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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Maestría en Bromatología y Tecnología de la Industrialización de alimentos
“PRESERVACIÓN DE JUGO DE DURAZNO MEDIANTE LA APLICACIÓN
DE OZONO. EFECTO SOBRE LA CALIDAD Y LA ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA”
Tesis presentada para optar al título de Magister en Bromatología y Tecnología de la
Industrialización de Alimentos.
Autora: Gabriela Maribel Jaramillo Sánchez
Directora: Dra. Analía B. García Loredo
Codirectora: Dra. Paula L. Gómez
Buenos Aires, Marzo 2014
I
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por su amor infinito y por haberme brindado la oportunidad de cumplir este sueño.
A Analìa y Paula, por cada una de sus enseñanzas, por haberme dirigido durante todo este tiempo, por su apoyo y dedicación para llevar a cabo esta investigación, por su amistad y solidaridad en todo momento.
A la Dra. Stella Alzamora un agradecimiento especial, no solo por los conocimientos impartidos, sino también por el apoyo incondicional que me ha brindado desde el momento que llegue a esta universidad.
A la Secretaría Nacional de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación (SENESCYT), por el aporte financiero brindado para la realización de esta maestría.
A Sebastián, Mariana por estar dispuestos a ayudar en lo que se pueda, por su amistad, por su compañerismo.
A Jaime, por estar siempre presto para ayudar en lo que necesitaba.
A mis compañeros: Alondrita, Mónica, Alejandra, Prisilla, Tatiana, Sandrita, Angélica, Laura, Adriana, Karolina, Wilson, por ser más que compañeros, ser la familia del diario vivir con quien compartimos alegrías y gratos momentos.
A Fabián por su amistad y ayuda.
A mi mamita y hermanos Patricio, Leonardo y David por su infinito cariño y apoyo a pesar de la distancia.
A mi esposo Diego por su incondicional amor, compañía, apoyo y estar en todo momento enseñando a confiar en Dios.
A todos quienes han sido parte de este sueño y de una u otra manera formaron parte de él.
Gaby
II
A mi esposo
A mi mamita
A mis hermanos
_________________________________________________________________Índice
III
1. OBJETIVOS……………………………………………………………….…….......1 1.1 ObjetivoGenerales…….....…………………………………………………………..2 1.2 Objetivos específicos………..……………………………….……………………. ..2
2. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………...4
2.1 Atributos de calidad en los alimentos…..…………………….……………………...5
2.1 El Durazno….……………………………………..…................................................8
2.2.1 Generalidades………….…………………………..……........................................8
2.2.2 Taxonomía y morfología……….….…………………….………………………..9
2.2.3 Productos derivados del durazno…….….……….……….………………………..9
2.3 Procesamiento Mínimo de Frutas………….…………………..……………….…. 10
2.3.1 Generalidades y concepto……….………………………….……………….…....10
2.3.2 Ozono……….…………………………………………………………...…….….11
2.3.2.1 Generación de Ozono…….………………………………………….……........12
2.3.2.2 Factores que influyen en la eficacia del tratamiento con ozono………..……....13
2.3.2.3 Efecto del ozono sobre los microorganismos….…………………………….....14
2.3.2.4 Uso del ozono en la industria de alimentos…….………………………..…….15
2.3.2.5 Uso del ozono en jugos de frutas…………………………………………..…..16
2.3.2.6 Efectos del ozono en la calidad de los alimentos líquidos……….……..……...16
2.4 Enzimas de importancia en la calidad de jugos......................................................18
2.4.1 Polifenoloxidasa (PPO) (E.C. 1.14.18.1)..………………………………..……..19
2.4.2 Peroxidasa (POD) (E.C. 1.11.1.7) ………………………………………..…......20
2.4.3 Pectinmetilesterasa (PME) (EC. 3.1.1.11)…………………………………...…..20
2.4.4 Influencia del tratamiento de ozono en las enzimas estudiadas……………........21
2.4.5 Modelos matemáticos usados para el modelado de enzimas………………..…....22
2.5 Medición de color en alimentos: evaluación…..…………………………..……….24
2.6 Reología de los alimentos: evaluación de jugos…….………………………..….…33
2.6.1 Viscosidad…………………………………….…………………………….…....34
2.6.1.1 Clasificación de fluidos …………….……………………………………..…...36
2.6.1.2 Viscosidad en jugos de frutas….………………………………………….…...38
3. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………..…..…….41
3.1 Materia Prima………………………………………………………………..……..41
3.2 Reactivos...................................................................................................................41
3.3 Preparación de la muestra……….……………………………………………….....42
3.4 Aplicación de ozono gaseoso….………………………………………………..….42
_________________________________________________________________Índice
IV
3.4.1 Descripción del equipo…….………...…………………..……………………….42
3.4.2 Concentración y tiempos de exposición……….……………………………........44
3.5 Evaluación de parámetros de calidad……….……………………………………...44
3.5.1 Determinación de pH, sólidos solubles y acidez titulable….………………..…...44
3.5.1.1 Determinación de pH……...…………………………..………………..……....44
3.5.1.2 Determinación de sólidos solubles…...……….………..……………….……...44
3.5.1.3 Determinación de acidez titulable…..…………..……………….…….…….....44
3.5.2 Determinación del índice de pardeamiento no enzimático (PNE)….……...….…45
3.5.3 Medición instrumental de color….………………………………………............45
