado en Ciencias Biomédicas para optar al grado de Magíster Scientiae en Fisiología Celular.
MANFRED SANDI DlAZ
Ciiidad Uiiiversitaria Rodrigo 1-acio. Costa Rica 3003
A nii esposa llse y a mi hijo Davitl Ricardo. A mis padres Víctor y Carmen. A mis hermanos Rodolfo, Nury, Gina y Verny, a nii cuñada July y mis sobrinos Luis Dicgo y Jorge Andrcs
AGRADECIMIENTOS
A Dios y la Virgen de los Ángeles por darme la oportunidad de vivir y ver crecer este proyecto.
A los pacientes, a sus familias y a la Asociación Costarricense de Fibrosis Quística, por su participación constante en este estudio y por su voz de aliento y amistad en este camino
Al Dr. Ramiro Barrantes Mesén, por brindarme sus enseñanzas, sabiduría y amistad.
Al Dr. Manuel Saborío Rocafort, por darme la oportunidad de abrir las puertas de su servicio para iniciar este proyecto y su apoyo incondicional.
Al Dr. Carlos de Céspedes Montealegre, por sus consejos oportunos.
Al Dr. Federico Aragón Ortiz, por darme su apoyo y su amistad incondicional.
A la M.Sc. Jollyanna Malavassi Gil. Por brindarme siempre sus consejos y la oportunidad seguir adelante.
Al Dr. Julio Rivera Madríz. Por sus enseñaiizas, consejos sabios y su gran amistad en todo moinento
Al Dr. José Pablo Gutiérrez por velar sieinpre que las familias coiiocieran sobre ei proyecto y por ser un gran aii~igo.
A Dra.Olga Arguedas Arguedas, Dr. Oscar Porras Madrigal y Mayra Rainírez por su apoyo y confianza en esta idea.
Al Dr. Lap Cliee Tsui por brindarnie su asesoría, experiencia y enseñanza en la biología Molecular de la fibrosis quística.
Al Dr. Juliaii Zielenski, por su amistad y consejos en el " Hospital for Sick Children"
A la Dra. Isabel Aziiarez (Poli) por su amistad y asesoría eii la búsqueda de mutaciones. A Zhizliuo Hu, por sus consejos en la sintesis y fabricación de oligonúcleotidos.
A los departaiiieiitos de Genética Médica y Metabolisino, Neumología, Terapia Respiratoria, Clíiiica de Fibrosis Quística, Medicina 1 , Inrnunología, Unidad Bioética e Irivestigación. Laboratorio Genética, Laboratorio de Bioquímica y Laboratorio Nacional de Tariiizaje del Hospital Naciorial de Niños "Dr. Carlos Sáeiiz Herrera".
Al profesor Denriis Salas de la Esciiela de Geografía de la Ur~iversidad de Costa Rica. por facilitarrios el programa Mapirifo para el diseño de los riiapas.
Al Centro de Investigaciones en Hemoglobinas Anormales y Trastornos Afines (CIHATA), al Departamento de Bioquimica y al Posgrado en Ciencias Biomédicas de la Universidad de Costa Rica.
Al Departamento de Genética Molecular y al Centro de Genómica Aplicada del Hospital for Sick Children en Toronto.
A la Dra. Teresa Casals y al Dr. Xavier Estivill del Instituto de Investigaciones Oncológicas (IRO) de Barcelona, España.
Al Dr. Michael Knowles, Jessica Booker del Departamento de Genética de la Universidad de Carolina del Norte y a Jackie Zhou de Genzime por sus consejos con la mutación 3849+10 kb C-T
A la Fundación Costarricense en Docencia para la Salud (FUCODOCSA) y la Fundación para la Investigación del "Hospital For Sick Children" por el financiamiento de este Proyecto de Investigación y al Sistema de Estudios de Posgrado de la Universidad de Costa Rica y a CSS Biogen de Costa Rica S.A. por el financiamiento de la manutención en Canadá.
Esta tesis fue aceptada por la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Ciencias Biomédicas de la Universidad de Costa Rica, como requisito parcial para optar el grado de Magíster Scientiae.
ios de Posgrado
Dr. Ramiro Barrantes Mesén, PhD. Director de tesis
Dr. Carlos de Céspedes Montealegre, PhD. Asesor
/
S- -- C?
/
Dr. Federico Aragón Ortiz, PhD. Asesor
Asesor
s. GJG- Dra. Silvia Quesada Mora, PhD. Directora del Programa de Posgrado en Ciencias Biomédicas
Manfied ~ a i d í Díaz Candidato
INDICE
. . .................................................................................... INFORMACI~N DESCRIPTIVA XII
... RESUMEN ................................................................................................................... xiii
1 . INTRODUCCI~N ............................................................................................................ 1
2 . DESARROLLO DEL TEMA .......................................................................................... 4
2.1 CONCEPTO E HISTORIA ........................................................................................... 4
2.2 INCIDENCIA .................................................................................................................. 5
........................................................................................................ 2.3 EPIDEMIOLOGIA 8
2.4. MANIFESTACIONES CLINICAS ....................................................................... 10
2.5 HISTORIA NATURAL .............................................................................................. 13
........................................................................................... 2.6 BASES MOLECULARES 15
................................................................... 2.6.1 LOCALIZACIÓN DEL GEN CFTR 15
2.6.2 MAPEO GENETICO: ......................................................................................... 17
2.6.3 CLONAJE POSICIONAL: ............................................................................ 17
2.6.4 DESEQUILIBRIO DE LIGAMIENTO ENTRE KM19 Y XV2C Y EL GENE
CFTR ........................................................................................................................... 22
...................... 2.6.5 I D E N T I F I C A C I ~ N DEL GENE DE LA FIBROSIS QUISTICA 23
2.6.6 EL GENE Y LA PROTEINA CFTR ................................................................... 25
2.6.7 MUTACIONES EN EL GENE CFTR ............................................................... 35
2.6.7.1 MUTACIÓN AF508 ................................................................................ 37
2.6.7.2 OTRAS MUTACIONES EN GENE CFTR ............................................ 40
2.6.7.3 CLASIFICACIÓN DE MUTACIONES EN GENE CFTR .................... 48
3 . OBJETIVOS: .................................................................................................................. 50
4 . MATERIALES Y METODOS ...................................................................................... 51
............................................................................................................. 4.1 SUJETOS: 51
.............................................................................. 4.2 ANÁLISIS CENEALOCICO 52
.......................................................................... 4.3 O B T E N C I ~ N DE MUESTRAS 53
.............................................. 4.3.1 OBTENCION DE MUESTRA SANGUINEA 53
................ 4.3.2 ODTENCIÓN DE ACIDO DESOXlRRlBONUCLElCO (ADN) 53
4.4 ANÁLISIS MOLECULAR .................................................................................. 54
4.4.1 ESTRATEGIA UTILIZADA ....................................................................... 54
4.4.2 DESCRIPCI~N ANALISIS MOLECULAR .............................................. 54
4.4.2.1 DETERMINACION DE 1 1 MUTACIONES EN EL GENE CFTR.54
4.4.2.2 ANALISIS HETERODUPLEX DE MUTACIONES ....................... 57
4.4.2.3 DETERMINACION DE HAPLOTIPOS .......................................... 63
4.4.2.4 CALCULO DE FRECUENCIAS ...................................................... 65
4.4.2.5 FACTORES CRUZAMIENTO, MIGRACION Y GEOGRAFICOS
...................................................................................................................................... 66
. 5 RESULTADOS ............................................................................................................... 69
5.1 POLIMORFISMOS DIALELICOS KM19 Y XV2C ................................................ 69
5.1 . 1 Frecuencias alélicas ............................................................................................. 69
5.1.2 Frecuencia genotípica .......................................................................................... 70
. ......................................................... 5.1 3 Comparación estadística de las frecuencias 72
5.2 HAPLOTIPOS KM19 Y XV2C .................................................................................. -73
5.2.1 frecuencia haplotipica ....................................................................................... 73
5.2.2 Combinación haplotipica de KM 19 Y XV2C ..................................................... 74
5.3 MUTACIONES DEL GENE CFTR ........................................................................... 75
5.3.1 Mutacioiies y frecuencia ...................................................................................... 75
5.3.2 frecuencia Genotípica .......................................................................................... 79
5.3.3 Frecuencia combinacióii mutación versus haplotipo ........................................... 81
5.4 DEMOGRAF~A GENETICA ...................................................................................... 82
....................................................................................... 5.4.1 . Distribución geográfica 82
. 5.4.1 1 Probaiidos ................................................................................................. 82
.......................................................................... 5.4.1.2. Portadores Obligatorios 83
5.4.2. UNIONES Y MIGRAC~ON ............................................................................... 85
. ............................................. 5.4.2.1 Eiidogamia, esoganiia y coiisaiiguiiiidad 85
.................................................................... 5.4.2.3. Distaiicias iiiigracioiiales 86
6 . DISCUSIÓN ................................................................................................................... 88
6.1 FRECUENCIAS ALÉLICAS. GEN~TIPICAS Y HAPLOTIPICAS DE LOS
POLIMORFISMOS K M I ~ Y X V ~ C EN CROMOSOMAS CON M U T A C I ~ N EN
CFTR Y NORMAL ............................................................................................................ 89
6.2 MUTACIONES EN CFTR .......................................................................................... 92
6.2.1 Mutación G542X .................................................................................................. 92
6.2.2 Mutación AF508 ................................................................................................... 98
6.2.3 OTRAS MUTACIONES DETECTADAS ....................................................... 102
6.2.3.1 Mutación R1 17H ............................................................................................. 102
6.2.3.2 Mutación 17 17- 1 G-A ...................................................................................... 104
6.2.3.3 Mutación (355 1 D .................................................................................. 106
6.2.3.4 Mutación W1282X ................................................................................. 107
6.2.3.5 Mutación 62 1 + 1 G-T .............................................................................. 109
6.2.3.6 Mutación 3849+10kb C-T ............................................................. 110
6.2.4 GENOTIPOS . .............................................................................................. 112
6.3 Factores migracionales, geográficos y matrimoniales en familias con Fibrosis
Quistica en Costa Rica ................................................................................................. 113
6.3.1 Factores niatriinoiiiales ...................................................................................... 114
6.3.2 Factores geográficos y niigracionales ................................................................ 114
7.CONCLUSIONES ................................................................................... 117
&REFERENCIAS .................................................................................... 121
9.ANEXOS ............................................................................................ -142
ANEXO 1 : Fórmula de consentimiento para investigacióii clíiiica ............................ 142
ANEXO 2: Fórmula información del paciente .......................................................... 145
ANEX03- 1 1 : Distribucióii geográfica de portadores ....................................... 147
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1:Localización física de marcadores polimórficos Loci D7S340/D7S122 y
gene CFTR ........................................................................................................................... 24
FIGURA 2: Distribución de exones en gene CFTR ......................................................... 24
FIGURA 3 . Representación Esquemática de la proteína CFTR .................................... 30
FIGURA 4: Modelo de regulación del canal de cloruro cftr .......................................... 34
FIGURA 5: Distribución de mutaciones en CFTR .......................................................... 36
FIGURA 6: Distribución de frecuencias de la mutacion AF508 en Europa .................. 39
FIGURA7: Distribución geográficade mutaciones más comunes del gene CFTR ........ 41
FIGURA 8: Distribución y gradiente de frecuencias de la mutación G542X en Europa
.............................................................................................................................................. 43
FIGURA 9: Distribución y gradiente de frecuencia de la mutación G551D en Europa
............................................................................................................................................. -45
....... FIGURA 10: Clasificación de mutaciones en el gene cftr según función proteica 49
FIGURA 11: Distribución geográfica de pacientes con Fibrosis Quística .................... 83
FIGURA 12: Distribución geográfica de pacientes y portadores obligatorios, según
lugar de nacimiento en familias con Fibrosis Quística en Costa Rica ........................... 84
FIGURA 13: Distribución de Distancias Maritales en familias con fibrosis quística en
Costa Rica ............................................................................................... -86
FIGURA 14: Distribución de Distancias Migracionales en familias con fibrosis
quística en Costa Rica ................................................................................. 87
LISTA DE CUADROS
CUADRO 1: Incidencia de fibrosis quística según estudios epidemiológicos ................. 6
CUADRO 2: Incidencia de fibrosis quística según tamizaje neonatal. determinada por
tripsina inmunoreactiva ....................................................................................................... 7
CUADRO 3: Formas atípicas de presentación de la fibrosis quística ........................... 13
CUADRO 4: Haplotipos posibles para los polimorfismos KM19 y XV2c ..................... 20
CUADRO 5: Distribución de haplotipos en cromosomas con mutaciones y sin
mutaciones en cftr en la población euronorteamericana ................................................ 20
CUADRO 6: Frecuencias haplotipicas en cromosomas con y sin la mutación AF508 en
el gene cftr en Italia. Portugal. España y Alemania ........................................................ 22
CUADRO 7: Mutación AF508 del gene cftr ..................................................................... 38
CUADRO 8: Frecuencia de la mutación AF508 en diferentes poblaciones ................... 40
CUADRO 9 . Mutaciones más frecuentes .......................................................................... 42
CUADRO 10: Simbología utilizada en el análisis genealógico ....................................... 52
CUADEiO 11 : Condiciones de reacción ARMS ............................................................... 55
CUADRO 12: Secuencias de primers utilizados en ARMS ............................................ 56
CUADRO 13: Condiciones de reacción PCR multiplex .................................................. 58
CUADRO 14: Mix de Oligonúcleotidos utilizados como sondas exón específicas ........ 62
CUADRO 15: Definición haplotipos dialélicos KM19KV2c .......................................... 64
CUADRO 16 . Frecuencia alélica de los polimorfismos dialélicos KM19 y XV2C. en
cromosomas de individuos afectados y normales en Costa Rica .................................... 69
CUADRO 17 . Frecuencia alélica de los polimorfismos dialélicos KM19 y XV2C. en
cromosomas mutantes CFTR en varias regiones de Costa Rica .................................... 70
CUADRO 18: Frecuencias genotípicas de los polimorfismos dialélicos KM19 y XV2c
.................. en croniosomas mutantes de pacientes con fibrosis quística en Costa Rica 71
CUADRO 19: Frecuencias genotípicas de los polimorfismos dialélicos KM19 y XV2c
............................................... en cromosonias niutados CFTR según región geográfica 72
CUADRO 20: Coniparación en las frecuencias genotípicas en cromosomas cftr
afectados cn Costa Rica ...................................................................................................... 72
CUADRO 21: Frecuencia haplotípica de los marcadores dialélicos KM19 y XV2C en
cromosomas afectados FQ y normales en Costa Rica. .................................................... 73
CUADRO 22: Frecuencia haplotípica de los marcadores dialélicos KM19 y XV2C en
Cromosomas afectados, según región geográfica de Costa Rica .................................... 74
CUADRO 23: Frecuencia combinación haplotípica de los marcadores dialélicos KM19
y XV2C en individuos afectados. ................................................................................... ... 75
CUADRO 24: Frecuencia de mutaciones CFTR detectadas en individuos con fibrosis
quística en Costa Rica ......................................................................................................... 77
CUADRO 25: Frecuencia de mutaciones CFTR detectadas en individuos con fibrosis
quística en Costa Rica según región geográfica ............................................................... 78
CUADRO 26. Frecuencias genotípicas del gene cftr en individuos afectados por
fibrosis quística en Costa Rica. ......................................................................................... 80
CUADRO 27. Combinación mutación/ haplotipo en pacientes con fibrosis quística en
Costa Rica. ................................................................................................................... 81
CUADRO 28. Combinación Haplotipol mutación según mutación específica en
pacientes con fibrosis quística de Costa Rica ................................................................... 82
CUADRO 24: Endogamia y exogamia en familias con fibrosis quística en Costa Rica.
Sandí Díaz, Manfred Análisis de las mutaciones del gene cflr
y de los marcadores polimórficos asociados en familias con fibrosis quística en Costa Rica.
Tesis Ciencias Biomédicas.-San José, C.R.: M. Sandí D., 2005 168h.:il.-262 refs
RESUMEN
Fibrosis quística (FQ) es la enfermedad autosómica recesiva más común y severa en
poblaciones de origen europeo y sus descendientes con una incidencia promedio de 1/2500
individuos. El gene regulador de transporte de transmembrana (CFTR), se ha identificado
como el gene implicado en la FQ. La mutación más frecuente es la deleción AF508
presente en un 70% de los cromosomas FQ de norteamérica y noreuropeos y con menos de
50% en Latinoamérica. En un estudio de familias de Costa Rica se analizaron y
caracterizaron las siguientes mutaciones del gene CFTR: AF508, AI507, R560T, R553X,
(3551 D, G542X, 1717-1G>A, R117H, N1303K, 621+IG>T, W1282X, por medio del
sistema de amplificación refractaria de mutaciones ARMS por sus siglas en ingles y la
mutación 3849+10 kb C>T con el protocolo de análisis heteroduplex de mutaciones para
CFTR de Zielenski y colaboradores. Además se realizó el análisis de los marcadores
poliinórfícos extragénicos KM19 y XV2c por medio de la reacción en cadena de la
polimerasa con posterior digestión con endonucleasa y el estudio de los factores
deinográficos, migratorios y cruzamiento poblacional en familias afectadas por FQ en
Costa Rica.
El nivel de detección de mutaciones para el gene CFTR coi1 este método es del
75.5%. Las más frecuentes en nuestra población son la G542X, AF508 y R1 17H con un
24.5 %, 16.5% y 10.8% respectivamente. Otras cinco mutaciones se encuentran por debajo
del 7%; el análisis de haplotipos nos indica que existe alta heterogeneidad por mutación
especialmente en las tres más comunes. De acuerdo a esto podemos reconocer que a pesar
del efecto sur europeo que presenta la población con FQ en nuestro país, se reconoce un
efecto claro de otras ascendencias como las noreuropeas, sin dejar de lado los posibles
orígenes por evolución convergeiite y la recombinación génica de algunas de ellas en
nuestro país.
l 'alabr~(s) Cla\.e(s): Fibrosis q~iistica, gene cftr, iiiutaciones, poliiiiorfisiiios. KM19,
XV?c, Costa Rica.
1)irector de tesis: Dr. Raiiiiro Rarraiites Meséii. PI1.D.
Clrii(la(1 Aca(léniica: Esc~icla de Mediciiia
ABSTRACT
Cystic fibrosis (CF) is the most frequent and severe autosomic recessive illness
diagnosed in Caucasians and their descendants with an average incidence of 112500. The
gene coding the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR),
responsible for the chloride ion transport, when mutated, has been implicated as the
molecular defect in clinical CF. The most frequently reported mutation worldwide is
AF508, present in 70% of North American and North European chromosomes of patients
with CF, and in less than 50% in Latin Americans. In our study, we extensively analyzed
and characterized I I frequent mutations of the CFTR gene: AF508, AI507, R560T, R553X,
G551 D, G542X, 171 7-lG>A, R117H, N 1303K, 621+IG>T, W 1282X, using the
amplification of refractory mutations system (ARMS). The 3849+10 kb C>T mutation was
studied with a known protocol of heteroduplex analysis for CFTR mutations described
elsewhere. An analysis of tlie extragenic haplotypes KM19 and XV2c was carried out using
a traditional PCR method with specific primers and subsequent restriction endonuclease
digestioii. A detailed study of demographic factcrs, migratory and population crossing
patterns, was takeii from a large record of fainilies with at least one CF diagnosed Costa
Rican patient.
Tlie degree of mutations detectioii in tlie CFTR gene with this inethod was 75.5%.
Tlie most frequently observed mutations in the Costa Rican population are G542X, AF508
and RI 17H with a 24.5%, 16.5% and 10.8%, respectively. Other five mutations were found
in less tlian 7% of tlie cases; the haplotype analysis indicates that tliere is a high
heterogeneity especially for mutations i i i tliree more commoii alterations. Tlius, we
coiiclude tliat i i i spite of our well-known Soutli European genetic background o11 our
populatioii, tliere is a clear recogiiizable iiiflueiice niost probably origiiiated in Nortli
Europeaii couiitries without leaving aside tlie possible origins for coiivergent evolution aiid
tlie genetic recoinbination pattern witliiii our country.
Key words: Cystic fibrosis. cttr geiie. iiiutatioiis. polyniorpliisiii. K M 19. XV2c.
Costa Rica.
La íibrosis quística, es el trastorno multisistémico, autosómico recesivo más común
y severo entre los caucásicos (Bayleran et al, 1996; Vidaud et al, 1990), con una incidencia
estimada entre los hispanos de 118000-9000 nacidos vivos y una frecuencia de
heterocigotos de 1146 aproximadamente (NIH consensus statement, 1997).
La mayoría de los signos y síntomas clínicos consistentes con el diagnóstico de
fibrosis quistica son la enfermedad pulmonar crónica con una persistente colonización, la
iiifección de patógerios y la obstrucción en las vías respiratorias. (Rosenstein et al, 1998).
En el 85% de los casos se presentan varias anormalidades gastrointestinales (Roseiistein et
al, 1998; Davidson et al, 1998) y eii el 95 % de los hombres con esta enferriiedad se
presentan trastornos genitouriiiarios que resultan en azoospermia obstructiva (Kurnar et al,
1990).
El gene relacionado con la fibrosis quistica fue secuenciado y ubicado eii el
cromosoina 7, en la regio11 q3 1; presenta 27 exones extendidos en una región de 230 Kb
(Kereiii et al, 1989). El coiisorcio internacioiial de análisis genético en fibrosis qiiística
reportó eii sir última actualización en internet 1 177 mutaciones en este gene, clasificadas en
5 clases de acuerdo a las alteracioiies eii la proteína CFTR (Taylor, C.J., 1999).
La iiicidencia de las mutaciones varía de acuerdo con la población y con el origen
etiiico de la iiiisina; así corno la Iieterogeiieidad para otras mutaciones (Bayleran et al.
1996; Oiiay et al, 1998). La riiutación del CFTR rnás frecuente a nivel mundial es la A F
508 qiie varia eii i i i i i-aiigo entre el 30-85%. siendo sil frecuencia eii la poblacióii espafiola
de i i i i 53.30%: iio obstaiite. se Iia deteriniiiado eii esta población iriia alta Iieterogeiieidad
(C'nsnls c.t al. 1997).
La alta frecuencia de portadores de fibrosis quística en la población occidental
sugiere que esta enfermedad no es reciente; datos publicados estiman que la primera
mutación del gene CFTR aconteció aproximadamente 52000 años atrás, después de la
divergencia del Horno sa~ierts en tres grupos continentales, siendo la mutación AF 508
generaciones (Morral et al, 1993).
Este gene codifica para una fosfoglicoproteína de membrana de 1480 aminoácidos
Ilainada regulador de transporte de transinembrana de Fibrosis Quística (CFTR) (Kerem et
al, 1989, Riordan et al, 1989; Rommens et al, 1989). La proteína funciona como un canal
de cloruro regulado por el AMPc y proteínas kinasa A y C.- El defecto básico de la fibrosis
quística se ha asociado con la disininución en el transporte del ion cloruro a través de la
iiieinbraiia apical de las células epiteliales secretoras (Riordan et al, 1989).
Estudios de ligamieiito geiiético demuestran que la gran niayoría de mutaciones del
gene de la fibrosis quística están en uii fuerte desequilibrio de ligamieiito con el haplotipo B
para los iiiarcadores KM 19 y XV2c en poblaciones caucásicas europeas y iiorteainericaiias
(Cutting et al, 1989).
Eii los últiiiios aíios, la población costarricense, ha experiineiitado un aumento en la
iiicideiicia y prevaleiicia de la fibrosis quistica; uiia enfermedad autosómica recesiva muy
coniiiii en poblacioiies de origen europeas, que presenta uiia heterogeneidad inutacioiial
iiiuy graiide a iiivel iiiuiidial y inaiiifestacioiies clíiiicas variables.
A pesar de ser Costa Rica, una población de origen multiracial, con gran influencia
de genes de origen europeo, principalmente español, amerindio y negro; se desconocen
varios aspectos relacionados con esta enfermedad en nuestra población. Por lo tanto el
propósito del presente trabajo es: la caracterización completa de las mutaciones en este
gene, sus marcadores polimórficos asociados (haplotipos), y un estudio más completo de la
genética-epidemiológica y demográfica, para comprender en detalle las diferentes variables
relacionadas con la composición genética y poblacional de esta enfermedad.
2. DESARROLLO DEL TEMA
2.1 CONCEPTO E HISTORIA.
La Fibrosis quística (FQ) es la enfermedad más común y severa en poblaciones de
descendencia Europea, donde su incidencia es de 112500 nacidos vivos, con una frecuencia
de portadores 1/25. En las poblaciones afro-americanas su incidencia es de 1115000
nacidos (Hamosh et al, 1998) y en orientales nacidos en Hawaii es de 1190000 individuos
nacidos vivos (Wright, Morton, 1968).
En el periodo comprendido entre 1650 a 1800, varios autores describieron varios
casos de insuficiencia pancreática (Taussing, 1984); sin embargo fue hasta 1857 cuando se
encuentra en la literatura alemaiia referencias sobre la creencia que el "exceso de sudor
salado eii iiiños" originaba la inuerte (Wood, Boat, Doershuk, 1976).
La primera descripción de la FQ coino patología data a fines de la dicada de los 33
cuando Faiicoii; y Andersoii describen un síndrome coi1 alteracioiies a iiivel pulrnoiiar y
pancreático coi1 di fereiites con~plicaciones típicas (Fanconi, Veliliiiger, Kraver, 1 936;
Andersoii, 1938). Esta última referencia introduce una coinpleta descripción
aiiatoinopatológica de la enfermedad, denominándola "dolencia fibroquística del Páiicreas".
Posteriorinente en 1945 Farber introdujo el térmiiio "mucoviscidosis" que relacionaba la
eiiferinedad coi1 el aspecto espeso y viscoso de las secreciones.
En 1946, se sugirió por primera vez que el tipo de Iierencia de la FQ era autosoinica
recesiva y eii 1953, Di Saiit'Agiiese demostró que la coiicentración anorinalnieiite elevada
dc cloruro dc sodio eii sudor se encoiitraba preseiite en persoiias afectadas por FQ. Eii 1985,
la sccueiicia sih'estre preseiite eii los seres hiiniaiios fue ligada al brazo largo del
croiiiosonia (Cr) 7 (Kiionltoii et al. 1985). Para setienibrc dc 1989 el geii Sile cloiiado.
~eciieiicindo 1 s ~ i iiiiiiacióii iiiris tiecuciiie eii cniicásicos lile ideiiiiliciida (Lcicii~. 13 S ct al
1989; Riordan et al, 1989; Rommens et al 1989). A partir de 1994 se inician los primeros
estudios con genes con secuencias silvestres en lugar de genes mutados, y se estima que los
próximos años se obtendrá una cura para esta enfermedad por medio de la terapia génica.
(Rosenfeld et al; 1984; Welsh et al 1994; Wagner et al 1998, 1999; Albelda, Wiewrodt,
Zuckerman; 2000; Zielenski, 2000).
2.2 INCIDENCIA
FQ es la enfermedad más común y severa entre las poblaciones de descendencia
europea variando entre los 1:2000 a 1 :8000 en estas poblaciones y sus descendientes
(Cuadro 1). Una alta incidencia se ha observado en ciertas partes del Reino Unido (l:377)
y en la población An~ish en Norteamérica (1 :643 a 1 : 1200) (Taussing, 1984). Las mayores
incidencias a nivel Europeo se observan en las Islas Británicas (1 :2000) y en Francia (1:
2500). La incidencia en Europa disminuye hacia el norte (1: 3700 en Bélgica y Holanda,
1 :4700 en 3inainarca y 1 :6300 en Noruega y Suecia, en el centro y oeste de Europa es de
1:3200 en Alemania, 1:6000 en Poloiiia y i:3500 en Italia, Espaiía y Grecia, (De
Braekeleer y Daigneault, 1992).
