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UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO
CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DEL VENENO DEL ESCORPIÓN
Didymocentrus krausi (SCORPIONES: SCORPIONIDAE)
Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de
Posgrado en Ciencias Biomédicas para optar al grado y título de Maestría Académica
en Ciencias Biomédicas con énfasis en Bioquímica y Fisiología Celular
DANIELA ROJAS AZOFEIFA
Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica
2016
Dedicutoria
A mi mamá, que me. eJw~ñci q11c se luGha hasta e/final ...
¡¡
Agradecimientos
Podría hacer otra tesis de solo agradecimientos, pero trataré de resumir el nombre de
todas las personas que de alguna u otra forma me apoyaron y ayudaron con esta!
Le agradezco a las personas más importantes en mi vida: mi papá, mis hermanos y
sobrinos por todo el apoyo (realmente incondicional) que me han brindado toda la vida.
Por supuesto, a mi comité de tesis por darme la oportunidad de trabajar en este proyecto
y en un instituto tan reconocido como el Instituto Clodomiro Picado (ICP).
A Natalia Ortiz, Bruno Lomonte y Osear Brenes, por TODA la ayuda y los consejos
que me brindaron.
A todos mis amigos y compañeros del ICP, realmente trabajar ahí fue una experiencia
increíble, aprendí muchísimo.
A todo el personal de la Estación Biológica Palo Verde en las giras de campo.
Y a mis diferentes grupos de amigos:
Las tesiarias (Emi, Nati V y Sofi) por las tesiatones.
Las chicas de biolo, por toda la paciencia, consejos y ayuda.
Los trambólikos: Soma, Karol, Fofo, MariJose, Gaby.
Las cuaimas, en especial a Jenni, Grettel, Eli, Raque.
A Fisio-team, por todo el apoyo en especial en las últimas semanas.
A mis mejores campas en el mundo: Jaji, Allan, Rose, gracias por todo ...
¡¡¡
"Esta tesis fue aceptada por la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en
Ciencias Biomédicas de la Universidad de Costa Rica, como requisito parcial para optar
al grado y título de Maestría Académica en Ciencias Biomédicas con énfasis en
Bioquímica y Fisiología Celular."
omonte Vigliotti Represente del Decan d Sistema de Estudios de Posgrado
Dr. Mahmood Sasa Marín Director de Tesis
o Asesora de Tesis
· omero Vásquez
Asesora de Tesis
M.Sc. Osear Brenes Representante de la Directora del Pr:¡:osgrado en Ciencias Biomédicas
Daniela Rojas Azofeifa Candidata
Índice
Dedicatoria ...................................................................................................................... ii
Agradecimientos ............................................................................................................ iii
Hoja de aprobación .............................................................................. .iv
RESUMEN .................................................................................................................... vii
Lista de cuadros .......................................................................................................... viii
Lista de figuras ............................................................................................................... ix
Lista de abreviaturas ..................................................................................................... xi
MARCO TEÓRIC0 ....................................................................................................... 1
Diversidad de péptidos con puentes de disulfuro y sin puentes de disulfuro presentes en venenos de escorpiones .......................................................................... .4
Otros efectos biológicos de los venenos de escorpiones .............................................. 6
JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................... 9
OBJETIVO GENERAL ............................................................................................... 11
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................... 11
MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................... 12
l. Obtención del veneno de D. krausi ....................................................................... 12
2. Determinación de actividad citotóxica .......... ...... .......... ... ... .. .... .. ........... .. ........... 12 2.1 Cultivo Celular .............................................................................................................. 12 2.2 Ensayo de citotoxicidad .. ............................... ....................... ... ... ................ .. ... .... ......... 12 3 .1 Ensayo de azocaseína ........ ......... .................... .. .................... ........ .............. .... ............... 14 3.2 Actividad gelatinolítica ................................................................................................. 14
4. Determinación de la producción de óxido nítrico ......... ......................... ... ......... 14 4.1 Cultivo Celular ..................... .... ............ ......... .. ............... ...... ..... .................... .... ............ 14 4.2 Ensayo de Griess ................. .......................................................................................... 15
5. Separación por HPLC-RP del veneno de D. krausi ............................................ 15
6. Análisis electroforético .......................................................................................... 16
7. Caracterización de las fracciones de veneno de D. krausi con MALDI TOF-TOF ............................................................................................................................ 16
8. Detección de acetilcolina en el veneno de D. krausi ........................ .................... 17
9. Construcción de biblioteca de ADNc y análisis de secuencias .......................... 17 9.1. Alineamientos y análisis bioinformáticos .............................. ... ................................... 18
10. Determinación de composición de la fracción coloreada ................................. 18
11. Análisis de Jos datos ............................................................................................ 19
RESULTADOS ............................................................................................................. 20
Actividad cito tóxica del veneno de D. krausi ......... ................ .. ...... ..... ...... ............... 20
Actividad proteolítica del veneno de D. krausi ........... ....... ....... ....... ... .... ... .............. 21
Producción de Óxido Nítrico ... .. .... .. ........ ... ......... .. ..... .... ...... .. .... ..... ......... ... ..... .. ...... 22
Caracterización de las fracciones de veneno de D. krausi .. ............. ............ ........... 24
Detección de acetilcolina t!n el veneno de D. krausi .. ........ ... .. .. ......... ........ ... .... .... ... 31
Construcción de biblioteca de ADNc y análisis de secuencias .. ... ....... ........ .......... 33
Determinación de fracción coloreada .... .......................... ....... ... ... .... .. .... .... ............. 3 7
DISCUSIÓN .........................•........................................•............................................... 38
CONCLUSIONES FINALES .............•......................•.....•......................•..........•....•.... 49
ANEXOS ...............••.......•...................................•......•.•.•..............................................•. 63
vi
RESUMEN
Marco Teórico: Los venenos de escorpiones están compuestos por diferentes mezclas de sustancias, entre ellas neurotoxinas, péptidos sin puentes disulfuro, moco, sales, componentes orgánicos y enzimas. Algunos de los efectos que estos venenos pueden presentar a nivel celular son: prolongación del potencial de acción en células excitables, actividad proteolítica, efectos en la permeabilidad de las membranas celulares, producción de interleucinas y óxido nítrico en macrófagos. A nivel sistémico pueden afectar el sistema autónomo y desencadenar un fallo multiorgánico. Muchos de los venenos de escorpiones estudiados, corresponden a especies de Ja familia Buthidae, debido a que presentan más accidentes letales, pero se ha dejado de lado otras especies que poseen características únicas en su veneno y que no pertenecen a esta familia de escorpiones. Uno de estos es Didymocentrus krausi (Scorpionidae), por lo que el objetivo principal de este proyecto fue caracterizar parcialmente el veneno, e identificar los principales componentes presentes en el veneno de este escorpión que habita la región noroeste de Costa Rica.
Materiales y métodos: con la finalidad de analizar los distintos componentes del veneno, este se separó por HPLC-RP para su posterior caracterización por medio de espectrometría de masas MALDI-TOF-TOF, nESI-MS/MS, además se incorporó la construcción de una biblioteca de ADNc. Por otra parte, se determinó la actividad citotóxica del veneno con el ensayo calorimétrico de sulforodamina B, en células excitables y no excitables, así como su actividad proteolítica con la prueba de azocaseína y producción de óxido nítrico en macrófagos, por medio de la prueba de Griess.
Resultados y Discusión: Este veneno está compuesto por diferentes tipos de péptidos. Estos, en su mayoría, son de bajo peso molecular, y algunos pueden estar o no, estabilizados por puentes disulfuro. Dentro de los primeros, el veneno de D. krausi presentó una neurotoxina de tipo ~-KTx, y con respecto a las proteínas sin puentes disulfuro, se encontraron algunos péptidos antimicrobianos. Tras análisis proteómicos se encontró que hay proteasas, específicamente metaloproteínasas, elastasas, peptidasas y aminopeptidasas, las cuales podrían determinar la actividad proteolítica encontrada en el veneno sobre sustratos como la caseína y la gelatina. Por otro lado, en este veneno no se encontró acetilcolina, pero si presentó una paraquinona, la cual es el compuesto que brinda el color rojo al veneno y que podría ser responsable de algunas propiedades tóxicas de este. Además, el veneno crudo de este escorpión presentó el 50% de inhibición del crecimiento (IG50) para la línea celular de mioblastos a una concentración de 10.5 µg/ml, 15.l µg/ml, para células cromafmes murinas y 17.9 µg/ml para fibroblastos murinos. La inhibición del crecimiento podría estar asociada con la presencia de péptidos antimicrobianos y la quinona antes mencionada en el veneno. Finalmente, este veneno produjo una disminución en la liberación de óxido nítrico en macrófagos murinos, pero este efecto no fue dosis dependiente. El veneno de esta especie, revela similitudes, tanto con venenos de bútidos, como con los venenos reportados para especies de escorpiones en otras familias (Scorpionidae, Chaerilidae, Liochelidae) lo que refuerza la hipótesis de que la composición de venenos difiere entre familias.
vii
Lista de cuadros
Cuadro l. Peso molecular (KDa) de fracciones proteicas analizadas por SDS-
PAGE (5-20%) bajo condiciones reductoras................................. 25
Cuadro 2. Análisis de secuencias de las bibliotecas de ADNc de D. krausi: CR3,
CR5, CRI 1 con 215 clones totales y 115 secuencias de
ADN............................................................ ..... ............... 35
Cuadro 3. Composición del veneno de diferentes especies de escorpiones de
ocho familias
diferentes....................... . ....................................... 45
viii
Figura l.
Figura 2.
Figura 3.
Figura 4.
Figura 5.
Figura 6.
Figura 7.
Figura 8.
Figura 9.
Lista de figuras
Relaciones filogenéticas de escorpiones según diferentes
autores........................................................................ ]
Didymocentrus krausi (Scorpionidae), Estación Biológica Palo
Verde, Guanacaste, Costa Rica.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Distribución de D. krausi en Costa Rica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 3
Porcentaje de crecimiento celular de las líneas C2C12, PC12 y
L929 al aumentar la concentración de veneno (µg/ml) de D.
krausi......................................................................... 21
Actividad proteolítica del veneno crudo de D. krausi sobre
azocaseína................................................................ 21
Gel de SDS-PAGE-gelatina del veneno crudo de D.
krausi....................................................................... 22
Concentración de nitritos (N02-) y porcentaje de viabilidad en
células macrófagos J774 con LPS ante tratamientos de veneno
crudo de D. krausi a 15 y 30 µg/ml y en el control (O µg/ml).