3.5.4 Medición instrumental de las propiedades reológicas…….……………………..47
3.6 Determinación de la actividad enzimática………….…………………………..…..48
3.6.1 Determinación de la actividad enzimática de la peroxidasa (POD)
(E.C. 1.11.1.7) …………………………………………………………………..48
3.6.1.1 Extracción de POD……………………………………………………………..48
3.6.1.2 Determinación de la actividad POD………………………………...………….48
3.6.2 Determinación de la actividad enzimática de la polifenoloxidasa (PPO)
(E.C. 1.14.18.1)…………………………………………………………………..49
3.6.2.1 Extracción de PPO…….………………………………………………..……...49
3.6.2.2 Determinación de la actividad PP0 ….…………………………………...…..49
3.6.3 Determinación de la actividad enzimática de la pectinmetilesterasa (PME)
(EC. 3.1.1.11)……..………………………………………………………………49
3.6.3.1 Extracción de PME …….…………………………………………...………….49
3.6.3.2 Determinación de la actividad PME ………………...……………….………..50
3.6.4 Determinación del contenido de proteínas………………..……………….……..51
3.6.5 Análisis de la cinética de inactivación de las enzimas POD y PPO.……………..52
3.7 Análisis estadístico………..……………………………………………….…….....55
4. RESULTADOS…...………………………………………………………………...56
4.1 Efecto del Ozono sobre pH, sólidos solubles y acidez titulable en jugo de
durazno……………………………………………………………….……………..57
4.2 Determinación del índice de pardeamiento no enzimático (PNE)……..……….......61
4.3 Estudio de los cambios de color por efecto del ozono en el jugo de durazno..….....63
4.4 Efecto del tratamiento de ozono en las propiedades reológicas del jugo de
durazno……...…………………...…………………………………………………..78
4.5 Actividad enzimática en el jugo de durazno………..………………………….…..85
_________________________________________________________________Índice
V
4.5.1 Efecto del ozono sobre la actividad enzimática de PME, POD y PPO…..……..85
4.5.2 Modelado de las curvas de inactivación de las enzimas POD y PPO…..………90
5. CONCLUSIONES…………….………………………………………………….101
6. BIBLIOGRAFÍA…………….………………………………...…………………104
1. OBJETIVOS
____________________________________________________________Objetivos
2
1.1 Objetivo general
Para el consumidor la calidad (organoléptica y nutricional) de un producto
alimenticio determina su valor. En la actualidad tanto las frutas como sus subproductos
(jugos, puré, néctares y otros) son fundamentales dentro de la dieta del hombre. Los
jugos de frutas se destacan por ser una fuente importante de compuestos bioactivos
como vitaminas, compuestos fenólicos, antocianinas y carotenoides. La presencia de los
compuestos antes mencionados en las frutas promueve la salud y han sido considerados
de gran importancia para la prevención de patologías crónicas, tales como enfermedades
cardiovasculares, diversos tipos de cáncer, diabetes, y enfermedades neurológicas.
Las tecnologías convencionales de conservación como los tratamientos térmicos
siempre han resultado ser las más eficaces en cuanto a inocuidad de productos se
refiere, sin embargo, en muchos de los casos provocan pérdidas severas de calidad,
tanto organoléptica como nutricional. Es por ello que se encuentran en estudio diversas
tecnologías emergentes (pulsos eléctricos, ozono, ultrasonido, radiación ultravioleta, luz
pulsada, etc.), con el objeto de obtener productos inocuos con un mínimo
procesamiento, que conserven sus características de calidad (mínimas perdidas de color,
textura, aroma, sabor y contenido de nutrientes).
El objetivo general de esta tesis fue evaluar el efecto del ozono gaseoso sobre la
calidad y la actividad enzimática de jugo de durazno.
1.2 Objetivos específicos
1) Evaluar el efecto de la aplicación de ozono gaseoso en función del tiempo de
exposición y de la concentración aplicada, sobre los sólidos solubles, el pH, la
acidez titulable y el pardeamiento no enzimático de jugo de durazno.
2) Evaluar los cambios en el color y las propiedades reológicas para las diferentes
concentraciones de ozono y tiempos de exposición analizados.
____________________________________________________________Objetivos
3
3) Estudiar el efecto del ozono gaseoso sobre la actividad de las enzimas
pectinmetilesterasa (PME), peroxidasa (POD) y polifenoloxidasa (PPO) presentes
en el jugo de durazno.
4) Describir matemáticamente las curvas de actividad enzimática (actividad residual vs
tiempo de exposición) evaluando diferentes modelos, y establecer cuál de ellos es el
más adecuado para una descripción completa de la conducta de la actividad
enzimática por efecto de los tratamientos.
2. INTRODUCCIÓN
____________________________________________________________Introducción
5
2.1 Atributos de calidad en los alimentos
La calidad de los productos determinan su valor para el consumidor, y ésta es
una combinación de atributos que incluyen apariencia, textura y valor nutritivo. La
importancia relativa de cada parámetro va depender de cada producto y si va a ser
consumido fresco o cocido (Kader, 2002).
Por su parte Abbott (1998) sugirió que el término calidad implica el grado de
excelencia de un producto o de su idoneidad para un uso determinado. Además,
menciona que la calidad de los productos abarca propiedades organolépticas (aspecto,
textura, sabor y aroma), valores nutritivos, componentes químicos, propiedades
mecánicas, propiedades funcionales y defectos.