Eii poblaciones iio Europeas coino las Iiindúes, árabes, asiáticas, africanas y
orieiitales (Taussing, 1984), se observa una incidencia muy baja; por ejemplo, la incideiicia
eii iiegros surafricanos es 1 : 12000 (Hill et al, 1988) y 1 : 1 5000 eii afroaiiiericanos (Hainosli
et al. 1998). Eii estudios recieiites se Iia eiicoiitrado que la incideiicia en estos grupos
(Africaiios) es de 1: 784 a 1: 13924; basados en estudios de frecuencia de portadores de
riiiitacioiies específicas. En las poblacioiies orientales la proporción es de 1:90 000 eii las
pcihlacioiies de Hawaii (Wriglit, Mortoi~, 1968), 1: 100 000 eii poblacioiies orieiitales de
Graii L3retriiin >- 1: 350 000 eii Japóii (Beaudet 1989. Welsli et al. 1995; Yaiiiasliiro. 1997).
En la población China se han descrito pocos casos (Boon, 1975, Zielenski, 1995, Wagner,
CUADRO 1 : Incidencia de fibrosis quística según estudios epidemiológicos
P A ~ S INCIDENCIA REFERENCIA Estados Unidos amish 1 :640 a 1 : 1200 Taussig, 1984 amerindios 1 : 1500 a 1 :3970 Cutting, 1997 afroamericanos 1:15300 Cutting, 1997
1:15000 Hamosh et al, 1998 asiaticoainericanos 1 :32 100 Cutting, 1997
1 :3 1 O00 Hamosh et al, 1998 euroamericaiios 1 : 1900 a 1 :3700 Steinberg, Brown, 1960; Krainm et al, 1962;
Merritt et al, 1962. 1 :3200 Hamosh et al, 1998
hispanoamericanos 1 :9200 Hamosh et al, 1998 Irlanda del Norte 1 : 1700 a 1 : 1900 Nevin y Redmond, 1979 Francia 1 : 1800 Bois et al, 1978
1 :2500 De Braekeleer Daigneault et al, 1992 Italia 1 :2000 Roineo et al, 1985
1 :2000 Lucotte; Hazout, 1995; De Braekeleer, 1995 1: 3500 De Braeke!eer Daigiieault et al, 1992
Inglaterra 1 :2400 a 1 :3000 Carter, 1967; Hall; Simpkiss, 1968 Australia 1 :2450 a 1 :2550 Daiiks; Allan Anderson, 1965; Daiiks et al, 1983 Alemania 1 :3200 De Braekeleer Daigneault et al, 1992 Portugal 1 :3500 De Braekeleer Daigneault et al, 1992 España 1 :3500 Lucotte; Hazout, 1995; De Braekeleer, 1995 Bélgica 1 :3700 De Braekeleer Daigneault et al, 1992 Antigua URSS 1 :4900 De Braekeleer Daigneault et al, 1992 Israel 1 :5000 Levin, 1963 Polonia 1 :6000 De Braekeleer Daigneault et al, 1992 México 1 :S000 a 9000 Grebe et al, 1994 Finlanciia 1 :25000 Kere et al, 1994 Japón 1 :350000 Yaniasliiro et al, 1997
Alioia bieii, eii estudios basados eii tamizaje iieoiiatal en la ideiitificacióii de niveles
iilios de tiipsiiin eii la saiigre, se Iia observado que la iiicideiicia está eiitre 1 :2730 y 1 :47 12
(CasicIIniiic. 1997. 1:arrell et al, 1997, Pollitt et al, 1997) (cuadro 2) Al agruparse los
esiiidios i.eii.ospe.-ctivos de IKT iieoiiatal. se puede esiiiiiar uiia iiicideiicia iiiedia de 1 :?S00
CUADRO 2: Incidencia de fibrosis quistica segun tamizaje neonatal, determinada por
tripsina inmunoreactiva
PAIS INCIDENCIA
ITALIA Venecia 1: 3944
Noreste 1 : 2730
AUSTRALIA New South Wales 1 : 2669 Sur 1 : 3960
NUEVA ZELANDIA 1 : 4 140
ESTADOS UNIDOS Colorado 1 :3827 Wisconsin 1 :343 1
1:4712
INGLATERRA Peterburgo 1 :3 190
Leste 1 :2234
REINO UNIDO 1 :4658
REFERENCIA
Hammond; Naylor; Wilcken, 1987. Castellani et al, 1997
Wilcken et al, 1995 Ranieri et al, 1994
Hammond et al, 199 1
Hammond et al, 1991 Gregg et al, 1993 Farrell et al. 1997
Haininoiid; Najrlor; Wilckeii, 1987 Greeii et al, 1993
Pollitr et al. 1997
2.3 EPIDEMIOLOGIA
La FQ es la enfermedad hereditaria más común en poblaciones de origen caucásico;
en las últimas tres décadas los países desarrollados han originado cambios muy importantes
a lo que se refiere a FQ, por ejemplo en el caso de Estados Unidos en 1969 existían
aproximadamente 8000 individuos con FQ. Para 1991, existían 18926 casos y en 1996
fueron diagnosticados 900 afectados más (4.3%), aumentando la población a 20 886 con
una estimativa que el 91 % de afectados con FQ estaban diagnosticados.
Para 1896 la edad media de afectados era de 3 años. La proporción de afectados en
edad adulta se multiplicó más de 4 veces en los últimos 30 años (8% en 1969 al 36 % en
1996). Con respecto a la taza media de sobrevida se observó que esta aumentó unas 30
veces en los últimos cincuenta años y dos veces en los últimas dos décadas, aumentando en
la última década. (1940 menos de un aíio, 1969 a 14 años, 1989 a 26.8 años, 1990 a 27.6
anos, 199 1 a 29.4 años y 1996 aproximadainente 3 1.3 aíios.).
La edad mediana d-i sobrevivencia de afectados era de 13.5 años en 1986 y 14.5
anos en 1990 y de 16 aííos en 1996. En este año la tasa de mortalidad fue de 1,911 00
afectados, con un 53 % de individuos geiiotipados y proporción de sexos entre individuos
afectados de 1 : 1 (Fitzsimiiions, 1992). Elbom, Shale y Britton en 1991 en un estudio
realizado eii Iiiglaterra Iiasta 1990 entre afectados por FQ, demostraroii que la edad de vida
de la población era de 20 aíios, con uiia espectativa media de vida al nacer de 40 años y el
iiúinero de adultos aumeiitó cerca del 36% entre 1900 y el 2000.
En Australia un estudio prospectivo de 48 recién nacidos diagnosticados por
tamizaje neonatal mostró que cerca del 96 % de los infantes presentaron síntomas a los 3
meses de edad; y tan solo un 39% de un segundo grupo de 33 niños diagnosticados sin
tamizaje neonatal fueron diagnosticados con menos de 12 meses de vida (Wilcken, Towns,
Mellis, 1983).
En el caso de Ainérica Latina, a partir de 1990 se creó un Registro Latinoamericano
de Fibrosis Quística (REGLAFQ), El REGLAFQ obtuvo los primeros datos
epidemiológicos publicados en 1991. En este estudio se demostró que la mayoría de
afectados provenían de Brasil, Argentina y México (1979-89), con una predominancia de
hoinbres afectados (61%), la edad inedia de diagnóstico era de 3.6 alios y una edad media
de afectados vivos de 6.4 años eii Brasil.
Los primeros datos eii Ainérica Latina demostraron que en 1992 existían 1342
individuos coi1 FQ. De estos únicamente el 36 % fueron diagnosticados con inenos de un
año de edad. La tasa de inortalidad fue del 5 %. Entre los afectados, 1 % eran mayores de
18 años; 77.5% blaiicos, 14.2% mestizos, 7.6% inulatos, 0.3% negros, 0.4 % indígenas y
orieiitales ~ i i i 0.1 %. La tasa de sobrevida al ser diagiiosticados fue cercana a los 9 años
(REGLAFQ, 1992).
Eii 1995 el REGLAFQ registró 1588 afectados eii América Latina con una
estiiiiativa que represeiita iiieiios del 20 % del total, con uii proniedio de edad al iiioniento
de diagiióstico de 4,l +/- 5.4 años y coi1 edad inedia de 10.2 +/- 7.5 afios. Durante el año
1993. frillecicroii 57 dc los cuales el 13% eran iiiayores de 18 años. El 51 % de los
:iIi.ciados craii Iioiiibres y cl 46 % iii~!jcres, coi1 respecto a la distribucióii por grupo étnico:
el 76,6 % era blanco, el 13,8% mestizo y el 0,8 % negro. La incidencia por colonización
bacteria1 fue de 46.1 % por Pseudomona aeru~inosa y de 1.9 % por Burkliolderia
cepaceae. (REGLAFQ, 1995).
En 1996, el 15% de los afectados tenían más de 18 años en promedio, edad media
10.4 años y con diagnóstico a los 3,9 años, el 53% eran de sexo masculino, el 74% eran
blancos y u n 15.7 % mestizos. Además el porcentaje de colonización por Pseudomorta
nerupinosn era de u n 45.4 % (REGLAFQ, 1997). En las ultimas décadas se ha observado
uiia alta capacidad de diagnóstico lo que representa un tratamiento adecuado de los
individuos afectados, proporcionando una mejor tasa y una mejor calidad de vida de los
pacientes.
2.4. MANIFESTACIONES CLINICAS
La FQ presenta heterogeneidad bioquiinica, molecular y clínica; eii este sentido se
Iia observado que las manifestaciones clínicas se pueden presentar en varias etapas de la
vida de un individuo siendo posible diagnosticar la dolencia desde la fase intra-uterina
liasta la edad niás avanzada. Overbeek y Hilvering en 1992 preseiitaron u n caso
diagnosticado coi1 FQ eii u n individuo de 70 años de edad.
Los síntomas clíiiicos en la fibrosis quística son muy variables y se expresan con u n
patrón específico en tejidos y células, siendo los más afectados las células epiteliales de las
glaiidulas sudoriparas, los conductos paricreáticos y del tracto digestivo particularmente en
las criptas del iiitestiiio delgado, las glaiidulas de Bruriner, los coriductos biliares, las
glindiilas salivares, las células serosas de las gláiidulas dc la subiiiucosa y las ctilulas del
epitelio respiratorio (Colliris. 1992; Bchrniari, 1992; Warreii et al. 1997). Es as¡ coino los
sigiios y síiitoriias clíiiicos coiisisteiites coi1 el diagiióstico de esta eiiferiiicdad (M!arreii et al.
1007) soii: erifcriiicd;id siiiopulriion;ir cr0iiic;i, iiiaiiili.strida por iiiia persistciite
colonización e infección de patógenos como Sta~hvlococcus aureus. Haemopltilus
influenzae y las mucoides y no mucoides Pseudomonas aeruninosa, así como los
patógenos Burkltolderia cepacia, Stenotro~homonas maltophilia (Xanthomonas), B,
Gladioli, Aspernillus fuminatus y mycobacterias no-tuberculosas; todos son
particularmente problemáticos en algunos pacientes (Rosenstein et al, 1998; Davidson et al,
1998).
La tos crónica, que al principio puede ser seca y áspera, pero finalmente se hace
húmeda y productiva en los pacientes de mayor edad, es más llamativa y mayor en las
inaííanas o después de realizar una actividad, y con una prodricción de esputo que suele ser
purzdlento (Behrman, 1992).
En la radiografía de tórax se presentan persistentes anomalías como las
bronquiectasias, atelectasias e hiperinflaci0n. Además otros signos iinportantes coino la
obstruccióii en las vías respiratorias manifestada por respiración coi1 dificultad y
aiiorinalidades radiográficas y de tomografías coinputarizadas del seno paranasal
(Roseiistein et al, 1998).
Otros probleinas relacionados con la FQ son las anorinalidades gastrointestinales
y nutricionales entre ellas se destacan, a nivel intestinal, íleo meconial; síndrome de
obstruccióii iiitestiiial distal, prolapso rectal, esteatorrea. A nivel paiicreático se observa
iiisuficieiicia paiicreática, pancreatitis recurreiite; coi1 relacióii a problenias hepáticos
eiicoiitranios eiiferinedad hepática crónica manifestada por evideiicias clínicas e
Iiistológicas de cirrosis biliar foca1 o cirrosis niultilobular. Con relacióii a las aiioriiialidades
iiiitricioiiales se eiiciieiitra, fracaso eii el creciinieiito (nialiiutricióii proteico-calórica),
Iiipoprotcíiiciiiia J edema: coiiiplicacioiies secuiidarias por deficiciicia de vitaiiiiiins
lipc~soliihles J nlcrilosis iiictnhólica crcíiiica (Riordaii et al. 1989: Kiiiiinr et al. 1990).
Anormalidades genitourinarias en el hombre, resultando en azoospermia obstructiva
presente en el 95% de los pacientes debido al poco desarrollo de las estructuras de los
conductos de Wolff. (Behrman, 1992 y Rosenstein et al, 1998).
El síndrome de pérdida de sal es uno de los más importantes, el paciente presenta un
incremento en la concentración de electrólitos en el sudor (Rommens et al, 1989; White et
al, 1985), debido a una relativa impermeabilidad al ión cloruro de las células epiteliales de
los conductos sudoríparos. Por tanto a medida que el sudor se traslada hacia la superficie,
no se produce la reabsorción de cloruro y de sodio dándose así una perdida de sal aguda
(Kuinar et al, 1990).
Sin embargo en los coiiductos respiratorios, pancreáticos y del sistema reproductivo
se da una alta coiiceiitración de NaCl en la subinucosa por una reducción en la secreción de
cloruro, originando así una hidratación insuficiente de la mucosa que conduce a un
progresivo daño obstructivo en esos Órganos (Braiicoliiii et al, 1995). Las altas
conceiitracioiies salinas en el epitelio respiratorio de los pacientes con fibrosis quística
coiiduceii a la iiiactivación de péptidos catióiiicos llamados P- defensinas (Hancock, R.E.,
1997); contribuyendo así al aumento y recurrencia de infecciones bacteriales (Russell, J.P.
et al, 1996; Harder, J. et al, 1 997; Bals, R. et al, 1998, Tarver, A.P. et al, 1 998).
La FQ puede iiiaiiifestarse de varias formas siniulaiido varias entidades clínicas, las
iiiaiiifestacioiies iiiás coiiiuiies iiicluyeii a iiivel puliiioiiar tos persistente con presencia de
iiifiltrados puliiioiiares refractarios o recurrentes con o sin presencia de manifestaciones
gnstroiiitestiiiales tales coiiio íleo iiiecoiiial. la cual se presenta en un 10 % de los afectados
con dCticit cii el creciiiiieiito. Afectados con Iiistoria faiiiiliar positiva de FQ puedeii ser
diagiiósticridos aiitcs dcl inicio de los síiitoiiias a través de téciiicas eii biología iiioleciilar.
En las primeras décadas de la vida, gran cantidad de pacientes con FQ no son
diagnosticados principalmente por formas atípicas de presentación o por desconocimiento
del personal en salud (Cuadro 3).
CUADRO 3: Formas atípicas de presentación de la fibrosis quística - --
MANIFESTACIONES RESPIRATORIAS Broquiolitislasma Neumonías estafilococicas Colonización del tracto respiratorio por pseudomonas Pólipos nasales
MANIFESTACIONES GASTROINTESTINALES Prolapso rectal1 Síndrome de íleo meconial Dolor abdominal recurrente y10 masas en el cuadrante infcrior derecho Ictericia neonatal prolongaddedema hipoproteico Deficiencia vitaminica ADEK y cirrosis biliar con hipertensión portal Acroderinatitis enteropática (Tipo deficit de zinc y ácidos grasos)
Pancreatitis recurrente
MANIFESTACIONES GENITOURINARIAS Iiifertilidad masculina
Iiifertilidad femenina
OTRAS MANIFESTACIONES Alcalosis liipoclorémicdhiponatrémica
2.5 HISTORIA NATURAL
El curso de la enfermedad es niuy variable y pueden presentarse complicaciones
relacioiiadas coi1 íleo meconial eii los primeros días de nacido; en las primeras semanas o
iiieses después del naciiniento se pueden presentar problenias respiratorios; o bieii ser
nsiiitoiiiritico. (Vaii biezeii, Overbeek. Hilveriiig,l992)
Eii la iiialforía de ceiitros de salud a nivel iiiundial, lo pacieiites coi1 FQ soii
sl>iiie~id»s. eii proiiicdio. cada tres iiicses a revisioiies iiiédicas periódicas para ideiitificrir
presencia de infecciones en el tracto respiratorio, al mismo tiempo son sometidos a
radiografías de tórax y a evaluaciones en su función pulmonar y a revisión de su estado
nutricional, esto finalmente contribuye a un aumento progresivo del indice de vida
(Lewiston, 1990). Para 1990, varios estudios establecieron que el 50% de los recién nacidos
de paises desarrollados lograron sobrevivir hasta los 40 años de edad (Elborn, Shale,
Britton, 1991).
Muchos factores son los que determinan la prognosis de los afectados (Wood,1984),
en promedio los honibres tienen una sobrevida de 3 años mayor que las mujeres con FQ.
Los pacientes con ascendencia africana presentan un mejor pronóstico de vida que los
individuos de ascendencia europea. El diagnóstico prenatal pareciera no ser un factor
pronóstico de la enfermedad; los diagnósticos al nacimiento o posterior a este presentan
me.jores resultados especialinente ante? del inicio de los síntomas, cuando se comparan con
los casos sintoináticos. (Oreiistein et al, 1997; Rosenstein, Leitlin, 1995; Westwoond, i 996;
Farrell et al, 1997). Varios estudios sugieren que el modo de preseiitación de la dolencia
iridica su probabie evolución, por ejemplo se ha observado que los pacientes con esteatorrea
y déficit en el creciniiento responden generalmente mejor a los tratamientos y pasan largos
periodos de tiempo asintornático, en contraposición a los que presentan síntomas
respiratorios que continuaii con rnaiiifestacioiies meiios favorables durante su desarrollo
(Kereiii et al, 1989). Factores de nial proiióstico en la enfermedad pulmoiiar iricluyeri las
iiifeccioiies por Psercdomorra aeru~ir~oscr o Berk-kokderia cepacea y coitiplicacioiies
pliliiioiiares conio neumotóras y Iiemoptisis masivas (Knoke et al. 1978: Tnblan et al.
1987).
2.6 BASES MOLECULARES.
2.6.1 LOCALIZACI~N DEL GEN CFTR.
La FQ se debe a mutaciones en el gene cftr que codifica para el regulador de
transporte transmembranal CFTR; este es un canal de cloruro en la membrana apical de las
células epiteliales secretoras, regulado por AMPc que produce la reducción en la secreción
y absorción de electrolitos a través de la membrana apical. (Frizzell; Rechkemmer,
Shoemaker, 1986).
El avance en las técnicas de análisis en ADN permitió el primer requisito para
inapear el gene por niedio de un análisis de ligamiento genético. Esto permitió atribuir la
localización de un gene responsable a una región específica de un determinado cromosoma
(Botstein et al 1980). La segunda etapa fue aislar los fragmentos de la región cromosómica
y 1s última etapa fue aislar el gen para estudiar la proteína responsable; así como
determinar y analizar las mutaciones responsables de la dolencia (Orkin, 1987).
La utilización de fragmentos de restricción de longitud polimórfica en sus siglas eii
ingles RFLP puede ser utilizada para analizar la segregación de genes portadores de la
enfermedad en familias con individuos afectados. Según el principio de ligainieiito
genético, dos marcadores que se encuentran próximos uno al otro en el mismo cromosonia,
puede11 ser transiiiitidos hacia la próxima geiieracióii; hasta que no ocurra uria
recoiiibinación entre ellos durante la meiosis (Vogel, Motulski, 1997). Así uria distancia
estimada para que ocurra la recoinbiiiación, se da por medio del cálculo de la tasa de
recoiiibiiiacióri, 1111 1% de recoiiibiriacióii es igual a 1 Ceiitirnorgan (CM) eii distaiicia
geiiética o a uria distaiicia física aprosirnada a 1 iiiillóri de pares de bases. Cuarito iiieiior
sea la distaiicia eritre los dos locus. iiiayor es la posibilidad qiie ellos se tra~isliiit:iii cii
coii~iiiiito (Ott. 19S6). Ida tsistciicia de iiinrcndorrs poliiiiórlicos pcriiiitc In rt:ilizncicíii tic
estudios de ligamento genético para marcadores o genes causantes de enfermedad (Botstein
et al; 1980).
En 1985, se presentó un mapa del genoma en donde se excluía aproximadamente el
40% por ligamiento con FQ (Williamson et al, 1986). Durante esa misma época un equipo
de Coopeliague, encontró ligamiento positivo del gen FQ con un gene de la enzima
paraoxonasa (ponl) con una tasa de recombinación 15 CM (Eiberg et al 1985). En 1985
Tsui y colaboradores describe el ligamiento genético entre el gen FQ a la sonda de ADN
Docri-917 situado a 15 CM del locus FQ; posteriormente este marcador (D7515) fue
atribuido al cromosoma 15 (Knowlton et al; 1985). Simultáneamente White et al en 1986
en Salt Lake City y Wein Wright et al en 1985 en Londres describieron el ligamiento entre
el locus de FQ por dos niarcadores (met y el D758 respectivamente).
Otros marcadores genéticos ligados descubiertos, posteriorrneiite posibilitaroii la
elaboración de uii mapa de ligamiento genético entre ellos y el geiie niutado productor de la
enfermedad (Beaudet et al, 1986; Estivill et al, 1986; Scambler et al, 1986; Latlirop et al,
1988) (figura 1). Los inarcadores met y D758 fueron utilizados por mucho tiempo para el
diagiióstico prenatal y para diagiióstico de portadores en familias con un individuo afectado
(Farrel et al, 1986; Law et al 1987) y en estudios de genética de poblaciones; sin embargo
estos preseiitaban ciertos limites en la aplicación diagiiostica, en priiiier lugar la existencia
de reconibiiiantes entre el iiiarcador y el geiie que no permite iin diagiióstico absolutaineiite
preciso y eii segundo lugar los dos progenitores deben de ser geiiotipados para que la
faiiiilia sea coiiipletaiiieiite iiiforinativa ya qiie en estudios realizados se Iia deterriiinado que
el 15% de las faiiiilias no eraii iiiforiiiativas y en otras 15% fueron parcialmente
iiilbriiinti\~ns (1:nrrril et al: 1986: Farral. Estivill. Williaiisoii.l987). Estos iiiarcadores poseen
importancia en los estudios de genética poblacional, incidencia y en la historia, geografía y
en fenómenos evolutivos que acompañan al gen mutado.
2.6.2 MAPEO GENETICO: El ordenar las sondas ligadas al gene cftr fue difícil, ya que eran pocas las familias
que presentaban fenómenos de recombinación útiles para ese tipo de pesquisa, para tal fin
fue necesario un gran esfuerzo cooperativo entre diversos grupos para estudiar esas
familias. Esos estudios demostraron que el gene FQ se encontraba entre los marcadores
MET y D758 a uiia distancia genética inferior de 1 CM (Farra1 et al, 1986).
Estudios familiares con estos marcadores de ADN fueron más informativos y
establecieron un mapa de ligamiento genético donde se determinó que las distancia fisica
eiitre estos marcadores era inferior a los 4 x lo6 pares de bases. La secuencia fue aislada y
el fragineiitu de ADN situado eiitre MET y D758 y se analizó esa región por riiedio técnicas
de iiiapa físico y geiiético.
2.6.3 CLONAJE POSICIONAL:
La identificación del gene cftr fue dificil a falta de téciiicas nioleculares mas
refinadas de las que se utilizaban en esa época. Al contrario de pacientes con distrofia
iiiiiscular de Duclieiiiie o retiiioblastoitias, en donde las deleciones eran visibles a
resolucióii de citogenética y de gran utilidad para estos estudios (Monaco et al, 1986). En
esta epoca no se Iiabía deterniinado riingúii afectado FQ con deleciones microscópicas y
taiiipoco coi1 iiiarcadores citogenéticos que facilitaran la localizacióri precisa del gene.
El desarrollo de nuevos métodos como la electroforesis de campo pulsados sobre
geles (pulsed field gel electrophoresis PFGE), con resolución capaz de definir millones de
pares de bases (Carle, Olson,1984) y la elaboración de bancos de segmentos de DNA
clonados en cosmidos o salto de cromosomas (chromosome jumping) (Collins, Weissman,
1984) y el clonaje de genes en cromosomas artificiales de levaduras (yacs) (Burke, Carle,
Olson, 1987) posibilitaron el desarrollo del clonaje posicional que consiste en identificar y
aislar un determinado gene según la función y características bioquímicas de la proteína
determinada según su codificación; fue esta misma técnica la utilizada para el clonaje del
geiie de distrofia inuscular de Duchenne (Monaco et al, 1986) que fue aplicada en el clonaje
del gene de FQ.
Otros métodos que fueroii aplicados en la pesquisa del gene FQ, fue la utilización de
ciertas células hibridas de linaje de ratoiies que contenían como úiiico coniponente humano
la región del croinosoma 7 donde se localizaba el gene FQ, obtenidas por la utilizacióii del
oiicogeiie MET como marcador selectivo (Scambler et al, 1986a, 1986b). A partir de allí, se
fabricaroii baiicos de cosinidos (vectores que permiten el cloiiaje de fragmentos de 40kb)
que permitió el estudio detallado de la región del cromosoma portador del gene de FQ.
Adeniás uii banco humano con mas de 550 clones situados en la región del cromosoma 7
posibilitó la elaboración de un mapa físico de esta región.(Estivill, Williamson,l987,
Scaiiibler et al, 1987).
Eii el geiioiiia Iiumano existen secuencias ricas de nucleótidos CpG que geiieran
tiagiiieiitos de alto peso iiiolecular. Tales regioiies se localizaii eii ciertos puntos del
geiioiiia que se deiioniiiian islas HTF o islas CpG , estas islas iio iiietiladas se situaii eii la
posicióii 5 ' eii la iiiayoria de geiies (Biid,1987). Lo que posibilitó la localizacióii
cioliiosóliiica del gciit: dt: FQ y la idciitificacióii exacta de este. Estas regioiics eii 121
mayoría de genes "house keeping", contienen sitios de restricción para endonucleasas
sensibles a metilación, que originó la estrategia de identificación al construir genotecas de
islas libres de metilación. La identificación de islas HTF en la región del gene FQ permitió
aislar de modo selectivo los genes que por su semejanza genética y física podrían contar
con mutaciones causantes de FQ. La técnica de identificación de clones que contienen isla
HTF, con la selección densa posterior de islas HTF situadas a igual distancia entre los
marcadores MET y D758, permitieron localizar con gran probabilidad el gene FQ. Esto
promovió considerablemente el avance del mapeo final de este gene (Estivill, Williamson,
1987 Estivill et al, 1987").
Los locus D7s23 e INTl Ll cuyos polimorfismos pueden ser detectados por las
soiidas KM19IPst 1 y Xv2cITaq 1 respectivamente fueron asociadas a islas HTF
ideiitificadas próximas al gene FQ, estas fueron el punto dc partida para !os estudios
geiiéticos y inoleculares iiecesarios para la identiticacióii filial del gene FQ (Estivill,
Williamsoii. 1987, Wright et al 1988). E~tudios posteriores a su cloiiaje mostraroii que los
iiiarcadores KM19 y XV2c estaban localizados a 200kb y 260kb respectivamente del
extremo 5' del ge:ie FQ y a 220kb y 280kb de la mutación mas frecuente y que corresponde
a una tasa de recoinbinación de 0,00220 y 0,00285 (lcM=1000kb) (Kerem B.S. et al 1989b
Kaplaii, Lewis, Weir, 1994). estos locus presentan polimorfismos dialélicos detectables
coi1 el uso de eiiziiiias de restricción Pst I y Taq I respectivamente.