Cromatografia de elución del veneno de Didymocentrus krausi en
HPLC fase reversa en una columna C 18. Las fracciones fueron
analizadas por SDS-PAGE (5-20%) bajo condiciones
reducidas ................................................................. .
Frecuencia de los pesos moleculares (KDa) correspondientes a las
23
24
bandas proteicas obtenidas en el gel de gradiente (5-20%)..... ..... 26
Figura 10. Secuencia de aminoácidos y espectro de MS/MS para la masa de
1187.6 Da ............................................................................... . 27
Figura 11. Secuencia de aminoácidos y espectro de MS/MS para Ja masa de
1272.7 Da .................................................................... . 28
Figura 12. Secuencia de aminoácidos y espectro de MS/MS para las masas de
1222. 7 Da y la masa de 1542.8 Da, respectivamente ........... . .. . 29
ix
Figura 13. Secuencia de aminoácidos y espectro de MS/MS para la masa de
1601.9 Da ..................... . ........................................... . 30
Figura 14. Cromatografía de alta resolución del estándar comercial de
acetilcolina (Sigma) se observa en el minuto 31 3.774 .. ......... .. .. . .... .
Figura 15. Espectrometría de masas mediante ionización por electrospray
(nESI-MS/MS) del estándar de acetilcolina, espectro de
fragmentación (MS/MS) de acetilcolina y del veneno crudo de D.
krausi . . ................. . . .... .. .. ..... . .. ........ . ...... . . ... . .. .. . .. . .... . . .
Figura 16. Alineación múltiple de secuencias de aminoácidos de D. krausi.
Figura 17. Estructura molecular de una paraquinona identificada en el veneno
de D. krausi. Datos espectroscópicos obtenidos a partir del
espectro 1H-RMN de compuesto, en CDC13, 600 MHz en ppm. y 13C-RMN de compuesto, en CDC13, 125 MHz en
ppm . ... .. .... . .. . .... .. .. . . . ..... . . ... ... . .. . .. . . .. .............. ... . . . ... ... . .
Figura 18. Análisis de componentes principales de los venenos butidos y no
32
35
37
bútidos.. ........................ ...... ...... ... ... ............................ ... .. ................... 48
Figura 19. Respuestas obtenidas al inmovilizar a Didymocentrus krausi y
Centruroides edwarsii.... .. ........................... . . . . . .. .. . . .......... 48
Lista de abreviaturas
NO: Óxido nítrico
IL: interleucina
OET: Organización de Estudios Tropicales
UCR: Universidad de Costa Rica
C2C12: Células mioblasto de ratón
PC12: Células médula suprarrenal de rata
L929: Células fibroblasto de ratón
TCA: Ácido tricloroacético
SRB: sulforadamina B
Tt: tratamiento
Te: control
TO: células sin tratamiento "no crecimiento"
IG50: reducción del 50% del crecimiento celular
TGI: inhibición total del crecimiento
LC20: Concentración letal 20
RP-HPLC: cromatografía de alta eficiencia de fase reversa
TF A: Ácido trifluoracético
PAGE : electroforesis en gel de poliacrilamida
ADNc: ácido nucleico complementario
EST: marcadores de secuencia expresada
RMN: Resonancia magnética nuclear
CIPRONA: Centro de Investigaciones en Productos Naturales
LPS: lipopolisacárido
xi
1
MARCO TEÓRICO
Los escorpiones, (orden Scorpiones) han existido por más de 400 millones de años, con
registro fósil desde el Silúrico. Actualmente, se reconocen más de 2000 especies
distribuidas en seis superfamilias (Sharma et al. 2015). A pesar de que esta clasificación
ha sido modificada en diferentes estudios taxonómicos recientes (Fig 1) (Fet &
Soleglad, 2005; Prendini & Wheeler, 2005; Sharma et al., 2015), tradicionalmente se
reconocen dos grandes grupos de escorpiones, los de la familia Buthidae y los no
bútidos (Sharma et al., 2015; Sunagar et al., 2013).
- Scorpíonoídca Chactoídca
- Pscudochactoidca - Iuroidca
Chaeríloídea Buthoidca
Sissom 1990 Buthi<lac Chaerilidac Hormuri<lac Diploccntridac Scorpionidac Bothríuridac Chaclidac luri<lac Vacjovidac
Coddington et al. 2004 Pscudochactidac Buthitfac Chacrilidac lurí<lac Vacjovidac Supcrstilioniidac Chacti<lac Euscorpiidac Scorpiopidac Bolhriuridac
, U rodacidac Hctcrosc.:11rpionidac
1
Hormuridae Hemiscorpiidae Diploccntridac Scorpionidac
Stockwell 1989 Buthidac Chacrilidac Chacti<lac Euscorpi ida e Scorpiopidac
Supcrstilionii<lac luridac Vacjovidac Bothriuridac Hormuridac
Urodacidac Diploccntri<lac Scorpionidac
Soleglad & Fet 2003 Fet & Soleglad 2005 _ __ ... Pscu<lochaclidac
Buthidac Chacrilidac luridac Caraboclonidac Bothriuridac Urodacidac Diploccntridac Scorpionidac Hetcroscorpionidac Hormuridac Hcmiscorpiidac Vacjovidac Supcrstitioniidac Euscorpiidac Chactidac
Figura l. Relaciones filogenéticas de escorpiones según diferentes autores. Los colores
representan la clasificación en seis superfamilias (recuadro). Modificado de Sharma et
al. 2015. Nótese la estrecha relación entre las familias Scorpionidae y Diplocentridae en
todas las reconstrucciones.
2
La familia Buthidae posee especies de gran importancia médica, con veneno potente,
pedipalpos pequeños y telsón grande. En contraste, los escorpiones pertenecientes a
familias no-bútidas usualmente poseen pedipalpos fuertes y grandes, telsones de menor
tamaño y con venenos considerados como no letales para el ser humano (Sunagar et al.,
2013).
Dentro de los no-bútidos, se puede encontrar la especie en estudio Didymocentrus
krausi (Francke, 1978) (Fig 2). Este escorpión perteneciente a la familia Scorpionidae,
subfamilia Diplocentrinae, está distribuido en el Pacifico centroamericano desde El
Salvador hasta Costa Rica, en donde específicamente, se puede localizar en la región
pacífico norte en la provincia de Guanacaste (Fig, 3). Se caracteriza por ser pequeño de
aproximadamente cuatro cm de largo, con tonalidades rojizas, grises o negras, y posee
pedipalpos grandes y robustos como la mayoría de especies dentro de esta familia
(Víquez 1999).
Con respecto a su comportamiento e historia natural, la mayoría del tiempo se le puede
encontrar debajo de rocas y troncos, por lo que se dice que posee hábitos fosoriales.
Actualmente se desconoce el tipo de presa que prefiere, pero se cree que puede consistir
fundamentalmente en artrópodos pequeños (Víquez 1999).
Figura 2. Didymocentrus krausi (Scorpionidae), Estación Biológica Palo Verde,
Guanacaste, Costa Rica (Fotografia tomada por: Natalia Valverde)
z o' :. --.,,.----
Océano Pacifico
3
84º0'W 83'0'W
Figura 3. Distribución de D. krausi en Costa Rica mostrado en la región verde en el
mapa (Modificado de Víquez 1999).
En general, Jos venenos de escorpiones tanto bútidos, como no-bútidos son
considerados una herramienta biológica que incrementa las probabilidades de
sobrevivencia, por medio de la defensa de depredadores y en la inmovilización de sus
presas, (McCormick & Polis 1990, Zhijian et al. 2006, Salceda & Ortega 2009, Yigit &
Benli 2010).
Estos venenos están compuestos por diferentes mezclas de sustancias, producidas en
glándulas especializadas (Bosmans & Tytgat 2007), y secretadas de manera apocrina
donde el contenido de las células epiteliales secretoras es descargado en el lumen de la
glándula sin destruir ninguna de estas células (Hjelle 1990).
En cada glándula están presentes diferentes tipos de células secretoras, que producen
distintos compuestos específicos (Hjelle 1990). Entre ellos, se pueden mencionar
proteínas de bajo peso molecular llamadas neurotoxinas (Becerril et al. 1997, Zhu et al.
2004), moco, sales, y otros componentes orgánicos como oligopéptidos, nucleótidos,
aminoácidos y enzimas como metaloproteinasas, hialuronidasas, proteasas (Simard &
Watt 1990, Gwee et al. 2002, Zhu & Gao 2006) y fosfolipasas. La diferente
4
combinación de los componentes del veneno pennite explicar la gran variedad de
actividades y funciones bioquímicas y fannacológicas (Zeng et al. 2005).
Se ha evidenciado que múltiples péptidos pueden estar presentes en el veneno de una
sola especie de escorpión (Tan et al. 2005), lo cual permite producir potentes acciones
sinérgicas cuando estos son liberados (Gwee et al. 2002). Estos péptidos se pueden
clasificar en péptidos con puentes disulfuro o sin estos puentes (Zeng et al. 2005).
Diversidad de péptidos con puentes de disulfuro y sin puentes de disulfuro presentes
en venenos de escorpiones
Con respecto a los péptidos con puentes disulfuro, específicamente las neurotoxinas, se
pueden dividir como toxinas de cadena larga o de cadena corta. Las del primer grupo
están compuestas por 60 a 70 residuos de aminoácidos y están unidos por cuatro
puentes disulfuro, en donde dos de los puentes se unen covalentemente a una a-hélice a
una sección de una hoja plegada p. Por otro lado, las toxinas de cadena corta,
usualmente contienen de 30 a 40 residuos y tres o cuatro puentes disulfuro. Ambos
tipos de toxinas poseen un motivo estructural de cisteína conocido como CS-ap,
característico de estas proteínas (Srairi-Abid et al. 2005).
En general, las neurotoxinas del escorpión actúan principalmente en las células
excitables como los nervios y los músculos (Gwee et al. 2002). Los principales blancos
moleculares de estas toxinas son distintas familias de canales iónicos dependientes de
voltaje, como los canales de sodio (Na+) y potasio (K+) dependientes de voltaje (Froy et
al. 1999, Winterfield & Swartz 2000, Srairi-Abid et al. 2005, Tan et al. 2005). Además,
se han caracterizado toxinas que afectan otros canales como los canales de calcio (Ca2+)
(Winterfield & Swartz 2000) y canales de cloruro (Cr) (Froy et al. 1999, Tan et al.
2005).
