universidad de chile quÍmica departamento de ciencia de...
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UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y TECNOLOGÍA
QUÍMICA
Profesor Patrocinante:
Lilian Elizabeth Abugoch James
Departamento de Ciencia de los
Alimentos y Tecnología Química,
Universidad de Chile
Directores de Memoria:
Lilian Elizabeth Abugoch James
Departamento de Ciencia de los
Alimentos y Tecnología Química,
Universidad de Chile
Nalda Marcela Romero Palacios
Departamento de Ciencia de los
Alimentos y Tecnología Química,
Universidad de Chile
OBTENCION, CARACTERIZACION Y RELACION ESTRUCTURA - FUNCIONALIDAD
DE UN AISLADO PROTEICO DE QUINUA (Chenopodium quinoa) ORGANICA PROVENIENTE DE LA VI REGION DE CHILE.
Memoria para optar al Título Profesional de
Ingeniero en Alimentos
JORGE ANDRES SILVA MANZO Santiago, 2006
II
La imaginación es más importante que el conocimiento
Albert Einstein
III
AGRADECIMIENTOS
A mi profesora patrocinante y directora de memoria Lilian Abugoch, por
su dedicación, estimulo, apoyo personal y profesional en el desarrollo de
este trabajo, por confiar en mis capacidades y proyectarlas hacia mi
futuro.
A mi profesora Nalda Romero por su ayuda y contribución a la
realización de mi tesis.
Al profesor Jorge Chávez por su disposición y facilitar el equipo de
secado spray, y a Alejandra Olave por instruirme en el equipo.
A la profesora María Eugenia Letelier, por su ayuda, y facilitar la
centrífuga.
A los profesores Abel Guarda y María José Galotto del Departamento de
Ciencia y Tecnología de los Alimentos de la Facultad de Tecnología de
la Universidad de Santiago de Chile, por facilitar el equipo DSC para
llevar acabo los análisis.
A todos mis profesores y personal de la Universidad por haber
contribuido en mi formación académica y profesional.
A mi querida amiga Mónica Rivera por su compañía y ayuda a lo largo
de mi tesis.
A todos mis amigos y compañeros que encontré a lo largo de mi carrera.
A mis padres y hermanos por apoyarme incondicionalmente durante
toda mi carrera y mi vida.
IV
INDICE
RESUMEN ....................................................................................................................VII
SUMMARY...................................................................................................................VIII
I. INTRODUCCION ......................................................................................................... 1
1.1.- Antecedentes generales. ........................................................................................ 1
1.2.- Antecedentes de la Quinua..................................................................................... 2
1.3.- Descripción botánica............................................................................................... 3
1.4.- Composición química.............................................................................................. 4
1.5.- Saponinas ............................................................................................................... 6
1.6.- Usos de la Quinua................................................................................................... 6
1.7.- Mercado .................................................................................................................. 7
II. HIPOTESIS ................................................................................................................. 9
III. OBJETIVOS............................................................................................................... 9
3.1.- Objetivo General ..................................................................................................... 9
3.2.- Objetivos Específicos.............................................................................................. 9
IV. MATERIALES Y EQUIPOS..................................................................................... 10
4.1.- Materiales.............................................................................................................. 10 4.1.1.- Materia Prima ................................................................................................. 10 4.1.2.- Reactivos químicos ........................................................................................ 10 4.1.3.- Insumos y utensilios ....................................................................................... 11 4.1.4.- Equipos e Instrumentos.................................................................................. 12
V. METODOS................................................................................................................ 14
5.1.- Procedimiento de obtención de harina.................................................................. 14
5.2.- Procedimiento de obtención de un aislado proteico.............................................. 15 5.2.1.- Preparación de la fracción proteica................................................................ 15
V
5.3.- Determinación del contenido de proteínas totales. ............................................... 17
5.4.- Análisis Proximal. .................................................................................................. 17
5.5.- Tamizado .............................................................................................................. 17
5.6.- Perfil de aminoácidos. ........................................................................................... 17
5.7.- Determinación de Fitoestrógeno. .......................................................................... 18
5.8.- Análisis y caracterización de polipéptidos que integran los aislados de quinua mediante Electroforesis (PAGE).................................................................................... 18
5.9.- Análisis de las características conformacionales de las proteínas en solución. ... 19 5.9.1.- Espectroscopia UV......................................................................................... 19 5.9.2.- Fluorescencia. ................................................................................................ 19 5.9.3.- Calorimetría diferencial de barrido (DSC) ...................................................... 19
5.10.- Determinación de las propiedades funcionales de Hidratación .......................... 20 5.10.1.- Solubilidad.................................................................................................... 20 5.10.2.- Capacidad de retención de agua ................................................................ 20 5.10.3.- Capacidad de absorción de agua................................................................. 21
5.11.- Análisis estadístico.............................................................................................. 21
VI. RESULTADOS Y DISCUSION................................................................................ 22
6.1.- Composición proximal ........................................................................................... 22
6.2.- Determinación de fitoestrogenos........................................................................... 22
6.3.- Determinación de Aminoácidos............................................................................. 22
6.4.- Tamizado .............................................................................................................. 25
6.5.- Espectroscopia UV................................................................................................ 25
6.6.- Espectroscopia de Fluorescencia ......................................................................... 26
6.7.- Análisis y caracterización de la composición de polipéptidos que integran el aislado proteico de quinua A11 ..................................................................................... 29
6.7.1.- Electroforesis Nativa PAGE-nativo................................................................. 29 6.7.2.- Composición polipeptídica a partir de electroforesis Desnaturante con y sin 2-mercaptoetanol (2-Me) .............................................................................................. 30
6.8.- Calorimetría diferencial de barrido (DSC) ............................................................. 32
6.9.- Solubilidad............................................................................................................. 35
VI
6.10.- Capacidad de Retención de Agua (WHC)........................................................... 36
6.11.- Capacidad de Absorción de Agua (WIC) ............................................................ 38
VII. CONCLUSIONES ................................................................................................... 40
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 42
ANEXO 1....................................................................................................................... 48
ANEXO 2....................................................................................................................... 49 Caracterización de los perfiles polipeptídicos del aislado proteico de quinua........... 49 Electroforesis PAGE.................................................................................................. 49
ANEXO 3....................................................................................................................... 54 Determinación de Hidratos Carbono ....................................................................... 54 Método Reacción de ANTRONA............................................................................... 54
ANEXO 4....................................................................................................................... 55 Determinación de Solubilidad................................................................................... 55
ANEXO 5....................................................................................................................... 56 Capacidad de Retención de Agua (WHC)................................................................. 56
ANEXO 6....................................................................................................................... 58 Capacidad de Absorción de Agua (WIC)................................................................... 58
ANEXO 7....................................................................................................................... 59 Preparación de Buffers.............................................................................................. 59
ANEXO 8....................................................................................................................... 60 Cuantificación de Proteínas – Método de BRADFORD ............................................ 60
VII
RESUMEN
El presente trabajo tuvo por objetivo la obtención de un aislado proteico de
quinua orgánica a pH 11, con materia prima proveniente de la VI Región. Se
caracterizó desde el punto de vista químico, bioquímico y funcional. Los resultados se
analizaron estadísticamente mediante el uso de análisis de varianza y test de Tukey y
Duncan al 95 % de confianza.
El aislado proteico se preparó mediante la extracción a pH 11 y precipitación a
pH 5. Contenido de proteínas fue del 83,5% con una humedad del 6,8% valor bajo, lo
que le confiere estabilidad en el tiempo. La composición de aminoácidos coincidió con
lo descrito en la literatura, destacando su alto contenido de lisina y leucina
sobrepasando al patrón propuesto por la FAO. En espectroscopia UV y de
fluorescencia se tuvo como resultado que a pHs alcalinos se obtuvo mayor
absorbancia y mayor intensidad de fluorescencia. En la caracterización de polipéptidos
por PAGE nativa y desnaturante se pudo determinar los perfiles de proteínas de quinua
y se comprobó que están compuestas principalmente por dos tipos de polipéptidos,
albúminas del tipo 2S y globulinas 11S ambas estabilizadas por puentes disulfuro. La
calorimetría diferencial de barrido (DSC) dio como resultado que el aislado proteico de
quinua A11 poseía poco grado de estructura cuando se analiza en medio acuoso y en
medio alcalino (pH 9), esto sugiere que las proteínas quedan prácticamente
desestructuradas, ya al momento de ser extraídas a pH 11. La solubilidad tendió a
aumentar a pH alcalino siendo máxima a pH 11 con un 41,4%, por otro lado la
capacidad de retención de agua (WHC) no fue afectada por el pH, registrándose una
retención de agua entre 3,1 – 4,0 mL de agua por g de aislado proteico, esto lo hace
muy útil en la elaboración y desarrollo de nuevos productos de panificación, embutidos
y bebidas enriquecidas. Con respecto a la capacidad de absorción de agua (WIC) se
puede decir que este mostró una gran velocidad inicial de absorción, con una
absorción de agua máxima de 2,8 mL de agua/ g de aislado proteico. Por consiguiente
se concluye que el aislado proteico de quinua A11 tiene una alta capacidad para ser
utilizado como suplemento de otros alimentos como bebidas para deportista,
embutidos, salchichas, sopas y en productos deshidratados, como por ejemplo en el
desarrollo de alimentos funcionales altamente proteicos.
VIII
SUMMARY
OBTAINING, CHARACTERIZATION AND RELATION STRUCTURE FUNCTIONALITY OF A PROTEIN ISOLATE OF QUINUA (Chenopodium quinua)
ORGANIC ORIGINATING OF VI REGION OF CHILE. The present work had by objective the obtention of a protein isolate at pH 11 of
organic precedence quinua, originated at the VI Region. It was characterized from the
chemical, biochemical and functional point of view. The results where statistically
analyzed by means of analysis of variance and test of Tukey and Duncan at 95 % of
confidence.
The protein isolate was prepared by means of extraction at pH 11 and
precipitation at pH 5. The protein content was 83.5 % with an humidity of 6.8% low
value, that it confers stability in time to the product. The amino acidic composition
correspond to the described in references, emphasizing the high content of lisine and
leucine exceeding the pattern proposed by the FAO. In UV and fluorescence
spectroscopy got as result a bigger fluorescence peak at alkaline pHs of the samples.
In the characterization of polypeptides by native and denaturing PAGE it was possible
to determine the protein profiles of quinua and it was verified that they are in mainly
composed two types of polypeptides, albumin 2S and globulins 11S both stabilized by
disulphur bridges. The differential scanning calorimetry (DSC) gave as result that
protein isolate of quinua A11 has little degree of structure when it is analyzed in the
middle watery and in the middle alkaline (pH 9), this suggests proteins are left
practically without structure, already at the time of being extracted at pH 11. The
solubility tended to increase at an alkaline range reaching peak values pH 11 with value
of 41.4%, for other side the water holding capacity (WHC) was not affected by pH,
registering a water retention between 3.1 - 4.0 mL of water by g of protein isolate , this
is useful in the elaboration and new developments in baking industry, inlays and
enriched drinks, with respect to the water imbibing capacity (WIC) can be said that this
it showed a great initial speed of absorption, with a maximum water absorption of 2.8
mL of water per g. of isolate. Therefore in conclusion the protein isolate of quinua A11
has a high capacity and can be used like supplement of foods like drinks for sportsman,
inlays, sausages, soups and in dehydrated products, like for example in highly protein
the functional food development.
1
I. INTRODUCCION
1.1.- Antecedentes generales.
Las proteínas representan uno de los componentes principales de los
alimentos, tanto desde un punto de vista funcional como nutricional. Por ejemplo,
determinan las propiedades físicas y organolépticas de muchos alimentos. Así, la
consistencia y textura de la carne, queso o pan, dependen en gran medida de la
naturaleza de las proteínas que los constituyen. Pero también, en alimentos elaborados
con una presencia menor de proteínas, pueden jugar un papel muy importante,
influyendo en características funcionales, como la formación de emulsiones, geles,
espumas y la absorción de agua o aceite. Además las proteínas también constituyen
un aporte nutricional importante, representando una fuente de energía, nitrógeno y
aminoácidos esenciales (Vioque y Millán, 2006).
Las proteínas son macronutrientes esenciales para la nutrición humana y
animal que habitualmente forman parte de los propios alimentos en su forma natural.
Además de su papel básico en la nutrición, las proteínas poseen propiedades físico-
químicas que otorgan unas propiedades funcionales muy específicas al ser
adicionadas a ciertos alimentos. Por esta razón el desarrollo tecnológico de la industria
alimentaría ha recurrido en forma habitual a la utilización de productos proteicos con
fines funcionales-tecnológicos, encaminados a dotar de propiedades físico-químicas y
organolépticas a los alimentos donde son incorporadas. Este hecho ha llevado a las
proteínas, más allá de su actividad como macronutriente a ser un producto necesario
como ingrediente en la producción tecnológica de alimentos. A partir de esta
necesidad, se desarrollaron los procesos necesarios para aislar o extraer las proteínas
de sus fuentes orgánicas originales. Se obtienen así los denominados concentrados
proteicos y aislados proteicos, que constituyen un purificado proteico a partir del
alimento o fuente orgánica inicial (Curare, 2006).