Estivill y colaboradores en 1987 y Keren, B.S. eii 1989b construye11 un cuadro
Iiaplotipico. eii doiide se desigiia arbitrariaineiite el iiúmero 1 para los alelos doiide no
esistc el sitio de rcstriccióii para la eiiziina y el iiúiiiero 2 para los alelos que presriitabaii el
sitio dc restriccióii, los cuatros Iiaplc5tipos posibles fuero11 deiioiiiiiiados A.U.C.D. coiihi-iiic
a la presencia del alelo 1 o 2 de los marcadores KM19 y XV2c como se describe en el
cuadro 4.
CUADRO 4: Haplotipos posibles para los polimorfismos KM19 y XV2c
ID 1 alelo 2 1 alelo 2 Fuente: Estivill et al, 1987b
HAPLOTIPO
Estos marcadores muestran un fuerte desequilibrio de ligamiento con el gene cftr en
familias norteamericanas y europeas. Por ejemplo el Iiaplotipo B se encuentra
KM19
aproxiinadaineiite en el 83.5% de cromosoinas (Cr) FQ inutados; en contraste al 15.4%
XV2C
iaeiitificado en Cr iiormales (cuadro 5). Esros datos sugieren que una única mutación en el
geiie cftr sería predominante en estas poblaciones europeas (Estivill et al. 1987b; 1988;
Beaudet et al, 1989).
CUADRO 5: Distribución de haplotipos en cromosomas con y sin mutaciones
mutaciones en cftr en la población euronorteamericana
SIN M U T A C I ~ N HAPLOTIPOS
D
CROMOSOMAS MUTADOS
I.'iiciitc: ViC1;iii~i ct iil. 1989 7 11.4
Kerem, B.S. y colaboradores, 1989b confirmaron la hipótesis con la identificación de la
mutación AF508 en aproximadamente el 70% de los cromosomas mutantes, con estos
hallazgos se realizó un gran estudio colaborativo con los marcadores KM19 y XV2c
analizando 84 10 Cr. (EWGCFG, 1990).
En este estudio se concluyó que cerca del 90% de los Cr con AF508 y cerca del 50%
de Cr con mutaciones no AF508 estaban asociadas al haplotipo B. Con relación a la
secuencia normal se determinó que se presentaba una asociación principalmente con los
haplotipos A y C; tales resultados sugieren que los cromosomas con una mutación AF508
tienen un origen común (EWGCFG, 1990; Sereth et al, 1993). El segundo haplotipo inás
común en Cr inutantes es el D y posiblemente este surgió de la recoinbinación en la región
XV2c (Kerem, B.S: et al, 1989b; Gasparini et al, 1990").
El análisis PFGY y de otros marcadores originarios de esta rcgión contribuyeron a la
localización molecular del geiie de fq , así como las distancias físicas de la regióii del gene
(Estivill et al, 1987"; Druinin et al, 1988), paralelamente fue posible establecer el orden
exacto del locus gracias al estudio en fainilias donde existe11 fenóinenos de recoriibinación
entre los diferentes marcadores y fq el orden establecido fue: Met-INTlLl-D7523-FQ-
D758 (Estivill; Williainsori, 1987; Farral et al, 1988).
CUADRO 6: Frecuencias haplotipicas en cromosomas con y sin la mutación AF508 en
el gene cftr en Italia, Portugal, España y Alemania
2.6.4 DESEQUILIBRIO DE LIGAMIENTO ENTRE KM19 Y XV2C Y EL GENE CFTR
Los iiuevos marcado1.e~ servirán los estudios de ligamiento eii familias coi1 por
iiienos uii iiidividiio iiorinal y uii afectado de fq; uii ejemplo de desequilibrio de ligaiiiieiito
puede ocurrir cuaiido deteriiiiiiado alelo de un marcador segrega prefereiicialiiiente coi1 uii
alelo de un geiie en estudio. Existe un desequilibrio de ligamiento fuerte entre alelos del
geiie de fq y los alelos de marcadores extragénicos KM19 y XV2c situados eii la regióii 5'a
ineiios de 200 kb del gene de fq, con una tasa de recombinación menor al 1%. El gene
iiiiitado está asociado en más del 83% de casos en la población norteamericana, a un
liaplotipo formado por esos dos marcadores, en cuaiito al alelo normal este haplotipo se
eiicueiitra eii i i i i 15% (Estivill et al, 1987a. 1987b, 1989") (Cuadro 6). Los dos inarcadores
soii bnstaiites aiitiguos evolutivaiiieiite pues a pesar de que sus dos locus estáii prósiiiios
iiiio de otro n iiiia distaiicia de 60 lib. estos estáii eii equilibrio de ligainieiito (EWGCFG.
El fuerte desequilibrio de ligamiento verificado entre estos dos marcadores y el gene
cftr y la alta frecuencia génica en europeos y sus descendientes tienen una considerable
importancia: sugiere homogeneidad molecular, ya que considera que una única mutación
seria responsable de por lo menos la mayoría de casos de FQ. Además indica que esos dos
marcadores están físicamente muy próximos al gene responsable de la dolencia (Estivill et
al, 1987b 1988) y con el conocimiento de la proximidad de los marcadores y el gene fue
posible su aplicación al diagnóstico prenatal de fq (Estivill, Williamson, 1987; Feldman et
al, 1988, Beaudet et al, 1989).
2.6.5 IDENTIFICACI~N DEL GENE DE LA FIBROSIS QUISTICA
La región final de FQ se circunscribió en una región de 700kb, entre ¡os marcadores
j3.1 1 (D7s) y MP6d-9 (D7s399) o entre los marcadores MP6d-9 y C2 (D7S410) en una
región cercana a 300kb (Estivill et al, 1989"; Ramsay et al, 1990) ( Figura I ).
Los análisis de estas secuencias permitió que los grupos de Tsui y Riordan en
Canadá y Collins en Estados Unidos aislaron un ADN copia (ADNc) de 61219 pb a partir
de uii banco de geiies construido con la línea celular de células epiteliales de uii carcinonia
de colon. El clonage del gene de fq fue descrito en setiembre de 1989, junto a otros tres
artículos más. (Kerem, B.S. et al, 1989b, Riordan et al, 1989; Roininens et al, 1989).
Fuente: Kerem et al, 1989
Figura 1: Localización física de marcadores polimórficos Loci D7S3401D7S122 y gene CFTR
El gene situado entre los marcadores MP6d-9 y C2 (Estivill et al, 1989"; Rainsay et
al, 1990) cubre una región de 250kb y contiene 27 exoiies (Riordan et al, 1989; Rommens
et al, 1989). Figura 2.
exon 4 7 8 14. 15 17b
CF g e n e
1 2 3 S ~ . ~ , B I O iii2i3i~bi6i7~18 19 2 0 2 i n n 2 r
intron
Figura 2: Distribución de exones en gene CFTR
2.6.6 EL GENE Y LA PROTEINA CFTR
2.6.6.1 ESTRUCTURA DEL GENE CFTR
El gene está constituido por 27 exones plegados en una región de 250kb (figura 2)
La secuencia de nucleótidos, exones y regiones flanqueadoras son conocidas. Las regiones
5'y 3'no traducidas están constituidas por 134 y 1556 pb respectivamente (Harris et al,
1992. El extremo 5'no coditicante y rica en G+C (65% representan los primeros 500 pb que
preceden al primer exón), a lo contrario del 40% del genoma humano total (Yoshimura et
al, 1991 b) y no presenta secuencias TATA o CCAAT, a pesar de haberse encontrado
varios sitios SP y API (Zielenski et al, 1991). La poliadenilación del trascrito ocurre en 17
nucleótidos de la setial AATAAA. La secuencia del gene está altamente conservada en
distintas especies inclusive en aquellas que presentan gran divergencia evolutiva (Tucker,
Tannahill, Higgins, 1992).
Los 27 exones están enumerados del 1 al 24 incluyendo al 6 A y 6 B, 14 A y 14 B y
el 17 A y 17 B. Los tzinaFcs medios de los exones es de 200pb, El exón 6 A es el menor y
mide aproximadamente 38 pb, en cuanto al exón 13 es el niayor y inide 724 pb, El tamaño
de los intrones es inuy diverso y varía entre 1 .1 kb (intrón 6A y 40 kb (intrón 3). El análisis
de secuencias de procesamiento de corte de intrones y empaline de exones de ARNin del
gene CFTR inostró que seguían una regla invariable de GT-AG (Mount, 1982).
2.6.6.2 EXPRESION DEL GENE CFTR
Localización de la expresión
El gene cfir tiene como producto de expresión un ARNm de 6.1 kb que codifica para una
proteína de 1480 aminoácidos. Su expresión se da principalmente en el tracto respiratorio,
reproductor, glándulas sudoríparas, glándulas salivales, páncreas, hígado, intestino, riñones,
glandula paratiroides (Riordan et al, 1989; Trezisse, Buchwald, 199 1 ; Bremmer et al,
1992), en corazón (Levesque et al, 1992) y en linfocitos (Yoshimura et al, 1991 A), no se
detecta en ARNm del gene en cerebro, en glándulas suprarrenales, fibroblastos y
linfoblastos Riordan et al, 1989. El CFTR se expresa en la mayoría de células epiteliales de
varios tejidos analizados (Crawford et al, 1991) transcribiéndose en concentraciones
relativamente bajas (Trapnell et al, 1991). La expresión del gene CFTR es compleja y está
regulada tanto espacial coino temporalmente (Trezisse; Buchwald, 199 1 ). Entretanto se
observó una correspondericia entre la expresión de la proteína y la patología de la
enfermedad.
En el desarrollo fetal, mediante la hibridación i i i situ se ha localizado ARNni de cftr
en gran variedad de tejidos (Tizzano, Chitay y Buchwald, 1993, Trezisse et al 1993). En la
niayoría de estos tejidos el patrón de expresión del CFTR se da durante el ler y 2do
trimestre de vida fetal y su patrón es similar al encontrado durante vida adulta, sueiriendo
que la proteína CFTR es fuiicioiial en las primeras etapas del desarrollo (Porteus y Dorin
1993).
En los puliiioiies la expresión parece estar regulada ya que la esprcsióii es iiiayor en
el epitelio del p~iliiióii priiiiordial y disiiiiii~iye durante el desarrollo enibriológico p~iliiioiiar
liiiiitiiictosc al cpitclio de 121s vías respiratorias iiiferiorcs. Eii la traq~ica y los graiidcs
bronquios es inversa la expresión, no se observa expresión de la CFTR en el feto
apareciendo en el periodo neonatal (Tizzano, Chitaya, Buchwald, 1993, Trizisse et al 1993)
entre tanto al nacimiento, la ausencia del pulmón lesionado permanece sin explicación
(Tizzano, Buchwald, 1993).
En los testículos la expresión de la CFTR es regulada durante el ciclo del epitelio
seminífero. En los espermatides la expresión post meiótica es máxima especialmente
durante las etapas finales, sugiriendo que cftr tiene un papel crítico durante la
espermatogenesis y que la deficiencia de su función contribuye para la infertilidad de los
hombres. (Trazisse, Buchwald, 1991 ).
La correlación entre los niveles de expresión del gene y las anomalías presentes al
iiacimiento no son absolutas o ni son los causantes de la patogénesis en individuos con FQ,
por tanto depende de varios factores, tanto genéticos como ambientales (Tizzano,
Buchwald, 1993, Zielenski et al 1998, Mickle, Cutting, 2000).
Regulación en la expresión:
La trascripción del cftr es un proceso complejo en el cual intervienen distintos
factores, así mismo, el trascripto tiene una regulación típica en tejidos y está modulada por
diversos factores como fosfocolina, AMPc (Breuer et al 1992) esteres de forbol (Trapnell et
al 1991), proteína kinasa C agentes que influyen en niveles intracelulares de cationes
divalentes (Bargori et al 1992 a, 1992 b).
Las características estructurales del proinotor cftr y su baja tasa de expresión en
cflulas epiteliales iiidicaii que debería ser clasificado coriio uii geii de trascripcióii
coiistit~itiva. Eiitre taiito el gene iio es trascrito eii todos los tipos celulares. esto iiidica que
I;i csprcsi6ii de la protciiia CF-1-U iio es cseiicial para la cflula, >,a qiie cflulas eoii proteíiia
anómalas son viables. Por tanto cftr debería clasificarse en el subgrupo de genes con
características estructurales de genes de trascripción constitutiva con función específica de
tejidos, estando su expresión regulada por agentes específicos.
El promotor de cftr contiene secuencias específicas de unión e interacción con
proteínas nucleares que pueden intervenir en la modulación de la transcripción del gene.
Así mismo son detectados 3 sitios potenciales de unión de factores de trascripción de la
familia SPI (secuencias comúnmente encontradas en promotores de trascripción
constitutiva), 4 sitios potenciales de unión con elementos APl interviene en la activación
celular con esteres de forbol, un sitio potencial de respuesta a AMPc y varios sitios
potenciales de respuesta a glucocorticoides y al factor AP2. (Yosliiinura et al 1991b). El
papel que desempeíla cada uno de estos sitios de interacción ADN- proteínas no ha sido
esclarecido Iiasta el momento. Independientemente de la regulación directa de la
traiiscripcióii, la expresión del gene cftr parece estar sujeto o influenciada por mecanismos
indirectos tales coino la metilación diferencial de la región promotora (parece existir una
correlación entre un elevado nivel de expresión y un bajo grado de metilación de la región
promotora) (Koh Sferra y Collins 1993.)
"Splicing del ARNm"
El procesaiiiieiito de intrones y sus uniones con exones en el pre ARNm nuclear es un
proceso altaiiiente regulado, al igual que los iiitroiies estos son eliininados para producir un
ARNiii iiiaduro. Priiiiero la extremidad 5' del iiitroii es cortado y unido por el Spliceosoina
a uii 'braiicli poiiit site' (iiiicleótido de raiiiificación) generando una iiiol6ciila iiiteriiiediaria
Ilniiindn larint. Posterioriiieiite el corte del extreiiio 3' del iiitrón periiiite la ~iiiióii de los dos
tsoiies nd!~ricciites la eliiiiiiincióii del iiitroii iiiteriiiediario.
Las mutaciones que afectan los sitios de corte y unión 3 ' ó 5' son las principales
causas de cortes y uniones anómalas. Mutaciones en el gene cfir tales como la 181 1+1.6 kb
A-G y 3849+10 kb C-T son ejemplos que crean nuevos sitios de corte y unión y dan lugar
a la aparición de nuevos exones (1 1 b y 19b), otros ejemplos se dan en los exones 4,9, 1 1 y
12 donde se han descrito varios casos de cortes y uniones alternativos (Chu et al, 1991;
Bremer et al, 1992; Slomski et al, 1992; Will et al, 1993). En el caso del exon 9 estos
procesos están asociados a una secuencia de polipirimidinas más cortas y por lo tanto
nienos eficientes (Cliu et al, 1993), en el exón 12 pareciera ser debido a una baja homología
de secuencias de ramificación con una secuencia consenso. Para Zielenski y Tsui 1995; las
causas de estos procesos de corte y unión no son muy claras.
Los transcritos alternativos parece ser un fenómeno general que se han observado en
otros genes, como el de distrofia muscular de Duchenne (Chelly et al; 1990); en el gene del
Argiiiosuccinato (Walker ct al 1990) y en el Adenosina desaminasa (Kashii et al 1991).
Pareciera que mediante la regulación de factores específicos en ei proceso de corte y unión
del ARNin se podrían cambiar o controlar los patrones de corte y unión del transcrito y por
tanto modular la fuiición de la proteína (Montrose et al, 1992).
2.6.6.3 Proteína CFTR
2.6.6.3.1 Estrirctura El ARNin del gene CFTR codifica para uiia proteína de 1480 aininoácidos que en su
estado iiiaduro o N-glicosilado, tiene un peso de 168138 daltons. La CFTR esta formado
por dos doiiiinios repetidos y siinétricos coinpuesto por una región Iiidrofóbica
transiiieiiibraiial (MSD, "Meinbraiia Spaiiniiig Domaiii") y una región liidrofílica que tieiie
i i i i n ;loiin dc uiiióii coi1 el ATP. (NBF, "Nuclrotide Biiidirig Fold"): los dos doiiiiriios están
unidos por la región citoplasmática R, que intervienen en la regulación de la proteína
(Figura 3) (Riordan et al, 1989).
O G G . . -Q e-----\
,.' c.1 Carbohidratos
Unión a ' - . - y Lugar donde '1 '. h..-. Nucleótidos
0 0 ocurre la delección' Domlnro de de la fenllalanina' Unión a enila mutación más - Nucieótidos
%ente. deiF508 4 . - , - . ..
Figura 3. Representación Esquemática de la proteína CFTR
La proteína CFTR tiene una estructura semejante a las proteínas transportadoras
dependientes de ATP. La secuencia de ainiiioácidos de CFTR revela fuerte homología coi1
la faiiiilia de proteíiias "ATP Biiidiiig Cassette" o ABC; iiiicialiiiente descritas eii
procariotas y iiiás recieiiteiiieiite eii eucariotas coino proteíiias MDR (Multidrug resisteiice),
COR (resistencia a cloroquiiia) (Mcliitosli; Loreiizo; Brock, 1989) y esta iii\~olucrada eii
el traiisporte de iiioleciilas a través de la iiieiiibraiia celular (Riordaii et al, 1989).
!,as proteíiias de la fainilia ABC tienen eii coiiiuii la preseiicia de uiin a ciintro
regioiies Iiidrofóbicas traiisiiieiiibraiia (cada una foriiiada geiieraliiieiite por 6 segiiieiitos
liidrotobicos trniisiiiriiihrniin) y qiie coiitribii~cii a la foriiiacióii de un canal de traiisportc
en la membrana celular. Presentan una o dos regiones NBF que son sitios de unión e
hidrólisis de ATP y proporcionan la energía necesaria para el transporte (Bremer et al.
1992). La proteína CFTR está formada por dos regiones de transmembrana y dos NBFS y
un dominio regulador central (dominio R) presente solamente en CFTR, además poseen
varios sitios de fosforilación para las Proteinas Kinasa A (PKA) y Proteinas Kinasa C
(PKC), así como numerosos residuos polares dispuestos alternadamente en grupos cargados
positiva y negativamente (Riordan et al 1989; Cheng et al; 1991 ).
La hoinología estructural entre los dos dominios de CFTR sugieren una relación
evolutiva entre ellos, pero la escasa homología de secuencias, excepto entre los dos
dominios NBFs contradice esta posibilidad (Riordan et al., 1989), indicando que las dos
iiiitades del CFTR no son derivadas una de otra por duplicación reciente del gene (Zielenski
et al 199 1 a).
2.6.6.3.2 Fttttcicítt proteirtu CFTR
La proteíiia CFTR iiiterviei;e eii el transporte de cloruro a través de la iiieiiibraiia
celular esto fiie deinostrado por numerosos experiinentos, primero fue con la iiitroduccióii
de moléculas de ARNm de CFTR normal en células FQ suficientes para corregir el defecto
en el traiisporte de cloruro (Drumm et al, 1990; Rich et al, 1990.) La iiitroducción de
ARNin de CFTR en líneas que normalmente no expresan CFTR provoca la activación de la
coriduccióri del cloruro por AMPc (Drumm et al, 1990; Tabcharaiii et al, 1991) y la
iiicorporacióii de proteíiia pura CFTR norriial (Bear et al. 1991) o coi1 uria mutacióii Af508
(Li et al. 1993) qiie eii uria iiieiiibraiia artificial provoca la aparicióii de iiii caiial de cloriiro
activado por AMPc de características idéiiticas a las del CFTR.
La mutagénesis de determinados aminoácidos en la zona de transmembrana permite
una permeabilidad relativa a los iones yodo, cloruros, bromuros y floruros; esto es muy
bien explicado cuando se considera la proteína CFTR como una proteína transportadora de
cloruro más que una proteína reguladora que actúa sobre otros canales (Anderson et al,
1991b).
Así mismo, se ha observado que se necesita apenas la primera mitad de CFTR para
formar un canal de cloruro de características transportadoras similares a las de CFTR, pero
con regulación distinta (Slieppard et al, 1994). En este sentido, Johnson et al, 1992 postula
que es necesario solamente entre 6% al 10% de proteína CFTR normal para que una célula
FQ recupere un transporte de cloruro similar a las células con 100% de proteína normal. La -
unión célula-célula parece ser el mecanismo de amplificación de efectos de células
corregidas (!olinson et al, 1992).
2.6.6.3.3 Regulacicín de la proteína CFTR
El doininio R, es la estructura fundamental en la regulacióii de la proteína CFTR, Se
ha demostrado que cuatro residuos de serina (codones 660, 737, 795, 8 13) son
específicainente fosforilados por la PKA en presencia de AMPc (Cheng et al, 1991) y es
iiecesario que por lo nienos una de ellas se encuentre fosforilada para originar la activacióii
del canal de cloruro (paso 1, Figura 4).
Este paso es reversible mediante la acción de fosfatasas que hasta el moiiiento no
Iiaii sido ideiitificadas (Paso 2, figura 4). Se Iia observado que cuaiido este doiiiiiiio se
riicueiitra deletado. el canal de cloruro actiia en foriiia constitutiva, iiidependieiitr mente de
la preseiicia o iio de AMPc (Ricli et al. 1991).
La fosforilación del dominio R es necesario y podría no ser suficiente para que
exista el transporte de cloruro, una vez que el dominio R se encuentra fosforilado es preciso
que el ATP se una a uno de los dos NBF (Paso 3, figura 4), esto permite un cambio
conformacional en la proteína y permite la apertura del canal de cloruro (Anderson et al,
1991 a), este proceso es reversible dependiendo del sentido de reacción y de la
proporciones intracelular de ATP y ADP, más que de la concentración absoluta de ATC
(Paso 4 figura 4). Los dos NBF no son funcionalmente equivalentes: La hidrólisis de ATP
por la CFTR únicamente ocurre en NBF-2 (Anderson, Welsh, 1992).
Después de la hidrólisis de ATP y del paso de cloruro (Paso 5 figura 4), los NBF
recuperan su conformación inicial y la CFTR vuelve a su estado de cierre (Paso 6 figura 4).
Este inodelo presume que el ATP fosforila la CFTR y esto da apertura del canal
produciendo un flujo pasivo de cloruro a través de la membrana celular de acuerdo a su
gradiente electroquíinico. De este modo, CFTR seria uii canal de cloruro y iio un
transportador activo, pues no existiría una relación estequiométrica eiitre las inoléculas de
ATP Iiidrolizadas y el iiúiiiero de moléculas de cloruro que pasan a través de la nieinbrana
(Colliiis, 1992).
AMPC
x . l \
Fuente: Welsh et al, 1995
FIGURA 4: MODELO
TM TM Ext
Int
CT
2 A W + 2 Pi
P-- 'P
REGULACIÓN DEL CANAL DE CLORURO CFTR
2.6.7 MUTACIONES EN EL GENE CFTR
Las variaciones asociadas a FQ no son aleatorias en su localización y se encuentran
principalmente en la primera mitad de la proteína CFTR, particularmente en la región NBF,
específicamente en los exones 10 y 11, además la primera región MSD revela una
conglomeración importante de mutaciones especialmente en los exones 4 y 7. En
contraposición la subunidad R y en la segunda región MSD son pocas y escasa las
mutaciones identificadas hasta el momento, en la segunda región NBF se han registrado
diversas variaciones, principalinente en los exones 19 y 20. (Comunicación personal Tsui,
2004).
Con relacióii a las mutaciones en la región codificante del cftr, se observa que las
inutaciones de transición de tipo G-A representan el 24,1% y C-T un 14,7%; el tercer tipo
de mutación iiiás coinún son las traiisversiones G-T con 11,9%, apenas el 15.7% de las
iiiutaciones puiituales de la región codificante ocurre en sitios CG, en contraste de lo que
ocurre en otros genes Iiuinanos (Cooper, Krawczak. 1993; Morral et al, 1994). Cerca del
43% de las niutaciones son inodificaciones o alteraciones de sentido debido a sustituciones
de aminoácidos "inissense"; el 22% son de tipo "frameshift", 18% son mutaciones
"nonsense", el 8% iinpide el correcto procesamiento de ARNm (Splicing); el 1% son
deleciones y el 8% son otros tipos mutaciones (Figura 5).
Después de la ideiitificacióii del gene cftr se describieroii por lo inenos 21
iiiutaciones de tipo "riiissense" (alteraciones de sentido) eii el dominio R. De estas
iiiutaciones 19 fueroii estudiadas y observadas que todas causan defectos eii el
procesaiiiieiito y se localizaii eii codones que deteriniiian aiiiiiioácidos eii el estreirio aiiiiiio
tcriiiiiial (aiiiiiioiicidos 60 1-61 9) del doiniiiio R y las que determiiian uii patróii rioriiial de
iii;idiiincióii se rcticicii a aiiiiiioácidos dcl estreiiio carbosi teriiiiiial (aiiiiiioácidos 648-876).
Con relación al estado de maduración del dominio R el gene cf tr se puede dividir en dos
subdominios: primero la sección N terminal que corresponde a un tercio del exón 13 y que
es susceptible a mutaciones missense y segundo el extremo C terminal que se refiere al
exón remanente y que muestra tener una estructura menos estrigente (Van Keeberghen et
al, 1998).
Exon # 1 2 3 4 5 6 a 6 b 7 8 9 10 1 1 1 2 1 3 l l a l W 5 16 17a 1% 18 19 20 21 22 23 24
iiissense II llil 1111 m 1 lll llill lllll 11111 llll III II IIlNll l l 1 111111 IIlllll lllll llll llllllll 111 1111111'1 III 1111 II l l l l I I 11111 llll U111 Nonsense 11 111 1 111 ~~~~l~ 11 1 111 1 1 1 1 11 1 11 1 1 1 1 11 1 11 111 1 ~~~~~~ illl llll 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 111 111 1 1 1 llll 1 1 111 1 1 1 11 1 1 1 Frameshift 11 111 lllll l l l l l 111 1 111 illlllll 111 1 11 111 1 111 111 1 IIIII 1111111111 111 1 llllll 111 111 11111 1 111 11 111 illll 11 1 1 1 111 1 1 I n frame in/del 1 1 111 1 i 1 1 1 1 1 1 1 1 1 l I I II I Splicing / I I l I i i II I I I I 1 1 1 ' I 1 ' l l 1 1 I I I Promotor
sequence~ariirt(iiihIIi1111111lill 1 ' illlIIiI1 1111111llI lllll I I I ll I l l l l l ~ l I l i l l l l l l IIllIlllIlllll I I I I I l Legend Exon Region I lnt ron Regionhot t o scale) - Exon M t a t i o n 1 IntmníPronotor Mutation .