Las toxinas que modulan principalmente a los canales de Na+, son de cadena larga, y
afectan los mecanismos de compuerta de estos. Con base en experimentos de
electrofisiología, se han propuesto dos sitios distintivos donde estas toxinas pueden
unirse al canal. La a-toxina se une en los segmentos S3-S4 del dominio IV (Possani &
Rodríguez 2006); además, afectan el sensor de voltaje del canal, produciendo en
5
conjunto un retraso del cierre de la puerta de inactivación de estos receptores (Simard &
Watt 1990, Gwee et al. 2002, Zhu et al. 2004, Restrepo-Angulo et al. 2010).
Este primer grupo de a-toxinas, afecta específicamente los canales iónicos presentes en
mamíferos e insectos, por lo que se subdividen en a-toxinas anti-mamífero, a-toxinas
anti-insectos y similares a a-toxina. Las primeras son altamente tóxicas para mamíferos
y se unen con alta afinidad a los canales de Na+ en tejido cerebral de rata, como por
ejemplo, la toxina Aah2 del escorpión norafricano Androctonus australis, y la Lqh2 de
Leiurus quinquestriatus (Cohen et al. 2006). La a-toxina anti-insectos es muy tóxica en
insectos y muestra baja actividad en cerebro de mamíferos, aunque se ha visto que
tienen algún efecto en el tejido muscular (Zuo & Ji 2006). Finalmente, están las
similares a a-toxina, de la especie Buthus occitanus, que es tóxica tanto para ratas como
para insectos (Cohen et al. 2006).
El segundo tipo de toxinas, las ~-toxinas se unen en los segmentos S3-S4 del dominio II
de los canales iónicos (Possani & Rodriguez 2006), afectando la compuerta de
activación de estos y promoviendo una subsecuente despolarización sostenida (Gwee et
al. 2002). Estas toxinas también se pueden clasificar en ~-toxina anti-mamífero, como
es el caso de la toxina de Centruroides sujfusus, con las toxinas Css2 y Css4. En el
segundo caso están las ~-toxinas que afectan tanto a insectos como mamíferos, como
las de los escorpiones del género Tityus, por ejemplo, T. serrulatus, y en T. bahiensis
(Campos et al. 2007, Restrepo-Angulo et al. 2010); y las j3--toxinas selectivas anti
insecto con efecto inhibitorio, que inducen una parálisis progresiva lenta, seguida de un
fase de contracción transitoria, o con efecto excitatorio, donde se presenta una parálisis
inmediata (Goudet et al. 2002, Cohen et al. 2006).
Muchas otras toxinas de escorpiones pueden afectar canales de K+ dependientes de
voltaje. Estas toxinas han sido clasificadas recientemente en tres familias: la a-toxina
(a-KTxs), la ~-toxina(~ -KTxs) y la y-toxina (y -KTxs) (Rodríguez de la Vega et al.
2003, Diego-García et al. 2006) y se han caracterizado por afectar estos canales y por
ende, el potencial de acción en células excitables (Huys et al.2004, Rodríguez de la
Vega et al. 2003, Rodríguez de la Vega & Possani 2004). Por esta razón, las toxinas que
afectan los canales de Na+ y K+, median acciones sinérgicas que causan una mayor tasa
de despolarización de estas células (Gwee et al. 2002).
6
Otros efectos biológicos de los venenos de escorpiones
Pocos péptidos sin puentes disulfuro han sido aislados y caracterizados. Estos producen
actividades potenciadoras de la bradiquinina, que es un factor importante en la
regulación de la presión sanguínea. Ejemplos de estas son la proteína T y la K12, en los
venenos de T. serrulatus y B. occitanus (Zeng et al. 2005), además de estar presentes en
otras especies de otras familias como Caraboctonidae y Chaerilidae ( Chaerilus
tricostatus) (He et al. 2013).
Otro efecto de estas proteínas es antimicrobiano, el cual inhibe el crecimiento de virus y
organismos procariotas. Estos péptidos también pueden ser hemolíticos y citotóxicos
(Zeng et al. 2005).
Uno de los efectos poco estudiado de estos venenos es su actividad proteolítica (Costal
Oliveira et al. 2012). Basado en observaciones de necrosis, hemólisis y gangrena
exhibidos en animales que fueron picados por T. serrulatus y T. bahiensis, se ha
sugerido que en el género Tityus, se podrían presentar también enzimas proteolíticas
(Almeida et al. 2002).
Aparte de lo anterior, algunos péptidos pueden actuar como moduladores de la
respuesta inmune y desencadenar la liberación de mediadores inflamatorios, como -
citoquinas y óxido nítrico (NO), lo cual ha sido ensayado con el veneno crudo y algunas
toxinas específicas de T. serrulatus (Furlani et al. 2011). Fialho y colaboradores (2011)
evidencian que la producción de citoquinas tras envenenamiento se da en cascada, ya
que durante sus mediciones, la principal citoquina involucrada en la respuesta
inflamatoria aguda es TNF- a, producida inicialmente por monocitos y macrófagos, la
cual se libera en las primeras horas, y esta a su vez permite aumentar la expresión de
interleucina (IL) -1~ e IL-6, moléculas de adhesión y NO. Además, esta citoquina es la
primera en reclutar y activar células inflamatorias y la reacción de fase aguda (Adi
Bessalem et al. 2008).
Posteriormente, se observa un incremento en IL-6, lo que sugiere una prolongación de
la respuesta inmune, debido a que esta interleucina está relacionada con la movilización
de neutrófilos hacía la circulación. Por último, se observa un aumento de IL-1 O, lo que
7
confirma la función de esta molécula anti-inflamatoria, en la resolución del proceso
inflamatorio, por medio de inhibición de las citoquinas antes mencionadas, supresión de
radicales libres de oxígeno, NO y de prostaglandinas (Fialho et al. 2011).
Otro de los mediadores liberados por las toxinas del veneno de escorpión durante el
envenenamiento, es el NO (Furlani et al. 2011). Se sabe que esta molécula está
involucrada en la regulación del tono vascular, y en la respuesta inflamatoria aguda y
crónica (Tripathi 2007). Diferentes autores han encontrado un alto nivel de NO en el
suero de ratones inyectados con veneno del escorpión T. serrulatus (Petricevich y Peña
2002; Severino et al. 2009), así como en sobrenadantes de cultivos celulares de
macrófagos tratados con este veneno o con diferentes toxinas de este (Petricevich &
Lebrun 2005; Petricevich et al. 2007; Furlani et al. 2011).
El envenenamiento a causa de escorpión se conoce por sus efectos producidos por
sobreactividad del sistema simpático, como lo son taquicardia, hipertensión, arritmia
cardiaca, midriasis, o/y efectos parasimpáticos como salivación, bradicardia e
hipotensión, entre otros (Gwee et al. 2002). Sin embargo, el escorpionismo puede
causar complicaciones cardiovasculares letales como resultado de la liberación masiva
de catecolaminas, fenómeno conocido como tormenta autonómica (Nirthanan et al.
2002), lo que resulta en alteraciones de la perfusión del miocardio y en el metabolismo
(Adi-Bessalem et al. 2008; Petricevich 2010).
En algunas especies dentro de Scorpionidae, se ha descrito que, además de las
neurotoxinas en los venenos, se presentan otros compuestos como acetilcolina,
adrenalina o agonistas de estos neurotransmisores. Por ejemplo, al tratar diferentes
músculos, como lo es el músculo liso anococcigeo de rata o músculo esquelético
biventer cervicis de pollo, el veneno de Heterometrus spinifer provocó contracciones,
evidenciando efectos colinérgicos o adrenérgicos por parte de este veneno (Nirthanan et
al. 2002).
En el caso de especies dentro de la subfamilia Diplocentrinae, no se conoce ningún
estudio sobre su venómica, sin embargo existen algunas referencias sobre el veneno de
Nebo hierichonticus en donde se describen algunas propiedades particulares que
podrían ser muy similares a D. krausi. Tal es el caso de cambio en el color del veneno
blancuzco a rojizo al ser expuesto al aire (Rosin 1973) y que en el caso de D. krausi, el
veneno se vuelve de un color rojizo del veneno al ser extraído. Además, el veneno de N.
8
hierichonticus, parece contener una menor cantidad de proteínas en comparación a otros
venenos de escorpiones de la familia Buthidae (Nitzan & Shulov, 1966), pero a pesar de
eso ha demostrado que causa hemorragias locales, necrosis y parálisis en ratones (Rosin
1969), necrosis local en humanos y efecto ex-hemolítico en eritrocitos humanos (Rosin
1973).
9
JUSTIFICACIÓN
La investigación de los venenos de escorpiones ha sido, en su mayoría, restringida a
pocas especies de importancia médica de la familia Buthidae. En el continente
americano, por ejemplo, se ha estudiado principalmente el veneno de escorpiones del
género Centruroides y Tityus (García-Gómez et al. 2011; Chippaux & Goyffon 2008),
presentes en países como México, Venezuela, Brasil, Colombia y Argentina (Chippaux
& Goyffon 2008). Esto ha dejado un vacío en la caracterización de los venenos de otras
especies no bútidas.
En el caso de la especie de interés de este estudio, Didymocentrus krausi es el único
representante de la familia Scorpionidae en Costa Rica. Previamente, este escorpión
había sido clasificado dentro de la familia Diplocentridae, la cual pasó a ser subfamilia
de Scorpionidae (Fet & Soleglad 2005), ya que comparte similitudes morfológicas y de
comportamiento con otros miembros de esta familia. Entre estas están, un telson
pequeño y grandes pedipalpos en comparación con el tamaño de su cuerpo, así como un
comportamiento fosorial debajo de troncos o rocas.
Por otro lado, existen muy pocas investigaciones sobre la biología o el comportamiento
de D. krausi, y en general, no se ha encontrado ninguna investigación sobre el veneno
de este escorpión, probablemente debido a la escasez de datos de accidentes de
envenenamiento por parte de este arácnido. Aun así, este escorpión posee un veneno
con características únicas, como lo son su color rojizo, contextura pegajosa y poco
hidrosoluble, que únicamente han sido reportadas en una especie emparentada Nebo sp,
pero aun así, no han sido estudiadas a profundidad.
Lo anterior hace que este escorpión sea de interés, en términos de si el veneno de D.
krausi presenta algunos de los componentes predominantes o actividades biológicas
presentes en otros de venenos de especies dentro de Scorpionidae, como la presencia de
neurotransmisores como acetilcolina y actividad proteolítica (Nirthanan et al. 2002).