A los consumidores, el orden de los atributos de calidad que normalmente los
afectan a la hora de aceptar o rechazar un producto son: primero el aspecto visual y de
color, seguido por el sabor, aroma y textura. El aspecto del producto suele determinar si
un producto es aceptado o rechazado, por lo que este es uno de los atributos más
importantes de calidad. El valor nutricional es una característica oculta que afecta al
consumidor en forma que no puede percibir, pero este atributo de calidad es cada vez
más valorado por los consumidores, científicos y profesionales médicos (Barrett y col.,
2010).
En el caso de frutas y verduras, los consumidores juzgan la calidad de éstas en
base a la apariencia y frescura, posterior a ello su satisfacción va depender de la textura
y sabor del producto, así como su calidad nutricional y la inocuidad de los mismos
(Kader, 2002). En cambio para otros productos como los jugos de frutas, las principales
características de calidad para el consumidor son el color, la presencia o ausencia de
turbidez y su calidad nutricional (Suárez-Jacobo y col., 2011).
! Apariencia y Color
La apariencia de un producto es determinada por su aspecto físico como el color,
el tamaño, la forma, el brillo, la consistencia y la integridad. También se hace referencia
a la presencia de defectos internos y/o externos (golpes, daños mecánicos, daños
fisiológicos, manchas, etc). Todos estos factores (apariencia) atraen al consumidor hasta
que este lleve el producto a la boca donde recién perciben el aroma y sabor del producto
(Barrett y col., 2010; Hutchings, 2003; Viñas y col., 2013).
____________________________________________________________Introducción
6
El color y la forma son atributos de suma importancia que influyen en la
selección de un alimento (Hutchings, 2003), el primer acercamiento del consumidor al
alimento es por su color, aceptándolo cuando presenta un color adecuado o
rechazándolo cuando su color no es el característico (Badui, 2006). Algunos estudios
reportan que los consumidores rechazan los productos a los que intencionalmente se les
ha modificado el color, aún cuando el resto de propiedades sensoriales (aroma, sabor y
textura) permanecen inalteradas (Badui, 2012).
El color de un alimento depende de cuatro factores:
• el contenido de sus pigmentos naturales, los vegetales incluyen clorofilas,
carotenoides, betalainas y flavonoides;
• el contenido de sus pigmentos naturales transformados durante el procesamiento,
almacenamiento y preparación, como ocurre por ejemplo con la clorofila que
pasa de color verde a café, los carotenoides rojos se oxidan y se convierten en
anaranjados o las antocianinas que se alteran con el pH;
• la presencia de los colorantes usados como aditivos;
• las reacciones de oscurecimiento enzimático y no enzimático (Badui, 2012).
! Textura
Las propiedades texturales de un alimento son “el conjunto de características
físicas que surgen de los elementos estructurales de los alimentos detectadas por el
tacto, están relacionadas con la deformación, la desintegración y el flujo del alimento
bajo una fuerza, y son medidos objetivamente por funciones de masa, tiempo y
distancia” (Bourne, 2002).
La textura es una propiedad sensorial cuyo estudio es complejo ya que el
consumidor distingue con la boca, los ojos, las manos y el oído, y de esta forma puede
describir el alimento como blando, cremoso, crocante, pegajoso, elástico, suave, untoso,
viscoso, etc. (Badui, 2012). En los alimentos existen dos grandes grupos de texturas:
los que están en forma natural en los tejidos animales (carne, pescado, etc.) y vegetales
(vegetales, frutas, etc.), y los llamados coloides o dispersiones. Las células vegetales y
animales tiene una estructura muy compleja y la unión de millones de ellas genera
distintos tejidos pluricelulares, los mismos que a su vez integran por ejemplo en el
músculo de las carnes, el crujiente de las frutas o los sólidos de cereales y leguminosas.
____________________________________________________________Introducción
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Los coloides por su parte no son celulares, contienen sustancias sólidas y líquidos cuyas
interacciones crean un sistema de dos fases: una continua o medio de dispersión y otra
discontinua o dispersa. En base a estas interacciones moleculares se generan distintos
sistemas coloidales entre los cuales tenemos: espumas, espuma sólida, soles (dispersión
coloidal sólido-líquida), emulsiones y geles (Badui, 2012).
La textura de las frutas y verduras se debe a la turgencia, a la composición de las
paredes celulares (celulosa, hemicelulosa, sustancias pépticas, proteínas, y en el caso de
los vegetales la lignina) de las plantas individuales y a la laminilla media que es la que
mantiene las células individuales en forma conjunta (Barrett y col., 2010). Los atributos
más destacables en frutas como manzana, pera y duraznos se encuentran la firmeza,
jugosidad, crujencia, granulosidad, harinosidad, fibrosidad, entre otras.
Los jugos son los principales derivados de las frutas y pueden ser clasificados
según el contenido de pulpa en purés y jugos (Ibarz y col., 1992). Los jugos son tratados
como una suspensión coloidal que se componen de una fase insoluble (la pulpa)
dispersa en una solución viscosa (fase acuosa) (Pedro y col., 2012).