Figura 5: Distribución de mutaciones en CFTR
E l consorcio de aiiálisis genético de FQ ha confirmado que los doii i inios de unión al
ATP son importantes para la correcta función del CFTR, ya que se ha evidenciado
niúltiples niutaciones en estos doiniiiios, además por su compatibilidad con la vida. Las
dos regiones NBF 's son las más coiiservadas entre las especies acentuando su función
crítica en la proteína CFTR. E l t ipo de inutación de gran influencia en el cuadro clínico son
las alteracioiies por delecióii (que influye11 en el tamalio del péptido f i l ial) y las más críticas
soii las de trocaiiiieiito simple de aniiiioácidos. E i i caiiibio las mutaciones que provocan la
fiiializacióii de la transcripción (nonsense) así conio las que impiden el correcto
procesaniieiito del A R N m (Spliciiig) sugiere11 la auseiicia total del CFTR y la
iiiconipatibilidad coi1 la vida (CFGAC. 1994).
Extensos análisis de haplótipos demuestran que la mayoría de mutaciones están
asociadas con haplótipos únicos, o que indica que tales mutaciones son derivadas de un
evento mutacional único (Morral et al., 1993, 1996). En algunas poblaciones es posible
identificar prácticamente todas las mutaciones del gene CFTR, en otras eso no es posible, lo
que demuestra la importancia de los polimorfismos como instrumentos de consejo genético,
tal es el caso de los extragénicos KM19 y XV2c, así como los intragénicos con repetición
TA, CA, GT, TTGA de los intrones 1, 6 a, 8 y 17b. (Morral et al., 199 1 ; Zielenski et al,
1991 c; Morral et al., 1992 Moulin; Smith; Harris, 1997).
Otras mutaciones son asociadas con dos o tres haplotipos diferentes y por tanto no
pueden ser derivadas una de otras por mecanismos moleculares simples (Dork et al, 1992;
Morral et al., 1994) En algunas de estas mutaciones son detectadas en diferentes grupos
continentales, probablerneiite representan mutacioiies recurrentes que se originan
independientemente eii Cr con diferentes haplotipos. En la literatura se describen pocas
inutaciones de novo en el gene CFTR, únicamente se han reportado dos casos, ambos
paternos, una ocurrió en un diiiucleótido CG y otra en una mutacióii T a G, deinostraiido
uiia baja tasa mutacional de Novo en el gene CFTR (Morral et al. 1991. White et al 1991;
Cremonesi et a 19961; Casals et al 1998).
2.6.7.1 MUTACIÓN AF508
La coniparación de la secuencia del geiie mutado, coi1 la secuencia del alelo
silvestre coiifiriiiaii los resultados de los estudios geiiéticos de los iiiarcadores estragénicos
ligados al geiie. es decir qiie la niayoría de afectados soii portadores de uiia iiiisiiia
iii~itacióii la ciial coiisistc cii iiiia delccióii de 3pb eiitre los iiiicleótidos 1652 a 1655 del
rróii 10. teiiieiido coiiio coiist.ciit.iicia iiiia dclrcióii del aiiiiiioicido ki i i l r i l r i i i i i i r i t.11 el ~0d6ii
508. Esta mutación fue descrita por primera vez por Tsui et al, el 24 de agosto de 1989 en
el CFGAC (apud CFGAC) (Cuadro 7)
La deleción se realiza en una región clave de la proteína CFTR, por tanto esta
proteína no se localiza en el citoplasma celular,en el complejo de golgi, ni en el retículo
endoplásmico, no se encuentra una correcta localización en el ápice de la membrana celular
(Kerem, B.S. et al 1989 b).
CUADRO 7: Mutación AF508 del gene cftr
SECUENCIA SILVESTRE DEL EXON 1 O DEL GENE CFTR ADN GAA AAT ATC ATC TTT GGT GTT TCC AMlNOAClDOS Glu Asn Ile Ile Phe Gly Val Ser CODON 5 04 505 506 507 508 509 510 51 1
SECUENCIA MUTANTE DEL EXON 10 DEL GENE CFTR ADN GAA AAT ATC AT- --T GGT GTT TCC AMINOACIDOS Glu Asn Ile Ile Gly Val Ser CODON 5 04 505 5C6 507 508 509 510 51 1 Fuente: Gelehrter; Collins. 1090 (adaptado)
En la gran mayoría de poblaciones a nivel mundial, esta es la mutación mas
frecuente del gene CFTR, es detectada en el 66,62% en un estudio de 11378 cromosomas
de diversos contineiites (CFGAC) de poblaciones variadas. Se mostró que existen
profundas variacioiies en la frecuencia: desde el 22% en Israel, 26% en Argelia, en
Dinamarca 88% de los alelos están niutados con esta alteración (CFGAC).
En el sur de Europa cerca del 50% de los alelos mutados presentan una mutación
AF508 (Estivill et al, 1989~; Gasparini et al; 1990b) (figura 6) Estudios geiiéticos
epideiiiiológicos iiiás rrcieiites con respecto a AF508 presentan íiidices eiitre los individuos
:ifCctados riiropeos de 67.3% eii los espaiioles; 50.93% eii italiaiios y 72.70% eii aleiiiaiies
Estos datos confirman la homogeneidad sugerida en la determinación de haplotipos
obtenidos en los marcadores extragénicos próximos al gene CFTR (Estivill et al., 1988,
1989~).
La mutación AF508 es la más común en las poblaciones del Norte de América y
Europa, con un gradiente de distribución que se moviliza al sur de Europa con menor
frecuencia en los países del Sur de Europa (Loirat, Hazout, Lucotte, 1997). (cuadro 8,
Figura 6)
I'uciitc: Loirat. Ilazout. Lucotte, 1997
FIGURA 6: D I S T R I B U C I ~ N DE FRECUENCIAS DE LA MUTACION AF508 EN
EUIiOPA
CUADRO 8: Frecuencia de la mutación AF508 en diferentes poblaciones
PAIS Yo Alemania 7 3 Argelia 26 Dinamarca 8 8 España 5 4 Estados Unidos 76 Inglaterra 8 1 Italia 5 1 Portugal 69
REFERENCIA Estivill, Bancells, Ramos, 1997 Estivill, Bancells, Ramos, 1997 Schwartz et al, 1992 Estivill, Bancells, Ramos, 1997 Beaudet, 1992 Super, Schwarz, Malone, 1992 Estivill, Bancells, Ramos, 1997 Estivill, Bancells, Ramos, 1997
En poblaciones latinoamericanas las frecuencias de esta mutación es 60,9%, 66%,
56,45% en Argentina (Luna et al, 1996; Saleh et al, 1996, Chertkoff et al, 1997); 39%,
45%, 34,4% y 47,8% en México (Orozco et al, 1993 a, 1993 b; Villalobos-Torres et al
1997; Flores-Martinez et al 1998, Restrepo et al., 2000 respectivamente) 29,2910, en Chile
(Rios et al, 1994), 34% en Cuba (Collazo et al 1995); 25% en Ecuador (Paz y Mino et al
1999); 29,63% en Venezuela (Restrepo et al, 2000) y 48%, 35,4% en Colombia (Keyeux et
al 1997; Restrepo et al. 2000). En Brasil 33% en Campinas, Sp (Martins, Ribeiro, Costa
1993) 35% y 44% en Rio de Janeiro (Miranda et al 1993) (Fernandez et al, 1994); 3 1,7%
Campinas (Parizotto, Bertuzzo, 1997) 47,7% en Rio de Janeiro (Cabello et al, 1999)
48.4%. en Sao Paulo (Beriiardino et al 2000). En Costa Rica Veiiegas et al, 2003 reporta
una frecuencia del 22% AF508 en 44 cromosomas FQ analizados en la población.
2.6.7.2 OTRAS MUTACIONES EN CENE CFTR Desde la identificación del gene en 1989 y la determinación de la niutacióii AF508;
iiiás de 1375 iiiutacioiies y aprosiniadanieiite 150 variaiites asociadas a FQ se Iiati
ideiitificado. (CFGAC.2004 web: \v\v\v.sickkids.oti.ca); el coiisorcio de aiiálisis geiiético
de FQ Iia aiinlizado iiiás de 50 i i i i l alrlos CFTR de afectados de los S cotititietitrs y Iiati
concluido de modo general que otras mutaciones son menos frecuentes que la AF508 y que
muchas de ellas se presentan en una única familia (CFGAC). Se ha encontrado que la
distribución geográfica de estas mutaciones y algunas de estas predominan en poblaciones
del norte de Europa y de América en cuanto a otras predominan en poblaciones del sur de
Europa y en poblaciones africanas y sus descendientes (figura 7).
Porcentaje
.No detenninada . n Z . i n
0+473:?1V
' O R ' l i b l ' i
.3B49+10kb C-T
.R..? I,.
' n.-d%tra
m.-A*?.
11717-1GT 1
I r r e 5.5, I o**i17:
Oir?i.'r,
.621+1GT
o.+,,:-
Fuente: CFGAC. 1994 (adaptado)
Figura 7: Distribución geográfica de mutaciones más comunes del gene CFTR
Uii anlplio estudio de 43849 alelos en 1994 demostró que otras 5 mutaciones
escluyeiido AF508 preseiitabaii frecuencias entre 0.7-2.4% de los afectados eii poblacioiies
europeas y sus descendieiites (CFGAC) (Cuadro 9) y que podrían ser detectadas
siiii~iltáiieaiiieiite por LIII ~iiétodo siiiiple (Ng et al, 1993).
CUADRO 9. Mutaciones más frecuentes en gene CFTR
1 ~ 5 . 5 3 ~ 1322 Fuente: CFGAC, 1994.
MUTACIÓN G542X La mutacioii G542X consiste en la transversión G a T en el nucleotido 1756, en el
codón 642 del exón I 1, transformando el aniinoácido glicina en codón de terminación y fue
descrita por Kerem et al, 1990.
Es la segunda mutación más frecuente a nivel mundial y se presenta en el 2.38% de
los croinosoinas de individuos afectados. En el sureste de Estados Unidos es la sétima
mutación mhs frecuente con un 1.29% y está presente en 0.67 YO en afro americanos
(Macek et al, 1997). Otros trabajos realizados en afro americanos detectaron G542X con
frecuencia de 5% (Phillips et al, 1993) y de 3.6% (Ober et al, 1992).
Entre los europeos también es la segunda mutación más frecuente (2.65%) (Estivill,
Bancells, Ramos. 1997), con variación de 0.75 % entre los ingleses y 2.05% entre los
portugueses, 7.67 % en España, 4.42 % en italianos y 1.12 % en Alemania (Estivill,
Bancells, Ramos, 1997) (Figura 8).
Fuente: Estivill, Bancells, Ramos, 1997
FIGURA 8:Distribución y gradientes de frecuencias de la mutación G542X en Europa
La mutación G542X esta fuertemente asociada al Iiaplotipo B y se eiicueiitra
presente en la mayoría de poblacioiies por tal motivo es considerada antigua, ya que se
deriva del iiiisino tiaplotipo ancestral junto a la AF508 y N1303K. Esta divergencia se da
aprosiiiiadaiiieiite 1350 generaciones o 34000 años y ocurrió en el periodo neolitico antes
del últiiiio periodo glacial, esto explicaría la presencia de esta mutación en muchas
poblacioiies (Casals et al, 1993; Slatkiii, Raiinala. 1997). Su frecuencia relativaineiite alta
eiitre afectados del iiorte de África y el sur de Espaiia ( 1 2.5%) sugiere que la iiitroduccióii
de esta iii~itacióii se prod~i-jo por la peiiiiisula Ibérica (Casals ct al. 1993).
Su frecuencia entre afectados es más alta en población mediterránea (6.1%) y su
mayor pico en las Islas Bálticas (1 6.7%) (Estivill, Bancells, Ramos, 1997). Las frecuencias
descritas de esta mutación entre afectados en poblaciones latinoamericanas son O%, 3.9%,
en Argentina (Saleh et al, 1996, Cherktkoff et al, 1997); 7.2%; 3.3% 4.4%% en México
(Villareal et al, 1996, Flores-Martinez et al, 1998, Restrepo et al, 2000), 4% Cuba (Collazo
et al, 1995), 5,8% en Uruguay (Luzardo, et al, 2002), 6.3% en Panamá (comunicación
personal Cukier, 2004), 3,78% en Venezuela (Restrepo et al, 2000) y en Costa Rica 23%
(Venegas et al, 2003).
El CFGAC en 1993 en un trabajo internacional en 14 paises correlaciono el
genotipo de 399 afectados con una mutación G542X y el fenotipo FQ, demostró que
cualquier composición que contenga las mutaciones F508, G542X, R553X, W 1282X,
N 1303K, 62 1 +1 G-T o 171 7- 1 G-A implicaría insuficiencia pancreática en los afectados;
Kristidis et al, 1992 y Bienvenu et al, 1993 a; en estudios de deterininismo genético en
función pancreática esocrina en afectados, clasifican esta mutación como grave.
Es una mutación de transicióii de una Guanina por una Adenina en el exón 1 1 que
origina el cainbio de una glicina por ácido aspártico en el codón 551. Fue descrita por
Cutting et al, 1990. Es la tercera mutacion más frecuente del CFTR en la población
mundial, se encuentra en el 1.75% en diversos continentes (CFGAC, 1994). Se encuentra
en 1.7% de 1470 croinosomas de afectados euro americanos y en 11148 croinosomas de
afectados afro americanos (Maceli et al, 1997).
A nivel europeo es la cuarta inutacióii más frecuente en 2.25% eii 1600 croiiiosoinas
dc iiiglcsc.~ (CI-GAC) y iiiila eii 797 croiiiosoiiias portiigiieses. espaiiolcs e italiaiios 0.89 eii
978 cromosomas alemanes (Estivill, Bancells, Ramos, 1997). Se observa una elevada
frecuencia en el noreste y centro de europa y su localización actual muestra que podría ser
de origen Celta (Hamosh et al, 1992). Figura 9.
Para Latinoamérica se ha reportado que esta mutación es muy poco frecuente por
ejemplo en Argentina, México, Chile, Costa Rica no se reporta (Cherkotkoff et al, 1997;
Flores-Martínez et al, 1998; Rios et al, 1994, Venegas et al, 2003), Unicamente Orozco et
al, 1999 reporta una frecuencia de 0.35% en su estudio en población Mexicana.
Esta mutación se ha descrito asociada al haplotipo B en relación a Km19 y XV2c
(Casals et al, 1993); Cashman y colaboradores en 1995 demostraron que la mutación
G551D presenta un mismo haplotipo intragénico lo que ha sugerido que todos los
individuos con esta mutación son idénticos por ascendencia; se ha calculado que el primer
evento mutacional ocurrió hace más de 170 generaciones (3520 allos).
Fuente: Estivill. Rancells, Kamos, 1997
FIG[lII:\ 9: I>istribución y gradiente de frecuencia de la niutación G S S I D en Eiirol>a
MUTACIÓN W1282X
Esta mutación consiste en el cambio de una guanina por una adenina en el
nucleotido 3978 del exón 20, sustituyendo el triptofano del codon 1282 por un codón de
terminación (Vidaud et al, 1990).
Es la quinta mutación más frecuente del gene CFTR a nivel mundial, presente en un
1.75% de 1 1378 cromosomas de afectados en diversos continentes (CFGAC). Entre los
afectados euro-americanos fue detectado en un 1.70% de 1470 cromosomas, sin embargo
en 200 cromosomas de afectados afro americanos no fue encontrada (Macek et al, 1997;
CFGAC).
En Europa, es la quinta mutación más frecuente con una media de 1 % de los
cromosomas de individuos afectados (Estivill; Bancells; Rainos, 1997), fue detectada en
0.1 2% de 1600 croinosoinas en la población inglesa (CFGAC), 0.5 1 % en la población
espaíiola y no se reportó en la población portuguesa de 292 cromosomas, en Italia se
reporta en 1.16% y no se reporta en 978 cromosomas FQ en Alemania (Estivill, Bancells,
Rainos, 1997).
Esta mutación presenta una elevada frecuencia entre judíos Askenazis, con mayor
frecuencia en Israel (36.2%). Su origen probablemente es asiático, pero es muy común eii la
mayoría de países inediterráneos y del norte de África (Estivill; Baiicells, Ramos, 1997).
A nivel latiiioamericaiio, las frecueiicias descritas de esta inutación fue: 3.1% eii
Argentina (Cliertkoff et al, 1997), no se determinó en México (Flores-Martinez rt al, 1998;
Restrepo et al, 2000), 0% eii Vriiezurla y 2.1 % eii Coloiiibia (Restrcpo et al. 2000) y 0% eii
Costa Rica (Veiiegas et al. 2003). En Brasil no se deterniiiió iiiiigíin afectado (Feriiáiidez et
al, 1994: Cabello et al. 1999). Beriiardiiio y colaboradores eii el 2000 eiicoiitraroii ti11
C I ~ O I I I O S ~ I ~ ~ ; ~ COII esta i i i t i t : i ~ i i ~ i i c'iitre 320 croiiiosoiiias ( 1 . 3 %) e11 Snii f'atilo.
Esta mutación a pesar de estar asociada al haplotipo "B", cuando se analiza las
repeticiones GATT en el intrón 6 A se encuentra asociada a un haplotipo intragénico
diferente en relación a las mutaciones DF508, G542X, N1303K, Q359K/T360K, S549R,
Esto muestra que esta mutación no tiene el mismo origen que las cinco mutaciones
anteriores y pareciera estar asociadas a un haplotipo para el cuál quizás exista una ventaja
selectiva (Sereth et al, 1993).
Kristidis et al, 1992, clasificaron esta mutación como grave, de acuerdo a la
correlación genotipo fenotipo publicada por la CFGAC, 1993. Recientemente Cotellessa et
al, 2000 realizaron una extensa serie de 1229 afectados de los cuales 141 presentan
diabetes, encontrándose que los pacientes con diabetes presenta mayor frecuencia de
W1282X que los afectados sin diabetes (5.3% vs. 2%), sugiriendo uiia posible asociación
de esta mutación co:i el fenotipo de diabetes.
MUTACIÓN A1507
Esta mutación fue descrita por primera vez por Kerem, B.S. et al, 1989. Consiste en
uiia deleción de 3 pb entre los nucleotidos 1648 y 1653 del exón 1 0, provocando la deleción
de isoleucina del codon 506 o 507 (Schwarz et al, 1991).
Es la 13" mutación nias frecuente a nivel mundial, encontrada en 0.45% de 11378
cromosomas (CFGAC). Fue detectada en 0.27% de 1470 cromosomas de afectados euro
aiiiericanos y no fiie encontrada en 200 cromosomas de afectados afro aiiiericaiios (Macek
et al, 1997), en Europa es la 1 1" mutación inás frecuente, presente en prornedio en 0.24% de
los croniosoiiias de afectados (Estivill. Baiicells, Raiiios, 1997). Por país presenta las
sigiiientes tasas: 0.12% eii 1600 croiiiosoiiias de ingleses. 0.34% dc los croiiiosoiiias
portugueses, 0.07% en españoles y 0.05% en Italianos, 0% entre los afectados alemanes
(Estivill; Bancells; Ramos, 1997).
En Latinoamérica 0.45% en Argentina (Chertkoff et al, 1999) y 2.1 5% y 0% en
México (Orozco et al, 1999 y Restrepo et al, 2000), no fue detectada en Colombia ni en
Venezuela (Restrepo et al, 2000). No se encuentra presente en Brasil, ni en Costa Rica
(Venegas et al, 2003).
Nelson, Carey y Morris, 1991, describieron una familia con dos hijos homocigotos
para A1507, concluyéndose que la mutación es tan severa como AF508. La mutación A1507
fue considerada severa por Kristidis et al, 1992 y por Al-Jader et al, 1992. Pero Curtis et al,
1991 consideraron que era una mutación con fenotipo leve, sugiriendo que la remoción de
la isoleucina eii el codón 507 causaba un fenotipo menos severo que la perdida de
fenilalanina en codón 508 (AF508).
2.6.7.3 CLASIFICACION DE MUTACIGNES EN GENE CFTR Todas las mutacioiies en el geiie cftr se han clasificado en 5 grupos, de acuerdo al
siguieiite esquema (Davidsoii et al, 1998) (Figura 10).
CLASE 1 (PRODUCCION). La producción del regulador es totalineiite defectuosa, conio
ocurre en el caso de la mutación R553X, donde el ARNm es inestable y10 la proteína es
truncada preiiiaturaiiieiite. (Davidson et al, 1998; Rosenstein et al, 1998)
CLASE 11 (BLOQUEO EN EL PROCESAMIENTO). En esta clase, la proteína no es
procesada eii su foriiia glicosilada inadura y iio se localiza correctamente en la membrana
apical, pero es retenida en el retículo eiidoplásmico y degradada (Davidson et al, 1998).
Los c.jeinplos iiie-jor coiiocidos de esta clase. soii las iiiiitacioiies A F SO8 y G-CHOC
CLASE 111 (BLOQUEO EN LA REGULACI~N). Se da una producción normal de la
proteína, sin embargo, falla la respuesta al AMPc, tiene <1% de función del canal y
presenta un fenotipo severo, con insuficiencia pancreática (Taylor,C.J., 1999).
CLASE IV (CONDUCTANCIA ALTERADA). También llamado defecto en la función
del canal iónico, donde el mutante está bien localizado en la membrana plasmática, como
ocurre con las mutaciones G551D o la R117H, sin embargo, su función en el transporte
iónico es muy poca o de un nivel muy reducido. (Davidson et al, 1998).
CLASE V (SINTESIS REDUCIDA O DEFECTO PARCIAL EN EL
PROCESAMIENTO). Causa una enfermedad leve, los pacientes presentan suficiencia
pancreática y frecuentemente bajas concentraciones de electrólitos en el sudor (Taylor,C.J.,
1999).
Normal I I I I I I I v v
G542X N1303K G551D RI 17H A455E 391dclI-f AF508 R347P 3849+10kb C-l' 1717+ 1 G-T
FIGURA 10: Clasificación de mutaciones en el gene cftr según función proteica
3. OBJETIVOS GENERALES
1. Identificar las mutaciones del gene CFTR y sus haplotipos asociados en familias con
fibrosis quística (FQ) en Costa Rica, así como determinar las frecuencias de estas en la
población costarricense afectada por dicha enfermedad.
11. Analizar los fenómenos demográficos, evolutivos y epidemiológicos relacionados con la
fibrosis quística en Costa Rica mediante análisis genealógico, cálculo de coeficientes de
endocruzamiento, medición de distancias migracionales y maritales.
3.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS:
1. Realizar estudios genealógicos en familias que se diagnosticó al menos un caso de
fibrosis quistica.
11. Determinar las niutaciones en el geiie CFTR cti estas familias y calcular las frecuencias
relativas de cada una de ellas.
111. Determinar el o los haplotipos polimórficos tnás frecueiites ligados a los genes
mutaiites y al gene normal en las familias afectadas por fibrosis quística, así como obtener
las frecuencias relativas de estos polimorfismos y haplotipos.
IV. Relacionar las frecuencias obtenidas de las mutaciones, poliinorfismos y haplotipos,
con las reportadas en otras poblaciones de origen étnico europeo y africano.
V. Definir los factores inigracionales, la distribución geográfica y Iris uniones
inatriiiioniales, relacionados con esta enfermedad.
4. MATERIALES Y METODOS
4.1 SUJETOS:
El estudio incluyó todos los pacientes diagnosticados con fibrosis quística, sin
relación consanguínea hasta la tercera generación, con manifestaciones clínicas definidas y
con una concentración de cloruros en sudor mayor a 60 mEq/l en la Clínica de Fibrosis
Quística y el servicio de Neumología del Hospital Nacional de Niños hasta el 31 de
Diciembre del 2003. Además se incluyó a un paciente diagnosticado en el estudio piloto
del Programa Nacional de Tamizaje Neonatal y de Alto Riesgo de Costa Rica con
tripsinógeno inmunoreactivo alto ( 2 98,O nglml) y cloruro confirmatorio mayor a 60 mEq/l
y sus familias.
Las personas participantes en este proyecto de investigación mayores de edad y los
padres, madres o encargados inayores de 18 años de los meiiores de edad, debieron leer y
firniar el consentimiento informado del protocolo de Investigación (anexo 1) aprobado por
la Unidad de Bioética e Investigación del Hospital Nacional de Niiios "Dr. Carlos Sáenz
Herrera" (inscripción del protocolo en Unidad de Bioética e Investigación del Hospital
Nacional de Niños #029-2000).
Se analizaron un total de 130 personas de los cuales 51 corresponden a pacientes
diagnosticados con fibrosis quística en Costa Rica y 79 individuos entre padres y hermanos
del grupo faiiiiliar básico.
4.2 ANÁLISIS GENEAL~GICO.
El análisis genealógico se realizó por dos metodologias: a. Entrevista directa a los
miembros del grupo familiar de cada uno de los probandos y b. Estudios en el Archivo
Histórico Arquidiocesano de la Curia Metropolitana de San José y el Registro Civil.
Se utilizaron los paquetes de computo Cyrillic.exe, family origins 4.0 en la representación
esquemática de la genealogía y en la elaboración de la base de datos de las familias
fibroquisticas. Los simbolos utilizados en esta representación se resumen a continuación:
CUADRO 10: Simbología utilizada en el análisis genealógico
4.3 O B T E N C I ~ N DE MUESTRAS
4.3.1 O B T E N C I ~ N DE MUESTRA SANGUINEA
Se tomó una muestra de 1,5 a 3 ml de sangre periférica venosa del antebrazo del
probando y sus familiares más cercanos. Este procedimiento fue realizado por un
microbiólogo o diplomado en microbiología y es el mismo procedimiento de obtención
utilizado para cualquier examen de sangre de acuerdo a Sáenz et al, 1995.
La sangre se trasvasa a un tubo con anticoagulante EDTA K3 y se mezcla
suavemente tratando de no formar espuma. Una vez que la sangre está mezclada centrífuga
a 1800 g por 15 minutos para separar el plasma.
4.3.2 OBTENCIÓN DE ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (ADN)
Las muestras de sangre son procesadas por el método de extracción de ADN
genóinico "Saltiiig-cut" de Miller, S.A., Dykes, D.D., Polesky, H.F., 1988. En el
Laboratorio de Geiiética y Biología Molecular del Centro para la Prevención de
Discapacidades del Hospital Nacioiial de Nilios "Dr. Carlos Saénz Herrera" mediante el
siguieiite procediiniento:
Las células saiiguíiieas son resuspendidas en 3 ml de buffer lisis (1 OinM tris-HCI, 400inM
NaCl,y 2 inM Na2EDTA a pH 8,2), luego digeridas toda la noche a 37 OC con 0.2 ml de
10% SDS y 0,5 i i i l de solucióii proteasa K.
Finalizada la digestióii, se agregó 1 inl de NaCl 6M y se mezcló Vortes por 15 seguiidos:
luego se ceiitrifugaii por 1 5 iiiiiiiitos a 3500 rpni.
El sobreiiadaiite es transferido a otro tubo de polipropileiio de 15 i i i l y se adicioiiaii dos
voliiineiics de etaiiol absoliito se iiivierte varias veces para la precipitacióii de ADN. todo 11
tt'iiiperatiira aiiihieiitt'.
Las hebras de ADN precipitado son removidas con pipetas y transferidas a un tubo de
microcentrifugación de 1.5 ml con 100-200pl de buffer TE (IOmM tris-HC1, 0.2mM
Na2EDTA, pH 73); el ADN se resuspende por dos horas a 37 OC, para su posterior
análisis.
4.4 ANÁLISIS MOLECULAR
4.4.1 ESTRATEGIA UTILIZADA
Las muestras fueron procesadas en el laboratorio de biología molecular del Centro
para la Prevención de Discapacidades del Hospital Nacional de Niños " Dr. Carlos Saénz
Herrera" en el periodo comprendido de enero 2001 a enero del 2004, y en el Research
Institute del Hospital for Sick Children de Toronto, Canadá de setiembre del 2002 a enero
del 2003.