Por otro lado, a pesar de que la toxicidad del veneno de D. krausi no es conocida,
nuestros estudios preliminares sobre la citotoxicidad de ocho especies de escorpiones
costarricenses: siete de la familia Buthidae, Centruroides bicolor, C. limbatus, C.
margaritatus, Tityus dedoslargos, T ocelote, T asthenes y T pachyurus; y
10
Dydimocentrus krausi de la familia Scorpionidae, han demostrado que el veneno de D.
krausi posee una mayor toxicidad relativa en líneas de células excitables, en
comparación con las otras especies de bútidos mencionados (Anexo 1 ).
En vista de las particularidades que presenta el veneno y las características antes
mencionadas para D. krausi, el objetivo principal de este proyecto es caracterizar
parcialmente el veneno de este escorpión, así como también identificar por medio de
técnicas químicas y proteómicas, algunos de los componentes principales presentes en
este veneno.
11
OBJETIVO GENERAL
Caracterizar parcialmente el veneno de Didymocentrus krausi (Scorpiones:
Scorpionidae), e identificar los principales componentes presentes en el veneno de este
escorpión que habita la región noroeste de Costa Rica.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Evaluar el efecto citotóxico del veneno de D. krausi, en líneas celulares
excitables y no excitables.
2. Determinar la actividad proteolítica del veneno del escorpión D. krausi, por
medio de pruebas con azocaseína y gelatina como sustratos.
3. Evaluar el efecto del veneno en la producción de óxido nítrico en una línea
celular inflamatoria.
4. Identificar las principales proteínas y componentes del veneno de D. krausi, por
medio de análisis químicos, proteómicos y basados en bibliotecas de ADN.
12
MATERIALES Y MÉTODOS
l. Obtención del veneno de D. krausi
Los escorpiones D. krausi fueron colectados en la Estación Biológica Palo Verde,
Organización de Estudios Tropicales (OET), Guanacaste y se mantuvieron en La Finca
Experimental Santa Ana, UCR. Los animales se alimentaron quincenalmente con grillos
(Acheta domesticus) o larvas de escarabajos (Tenebrio molitor), además de tener agua
ad libitum.
Para la extracción del veneno, los escorpiones fueron inmovilizados en la base del
telson, el cual fue estimulado eléctricamente, con pulsos de 0.7 o 0.8 mV, que se
aplicaron tres veces por un tiempo máximo de 2 a 3 s. El veneno crudo fue colectado
en capilares de vidrio, transferido en tubos Eppendorf y congelado a -70ºC por 24
horas. Posteriormente, este fue liofilizado y almacenado a -20ºC hasta su posterior uso.
Para las siguientes pruebas el veneno fue diluido y únicamente se analizó la fase soluble
de este. Posteriormente, los ensayos celulares de laboratorio y de proteómica, se
llevaron a cabo en las instalaciones del Instituto Clodomiro Picado, Universidad de
Costa Rica (UCR).
2. Determinación de actividad citotóxica
2.1 Cultivo Celular
Las células mioblastos de ratón (C2C12) y la línea de células de médula suprarrenal de
rata (PC12), fueron usadas como modelo de células excitables, las células L929 de
fibroblasto de ratón fueron el control de células no excitables. Las células crecieron en
medio RPMI suplementado con 10% de suero fetal bovino, penicilina-estreptomicina al
1 %, ciprofloxacina e incubadas a 37ºC y a una atmósfera de 7% C02 en aire. El número
total de células fue contado con azul tripán en una cámara de Neubauer (Sigma).
2.2 Ensayo de citotoxicidad
Para este ensayo, el veneno fue disuelto en medio RPMI estéril, centrifugado a 5000
rpm, por tres minutos, y el sobrenadante fue usado en diluciones 1 :2. Después de
13
pruebas preliminares se establecieron las concentraciones finales de 62.5, 31.25, 15.63,
7.81, 3.90, 1.95 y 0.98 µg/mL,
Las células fueron cultivadas en placas de 96 pozos, la densidad de las células para
C2Cl2 fue de lxl03 células/pozo, para PC12 fue de 5x103 células/pozo y para L929
2x103 células/pozo. Al mismo tiempo, para el control se utilizó una placa con células
sin tratamientos llamado como no crecimiento (To).
Después de 24 horas de incubación, el medio fue reemplazado por 100 µL de las
preparaciones de veneno por triplicado y medio RPMI en las células control, y la placa
To fue fijada para el ensayo con sulforodamina B (SRB). Seguidas las 48 horas de
tratamiento, el efecto citotóxico fue medido mediante el ensayo de SRB modificado de
Skehan et al. (1990). Brevemente, las células fueron fijadas con 25 µL de ácido
tricloroacético (TCA) al 50%, incubadas por una hora a 4ºC y luego fueron lavadas
cuatro veces con 100 µL de agua destilada para remover el TCA, suero y proteínas no
fijadas. Una vez secas, las células fijadas se tiñeron por 30 min con 25 µL de SRB 0.4%
(Sigma-Aldrich) disuelta en ácido acético 1 %. Luego, el SRB fue lavado con 100 µL
de ácido acético 1 %.y las placas se dejaron secar al aire. El tinte fijado en las células
fue solubilizado con 100 µL de TRIS-base 1 O nM, en un agitador por cinco min, y se
midió la absorbancia a 540 nm (As4o) y a 690nm (A69o).
El % de crecimiento celular, se calculó con el promedio de absorbancia real (A540- A690)
para los tratamientos (T1), los controles (Te) y a la placa T 0, mediante la siguiente
fórmula (Savariz et al. 2012):
Para concentraciones donde Tt era mayor o igual To (T1 2'. T0), se aplicó la siguiente
ecuación
Tt-TO % de crecimiento celular= Te_ TO x 100
Cuando Ti resultó ser menor que To (T1 < To) se usó la ecuación:
% de crecimiento celular = Tt-TO
TO X 100
La concentración de veneno donde se presenta la reducción del 50% de crecimiento
celular (IG5o), la inhibición total del crecimiento (TGI) y la concentración letal 20
14
(LC20) fueron calculados para cada línea de células mediante un gráfico de dosis
respuesta del porcentaje de crecimiento celular en función de la concentración de
veneno, usando el programa Graph Pad Prism 5.
3. Determinación de actividad proteolítica
3.1 Ensayo de azocaseína
La actividad proteolítica del veneno fue determinada por medio del ensayo con
azocaseina (Sigma) descrito por Escalante et al. (2011 ). En breve, la azocaseina fue
preparada en un buffer Tris 25mM, NaCl 150 mM, CaCli 5 mM. Luego, 60.0, 30.0,
15.0, 7.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.78 y 0.39 µg del veneno fueron disueltos PBS y 20 µL de
estas muestras fueron incubadas con 90 µL de la azocaseína 1 Omg/ml, durante 90
minutos a 37ºC. Posteriormente, se agregó 200 µL de TCA al 5%, se centrifugó a 4000
rpm durante cinco minutos, y 150 µL del sobrenadante fue disuelto en partes iguales de
NaOH 0.5 M. Finalmente, se registró la absorbancia a 450 nm.
3.2 Actividad gelatinolítica
Para estudiar la actividad enzimática de este veneno, se preparó un gel de SDS-PAGE
al 12%, polimerizado con gelatina 1 mg/mL (Herron et al. 1986). El veneno se preparó
en partes iguales con buffer muestra, SDS 10%, Sacarosa 4%, Tris-HCl 0,25M, azul de
bromofenol 0,1 %, pH=6.8. La electroforesis se realizó a lOOV, y luego.los geles fueron
lavados con Triton-X-100 por 30 min y se incubaron durante 24 horas a 37ºC en buffer
de sustrato (Tris-HCl 50 mM, CaCli 0.5 mM, NaN3 0.02%, pH=8.0). Los geles fueron
teñidos con Coomasie Blue R-250 0.5% en ácido acético: alcohol isopropílico:agua
(1 :3:6), seguido de la decoloración con agua destilada, se obtuvieron imágenes
mediante el programa ImageLab (Bio-Rad).
4. Determinación de la producción de óxido nítrico
4.1 Cultivo Celular
Para esta prueba se utilizó la línea celular J774 de monocitos/macrófagos de ratón. Las
células se crecieron en medio RPMI suplementado con suero fetal bovino 10%,
penicilina-estreptomicina al 1 %, ciprofloxacina e incubadas a 37ºC y a una atmósfera
de 7% C02. Después de la formación de una monocapa, las células fueron tratadas con
15
tripsina y el número total fue contado con una cámara de Neubauer (Sigma) con tripán
azul.
Se cultivaron 4xl04 células por pozo, en placas de 96 pozos en medio RPMI
suplementado sin ciprofloxacina, e incubadas en 7% C02 a 37ºC. Después de 24 horas,
el potencial inflamatorio o anti-inflamatorio del veneno de D. krausi fue analizado pre
estimulando las células con LPS (0,5 µg/mL) (Escherichia coli LPS, Sigma-Aldrich,
donado por el Dr. Norman Rojas, del Departamento de Bacteriología de la UCR).Tras
dos horas de estimulación con LPS, las células fueron expuestas a 15 µg/ml y 30 µg/ml
del veneno, y las células control no expuestas al veneno fueron consideradas como
viabilidad celular al 100%. 24 horas después, 50 µL del sobrenadante de las células fue
tomado y almacenado a -20ºC para evaluar la producción de NO, y la viabilidad celular
fue determinada utilizando el ensayo de MTT.
4.2 Ensayo de Griess
Por medio de la técnica colorimétrica de Griess descrita por Stuehr et al. (1989) se
determinaron los niveles de óxido nítrico en el sobrenadante de cultivo celular de
macrófagos. En breve, se preparó una curva de estándar de nitrito, y cada pozo con las
diluciones de nitrito estándar y a los 50 µL del sobrenadante de cultivo de los
tratamientos, se les agregó 50 µL de una solución de sulfanilamida 1 % en ácido
fosfórico al 5%, se incubó a temperatura ambiente por siete minutos, en condiciones de
oscuridad y luego se le agregaron 50 µL de naftilenediamina dihidroclorito 0,1 % en
agua. Después de siete minutos de incubación en oscuridad, se determinó la absorbancia
en un lector de microplacas a 540 nm. Finalmente, la concentración de nitrito de cada
tratamiento y los controles, se estableció usando la curva estándar de nitrito.