Un concentrado proteico es considerado aquel cuyo contenido en proteína es
menor del 65%. El aislado proteico se considera aquel con un contenido proteico
mayor que 70%. Las proteínas constituyentes de ambos productos deben ser
exactamente las que se encontraban en la fuente orgánica inicial, sin haber sufrido
2
procesos de degradación o hidrólisis no deseables. La idea es obtener un
macronutriente purificado con papel tecnológico y nutricional (Curare, 2006).
Las proteínas son agregadas a los alimentos por varias razones, ya que son un
importante suplemento nutricional, las proteínas también cumplen roles funcionales en
los alimentos. Las propiedades funcionales de las proteínas son solubilidad, absorción
de agua y aceite, comportamiento reológico, capacidad emulsificante y espumante. La
proteínas se usan como aditivos en suplementos nutricionales para mejorar el perfil de
aminoácidos e incrementar el contenido de proteínas, también conlleva beneficios
funcionales como emulsificación y estabilización e incremento de viscosidad, mejora
apariencia, gusto, textura y absorción de agua o aceite. Los beneficios nutricionales
incluyen un bajo contenido calórico de los alimentos. Los aislados proteicos pueden ser
utilizados en pastelería, en la elaboración de bebidas para deportistas, en la
elaboración de embutidos. (Giese, 1994).
1.2.- Antecedentes de la Quinua
La quinua (Chenopodium quinua willd.) es un nutritivo pseudocereal que se
cultivó en forma tradicional en el área andina desde la época incásica. Fue
ampliamente usada en la alimentación de los pueblos antiguos de Sudamérica como
uno de los alimentos básicos. El cultivo de la quinua en el altiplano disminuyó después
de la conquista española, cediendo el paso a cereales introducidos como el trigo y la
cebada. En la actualidad la quinua se cultiva en Argentina, Chile, Colombia y Ecuador
a nivel de pequeño agricultor y para autoconsumo. En Bolivia y Perú el cultivo está
difundido en zonas marginales donde no hay otras alternativas agrícolas (Wahli, 1990).
Se distribuye en todo el cordón andino, en una extensión aproximada de 12.000
kilómetros desde Venezuela hasta Chile, desde la latitud norte 6º hasta la latitud sur
47º. Esta diversidad geográfica ha alentado una gran dispersión genética, que se
traduce en la existencia de unas 3.000 variedades conservadas en los “bancos de
germoplasma” naturales existentes en la Cordillera de los Andes.
Recientemente se ha despertado el interés en la quinua por el reconocimiento
de su potencial agrícola y de su potencial nutritivo. Aunque la quinua supera a los
cereales más importantes en algunos nutrientes, es más notable en el contenido y
calidad de sus proteínas (respecto al contenido de aminoácidos esenciales). El
3
verdadero valor de la quinua no es como un reemplazo de algunos alimentos sino más
bien como un complemento de ellos para que alcance un valor nutritivo alto (Wahli,
1990).
Es considerada por la FAO y la OMS como un alimento único por su altísimo
valor nutricional. Como un alimento libre de gluten puede consumirla la gran parte de la
población, incluyendo las personas celíacas (alérgicas al gluten). La quinua mantiene
sus cualidades nutritivas incluso en procesos industriales, y es capaz de sustituir
notablemente a las proteínas de origen animal (CCBOLgroup, 2006).
1.3.- Descripción botánica
El nombre botánico de la quinua es Chenopodium quinua willdnow, cuya familia
es Chenopodiaceae. Nombres comunes: Quechua: kiuna, quinua, parca; Aymará:
supha, jopa, jupha; Mapuche: quinhua; Español: quínua, quínoa; Inglés: quinua,
quinua, kinoa, sweet quinua, white quinua, peruvian rice, Inca rice (Nacional research
council, 1989).
La quinua es una planta herbácea. La raíz es pivotante con muchas
ramificaciones y alcanza una profundidad hasta los 60 cm. La altura de la planta varía
entre los 100 cm. y los 230 cm. (Fig. 1). El tallo es cilíndrico a la altura del cuello y
angular a partir de las ramificaciones. El número de ramificaciones depende del tipo de
entrada y puede variar mucho. El fruto es pequeño, aproximadamente de 2 mm de
diámetro y 1 mm de espesor, el color de la semilla puede ser amarillo, café, crema,
blanco o translúcido. Como se muestra en la figura 1 la planta puede tener diferentes
colores desde amarillo a naranja, rojo vivo, rojo oscuro y verde (Wahli, 1990).
Figura 1: Planta de Quinua (Chenopodium quinoa willd)
4
Las hojas son alternas, simples, los bordes son dentados pudiendo ser
pronunciados o leves según las variedades lámina polimorfa hojas inferiores
romboidales, o triangulares, hojas superiores lanceoladas o triangulares, planas u
onduladas, algo carnosas, hojas jóvenes cubiertas de papilas esferoidales o globosas
de 1.4 mm de diámetro, blancas púrpuras o rojas, a veces las hojas son brillantes y
carentes de papilas, de bordes más o menos profundamente dentados, 3 a 20 dientes,
en el último caso hojas aserradas, pecíolos largos, finos, acanalados en el lado
superior, la coloración en general varía de verde claro a verde oscuro, las que a su vez
se van transformando en amarillas, rojas o púrpuras según su estado de maduración.
Posee una inflorescencia denominada panícula, de forma glomerulada, y pueden tener
un aspecto laxo y compacto, forman una panoja que contiene los frutos (granos)
esféricos de 0.8 a 2.3 mm de diámetro, de colores variados desde blanco hasta gris y
negro, pasando por todas las tonalidades de amarillo, rosado, rojo, púrpura y morado,
incluyendo vistosas mezclas de varios colores en una sola panoja. El ciclo vegetativo
de la planta tiene una duración de 8 meses con la siembra en septiembre, alcanzando
su fase de maduración en abril, para efectuar la cosecha y trilla en los meses de Mayo
y Junio. La variedad "Real" es cultivada generalmente con fines comerciales y de
exportación. Además existe la "Blanca" que tiene un diámetro comprendido entre 2.4 y
2.8 milímetros y otra gama de semillas que son cultivadas con fines específicos de
consumo (CIED, 2006).
1.4.- Composición química
La semilla de quinua tiene un alto valor nutritivo, tanto por su composición
química, como por la cantidad y calidad de sus proteínas, que fluctúa entre un 12 y 22
%. Es así como, la calidad de las proteínas de quinua es considerada tan buena o
mejor que la caseína, esto, debido al buen balance de los aminoácidos esenciales,
sobresaliendo el triptófano, la cisteina y la metionina. Sin embargo, la mayor
importancia radica en su alto contenido de lisina, un aminoácido deficitario en la
mayoría de los vegetales, especialmente en el trigo (Albarran, 1993).
Por otro lado, la semilla de quinua presenta un alto contenido de vitaminas del
complejo B, C y E. Pero también, es importante su composición de sales minerales
tales como: hierro, fósforo, potasio y calcio. Este último se encuentra en la misma
5
concentración que en la leche descremada, mientras que el fósforo es cuatro veces
más concentrado que el de ésta (Albarran, 1993).
Como se muestra en la Tabla 1 la harina de quinua tiene un alto contenido de
proteínas con un buen balance de aminoácidos como se muestra en la Tabla 2 en
donde se puede ver que tiene 16 aminoácidos de los cuales 10 son aminoácidos
esenciales (Araneda, 2004). La harina de quinua contiene 11,2 % de humedad, 13,5 %
de proteínas, 9,5 % de fibra, 58,3 % de carbohidratos y 1,2 % de minerales
(Ogungbenle, 2003).
Tabla 1: Análisis proximal harina de Quinua
%
Grasa 5,2 ± 0,09 Humedad 11,7 ± 0,06 Cenizas 1,4 ± 0,03
Proteínas 14,7 ± 0,5
Carbohidratos totales 64,2
Fuente: Araneda, 2004.
Tabla 2: Contenido de aminoácidos en la harina de Quinua.
Aminoácidos % Ac. Aspártico 1,3 Ac. Glutámico 3 Serina 0,7 Histidina* 0,4 Glicina 1,2 Treonina* 0,8 Arginina* 1,6 Alanina 0,7 Tirosina 0,6 Valina* 0,9 Metionina* 0,4 Cistina 0,1 Isoleucina* 0,8 Leucina* 1,2 Fenilalanina* 0,8 Lisina* 1
* Aminoácidos esenciales. Fuente: Araneda, 2004.
6
1.5.- Saponinas
El contenido de la saponina en la quinua es de entre 0-6% dependiendo de la
variedad. Se ha observado que la semilla de quinua es de sabor amargo y posee un
cierto grado de toxicidad, que se debe a la presencia de saponinas (glucósido
triterpenoide) en el pericarpio, se elimina, sin embargo por lavado y fricción. Antes de
consumir la quinua es necesario desaponificarla (eliminar las sustancias amargas,
saponinas). Esto se hace frotando los granos de quinua con las manos en agua
corriente hasta que no se forme más espuma. Se puede usar también una piedra para
facilitar la eliminación de las primeras capas. (Albarran, 1993; Vilche y col., 2003;
Ruales y Nair, 1992; Comai y col., 2006).
En el organismo, las saponinas ocasionan dolor estomacal, nauseas, ligera
diarrea y problemas en la digestión, puesto que la fase jabonosa producida al
mezclarse con el agua y al ser agitada por los movimientos peristálticos de las
vísceras, hace que se rompan las fuerzas de tensión superficial de las fases líquidas
que intervienen en el proceso de digestión. Por esta razón, es necesario eliminar estos
compuestos, previo al consumo, pues no la hacen atractiva como alimento.
Aparentemente, éste ha sido el principal problema para expandir su consumo y cultivo
(Fontúrbel, 2003).
1.6.- Usos de la quinua
Se consume como el arroz, en grano; sus hojas tiernas se comen guisadas
como las acelgas y espinacas; su tallo y hojas verdes se aprovechan como ensalada;
se hacían además sopas o mazamorras; con su harina se elaboran panecillos y
galletas. Igualmente se pueden utilizar sus raíces. (CCBOLgroup, 2006).
La harina de quinua es utilizada para enriquecer harinas de panificación en la
elaboración de: galletas, barritas, tartas, batidos, pasteles, spaghettis, aportando un
alto valor nutritivo. Se utiliza igualmente en la elaboración de alimentos rebozados,
enriqueciéndolos, conservando su humedad y aportando un sabor muy agradable así
como una textura fina y especial. Así se consigue elaborar alimentos altamente
energéticos, muy agradables, 100 % naturales sin colesterol y libres de gluten.
7
Pastas de quinua: un buen alimento sano y nutritivo estas pastas están hechas con
una mezcla de sémola de trigo candeal y sémola de Quinua Real Orgánica y con
resultados extraordinarios, obteniendo textura y gusto muy delicado.
Harina de quinua: Para repostería, incrementa el valor nutritivo de cualquier alimento;
en pastas, panes, galletas. Además es una de las pocas harinas para celiacos que
tiene un gran valor nutritivo.
Harina tostada de quinua: Quinua cocida finamente molida, para mezclar con agua
fría y azúcar para refrescos o con agua hervida, leche y azúcar; también para
acompañar una rica Sandía.
Hojuelas de quinua: Quinua procesada tipo avena, para sopas, en el desayuno con
leche, para postres se puede cocer con frutas. (CCBOLgroup, 2006).
1.7.- Mercado
Bolivia dominó la producción mundial de quinua entre 1982 y 1998, año en el
que fue rebasada por el Perú. Desde 1990, Bolivia controla más del 90% de las
exportaciones mundiales de este grano, esencialmente constituido de variedades del
ecotipo denominado real. Este tipo de quinua, apetecido por su mejor aspecto,
cualidades agroindustriales y nivel nutritivo, crece únicamente en las riberas del Salar
de Uyuni, Altiplano Sur, región que contribuye con más del 57% de la producción
boliviana de quinua desde 1989. La mayoría de la quinua real producida es
convencional, siendo primordialmente consumida en Bolivia y secundariamente
comercializada de manera no registrada al Perú desde fines de la década de los años
1960, país que constituye el principal mercado externo de la quinua boliviana y
principal consumidor mundial de quinua. Desde el año 2000, el 20% de la producción
de quinua real es biológica, de la cual se exportan 1.800 toneladas en dirección de los
países del norte, con mercados inestables y de débil crecimiento, los cuales han sido
creados y en gran parte se desarrollan por acción de empresas privadas: Quinua
Corporation para los Estados Unidos y Euronat-Priméal para Europa occidental (Lagos,
2006)
El consumo en Chile es bajo, comparado con otros alimentos ricos en
carbohidratos como: trigo, arroz y maíz. Esto se debe a que no se conocen las ventajas
8
nutritivas de la quinua y a que existe una oferta irregular del producto (Sepúlveda y
col., 2004).