La identificación de los polimorfisinos y las mutaciones presentes en nuestra
poblacióii ocurrió en varias etapas: primero la identificación de las inutacionesAF508,
A1507, G542X por medio del sistema de amplificación refractaria de mutacioncs (ARMS
iiiultiplex), luego el aiiálisis heteroduplex de exones y la amplificación específica para las
siguientes 9 mutaciones por ARMS simple y los marcadores polimórficos KM 19 y XV2c.
4.4.2 D E S C R I P C I ~ N ANÁLISIS MOLECULAR
4.4.2.1 D E T E R M I N A C I ~ N DE 11 MUTACIONZS EN EL GENE CFTR
El aiiálisis de las 1 1 mutaciones más comunes eii el gene CFTR se realizó en los
pacientes coi1 FQ y los parientes del grupo familiar básico por niedio de la metodología
ARMS iii~iltiples (Ferrie et al, 1992) eii el Laboratorio de Biología Molecular del Hospital
Esta técnica comprende la identificación de las mutaciones AF508, AI507, R560T,
R553X, G551D, G542X, 1717-1G>A, R1 17H, N1303K, 621+1G>T, W1282X, por medio
de amplificación simple y10 múltiple de cada una de las secuencias respectivas, bajo el
siguiente protocolo:
CONDICIONES DE REACCION ARMS (Ferrie et al, 1992).
43 pmol de cada uno de los "primers" (Oligonúcleotidos) apropiados (cuadro 12)
4,3 mmol cie dNTP (dATP; dCTP; dGTP, TTP). En Buffer de reacción: (43mM KCI, 8.6
mM Tris-HCI (pH: 8,3), 1,O mM MgC12, y 0.0008% gelatina) y 1 unidad de cetus taq DNA
polimerasa en 5p1 de buffer reacción y 3 p1 ADN. La reacción de ARMS se realiza en un
termociclador Perkin Elmer modelo 2400 con el siguiente perfil.
CUADRO 11: Condiciones de reacción ARMS
Los productos del ARMS (cuadro 12) son revelados por inedio de electroforesis en
geles de agarosa al 3% (3: 1 agarosa: nusieve) con brornuro de etidio y visualizado bajo luz
iiltravioleta.
TIEMPO 5 minutos
2 minutos
2 minutos
2 minutos
10 minutos
PERFIL Dcsnaturalización Inicial
Desnaturalización
"Annealing"
Extensión
Extensión final
TEMPERATURA 94
94
60 72
72
CUADRO 12. SECUENCIAS DE PRIMERS UTILIZADOS EN ARMS
NOMBRE PRIMER
DF-C DF-j-N DF-W-M
GX-e-N GX-M
NK-C NK-N
NK-M
WX-C W X-b-N
WX-b-M
AATI AAT3 Ar1.1'3 /1/1.1'4
MUTACION Y SECUENCIA (5' A 3') TAMAÑO (pb) AF508 A
GACTTCACTTCTAATGATGATTATGGGAGA GTATCTATATTCATCATAGGAAACACCACA 160 GTATCTATATTCATCATAGGAAACACCATT 156
A15071 AF508 GGGTAGTGTGAAGGGTTCATATGCATAATC
GCCTGGCACCATTAAAGAAAATATCATCTT 146 GCCTGGCACCATTAAAGAAAATATCATTGG 143 EXON 11:
TAAAATTTCAGCAATGTTGTTTTTGACC R553X:
CACCTTGCTAAAGAAATTCTTGCTAG 29 1 CACCTTGCTAAAGAAATTCTTGCTAG 29 1
G551 D: GCTAAAGAAATTCTTGCTCGTTGCC 285 AGCTAAAGAAATTCTTGCTCGTTGCT 286
G542X: ACTCAGTGTGATTCCACCTTCTAC 256 C7ACTCAGTGTGATTCCACCTTCTCA 257
1717-IG-rA: GTCTTTCTCTGCAAACTTGG.4GATGTGC 220 G 1 CTTTCTC TGCAAACTTGGAGATGTti'r 220
R117H: CACATATGGTATGACCCTCTATATAAACTC CCTATGCCTAGATAAATCGCGATAGAAC 23 7 CCTA.FGCCT.4GATAAATCGCGATAGA 4 C 237
N1303K: CTCAATTTCTTTATTCTAAAGACATTGG
GATCACTCCACiGTTCATAGGGATCCAAG 3 28 GATCACTCCACTGTTCPTAGGGATCCAAC 3 28
R560T: GCTTGCTAGACCAATAATTAGTTATTCATC 317 GCTTGCTAGACCAATAATTAGTTATTCATG 317
621+lG-+T: TCCATATGGTATGACCCTCTATAAACT TGCCATGGGGCCTGTGCAAGGAAGTATTCC 380
TGCCATGGGGCCTGTGCA AGGAAGTATTCA 380 W 1282X: CCCATCACTTTTACCTTATAGGTGGGCCTC CCTGTGGTATCACTCCAAAGGCTTTCCAC 178 CCTGTGGTATCACTCCAAAGGCfTFCCA'F 178 AAT: .I'GI'CCACG'TGAGCCTTGCTC<iAGGCC'TGGG 220 GAGACTTGGTAT17'TGTTCAATCATTAAG 330 CCCACC'T.fCCCCTCTCCTCCAGGCAAA.TGG(i 3 60 C~(~(~CC~~C.-1GI~CCCA~1CC~1~1'G(~CI'AAGACi~;~1'(; 360
AAT primers
AAT 3+4
AAT 3+4
AAT 1+2
AAT 1+2
AAT 1+2
AAT 3+4
AAT 3+4
AAT 1+2
AAT 1+2
4.4.2.2 ANALISIS HETERODUPLEX DE MUTACIONES
4.4.2.2.1 PCR MUL TIPLEX
Este PCR consiste en trabajar simultáneamente 29 fragmentos de ADN de todos los
exones del gene CFTR, 2 fragmentos de ADN que corresponde a 1 kilobase (kb) del
promotor y un fragmento de ADN del intron 19 que son amplificadas en 8 reacciones
simultaneas.
Cada reacción contiene los siguientes componentes en un volumen total de 25 VI,
13 V I de primer mix (de acuerdo a secuencia Zielenski et al, 2002), 1 . 0 ~ 1 de DNA
genómico, 2 . 5 ~ 1 dNTP's mix 2mM, 2.5 pI PCR buffer 10X (100mM tris-HCI, pH8.3,
500mM KCI; 17.5 mM MgC12; 0.01% gelatin), 0 .5~1 taq-polimerasa (5uI pl), 5.5 p1 de agua
desionizada. La PCR se realiza en un termociclador "Gene Amp PCR System 9600" de
applied biosystems bajo las siguientes condiciones (Cuadro 13).
CUADRO 13: Condiciones de reacción PCR multiplex
Desnaturalización &rLgundos
Segmento 11 "Auto"
Temp final 0°C O segundos
Extensi611 O segundos
X 20 ciclos
9°C k n a n i n l i u c i ó n
Segmento 1V ciclos Annealing X I ciclo
I Extensibn
Los prod~ictos filiales de la reacción de aiiiplificacióii son corridas en un gel de agarosa al
3% para verificar el PCR. Usualineiite se observaii niúltiples bandas después de la tiiicióii
coi1 bi-oiiiliro de etidio.
4.4.2.2.2 COLUMNA DE PURIFICACIÓN En la etapa de purificación de productos del PCR se utiliza el kit de purificación
QIAquick Spin PCR de QIAGEN (CAT #28104); 20pL de cada mix de PCR de un
paciente son combinados en un solo tubo (Todos los fragmentos del PCR de un paciente
dentro de un tubo), continuando con el siguiente protocolo:
Adicionar 5 volúmenes buffer PB a un volumen del "pool" de PCR mix, se mezcla
en vortex, este mix es colocado en una columna de purificación con un tubo colector de 2
ml y se centrífuga a 13000 RPM durante 30-60 segundos, se descarta el flujo y se lava la
columna con 0.75 ml de buffer PE, con posterior centrifugación a 13000 RPM por 30-60
segundos; se descarta el flujo y se centrífuga en las mismas condiciones durante 1 minuto
extra a velocidad máxima. Se coloca la columna de purificación dentro de un tubo 1.5inl
liinpio y esteril y se eluye el ADN, agregando 50 VI de agua desionizada en el centro de la
ineinbrana y se centrífuga la colunina por 1 minuto.
El inix purificado se seca en un Speed Vac duraiite 8 lloras y el residuo seco se
disuelve eii 25 VI de buffer carga 2X (Sucrosa, Urea, Azul de Bromofeiiol y Xilene cianol).
4.4.2.2.3 Electroforesis de ADN en gel Hydrolink-MDE
4.4.2.2.3.1 Preparación gel
A 20 ml de Hydrolink MDE-Gel se adiciona 40inI de Buffer TBE 30% Urea (Tris,
Acido Borico, EDTA, Urea) y 20 ni1 de formamida desioiiizada a 4 "C y mezclar. A este
iiiis se le adicioiia solucióii persulfato de ainoiiio 10% y 70 p1 TEMED. Este niis se aplica
leiitaiiieiite eii uiia cáinara de electroforesis vertical por iiiedio de uiia jeriiiga de 60nil y se
espera aprosiiiiadaiiieiite 60 iiiiiiutos para la poliiiierizacióii.
4.4.2.2.3.2 Electroforesis
Con el gel polimerizado se carga la cámara con buffer TBE 0.6 X (Tris Acido
Bórico, EDTA) y se coloca en pre-electroforesis por 30 minutos con las siguientes
condiciones: VOLTAJE: 1000 Voltios constante, CORRIENTE: 20 mAmperios,
PODER: 20 Watts, TIEMPO: 30 minutos
Luego se cargan 3 pI de cada muestra cinco veces en el mismo gel, para completar
cinco juegos de corridas de las mismas muestras en un peine de 64 pozos. Se corre
inicialmente por cinco minutos a un voltaje de 1000 Voltios y se cambia luego bajo las
siguientes condiciones: VOLTAJE: 500 Voltios constante, CORRIENTE: 10 mAmperios
PODER: 7 Watts, TIEMPO: toda la noche (1 5-1 7 horas).
4.4.2.2.4 H I B R I D A C I ~ N DE SONDAS EXÓN ESPEC~FICAS
Después de la electroforesis, se retira una de las placas de vidrio y se coloca una
i~~ei-iibraiia de trai~sfereiicia "Hyboiid-N+" (Ainersham), pre-mojada con buffer TBE 0.6X.
Por encima de esta pieza se coloca tres piezas de papel de filtro Wliatniann 3MM y uiia
placa de vidrio sobre el papel Whatinaiin durante 16 horas.
Luego de la transferencia del ADN a la membrana, se coloca esta en solución NaOH
0.4N por 10 minutos, luego se coloca la membrana al buffer 2X SSC por 10 minutos, se
coloca la membrana seca eii uii papel Wliatinann y se guarda en una bolsa plástica hasta su
USO.
4.4.2.2.5 HIBRIDIZACIÓN Y SONDAS
4.4.2.2.5.1 PREHIBRIDIZACIÓN. En la hibridización se utilizó un horno de hibridación (HYBAID) para botellas.
Cada botella de hibridización contiene un buffer Amasino (SDS 20%, PEG 50%, Nacl 5M,
Buffer fosfatos 0.5M (pH=7.2), agua desionizada).
El papel Whatmann que contiene el ADN se coloca dentro de una botella de
hibridación con 30 ml de solución Amasino precalentada a 42" C , la prehibridización se
realiza en el horno a 42 O C durante 1 hora.
4.4.2.2.5.2 MARCAJE DE OLIGONUCLEOTIDOS.
Los oligonucleotidos utilizados se encuentran a una concentración de 100ng/;l, el
volumen final de primer que se utiliza se obtiene a partir de la formula 2X (número de
primer, buffer TdT 5X (Gibcc BRL), TdT (Gibco BRL), 32P-dCTP, aforados a 50pl.
Para el marcaje se utilizan los oiigonúcleotidos en cuadro 14 (5 mix de
oligonucleotidos). En el cuadro se muestra el orden de bandas electroforéticas
correspoiidientes a diferentes exones del gene CFTR después de hibridizarse con cinco
diferentes inix.
Eii la preparación de la sonda se realiza el mix de Oligonúcleotidos se adiciona TdT
y 32-dCTP e incubar por una hora a 37 grados centígrados. Se agrega 100 p1 de solución
TE a la iiiezcla de reaccióii y se carga el voluiiieii total dentro de una columna de Sephadex
(325, se colecta la primera iiiuestra eluyente y después se centrífuga a 1000 rpm por un
iiiiiiuto.
CUADRO 14: Mix de Oligonúcleotidos utilizados como sondas exón especificas
FRAGMENTO PCR
MIX SONDA 1 1 o 13B 23 8 22
MIX SONDA 2 PRO 2 1 13 A 6 A 1 1 3
EX 2 1 14 A
, 5
, 6 B
AGTGTGAAGGGTTCATATGC TTTCGGTGAATGTTCTGACC GTAAATACAGATCATTACTG A ATGC ATTA ATGCTATTCTG TGTCACCATGAAGCAGGCAT
SECUENCIA (5'-3') TAMAÑO FRAGMENTO (pb)
NOMBRE PRIMER
AAGGAGGGTCTAGGAAGCTC TTAGGAGCTTGAGCCCAGAC TGGTCGAAAGAATCACATCC GGAAGATACAATGACACCTG CAGGAAATGGTTGCTAGACC TGCAACTTATTGGTCCCACT 1
I CTTAGACTTGC ACTTGCTTG GGTAAGTACATGGGTGTTTC TGGCATGAAACTGTACTGTC CCTGAGAAGATAGTAAGCTAG TCTACACTAGATGACCAGGA TGTGTTGAAATTCTCAGGGT TTAAGGACAGAATTACTAAC
4.4.2.2.5.3 HIBRIDIZACIÓN Y LAVADO Se adiciona la sonda al buffer de hibridización y se hibridiza toda la noche a 42OC,
después de la Iiibridización los filtros so11 lavados con SSC 3X y O. 1% SDS a temperatura
ambiente por 20 minutos, seguido de dos lavado a 36°C de 20 iniiiutos con SSC 0.2X. Los
filtros son traiisferidos secos y expuestos en película de autoradiografia (2-1 8 horas).
4.4.2.2.6 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS La autoradiografia se observa a través de uiia caja de luz blanca para la observncioii
de patroiies de baiidas electroforéticas aiioriiiales.
4.4.2.3 DETERMINACI~N DE HAPLOTIPOS En esta etapa se realizará la identificación de los marcadores polimórficos tipo
"RFLP" extragénicos KM19 y XV2, ubicados a un centimorgan del gene cfir. Este
procedimiento se realizará a los probandos v su familia en el Laboratorio de Genética v
El primer marcador extragénico por analizar fue el XV2c/TaqI; el cual se determinó
de acuerdo al protocolo de Rosenbloom et al, 1989 mediante el siguiente procedimiento:
Las secuencias de Oligonúcleotidos utilizadas fueron:
5'GTTGAAGTGAATTGAATG 3'
5'GmCAAACTATGTCAAAG 3'
A partir de esta amplificación se obtiene un fragmento de I .O kb. que es digerido
con la enzima de restricción Taq 1, la cual produce dos fragmentos de restricción de 0.6 kb
y 0.4 kb.
Las condiciones de laboratorio fueron:
Annealing: 2 minutos 55"C, extensión: 5 minutos 72"C, desnaturalización: l minuto a 94
"C en 30 ciclos. Estos productos son corridos en un gel de agarosa al I %.
El segundo polimorfisino utilizado fue el KM19 / PstI, el cual se llevó a cabo de
acuerdo a Feldman et al, 1988
La secuencia de Oligonúcleotidos utilizada es:
5 'GCTGCATCATATAAGTTGCC 3'
S'AAGGCTACACTGTTAATTTT 3'
Las coiidicioiies de laboratorio fiieron:
Aiiticaliiig: 2 iiiiiiutos 55°C. estensióti: 5 iiiitiutos 72°C. desriatiiralizncióti: I iiiiiiitto a 94
"C cti -30 ciclos. Estos proditctos soti corridos cri i t i i gel de rigai-osa al I ",ó
Para estos dos protocolos se utilizaron los siguientes componentes de PCR:
75 pmol de cada oligonucleotido
1 pg ADN genómico
2,5 U Taq DNA polimerasa en un volumen de 50 p1
Los productos de la amplificación se deben digerir con Pst I y correr en geles de agarosa
1.5% con bromuro de etidio.
Los haplotipos A, B, C y D serán definidos de acuerdo al Grupo de Trabajo Europeo en
genética de fibrosis quística de la siguiente manera (cuadro 15):
CUADRO 15: Definición haplotipos dialélicos KM19KV2c
(1) Las enziinas de restricción no cortan los segmentos amplificados
(2) Las enzimas de restricción cortan en dos segmentos la secuencia de ADN
Amplificada.
4.4.2.4 CALCULO DE FRECUENCIAS
4.4.2.4.1 FRECUENCIAS DE MUTACIONES Con los datos obtenidos del análisis de las mutaciones, se obtendrán las frecuencias
genotípicas, alélicas de los pacientes afectados por fibrosis quística y de sus familias en
nuestro país. Esta se realizará por el método de conteo de genes y se calculará por medio
de la fórmula para estimar la frecuencia alélica para n alelos con una segregación
codominante de acuerdo a Hedrick et al, 2000:
Pi= Nii + 1/2 (Cni=l Nij)/N
N= número total de individuos
Ni¡= Número de individuos homocigota para una mutación i.
Nij=NÚmero de individuos heterocigotas para mutación i y otro alelo.
Pi= Frecuencia relativa (alélica) para mutación i.
Con varianza: V (Pi)= Pi (1- Pi)/2N.
Las frecuencias genotípicas observadas se compararan con las frecuencias
genotípicas esperadas por medio de un Chi- cuadrado de Pearson con un 95% de confianza,
con el propósito de observar si existen diferencia significativas entre estas frecuencias y si
se encuentran en equilibrio de Hardy - Weinberg.
4.4.2.4.2 FRECUENCIAS HAPLOTIPICAS.
Las frecuencias de los haplotipos se obtendrán al igual que la sección anterior por
inedio del conteo de genes con la utilización la fórmula para estimar la frecuencia alélica
para 11 alelos con una segregación codoininante de acuerdo a Hedrick et al, 2000.
4.4.2.5 FACTORES DE CRUZAMIENTO, MIGRACIONALES Y GEOGRAFICOS
En esta etapa cada una de las familias involucradas en la investigación debió
completar un cuestionario diseñado para ellos (Anexo 2). Este contempla la siguiente
información:
4.4.2.5.1 HISTORIA CLÍNICA Con anterioridad a los análisis moleculares, se conoció el historial clínico, heredo-
familiar, postnatal, quirúrgico del paciente y las evaluaciones de laboratorio practicadas a la
familia como pruebas de cloruro en sudor, tripsinógeno inmunorreactivo, así como pruebas
de función pulmonar, presencia de infecciones pulmonares con especificación del agente
infeccioso, así como otras enfermedades (Este apartado es utilizado en el proyecto general
realizado para el Hospital Nacional de Niños y son pocos los puntos utilizados en este
trabajo).
4.4.2.5.2 FACTORES EVOLUTIVOS Con la finalidad de conocer los factores que podrían influir en la presencia de la
fibrosis quística en Costa Rica, se investigó la migración (flujo génico), distribución
geográfica por regiones, los tipos de cruzamientos en la población (consanguínea,
aleatoria), así como la endogamia y exogamia, mediante los siguientes análisis:
4.4.2.5.2.1 FL UJO GENÉTICO El análisis del flujo géiiico se realizó iiiediaiite la medición de las distancias
migracionales o generacionales padre-hijo y madre-liijo, estas deterininaii cuanto se ha
iiiovilizado el gene iiiutado de 1 geiieracióii a otra y así se observa el tliijo de cada uiia de
las iiiiitacioiies.
La distancia migracional se midió en metros a partir de la distancias comprendidas
entre el lugar de nacimiento del padre y la madre y el lugar de nacimiento del probando.
Esto se realizó mediante el uso de un mapa fisico político y de carreteras de Costa Rica
proporcionado por el Instituto Geográfico Nacional. No se tomó como lugar de nacimiento
los Hospitales, sino donde vivió en los primeros seis meses de edad.
Las distancias migracionales se tabularon en forma general para la población
costarricense y según el tipo de mutación implicada en la segregación por familia. Se
realizó estadística descriptiva para los datos obtenidos, así como el análisis de varianza de
una vía con un a=%, para observar diferencias entre el flujo genético de cada una de las
mutaciones identificadas, con una posterior prueba a posteriori tipo Tukey.
4.4.2.5.2.2 CRUZAMIENTOS
Para conocer los tipos de cruzamientos implicados se realizaron dos procedimientos
principales; el primero de ellos fue a partir de los lugares de nacimiento de los padres con la
medición de las distancias maritales. Esto permite conocer la cercanía de dos personas
portadoras para cftr y la presencia de endogamia y exogamia.
Se tabularon los datos en dos grupos importantes endogamia y exogamia, en el
primero de ellos ainbos padres (portadores obligatorios) nacieron en la misma región
geográfica; con relación a la exogainia se tomará como referencia, sí el padre nació en otra
regióii fuera de Saii José o si la madre nació en otra región fuera de Saii José, o si ainbos
iiacieroii eii regioiies diferentes, coi1 respecto a estos datos se obtendrá estadística
descriptiva.
El segundo tipo de procedimiento utilizado es el cálculo del coeficiente de
endocruzamiento, esto se realiza a partir de las genealogías de cada una de las familias por
medio de la técnica de conteo en cadena (Hedrick et al, 2000); esto con el fin de observar la
probabilidad de alelos de origen común en cada una de ellas y así verificar el grado de
relación consanguínea.
4.4.2.5.2.3 DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA Los lugares de nacimiento de los probandos, así como de los portadores obligatorios
(padres) se tabularán en nueve regiones a saber: San José que se dividió en San José 1:
Parroquias de Aserrí, Curridabat, Desamparados, Alajuelita, Dota, Acosta, San Juan de
Tobosi. San José 2, el resto de parroquias de San José. Alajuela, Heredia y Cartago
(Zumbado y Barrantes, 1991). Guanacaste, Limón, Puntarenas por su origen
etnohistórico (Morera y Barrantes, 1994, 2003) y por último una subdivisión llamada
extranjeros que representa a todos los individuos nacidos fuera de Costa Rica.
La distribución geográfica de las mutaciones y haplotipos de nuestro país se
obtuvieroii a partir del lugar de nacimiento de los portadores obligatorios. Los datos
obtenidos se codificaron con el sistema digital de división territorial y se graficaron en
inapas cartográficos de Costa Rica con el software Mapinfo en la Escuela de Geografia de
la Universidad de Costa Rica.
5. RESULTADOS
5.1 POLIMORFISMOS DIALELICOS KM19 Y XV2C
5.1.1 Frecuencias alélicas. En el cuadro 16 se resume el cálculo de las frecuencias alélicas de los
polimorfismos dialélicos KM19 y XV2C en cromosomas mutados y normales en la
población costarricense así como del desequilibrio de ligamiento (D.L.).
CUADRO 16. Frecuencia alélica de los polimorfismos dialélicos KM19 y XVLC, en
cromosomas de individuos afectados y normales en Costa Rica
CROMOSOMAS . , . . 7 . . -
' " ' 2 " , . p POLIMORFISMOALELO .' - 'FQ4 t.- ~:T;~;No&MAL . , -Q D.L. ,' ' '' ;c../:? :;:._+;Y:,\.X .
1 57 (55,9%) , . S' ,52 (81,25) .' ' . 7 , " > . . p .. . ..t:. . -_ ',, .S-x i' .
A nivel nacional se observa que el alelo I de los polimorfismos KM19 y XV2c es el
inás frecuente en ambos grupos. Por regiones geográficas de estudio se observó que el alelo
1 del poliniorfisino KM19 se encuentra con mayor frecuencia eri las regiones Saii José
coiisaiiguíiiea, Alajuela, Guanacaste, Linióri. Cori respecto a Guanacaste únicaniente se
encuentra representada por un solo individuo que es honiocigoto para diclio alelo
(Cuadro 1 7).
Con respecto al polimorfismo XV2c se observa que el alelo 1 se encuentra con mayor
porcentaje en las regiones de San José consanguíneo, Alajuela, Heredia y Limón.
Únicamente la región de Puntarenas presenta mayor frecuencia en el Alelo 2 con un 58.3%
(Cuadro 17).
CUADRO 17. Frecuencia alélica de los polimorfismos dialélicos KM19 y XVLC, en
cromosomas mutantes CFTR en varias regiones de Costa Rica
Lonsanguineo, >.~.i\I.C.=>an Jose no Lonsanguineo
5.1.2 Frecuencia genotipica
Eii los Cuadros 18 y 19 se muestra las frecuencias genotipicas de los poliinorfisinos
dialélicos KM19 y XV2c en cromosonias afectados a nivel nacional y por regiones
geográficas respectivamente.
Coino se observa en ellos los pacientes fibroquisticos de nuestro país presentan la
iiiayor frecuencia eii el geiiotipo Iieterocigota 112, en contraposición al geriotipo
Iioiiiocigota 712 el cual es represeiitado en iiri 15.7% de los pacieiites (Cuadro 18).
CUADRO 18: Frecuencias genotípicas de los polimorfismos dialélicos KM19 y XV2c
en cromosomas mutantes de pacientes con fibrosis quística en Costa Rica.
En relación a la distribución de genotipos por región geográfica se encontró con
respecto al polimorfismo KM19 que el genotipo 111 se encuentra en rnenor proporción en
las regiones S.J.N.C., Guanacaste y Limón y con mayor proporción en la región de
Alajuela. Este genotipo no se presenta en Heredia, Cartago y Puntarenas, además no es
observado en los individuos provenientes de otros paises incluidos en la muestra.
El heterocigoto de KM19 no se presenta en Guanacaste, no obstante eri las demás
regiones de Costa Rica se presenta y el inayor número de individuos está principalrnerite en
las regiones de S.J.N.C.y Alajuela. El genotipo 212 de este marcador polimórfico es menos
frecuente de individuos y su distribución es muy homogénea, agrupándose en las regiones
de S.J.C., S.J.N.C., Alajuela, Cartago y Puntarenas. La región con mayor frecuencia es
S.J.C con 3 individuos representando el 5.9% del total.
Con relación al polimorfismo XV2c, se observa que Alajuela presenta la mayor
cantidad de individuos liomocigoto 111; en contraposición Puritarenas, Heredia y Limón
presenta11 la nierior proporción de individuos hoiiiocigotos. El geiiotipo hoiiiocigota 212
preseiita iiidividuos únicariiente eii cuatro de las riueve regiones definidas; cada uria coi1 uii
2% (Cuadro 19). Por otra parte, los iiidividuos Iieterocigotas para XV2c. se preseiitaii eii
iiiayor proporcihii eii la proviiicia de Ala-juela y rii iiiriior proporcióii (2%) rii i rrgioiirs
específicas, definidas en las provincias de Heredia, Guanacaste y además por un individuo
proveniente de otro país.
CUADRO 19: Frecuencias genotípicas de los polimorfismos dialélicos KM19 y XV2c
en cromosomas mutados CFTR según región geográfica.