5. Separación por HPLC-RP del veneno de D. krausi
Se fraccionó el veneno mediante cromatografia líquida de alta eficiencia (HPLC) en
fase reversa en un cromatógrafo Agilent 1200, aplicando 1,0-1,5 mg (en 200 µL de
agua con 0,1 % de ácido trifluoroacético; solución A) en una columna C1s (250 x 4.6
mm, 5 µm tamaño de partícula) la cual fue eluída con un gradiente de acetonitrilo con
O, 1 % de ácido trifluoroacético (TFA) (solución B) de la siguiente manera: 0-5 min 0%,
5-15 min 15%, 15-75 min 45%, 75-85 min 70% y 85-94 min 70%. Se medió la
16
absorbancia a 215 nm, y cada fracción obtenida se colectó manualmente y se secó en
una centrifuga al vacío (Savant) para su posterior caracterización.
6. Análisis electroforético
Para una ulterior separación de las fracciones del veneno obtenidas mediante HPLC de
fase reversa (RP-HPLC), cada una de estas se analizó en un gel SDS-PAGE en
gradiente de concentraciones de acrilamida de 5 a 20%, y se les aplicó un voltaje de 130
V. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie R-250, y luego, se obtuvieron imágenes
mediante el programa ImageLab (Bio-Rad).Las bandas encontradas fueron cortadas
para su posterior identificación mediante espectrometría de masas.
7. Caracterización de las fracciones de veneno de D. krausi con MALDI TOF-TOF
Las bandas proteicas del veneno, provenientes de las separaciones mediante RP-HPLC,
seguida de SDS-PAGE, fueron reducidas con ditiotreitol y alquiladas con
iodoacetamida para realizar una digestión con tripsina a 37ºC.
Los péptidos resultantes fueron analizados por espectrometría de masas MALDI-TOF
TOF en un instrumento Applied Biosystems 4800-Plus. Cada muestra de los péptidos
fue mezclada con un volumen igual de una solución saturada de ácido a-ciano-4-
hidroxicinámico en 50% de acetonitrilo con O, 1 % TF A, y 1 µL de la mezcla se aplicó
sobre una placa Opti-TOF.
Una vez secas, las muestras se analizaron en modo reflector positivo, utilizando una
intensidad del láser de 3000 y 1625 disparos por espectro. Los espectros se analizaron
usando ProteinPilot 4.0 (Applied Biosystems) o MASCOT
((http://www.matrixscience.com) frente a las bases de datos existentes de proteínas
(UniProt/SwissProt/NCBI) para obtener identificaciones, además, fueron interpretados
manualmente para derivar secuencias de novo de aminoácidos.
Las secuencias obtenidas se sometieron a búsqueda en BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) para buscar similitudes con familias de las proteínas
(Femández et al. 2011). Para los análisis de espectrometría de masas, se contó con la
colaboración experta del Dr. Bruno Lomonte, investigador responsable del Análisis de
Espectrometría de Masas en el Instituto Clodomiro Picado.
17
8. Detección de acetilcolina en el veneno de D. krausi
Con el fin de determinar si el veneno de D. krausi contiene el neurotransmisor
acetilcolina (ACh), se utilizó la espectrometría de masas mediante ionización por
electrospray (nESI-MS/MS). Para ello, se analizó primeramente una muestra comercial
de acetilcolina (Sigma).
Previamente, la ACh comercial se purificó mediante RP-HPLC en una columna C18
(250 x 4,6 mm) eluída a 1 mL/min con un gradiente de agua a acetonitrilo con 0,1 % de
ácido trifluoracético, desde 0% hasta 70% de la siguiente manera: 5 mina 0%, de 0% a
28% en 23 min, y finalmente 2 mina 70%. El pico mayoritario (absorbancia a 215 nm)
se recolectó y se analizó mediante espectrometría de masas.
La masa de la ACh comercial se determinó en un instrumento QTrap3200® (Applied
Biosystems) mediante infusión directa en una fuente nanospray. En breve, se diluyó el
ACh estándar (4 mg/mL en agua) a partes iguales con una solución de acetonitrilo al
50% con O, 1 % de ácido fórmico, y se colocó 1 O µL de esta dilución en un capilar
metalizado (Proxeon). La muestra se ionizó a 1300 V y se analizó en modo positivo
( enhanced MS) para obtener la masa de la molécula intacta. Posteriormente, el estándar
se sometió a fragmentación inducida por colisión (CID) para obtener su patrón de iones
producto.
Con base en esta información, se analizó una muestra del veneno de D. krausi, bajo las
mismas condiciones (10 µL de una solución de 2 mg/mL), con el fin de detectar la
posible presencia de la molécula con la misma masa observada para el estándar de
acetilcolina.
9. Construcción de biblioteca de ADNc y análisis de secuencias
Se construyó una biblioteca de ADN complementario (ADNc) de la glándula de veneno
de D. krausi, en colaboración de los Doctores Elia Diego-García, Bea Mille y Jan
Tytgat del Laboratorio de Toxicología, Universidad de Leuven, Campus Gasthuisberg,
Leuven, Bélgica. Para ello, se utilizó ARNm total, el cual fue conservado en una
solución de ARN later y extraído del telson de tres especímenes de D. krausi, posterior
a cinco días de extracción. Para la síntesis de la hebra de ARN se usó TRizol (Sigma) y
con el fin de obtener el ADN se realizó un PCR-larga distancia (LD-PCR).
18
Para la construcción de una biblioteca de ADNc, se usó el kit SMARTer PCR de
síntesis de ADNc (CLONTECH). El ADNc fue clonado en un vector pGEM
(PROMEGA) y la ligación fue transformada en Escherichia coli DH5a (InvitroGen) por
medio de electroporación.
Se hizo una selección de colonias por color (blancas/azules), y se hizo PCR de las
colonias usando primers T7 y SP6, y para corroborar los productos de este se realizó
una electroforesis de gel de agarosa.
Únicamente se cultivaron los clones con más de 350pb en un medio Luria Bertani con
100 mg/ml de ampicilina (Sigma) y se utilizó el kit de aislamiento de plásmidos
(Roche) para la preparación de muestras para la secuenciación con los primers T7 y SP6
(GATC Biotech sequencing service).
9.1. Alineamientos y análisis bioinformáticos
Las secuencias obtenidas fueron examinadas con el algoritmo Pherd, y se seleccionaron
únicamente secuencias con más de 400 bases que poseían calificaciones de calidad
mayores a 20, luego los marcadores de secuencia expresada (ESTs) fueron agrupados y
ensamblados con el programa CAP3 (http://asparagin.cenargen.embrapa.br/phph/). Las
secuencias homólogas se buscaron en BLASTX y BLASTN
(http :/lb last.nc bi.nlm.nih. gov /B las t. c gi).
Para buscar los marcos de lectura abiertos (ORFs), las secuencias fueron sométidas a
ExP ASy (http://web.expasy.org/translate/) con un alineamiento elaborado por
ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalw2/). Después del alineamiento,
tanto el péptido señal, como el sitio de escisión, se predijeron con SignalP
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) y ProP
(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProP/), respectivamente.
10. Determinación de composición de la fracción coloreada
Para la obtención de la composición química de la fracción coloreada se trabajó en
colaboración con el Dr. Renato Murillo, quién realizó un análisis de espectrometría de
masas de alta resolución (HR-MS), utilizando un espectrómetro de masas Thermo
Exactive con un analizador tipo Orbitrap (Thermo Fisher). Luego, en el laboratorio del
Centro de Investigaciones en Productos Naturales (CIPRONA) de la UCR, se
19
obtuvieron mediciones de 1H-RMN y 13C-RMN para el compuesto de la fracción, con
un espectrómetro de resonancia magnética nuclear Bruker Ascend 600 MHz, a una
frecuencia de 600 MHz para mediciones 1H-RMN y 125 MHz para 13C-RMN,
respectivamente.
11. Análisis de los datos
Se calculó el promedio y error estándar para todos los datos de las mediciones
bioquímicas tanto para los grupos de tratamiento, como los controles.
El efecto citotóxico del veneno de escorpión sobre las líneas celulares se analizó por
medio de un análisis de comparaciones múltiples de Bonferroni con el programa
GraphPad.Para el cálculo de IG50, LD20 e inhibición de crecimiento de las líneas
celulares tratadas se utilizó el programa SlideWrite 6.
Para la determinación de los niveles de óxido nítrico en el sobrenadante del cultivo
celular de macrófagos según tratamientos, se realizó una prueba de contrastes planeados
con SPSS.
En el caso para proteólisis con azocaseína por cada concentración de veneno, se aplicó
una regresión polinomial de tipo cúbica con el programa SPSS. Durante todas las
pruebas estadísticas se establecieron diferencias significativas entre grupos con un nivel
de p < 0.05.
Además, se realizó un análisis de componentes principales para determinar los
componentes que explican las diferencias de los componentes entre los grupos de
escorpiones.
20
RESULTADOS
Actividad citotóxica del veneno de D. krausi
Tras el análisis de la dependencia en la concentración del veneno crudo y su grado de
toxicidad en las líneas celulares excitables (C2C12 y PC12) y no excitables, se observó
una relación de dosis-respuesta, en donde se encontraron diferencias entre las tres líneas
celulares (F=4.543; p= 0.0144; gl= 2,63) y entre las concentraciones del veneno crudo
aplicado (F=71.78; p< 0.0001; gl= 6,63).
Para todas las células estudiadas, a concentraciones menores a 7.8 µg/ml de veneno,
hay crecimiento celular mayor al 90%, pero al ir aumentando las concentraciones de
veneno, este porcentaje empieza a disminuir. Específicamente se encontró que la
inhibición total del crecimiento (TGI) para C2C12 se presenta a una concentración de
14.7 µg/ml, para la línea PC12 a 16.1 µg/ml y para L929 a 28.4 µg/ml. Por arriba de
estas concentraciones se produce muerte celular, donde la concentración letal al 20%
(LC20) para los rnioblastos fue de 17.4 µg/ml, para las células cromafines se presentó en
la concentración de 16.5 µg/ml, mientras que para los fibroblastos fue a los 46.8 µg/ml
(Fig. 4).
Por otro lado, se obtuvo que las concentraciones a las cuales se observó la disminución
del 50% del crecimiento celular (IG50) fue menor para la línea de los C2C12 con 10.5
µg/ml, mientras que para las células cromafines PC12 se obtuvo a 15.1 µg/ml y el
mayor valor fue de 17.9 µg/ml, para los fibroblastos L929 (Fig. 4).
Además, se obtuvo que a la concentración de 15.6 µg/ml fue donde se observaron
diferencias significativas entre las líneas celulares C2C12 y L929 (p<0.01) y entre
C2C12 y PC12 (p<0.05). No obstante, no se encontraron diferencias entre las líneas
PC12 y L929, a esta concentración (Fig. 4).