Los cultivos se han extendido hasta 35.700 hectáreas, principalmente en el
altiplano norte, central y sur, y la producción alcanza a un promedio de 23.200
toneladas métricas, de las que un 65 por ciento es para el autoconsumo y el 35 por
ciento se destina al mercado boliviano. Los productores de quinua exportaron 2.800
toneladas por un valor de más de tres millones de dólares a Europa y Estados Unidos
(Azcui, 2005).
9
II. HIPOTESIS
El estudio de fuentes alternativas de proteínas como la quinua, permite generar
conocimiento e información para proponer nuevos alimentos enriquecidos en proteínas
tecnológicamente funcionales. La quinua es un pseudocereal, con alto contenido
proteico y excelentes características nutricionales. La obtención de un aislado proteico
funcional que pueda ser incorporado a un alimento, es posible a través del estudio de
los cambios estructurales modificando las condiciones de procesamiento físicas y/o
químicas al medio que se expone la proteína, relacionando cambios estructurales con
modificaciones en sus propiedades funcionales.
III. OBJETIVOS
3.1.- Objetivo General
Estudiar aislados proteicos de harina desgrasada de quinua orgánica desde el
punto de vista estructural y funcional para poder obtener conocimientos e información
que permitan incorporar estas proteínas de alto valor nutricional en alimentos
destinados al consumo humano.
3.2.- Objetivos Específicos • Obtener un aislado proteico a pH 11.
• Obtener conocimiento sobre las características estructurales y
fisicoquímicas del aislado proteico.
• Determinar las propiedades funcionales que exhiben las proteínas
integrantes del aislado proteico obtenido a pH 11. Se estudiarán
propiedades de hidratación, como solubilidad, capacidad de retención
de agua y capacidad de absorción de agua.
• Analizar las relaciones existentes entre las características estructurales
que exhiben las proteínas y sus propiedades funcionales.
• Estudio de cambios conformacionales de los aislados proteicos
mediante el estudio de técnicas espectroforométricas y electroforéticas.
• Determinar el perfil aminoácidico y el contenido de fitoestrogenos.
• Determinación centesimal.
10
IV. MATERIALES Y EQUIPOS
4.1.- Materiales
4.1.1.- Materia Prima Quinua orgánica pelada en seco proveniente de la localidad de La Plaza en la
comuna de Pichilemu, del agricultor Crispulo Leiva, ubicadas en la VI Región de Chile
4.1.2.- Reactivos químicos
• Acetato de sodio (CH3COONa) Panreac, Barcelona, España
• Acetonitrilo (CH3CN) Panreac. Barcelona, España
• Ácido acético glacial (CH3COOH) p.a Merck. Darmstadt, Alemania
• Ácido cítrico monohidratado Sigma. USA
• Ácido bórico (H3BO3) Panreac, Barcelona, España
• Ácido clorhidrico fumante 37 % (HCl) p.a Merck. Darmstadt, Alemania
• Ácido orto-fosfórico 85% (H3PO4) p.a Merck. Darmstadt, Alemania
• Ácido perclórico 70-72% p.a Merck. Darmstadt, Alemania
• Ácido sulfúrico (H2SO4) p.a Merck. Darmstadt, Alemania
• Antrona p.a Merck. Darmstadt, Alemania
• Alcohol etílico (Etanol) (C2H60) p.a Winkler. México
• Alcohol etílico (Etanol) (C2H60) 99,5 % absoluto, técnico, comercializadora
tecnológica limitada.
• Achrilamida (C3H5NO) p.a Merck. Darmstadt, Alemania
• Azul brillante de coomasie G-250 (C47H50N3NaO7S2) Baker.USA
• Azul de bromofenol (C19H10Br4O5S) Sigma. USA
• Bicarbonato de sodio (NaHCO3)
• Bis-acrilamida (C7H10N2O2) Sigma. USA
• β -mercapto etanol (C2H6OS) p.a Merck. Darmstadt, Alemania
• Cloruro de sodio (NaCl) p.a Merck. Darmstadt, Alemania
• Coomassie blue R (C45H44N3O7S2Na) Sigma. USA
• Dietil etoximetilenmalonato. Fluka. Buchs, Suiza
• Dodecil sulfato de sodio (SDS) (C12H25NaO4S) p.a Merck. Darmstadt, Alemania
• Estándar para electroforesis Bio-Rad Presicion plus protein Catalog 161-0373.
11
• Estándar interno para aminoácidos DL-2 – aminobutyric acid for syntesis, Merck
Shuchardt
• Estándar para fitoestrógenos Daizenine Genist 2µg/mL.Sigma USA.
• Estándar: seroalbúmina de bovino (BSA). Sigma. USA
• Fosfato de potasio dihidrogeno (KH2PO4) p.a Merck. Darmstadt, Alemania
• Glicerol (C3H8O3) Sigma. USA
• Glicina (C2H5NO2) Sigma. USA
• Glucosa monohidratada p.a Merck. Darmstadt, Alemania
• Hidróxido de sodio (NaOH) W&Z
• Hidróxido de sodio (NaOH) p.a Merck. Darmstadt, Alemania
• Indicador fenoftaleina (C20H14O4) p.a Merck. Darmstadt, Alemania
• Indicador rojo de metilo (C15H15N3O2) p.a Merck. Darmstadt, Alemania
• Persulfato de amonio (PSA) ((NH4)2S2O8) Sigma. USA
• Sacarosa (C12H22O11) p.a Merck. Darmstadt, Alemania
• Sodio fosfato bibásico anhidro (Na2HPO4) p.a Merck. Darmstadt, Alemania
• Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4*5H2O) p.a Merck. Darmstadt, Alemania
• Sulfato de potasio (K2SO4) p.a Purom
• TEMED (N,N,N`,N`-Tetramethiletilendiamina) Sigma. USA
• Tetraborato de sodio
• Tris (C4H11NO3) p.a j.t.Baker. USA
4.1.3.- Insumos y utensilios Agua destilada, bandejas de acero galvanizado de 30 mallas de 44 cm x 24 cm,
cápsulas de aluminio, cápsulas DSC, cubeta para electroforesis, cubetas de cuarzo y
de plástico, espátula, gradilla, guantes, hielo, material de vidrio de laboratorio,
micropipetas, papel absorbente, papel Whatman nº1, parafilm, pinzas, plumavit, potes
de plástico, soporte para electroforesis, tubos Ependorf, tubos kjeldahl, tubos para
centrifugas, utensilios de cocina, vidrios para polimerización y peineta (plástico
dentado).
12
4.1.4.- Equipos e Instrumentos
• Agitador eléctrico vortex Thermolyne, tipo 37600 Mixer, model Nº M37610-26,
serie Nº 871570819103
• Agitador magnético Magnetic Stirrer HI 190M Hanna Instruments, serie
S229370
• Agitador Cenco Nº 34525-200
• Balanza analítica Precisa 125 A Swiss Quality
• Balanza analítica Mettler Toledo, AG135, snr 1121140784, hecho en Suiza
• Balanza granataria AND, model EK 120-A
• Baño de agua termoregulado HAAKE, tipo FK Nº 751117, Alemania
• Calorímetro diferencial de barrido (DSC) Mettler Toledo 822e snr 5122145369,
hecho en Suiza.
• Cámara de refrigeración FríoLux
• Campana de extracción
• Centrifuga Heraeus Sepatech Suprafuge 22, Alemania
• Conjunto para electroforesis Bio-Rad, con kit para preparación de geles, cuba
de corrida y fuente de poder.
• Desecador
• Digestor Büchi 426 Nº 1270878, type B-426RC, hecho en Suiza
• Espectrofotómetro de fluorescencia perkin Elmer, model LS50B, serie Nº 32938
Nº L225-0105
• Espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 11 NºBC11 230V, serie NR30031
• Espectrofotómetro UNICAM UV/Vis, type UV3-200, Nº UV 3022809, hecho en
Inglaterra
• Estufa Heraeus Instruments D-63450 Hnau, type UT 6200, hecho en Alemania
• Estufa Heraeus, type TU 60/60, Nº 2760-02, Alemania
• Estufa WTB binder, tipo 1924090000200, Nº 940107
• Freezer medical Freezer Sanyo, model MDF-U332, Nº606033941, hecho en
Japón
• Microcentrifuga HermLe Z160 Herteller Spintron, Alemania
• Mini secador spray B-191 Büchi, Suiza.
13
• Molino de impacto Retsh Muhle GmbH West-Germany, type SR-2 Nº73454
• Mufla , Wild Barfiel, tipo M254 Nº c2441557, hecho en Inglaterra
• Placa calefactora, Gerhardt, tipo H52 Nº 443792
• PHmetro microprocesador pH 537 WTW, hecho en Alemania
• Refrigerador Mademsa
• Sistema HPLC Merck Hitachi bomba ternaria L6200 con inyector Rheodyne
7725;loop de 20 µl, Detector espectrofotométrico UV-Visible modelo 484 a 280
nm, Integrador D-2500; Columna Nova Pack RP18 (3,9 x 300 mm y un tamaño
de partícula de 4 µm) Waters, con software Clarity Chromatography Station
para Windows.
• Termómetro
• Unidad destiladora Büchi 323Nº1258804, tipo B-323, hecho en Suiza
14
V. METODOS
5.1.- Procedimiento de obtención de harina
El proceso de obtención de harina sigue las siguientes etapas (Pearson, 1976):
• Recepción de semillas: Se recibieron semillas de quinua envasada en sacos de
papel doble. Una vez determinada la humedad, estas fueron almacenadas a
temperatura ambiente y en lugar seco.
• Limpieza: Se limpió la quinua en forma manual retirando impurezas, tales como,
ramas, palos, piedras y restos de insectos.
• Lavado: Esta operación se realizó en forma manual retirando el total de las
saponinas presente en el grano. Se hizo tantos lavados con agua fría como fue
necesario para no obtener más espuma proveniente de las saponinas.
• Ajuste de humedad: Se ajustó el contenido de humedad hasta un 15 +/- 1%
mediante secado en estufa a 50°C en regillas de acero galvanizado.
• Determinación de humedad: según método oficial de análisis de AOAC
Internacional, 935.29, método gravimétrico.
• Molienda: Esta operación se efectuó en molino de martillo-cuchillo,
• Tamizado: Este se realizó mediante un tamiz de 60 mesh (Fig. 4).
• Almacenamiento: Se almacena en papel kraf en un lugar a temperatura
ambiente y seco.
Figura 2: Secado de semillas de quinua en regilla de acero galvanizado
15
5.2.- Procedimiento de obtención de un aislado proteico
Este procedimiento comienza con el desgrasado de la harina de quinua, este
consiste en mantener una suspensión al 10 % p/v de harina de quinua con hexano en
continua agitación, en una cámara de refrigeración durante 24 horas (Fig. 5).
5.2.1.- Preparación de la fracción proteica
El proceso de preparación de las fracciones proteica sigue las siguientes etapas
(Martínez y Añón, 1996):
• Suspender la harina desgrasada en agua (10 % p/v).
• Ajustar a pH 11 con NaOH 2N para solubilizar las proteínas.
• Agitar la suspensión por 30 min. A temperatura ambiente.(Fig. 3)
• Centrifugar a 3400 rpm por 60 minutos a 15 ºC (anexo 1, Fig. 17 y 18)
• Ajustar el pH del sobrenadante a 5 con HCl 2N para precipitar las proteínas.
• Luego centrifugar a 3400 rpm por 60 min. y se mantiene a 4 ºC.
• El precipitado se resuspende en agua.
• Neutralización con NaOH 0,1 N
• Secado spray (ver anexo 1, Fig. 21).
Figura 3: Solubilización de proteínas Figura 4: Grano, harina y aislado proteico
de quinua de quinua
16
Figura 5: Obtención de Aislado Proteico de Quinua A11
Recepción materia prima
Limpieza manual
Lavado con agua fría
Desgrasado en hexano al 10 % a 4 – 5 ºC por 24 h.
Almacenamiento
Suspendido en agua y ajuste a pH 11 con agitación por 30 min.
Control de humedad hasta 15 +/- 1%
Eliminación Saponinas
Obtención de harina
Centrifugado a 3400 rpm por 60 min. a 15 ºC.
Centrifugado a 3400 rpm por 60 min. a 4ºC
Ajustado a pH 5 con agitación del sobrenadante
Secado spray
Neutralización con NaOH 0,1 N
Análisis
Filtrado al vacío y secado a tº ambiente
Resuspensión en agua del precipitado
Molienda
Secado a 50 ºC
Determinación de humedad
17
5.3.- Determinación del contenido de proteínas totales.