! Flavor: aroma y sabor
El término flavor integra la percepción del sabor y aroma de muchos compuestos
(Karder, 2002). Los compuestos del aroma son volátiles y se perciben principalmente
con la nariz, mientras que los receptores del gusto están en la boca y se ven afectados
durante la masticación. El sabor se ha dividido en cinco sabores primarios: dulce, agrio,
salado, amargo y umami (sabor que se asocia con sales de ácidos y nucleótidos). Los
olores son mucho más diversos y difíciles de clasificar, sin embargo se ha intentado
agruparlos en: picante, floral, frutal, balsámico o resinosa y quemado (Barrett y col.,
2010).
El flavor de la frutas está influenciado por su contenido de azúcares (dulzor),
ácidos orgánicos (acidez), compuestos fenólicos (astringencia) y el olor activo de los
volátiles (aroma) (Kader, 2002; Viñas y col., 2013). En la evaluación del flavor de las
frutas y vegetales, es importante considerar "off - flavor", éstos resultan en sabores
desagradables (descriptos como rancio u oxidado) catalizados por la acción de enzimas
tales como la peroxidasa o la lipooxigenasa, que forman radicales libres reactivos e
hidroperóxidos que pueden catalizar la oxidación de compuestos lipídicos (Barrett y
col., 2010).
____________________________________________________________Introducción
8
! Valor Nutricional
Las frutas y vegetales son una fuente importante de nutrientes "macro", como la
fibra y carbohidratos, y nutrientes "micro" como la vitamina C, A, E, minerales (Ca,
Mg, Na, K, Fe, Cu) y otros compuestos como los polifenoles y carotenoides (Barrett y
col., 2010; Kader, 2002). Estas son relativamente bajas en calorías y grasa, no tienen
colesterol, también tienen un bajo contenido de sodio y alto contenido de potasio. El
ácido ascórbico en frutas y verduras mejora la biodisponibilidad de hierro en la dieta
(Vicente y col., 2009).
La presencia de fitoquímicos en frutas y verduras que promueven la salud han
sido considerados de gran importancia para la prevención de patologías crónicas, tales
como enfermedades cardiovasculares, diversos tipos de cáncer, diabetes, y
enfermedades neurológicas (Quintão-Teixerira y col., 2013). Los duraznos son una
fuente rica en compuestos bioactivos tales como los carotenos, además poseen
compuestos ricos en fibra soluble e insoluble, con predominio de la fibra insoluble (que
mejora la función intestinal), y entre los minerales se destaca su riqueza en potasio;
también presenta en su composición cumarinas, las cuales se conoce por su acción
protectora vascular (Viñas y col., 2013). Los hidratos de carbono, ácidos orgánicos y
compuestos fenólicos se encuentran entre los principales componentes del jugo de
durazno (Versari y col., 2002).
2.2 El Durazno
2.2. 1 Generalidades
El durazno o melocotón es el nombre tanto del árbol como de la fruta que se
produce, esta contiene una única y gran semilla encerrada en una cáscara dura, es de
piel aterciopelada (roja o amarilla), posee una carne amarilla o blanquecina, y enviste un
sabor dulce con regusto ácido que despide un aroma delicado; pertenece a la subfamilia
pronoides (drupa), y junto con las ciruelas es de las drupas más representativas.
Además, es la segunda especie frutal de mayor importancia, después del manzano, en
las rosáceas.
El durazno, como fruto, posee una composición media formada por: agua en un
77-90%, azúcares totales del 6 al 16%, proteínas alrededor del 0,3-0,9%, grasa tan sólo
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el 0,1%, ácidos del 14 a 17 (meq/100 g), pectina (pectato cálcico) del 0,6 -1%, cenizas
en un 0,3-0,6% y fibra del 0,3 al 1,4% (Chirinos-Lozada, 1996).
De los azúcares presentes los más representativos son la glucosa (1,47%),
fructosa (0,93%) y sacarosa (6,66%). Entre los aminoácidos característicos se destacan:
aspártico, glutámico, isoleucina, prolina, treonina y valina. El durazno contiene ácido
málico (20-64%), ácido cítrico (12-36%) y ácido quínico (16-40%). Otras sustancias
importantes de este fruto son los carotenoides, responsables del color rojo-amarillo
(Herrero y Guardia, 1992).
Los principales productores de durazno son China, EE.UU., Italia y España. De
acuerdo con la Organización para la Agricultura y la Alimentación, la producción
mundial de duraznos y nectarinas en 2011 fue de aproximadamente 21,5 millones de
toneladas, de los cuales Argentina produjo un aproximado de 285 mil toneladas (FAO,
2011).
2.2.2 Taxonomía y morfología
Familia: Rosáceas.
Género: Prunus.
Especie: Prunus pérsica. Incluye al melocotón o durazno, la nectarina.
Fruto: Drupa de gran tamaño. La aparición de huesos partidos es un carácter varietal.
Existen dos grupos según el tipo de fruto: de carne blanda con pulpa sin adherencia al
endocarpio y de carne dura con pulpa fuertemente adherida.
Tipo Pavía: Son variedades de pulpa dura o semidura adherida al hueso. Hay múltiples
variedades según sea su aprovechamiento (industria, consumo y fresco) y su origen,
destacando: An-dross, Catherina, Everts, Suney, Tirrenia, Ionia, Serena, Federica,
Romea, Carson, Muntaingold y Sudanell.
2.2.3 Productos derivados del durazno
Entre los productos que se pueden elaborar con el durazno se encuentran: las
mermeladas, duraznos en almíbar, jugos, néctares, purés y frutas deshidratadas entre
otros.