2.0
Log Concentración de veneno (µ.g/ml)
....,_ C2Cl2
-• · L929 ..... PC12
21
728453
Figura 4. Porcentaje de crecimiento celular de las líneas C2Cl2, PC12 y L929 al
aumentar la concentración de veneno (µg/ml) de D. krausi. (*)El crecimiento celular en
C2Cl2 difiere significativamente respecto a L929 (p< 0.01) y PC12 (p<0.05) en la
concentración de 15.62 µg/ml.
Actividad proteolítica del veneno de D. krausi
Se encontró que el veneno de D. krausi posee actividad proteolítica sobre azocaseína,
reflejada como un aumento en la absorbancia (R2=0.97; F= 67.93; gl=3,5; p< 0.0001)
(Fig. 5).
Veneno (µg)
Figura 5. Actividad proteolítica del veneno crudo de D. krausi sobre azocaseína
(R2=0.976).
22
Por otra parte, el veneno crudo en estudio mostró actividad proteolítica sobre gelatina,
determinada por zimografía. Esta actividad proteolítica fue detectada en la banda
señalada con una flecha en la Figura 6, la cual posee un peso molecular de
aproximadamente 23 KDa, que parece corresponder a la fracción Dk-12 del veneno
estudiado.
250 150 100 75
50
37
25 1
1
20 ... 15
10
Figura 6. Gel de SDS-PAGE-gelatina del veneno crudo de D. krausi. Banda con
actividad gelatinolítica señalada con la flecha.
Producción de Óxido Nítrico
Después del análisis del sobrenadante de cultivo celular de macrófagos, no se
observaron diferencias significativas de los niveles de óxido nítrico entre los
tratamientos y el control, esto en las células que no tuvieron estimulación previa de
LPS, (t=-0.711; gl=15; p=0.488).
Pero, al pre-estimular con LPS, las células tratadas con diferentes concentraciones de
veneno produjeron menor concentración de N02 que las células control (t=-5.413;
23
g1=15; p< 0.0001). A pesar de lo anterior, no se observaron diferencias entre los
tratamientos, por lo que parece ser que esta respuesta no es dosis dependiente (Fig. 7 A).
Por otro lado, el porcentaje de viabilidad celular determinado por el ensayo de MTT,
fue muy cercano al 100% tanto en las células control, como en aquellas tratadas con el
veneno de D. krausi (Fig. 7B), por lo que podemos afirmar que el efecto de disminución
de NO, se debe a un efecto del tratamiento y no a una disminución en la viabilidad de
macrófagos presentes.
A
-::!: ::1.
N o z
B
10
8
4
o
o
15
Concentración (µg/ml)
15
Concentración (µg/ml)
30
30
Figura 7. (A) Concentración de nitritos (Non en células macrófagos J774 con LPS
ante tratamientos de veneno crudo de D. krausi a 15 y 30 µg/ml y en el control (O
µg/ml). (B) Porcentaje de viabilidad celular en las células J774 de macrófagos murinos,
al aplicar el a 15 y 30 µg/ml veneno de D. krausz y sin este (O µg/ml) sin previo
tratamiento de LPS
24
Caracterización de las fracciones de veneno de D. krausi
Al separar el veneno de D. krausi por medio de HPLC de fase reversa, se obtuvieron 18
fracciones (Fig. 8), las cuales fueron analizadas mediante electroforesis (SDS-PAGE).
De las anteriores, las fracciones 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17 y 18 presentaron
bandas proteicas en el gel (Fig. 8 recuadros). El peso molecular de estas, se encuentra
en un rango de 4.6-173.4 KDa (cuadro 1). El 78.13% de estas bandas corresponde a
proteínas de bajo peso molecular menor a los 50 KDa (Fig 9).
-E 4000J = 5
2~0 -· 1!'0 -100- --¡5-··-
?~---·
!O ---15 · -IO ··-
---- -
-l('¡ ' ft '
~I 10 11 1: 13 U l~ I~ 17 IH -N -C':I 8 ·~
= 6 C':I .= 5 ~
.= ~
o 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (ruin)
Figura 8. Cromatografía de elución del veneno de Didymocentrus krausi en HPLC fase
reversa en una columna C1s. Las fracciones fueron analizadas por SDS-PAGE (5-20%)
bajo condiciones reducidas (en el recuadro). (M) corresponde a los marcadores de peso
molecular (kDa).
90
25
Cuadro l. Peso molecular (KDa) de fracciones proteicas analizadas por SDS-PAGE (5-
20%) bajo condiciones reductoras.
Número de Peso molecular fracción estimado (KDa)
5 9.00
6 8.43
7 9.22
83.09 75.95
9 68.60 11.37 9.73
10 8.48 6.88
11 5.35
9.74
12 8.19 5.51 5.00
27.41
13 14.77 5.56 4.91
14 13.67 4.59
49.91 15 43.71
37.71
17 44.54
39.96 173.40 165.43
18 123.80 50.88 17.57 4.86
1
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Peso Molecular (KDa)
Figura 9. Frecuencia de los pesos moleculares (KDa) correspondientes a las bandas
proteicas obtenidas en el gel de gradiente (5-20%).
26
A partir de las bandas proteicas digeridas y analizadas mediante MALDl-TOF-TOF, se
obtuvieron las masas de los iones fragmentados y las secuencias peptídicas de los
componentes del veneno. Se identificaron pequeños fragmentos de secuencia de
aminoácidos, los cuales podrían localizarse dentro de cuatro familias proteicas. Dentro
de estas, se encuentra una metaloproteinasa similar a astacina (valor e=0.009)
correspondiente a la masa 1187.6 Da de la fracción nueve (Dk-9) del veneno de D.
krausi (Fig 1 O).
A partir de la fracción once (Dk-11 ), la masa de 1272.7 Da se identificó como una
cisteína peptidasa similar a catepsina O (valor e= 0.020) (Fig 11). En la Dk-13, la
proteína encontrada fue similar a elastasa (valor e= 0.57) y se identificó a partir de dos
secuencias de masas de 1222.7 y 1542.8 Da (Fig 12).
Finalmente, de la fracción Dk-18, se obtuvo una de masa 1601.9 Da que podría
corresponder a una leucina aminopeptidasa, ya que a pesar de que esta presentó un
valor e mayor (valor e=6.1) (Fig. 13) posee un patrón de elución en la cromatografía,
que podría sugerir que se trata de una proteasa, porque este tipo de proteínas tienden a
separarse en los últimos minutos en las cromatografías de este tipo.
27
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Figura 12. (A, C) Secuencia de aminoácidos obtenida manualmente e identificada como una
proteína similar a elastasa, a partir del (B) espectro de MS/MS para las masas de 1222.7 Da y
(D) el espectro de MS/MS para la masa de 1542.8 Da, respectivamente.
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31
Detección de acetilcolina en el veneno de D. krausi
El estándar de Acetilcolina correspondió a una fracción predominante en la
cromatografía, al minuto 3.752 (Fig.14). El espectro de masa (MS) de dicho estándar
(Fig.15A) con miz 146.2 Da y su correspondiente espectro de fragmentación (MS/MS)
en iones miz 87.1y60.1 Da se muestran en la figura 15B.
Al observar el espectro de masas (MS) del veneno crudo de D. krausi (Fig. l 5C)
analizado bajo las mismas condiciones, las fracciones de mayor intensidad que se
encontraron fueron de miz 253.1, 191.2, 159.2, 143.1, 273.3 y 231.2 Da, los cuales
corresponde a un espectro miz muy diferente al obtenido para ACh. La masa de miz
146.2 Da observada para ACh tampoco se obtuvo en fracciones menores, por lo tanto se
puede inferir la ausencia de ACh en el veneno de este escorpión .
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Figura 14. Cromatografía de HPLC del estándar comercial de acetilcolina (Sigma) se
observa en el minuto 3.774
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32
Figura 15. (A) Espectrometría de masas mediante ionización por electrospray (nESI
MS/MS) del estándar de acetilcolina, (B) espectro de fragmentación (MS/MS) de
acetilcolina, (C) espectro de masas (MS) del veneno crudo de D. krausi
Construcción de biblioteca de ADNc y análisis de secuencias
33
A partir de la biblioteca de ADNc construida de las glándulas de veneno de D. krausi,
se encontró un total de nueve secuencias relacionadas con veneno de escorpión. La
identidad, así como la secuencia de aminoácidos de cada una, se presentan en la figura
16, en la cual se muestran todas las secuencias totales o parciales y donde se identifica
la sección de péptido señal y la secuencia madura. Todo lo anterior se resume en el
Cuadro2.
Se identificaron seis péptidos sin puentes disulfuro, específicamente clasificados como
péptidos antimicrobianos. De estos, las secuencias CR3_DiK_508_clusterl, CR5_39,
Contig_l, CRl 1_851, fueron identificadas como péptidos del tipo NBDP, y las
secuencias CR5 _ Cluster2 y Contig_ 15 mostraron similitud con péptidos de heterin-2 y
marcin-18, respectivamente (Fig. 16). Además, se encontró una secuencia parcial
identificada dentro de la familia de péptidos de porinas· 3, cuyos residuos son
GIQLHLSTMIDGKNFNQGGHK (valor-e=l,74e-3).
Por otro lado, se encontraron algunas secuencias con presencia de puentes disulfuro. De
estos, se identificó la secuencia total de una neurotoxina similar a ~-KTx, que afecta
canales iónicos (Fig. 16). También se encontró dentro de la secuencia total de
DiKLIB14,
MGSNMLLLNWNNHKTNVVDEFQQLFSRSELTDVTLVCEDFSLQAHKAVLSAS
SLFFRNMFLHNPCTLR, un dominio que se encuentra en las proteínas de dedos de
zinc, de la familia BTB/POZ (valor-e=l.37e-12) y que corresponde a los residuos 21 al
64. Finalmente, se identificó también una toxina putativa a partir de la secuencia
CR11_912 (Fig. 16).
34
Adicionalmente, se obtuvieron secuencias completas o parciales de proteínas
relacionadas con función celular, entre ellas: proteína relacionada a tirosina-quinasa,
acil-CoA deshidrogenasa, factor de elongación 1-gamma, subunidad 6C de citocromo C
oxidasa, proteína 60S ribosomal, complejo de proteína 1 de accesibilidad a cromatina,
factor liberador de histamina y una proteína similar a ubiquitina- L40 ribosomal.
Cuadro 2. Análisis de secuencias de las bibliotecas de ADNc de D. krausi: CR3, CR5,
CRl 1con215 clones totales y 115 secuencias de ADN.