Se determinó mediante el Método AOAC (1995). La medición se efectuará solo
una vez a la harina de quinua y al aislado proteico. El método descrito es el de Kjeldahl
que es el método oficial más ampliamente usado para la determinación del contenido
de proteínas en los alimentos, la razón se debe a su grado de precisión y
reproducibilidad. Consiste en la digestión ácida total de la proteína y conversión
cuantitativa de nitrógeno a NH3 que se valora por retrotitulación. El factor de conversión
de nitrógeno utilizado para obtener el contenido de proteínas total fue de 5,77
(Schmitd-Hebbel, 1981) (anexo 1, Fig. 22).
5.4.- Análisis Proximal.
5.4.1.- Cenizas, según método oficial de análisis de AOAC Internacional, 923.03
método directo.
5.4.2.- Humedad, según método oficial de análisis de AOAC Internacional, 935.29,
método gravimétrico.
5.4.3.- Carbohidratos, método colorimétrico de reacción de antrona, la muestra se
digiere con ácido perclórico. Los almidones hidrolizados, junto con los azúcares
solubles reaccionan con el reactivo de antrona originando un compuesto de color verde
– azul, el cual se utiliza para la determinación colorimétrica, mediante el
espectrofotómetro. Los resultados se expresan en glucosa (Osborne y Voogt, 1986)
(Ver anexo 3).
5.5.- Tamizado
Este se realizo mediante una batería de tamices con luces de malla de 0,500;
0,250 y 0,125 mm.
5.6.- Perfil de aminoácidos.
Se siguió la metódica descrita por (Alaiz y col., 1992) en la cual la muestra se
hidroliza con 4 mL de HCl 6 N a 110 ºC por 24 horas. Posteriormente el hidrolizado de
aminoácidos se lleva a sequedad y se disuelve con buffer borato de sodio pH 9,
aforando a un volumen de 25 mL, luego se derivatizan 5 mL con 0,8 µl de
etoximetilenmalonato de dietilo a 50ºC por 50 minutos con agitación vigorosa. Se
18
inyectan 20 µl en el cromatógrafo HPLC. Se utilizó el equipo HPLC Merck Hitachi con
inyector Rheodyne 7725i, loop de 20 µl y detección espectrofotométrica UV-visible
modelo 484 a 280 nm, integrador D-2500, columna Nova Pack RP18 (3,9 x 300 mm y
un tamaño de partícula de 4 µm) Waters, con software Clarity Chromatography Station
para Windows La resolución de los derivados de aminoácidos se logró usando un
sistema de gradiente binario con flujo de 0,9 mL/min a temperatura ambiente
empleando como fase móvil buffer acetato de sodio pH 6 y acetonitrilo.
5.7.- Determinación de Fitoestrógeno.
Se siguió la metódica descrita por (wang y col., 1990) en la cual a 1 g de
muestra se agregó 24 mL de HCl 1 M, luego se calentó en baño de agua a 98 ºC por 2
horas, se deja enfriar y se agregaron 100 mL de acetonitrilo, después se agitó por 1
minuto y se diluyó 1 mL del sobrenadante con 1 mL de agua luego se filtro. Por último
este filtrado se analizó mediante HPLC. Se utilizó el mismo equipo señalado en la
sección 5.6 y una fase móvil de metanol: agua en gradiente binario con flujo de 0,7
mL/min con longitud de onda de 254 nm.
5.8.- Análisis y caracterización de polipéptidos que integran los aislados de quinua mediante Electroforesis (PAGE)
Se realizó de acuerdo al método descrito por LaemmLi U. K. (1970). Este
método describe la técnica PAGE que se realizó en función del estado de las proteínas
(nativo o desnaturalizado) a lo largo del proceso electroforético.
En la electroforesis nativa (PAGE-nativa), se sometió a las proteínas a
migración en un campo eléctrico. En esta situación las proteínas migran en función de
su carga, de su tamaño y de su forma. Para esto se utilizo un gel separador de
poliacrilamida al 5% en ausencia de SDS, para un gel de 1 mm de espesor.
En la electroforesis desnaturalizante (PAGE-SDS), las proteínas son sometidas
a migración en un campo eléctrico en presencia de un detergente aniónico (SDS),
asegurando la completa desnaturalización (pérdida de la estructura tridimensional). En
esta situación la migración es proporcional al tamaño molecular de la molécula pero no
a su carga. Para esto se utilizo un gel concentrador de poliacrilamida al 5% y un gel
separador de poliacrilamida al 12 %, para un gel de 1 mm de espesor.
19
Para la electroforesis desnaturante en condiciones reductoras se agregó a la
muestra 2-mercaptoetanol al 20% (Ver anexo 1, Fig. 20 y anexo 2).
Las masas moleculares de los polipéptidos fueron calculadas usando los
siguientes estándares de proteínas de 10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150 y 250 kDa,
Bio-Rad Presicion Plus Protein.
5.9.- Análisis de las características conformacionales de las proteínas en solución.
5.9.1.- Espectroscopia UV Se prepararon dispersiones de aislado al 1% en buffer de pH 3, 5, 7, 9 y 11, los
cuales se agitaron mediante vortex por lapsos de 15 minutos durante 1 hora, luego se
centrifugaron por 30 minutos a 10000 rpm. Por último se midió la absorción de las
muestras mediante un barrido de 250 a 450 nm (Abugoch, 2006; Mathews y col. 2002).
5.9.2.- Fluorescencia. Se prepararon dispersiones de aislado al 1% en buffer de pH 3, 5, 7, 9 y 11, los
cuales se agitaron mediante vortex por lapsos de 15 minutos durante 1 hora, luego se
centrifugaron por 30 minutos a 10000 rpm. Posteriormente Se estandarizó el contenido
de proteínas a 0,02 mg/mL, luego se procedió a la medición excitando a 270 y 290 nm
y obteniendo el espectro de emisión en cada caso en el rango de 300 a 500 nm a una
velocidad de barrido de 300 nm/min (Abugoch, 2006; Mathews y col., 2002;
Permyakov, 1993). 5.9.3.- Calorimetría diferencial de barrido (DSC)
Esta técnica permite medir la energía suministrada a una sustancia (muestra) y a
un material de referencia en función del tiempo o la temperatura, mientras que la
sustancia y el material de referencia son sometidos a un programa controlado de
calentamiento. Cabe señalar que la referencia debe estar constituida por un material
inerte el cual no sufre ningún cambio físico o químico en el rango de temperatura a
emplear (Añon y Jovanovich, 2000).
El método consiste en tomar entre 15 – 20 mg de la suspensión al 20 % del
aislado proteico en agua y en buffer de pH 9 y colocarla en una cápsula previamente
20
pesada y tarada, posteriormente sellar y colocar la muestra en el equipo de
calorimetría diferencial de barrido (DSC), se trabajó con un régimen de calentamiento
desde 10 a 120 ºC con un flujo de calor de 10ºC/ minuto, la cápsula de referencia
contenía el aislado proteico de quinua con la proteína previamente desnaturalizada
(Abugoch, 2006; Martínez y Añón, 1996).
5.10.- Determinación de las propiedades funcionales de hidratación 5.10.1.- Solubilidad
Se prepararon dispersiones proteicas al 1% p/v en buffer de pH 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9, 10 y 11. Las muestras se sometieron cada 15 minutos a agitación intensa y breve en
vortex durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador mecánico.
Seguidamente los tubos se centrifugaron a 10.000 rpm durante 30 minutos a 15°C.
(Scilingo, 2000). La proteína que queda en el sobrenadante se cuantificara mediante el
método descrito por Bradford, M. M. (1976) (Ver anexo 1, Fig. 19 y anexo 4).
5.10.2.- Capacidad de retención de agua
Se prepararon dispersiones proteicas al 1% p/v en buffer de pH 3, 4, 5, 7, 9 y
agua. Las muestras se sometieron cada 15 minutos a agitación intensa y breve en
vortex durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador mecánico. Seguidamente
los tubos se centrifugaron a 10.000 rpm durante 30 minutos a 15°C y se determinará la
masa de precipitado obtenido (Scilingo, 2000). La cantidad de proteína que puede
solubilizarse en las condiciones de ensayo se determino en el sobrenadante obtenido
luego de la centrifugación, haciendo uso del método de Bradford M. M. A (1976).
La capacidad de retención de agua se calcula de acuerdo a la siguiente ecuación:
Donde: ( )( )
dMMMMWHC
⋅−−
=1
312
WHC: Capacidad de retención de agua expresada en mL de agua por g de muestra.
M1: masa de muestra pesada en g.
M2: masa de precipitado obtenido en g.
M3: masa de la proteína soluble en g.
D: densidad del agua a 25º C (Ver anexo 5)
21
5.10.3.- Capacidad de absorción de agua Este método consiste en determinar la cantidad de agua que un polvo proteico
es capaz de absorber espontáneamente a una temperatura dada, cuando se pone en
contacto con una cantidad limitada de agua.
El equipo consiste en una pipeta de pequeño volumen graduada, cuyo eje
longitudinal se encuentra al mismo nivel que la superficie de contacto entre el agua y el
polvo proteico. El polvo se coloca sobre un papel filtro que está apoyado en una
superficie plana y en un embudo. Ambos, la pipeta y el embudo se conectan a través
de una manguera transparente (Fig. 6). Los resultado se expresan en cantidad de agua
absorbida por cantidad de aislado (mL de agua/ g aislado) en función del tiempo (Añón
y col, 2000) (Ver anexo 6).
Figura 6: Esquema del equipo utilizado para la determinación de absorción de agua del
aislado proteico de quinua A11.
5.11.- Análisis estadístico. Los resultados obtenidos fueron analizados utilizando la media aritmética y la
desviación estándar. Además se realizó un análisis de varianza con un nivel de
confianza del 95 % para ver si existen diferencias significativas entre los pH
estudiados. Para ello se utilizó el programa StatGraphics Plus 4.0 con el que se realizó
un ANOVA simple según Tukey y Duncan usando como variable dependiente el
análisis que corresponda y como variable independiente el pH.
22
VI. RESULTADOS Y DISCUSION
6.1.- Composición proximal
En la Tabla 3 se muestra la composición proximal del aislado proteico de quinua
A11, en donde se puede apreciar que el contenido de proteínas es bastante alto, pero
menor que para aislado proteico de soya (85,4% Tomotake y col., 2002) y también
menores a los obtenidos para aislado proteico de amaranto (90% Martínez y Añón,
1996). Otra investigación obtuvo un aislado proteico de amaranto con similares
resultados con un contenido de proteínas de 82,2% (Abugoch, 2006). El contenido de
humedad fue bajo, lo que le confiere estabilidad en el tiempo a las proteínas.
Tabla 3: Composición proximal del aislado proteico de quinua
Composición del aislado A11 % Proteínas* 83,5 ± 0,2 Humedad 6,8 Cenizas* 3,5
Hidratos de Carbono* 11,9 ± 0,2 Aw (25 ºC) 0,32
*Expresado en base seca.
6.2.- Determinación de fitoestrogenos
Se determinó el contenido de fitoestrogenos y se encontró que tanto el aislado
proteico como su materia prima no presentaron fitoestrogenos. En tres ecotipos de
quinua estudiados anteriormente, también procedentes de la VI Región, se encontró
fitoestrogenos del grupo isoflavonas, específicamente Genisteina y Daidzeina
(Araneda, 2004), por consiguiente, en estudios posteriores deberá determinarse si
estos compuestos quedan en el aislado o se pierden en el proceso de extracción de la
proteínas.
6.3.- Determinación de aminoácidos
Se determinó la composición de aminoácidos del aislado proteico de quinua
A11, los resultados expresados, se muestran en la Tabla 4, como g de aminoácidos/
100 g de proteína del aislado proteico de quinua A11.
23
Tabla 4: Composición de aminoácidos en g/100g de proteína de quinua
Aislado proteico de quinua
Ac. Aspártico 7,7 ± 0,12 Ac. Glutámico 16,1 ± 1,13 Serina 5,2 ± 0,00 Histidina* 2,5 ± 0,07 Glicina 5,5 ± 0,09 Treonina* 4,7 ± 0,05 Arginina* 9,8 ± 0,22 Alanina 4,1 ± 0,07 Tirosina 3,9 ± 0,05 Valina* 5,2 ± 0,12 Metionina* 2,6 ± 0,09 Cistina 0,7 ± 0,07 Isoleucina* 4,3 ± 0,10 Leucina* 7,6 ± 0,17 Fenilalanina* 4,5 ± 0,09 Lisina* 5,7 ± 0,12
* Aminoácidos esenciales.
La quinua contiene 16 aminoácidos, de los cuales 10 son esenciales: histidina,
treonina, arginina, valina, metionina, isoleucina, leucina, fenilalanina, lisina y triptófano.
Los que no pueden ser sintetizados por el organismo y deben ser aportados por la
dieta o en caso contrario pueden producir trastornos en la salud.
La lisina, uno de los aminoácidos más escasos en los alimentos de origen
vegetal, se muestra en la quinua en una proporción que al menos duplica la contenida
en los otros cereales. La importancia de la lisina se debe a que tiene funciones claves
en el desarrollo de las células del cerebro humano y en el crecimiento. De hecho, se la
asocia con el desarrollo de la inteligencia, la memoria y el aprendizaje.