Los jugos de frutas son una fuente importante de compuestos bioactivos como
vitaminas, compuestos fenólicos, antocianinas y carotenoides (Cullen y col., 2010). El
____________________________________________________________Introducción
10
interés de los consumidores por productos naturales y saludables ha ido creciendo y
contribuyendo al aumento del consumo de jugos y bebidas a base de frutas, como
néctares, cócteles y bebidas ligeras. En función de su contenido de pulpa se los puede
clasificar en dos grupos principales: los purés y jugos, los cuales se obtienen por
trituración o por estrujamiento. Los jugos contienen coloides (pectina, celulosa,
hemicelulosa, lignina y almidón) y son los derivados líquidos más importantes de frutas
en la industria alimentaria (Ibarz y col., 1992; Santin y col., 2008).
Los hidratos de carbono, ácidos orgánicos y compuestos fenólicos son
marcadores útiles para la evaluación de las condiciones de almacenamiento, de
procesamiento de frutas y la autenticidad de los jugos de frutas. Los ácidos orgánicos,
ácido málico y cítrico, han sido correlacionados con la percepción sensorial de acidez y
los compuestos fenólicos se los asocia a sus propiedades antioxidantes.
2.3 Procesamiento Mínimo de Frutas
2.3.1 Generalidades y concepto
El uso de las tecnologías convencionales, como el tratamiento térmico para la
inactivación microbiana y la extensión de la vida útil ha resultado muy eficaz, sin
embargo estas tecnologías resultan en la degradación acelerada de la calidad sensorial,
nutritiva, y funcional de los productos alimenticios. Los avances tecnológicos más
recientes han permitido la aplicación de tratamientos menos drásticos a los alimentos
con la promesa de obtener productos seguros y de buena calidad. Estas tecnologías se
denominan tecnologías de procesamiento mínimo, y los productos alimenticios
obtenidos por sus aplicaciones se conocen como alimentos mínimamente procesados
(Ngadi y col., 2012).
El objetivo de estos métodos incluye procedimientos que causen los mínimos
cambios posibles en la matriz del alimento. Estas tecnologías han sido diseñadas para
obtener alimentos naturales, simil frescos, con un mínimo deterioro en el color, la
textura, el flavor y el contenido de nutrientes. Al mismo tiempo estas tecnologías deben
proveer alimentos con la suficiente vida útil para ser transportados desde su lugar de
producción hasta el consumidor (Alzamora y col., 2000; Ngadi y col., 2012).
Entre las tecnologías emergentes encontramos:
• alta presión,
____________________________________________________________Introducción
11
• campos de pulsos eléctricos,
• radiación ionizante,
• luz pulsada de alta intensidad,
• luz ultravioleta (UV-C),
• ultrasonido de alta intensidad,
• ozono,
• antimicrobianos naturales, etc.
En el caso de los jugos, tradicionalmente se pasteurizan y aunque se trata de un
tratamiento corto, normalmente a este método convencional se lo asocia con la pérdida
de las propiedades nutritivas y organolépticas. Los productores de jugo de frutas han
encontrado en las tecnologías de procesamiento mínimo una alternativa para producir
jugos mínimamente procesados con leves cambios en la calidad de los mismos (Cullen
y col, 2010; Franz y col., 2009; Patil y col., 2010a, b).
2.3.2 Ozono
El ozono (O3) resulta de la reordenación de los átomos de oxígeno cuando sus
moléculas son sometidos a descarga eléctrica de alto voltaje, la reacción de los radicales
libres de oxígeno diatómico con el oxígeno dan lugar a la formación de moléculas de
oxígeno triatómicas. El gas obtenido (ozono) posee un olor acre o picante asociado al
olor del aire fresco después de una tormenta, es de color azulado a temperaturas
ordinarias y tienen fuertes propiedades oxidantes (Patil y Bourke, 2012; Zeynep y col.,
2003).
Aunque en bajas concentraciones el ozono no es un gas extremadamente tóxico,
las altas concentraciones de este gas pueden ser fatales para los humanos. En los
EE.UU., la Administración Federal de Seguridad y Salud Ocupacional (OSHA)
especificó límites de exposición al ozono con un umbral de 0,1 ppm para la exposición
continua durante un período de 8 horas y de 0,3 ppm durante un período de 15 minutos
(Karaca y Velioglu, 2007; Zeynep y col., 2003).
El ozono se caracteriza por su alto potencial de oxidación que transmite
propiedades bactericidas y viricidas. Es un potente agente antimicrobiano de amplio
espectro activo frente a bacterias, hongos, virus, protozoos, y esporas bacterianas y
fúngicas. Como desinfectante es más eficaz y rápido que el cloro, reacciona con muchos
____________________________________________________________Introducción
12
materiales orgánicos y produce menos productos de descomposición (Cullen y col.,
2010).
El ozono, es parcialmente soluble en agua, relativamente estable en el aire, pero
muy inestable en agua, se descompone en un tiempo muy corto, consecuentemente no
se puede almacenar y se debe generar continuamente. El ozono a temperatura de 20 °C
tiene una vida media de 20 minutos y este tiempo aumenta conforme disminuye la
temperatura. El único producto de ozono que se genera cuando se descompone es
oxígeno, por lo tanto, los productos alimenticios tratados con ozono no dejan residuos
en los alimentos. Estas ventajas hacen del ozono una tecnología de procesamiento
atractiva para la industria alimentaria (Karaca y Velioglu, 2007; Cullen y col., 2010).