5.1.3 Comparación estadística de las frecuencias
En el Cuadro 20 se comparan las frecuencias genotipicas de los poliinori'ismos
dialélicos KM19 y XV2c en croinosomas cftr mutado mediante la prueba estadística de Chi
cuadrado. No existen diferencias significativas entre las frecuencias genotípicas observadas
y esperadas de los marcadores polimórficos KM19 y XV2C en la población costarricense.
CUADRO 20: Comparación en las frecuencias genotípicas en cromosomas cftr
afectados en Costa Rica
. : .. . . . . . . . .
1 1 . - 1 2 .. 22
S
. . . xvic 12 3 1 K
I . . I I . - . - - . . 1
NS= no significativo.
5.2 HAPLOTIPOS KM19 Y XV2C
El análisis de haplotipos se realizó en los 5 1 pacientes diagnosticados en la clínica
de fibrosis quística del Hospital Nacional de Niños. A 44 se les confirmó el haplotipo y 7
pacientes no se determinó el haplotipo especifico ya que los genotipos heterocigotas para
los marcadores dialélicos KM19 y XV2c especifican varios tipos de haplotipos.
5.2.1 Frecuencia haplotípica En el cuadro 21 se observa la distribución haplotípica de los polimorfismos
dialélicos KM19 y XV2c en cromosomas afectados y en cromosomas normales. En el
grupo afectado el haplotipo A es el más frecuente con un 30.68% y los haplotipos B y D los
menos frecuentes con 23.86% y un 19.32% respectivamente.
En los haplotipos relacionados con los cromosomas cftr normal los haplotipo A y C
son más frecuentes, sin embargo se determinó que el haplotipo B está en menor proporción
en un 7.8%. Existen diferencias significativas entre los haplotipos en cromosoinas
afectados y cromosoinas normales ( ~ 2 = 10,s; 3gl; p< 0,0 1).
CUADRO 21: Frecuencia haplotípica de los marcadores dialélicos KM19 y XV2C en
cromosomas afectados FQ y normales en Costa Rica.
Con respecto a la frecuencia haplotípica por región geográfica (Cuadro 22) se
observa que el haplotipo A se tiene la mayor frecuencia (13.6%) en la región de Alajuela,
seguido por la provincia de San José (10,2%). Con relación al haplotipo B muestra mayor
proporción de individuos en la provincia de San José con un 9.1%. Alajuela presenta un
10.2% de individuos con haplotipo C. Además, el haplotipo D presenta 17 haplotipos de
los cuales 8,O % se concentran en la provincia de San José, los otros se distribuyen en las
regiones de Alajuela, Cartago, Puntarenas y Limón (Cuadro 7). ~2=12,008; 18 gl, p=0.847
CUADRO 22: Frecuencia haplotípica de los marcadores dialélicos KM19 y XV2C en
Cromosomas afectados, según región geográfica de Costa Rica
5.2.2 Combinación haplotipica de KM19 Y XV2C Eii el cuadro 23 se preseiitaii las frecuencias de combinación Iiaplotípica de KM19 y
XV2C, eii iiidividuos afectados por fibrosis quística. Debido a dificultades eii deducir los
Iiaplotipos de los iiidividuos heterocigotas 1,2 para los marcadores dialélicos KM19 y
XV2C, iio fue posible deteriniiiar la conibiiiacióii haplotípica de siete pacieiites de nuestra
poblacióii.
Analizadas las combinaciones haplotípicas de KM19 y XV2C en afectados se
encontró que la combinación más común fueron AC y AB con un 22,73% y 18,18%. Las
combinaciones BD y CD fueron las terceras más frecuentes en nuestro país con 13,64%
cada una. Las combinaciones homocigotas BB, CC, DD fueron las menos, cada una con 1
individuo (2,27%). Las diferencias existentes son estadísticamente significativas
(~2=20,09 1, p<0.02).
CUADRO 23: Frecuencia combinación haplotípica de los marcadores dialélicos KM19
y XV2C en individuos afectados.
5.3 MUTACIONES DEL GENE CFTR
5.3.1 Mutaciones y frecuencia
En los Cuadros 24 y 25 se presentan las frecuencias de inutaciones detectadas en
pacieiites coi1 fibrosis quística en Costa Rica y su distribución por región de naciiiiieiito del
afectado. Como se observa en el Cuadro 24 el nivel de detección de mutaciones para el
geiie cftr es del 75.5%, identificáiidose con ello 8 inutaciones a saber: G542X, AF508,
R117H, 1717-1G-A, G551D, 3849+10kb C-T, 621 +IG-T, W1282X. La niutación G542X
es la iiiás frecueiite coi1 uii 24.5%. La iiiutacióii AF508 es la segunda iiiás frecueiite coi1 u11
16.7% y las iiiutacioiies 3849+10 kb C+T, 621 +1 G+T, W 1282X las iiieiios frecueiites.
El Cuadro 25 presenta el análisis de las mutaciones por regiones, La provincia de
San José presenta todo el espectro de mutaciones identificadas en nuestro pais, la provincia
de Alajuela presenta todas las mutaciones identificadas en Costa Rica con excepción de la
mutación 3849 + 10 kb C-T. Por otra parte de acuerdo al tipo de mutación por provincia se
determinó que la mutación G542X se presenta en las provincias de San José, Alajuela,
Puntarenas y Limón, siendo San José la región con mayor incidencia de esta mutación en
todo el pais.
Con respecto a la mutación AF508 se observa que San José y Alajuela presentan el
7 1 % de esta mutación. La provincia de Puntarenas es la provincia con la menor frecuencia
AF508 a nivel nacional con un 0.98%.
En relación a las mutaciones con una frecuencia intermedia R 1 1 7H, 1 7 17- 1 G-A,
G55 1 D son frecuentes en las provincias de San José y Alajuela, pero en el caso de la
RI !7H se encuentran en la región S.J.C., además de las provincias de Heredia y
Puntarenas. La mutación 17 17- 1 G-A presenta un alelo mutante en Guanacaste y Liinón,
en contraposición a la mutación G55 1 D en la cual se encuentra restringida a la regiones de
San José y Alajuela. La mutación 621 +IG-T se presenta en dos ocasiones en la provincia
de San José y en una ocasión en Alajuela y Puntarenas para 0.98% cada una. Con respecto
a la inutación W1282X los cuatro cromosomas mutantes se encuentran distribuidos
equitativamente en las regiones de San José, Alajuela, Heredia y Puntarenas.
La mutación 3849 + 10 kb C-T es frecuente en la proviiicia de San José con un
1.96% coii relación a la población general y se encuentra presente en las dos regiones de
Saii Josk, S.J.C y S.J.N.C.
CUADRO 24: Frecuencia de mutaciones CFTR detectadas en individuos con
fibrosis quística en Costa Rica
CUADRO 25: Frecuencia de mutaciones CF'i'R detectadas en individuos con fibrosis quística en Costa Rica
según región geográfica
- - I 3849+10 kb C-
! RECIÓN G M ~ X ~ 5 0 8 RII'IH I~ I~ - IG -A G S S ~ D T 6 2 i + i ~ - ~ ~ 1 2 8 2 ~ no determ I I - . .. . ,
,'.. . . , m . , ,+ . . m 1 ' . .-:.:, .
1 I . . o ! O/n % % O/n n- - 0 - , " TC)TAL:.: :,,.:y: O,&
5.3.2 Frecuencia Genotípica De acuerdo al número de mutaciones determinadas en este estudio, podríamos
obtener en forma teórica un total de 45 genotipos diferentes, de los cuales 44 representan
genotipos con al menos una mutación conocida, el genotipo otrolotro no representa
condición homocigota, su significado reside en genotipo no determinado en este estudio.
En nuestra población se encontraron 19 genotipos (Cuadro 26), 13 de ellos (68.4%)
con las dos mutaciones conocidas y cinco con al menos una mutación determinada (26.3%);
en homocigosis únicamente está presente el genotipo G542XlG542X con dos individuos
(3.92%).
Con respecto a las frecuencias genotipicas del gene cftr en la población fibroquistica
costarricense, cinco genotipos son los más frecuentes a saber: AF508/G542X,
AF508lOTR0, G542XlG55 1 D, 62 1 + 1 G-TIR 1 1 7H y OTROIOTRO que cubren
aproximadainente el 5 1 % de individuos analizados.
Las frecuencias geiiotípicas menores al 2% está representada por cinco genotipos, los
cuales en su mayoría están dadas por mutaciones en baja frecuencia alelica; estos genotipos
son conocidos coino AF508/3849+1 OkbC-T, AF5081G55 1 D, G542XlW 1282X,
WI 282X/R117H,3849+1 OkbC-TlG551D.
CUADRO 26. Frecuencias genotípicas del gene cftr en individuos afectados
por fibrosis quística en Costa Rica.
5.3.3 Frecuencia combinación mutación versus haplotipo La frecuencia haplotípica combinada con mutaciones se realizó en 44 pacientes
informativos de nuestro estudio, del cuál podemos deducir que la combinación G542X con
haplotipo A y la mutación AF508 con el haplotipo B presenta la mayor cantidad de
individuos con un 9,09% respectivamente del total de pacientes. Sin embargo existe un
total de cinco individuos con combinaciones haplotipo /mutación con un porcentaje del 1%
(cuadro 27). Las diferencias entre el tipo de mutación y su asociación con un haplotipo
definido son significativos (X2= 4 1,73; p<0.02).
CUADRO 27. Combinación mutación/ haplotipo en pacientes con fibrosis quistica en
Costa Rica.
Aliora bieii, sí aiializainos nuestros resultados de acuerdo al porcentaje que tiene
cada haplotipo con relación a las mutaciones, deteriiiinainos que el Iiaplotipo A eii su
inayoría se eiicueiitra asociado a la niutación G542X, 171 7 - I G - + A , 621 + I G+T, sin
eiiibargo la iii~itacióii AF508 se eiicueiitra en su mayoría asociada al haplotipo B.
Con relación a las mutaciones R117H y 3849+10 kb C+T presentan asociación
mayoritaria con el haplotipo C, en el primer caso en un 50% y en el segundo caso 100%. La
distribución de haplotipos según mutación especifica, se muestra en el Cuadro 28.
CUADRO 28. Combinación Haplotipol mutación según mutación especifica en
pacientes con fibrosis quistica de Costa Rica
! (33.3%) i (33.3%) S (83.3%) 2 (50%) 1(25%) 1(25%) [y --
1 ( l o 2 (20%) , 5 (,50%) 2 (2Ph1, P , ,
.. 2 (100) 5126.3%) ' 4 1 2 1 % j - - 6(31,6%) 4(21%) '
5.4.1. Distribución geográfica.
5.4.1.1 Probandos
Del total de individuos estudiados se determinó que el 68 % de ellos nacieron en en
las provincias de San José y Alajuela y tan solo el 2% nació en la provincia de Guanacaste
(Figura 11). La iiiflueiicia extranjera es representa por una niña que iiació en Nicaragua y
posteriormeiite iiiigró hacia Costa Rica con sus padres cuando tenía 5 años de edad.
Al dividir la Provincia de San José en dos subgrupos importantes a saber San José
consanguíneo y no consanguíneo se determinó que ambos grupos comparten
aproximadamente la mitad de pacientes de la provincia de San José, 9 y 10 individuos
respectivamente.
Individuos 20
16 14
1 o 6 4 2 o
2 2 , s o a> r c o a > u ~ u
c m m Provincia E V)
u
3 3 K
O L 0
Figura 11: Distribución geográfica de pacientes con fibrosis quística en Costa Rica.
La ubicación geográfica de los pacientes según su distribución por cantones,
inuestra en la provincia de San José la mayor concentración de nacimientos de riiíios coi1
fibrosis quística se da principalmente en la región de Desamparados, seguido por el Caiitón
Central de Alajuela.
5.4.1.2. Portadores Obligatorios En la figura 12 se presenta la distribución geográfica de los pacierites y portadores
obligatorios (padres), segúii su lugar de iiaciinieiito. Eii este podeinos observar que del
total de portadores obligatorios provieiieii del estraiijero 7 iiidividuos (6.86%) de los cuales
3 soii iiiiijeres (3.94%) y 4 so11 Iioiiibres (3.93%). coi1 respecto a los padres iiacidos eii
Costa Rica se eiicoiitrí, cl11e las regioiies de San Jos6 (37.35%) y Al:l-jiiela (36.47%) so11 las
que presentan mayor cantidad de portadores en contraposición a la región de Cartago en
donde únicamente se presenta el nacimiento de una madre.
Ahora bien, la mayor cantidad de los portadores obligatorios nacidos en Costa Rica
se presentan en las cuatro provincias centrales (San José, Alajuela, Heredia y Cartago)
(73,68%); sin embargo, al tabular estos datos según el sexo, las mujeres portadoras que
nacieron en las provincias centrales representan el 41.1% del total de individuos, mientras
que en las provincias costeras se observa mayor cantidad de hombres portadores en relación
al número de mujeres ( ~ = 2 , 1 ; p=0,14). En los anexos 3 al I I se muestra la distribución
geográfica de los portadores obligaiorios por distritos según mutación, haplotipos y sexo de
cada uno de ellos.
- 25
20
15
Frecuencia (ind) 1 O
5
0
Provincia
O R E G ~ N PROB m REGION MADRE O REGION PADRE
Figura 12: Distribución geográfica de pacientes y portadores obligatorios, según lugar de nacimiento en faniilias con Fibrosis Quística en Costa Rica
5.4.2. UNIONES Y MIGRACIÓN.
5.4.2.1. Endogamia, exogamia y consanguinidad
En relación con las uniones endogámicas y exogámicas, se desprende del cuadro 29,
que aproximadamente el 65% de las uniones maritales fibroquísticas son endogámicas esto
es debido a uniones de parejas de la misma localidad, de las cuales en su mayoría proceden
de las provincias de San José, Alajuela y Puntarenas representando estas en conjunto el
56.9% de las uniones maritales.
Con relación al grupo de extranjeros, se determinó la presencia de dos uniones
endogámicas, originadas una en la provincia de San Carlos en Nicaragua, y otra en México
D. F.
CUADRO 29: Endogarnia y exogarnia en familias con fibrosis quística en Costa Rica.
AMBOS PADRES-PRO VI EN EN,^^ L"':z 10 19,6 1 DIFERENTES REGIONES ' '
TOTAL 1 Il00,00 .
El estudio genealógico indica la presencia de cuatro familias con un claro componente
consanguíneo. La ecuación de conteo en cadena, establece que dos de ellas son primos
segundos (F=0.0156), una de primos hermanos (F=0.0625) y la última familia presenta una
relación de primos cuartos (F= 0.00098).
5.4.2.2. DISTANCIAS MIGRACIONALES
5.4.2.2.1 Distancia Marital
Con relación a la distancia marital, se observa en la figura 13 que la mayor cantidad
de uniones se da entre individuos cuya distancia es menor a los 100 kilómetros, (39
uniones, 76.5%) y un 45,1% del total de uniones se da a distancias menores de 2
kilómetros. Con un promedio de 61.3 kilómetros y con desviación cstándar de 122
kilóinetros. La mayor migración se da a los 514,9 kilómetros y la menor distancia de 100
metros.
Frecuencia 40 35
30
25
20
15 1 o 5
o OA 100a 200a 300A 400A 500A
99,99 199,99 299,99 399,99 499,99 599,99
Distancia (km)
Figura 13: 1)istribución de las distancias niaritales en faniilias con fibrosis quistica en Costa Rica, 11ictlitl:i cii kil0nietros (knis)
Con respecto al desplazamiento de las mutaciones cftr en nuestra población
observamos, que la distancia entre el lugar de nacimiento de la madre y lugar de nacimiento
del hijo tiene un promedio de 88,44 kms y una desviación estándar de 280,7 kms, con una
distancia máxima de migración de 1900 kms y mínima de cero.
Con relación a la distancia migracional paterna se observa que esta es mucho menor
a la materna, de 62,3 kilómetros +/- 273,12 kms. No observamos diferencias significativas
entre ambas migraciones (Tc = 1.74 p=0,088).
La figura 14 muestra la distribucijn de las distancias migracionales madre-probando
y padre-probando en las familias con fibrosis quística de Costa Rica. En esta se observa que
la mayor cantidad se da entre los O y 100 kms, con 29 y 33 familias respectivamente, en
coiitraposición a las distancias de recorrido superiores a los 100 kilómetros en donde se
observan la presencia 10 y 6 familias.
frecuencia 50
(ind) 40
30
distancia (km)
Figura 14: Distribucion de distancias migracionales en faniilias con fibrosis quística en Costa Rica
La fibrosis quística está clasificada en la literatura científica como la enfermedad
genética autosómica recesiva más frecuente y de mayor gravedad en poblaciones europeas
y sus similares fuera de Europa. Es por ello que la mayoría de los estudios genético
poblacionales se han realizado principalmente en paises de Europa, Canadá, Estados
Unidos y en menor cantidad en medio oriente (WHO, 2004).
Con respecto a América latina, son muy pocas las publicaciones relacioiiadas con la
genética molecular y poblacional de la fibrosis quística; hasta la fecha se han descrito
principalmente publicaciones en México (Orozco et al, 2000) y a nivel suramericano, a
saber Brasil (Raskin et al, 1993), Colombia (Keyeus et al, 2003), Uruguay (Luzardo, G. et
al, 2002), Argentina (Chertkoff et al, 1997).
Costa Rica se ha caracterizado, eri términos genéticos y etnohistóricos, por la
preseiicia de un "p~ol" génico de origen cauc6sic0, amerindio y africano formando así una
poblacióii Iiíbrida multirracial. Esta constitución genética se formó con el aporte de la
población amer i~dia residente en nuestro territorio antes de la conquista. Durante esta y
posterior colonización de nuestro país, las frecuencias alélicas de esta población son
inodificadas por migraciones en su mayoría españolas y negras que originan la mezcla
racial característica de la poblacióri costarricense (Meléiidez, 1982; Morera y Barrantes
1995 y Morera, Barraiites y Maríii, 2003).
Las piiblicacioiies realizadas en riuestro país coi1 relacióii a fibrosis quistica
se restriiigeii íiriicaiiieiite a ciiico articiilos dociiiiieiitados. El primero de ellos por el
servicio de patología del Hospital Nacioiial de Niiios (HNN) eii 1985, donde Vargas y
Snla/ar. realií.nri i i i i estiidio retrospecti\~o de los casos de aiitopsia del HNN. eri i i i i periodo
comprendido de marzo de 1974 a enero de 1980. Ellos determinaron que un 1,56% de los
pacientes presentaban fibrosis quística, con una relación por sexo de 1,l: 1 (hombre: mujer),
la edad al momento de la muerte osciló entre los tres días y los 2 años de edad. Los
hallazgos clínicos de la enfermedad en estos pacientes fue dividida en cuatro grupos a
saber: íleo meconial, diarrea crónica, neumopatía crónica y grupo misceláneo (vómitos,
distensión abdominal, deshidratación entre otros). Los otros estudio fueron: Saborio, 1992,
brinda una estimación de la prevalencia de la enfermedad en nuestro país y dos estudios
realizados por los laboratorios de bioquimica y bacteriología del HNN en 1999. Estos
estudios revisan retrospectivamente la cantidad de cloruros en sudor realizados y los tipos
de colonizaciones bacteriales presentes en pacientes con fibrosis quística (Navarro et al,
1999; )
Y! primer estudio que brinda énfasis en la ider?tificación de inutaciones de la fibrosis
quistica eii Costa Rica, fue Venegas et al, 2003, aunque este iio establece un enfoque
poblacional. Por últiino el estudio de Ivaiikovich et al, 2004, donde hace referencia a las
ventajas y desventajas de la fibrosis quística dentro de un programa de tamizaje neonatal.
6.1 FRECUENCIAS ALÉLICAS, GEN~TIPICAS Y HAPLOTIPICAS DE LOS
POLIMORFISMOS ~ ~ 1 9 Y X V ~ C EN CROMOSOMAS CON M U T A C I ~ N EN
CFTR Y NORMAL.
Coii relacióii a los poliniorfisnios KM19 y XV2c; observainos en la población
costarriceiise que el alelo 1 eii aiiibos poliniorfisiiios soii los niás frecuentes tanto en
croiiiosoiiias cftr. coiiio eii croiiiosonias iioriiiales. coi1 una alta proporcióii de Iieterocigotos
1 /7.
A nivel mundial observamos en alelos mutantes cftr, varias diferencias, por ejemplo
en población mexicana el alelo 1 del polimorfismo XV2c es el más frecuente; en
contraposición el alelo 2 de KM19 es el más frecuente, en Europa el alelo 1 de XV2c es el
más frecuente y el alelo 2 de KM 19.
En el caso de los cromosomas normales a nivel mundial, se observa que el alelo 1
de los polimorfismos KM19 y XV2c presenta mayor frecuencia alélica que el alelo 2
(EWGCFG, 1990; Orozco et al, 2001), tal como sucede en nuestro país.
Éstas diferencias en las frecuencias alélicas de nuestra población con respecto a las
de otras poblaciones están relacionas directamente a la mezcla racial y a la heterogeneidad
genética de cada una de estas. Es claro que las poblaciones latinoamericanas presentan una
mayor heterogeneidad y mayor mezcla racial que las poblaciones caucásicas antecesoras ya
que al considerar la población mexicana se observa que esta presenta u11 mayor componente
de genes amerindios (más del 50%), 40% genes caucásicos y el resto de componente negro
(Lisker et al, 1990); en cambio nuestra población presenta mayor componente europeo
61 %, 30% ainerindio y un 9% negro.
Una de las hipótesis que podría explicar la alta frecuencia de alelo 1 en KM19 en
cromosomas afectados en estas regiones podría ser una tasa de mezcla racial mayor entre
poblacioiies coi1 desceiideiicia europea y negroide, aunada al flujo genético existente entre
regioiies. Esto es fortalecido por lo observado en poblaciones africanas y sus descendientes
que tienen frecuencias más elevadas de alelo 1 en KM19 al contrario de la distribución de
alelos en Europa. (Rodger et al, 1988). Otra Iiipótesis sería una mayor frecuencia de
iiiutacioiies asociadas a Iiaplotipos coi1 el alelo 1 de KM1 9 en nuestra población.
Para una mejor comprensión de las diferencias encontradas de los marcadores
polimórficos, se une la información de los dos locis KM19 y XV2C en haplotipos.
Como se observó en resultados los haplotipos A y C son los más frecuentes en
cromosomas mutantes y normales; sin embargo en los primeros no existen diferencias
significativas con respecto a los otros haplotipos B y D; contrario a lo ocurrido con los
haplotipos en cromosomas normales, donde existen diferencias altamente significativas; al
comparar ambas distribuciones encontramos la existencia de diferencias significativas entre
haplotipos normales y mutados en nuestra población.
Ahora bien, en cromosomas mutantes, Costa Rica presenta una distribución
haplotípica muy uniforme contrario a lo que ocurre en otras regiones mundiales donde se
determina diferencias claras eii las frecuencias haplotípicas mutadas. Ejemplo, son las
frecuencias obtenidas en estudios Españoles y Mexicanos, en estos estudios observamos
que el Iiaplotipo B es t l niás común en ambos países, sin embargo, el segundo haplotipo es
diferente en estas dos poblaciones en Sspaiía es el C y en México el haplotipo A; la
difereiicia entre el haplotipo B y los segundos más frecuentes es de 4 veces
aproxiinadamente.
Es importaiite destacar ahora por qué la comparación con estos países; primero a
nivel iiiuiidial la mayor cantidad de estudios donde se han realizado haplotipos ha sido
Europa y Norteamérica; por el contrario, en América latina únicamente se Iian realizado en
México, Brasil y Cuba. Ahora bieii, se pueden propoiier tres hipótesis con respecto a la alta
frecueiicia de A y C en croniosomas niutados en Costa Rica. La priiiiera de ellas es la
preseiicia de iiiiitacioiies ligadas al Iiaplotipo iio-B que eii conjuiito sobrepasa en frecueiicia
a las iiiiitacioiies ligadas al Iiaplotipo B: coiiio sucede en poblacioiies de origeii caucasico
doiidc se observa qiic iiiiitacioiit.~ coiiio la .Al:508 y G542X soti las 1116s frecueiites eii esas
poblaciones y están relacionadas principalmente al haplotipo B. Con respecto a esto
observamos en nuestros resultados que las mutaciones G542X y AF508 en conjunto
alcanzan un 42% y de ellas solamente el 20% están relacionados al haplotipo B. Ahora
bien, la causa de la preferencia del haplotipo B en cromosomas con mutación CFTR sería
la existencia de selección epistásica que favorece al gene localizado próximo y asociado al
haplotipo B; esta selección sería el resultado de una adaptación a ambientes dominados por
infecciones epidémicas, como por ejemplo el cólera (Meindl et al, 1987; EWGCFG, 1990;
Serre et al, 1988).
Otra hipótesis que explicaría la alta frecuencia de A y C en cromosomas mutados en
CFTR sería la posibilidad de recombinación entre los marcadores y el gene CFTR, como se
observó en nuestros resultados el equilibrio de ligamiento presenta menor fuerza en
comparación a las presentadas en poblaciones caucásicas, contribuyendo a la posibilidad de
recombinación.
6,2 Mutaciones en CFTR
6,2,1 Mutación G542X
Los resultados del análisis de 102 cromosomas de afectados en Costa Rica,
demostraron que la mutación más frecuente es la G542X, con una frecuencia de 24,5% de
los crornosomas analizados. Sí comparamos estos resultado con los datos publicados por la
CFGAC, nuestra frecueiicia es la niás alta reportada a nivel mundial (WHO, 2004) y es
semejante a la reportada en el estudio anterior de nuestro país por Venegas et al, 2003,
doiide estableció la frecuencia en uii 25%.
La mutación G542X está presente en la gran mayoría de poblaciones y es también
considerada como una mutación antigua, como AF508, siendo además la segunda más
frecuente en europeos (Estivill, Bancels, Ramos, 1997).
Diversos estudios sugieren que esta mutación surgió del mismo haplotipo ancestral
de AF508 y N1303K aproximadamente 1350 generaciones o el equivalente a 34.000 años,
durante o después del período neolítico, antes del último período glacial (Casals et al 1993;
Morral et al 1993, 1994, 1996). La frecuencia relativamente alta de esta mutación en el
Norte de África y en el Sur de España lleva a suponer que la mutación se introduce por la
península Ibérica a partir de una población semítica de la cual fenicios y judíos son
descendientes. (Casals et al 1992, Estivill, Bancells, Ramos, 1997). Su alta frecuencia en
poblaciones mediterráneas y sureropeas podría explicar en parte su presencia en nuestra
poblacióii.
La hipótesis ariterior se sustenta en la historia étnica de la población costarriceiise.
Desde este punto de vista las poblaciones amerindias al menos por línea paterna fueron
reducidas y desplazadas durante la conquista y colonia por emigrantes procedentes de
Espalia y la peníiisula Ibérica (Bolalios, 198 1).
Estos ernigraiites procedíari principalmente de Andalucía, Extreniadura, Castilla La
Vieja, Castilla La Nueva, Navarra, De Vascongadas, Galicia, Valeiicia y Leóii. además de
1.111 9.52% que procedían de Portugal, Italia y Francia (Meléiidez, 1982). En la obra de
genealogías de Cartago de Monseñor Sanabria, citado por Meléndez, Iiace referencia que
Iiasta 1850 la cantidad de españoles que Iiabiaii ingresado a Costa Rica eran 443 persoiias
que adeiiiás de las aiiteriores comuriidades procedíaii de Aragóii. Murcia. Astiirias
Caiiarias.