24
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00
20,00
Ac. Asp
ártico
Ac. Glut
ámico
Serina
Histidi
na
Glicina
treon
ina
Arginin
a
Alanina
Tirosin
aVali
na
metion
inacis
tina
Isoleu
cina
Leuc
ina
Fenila
lanina
Lisina
Con
teni
do (g
/100
g p
rote
ina)
A11A9harinas VI Región
Figura 7: Grafico comparativo de aminoácidos entre el aislado proteico A11, un aislado
obtenido a pH 9 y un promedio de harinas de quinua de la VI región
Los aminoácidos en menor cantidad fueron histidina y metionina, similares
resultados se obtuvieron en harina de quinua (Ranhotra y col., 1993), en aislado
proteico de arveja (Rangel y col., 2003). Al comparar la composición de aminoácidos
de A11 con aislado proteico de salvado de arroz (Wang y col., 1999) se puede
observar que se obtuvieron resultados similares en todos los aminoácidos siendo la
cistina el de menor cantidad.
En la Figura 7 se puede ver que comparando con un aislado de quinua obtenido
a pH 9 (Rivera, 2006) el contenido de aminoácidos fue bastante similar no
destacándose el mayor contenido de algún aminoácido. Comparando con harinas de
quinua de la VI Región (Gajardo, 2006; Villarroel, 2006) se puede decir que ésta tiene
un contenido de ácido glutámico, glicina, treonina y alanina más alto que el aislado
A11; está diferencia se puede deber a los distintos ecotipos utilizados en aquellos
estudios.
25
Comparado con el patrón de aminoácidos propuesto por la FAO en la Tabla 5,
se puede decir que el contenido de aminoácidos del aislado A11 supera al patrón e
igualando en el contenido de lisina, demostrándose el alto nivel nutricional del aislado.
Tabla 5: Comparación entre el patrón FAO/OMS y el aislado A11
Aminoácidos Patrón FAO/OMS para
niños de 2-5 años g/
100 g de proteínas
A11
Histidina 1,9 2,5 Isoleucina 2,8 4,3 Leucina 6,6 7,6 Lisina 5,8 5,7
Metionina + Cistina 2,5 3,3 Fenilalanina + Tirosina 6,3 8,4
Treonina 3,4 4,7 Valina 3,5 5,2
6.4.- Tamizado
Los resultados arrojan que el tamaño de partícula del aislado proteico de quinua
A11. Tiene 35,33 % entre 0,250 y 0,500 mm; 58,37 % entre 0,125 y 0,250 mm y 4,82 %
menor a 0,125 mm.
6.5.- Espectroscopia UV En la Figura 8 se muestran los espectros UV de dispersiones al 1% del aislado
proteico de quinua en distintos pH. Se graficó el promedio de cada ensayo y su
duplicado. De donde se desprende que la estructura proteica es afectada por el pH,
observándose que hay un aumento de la absorbancia y de la longitud de onda a pH
alcalinos, encontrándose a pH 11 una absorbancia máxima a una longitud de onda de
376 nm.
También se puede decir que los pH 9 y 11 tienen una marcada diferencia con
respecto a los pH ácidos, probablemente debido a que los pH 3 y 5 están cercanos al
punto isoeléctrico, y por lo tanto habría menos concentración de proteínas,
26
obteniéndose por consiguiente una absorbancia menor que a pH alcalinos, en donde
las proteínas se encuentran parcialmente desnaturalizadas (Abugoch, 2006).
0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,82,0
300 320 340 360 380 400 420 440 460
Longitud de Onda (nm)
Abs
orba
ncia
pH 3
pH 5
pH 7
pH 9
pH 11
Figura 8: Espectros UV para aislado proteico de quinua a distintos pHs
La absorción sucede cuando las transiciones de energía elevada entre estados
electrónicos de una molécula conducen a la absorción en la región visible o ultravioleta
del espectro. La absorción proteica más fuerte se encuentra en dos márgenes de
longitud de onda dentro de las regiones ultravioleta, en la proximidad de 280 y 200 nm.
En el margen de 270-290 nm, vemos la absorción por las cadenas laterales aromáticas
de fenilalanina, tirosina y triptófano (Mathews y col., 2002).
6.6.- Espectroscopia de Fluorescencia
A continuación en la Figura 9 se muestran los espectros de fluorescencia, de
dispersiones de concentración 2 mg/mL del aislado proteico A11, en distintos buffers.
Se graficó el promedio de cada ensayo y su duplicado. En donde se puede observar
que la intensidad de fluorescencia es afectada por el pH, encontrándose un aumento a
pH alcalino acompañada de un corrimiento de las longitudes de onda máxima hacia
valores menores, observándose una intensidad máxima a pH 11 a una longitud de
onda de 346,5 nm.
27
Tabla 6: Longitud de onda e Intensidad de fluorescencia para el aislado proteico de quinua (A11)
pH Longitud de onda (nm) Intensidad
3 361 ± 0b 27,6 ± 0,0a
5 349 ± 0a 60,6 ± 3,2b
7 346 ± 3a 83,1 ± 1,5c
9 344 ± 1a 90,4 ± 2,5cd
11 348 ± 2a 91,1 ± 0,8d
(*Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas)
En la Tabla 6 se presentan las longitudes de onda e intensidades promedio en
donde se observa que a pH 3 y 5 los espectros presentan mayores diferencias con
respecto al pH 7 que los espectros obtenidos a pH alcalinos. Estas variaciones se
pueden atribuir a cambios en el entorno del triptófano inducido en una misma proteína
por efecto del pH o a la presencia de distintas especies proteicas con diferentes
contenidos de triptófano los que tendrían entornos moleculares diferentes (Abugoch,
2006).
Al comparar con los resultados obtenidos de un aislado proteico solubilizado a
pH 9 (A9) (Rivera, 2006), se puede decir que el aislado proteico de quinua a pH 11
(A11) tiene una tendencia similar que el aislado proteico obtenido a pH 9 (A9), pero el
aislado proteico A11 tiene intensidades de fluorescencia menores que los obtenidos
por el aislado proteico A9, esto debido a que este aislado tiene mayor solubilidad que
el aislado proteico A11 y por ende hay una mayor cantidad de proteínas en solución y
también podría deberse a diferencias en la estructura de las proteínas, dado que el
A11 presentó menor grado de estructura que el A9 (Rivera, 2006) debido al tratamiento
de obtención de este aislado. También se puede decir que ambos aislados proteico A9
y A11 podrían tener una composición similar pero con diferente grado de estructura.
28
0102030405060708090
100
310 330 350 370 390 410 430 450 470 490
Longitud de Onda (nm)
Inte
nsid
ad pH 3pH 5pH 7pH 9pH 11
Figura 9: Espectros de fluorescencia para aislado proteico A11 de quinua a distintos
pHs
La disminución de la intensidad de fluorescencia acompañada del corrimiento
de la longitud de onda máxima hacia el rojo nos estaría indicando la presencia de
residuos de triptófano más expuestos al medio polar en las estructuras a pH ácido y
por lo tanto un cambio en el grado de estructura (Abugoch, 2006).
El fenómeno de la fluorescencia se origina cuando las moléculas pasan a un
estado electrónico excitado por la absorción de energía radiante vuelve al estado basal
por una transferencia sin radiación de la energía de excitación a las moléculas
circundantes, es decir la energía vuelve como calor, pero en ocasiones una molécula
perderá solo una parte de su energía de excitación por transferencia y volverá a radiar
la parte mas grande. En las proteínas la tirosina y el triptófano son los grupos
fluorescentes más importantes (Mathews y col., 2002). El triptófano cuando es excitado
a 295 nm genera fluorescencia que es muy sensible a los cambios en el entorno vecino
a él (Royer, 1995). Este aminoácido da un espectro de mayor intensidad, que
fenilalanina y tirosina, que son frecuentemente apagadas por él, siendo por lo tanto el
fluorófobo dominante (Abugoch, 2006). El entorno de estos residuos puede modificar
en gran medida la intensidad de su fluorescencia, por esto, esta técnica es de gran
utilidad para observar los cambios de conformación proteica (Mathews y col., 2002).
29
6.7.- Análisis y caracterización de la composición de polipéptidos que integran el aislado proteico de quinua A11
6.7.1.- Electroforesis Nativa PAGE-nativo En la Figura 10 se presenta el gel obtenido en condiciones nativas para el
aislado proteico de quinua obtenido a pH 11 (A11),
Aquí se observaron principalmente 3 bandas proteicas, dos de las cuales
poseen baja movilidad, estas podrían corresponder albúminas y globulinas de acuerdo
a lo descrito por Martínez y Añón (1996). En condiciones nativas las proteínas de
quinua están compuestas principalmente por dos tipos de polipéptidos, albúminas del
tipo 2S y globulinas 11S ambas estabilizadas por puentes disulfuro con masas
moleculares de 3 - 4 kD y 7 - 9 kD (Brinegar y col., 1996; Brinegar y Goundan, 1993).
En comparación con un aislado proteico de quinua a pH 9 (A9) (Rivera, 2006),
se puede decir que no se encontraron diferencias, ya que esté presentó las mismas
bandas proteicas. Por otra parte, en contraste con resultados obtenidos para harina de
quinua (Villarroel, 2005; Gajardo, 2005) se puede decir que no concuerdan, ya que en
la electroforesis nativa para el aislado proteico de quinua (A11) se obtuvo una menor
movilidad de las proteínas y mayor número de bandas que las presentara la harina.
Figura 10: PAGE – Nativa de aislado proteico de quinua a pH 11 (A11) y pH 9 (A9)
30
6.7.2.- Composición polipeptídica a partir de electroforesis Desnaturante con y sin 2-mercaptoetanol (2-Me)
Cuando se investigan las subunidades de una proteína mediante esta técnica,
es aconsejable realizar dos experimentos: uno en presencia de un agente reductor de
enlaces disulfuro como el 2-mercaptoetanol y otro en su ausencia. De este modo, se
distinguirá entre las subunidades que se mantienen juntas mediante puentes de
disulfuro y las que se mantienen juntas solo mediante fuerzas no covalentes (Mathews
y col., 2002). En la Figura 11 se puede apreciar en a la electroforesis desnaturante en
ausencia de 2-mercaptoetanol y en b la electroforesis en presencia de 2-Me para el
aislado proteico de quinua obtenido a pH 11 (A11).
Para la electroforesis desnaturante en ausencia de 2-Me (a) se observaron
bandas proteicas de variadas masas moleculares de las cuales las más importantes
son 12,9; 14,5; 16,0; 17,1; 23,3; 27,6; 36,9 y 49,7 kDa, ya que son las bandas más
intensas que tienen una mayor cantidad de esas proteínas.
Figura 11: PAGE – SDS de aislado proteico de quinua a pH 11 (A11): a) sin 2-Me y b) con 2-Me
31
Tabla 7: Composición de polipéptidos del A11 con y sin 2-Me (kDa)
Con 2- Me Sin 2-Me 107,7 56,4 65,1 40,4 49,7 34,1 36,9 17,1 31,6 15,4 27,6 13,2 23,3 12,9 19,3 10,8 17,2 16,0 14,5 12,9 11,3
Para la electroforesis desnaturante en presencia de 2-Me (b) se observan
bandas proteicas de 12,9; 15,4; 17,1 y 34,1 kDa siendo estas las más intensas,
encontrándose una mayor intensidad de polipéptidos entre 11,3 y 12,9 kD. Además se
puede observar en la Tabla 7 que en comparación con la electroforesis en ausencia de
2-Me la desaparición de bandas, lo que da a entender la existencia de proteína
mantenidas por puentes de disulfuro (-S - S-), que son proteínas de mayor masa
molecular que al romperse sus enlaces disulfuro se convirtieron en proteínas de menor
masa molecular, como la banda obtenida a 49,7 kDa en presencia de 2-Me que se
rompe dos bandas de 17,1 y 34,1 kDa bandas más pequeñas.
Por otro lado las bandas mayores de 100 kDa son aglomerados proteicos,
proteínas que no se disolvieron.
Los resultados obtenido tanto para la electroforesis desnaturante en ausencia
de 2-Me como en presencia de 2-Me coinciden con los resultados obtenidos para un
aislado proteico de quinua obtenido a pH 9 (A9) (Rivera, 2006).
En estas condiciones, las estructuras secundarias, terciarias y cuaternarias de
las proteínas se descomponen todas. La cadena se despliega y se rodea de moléculas
de SDS. Las numerosas cargas negativas transportadas por las muchas moléculas de
32
SDS unidas a la proteína se hacen insignificantes. La cadena polipeptídica plegada se
transforma en un objeto alargado, cuya carga y longitud son proporcionales a la
longitud (y, por lo tanto al peso molecular) de la cadena (Mathews y col., 2002).