2.3.2.1 Generación de Ozono
En la naturaleza, la generación de ozono se produce cuando las moléculas de
oxígeno reaccionan en presencia de descargas eléctricas y por la acción de la radiación
electromagnética de alta energía. Existen varios métodos para la generación de ozono
entre ellos tenemos: de descarga eléctrica (arcos eléctricos de alta tensión),
fotoquímicos (radiación UV), métodos químicos, térmicos, y métodos electrolíticos
(Patil y Bourke, 2012).
Método de descarga eléctrica (Corona)
En este método se utilizan dos electrodos uno de alta tensión y uno de baja
tensión (electrodo de tierra). Se hace pasar aire seco u oxígeno adecuadamente entre dos
electrodos de alto voltaje separados por un material dieléctrico, que es generalmente
vidrio (Figura 2-1). Cuando los electrones tienen la energía cinética suficiente para
disociar la molécula de oxígeno, una cierta fracción de estas colisiona y una molécula
de ozono puede formarse a partir de cada átomo de oxígeno. Si se hace pasar aire como
un gas de alimentación a través del generador se puede producir del 1-3 % de ozono, en
cambio el uso de oxígeno puro como gas de alimentación permite rendimientos de hasta
6 % de ozono.
____________________________________________________________Introducción
13
Figura 2-1. Esquema de la generación de ozono por el método de descarga eléctrica.
2.3.2.2 Factores que influyen en la eficacia del tratamiento con ozono
Hay diferentes parámetros que afectan la eficacia de desinfección del tratamiento
con ozono (Patil y Bourke, 2012):
- parámetros extrínsecos: velocidad de flujo, concentración de ozono y
temperatura, que afectan a la difusión y la solubilidad del ozono en los medios
de desinfección.
- parámetros intrínsecos: pH y la matriz orgánica que afectan a la reactividad del
ozono.
La eficiencia del ozono en la inactivación microbiana o la eliminación de
residuos dependen en gran medida de factores medioambientales. Un aumento en la
temperatura del medio acuoso resulta en la disminución de la solubilidad del ozono, y
por lo tanto, disminuye su eficiencia. La descomposición de ozono también se acelera
con el incremento de temperatura. La estabilidad y la eficiencia del ozono se
incrementan al disminuir el pH. El incremento de la humedad es otro factor que refuerza
la eficacia del ozono (Karaca y Velioglu, 2007).
Además de los factores mencionados anteriormente, la eficiencia del ozono se ve
afectada por otro factor llamado “demanda de ozono del medio”. El ozono es una
molécula muy reactiva y reacciona con casi todos los compuestos orgánicos e
inorgánicos (Karaca y Velioglu, 2007). El término “ozono residual” es usado para una
concentración detectable en el medio de tratamiento, después que el ozono se ha
aplicado a un producto alimenticio específico. La efectividad del ozono (para la
inactivación microbiana o degradación de residuos) depende de la cantidad aplicada,
____________________________________________________________Introducción
14
pero más del ozono residual en el medio. La estabilidad de ozono bajo condiciones de
uso y la presencia de sustancias que demandan ozono en el medio de tratamiento afectan
en gran medida el nivel de ozono residual (Kim y col., 2003). En comparación con otros
medios de tratamiento, el agua pura tiene menos demanda de ozono. Las impurezas en
el agua, por ejemplo, minerales, reaccionan con el ozono aplicado, y por tanto aumenta
su demanda. El ozono aplicado en sistemas alimenticios, alimentos ricos en materia
orgánica, reacciona con todos los compuestos y por ende la cantidad de ozono requerida
(para la inactivación microbiana o degradación de residuos) es mayor (Karaca y
Velioglu, 2007).
2.3.2.3 Efecto del ozono sobre los microorganismos
Los efectos bactericidas del ozono han sido estudiados para una variedad de
organismos, incluyendo bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, así como las
esporas y células vegetativas. La eficacia antimicrobiana del ozono con respecto a los
microorganismos relacionados con los alimentos ha sido estudiado para levaduras
(Candida albicans y Zygosaccharomyces bacilos), esporas de Aspergillus niger y
bacterias: (Zeynep y col., 2003):
• Gram positivas: Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus
cereus, Enterococcus faecalis.
• Gram negativas: Pseudomonas aeruginosa y Yersinia enterocolitica,
El ozono es muy inestable tanto en fase gaseosa o en solución, descomponiéndose
en radicales hidroxilo (•OH), hidroperóxido (•HO2) y superóxido (•O2-). La reactividad
del ozono se atribuye al poder oxidante de los radicales libres, que son responsables de
la inactivación microbiana. La inactivación por el ozono es un proceso complejo que
actúa sobre diversos componentes de la membrana y pared celular (por ejemplo, las
grasas no saturadas) junto con el contenido de los componentes celulares (por ejemplo,
enzimas y ácidos nucleicos) (Cullen y col., 2010).