Clon/Contig Identidad
CR3 DiK 508 cluster 1 Péptido sin puentes disulfuro antimicrobiano (NDBP) 6.2
CR5 Cluster2 Péptido sin puentes disulfuro antimicrobiano Heterin-2
CR5 39 Péptido sin puentes disulfuro (NDBP) 4.3
DiKLIB14 Proteína dedos de zinc, con dominio BTB/POZ
CRl 1 853 Péptido similar a P-KTx
Contig_ l Péptido sin puentes disulfuro antimicrobiano
CRl 1 851 Antimicrobiano, péptido sin puentes disulfuro 4.3
Contig_ 15 Antimicrobiano, péptido sin puentes disulfuro Marcin-18-1
CRl 1 912 Toxina putativa
CR11_898 Péptido putativo porina-3
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37
Determinación de fracción coloreada
A partir de la prueba de MS de alta resolución (Anexo 2), se encontró que la fracción
correspondiente a Dk-8, la cual es la fracción coloreada del veneno, posee una masa de
231.01496 Da y compatible con una fórmula molecular es C9H1103S2.
Del espectro de 1H-NMR (Anexo 3), se obtuvo que este compuesto presenta dos grupos
S-CH3 y un grupo O-CH3; Además, se encontró que los seis carbonos restantes forman
un anillo de benceno, así como la presencia de dos grupos carbonilo en su estructura.
Estos resultados, aunado a que este compuesto posee un color rojizo permite deducir
que el compuesto coloreado corresponde a una paraquinona. A partir del espectro de 13C-NMR (Anexo 4), se encontró que los grupos sustituyentes antes mencionados y el
anillo de benceno poseen la estructura que se presenta en la figura 17.
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Figura 17. Estructura molecular de una paraquinona identificada en el veneno de D.
krausi. (A). Datos espectroscópicos obtenidos a partir del espectro 1H-RMN de
compuesto, en CDC13, 600 MHz en ppm. (B). Datos espectroscópicos obtenidos a partir
del espectro 13C-RMN de compuesto, en CDC13, 125 MHz en ppm
38
DISCUSIÓN
El veneno de D. krausi se puede describir como una mezcla de péptidos no enzimáticos,
junto con compuestos que permiten su coloración y una baja proporción de algunas
enzimas. En cuanto a las actividades biológicas, este veneno posee propiedades
caseinolíticas, gelatinolíticas, así como citotóxicas y de regulación inmune.
Estos compuestos fueron identificados mediante pruebas de proteómica y de
transcriptómica, pero al analizar los perfiles de proteínas del veneno no coinciden con
los obtenidos con el ADNc. Según Luna-Ramirez et al. (2013) esto podría deberse a
que un gran número de proteínas. expresadas en las glándulas no son liberadas en el
veneno inyectado por el escorpión, por lo que muchas de las secuencias reportadas en
las pruebas de ADNc, realmente no se encuentren en el veneno analizado de D. krausi.
Además, podría ser que algunas de estas proteínas reportadas únicamente para la
biblioteca de ADNc se encuentren en la fase no soluble del veneno de este escorpión y
esta fase del veneno no fue analizada por medio de espectrofotometría de masas o que
las secuencias expresadas sufran de cambios post-traduccionales (Abdel-Rahman et al.
2013).
Por otro lado, estas diferencias se han atribuido a que el veneno crudo usado para
pruebas de espectrometría de masas no es extraído de la misma glándula usada para la
construcción de bibliotecas de ADNc y se conoce que hay diferencias intraespecíficas
dentro del veneno de escorpiones, aún dentro de la misma población de estos arácnidos
(Abdel-Rahman et al. 2013).
Además, durante el análisis de las secuencias obtenidas por espectrometria de masas y
al alinear las secuencias obtenidas en el programa BLAST, no siempre se pudo
determinar un péptido específico, debido a la falta de información en las bases de datos
de proteínas provenientes de venenos de escorpiones (Abdel-Rahman et al. 2013).
Históricamente, los venenos de escorpiones han sido clasificados en dos grandes
grupos: los que comparten muchas características con venenos de la familia Buthidae,
conocidos como veneno de bútidos, y el resto que no las poseen, se les clasifica
conjuntamente como no-bútidos (He et al. 2013). A pesar de esto, cada vez más se
publican estudios de venenos de diferentes familias de escorpiones no butidos, que
39
permiten esclarecer un poco más sobre la evolución y las características de los venenos
en el orden de Scorpiones, y señala que hay venenos que comparten algunas
características con ambos grupos y no se pueden clasificar estrictamente como antes se
acostumbraba en bútidos y no-bútidos (He et al. 2013).
Lo anterior se refleja en familias como Chaerilidae (He et al. 2013) o como en el caso
del veneno estudiado en este trabajo, ya que si se compara la composición de este
veneno con los venenos de especies de bútidos y no-bútidos, se muestra que este
escorpión posee algunos componentes clasificados como estrictamente de un veneno de
bútido, como es el caso de ~-KTx (Ma et al. 2009) y los péptidos NDBPs, que suelen
tener más funciones citolíticas, y que son encontrados frecuentemente y en mayor
concentración en venenos de escorpiones no-bútidos (Kuhn 2003; He et al. 2013).
Algunos otros componentes, como las proteasas han sido encontradas en varias familias
como: Buthidae, Liochelidae, Chaerilidae, Scorpionidae (Silva et al. 2009; Alvarenga et
al. 2012; He et al. 2013; Cerda-Costa & Gomis-Rüth 2014; De Oliveira et al. 2015) y
así como en este veneno de D. krausi (Cuadro 3).
Aparte de lo anterior, uno de los componentes que resulta innovador en el grupo de
escorpiones, y que no ha sido reportado previamente para ninguno, es la paraquinona
encontrada en este veneno. Esta molécula parece ser muy específica para la subfamilia
Diplocentrinae, ya que aunque no se ha comprobado su presencia en el veneno de Nebo
sp (Scorpionidae: Diplocentrinae ), este veneno posee una coloración rojiza (Rosin
1973) similar a la de D. krausi, lo que parece indicar que los escorpiones dentro de esta
subfamilia, presentan estos compuestos en su veneno.
En otros grupos de artrópodos se ha encontrado diferentes tipos de quinonas en
secreciones, como algunos diplopodos con fluidos de color morados, las cuales se
liberan de glándulas exocrinas y que poseen hidroquinonas, quinazolinonas y
benzoquinonas, y que además, son tóxicas y causan parálisis si llegan a ser consumidos
por otros artrópodos (Vujisic et al. 2014). Otro caso son las 1,4-benzoquinonas
presentes en excreciones de opiliones y cucarachas que actúan como repelentes,
provocando irritación y mal sabor, y con propiedades antimicrobianas (Eisner 2004).
El hecho de que estas quinonas estén únicamente en esta subfamilia de escorpiones, no
está claro, pero se podría pensar que la presencia del compuesto paraquinona en el
veneno de D. krausi, podría ser un metabolito resultado de la esclerotización de la
40
cutícula del escorpión, ya que este tipo de moléculas también se han encontrado
involucradas en el este proceso de la formación de la cutícula de algunos artrópodos, en
donde acildopaminas se oxidan en ortoquinonas, que posteriormente se polimerizan y
forma una matriz (Nilius et al. 2008; Andersen 201 O). Debido a lo anterior, no se podría
descartar que la presencia del compuesto paraquinona en el veneno de D. krausi, podría
darse como consecuencia de la esclerotización del escorpión, y que además este
compuesto podría dotar de ciertas propiedades al veneno, a continuación discutidas, que
le resulten ventajosas a este escorpión.
Como la mayoría de venenos de escorpiones dentro de las familias: Scorpionidae,
Urodacidae, Hemiscorpiidae, Vaejovidae y Buthidae, el veneno de D. krausi consiste en
una mezcla de diferentes compuestos (Abdel-Rahman et al. 2014). No obstante, este
veneno con solo 18 fracciones, parece ser menos complejo en comparación con otros,
algunos de los cuales pueden tener más de cien péptidos diferentes (Possani et al. 2000;
Abdel-Rahman et al. 2013).
Sin embargo, parece que dentro de la familia Scorpionidae y otros no butidos, es
común observar venenos quepresentan pocas fracciones, como en el caso de
Heterometrus longimanus con 21 fracciones (Bringans et al. 2008) y en el veneno de
Heterometrus petersii que posee 30 fracciones (Ma et al. 2010), lo cual podría indicar
una tendencia a poseer venenos con relativamente pocos compuestos.
A pesar de lo anterior, los relativamente pocos compuestos encontrados, podrían
explicar las propiedades citolíticas, proteolíticas y de modulación inmune (Remijsen et
al. 2010), presentes en este veneno. El veneno de D. krausi es citotóxico para cultivos
celulares, y los NDBP que lo componen podrían explicar la citotoxicidad observada
sobre las células C2Cl2, PC12 y L929 (Zeng 2005). Estos péptidos sin puentes
disulfuro, pueden ingresar a las células por endocitosis, o formar poros en las
membranas celulares (Omran 2003), perturbando la estabilidad de la membrana
plasmática, lo que permite un flujo de iones a través de su gradiente de concentración
que resulta en cambios osmóticos (Powers et al. 2003).
Como consecuencia de este flujo iónico, puede presentarse un aumento en calcio
intracelular (Ca2+ ¡), que puede llevar a cascadas apoptóticas o necróticas en modelos in
vitro (Kenedy et al. 2009). Este aumento en Ca2+ celular, puede provocar la activación
de proteasas, como las calpainas y catepsinas, las cuales son las responsables de la
41
degradación celular del citoesqueleto, de bombas de iones, daño a la membrana
mitocondrial (Zargan et al. 2011), y por ende disminución en la producción de ATP y
aumento de radicales libres (Kenedy et al. 2009) que en conjunto conllevan a muerte
celular en poco tiempo. Lo anterior se denomina como excitotoxicidad (Dong et al.
2006} y se presenta en células excitables, lo cual podría explicar que el veneno afecte
más a las células de C2Cl2 y PCl2.
Otros de los componentes presentes en el veneno de D. krausi que podrían contribuir a
la toxicidad celular, son las quinonas (Bolton et al. 2000). Este compuesto, además de
dar color rojizo a este veneno, y encontrarse como gran proporción de las fracciones de
este, pueden interactuar con grupos nucleofilicos en ciclos de reducción-oxidación,
generar radicales libres, inducir rupturas en las cadenas de ADN e interferir en la
respiración celular. Estas moléculas también pueden causar un aumento en Ca2+
citosólico y formación de protuberancias en la membrana plasmática, llevando a la vía
de muerte celular (Monks et al. 1992).