Las globulinas tipo 11S se caracterizan por tener dos grupos heterogéneos de
polipéptidos a 30 - 40 kD (subunidades ácidas) y a 20 - 25 kD (subunidades básicas)
las cuales son ligadas por puentes de disulfuro (Brinegar y Goundan, 1993). Por
consiguiente las bandas alrededor de 36,9 y 23,3 kD (en ausencia de 2-Me) serían
globulinas tipo 11S. Además concuerdan, ya que estas desaparecen en condiciones
reductoras ratificando la condición de estar ligadas por puentes de disulfuro.
Los polipéptidos 2S poseen masas moleculares de entre 8 – 9 kD bajo
condiciones reductoras (Brinegar y col., 1996), por lo tanto se encuentran polipéptidos
de este tipo a 10,8 kD en b.
6.8.- Calorimetría diferencial de barrido (DSC)
La calorimetría diferencial de barrido (DSC) es una técnica termo-analítica que
se usa para monitorear los cambios en la energía térmica asociados con las
transformaciones físicas y químicas de los materiales como función de la temperatura.
En tecnología de alimentos existen numerosos ejemplos en los cuales algunas
sustancias experimentan cambios físicos y/o químicos cuando se les suministra o
extrae calor como: cambios de fase en agua, grasas y lípidos, desnaturalización de
proteínas y gelatinización de almidones (Rodríguez y col., 2001; Martínez y Añón,
1996).
Esta técnica es relativamente sencilla. Mediante la DSC se mide la capacidad
calorífica relativa de un sistema determinado cuando sufre una transición inducida por
un cambio térmico. En el experimento, las celdas con la muestra y la referencia se
calientan simultáneamente a una misma velocidad predeterminada. Cuando se
calientan ambas celdas y se produce una transición inducida por la temperatura, la
muestra absorbe parte del calor que se le está suministrando a la celda (Beldarraín,
2001).
En la Figura 12, se muestra el termograma obtenido para el aislado proteico de
quinua a pH 11 (A11) en una suspensión al 20 % en agua, en donde se puede
observar una pequeña endoterma con dos transiciones térmicas con una temperatura
33
de desnaturalización de al menos Td = 96,1 ºC, semejantes a las descritas para
globulinas vegetales del tipo 11S (Abugoch, 2006; Martínez y Añón, 1996) y una
entalpía ∆H= 1,35 mJ lo que esta señalando que el aislado proteico de quinua A11
presentó poco grado de estructura, similar resultado se obtuvo para el aislado proteico
de amaranto extraído bajo las mismas condiciones que el de quinua (Abugoch, 2006)
Cuando el A11 es sometido a pH alcalino, zona de pH en la cual se ha descrito
para numerosas proteínas vegetales que las globulinas presentan mayor grado de
estructura (Abugoch, 2006; Martínez y Añón, 1996; Castellani y col, 1998).
En la Figura 13, se muestra el termograma obtenido para el aislado proteico de
quinua a pH 11 (A11) en una suspensión al 20 % en buffer de pH 9, en esta condición
de pH alcalino se encontró una endoterma con un poco mayor grado de estructura que
en agua donde se obtuvo dos transiciones térmicas a partir de Td = 99,2 y una entalpía
un poco mayor a la obtenida en agua, pero igualmente baja de 2,1 mJ/g lo que no s
sugiere que las moléculas de las proteínas del aislado proteico de quinua a pH 11
quedan prácticamente desestructuradas, ya al momento de ser extraídas a ese pH.
Similar resultado se obtuvo de un aislado proteico de amaranto en buffer de pH 9
(Abugoch, 2006).
34
Integra l - 1.35 mJPeak 96.10 °CLeft Li mit 91.67 °CRight L imit 110.34 °CHeating Rate 10.00 °Cmin^- 1
A11 e n agua 2, 05.10.2006 12:06: 11A11 e n agua 2, 17.2500 mg
mW
-2.2
-2.1
-2.0
-1.9
-1.8
-1.7
-1.6
-1.5
min
°C70.0 75. 0 80 .0 8 5.0 90.0 95.0 100.0 105.0 110.0 115 .0
6 .0 6.5 7.0 7.5 8. 0 8 .5 9.0 9.5 1 0.0 10.5
^ex o A 11 en agu a 2 05.10.2006 12:10:39
Univ ers idad de Santiago de Chile: Lab. Prop. Fis ic as Sy s te meRTAMETTL ER TOLEDO S Figura 12: Calorimetría diferencial de barrido del aislado proteico de quinua a pH 11
(A11) en una suspensión al 20 % en agua.
Integral -1.29 mJPeak 104.15 °CLeft Limit 98.95 °CRight Limit 112.47 °CHeating Rate 10.00 °Cmin^-1
Integral -0.82 mJPeak 94.31 °CLeft Limit 86.32 °CRight Limit 98.90 °CHeating Rate 10.00 °Cmin^-1
A11 pH 9 2, 05.10.2006 13:20:44A11 pH 9 2, 15.5800 mg
mW
-0.7
-0.6
-0.5
-0.4
-0.3
-0.2
m in
°C60. 0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95 .0 100.0 105.0 110.0 1 15.0
5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8 .0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5
^ex o A 11 pH 9 2 05.10.2006 13:25:10
Univ ers idad de Santiago de Chile: Lab. Prop. Fis ic as Sy s te meRTAMETTL ER TOLEDO S Figura 13: Calorimetría diferencial de barrido del aislado proteico de quinua a pH 11 (A11) en una suspensión al 20 % en buffer de pH 9.
35
6.9.- Solubilidad
Los resultados de la solubilidad en función del pH del aislado proteico de quinua
A11 se muestran en la Figura 14. En donde se observa que a pH 11 se obtuvo la
máxima solubilidad del aislado y a pH 3 la mínima solubilidad, observándose asimismo
una tendencia significativamente (p<0,05) ascendente de la solubilidad con el pH.
Teniendo una mayor solubilidad entre los pHs 8 – 11 oscilando entre 31,9 – 41,4 %.
d
a ab b
b
c ccd
51015202530354045
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12pH
% S
olub
ilida
d
Figura 14: Solubilidad del aislado proteico de quinua a diferentes pHs
Las variaciones de solubilidad con el pH, tienen que ver con la modificación de
la carga neta de las proteínas y por lo tanto con su balance electrostático; en la zona
cercana a su punto isoeléctrico (pI) la carga neta de las proteínas tiende a 0 y la
variación de la solubilidad es mínima debido al aumento de la atracción entre las
moléculas. Del lado alcalino al pI las proteínas tendrán una carga neta negativa y
probablemente mayor que la carga neta positiva que presenta en medio ácido, de este
modo las fuerzas repulsivas a pHs alcalinos y ácidos extremos serán más importantes
que las fuerzas de atracción aumentando la solubilidad (Abugoch, 2006). De acuerdo a
esto el punto isoeléctrico de las proteínas de quinua estaría entre los pH 3 y 4, menor
que el punto isoeléctrico reportado para harina de quinua, el cual es pH 6 (Oshodi,
1999; Ogungbenle, 2003) Los resultados de solubilidad para el aislado proteico de quinua A11 (41,4%)
son menores a los resultados obtenidos para un aislado proteico de quinua obtenido a
pH 9 (A9) (94,6% a pH 11) (Rivera, 2006), pero concuerdan en que a pH alcalino se
obtiene la mayor solubilidad, de igual manera coinciden con los resultados reportados
36
para harina de quinua en donde se reporto una solubilidad máxima a pH 10 de 50% y
45% (Ogungbenle, 2003; Oshodi y col., 1999).
En comparación con otros aislados proteicos como el de trigo negro (Tomotake
y col., 2002) que presentó, una tendencia a aumentar la solubilidad a pH alcalino
siendo esta mayor que la del A11 (55% a pH 10). Por otro lado en contraste con un
aislado proteico de mucuna (Adebowale y Lawal, 2003), se puede decir, que de igual
manera presentó una tendencia a aumentar su solubilidad a pH alcalino siendo está,
mucho mayor a la del aislado proteico de quinua A11 con un 96% a pH 12. Y al
comparar con la solubilidad de proteínas de harina de amaranto (Mahajan y Dua,
2002), se puede decir que este también presentó una solubilidad mayor que para el
aislado A11 con una solubilidad máxima de 70% a pH 12, y en el caso de aislados
proteico de amaranto (Abugoch, 2006) también presentó una solubilidad máxima a pH
11 con un 90%. También se puede incluir los datos reportados para un aislado proteico
de salvado de arroz (Wang y col., 1999) que arrojaron una solubilidad máxima de 82%
a pH 10 con una tendencia muy similar a la mostrada por el aislado proteico A11 a
partir del pH 6 a 12, ya que también mostró un lento aumento de la solubilidad. Todos
los aislados citados presentan un punto isoeléctrico a pH 4 similar al del aislado
proteico de quinua A11 y en general también muestran una tendencia similar
aumentando gradualmente la solubilidad a partir del pH 6-7 hacia la zona alcalina.
6.10.- Capacidad de Retención de Agua (WHC) La capacidad de retención de agua de las proteínas, WHC es un índice
importante en la evaluación del comportamiento de las mismas como ingrediente en
productos de panadería, carnes embutidas, salchichas y geles alimentarios. Esta
propiedad afecta no sólo las condiciones del procesamiento sino también la calidad
final de los productos (Abugoch, 2006; Pilosof, 2000).
En la Figura 15 se muestran los resultados de retención de agua para el aislado
proteico de quinua A11, en donde se aprecia que no existen diferencia significativas
(p>0,05) entre cada pH, obteniéndose un máximo a pH 4 y un mínimo a pH 7. Además
se puede decir que la retención de agua oscila entre 3,1 – 4,0 mL de agua por g de
aislado proteico, también que el valor obtenido a pH 7 se asemeja al obtenido en agua
destilada (control).
37
a
a
a
a aa
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
Agua 3 4 5 7 9
pH
WH
C m
l agu
a/g
aisl
ado
(Control)
Figura 15: Retención de agua del aislado proteico a diferentes pH expresado en
mL de agua por g de aislado proteico (*Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas)
Los valores de retención de agua para el aislado proteico de quinua A11 fueron
un poco mayores (4,0± 1,3a mL de agua/g aislado proteico) que los obtenidos para un
aislado proteico de quinua obtenido a pH 9 (A9) con un máximo de 3,0 ± 0,6a mL de
agua/g aislado proteico (Rivera, 2006), esto se podría deber en un principio, al mayor
grado de desnaturalización que presentaron las proteínas del aislado proteico A11,
pero el valor obtenido a pH 9 para este aislado es muy cercano al máximo, esto
sugiere que para que un aislado proteico presente una alta WHC, no basta solamente
con encontrarse desnaturalizado, sino que también es función de cómo se encuentran
las moléculas proteicas en los agregados luego del tratamiento. Solamente aquellos
agregados en que las proteínas tienen los grupos polares más accesibles al agua
serán los que posean mayor WHC (Abugoch, 2006). Y también podría deberse a que el
aislado A9 tiene una mayor solubilidad, por lo tanto una menor fracción insoluble que
retenga agua.
Por otra parte, la retención de agua máxima se obtuvo al mismo pH donde se
registró la mínima solubilidad, lo cual coincide con lo reportado por Abugoch (2006).
Los resultados obtenidos en los pH 3, 5 y 9 son menores en comparación con
los datos obtenidos para un aislado proteico de amaranto obtenido en las misma
condiciones (Abugoch, 2006), pero son similares a los obtenidos a pH 7 y en agua
destilada.
38
Los datos obtenido para un aislado proteico de trigo negro 3,32 g de agua /g de
aislado (Tomotake y col., 2002) son similares a los resultados del estudio. Pero estos
datos son bastante mayores que los reportados para harina de quinua (1,47 g de agua/
g de harina), harinas de mijo y sesamo (1,15 y 1,82 g de agua/ g harina
respectivamente) y harina de amaranto (1,8 g de agua/ g de harina) (ogungbenle,
2003; Oshodi y col., 1999 y mahajan y dua, 2002).
6.11.- Capacidad de Absorción de Agua (WIC) A continuación en la Figura 16 se muestran, las curvas de capacidad de
absorción de agua del aislado proteico de quinua A11, en donde se observa
inicialmente una rápida absorción de agua. Después se llega a la etapa de saturación,
donde el aislado ya no es capaz de absorber agua, obteniéndose un máximo. El tiempo
que le toma al aislado para llegar a este máximo se denomina tiempo de equilibrio.
Mediante las graficas se puede calcular la velocidad inicial (vi), el volumen máximo de
agua absorbido por gramo de aislado (WIC) y el tiempo de equilibrio (te). Estas son
características de cada muestra (Pilosof, 2000).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8tiempo (min)
WIC
(ml d
e ag
ua/ g
ais
lado
)
Figura 16: Capacidad de absorción de agua del aislado proteico de quinua A11
39
Para el aislado A11 la velocidad inicial de absorción fue de 3,5 ± 0,35 mL de
agua/min. g aislado, llegando al equilibrio a los 0,8 minutos y con valor de WIC
alcanzado de 2,8 mL de agua/g aislado. La velocidad inicial (1,1 mL de agua/min. g
aislado) reportado para un aislado proteico de amaranto obtenido en las misma
condiciones (Abugoch, 2006), es menor que la del aislado A11, pero la WIC es similar
con 2,5 mL de agua/g aislado. La mayor capacidad de absorción de agua es resultado
de una mayor desnaturalización de las proteínas.