Con relación a la ubicación geográfica de la mutación G542X en España, las
comunidades autónomas con mayor frecuencia son Andalucía (3 1,5%), Canarias (1 3%),
Murcia (1 l , l%) y Castilla-León, Cataluña y Valencia 7,4% cada una; si se divide a España
en provincias se encuentra que las provincias costeras al mar mediterráneo pertenecientes a
Andalucía, Murcia, Valencia y Cataluña presenta un 14,4%, 2,5 veces mayor que el resto
del País.
Si se comparan estos datos con el origen de los conquistadores que llegaron a Costa
Rica se encuentra que las nueve regiones definidas por Meléndez presentan una frecuencia
para G542X de 64,8% (35 de 54 alelos) (Adaptado Casals et al, 1993) y sólo las
comunidades costeras al mediterráneo que dieron colonizadores a Costa Rica representan
una frecuencia de 38,8% (21 de 54 alelos). A pesar que esta hipótesis explicaría un origen
de la mutación en el Sur de España y que luego fue trasladada a Costa Rica es la más
fuerte; únicamente explica parte de la introducción de G542X a nuestro país ya que la
coinbinación mutación-liaplotipo (Cuadro 28) nos indica varias posibilidades de ingreso de
esta inutación a Costa Rica, tal como se explicará a continuación.
G542X y sus haplotipos
En nuestro estudio fue posible detectar que la mutación G542X al igual que la
RI 17H presenta los cuatro haplotipos posibles obtenidos a partir de la combinación de los
poliinorfisinos dialélicos KM 19 y XV2C.
Con relación al haplotipo B (27,3% 6 de 22 cromosomas) presenta concordancia
coi1 estudios de otras poblaciones especialmente las europeas que demostrar011 que G542X
surgió de uii iiiisiiio Iiaplotipo aiicestral que AF508 y N1303K y esplica al iiieiios
parcialiiieiitc por qué el liaplotipo B es el segundo niás frecuente.
Sí consideramos al haplotipo B, como un haplotipo ancestral tal como lo establece
Estivill et al, 1997, entonces esperaríamos que este se encuentre en mayor proporción que
los demás e incluso que las frecuencias de A, C, D sean mucho más bajas y poco
frecuentes; sin embargo, sus proporciones en Costa Rica son altas, ejemplo es el haplotipo
A que es encontrado en una proporción de 1 en cada 2.75 alelos G542X.
Al comparar nuestros resultados con otros estudios en Latinoamérica encontramos,
para el caso de México una mayor proporción de alelos G542X con haplotipo B (72,72%),
9,09% con la mutación y haplotipo A y un 18,18% con haplotipo D.
Los resultados anteriores establecen heterogeneidad haplotípica de G542X y
podrían tener varias explicaciones posibles y así conocer la verdadera presencia de G542X
en nuestra población:
l . Recombinación de un cromosoma G542X original, esta hipótesis se basa
en el hecho que u11 cromosoma G542X original con haplotipo B, recombinara durante la
profase de la ineiosis 1, con un alelo CFTR normal especialmente A o C y originara un
alelo G542X nuevo recombinante. Esta opción es posible de ocurrir ya que primero los
haplotipos A y C son más frecuentes en nuestra población y que el desequilibrio entre
KM1 9 y el locus CFTR (región 1) es muy bajo en relación a otras poblaciones, permitiendo
así una recombinación entre el alelo G542X con Iiaplotipo B y el alelo normal (EWGCFG,
1990).
2. Otra posible explicación de la presencia de G542X con otro Iiaplotipo no
B es la mezcla racial reciente de nuestra poblacióii coi1 otras, ya sea esta con hispáiiica u
otras europeas que prrsriite uiia distribución Iiaplotípica diferente o la i~itroduccioii de este
Iiaplotipo drsdc tieriipos coloriiales.
3. La presencia de esta mutación con haplotipos no B en poblaciones
amerindias y que hallan originado una evolución convergente. Este hecho es soportado por
la presencia de G542X en poblaciones amerindias del suroeste de Estados Unidos (Grebe et
al, 1992).
Distribución geográfica
Con relación a la mutación G542X, o b s e ~ a m o s que esta se distribuye actualmente en la
zona de Alajuela y San José, Sin embargo los orígenes de esta mutación, está claramente
distribuida en el gran Área Metropolitana en especial en la región occidental y la región del
Pacífico Norte; esta distribución se coinpleta con una portadora eii el Pacífico Central y
otro en el Atlántico (Limón).
A partir de la alta frecuencia, podemos establecer dos grandes grupos, el primero de
ellos en la región del Pacífico Norte. En iiuestro estudio, Guanacaste se caracteriza por
presentar esta mutacióii en su mayoría jutito al haplotipo B.
El otro grupo lo podemos establecer en la región central de Costa Rica,
especialineiite en la zona Alajuela y sur oeste de San José.
Lo anterior podría tener explicaciones en cuanto a mezcla racial, etnohistoria y
geográficas propias. Priniero, consideramos los datos de mezcla racial tanto en la región
cliorotega, coino eii la regióii central. en estas encontramos que los porcentajes de geiies
europeos soii del 51% y 65% (Morera, Barrantes, Marín, 2003), esto permitiría uiia
iiiflueiicia iniportaiite de geiies europeos y posibleniente uiia alta proporcióii de G542X,
periiiitieiido así uii efecto fundador propio en cada uiia de la zoiia.
Coii rclacióii a lo anterior, Iiistóricaiiiente. la regióii de Guaiiacaste tuvo uii fuerte
contacto iiiicial coi1 iiiigracioiies espaliolas: ejeiiiplo de ello fiicroti las pritiieras
espcdicioiic.~ qiie sc dieroii eii 13 19 ciiriiido las esciiisioiies de Jiinii dc. Castaiieda J Ilciiiriii
Ponce de León descubren los Golfo Nicoya y Dulce, sin embargo fueron las expediciones
de la segunda fase entre 1560-1 575, donde se da la penetración a nuestro territorio desde
Nicaragua y se dan fundaciones poblacionales mejor planificadas y ubicadas. Dos
expediciones importantes se realizan por la región de Guanacaste, la primera de Juan de
Cavallón en 1561, donde pasan por Guanacaste y entra a Orotina para luego fundar
Garcimuñoz, cerca de la actual Santa Ana; la otra expedición importante fue en 1563 con
Juan Vásquez de Coronado quien penetra por Nicoya y llega a Garcimuñoz, realizando
recorridos hacia Quepos.
Estos recorridos pudieron significar un flujo génico, produciendo mestizaje en
nuestra población y así introducir la mutación G542X en nuestra población. Ahora bien, sí
consideramos únicamente los portadores de Guanacaste, observamos la asociación de los
alelos G542X con el haplotipo B, igual al observado en poblaciones europeas. Sin embargo
se podría establecer otros hechos importantes para explicar este último punto: la regióii
cliorotega ha sido por mucho tiempo uiia importante región turística con un fuerte atractivo
para los europeos que consiguieron asentarse en esta región.
Por otra parte, la mutación Gj42X haplotipo A, observada mayoritariamente en la
región de Alajuela, establece un importante efecto fundador en esta zona, con excepción de
la presencia de un caso con haplotipo C. Este individuo es producto de una recombinación
geiiética reciente entre el haplotipo A y C. El estudio de marcadores intragénicos. la
esterisión de los marcadores extragénicos y de isonimía establecerían a futuro una niayor
coiiipreiisióii de los orígenes de esta mutación.
6.2.2 Mutación AF508
La segunda mutación de fq más frecuente es la AF508 con un 16.7% en los
cromosomas analizados. Según las últimas publicaciones sobre la epidemiología genética
de FQ a nivel mundial (Bobadilla et al, 2002 y WHO, 2004) nuestra población presenta una
de las frecuencias más bajas a nivel mundial, si tomamos en consideración el componente
caucásico de las mismas, Únicamente es superada por Turquía, especialmente su región
central y el este de Ankara (1 5.4%).
Las frecuencias descritas de la mutación AF508 en poblaciones latinoamericanas
fueron 60.9%, 66% y 56.49% en Argentina (Luna et al, 1996, Saleh et al, 1996, Chertkoff
et al, 1997); 39%, 45%, 34.4%, 40.72% y 47.8% en Mkico (Orozco, 1993b; Villalobos-
Torres et al, 1997; Flores-Martinez et al, 1998; Orozco et al, 2000; Restrepo et al, 2000);
29.2% en Chile (Ríos et al, 1994); 34% en Cuba (collazo et al, 1995); 25% en Ecuador (Paz
y Mino et al, 1999); 40.4% en Uruguay (Luzardo et al, 2002). 29.6% en Venezuela
(Restrepo et al, 2000) y 48% y 35.4 % en Colombia (Keyeux et al, 2003; Restrepo et al,
2000).
Coino se observa estas frecueiicias son en geiieral menores al 50% y que podrían
explicarse por la inmigración de poblaciones del sur de Europa, donde las frecuencias de
AF508 soti próxitiias al 50% y están probablemente asociadas coi1 el flujo de genes entre
europeos con negros y ainerindios, con iiicidencias de FQ y de AF508 posiblemente bajas.
Si comparamos las frecuencias de la inutación AF508 encontradas en este estudio
con las frecueiicias presentadas por Venegas et al, 2003, doiide la frecuencia es de un 23%
(1 1/48), es posible atribuir esta diferencia a las variaciones eii el tamaño de la iiiuestra
iitilijrada por Veiiegas. >.a qiie las frecueiicias piiedeii variar coiisiderableriieiite cuando se
tic'iicii ~ i í i ~ i i c ' ~ . ~ dc iiiiicstras relati\.aiiieiite peqiicñas. A pesar qiie esta íiltiiiia hipótesis
podría justificar la gran diferencia en frecuencia con relación a esta mutación, no se
descarta la posibilidad de diferencias en la composición étnica de la población y de los
diferentes flujos genéticos que pudieron ocurrir en los últimos 10 años.
Otra posible explicación en la diferencia porcentual observada en esta mutación y
las siguientes por discutir, es la concentración de cloruro en sudor en la muestra de
pacientes de Venegas y de este estudio, según comunicación personal con Venegas, 2005,
los pacientes utilizados en su estudio presentaban como mínimo cloruros de 75 mEq/l, en
cambio el límite de inclusión a nuestro estudio fue 60 mEq/l, tal como se establece
iiiternacionalmente, lo que permite identificar otras mutaciones.
AF508 y sus haplotipos
En nuestro estudio fue posible detectar que existe una clara relación entre el
Iiaplotipo E3 y cromosoinas con la mutacióii AF508 (cuadro 27 y 28). En estos se observan
que el 57.1% de los alelos AF508 poseen el haplotipo B y uii 38.1% del total de alelos con
Iiaplotipo B.
Estos resultados sugieren que la inayor parte de nuestros pacientes con mutación
AF508, tienen un origen único en el haplotipo B del cuál se originaron otras mutaciones
(EWGCFG, 1990). Una posible explicación de este resultado, se relaciona con el posible
efecto fundador europeo en iiuestra poblacióii; sin embargo, a pesar que las migraciones sur
europeas Iiaii sido abuiidaiites y coiitiiiuas por iiiás de ciiico siglos, especialmeiite al final
del siglo XV e inicios XVI, cabe seííalar que otras poblaciones conio las noreuropeas y
ceiitroeuropeas Iiaii originado un flujo géiiico hacia nuestro coiitiiieiite especialiiieiite a
iiiicios del siglo pasado.
Lo anterior explica que Costa Rica, y en general América Latina, está constituida
por poblaciones de mayor heterogeneidad alélica que poblaciones antecesoras. Un ejemplo
es la mutación AF508 y sus haplotipos; en nuestra muestra el 42.8% de cromosomas que
contienen esta mutación se encuentran asociadas a los haplotipos A y C. Esta frecuencia es
mucho mayor a la descrita en otras poblaciones europeas tal como sucede el caso de
Inglaterra 4.1%, Escocia 7.7%, Francia 8.6%, España 15.1% y un 12.1% en Italia
(EWGCFG, 1990).
Ahora bien, con relación a poblaciones latinoamericanas se ha informado en
México únicamente la presencia del haplotipo D (2.8%) (Orozco et al, 2001) y en Brasil un
9.5% de los cromosomas que contienen la mutación AF508 están asociados a los haplotipos
A, C y D (Raskin, coinunicación persona). Tales diferencias en relación con estas
poblaciones podrían explicarse a partir de que los haplotipos A, C y D fueron derivados de
inutación AF508 haplotipo B, por un simple evento de recombinación de Iieterocigotos,
mutación de punto o conversión génica. Un evento de recombinación simple pareciera ser
la explicación más aceptada, ya que la región alrededor de XV2c fue descrita corno un
punto caliente ("Hot spot") de recoinbinación y porque apenas 200kb separan los locus de
KM 19 y XV2c del locus CFTR (Kerem B.S. et al, 1989; Dork et al, 1992).
Esta asociación de la mutacióii AF508 con liaplotipos no-B puede explicarse por lo
iiieiios a partir de dos hipótesis iniportaiites:
A. Los países de origeii de los ininigrantes europeos que vinieroii a Costa
Rica preseiitaii riia>.or Iieterogeiieidad (deiiiostrado por el iiierior grado de
desequilibrio de ligariiieiito, ericoritrado en cr con iiiutacióri cftr ).
B. Migracioiies iiiteriias eii Costa Rica. periiiitierori uri flujo de geries critre
regioiies coi1 difereiitcs coiiipoiieiites europeos. afrocaribeiios r iiidígeiias.
Distribución Geográfica:
La mutación AF508 presentó una distribución original del Pacífico Sur hacia la
región Central del País y de esta región hacia el este, pasando por la Suiza de Turrialba y
Limón. Sí comparamos esta distribución con los datos de mestizaje en Costa Rica de
Morera y Barrantes de 1995 y 2003; observamos, que la frecuencia de genes europeos en la
región central es del 65%, una de las más altas de nuestro país y la región del pacífico
central a pesar que presenta una frecuencia baja de genes europeas, fue importante por las
encomiendas que se dieron durante la colonia; además de ello la región del pacífico central
ha tenido por mucho tiempo los principales puertos marítimos en Costa Rica.
La distribución observada presenta coincidencias importantes con las expediciones
reportadas de Juan de Caballón y Juan Vázquez de Coronado, además que han constituido
asentainientos humanos importantes en la región del pacífico. Sí bien, la presencia de
colonizadores o fundadores fue importante en la resiones del pacífico central y el Área
inetropolitana, no debemos olvidarnos de las interacciones existentes entre ciertas regiones
debido a su condición de zonas agrícolas que producen un efecto migratorio importante de
individuos entre estas zonas y una mayor comunicación comercial entre los diversos sitios;
a partir de ello observamos que actualmente existe muy buena comunicación entre los
cantones del pacifico central y los cantones del sur oeste de San José como lo son Puriscal,
Turrúbares, Mora, Acosta y estos a su vez con la región del área inetropolitana, además son
regiones de muy alta expulsión poblacional (Centro Centroamericano de Poblaciones,
3005), que posibleiiieiite Iian periiiitido una dispersión genica iinportaiite.
['ara tiiializar Iiay dos piiiitos importantes a destacar en la distribucióii geográfica:
iiiio se reticre a la región de Grecia (Tapezco) que presentan uii iiiisiiio haplotipo, dado
cliii/hs por i i i i iiiisiiio cfCcto fiiiidndor y segiiido. la región de Liiiióii y Puerto Jiiii2iiez. Iia
pesar que las regiones donde se ubican estos distritos presentan una baja frecuencia de
genes europeos, podríamos hipotetizar que son introducciones a partir de migraciones hacia
estos sitios de personas portadoras.
6.2.3 OTRAS MUTACIONES DETECTADAS Desde la clonación del gene cftr en 1989, más de 1200 mutaciones se han
identificado y la mayoría de ellas están involucradas como causantes de fq (CFGAC). Así
como la mutación AF508 que corresponde al 66% de todos los alelos examinados
inundialinente, su frecuencia varía entre diferentes poblaciones, las frecuencias de
mutaciones individuales también varían entre diferentes poblaciones, regiones geográficas
y grupos continentales (CFGAC, Estivill, Bancels, Ramos, 1997).
En nuestro estudio de las 12 mutaciones por detectarse, ocho se determinaron en
nuestra población, de las cuales Ri l7H, 171 7-1 G-A, G55 1 D, 3849+10 kb C-T, 621 +1G-T
y W 1282X, se encuentran en frecuencias inferiores al 10%.
6.2.3.1 MUTACIÓN R117H
En iiuestro estudio se deteriiiiiió que 1 1 alelos cftr (10.8%) correspondían a esta
mutación. A nivel mundial la R1 17H ocupa la sétima posición entre las mutaciones más
frecuentes en un 0.66% de 1 1 378 croiiiosomas estudiados.
En Europa esta mutación se encuentra en mayor frecuencia al noroeste de Europa
especialniente en Irlaiida, Escocia, Gales e Inglaterra; probablemente esta iiiutación surgió
después de la G551 D y posibleiiieiite de la región de Escocia o Irlanda de origen Celta
(1,ucottt.. 1 lazoiit 1995).
Esta mutación no se encuentra entre las 22 mutaciones más frecuentes en europa
(Estivill, Bancells; Ramos, 1997). Se detectó en el 1.75% de afectados en Inglaterra
(CFGCAC) y no se encuentra presente en Portugueses; Italianos; presentándose en un
0,22% en españoles y 0,10% en alemanes.
En América Latina no ha sido detectada en Colombia y Venezuela (Restrepo et al,
2000), ni en Brasil (Bernardino et al, 2000), ni Costa Rica (Venegas et al 2003). Sin
embargo, Orozco et al, 2001 detectó un solo alelo con esta mutación en su estudio con
pacientes mexicanos.
R117H y sus haplotipos.
Sí consideramos los haplotipos de esta mutación, encontramos que existe una
aiiiplia heterogeneidad Iiaplotípica en nuestra muestra, esto confirma su asociación a nivel
iiiuiidial de diferentes haplótipos y que posiblemente su origeii fue por recurrencia (Morral
et al, 1996).
De acuerdo a estos datos Costa Rica ~resenta la frecuencia más alta de R1 17H en
Aiiiérica Latiria, y se coiitrapone a lo establecido en el artículo de Venegas et al, 2003 y
otros autores al respecto, esto podría darse por varias razones que se detallarán en las
siguieiites Iiipótesis:
A. Eiitrada reciente de la mutación a nuestro país. La grari heterogeneidad
Iiaplotípica presentada por la mutacióri se debe en parte a entradas
recieiites de portadores RI 17H en los últinios 10 años; esto se ratifica
coi1 la presencia de dos individuos que iiigresaroii a iiurstro país uiio de
Clioiitales. Nicaragua y otro de Guaiiajuato, México.
B. Aumento del tamaño de muestra. Como se ha explicado anteriormente al
aumentar el tamaño de muestra en nuestro estudio, esto da origen a que
mutaciones menos frecuentes puedan representarse en el estudio.
C. Migración interna en Costa Rica originó que alelos como R117H se
presentaran en pacientes y se expresarán en conjunto con mutaciones
fuertes.
D. Con los datos disponibles en nuestro estudio no podríamos establecer
con certeza el origen de los otros R117H, sin embargo podríamos
establecer que estos se podrían originar a partir portadores provenientes
del norte de Europa.
Distribución geográfica
Anteriormente se explicó que muchos alelos Rl 17H, entraron a nuestro país
recieiiteineiite, siii cmbargo, en la distribución de portadores recalcamos un Iiecho
iinportante, los portadores obligatorios se encuent:an distribuidos uniformeiiiente en
Paliiiares, Atenas, Saii Pedro de Poás, Barva y San José de la Moiitafia y Desamparados-
Aserrí, estos dos últimos comparten un mismo haplotipo, quizás el producto de un inisino
efecto iiiigratorio o su origeii familiar que es el mismo.
6.2.3.2 MUTACIÓN 171 7-1 G+A La inutacióii 1 7 1 7- 1 G+A preseiita iiiia frecueiicia de 6.86% representado por 7
iiidividiios y ocupa el cuarto lugar entre las niás frecuentes de nuestro estudio.
Esta ti-ecueiicia es iiiiiclio iiiayor a la reportada en proinedio a nivel iiiuiidial (0.6%) y es
rara o niiseiite eii las rrgioiies central y siir de Europa (< 2%) (Lucotte. Hazout, 1995;
I<ciidiiie et al. 1997).
La mutación 171 7-1 G+A es muy frecuente en la región noroeste de Italia,
principalmente en Milan y Lobardia (Padoan et al, 1996; Rendine et al, 1997).
Es debido a su alta frecuencia en la población Italiana que varios estudios suponen que la
presencia de esta mutación en América Latina es debido a la inmigración a nuestras tierras
de italianos. Sin embargo nuestros análisis genealógicos y demográficos recientes no
explican directamente la introducción de esta mutación a Costa Rica a partir de
colonizadores o pobladores Italianos. Esto se ve fortalecido con los haplotipos relacionados
a esta mutación en nuestra población que son muy diferentes a los encontrados en Italia.
1 71 7-1 C-+A y sus /raplotipos. En nuestró estudio se determinó que esta mutación se encuentra en un 83.3%
relacionado con el haplotipo A y únicamente un alelo se encuentra con el Iiaplotipo D.
Estos datos ganan importancia sí consideramos que esta mutación es la scguiida iiiás
frecuente con presencia de haplotipo A, después de la G542X.
Los datos anteriores nos demuestran una homogeneidad bastante alta con relación al
haplotipo A y la mutación 17 17-1 G+A en nuestro país, sin embargo estos no coiicuerdan
con los datos obtenidos por Castaldo et al, 1996, donde establece para la población italiana
una homogeneidad alta con relación a esta mutación y el haplotipo B (1.2) para los
niarcadores KM19 y XV2c respectivamente, el cual no se ha determinado en la población
costarricense.
Una posible esplicación sobre el origen de esta mutación sería la esistencia de un
efecto fiiiidador iiiiportante qiie luego se dispersara hacia diferentes regiones del país. sin
eiiibai-go esto deberá ser fortalecido eii estudios poblacionales posteriores eii iiiiestro país
6.2.3.3 MUTACION C551D El cuadro 24 de resultados muestra que la quinta mutación más común en Costa
Rica es la G55 ID con un 6.9%. A nivel mundial esta mutación es la tercera más común en
todo el mundo (1.6%) y cuarta en Europa (1 S % ) (Estivill, Bancels, Ramos, 1997) y ocurre
con mayor frecuencia al noreste y centro de Europa donde las poblaciones han presentado
un pasado y una fuerte ascendencia celta; como por ejemplo los austriacos, checos y en
poblaciones de Inglaterra, Escocia e Irlanda del Norte con ascendencia probablemente Celta
(6.9%) (Hamosh, 1992; Estivill, Bancels, Ramos, 1997). En el mediterráneo donde los
Celtas fueron comparativainente meiior; la frecuencia de esta mutación es baja (Nunes et al,
1991"; Estivill, Baiicels, Ramos, 1997; Who, 2004) como sucede en España (0.3%) e Italia
(0.8%).
De acuerdo a los datos anteriores, la frecuencia alta presente en nuestro país podría
deberse en parte a la heterogeneidad de migraciones que Iian llegado a nuestro pais
principalmente del norte y centro de europa a finales del siglo XIX e inicios del XX. Sin
olvidarnos de las migraciones posteriores españolas en los últiinos dos siglos. Estas
hipótesis son fortalecidas por iiiinigraciones de ascendencia del norte de Espalla y Francia
que ingresaron aprosiinadamente hace más de 100 años.
G551D y sus haplotipos
Se deterinirió eii nuestro estudio que la mutacióii G555 1 D está relacioriada con tres
Iiaplotipos diferentes a saber A, C J. D.
Esisteri dos posibilidades coricretas para explicar la presericia de estos Iiaplotipos
coriibiriados eri iiirestro país. La pririiera es el iiigreso a riuestro país de la iiiutacióii cori
varios Iinploiipos asociados. i n l coriio se Iia csplicado ariterioriiicriie coi1 el caso de otras
mutaciones y que se hayan asentado en diversas regiones del país como es el caso de
portadores procedentes de Acosta y San Gabriel de Aserrí y los determinados en la región
central de San José.
La segunda posibilidad es la introducción de G551D con un haplotipo asociado y
posteriormente se diera la recombinación genética con otros haplotipos ligados a genes cftr
normales.
Esta última hipótesis podría investigarse más detallsdamente, ya que se ha
demostrado en estudios de Casals et al, 1993, Cashman et al, 1995 en sus estudios que esta
mutación se encontraba asociada al haplotipo B de KM 191XV2c y a un mismo haplotipo
intragénico, sugiriendo que todos los cromosomas G55 1 D son idénticos por ascendencia y
no resulta de mutaciones recurrentes.
Lo anterior podríamos de~iiostrarlo con un estudio de poliinorfismos inás extenso en
nuestra muestra en donde incluyainos estos marcadores intragériicos y determinar la
presencia o no de recombinación génica y mutación recurrente.
6.2.3.4 MUTACIÓN W1282X En este estudio encontramos que W 1282X es la sexta mutación más frecuente junto
con la mutación 621 +1 G-T (3.9%). A nivel mundial se ha observado que esta mutación es
más frecuente en poblaciones de ascendencia judía especialmente Aslikenazi donde
W1282X presenta una frecuencia de 47.9%, en no Aslikenazi (6.7%) y en judio arabe
(10.6%). (WHO, 2004) y común en la mayoría de países mediterráneos. (Estivill. Baricels.
Raiiios. I997), doiide su frecuencia no supera el 5%. A nivel de europa es la quinta
iiiutacióii iiiás coiiiúii con frecueiicia 1 % (Estivill, Baiicell. Raiiios. 1997).
En Latinoamérica esta mutación se ha determinado en Argentina (3.1%), Chertkoff
et al, 1997 y 2.1% en Colombia (Restrepo et al, 2000). En nuestro estudio de los cuatro
alelos determinados ninguno tiene ascendencia judía por tanto no podríamos atribuir la
presencia de esta mutación en población costarricense como consecuencia de inmigraciones
judías a nuestro país.
El origen de esta mutación en nuestro país podría explicarse por dos medios, el
primero por la influencia de inmigrantes italianos, esto es corroborado por la presencia de
una familia de ascendencia directa italiana portadora de esta mutación y haplotipo A y el
otro posible origen explicaría la presencia de W1282X en nuestra población son los dos
afectados con haplotipo D. Es importante rescatar que la zona de Andalucía en España
presenta una frecuencia de 1.1%, que podría originar migración hacia nuestro país con
representantes de esta mutación.
W1282X y sus haplotipos
De los cuatro alelos W1282X determinados 1 individuo prcsentaba el haplotipo A
de origen italiaiio como se comentó anteriormente, 2 niños presentaban el haplotipo D y
uno que no logró determinarse.
Esta mutacióii se encuentra asociada al haplotipo B de KM 19 y XV2c (Morral et al,
1993) y está asociada a u11 haplotipo intragénico diferente al detectado en asociación a las
in~itacioiies AF508, G542X, N1303K eiitre otras y que se verifica al analizar la repetición
GATT del iiitróii 6 A, indicando que esta niutación no tiene un inismo origen que las otras
iiiiitacioiies.
Posiblriiieiitr la difereiic ias eii el Iiaplotipo estragéiiico eiitre iiiiestros afectados y
los ciiropcos sc deba a la rccoiiibiiiacióii géiiica coi1 Iiaplotipos A y D iiorniales o quizás
i i i i i i posibilidad qiie dcheria rcnlirnrsc es In aiiipliaci6ii de nii6lisis coi1 repeticicíii GATf del
intrón 6 A, para confirmar o descartar un mismo origen con la mutación W1282X europea
y10 la recombinación de los haplotipos extragénicos.