Estas quinonas podrían estar afectando a todas las líneas celulares estudiadas, ya que no
se ha reportado que haya alguna relación entre la citoxicidad y el tipo de línea celular.
En cambio, lo que sí podría contribuir a esta actividad de citotoxicidad, es la alta
proporción de esta molécula en el veneno, representada como una fracción grande en la
cromatografía de alta afinidad.
Por otro lado, la presencia de actividad proteolítica ·por parte del veneno crudo de D.
krausi, comprueba la presencia de componentes enzimáticos en este veneno, lo cual fue
corroborado por la identificación de proteasas encontradas en los análisis de
espectrometría de masas. Específicamente, la actividad gelatinolítica podría darse
gracias a la presencia de metaloproteínasas y proteasas similares a catepsinas, ya que
estas enzimas han sido relacionadas con remodelación de tejido y la degradación de
colágeno (Gomis-Rüth et al. 2012; Cerda-Costa & Gomis-Rüth 2014), permitiendo la
dispersión de otras proteínas del veneno, por medio de un aumento en la permeabilidad
en el tejido y de la matriz extracelular (Carmo et al. 2014).
El veneno crudo de D. krausi promovió la disminución de los niveles de NO en
macrófagos J774 pre-tratados con LPS. El NO, tiene diversos efectos biológicos, en
especial a nivel inflamatorio (Tripathi 2007; Zargan et al., 2011), y es sintetizado a
42
partir de L-arginina, por la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) (Kim et al.
2005), presente en estas células (Nussler et al. 1993).
Esta disminución en la concentración de NO presentada por el veneno en estudio,
podría resultar de varios mecanismos no mutuamente excluyentes. Por un lado, el efecto
de la paraquinona en la expresión de enzimas, segundo por efecto de cambios en
corrientes iónicas de potasio y el tercero, por un efecto en la desestabilización de la
membrana de estos macrófagos. En el primer caso, se conoce que en las células de
mamíferos la expresión de la iNOS resulta de la activación del factor de transcripción
nuclear NF-KB y de la proteína de activación 1 (APl) (Kim et al., 2005) y que la
inhibición de NF-KB ha sido reportada por compuestos que poseen quinonas en su
estructura, impidiendo la expresión de la enzima iNOS, y como resultado promoviendo
una disminución de la concentración de NO (Dirsch et al. 1997).
El segundo factor que puede causar una disminución en NO, es la reducción de
corrientes de K+ en los macrófagos, afectando alguna de las vías de señalización
intracelular que induce la activación de iNOS (Lowry & Goldberg 1998). Lo anterior
podría suceder por el bloqueo de los canales de K+ por medio de neurotoxinas P-KTx,
como la encontrada en el veneno de D. krausí, lo que modularía las células inmunes
(Fialho et al., 2011).
Por otro lado, se han reportado que algunas proteínas de tipo NDBP pueden ser posibles
causantes de la inhibición en la liberación del NO en otros venenos de escorpiones
(Almaaytah & Albalas, 2014). Ya que estas proteínas desestabilizan las membranas
celulares, lo que conlleva a una modulación de la activación de los macrófagos y -
consecuentemente- la disminución de niveles de NO, sin que medie muerte celular.
La variación en venenos de escorpiones resulta de fuerzas selectivas que actúan de
forma desigual en sus diferentes componentes y que evolutivamente se ha adaptado
para cumplir distintas funciones (Sunagar et al., 2013). De manera general, los venenos
pueden tener un papel más defensivo o pueden ser más tróficos, empleados mayormente
en la inmovilización de presas relativamente difíciles. En otros casos, podrían tener un
papel menos preponderante en la ecología de la especie.
Las especies de la familia Buthidae, poseen pedipalpos más largos y menos robustos, y
suelen tener relativamente menor fuerza de agarre en ellos; pero tienen un metasoma
43
desarrollado con un telsón grande, donde se produce veneno que suele ser más
complejo y tóxico (menores LD50) en relación con otros escorpiones. En esta familia,
el envenenamiento suele ser más frecuente tanto a la hora de capturar presas como de
defenderse, lo que sugiere un rol activo del veneno en la ecología de las especies
(Morgenstem & King, 2013).
En contraste, escorpiones de las familias Liochelidae y Scorpionidae, poseen quelas
grandes y con mayor fuerza de agarre, pero tienden a poseer venenos menos potentes y
menos diversos que sus contrapartes bútidos (van der Meijden et al. 201 O; van der
Meijden et al. 2012; Morgenstem y King, 2013). En estos casos, las presas suelen ser
tomadas principalmente por medio de las quelas y solo infrecuentemente, y si es
necesario, envenenadas mediante picaduras del acúleo (Sollod et al. 2005). Como
otros miembros de este último grupo, D. krausi posee quelas relativamente grandes,
telson muy pequeño y un veneno poco complejo, lo que pareciera indicar que el veneno
no cumple un tan activo papel en la ecología de la especie.
Con respecto a los componentes en los diferentes grupos, la existencia de componentes
comunes a butidos y no butidos indica que el reclutamiento de esos componentes
ocurrió antes de la separación de esas líneas de escorpiones. Mientras que los
componentes exclusivos de no butidos, parecen indicar que esos linajes lograron
adquirir toxinas novedosas que posiblemente cumplan un rol particular en los nichos
ocupados por estos grupos.
Lo anterior, se puede explicar con el análisis de compontes principales (Fig. 18), en
donde se observa que los Componente 1 es explicado por NDBP y otros péptidos,
mientras que el Componente 2 corresponde a Proteasas y Na-Toxinas, los cuales en
conjunto, explican el 59% de la variación de estos venenos.
Por otro lado, la morfología y hábitos de D. krausi parecieran señalar un papel menos
protagónico del veneno en la ecología de esta especie. Sin embargo, los componentes
que se encontraron en este estudio y el hecho que se ha observado a la especie utilizar el
telson para inocular presas en cautiverio, parecen indicar un papel más activo del
veneno.
Este papel parece centrarse en la función trófica del veneno, mientras que la defensiva
pareciera estar más disminuida. Ya que en primer lugar, no se encontró ninguna
44
molécula en el veneno crudo que induzca dolor local, como ACh, que produzca efectos
sistémicos como para provocar la huida o muerte de algún potencial depredador,
componentes que son comunes en los venenos de especies que los utilizan por defensa
(Nirthanan et al. 2002).
En condiciones de cautiverio, se ha observado que este escorpión usa principalmente las
quelas para inmovilizar a su presa, pero también las pican múltiples veces con el aculeo,
presentando luego menos movimiento, lo que se apoya más la hipótesis de uso de
veneno para alimentación. Además, algunos componentes observados en este veneno
como la neurotoxina ~-KTx, podrían estar involucrados en inmovilización de
artrópodos pequeños, y la lisis celular y degradación de la matriz extracelular también
se asocian más a funciones tróficas que defensivas.
Sin embargo, estas observaciones no implican que el veneno no sea usado del todo en
funciones defensivas. Por ejemplo, si el escorpión es inmovilizado del prosoma se
observa que para defenderse utiliza ambas quelas pero también el telson, por lo que
probablemente este escorpión recurra al uso del veneno en momentos críticos (Fig. 19).
Tanto la producción, como la inyección del veneno son considerados procesos con una
alta demanda metabólica, por lo que el veneno suele emplearse, en casos que realmente
se amerite (van der Meijden et al. 2015). Así, la reticencia de D. krausi a emplear
activamente su veneno, parece corresponder a sus hábitos y el nicho ecológico que
ocupa. La especie es fosorial, y rara vez es visto en la superficie, aunque es abundante
bajo piedras y troncos a lo largo de su distribución, y parece estivar gran parte de la
temporada seca en grietas en el suelo, de manera que es poco visible a potenciales
depredadores. Al parecer se alimenta de presas pequeñas, que son capturadas y
manipuladas casi enteramente por sus fuertes quelas.
El veneno de esta especie, revela similitudes tanto con venenos de bútidos, como con
los venenos reportados para algunas especies de escorpiones no-bútidos, lo que refuerza
que la composición de venenos difiere entre linajes. Las características del veneno, en
adición a la morfología del telsón, y su baja frecuencia de uso, parecen indicar una
utilización más restringida del veneno en esta especie, posiblemente más asociado a
funciones tróficas, que defensivas.
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48
Figura 18. Análisis de componentes principales. Donde el componente 1 corresponde a NDBP
y otros péptidos, y el componente 2 a toxinas que afectan canales de Na+ y proteasas.
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Figura 19. Respuestas obtenidas al inmovilizar a Didymocentrus krausi y Centruroides
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49
CONCLUSIONES FINALES
El veneno del escorpión D. krausi está compuesto por varios polipéptidos: i) péptidos
no enzimáticos, los cuales corresponden a péptidos no estabilizados por puentes
disulfuro y una neurotoxina B-KTx. ii) en menor proporción se presentaron algunas
enzimas, iii) La presencia de una paraquinona, que permite la coloración rojiza del
veneno y podría ser responsable de algunas propiedades citotóxicas y de regulación
inmune por parte de este veneno.
Con respecto a las actividades biológicas in vitro, el veneno presentó actividad
citostática a bajas concentraciones, y posteriormente actividad citotóxica a
concentraciones mayores, afectando a las tres líneas celulares evaluadas, por lo que el
veneno tiene un efecto más generalista y que no es específico sobre las células
excitables. Esto probablemente por acción de NDBPs presentes en este veneno.
El veneno presenta actividad proteolítica sobre diferentes sustratos, asociada a la
presencia de proteasas encontrada en análisis de proteómica. Esto podría permitir
remodelación del tejido y dispersión de otros componentes del veneno.
La composición del veneno de D. krausi revela similitudes, tanto con venenos de
bútidos, como con los venenos reportados para otras especies de escorpiones no
bútidos, además posee una paraquinona única en el grupo, lo que refuerza la hipótesis
de que la composición de venenos difiere entre familias"
Debido a que se encontró que el veneno es poco complejo, al comportamiento fosorial
y a las características morfológicas de este escorpión, con pedipalpos muy grandes,
poco flexibles se sugiere que este veneno contribuye más a una función de depredación,
que de defensa. Además, por la composición, este veneno no se puede clasificar
específicamente en los dos grandes grupos: bútidos y no-bútidos, previamente
caracterizados en la literatura, ya que comparte características de ambos grupos.
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REFERENCIAS
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