En comparación con un aislado proteico de soya (Sorgentini y col., 1995). Este
aislado reporta una WIC de 4,5 mL/g de aislado considerablemente mayor a la WIC del
aislado A11 y comparando con una aislado proteico de quinua obtenido a pH 9 (Rivera,
2006), este obtuvo una menor velocidad de absorción con 1,34 mL de agua/min. g
aislado y también menor WIC con 1,8 mL/g de aislado, por lo tanto mayor tiempo de
equilibrio con 3,9 min, todo esto es debido probablemente a que el aislado A11 se
encontraría con un mayor de desnaturalización que el aislado A9.
La WIC es un parámetro muy importante desde el punto de vista tecnológico,
vinculado a la practica de rehidratación que normalmente se realiza antes de la
utilización de cualquier ingrediente proteico (Pilosof, 2000).
40
VII. CONCLUSIONES
El contenido de proteínas del aislado y su composición de aminoácidos fue
alto y contenía 10 aminoácidos esenciales: histidina, treonina, arginina,
valina, metionina, isoleucina, leucina, fenilalanina, lisina y triptófano. Siendo
el más importante la lisina, con una proporción que al menos duplicó el
contenido en otros cereales, ratificando su alta calidad nutricional.
El contenido de aminoácidos del aislado A11 superó al patrón propuesto por
la FAO, lo cual demuestra su alta calidad nutricional.
No se encontró la presencia de fitoestrógenos en el aislado proteico, debido
a que la harina de quinua utilizada para su elaboración no contenía estos
compuestos. En posteriores estudios deberá demostrarse si el proceso de
obtención del aislado afecta a dichas sustancias.
En espectroscopia UV se puede concluir que es afectada por el pH,
aumentado la absorbancia a pH alcalinos debido a un aumento de la
solubilidad de las proteínas.
En espectroscopia de fluorescencia se concluye que la estructura de las
proteínas es afectada por el pH, encontrándose que aumenta la intensidad
de fluorescencia a pH alcalinos y a la presencia de distintas especies
proteicas con diferentes contenidos de triptófano.
De la electroforesis nativa y desnaturante (PAGE) se puede concluir que las
proteínas de quinua están compuestas principalmente por dos tipos de
polipéptidos, albúminas del tipo 2S y globulinas 11S ambas estabilizadas
por puentes disulfuro.
En la calorimetría diferencial de barrido (DSC) las moléculas de las
proteínas del aislado de quinua presentaron un bajo grado de
estructuración, debido probablemente a la alcalinidad, del medio aplicado
para la obtención del aislado.
Con respecto a las propiedades funcionales de hidratación, para solubilidad
se concluye que ésta es máxima a pH 11 y mínima a pH 3, el cual sería su
punto isoeléctrico, esto implica que el aislado A11 podría ser utilizado en
bebidas carbonatadas.
41
Con respecto a la capacidad de retención de agua (WHC), se concluye que
el pH no tiene efecto sobre ésta. El aislado A11 presentó una alta retención
de agua obteniéndose un producto óptimo para su aplicación en embutidos,
salchichas y geles.
En la capacidad de absorción de agua (WIC) se puede concluir que el
aislado tuvo una gran velocidad inicial de absorción y también una WIC
bastante alta, también se puede concluir que aquellas proteínas más
desnaturalizadas presentan mayor capacidad de absorción de agua. Lo que
lo hace aplicable en la práctica de hidratación, sopas y también como por
ejemplo en el desarrollo de alimentos funcionales altamente proteicos.
De los resultados de solubilidad se puede suponer una alta capacidad
espumante en el aislado, debido a que ambas propiedades se relacionan.
Dicha capacidad se evidenció a través del manejo del aislado, pero deberá
ser evaluada en estudios posteriores.
Del estudio realizado se puede concluir que el aislado proteico de quinua
posee características nutricionales y funcionales excepcionalmente aptas
para su utilización a escala industrial, por lo tanto queda la ventana abierta
a estudios sobre su utilización en el desarrollo de productos que incorporen
el aislado proteico.
42
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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glutelinas y aislados proteicos de amaranto (amaranthus hypochondriacus).
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47
ANEXOS
48
ANEXO 1 Figura 17: Centrifuga Heraeus Figura 18: Rotor de Centrifuga Sepatech Suprafuge Figura 19: Espectrofotómetro Perkin Figura 20: Equipo Bio-Rad para Elmer Lambda Electroforesis Figura 21: Mini Secador Spray Figura 22: Unidad Destiladora
49
ANEXO 2
Caracterización de los perfiles polipeptídicos del aislado proteico de quinua Electroforesis PAGE
Reactivos 1. Buffer del electrodo o de corrida (pH 8,3): disolver 3,0 g de Tris, 14,4 g de
glicina y 1,0 g de SDS en un litro de agua destilada. En la preparación del buffer
nativo no incorporado SDS.
2. Buffer del gel de concentración (pH 6,8): disolver 6,0 g de Tris y 0,4 g de SDS
en 40 mL de agua destilada. Ajustar el pH con HCl 4 N, y completar el volumen
a 100 mL. En la preparación del buffer nativo no incorporar SDS.
3. Buffer del gel de separación (pH 8,8): disolver 18,2 g Tris y 0,4 g de SDS en 40
mL de agua destilada. Ajustar con HCl 4 N, y completar el volumen a 100 mL.
En la preparación del buffer nativo no incorporar SDS.
4. Solución de persulfato de amonio: disolver 200 mg de persulfato de amonio en
2 mL de agua destilada, eliminar el gas de la solución y congelar en pequeñas
alícuotas. Esta solución permanece estable por aproximadamente cuatro años.
5. Solución colorante: disolver 1,25 g de Coomassie Blue R en 227 mL de metanol
y 46 mL de ácido acético glacial. Completar con agua destilada a 500 mL.
6. Solución decolorante: mezclar 70 mL de ácido acético glacial, 300 mL de etanol
y completar el volumen a 1 litro con agua destilada.
7. Solución archilamida / Bis-acrilamida: disolver 30 g de archilamida y 0,8 g de
bis-acrilamida en 100 mL de agua destilada. Almacenar en frasco oscuro a 4
ºC.
8. Buffer de muestra desnaturante con β-mercapto: mezclar 2,5 mL buffer de gel
de concentración (pH 6,8) con sds, punta de espátula de azul de bromofenol, 4
mL de glicerol y 2 mL de β-mercapto Completar a 10 mL.
9. Buffer de muestra desnaturante: mezclar 2,5 mL buffer de gel de concentración
(pH 6,8) con sds, punta de espátula de azul de bromofenol y luego 4 mL de
glicerol. Completar a 10 mL.
50
10. Buffer de muestra nativa: mezclar 4 mL buffer de gel de concentración (pH 6,8)
(nativo), punta de espátula de azul de bromofenol y 4 mL de glicerol. Completar
a 10 mL.
11. SDS 10%: disolver 10 g de sds en 50 mL de agua destilada y completar a 100
mL.
12. Gel concentrador al 5 %: Para 2 geles, 2,1 mL de agua destilada, 0,5 mL de
A/BA, 0,38 mL de tris-HCl pH 6,8 1 M (buffer gel de concentración), 0,03 mL de
SDS 10%, 0,03 mL de PSA 10% y 0,003 mL de TEMED.
13. Gel separador al 12 %: para 2 geles, 2,182 mL de agua destilada, 4,008 mL de
A/BA, 2,6 mL de tris-HCl pH 8,8 1,5 M (buffer gel de separación), 0,1 mL de
SDS 10%, 0,1 mL de PSA 10 % y 0,01 mL de TEMED.
14. TEMED
15. Agua destilada
16. Etanol
17. Estándar de peso molecular
Materiales
• Espátula
• Tubos ependorf
• Micropipetas
• Toalla nova
• Matraces
• Papel Kraft
• Potes plásticos
• Mechero
• Regilla de asbesto
• Trípode
• Plumavit
• Hielo
• Guantes
51
Equipos
• Balanza analítica
• Agitador vortex
• Congelador
• Microcentrífuga
• Refrigerador
• Conjunto para electroforesis Bio-Rad, con kit para preparación de geles,
cuba de corrida y fuente de poder.
Preparación de las muestras para electroforesis PAGE 1. Pesar 5 mg de aislado en un tubo ependorf
2. Agregar 100 µl de la solución desnaturante con β-mercapto, desnaturante o
nativa, según corresponda.
3. Agitar breve e intensamente en vortex a intervalos de 5 minutos, durante 15
minutos.
4. Calentar las muestras durante 1 minuto en agua hirviendo (esto se hace
solo con las muestra desnaturantes), insertando los tubos en plumavit para
que floten.
5. Centrifugar a temperatura ambiente por 15 minutos a 14000 rpm.
6. Recolectar el sobrenadante en otro tubo ependorf. Almacenar los tubos en
congelador hasta llevar a cabo la electroforesis.
7. Cuando se desee ocupar, calentar las muestras durante 1 minuto en agua
hirviendo (esto se hace solo con las muestra desnaturantes), insertando los
tubos en plumavit para que floten.
Procedimiento para electroforesis nativa 1. Los geles se preparan entre dos placas de vidrio perfectamente limpias, es
por esto que antes de comenzar con la preparación de los reactivos, es muy
importante lavar los vidrios con detergente liquido, enjuagar con abundante
agua destilada y por último ponerles alcohol y secarlos con toalla nova.
2. Colocar los vidrios en el soporte del equipo Bio-Rad, procurando que
queden bien derechos y fijos al soporte.
52
3. Preparar gel al 5 %.
4. Colocar la mezcla en seguida entre las placas de vidrios, con la ayuda de
una micropipeta (hasta que resbale), usando guantes colocar el peine,
procurando que no queden burbujas.
5. Retirar los vidrios del soporte y colocarlos en la cubeta de corrida del
equipo Bio-Rad, siempre con el peine hacia adentro.
6. Quitar el peine con cuidado y cargar las muestras cuidadosamente con
micropipeta.
7. Cargar el buffer del electrodo (pH 8,3) (nativo) el espacio entre los vidrios
sobrepasando la placa más pequeña. Posteriormente completar con buffer
del electrodo (por fuera) todos los espacios de la cuba de corrida (hasta
cubrir los electrodos).
8. Tapar la cuba de corrida y conectarla a la fuente de poder (cable rojo con
rojo y negro con negro). Programada 200 voltios por aproximadamente 40
minutos, o hasta que la muestra haya alcanzado el borde inferior del gel.
9. Apagar el equipo y remover los vidrios de la cuba de corrida.
10. Retirar el gel cuidadosamente con la ayuda de una espátula o con las
manos, usando guantes, y colocarlo estirado en un recipiente que contenga
solución colorante, dejar reposar por tres o cuatro horas a temperatura
ambiente, si se desea se pude acelerar esta etapa a 60 ºC por 10 minutos.
11. Retirar la solución colorante y adicionar decolorante, esta etapa también
puede ser acelerada a 60 ºC, cambiar la solución a medida que se vaya
tornando azulada. La solución decolorante puede ser reaprovechada
adicionándole carbón activado y filtrándola.
Procedimiento para electroforesis desnaturante 1. Los geles se preparan entre dos placas de vidrio perfectamente limpias,
es por esto que antes de comenzar con la preparación de los reactivos,
es muy importante lavar los vidrios con detergente liquido, enjuagar con
abundante agua destilada y por último ponerles alcohol y secarlos con
toalla nova.
53
2. Colocar los vidrios en el soporte del equipo Bio-Rad, procurando que
queden bien derechos y fijos al soporte.
3. Preparar gel separador al 12 %.
4. Colocar en seguida 3,5 mL de la mezcla (gel separador) entre los vidrios
con la ayuda de una micropipeta. Cubrir la superficie con alcohol, la que
debe ser adicionada lentamente.
5. Sacar los vidrios del soporte y retirar la capa de alcohol que cubre el gel
separador, lavando con abundante agua destilada.
6. Secar entre los vidrios con papel absorbente.
7. Preparar gel de concentración al 5 %.
8. Colocar en seguida 1,5 mL (o hasta que rebalse) de la mezcla (gel
concentrador) entre los vidrios, sobre el gel separador, con la ayuda de
una micropipeta. Usando guantes colocar el peine, procurando que no
queden burbujas.
9. Retirar los vidrios del soporte y colocarlos en la cubeta de corrida del
equipo Bio-Rad, siempre con el peine hacia adentro.
10. Quitar el peine con cuidado y cargar las muestras cuidadosamente con
micropipeta.