Con respecto a la distribución geográfica, como lo hemos establecido podría haber
ocurrido por varios efectos fundadores y no tengan relación alguna y que podrían
comportarse a futuro como efecto fundadores locales.
6.2.3.5 MUTACIÓN 621 + 1 G-T Ida sétima mutación en nuestro estudio es la mutación 62 1 + 1 G-T. Esta se encontró
eii cuatro individuos de los cuales todos tenían el mismo genotipo 62 1 + I G-T 1 R117H.
Esta mutacióii es la octava mutación más común en Europa con una frecuencia de
(0.5%) con frecuencias elevadas en Grecia Central (7.8%), también ha sido localizada en
Italia en uiia frecuencia (1.8%); en especial en la región de.Veneto (6.3%) donde es la
tercera inás frecuente; en España, Portugal y Alemania presenta frecuencias muy bajas; la
distribucióii geográfica mundial indica que el principal foco de incidencia de 62 1 + 1 G-T
está probablemente localizada en Gales (Lucotte, Hazout et al, 1995).
Eii Latiiioamérica Únicaineiite Brasil se ha reportado la presencia de esta mutación,
pero Únicaniente en uii alelo y fue reportado por Bernardino, 2000 y un alelo que represecta
el 0.3% por Raskin et al, 2003.
621 + 1 G-T y sus haplotipos
Los cuatro alelos 621 + I G-T localizados en nuestro estudio se relacioiiaii con tres
Iiaplotipos. De los tres Iiaplotipos únicamente el haplotipo A se encuentra en 2 alelos; que
es el Iiaplotipo asociado al alelo eiicontrado en Brasil (Raskin et al, 2003). Zielenski et al,
1991 b deiiiostró qiie todos los afectados coi1 esta niutacióii tenían el liaplotipo B y siigirió
tiii origeii único. De Vries et al. 1996 deiiiostr6 qiie afectados Canadieiises y fraiiceses
afectados con esta mutación tienen el mismo haplotipo que se extiende por 14 CM. Este
haplotipo únicamente se presenta en una paciente costarricense, cuya mutación fue
introducida a nuestro país recientemente de la región de Guanajuato en México.
Con relación al haplótipo D, desconocemos hasta la actualidad presencia de esta
combinación a nivel mundial, sin embargo podría considerarse su presencia como efecto de
la recombinación de la mutación con un cromosoma cftr normal con haplotipo D. Debido a
la poca presencia de individuos con 621 + 1 G-T no podemos establecer una ascendencia
concreta de mutación en Costa Rica.
6.2.3.6 MUTACIÓN 3849+10 kb C-T La octava mutación detectada en nuestra población fue la 3849+10 kb C-T. De los 2
afectados determinados en Costa Rica, uno tiene ascendencia nicaragüense y el otro nació
en San Isidro de Pérez Zeledón.
Esta mutación tiene una frecueixia media de 0.15% eii población europea, donde
ocupa el décimo noveno lugar (Estivill, Bancels, ramos, 1997). Esta mutación se detectó
por priinera vez eii poblacióri judía asquenazí, donde presentan una frecuencia de 4.6%.
En afectados norteamericanos con origen hispánico fue hallado en un 2% (Grebe et
al, 1994); además se determinó en 3 cromosomas indígenas Pueblos donde se asoció a
Iiaplotipos diferentes a los encontrados entre europeos con la misma mutación (Mercier et
al, 1994).
Eii poblaciones latirioaniericanas, la 3849+10kb C-T fue encontrada eii afectados
niesicaiios (11194 croinosoinas analizados) (Orozco, 2000), Restrepo et al. 2000 que lo
detectó eii i i i i 2.2% eii su estudio de tres poblacioiies latiiioaiiiericaiias y eii Argeiitiiin
Cliertlioff' et al. 1999. detectó en 0.91%; coi1 cscepcióii de estos estiidios. iio Iia sido
detectada en otros estudios realizados en América Latina, Incluyendo Costa Rica (Venegas
et al, 2003)
Para Bobadilla et al, 2002 en su estudio de tamizaje neonatal en Estados Unidos de
América, estableció que por su frecuencia detectada entre varias poblaciones latinas, esta
mutación podría considerarse como la contribución latinoamericana al mundo de una
mutación cftr.
Con respecto a esto último existen dos puntos a discutir, del por qué no han sido
detectados a pesar de ser considerada como mutación latinoamericana.
El primero, es que muchos investigadores han realizado la determinación de
mutaciones en e-xones específicos del CFTR, donde el diseño del oligonúcleotido ha sido a
partir de la región de empalme Exón-lntrón y esto origina la no deteccióii de mutaciones
que se encuentran en intrones lejos de estas regiones.
La segunda razón es la utilización de muestras pequeñas en una población que no
periiiite conocer la situación del espectro de mutaciones presentes eii la población.
3849+10 kh C-tT y sus haplotipos
Se ha observado que esta mutación presenta asociación fuerte con el haplotipo C,
siiiiilar al Iiaplotipo determinado en el estudio de Orozco et al, 2000 en población
inesicaiia. La presencia de esta mutación en varías poblaciones europeas y de Norteamérica
Iiaii originado la Iiipótesis que esta mutación es de origeii Asquenazí, sin embargo, la
preseiicia de esta riiutacióii cori Iiaplotipo C en poblaciones latirioarnericanas
probableniente no se deba a i i i i origen judío Asqueiiazí por varios puntos:
A. La población judía en Costa Rica presenta sus orígenes principalmente en Polonia
(Lukow, Varsovia, Wiskow, Zellochow y Shetletz) (Kaufmann y Barrantes, 1982),
sin embargo los datos genealógicos de las dos familias no establece ascendencia
familiar concreta hacia una ascendencia judía.
B. Se han dado varias hipótesis con respecto al haplotipo de esta mutación y se ha
determinado que posiblemente presente una evolución convergente, confirmado por
la presencia de individuos portadores de esta mutación en el grupo indígena pueblo.
C. Debido a la presencia de la mutación con haplotipo diferente a los judíos, muchos
han considerado como mutación latinoamericana (Bobadilla, 2003).
6.2.4 GENOTIPOS. Eii nuestro estudio se determinó que el genotipo más común era el AF508/G542X,
siii embargo se encontró que la proporción de heterocigotos coinpuestos es de un 88.24% y
de honiocigotos 3.92%. Ahora bien, sí comparamos estos resultados con los obtenidos en el
apartado de cruces, observainos que estos datos eran los esperados. porque la
consanguiiiidad de las familias estudiadas es muy baja; de las 51 familias analizadas
úiiicaineiite 3 presentaban consaiiguiiiidad de segundo y tercer grado y otra con uiia
consanguinidad bastante baja.
Al observar la relación endogamia versus exogamia encoiitramos que a pesar de
que la eiidogainia era niuy alta con relación a la exogamia, la mayoría de uniones se daba
eii Saii José, Alajuela y Puiitareiias, lugares en doiide la heterogeneidad de mutaciones era
grande. periiiitieiido un pool génico mayor y con ello una alta variabilidad genotipica.
6.3 Factores migracionales, geográficos y matrimoniales en familias con Fibrosis
Quística en Costa Rica.
6.3.1 Factores matrimoniales
Los resultados obtenidos en la población con fibrosis quística en Costa Rica,
mostraron que la endogamia es bastante alta especialmente en las provincias de San José,
Alajuela y Puntarenas; estos resultados son confirmatorios con la distribución de distancias
maritales, en donde el mayor porcentaje de uniones se da a una distancia inferior a los 100
Km. de distancia. Por otro lado, las distancias entre padre e hijo y madre e hijo son muy
semejantes, lo que confirma la existencia de una alta endogamia en nuestro grupo familiar
con fibrosis quística.
Ahora bien, un fenómeno importante que se presenta en nuestro estudio es la
presencia de uiia muy baja cantidad de familias con u n índice de endocruzarniento alto,
estas fainilias preseiitabaii relaciones entre primos lierinaiios, primos segundos y primos
cuartos, con genotipos y Iiaplotipos heterocigotos en el gene CFTR. Esto establece la
presencia de relaciones consanguíneas distantes entre estos grupos familiares, dejando la
posibilidad de introducción de mutaciones por otras líneas de descendencia.
Otro puiito a destacar con respecto a estos datos es lo estipulado por Zumbado y
Barraiites, 1991, eii doiide establece11 que nuestro país la consanguinidad es Iiacia la
dismiiiucióii, al igual que la tendencia general en el iiiuiido occideiital y que la endogaiiiia
es alta a pesar de su teiideiicia a la disininución y no relacionada coi1 la consanguinidad.
6.3.2 Factores geográficos y migracionales Los factores geográficos y el comportamiento migracional son muy importantes en
la dinámica y la estructura poblacional en una región específica. Una determinada región
geográfica puede originar un flujo de entrada o salida de genes y con ello provocar cambios
en las frecuencias alélicas. En este estudio se determinó que la mayor cantidad de pacientes
con fibrosis quística se presentan en la gran área metropolitana, especialmente en las
provincias de San José y Alajuela. Sin embargo, la distribución de portadores en estas
provincias se presenta disminuida en relación a las provincias del interior del país y al
efecto de migraciones de otros países del área.
Con respecto a la distribución geográfica de probandos y portadores de fibrosis
quística, se observó que la mayor proporción de probandos y portadores se daba en San
José, Alajuela y Puntarenas. Sin embargo se determinó un puiito muy importante, en la
figura 14, y es que a pesar de la mayor incidencia de FQ en San Josk y Alajuela,
posibleineiite origine uiia mayor cantidad de portadores; siii embargo, en el caso de las
provincias costeras (Limón, Puntarenas y Guanacaste), el número de pcrtadores FQ es
significativamente alto en relación al número de habitantes, como sucede con Heredia y
Cartago. Una posible explicación de estos hechos pueden darse a la luz de la historia
política, social, cultural y econóinica de Costa Rica.
1. La región central desde hace cuatro siglos es el área más poblada de Costa Rica.
Esto se debe como coiisecuencia de un largo proceso ecoiióinico, político, social y cultural
qiie Iian coiivertido a esta región coino el centro motor del país, así por ejemplo al 1 de
eiicro del 2005. la poblacióii costarricense total cerrada es de 4 189 000 y la región de San
JosC y Alaj~ieln registrada Iiasta esa fecha era de 2 260 553 Iiabitaiites para un porceiitaje de
53.0% (Cciitru Cciit roriiiicricniio de Poblncióii. 2005). Sí coiisideraiiios esta cifra coriio
punto de partida para realizar la extrapolación con la fibrosis quística, se podría predecir
que al haber mayor cantidad de habitantes en esta zona, daría origen a una mayor cantidad
de portadores en contraposición a las zonas de menor concentración poblacional. Ahora
bien, de acuerdo al equilibrio de Hardy y Weinberg y bajo el supuesto que la población de
esta área fuera preferiblemente de origen Europeo y un hipotético aislamiento genético, con
incidencia de un paciente con fibrosis quística por cada 2500 nacidos, la cantidad de
portadores sería entonces de 77950 habitantes; Sin embargo, al ser la población
costarricense de origen trihibrido se esperaría que la incidencia fuera menor.
A pesar que en nuestra población no conocemos con exactitud la incidencia de la
enfermedad; se haii realizado cálculos aproxiinados de esta en el Programa Nacional de
Tainizaje Neonatal y Alto Riesgo; en un estudio piloto para deteccióii de fibrosis quistica
en el 2001 fue estimada en 1 paciente por cada 4 373 recién nacidos con una frecuencia de
portadores de uno por cada 68 habitaiites (Sánchez, A., Sandi, M., Abarca, G. en prensa); sí
esta iiicideiicia hipotética fuera real, entonces la cantidad de portadores esperados en la
zoiia de Alajuela y San José seria aprosiiiiadainente 33 243 personas.
2. Otro aspecto importante a recalcar es el rápido crecimiento que se da eii la región
central. Esto es originado por un efecto migratorio de otras áreas del país, especialinente
Guanacaste y Puntarenas, sobre la gran área Metropolitana. Estas persoiias migraii hacia el
Valle Ceiitral geiieralnieiite eii busca de nuevas oportuiiidades de trabajo, estudio, reuiiióii
fainiliar, etc. Esto coiilleva eii riiuclios casos a uri flujo gériico iriiportarite Iiacía la regióii
ceiitral del país, iiiodificaiido la estructiira geiiética taiito de las regioiies de procedericia
coiiio de las receptoras.
Con relación a esto observamos en nuestro estudio la existencia de 18 relaciones
exogámicas y esta proporción de matrimonios es mucho mayor a la observada en las
relaciones endogámicas por región y muestra el posible flujo génico de portadores de la FQ
hacia la zona central, especialmente San José.
3. La relación entre la geografía y la mezcla racial es otro aspecto iinportante a
recalcar, con relación a la distribución de mutaciones. Costa Rica, se caracteriza por ser una
población híbrida originada a partir de tres grupos étnicos importantes a saber de origen
europeo, africanos y amerindios con una proporción de mezcla promedio aproximada de
61 ,O%; 9.0% y 29.9% , la región del valle central presenta una mayor proporción de genes
de origen europeo, con relación a otras áreas del país, lo que posiblemente originó un
ingreso inayor de genes mutantes de estos orígenes hacia esta región, por el contrario las
poblaciones de la zona atlántica de Costa Rica, presenta mayor cantidad de genes negros
coi1 relación a otras zonas del país, además de una zona de alta ininigración de poblaciones
orieiitales que en coiijunto son poblaciones de portadores en inuy baja frecuencia de
rnutacioiies para FQ, lo que origina un descenso en la incidencia de FQ en esta región.
7. CONCLUSIONES
1. En relación con los polimorfismos KM19 y XV2c, el alelo 1 en ambos polimorfismos
son más frecuentes en cromosomas de afectados; en cromosomas normales, también el
alelo 1 de dichos marcadores son los más elevados. No obstante, la distribución de
afectados por regiones mostró que el alelo 2 de KM19 es más frecuente en Heredia,
Cartago, Puntarenas y SJNC; con relación al marcador XV2c, únicamente Puntarenas
presenta mayor frecuencia en el alelo 2. En estos dos marcadores la frecuencia de
heterocigotos (112) es mayor a la de homocigotos.
2. Con respecto a los haplotipos de KM19 y XV2c, el haplotipo A fue el más frecuente
entre los afectados, por regiones su mayor frecuencia se da en Alajuela; por otro lado,
el haplotipo D es el menos frecuente entre este tipo de cromosomas. En cromosomas
normales, sus haplotipos presentan mi s variabilidad que en los haplotipos CFTR
mutantes, eii estos el haplotipo más común es el haplotipo A y el menos frecuente es el
B. La alta frecuencia del haplotipo A se podría deber a gran cantidad de mutaciones
asociadas a haplotipos no B, en detrimento a las ligadas al haplotipo B, además de la
posibilidad de recombinación entre los marcadores y el gene. La combinación de
Iiaplotipos eii croinosomas niutaiites presentó un exceso de Iieterocigotos en
deficiencia de la coinbinacióii de Iioinocigotos en nuestra iiiuestra.
3. En relación a las mutaciones CFTR, Se determinaron 8 mutaciones que en conjunto
representan una frecuencia de detección de un 75,5%. La mutación G542X fue la más
común en nuestra muestra, esta se presentó en pacientes de todas las regiones del pais
con excepción de Guanacaste, sin embargo, esta última región exhibió una gran
cantidad de portadores obligatorios que son nativos de esta región del pais, mostrando
un fuerte flujo génico de portadores con esta mutación hacía el resto del país. La
AF508 es la segunda mutación más común; esta presenta la característica que más de
la initad de pacientes coi1 esta mutación muestran el haplotipo B; común en
poblaciones europeas. Otras seis mutaciones fueron identificadas (RI 17H, G551D,
W1282X, 1717-1G-A, 621+1G-T, 3849+10 kb C-T) en nuestro estudio con
frecuencias inferiores al 10%.
4. Los heterocigotos coinpuestos fueron los genotipos rnás conlunes en nuestra
población; el geriotipo AF508lG542X fue la combinacióii inas coniún eiitre nuestros
pacientes. Eii cambio, los Iioinocigotos para G542XlG542X fue el único genotipo de
este tipo observado.
5. Las determiiiacióii de frecuencias alélicas y haplotipicas de Km19 y XV2c, en
coiijunto coii la frecueiicia de mutaciones en cromosoinas con y sin mutación en
CFTR, periniten dar un coiisejo geiiético de familias costarricenses con un afectado o
uii pariente coi1 FQ, asimisiiio se podrá realizar de uiia nianera iiiás rápida y precisa un
diagiióstico coi1 Iiistoria faiiiiliar de FQ.
6. La coiisaiigiiiiiidad tieiie u11 efecto iiiuy pequeiio sobre la iiicideiicia de esta
eiifeiiiiedad. piies se eiicoiitraroii pocos casos a través del ariálisis geiiealógico y 10s
datos dc ciido~niiiin. esogaiiiia. distniicias iiiigracioiinles y riiiitaciories coiifiriiiaii este
Iicc.ll0.
7. En el futuro, debemos impulsar varias propuestas de investigación y análisis clínico
para fibrosis quística, a continuación presento las recomendaciones y perspectivas de
la enfermedad en nuestro país:
A. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR COMPLETA: Se debe finalizar la
caracterización molecular en pacientes diagnosticados con fibrosis quística, iniciada en
este estudio de investigación. Esto contempla el análisis y aislamiento de secuencias
exónicas e intrónicas heteroduplex y la posterior secuenciación genética.
B. DIAGNÓSTICO RUTINARIO: Implementar el diagnóstico confirmatorio de
fibrosis quística a pacientes con manifestaciones clínicas de esta enfermedad y brindar
así un manejo médico y consejo genético adecuado al pacieiite y su familia.
C. FORMAS AT~PICAS: Realizar la identificación de niutaciones del CFTR eii
persoiias con manifestaciones atipicas de presentación de la enfermedad. tales coiiio la
iiifertilidad inasculiiia, feineiiina, pancreatitis crónica, bronquiolitis entre otros.
D. CLORUROS DUDOSOS: Aproximadamente un 5% de los pacientes enviados al
laboratorio clíiiico del Hospital Nacional de Niños para la prueba de sudor presentati
niveles entre los 40 y 60 mEq/l (Navarro et al, 2000); en nuestra muestra determinamos
tres inutaciones que diversos autores han asociado a secrecioiies de cloruros normales.
Por ello es necesario iiiiplenieiitar la caracterización niolecular del CFTR en estos
pacieiites para un diagnóstico confirmatorio.
E. ANÁLISIS DE PORTADORES: estudios para diagnóstico a portadores si existen
aiitecedentes faiiiiliares de fibrosis quística; en especial a las faiiiilias con estudios
gt.iic.alogicos y iiiolrculares qiie faciliten un me-jor consejo geii2tico.
F. TAMIZAJE NEONATAL: Implementar el diagnóstico para fibrosis quistica en las
pruebas de tamizaje neonatal por medio del sistema de análisis de dos o tres pasos
(Tripsinogeno inmunoreactivo / molecular), (Tripsinogeno inmunoreactivo / cloruros en
sudor / molecular). Con ello podemos diagnosticar tempranamente a neonatos que en
muchos casos no han presentado síntomas.
G. ALTO RIESGO: En nuestro estudio observamos regiones geográficas que
presentaron una alta frecuencia de portadores; es necesario realizar estudios más
detallados para conocer la situación real de estas regiones, su estructura genética y la
prevención de la enfermedad
H. MARCADORES INTRAGENICOS Y GENES MODIFICADORES: Con ello
podemos ampliar los estudios poblacionales iniciados en este estudio y conocer el
efecto de otros genes sobre la expresión del CFTR.
8. REFERENCIAS
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9. ANEXOS
Hospital Naciond de Niños "Dr. Carlos Sáenz Herrera" Caja Costarricense de Seguro Socid San &SI¡, Costa Rica
~o~millrrconsocrnwmirrraii-aóna~ac~
Nombre del paciente: Expediente: COdigo:
TITULO D t l PROYECTO: Anhlisis de las mutaciones del gene CFTR y de los marcadores polintórficos asociados en familias con Fibrosis Quística en Costa Rica.
Estimado Padre de familia: Su hijo ha sido diagnosticado de padecer Fibrosis Quística. La Fibrosis Quística es una enfermedad hereditaria de las glándulas exocrinas que afecta principalmente los aparatos digestivos y respiratorios, presentando, casi siempre, problemas a nivel puiinonar coino tos con flemas persistente, respiración con silbidos, infecciones pulinonares crónicas, hemoptisis (expectoración con sangre), entre otros. A nivel digestivo se preseiita iilsuficieilcia pancreática (nial funcionamiento del páncreas), obstruccióii iiitestiiial a nivel de íleoii, distensión abdoiiiinal, prolapso rectal, cirrosis hepática, cálculos en vesícula, diabetes mellitus, heces con grasa (esteatorrea) así niismo 5e encue~tran otros síntomas coino sudor con perdida excesiva de sal, iiitolerancia al calor, alteraciones en las cifras de sodio y cloruro en sangre (las cuales estáii disminuidas).
E1 objetivo fundamental de este estudio es determinar en su hijo(a) afectado(a) por esta enferiiiedad y en todos los inieinbros del grupo familiar, la(s) mutación(es) del geiie de la Fibrosis Quística y los iiiarcadores de ADN (genéticos) asociados a dicho gene. Adeiiiás, este estudio permitirá aclarar aspectos epideiniológicos y poblacionales de esta enfermedad; que servirán para estudiar y diagnosticar teii-ipranainente a otros niiíos y sus faiiiilias.
Además, podría ayudar taiiibiéii en alguiios casos a deteriiiiiiar eii forina iiiás precisa el tipo de alteración, para podes iiiiciar un manejo inás proiito adecuado del iiiíio, coi1 el beiieticio pasa 61.
I'nra rcaliznr cstc estiidio lo úiiico qiic se requiere es la toma de iina miicstrLi de 10 ti
15 cc de sang1.e del antebrazo dc su Iii-jo, así como de los padrcs J su tiiiiiili~i. ~ciicialiiiciitc cii iiiia íiiiica ocasiciii. I'ndi-ía ser iicccsasio repctis la ioiiia dc 1') iiiiic\ti.:i > i iio sc logrnii icsiili:idos ci si los iiiisiiins iio son cciiiclii! C I ~ ~ C S .
El procedimiento de la obtención de la muestra es el mismo que se utiliza para cualquier examen de sangre, o sea produce una sensación de malestar transitoria o temporal, o un moretón y prácticamente nunca ocasiona un daño a quien se le toma. Por lo demás, no existe ningún riesgo para su hijo(a) ni para sus familiares al participar en el estudio.
Después de conocer los resultados de las mutaciones y10 de sus variaciones ligadas encontradas en una familia, es posible en prácticamente todos los casos detectar o descartar la presencia de enfermos o portadores entre los familiares del paciente. Todos los parientes que presenten las mutaciones y la variación relacionada podrían convertir a sus hijos(as) en portadores o transmitirle la enfermedad según el caso.
Si usted no desea que su hijo(a) participe en este estudio, el manejo médico y los estudios que se requieran en su hijo(a) no sufrirán detrimento alguno.
Si usted decide aceptar la participación en este estudio, tendrá la oportunidad en cualquier momento de preguntar a los investigadores principales del proyecto Dr. Manuel Saborio Rocafort, Sección de Genética y Metabolismo del Hospital Nacional de Niños (tel. 222-0122 ext. 2201) y10 Biól. Manfred Sandí Díaz, Laboratorio de Genética, Hospital Nacional de Niños (tcl. 222-0 122 cst.24 19) el estado en que sc encuentra la investigación. Adeinás usted tienc el derccho de retirarse o de retirar a su hijo del proyecto, sin que esto afecte la calidad del tratamiento dado o que se le vaya a dar a su hijo.
Los resultados de este estudio, se mantendrán en estricta coilfidencialidad a inenos qiie iistcd acccda a liberar dicha información. Los resultados podrán ser publicados en reunioilcs o revistas científicas sin revelar la identidad de su hijo ni la de ningún otro inicmbro de la fainilia. En ningún caso se harán estudios del ADN obtenido de su hijo o de algiino de sus familiares, con fines ajenos al objetivo de este proyecto, sin su previo consentiinicnto informado.
Si su hi.jo(a), usted o algún miembro de su familia no han sido tratados de manera adecuada en este proyecto de investigación; por favor comunicarse a la Unidad de BioCtica e Investigación del 1-Iospital Nacional de Niiíos. telcfbno 222-0122 estcnsióii 35 16 (Quiiito piso, Edificio dc Espcciiilidades MPdicas).
El llospital Nacicinal dc Niiías. la Ca-ja Costarricense de Segiirc) Social y la liiiivcrsidiid de Costa Rica no ticncii programas dc conipt.iis:icicíii ecoiiiiiiiica si sii hi-iii(;i) o iistcd(cs) siil'rcii iil=iiii daiío qiic iio sea ;iiribilil~lc ;iI pro!.ccto dc iii\,cstig:iciciii. Ilsicd(cs) o sil Iiijo iio pcrdei-riii iiiiigiiii dcrcclic, Icgal par liriiiiir cstc iloc~iiiiciilc~.
CONSENTIMIENTO
Yo he leído, o se me ha leído toda la información descrita en las páginas previas antes de firmar esta fórmula de consentimiento. Se me ha brindado la oportunidad de hacer preguntas y éstas han sido contestadas en forma satisfactoria.
Accedo a participar en este proyecto:
Firma del pariente o representante legal Número de cédula
Parentesco o relación con el paciente Fecha y hora
Firina del investigador principal Núinero de cédula
Firma del testigo 1 Número d e c6dula
.................................................... ....................................................
ESTUDIO DE PORTADORES
1:irtiia del pariente o rcprcsentaiite legal I..echn y hora
Anexo 2
Hospitd Nacional de Niños "Dr. Carlos Sáenz Herrera" Caja Costarricense de Segum Social San José. Costa Rica
Nombre del paciente:
TITULO DEL PROYECTO: Ancílisis (le las rlt~rtaciones del gene CFTR y de los ntarcatlores polintórficos asociarlos en familias con Fibrosis Quística en Costa Rica
NOMBRE: EXPEDIENTE: CEDULA O TIM:
CODIGO ADN:
TELEFONO:
L UGAR DE ORIGEN : (VI.:!< ( ~ I ~ N I < A I . O ( ~ I A A'I.I<AS)
I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
I N F O K M A C I ~ N DE LA MADRE NOMBIIE: CEDULA: D I R E C C I ~ N EXACTA:
cód reg. iiac.
CODIGO ADN:
LUCiAII DE ORIGEN:
I IldOS: [>l:N'flIO MAl'KIhlON 10 FUERA MATIIIhlONIO
...........................................................................
NOMBRE: CEDULA: D I R E C C I ~ N EXACTA:
cód reg. nac.
C O D l G O ADN:
LUGAR DE ORIGEN:
N U M E R O MATRIMONIOS:
HIJOS: DENTRO MATRIMONIO FUERA MATRIMONIO
ORIGEN DEL PADRE: ORIGEN DE LA MADRE:
G R A D O CONSANGUINIDAD: DISTAb!CIA MIGRACIONAL: DISTANCIA GEP4ERACIONAL:
REALIZADO POR: FECHA: HORA:
D i s t r i b u c i 6 n g e o g r h f i c a d e p o r t a d o r e s o b l i g a t o r i o s d e l g e n e C F T R R 1 1 7 H
y s u s h a p l o t i p o s e n C o s t a R i c a
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