Los microorganismos son inactivados por la ruptura de la envoltura celular o
desintegración que conduce a la lisis celular. Tanto el ozono molecular y los radicales
libres producidos por su descomposición juegan un papel en este mecanismo de
inactivación, pero no hay consenso sobre sus mecanismos de acción. La disrupción o
destrucción de células por lisis asociado con el ozono es un mecanismo de inactivación
____________________________________________________________Introducción
15
más rápida que la de otros desinfectantes que requieren que el agente desinfectante
penetre a través de la membrana celular. En general, con respecto al espectro de la
acción microbiana cada microorganismo tiene una sensibilidad inherente al ozono. Las
bacterias son más sensibles que las levaduras y hongos. Las bacterias Gram positivas
son más sensibles al ozono que los organismos Gram-negativos y las esporas son más
resistentes que las células vegetativas (Pascual y col., 2007).
2.3.2.4 Uso del ozono en la industria de alimentos
El ozono tiene numerosas aplicaciones potenciales en la industria alimentaria
debido a sus ventajas significativas sobre los agentes antimicrobianos tradicionales tales
como el cloro, sorbato de potasio, etc. (Cullen y col., 2010). El ozono como oxidante se
utiliza en el tratamiento de agua natural, en el lavado y desinfección de frutas y verduras
y en el procesamiento de jugos para la inactivación de microorganismos patógenos y de
deterioro (Cullen y col., 2009). También se ha utilizado tratamientos con ozono en la
carne, aves de corral, huevos y alimentos secos (Karaca y Velioglu, 2007).
Los alimentos se tratan principalmente con ozono gaseoso o agua ozonizada. El
tipo de tratamiento aplicado al producto depende del alimento (líquido o sólido) y del
proceso (lavado o limpieza o si es aplicación directa). Estudios previos han demostrado
que el ozono acuoso es más eficaz que el ozono gaseoso en la descontaminación de
productos intactos, mientras que el ozono gaseoso presenta la ventaja como aditivo
antimicrobiano directo en alimentos líquidos (Cullen y col., 2010). Aunque el ozono es
altamente efectivo contra los microorganismos en suspensiones de células puras, es
poco probable que se utilice directamente en los alimentos cuya demanda de ozono sea
alta, ya que los componentes orgánicos de tales alimentos compiten con los
microorganismos por el ozono, y por lo tanto, pueden ser necesarias altas dosis de este
agente para la eliminación eficaz de los microorganismos. Estos altos niveles de ozono
también pueden alterar los atributos sensoriales, y afectar negativamente la
aceptabilidad de los alimentos (Karaca y Velioglu, 2007).
En 1997 la United States Food and Drug Administration (FDA) reconoció al
ozono como GRAS (Generally Recognized As Safe) para su utilización en contacto con
alimentos. No obstante fue en 2001 cuando este organismo aprobó la normativa del uso
de ozono como aditivo directo de alimentos, ello generó interés entre investigadores y
en la industria de alimentos (Tiwari y col., 2008b).
____________________________________________________________Introducción
16
2.3.2.5 Uso del ozono en jugos de frutas
La ozonización u ozonación en jugos de frutas se encuentra aún en sus inicios.
La aprobación del ozono como aditivo directo llevó a la aplicación de ozono en el
procesamiento de varios jugos de frutas, incluyendo sidra de manzana (Choi y Nielsen,
2005), jugo de naranja (Tiwari y col., 2008a, b), jugo de mora (Tiwari y col., 2009c),
jugo de fresa (Tiwari y col., 2009d), entre otros.
En los Estados Unidos, la FDA emitió una norma definitiva que exige a los
productores de jugos de frutas y vegetales la reducción de 5 ciclos log de los patógenos
más resistentes (E. coli, Salmonella, Listeria monocytogenes) (Patil y col., 2010a, b;
Cullen y col., 2010). Por lo general, los estudios sobre la absorción de ozono en
sistemas acuosos se llevan a cabo en reactores de tanque agitado o columnas de
burbujeo (Cullen y col., 2009).
2.3.2.6 Efectos del ozono en la calidad de los alimentos líquidos
El ozono en algunos casos puede promover el deterioro oxidativo en los
alimentos. La aplicación de ozono en dosis que conducen a una descontaminación
eficaz de microorganismos puede afectar las cualidades sensoriales y nutricionales de
los alimentos (Patil y Bourke, 2012). Los efectos del tratamiento con ozono sobre la
calidad sensorial y nutricional en diversos estudios se muestran en la Tabla 2-1.
Números estudios se han realizado en jugos de frutas con tratamiento de ozono y
en ellos se ha reportado una pérdida significativa de los pigmentos de color, y en
consecuencia una pérdida de color del jugo (Cullen y col., 2010).
El contenido de antocianinas disminuyó significativamente por efecto del ozono
en jugos de frutilla, mora y uva. Una reducción significativa del 98,2 % en el contenido
de pelargonidina-3-glucósido fue observada en jugo de frutilla tratado con una
concentración de ozono del 7,8% (p/p) y 10 minutos de exposición (Tiwari y col.,
2009d). En jugo de mora fue reportada una reducción mayor al 90% en el contenido de
cianidina-3-glucósido en condiciones similares de tratamiento a la utilizada en jugo de
frutilla (Tiwari y col., 2009c). En el caso del jugo de uva se observaron cambios
significativos en el contenido de antocianinas (Tiwari y col., 2009e). La degradación de
las antocianinas o el ácido ascórbico durante el tratamiento con ozono en jugos de frutas
podría ser debido a una reacción directa con el ozono, o a reacciones indirectas con
____________________________________________________________Introducción
17
oxidantes secundarios tales como hidroxilo •OH, •HO2, •O2- y •O3
- (Tiwari y col., 2009
a).