11. Cargar el buffer del electrodo (pH 8,3) el espacio entre los vidrios
sobrepasando la placa más pequeña. Posteriormente completar con
buffer del electrodo (por fuera) todos los espacios de la cuba de corrida
(hasta cubrir los electrodos).
12. Tapar la cuba de corrida y conectarla a la fuente de poder (cable rojo
con rojo y negro con negro). Programada 200 voltios por
aproximadamente 40 minutos, o hasta que la muestra haya alcanzado el
borde inferior del gel.
13. Apagar el equipo y remover los vidrios de la cuba de corrida.
14. Retirar el gel cuidadosamente con la ayuda de una espátula o con las
manos, usando guantes, y colocarlo estirado en un recipiente que
contenga solución colorante, dejar reposar por tres o cuatro horas a
temperatura ambiente, si se desea se pude acelerar esta etapa a 60 ºC
por 10 minutos.
54
15. Retirar la solución colorante y adicionar decolorante, esta etapa también
puede ser acelerada a 60 ºC, cambiar la solución a medida que se vaya
tornando azulada. La solución decolorante puede ser reaprovechada
adicionándole carbón activado y filtrándola.
ANEXO 3
Determinación de Hidratos Carbono Método Reacción de ANTRONA
Reactivos
• Ácido perclórico al 52%
• Ácido sulfúrico al 76%
• Agua destilada
• Solución de antrona
• Solución patrón de glucosa 0,05 mg/mL
• Solución patrón de glucosa 0,1 mg/mL
Materiales
• 4 Tubos de ensayo con tapa
• Baño de agua (a ebullición)
• Baño de agua fría (con hielo)
• Embudo analítico
• Matraz aforado de 100 mL
• Matraz aforado de 250 mL
• Matraz erlenmeyer con tapa
• Papel filtro
• Varilla de vidrio
Equipos Espectrofotómetro
Procedimiento 1. Pesar 1 g de muestra seco ó 2 g de muestra húmeda en un matraz erlenmayer con
tapa.
2. Agregar 10 mL de agua destilada.
55
3. Agitar con una varilla de vidrio hasta completa homogeneización.
4. Agregar 15 mL de ácido perclórico al 52%.
5. Agitar y tapar.
6. Dejar por 12 horas para que hidrolice la muestra.
7. Agregar agua al matraz hasta completar 100 mL aproximadamente.
8. Filtrar la solución con embudo analítico y papel filtro. Recibir el filtrado en un matraz
aforado de 250 mL.
9. Lavar el precipitado, el matraz y el papel filtro con agua destilada (recibiendo la
solución en el matraz de 250 mL).
10. Tomar una alícuota de 10 mL y aforar con agua destilada.
11. Tomar una alícuota de 1 mL de dicha solución y colocarla en un tuvo de ensayo
con tapa.
12. Agregar 5 mL de solución de antrona y agitar.
13. Llevar a baño de agua a ebullición por exactamente 12 min.
14. Enfriar inmediatamente con agua fría.
15. Leer en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 630 nm
16. La misma reacción se realiza a 1 mL de glucosa (1 mg/mL) y a 1 mL de glucosa (5
mg/mL).
ANEXO 4
Determinación de Solubilidad Reactivos
• Bicarbonato de sodio
• Fosfato dihidrógeno de potasio
• Tetraborato de sodio
• Ácido clorhídrico fumante 37 %
• Hidróxido de sodio
• Cloruro de sodio
• Ácido cítrico monohidratado
Materiales
• Cronómetro
56
• Espátula
• Micropipeta
• Toalla nova
• Tubos ependorf
Equipos
• Agitador vortex
• Balanza analítica
• Microcentrífuga
• PHmetro
Procedimiento
1. Se prepararan dispersiones proteicas al 1% p/v en buffers de pH 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, y 11:
2. Pesar 10 mg del aislado proteico en tubos ependorf.
3. Agregar a cada tubo 1,0 mL de buffer.
4. Agitar la muestra cada 15 minutos de manera intensa y breve en vortex durante
1 hora a temperatura ambiente.
5. Centrifugar los tubos a 10.000 rpm, durante 30 minutos, a 15°C.
6. Cuantificar la proteína que queda en el sobrenadante mediante el método
descrito por Bradford, M. M. (1976).
ANEXO 5
Capacidad de Retención de Agua (WHC) Reactivos
• Solución estándar de albúmina (BSA) (± 1 mg/mL)
• Agua destilada
• Reactivo de Bradford (Disolver 100 mg de azul brillante de Cromassie G-250 en
50 mL de etanol al 95%, agregar 100 mL de ácido fosfórico al 85%. Llevar a un
litro con agua destilada. Agitar al menos por 2 horas, protegido de la luz directa.
Filtrar con papel Whatman Nº 1. Almacenar en botella de vidrio. Conservar a 4º
C.
57
Materiales
• Cronómetro
• Cubetas de acrílico para espectrofotómetro
• Cubetas de cuarzo para espectrofotómetro
• Espátulas
• Micropipetas
• Toalla de papel
• Tubos ependorf
Equipos
• Agitador vortex
• Balanza analítica
• Espectrofotómetro Unicam UV/Vis UV 3
• Microcentrífuga
Procedimiento 1. Se prepararán dispersiones proteicas al 1% p/v en buffer de pH 3, 4, 5, 7, 9 y
agua.
2. Pesar los tubos ependorf, y luego en cada uno de ellos pesar una cantidad de
muestra equivalente a 10 mg de harina.
3. Agregar a cada tubo 1,0 mL de agua destilada.
4. Las muestras se someterán cada 15 minutos a agitación intensa y breve en
vortex durante 1 hora, a temperatura ambiente.
5. Acto seguido, los tubos se centrifugarán a 10.000 rpm durante 30 minutos a
15°C y se determinará la masa de precipitado obtenido.
6. Separar el sobrenadante.
7. Con el fin de estandarizar las condiciones de la determinación, invertir los tubos
ependorf con el precipitado obtenido y se dejar reposando sobre papel
absorbente durante 10 min, antes de pesarlos.
58
8. Pesar los tubos con el precipitado, para obtener por diferencia la masa de
precipitado obtenido.
9. La cantidad de proteína que puede solubilizarse en las condiciones de ensayo
se determinará en el sobrenadante obtenido luego de la centrifugación,
haciendo uso del método de Bradford M. M. A (1976).
10. La capacidad de retención de agua se calcula de acuerdo a la siguiente
ecuación:
WHC = (m2 – (m1-m3))/m1 d
Donde:
WHC: Capacidad de retención de agua expresada en mL de agua por g de muestra.
M1: masa de muestra pesada en g.
M2: masa de precipitado obtenido en g.
M3: masa de la proteína soluble en g.
D: densidad del agua a 25º C.
ANEXO 6
Capacidad de Absorción de Agua (WIC) Materiales
• Filtro bacteriológico Millipore de 4 cm de diámetro o filtro Buchner con papel de
filtro tipo Whatman.
• Pipeta graduada de 1mL.
• Manguera flexible para conectar el filtro con la pipeta.
• Cronómetro
Procedimiento
1. El equipo mantenido a temperatura constante se llena con agua, evitando la
incorporación de burbujas y se coloca el papel de filtro dejando que embeba
agua aproximadamente 5 min.
2. Con un papel absorbente se elimina el exceso de agua sobre el papel de filtro
hasta lograr enrasar en cero la columna de agua en la pipeta.
3. Se deja 5-10 min para verificar la nivelación del equipo (en este tiempo no debe
variar la posición del menisco de agua).
59
4. Se pesa 50 a 100 ± 0,1 mg de muestra.
5. Se esparce la muestra rápidamente formando una monocapa uniforme sobre el
papel de filtro mojado mientras se dispara un cronómetro.
6. Se registra el retroceso de la columna de agua en la pipeta en función del
tiempo hasta que ésta no varíe más.
7. El tiempo para llegar al valor de equilibrio puede variar entre 5 min y 2 horas,
dependiendo del tipo de proteína y granulometría de la muestra.
Curvas de Absorción de Agua La cantidad de agua absorbida (q) a cada tiempo se expresa como mL de agua/g masa
seca (MS) y se grafica en función del tiempo.
ANEXO 7
Preparación de Buffers Buffer pH 3: mezclar 4,2028 g de ácido cítrico monohidratado, 0,4 g de NaOH y 2,34 g
de NaCl, disolver en 40 mL de agua destilada, ajustar pH y aforar a 100 mL.
Buffer pH 4: mezclar 4,2028 g de ácido cítrico monohidratado, 0,92 g de NaOH y 1,4 g
de NaCl, disolver en 40 mL de agua destilada, ajustar pH y aforar a 100 mL.
Buffer pH 5: mezclar 4,2028 g de ácido cítrico monohidratado, 1,3 g de NaOH y 0,29 g
de NaCl, disolver en 40 mL de agua destilada, ajustar pH y aforar a 100 mL.
Buffer pH 6: mezclar 50 mL de fosfato dihidrógeno de potasio 0,1 M, 5,6 mL de NaOH
0,1 M y 1,3 g de NaCl y ajustar pH.
Buffer pH 7: mezclar 50 mL de fosfato dihidrógeno de potasio 0,1 M, 29,1 mL de NaOH
0,1 M y 1,85 g de NaCl y ajustar pH.
Buffer pH 8: mezclar 50 mL de fosfato dihidrógeno de potasio 0,1 M, 46,7 mL de NaOH
0,1 M y 2,26 g de NaCl y ajustar pH.
Buffer pH 9: mezclar 50 mL de tetraborato de sodio 0,025 M, 4,6 mL de HCl 0,1 M y
1,35 g de NaCl y ajustar pH.
Buffer pH 10: mezclar 50 mL de bicarbonato de sodio 0,05 M, 10,7 mL de NaOH 0,1 M
y 1,57 g de NaCl y ajustar pH.
Buffer pH 11: mezclar 50 mL de bicarbonato de sodio 0,05 M, 22,7 mL de NaOH 0,1 M
y 1,85 g de NaCl y ajustar pH.
60
Buffer acetato de sodio pH 6: disolver 2,05075 g en 800 mL de agua ajustar pH con
HCl y aforar a 1 lt.
Buffer borato de sodio 1 M pH 9: disolver 17,78 g de ác. Bórico y 11,79 g de NaOH en
300 mL de agua ajustar pH y aforar a 500 mL.
ANEXO 8
Cuantificación de Proteínas – Método de BRADFORD Reactivos
• Solución estándar de albúmina (BSA) (± 1 mg/mL)
• Agua destilada
• Reactivo de Bradford
Materiales
• Cubetas de acrílico para espectrofotómetro
• Cubetas de cuarzo para espectrofotómetro
• Micropipetas
• Toalla de papel
• Tubos ependorf
Equipos
• Agitador vortex
• Espectrofotómetro Unicam UV/Vis UV 3
Procedimiento
Preparación del Estándar de proteína
Pesar en balanza analítica 10 mg exactos de albúmina de bovino, completar con 990
ul de agua destilada y disolver suavemente. Una vez disuelto, diluir en tubos de 1,5
mL la solución concentrada de 10 mg/mL de BSA tomando 100 ul de esta solución y
completando a 1 mL con 900 ul de agua destilada, agitar en vortex etiquetar y
congelar hasta el momento de su utilización.
Cada vez que se realice una curva de calibración, se debe comprobar la concentración
del estándar, leyendo a 280 nm, usando como blanco agua destilada. El valor obtenido
se divide por 0,63 y este resultado da la concentración exacta del estándar en mg/mL.
61
Curva de Calibración
Tubo 1 2 3 4 5
Estándar BSA (µl) 0 10 20 30 40
Agua (µl) 50 40 20 20 10
Agitar con vortex los tubos ependorf cerrados.
Reposar 5 minutos y agregar, tener cuidado de cada vez que se agrega este reactivo
agitar cada tubo cerrado con el vortex.
Bradford (µl) 1500 1500 1500 1500 1500
Dejar reposar 10 minutos y leer a 595 nm
Medición de Proteínas de las Muestras Los péptidos presentes en el sobrenadante de las muestras, se determinan de acuerdo
al método descrito por Bradford, la sensibilidad de este método oscila de 1 a 40 ul de
proteínas, por lo que hay que estimar el porcentaje de proteínas aproximado que se
espera en la muestra para caer en el rango de la curva.
El método a seguir es el siguiente:
Tomar entre muestra y agua destilada 50 ul, agitar después de agregar el solvente,
dejar reposar 5 minutos y después agregar 1500 ul de reactivo de Bradford.
Dejar reposar 10 minutos y leer las muestras en el espectrofotómetro a una longitud de
onda de 595 nm.
Dibujar la curva de calibración: cantidad de BSA (eje de las abscisas) contra
absorbancia obtenida a una longitud de onda de 595 nm (eje de las ordenadas).
La absorbancia resultante de las muestras, se interpola a la curva de calibración y se
extrapola de esta al eje de las X, para conocer la cantidad de proteína contenida en la
muestra. La curva de calibración debe hacerse en paralelo con la medición de la
muestra.