Tabla 2-1. Efecto del tratamiento de ozono en la calidad sensorial y nutricional de los
jugos de fruta.
Jugo Atributos de sensoriales y nutricionales Referencia
Jugo de naranja
Color (↓), pardeamiento no enzimático (PNE)
( ̴ ),pH ( ̴ ),acidez titulable (AT)( ̴ ), ac.
ascórbico (↓)
Tiwari y col.,2008 a,
2008b
Sidra de manzana Sedimentación (↑) , color (X) Choi y Nielsen, 2005
Jugo de frutilla Color (↓), pH ( ̴ ), AT ( ̴ ), ac. ascórbico (↓),
antocianina (↓) Tiwari y col.,2009 a
Jugo de Mora Color (↓), antocianina (↓) Tiwari y col.,2009 b
Jugo de tomate Color (↓), PNE ( ̴ ),pH ( ̴ ),AT,( ̴ ), ac.
ascórbico (↓) Tiwari y col.,2009 d
(X): Diferencia significativa, (↑): aumenta, (↓): disminuye, y ( ̴ ): sin cambios. Adaptada de Cullen y col.,
2009
Se reportaron cambios no significativos en los valores de pH, sólidos solubles,
acidez titulable (AT) y turbidez en jugo de naranja y tomate tratados con ozono (Tiwari
y col., 2008b; 2009b, respectivamente). Además, estos autores encontraron que el ozono
no afectó los valores de pardeamiento no enzimático (PNE). Sin embargo, es bien
sabido que la matriz de un alimento presenta un comportamiento distinto a la matriz de
otro alimento y el comportamiento de los valores PNE puede ser distinto en otros jugos.
En la sidra de manzana se observó importantes cambios en los ºBrix luego de 21
días de almacenamiento, y a pesar de no haber observado cambios significativos en los
valores de turbidez luego del tratamiento de ozonización; a los 21 días de
almacenamiento observaron una importante sedimentación (Choi y Nielsen, 2005). La
turbidez de los jugos cítricos es una suspensión coloidal de orgánulos celulares,
membranas, fragmentos de pared celular, gotitas de aceite, cromatóforos, cristales de
flavonoides y biopolímeros tales como pectina, celulosa, hemicelulosa y proteína. Un
aspecto turbio se considera una característica deseable en jugos cítricos ya que no
____________________________________________________________Introducción
18
proporciona sólo la turbidez y color en los jugos, sino también sabor y aroma (Carbonell
y col., 2005).
En comparación con otras alternativas químicas, el ozono tiene importantes
ventajas: (1) es uno de los agentes oxidantes más activos y fuerte; (2) se descompone
rápidamente en oxígeno sin dejar trazas; (3) no produce compuestos tóxicos
halogenados; (4) su acción es muy rápida, y (5) es eficaz contra una amplia gama de
microorganismos. Sin embargo, la eficacia del ozono en la inactivación microbiana
depende del tipo de microorganismo, tipo de producto, la cantidad y tipo de materia
orgánica, temperatura, pH, concentración de ozono, su estado físico (líquido o gaseoso),
y tiempo de contacto. La optimización de las condiciones de procesamiento de ozono
debe ser evaluada para cada producto en particular. Sólo un equilibrio entre la seguridad
y la calidad puede llevar a resultados favorables. Por lo tanto, los estudios sobre el
efecto de tratamiento con ozono en los distintos productos es necesario con el fin de
lograr productos seguros (desde una perspectiva microbiológica) y con características de
alta calidad (Miller y col., 2013).
2.4 Enzimas de importancia en la calidad de jugos
Los jugos de frutas son susceptibles al deterioro microbiano y la actividad
enzimática, lo cual limita su vida útil (Bayındırlı y col., 2004). La peroxidasa (POD) y
polifenoloxidasa (PPO) están involucradas con frecuencia en múltiples cambios de
deterioro, tales como pardeamiento enzimático y en consecuencia la pérdida de las
propiedades sensoriales y nutricionales de las frutas, verduras y subproductos (jugos,
purés, etc). Otro grupo de enzimas han sido relacionadas con la degradación de
antocianinas en jugos, en este grupo se incluyen la peroxidasa (POD), polifenoloxidasa
(PPO) y las β-glucosidasas (Patil y Bourke, 2012; Vidal y col., 2012).
Cuando la integridad del tejido se daña, las enzimas como la PPO y POD,
degradan a los compuestos fenólicos, transformando a los sustratos incoloros en
pigmentos pardos a través del oscurecimiento enzimático. Aunque las antocianinas no
reaccionan fácilmente con la PPO, la enzima POD si las afecta por la ruptura del anillo
heterocíclico al degradarse rápidamente cuando existe catecol, ya que este al convertirse
en o-quinona oxida estos pigmentos. La degradación enzimática de antocianinas por la
β-glucosidasa se debe principalmente a la pérdida de la fracción glicosídica en la
____________________________________________________________Introducción
19
posición 3 que conduce a la formación de aglicona (antocianidinas), afectando en
consecuencia el color del jugo (Badui, 2006; Patil y Bourke, 2012).
Otro de los principales problemas en la industria de jugo de fruta es el
mantenimiento de la turbidez de los jugos. Como lo nombramos en los párrafos
anteriores la turbidez de los jugos de frutas se produce principalmente por las partículas
suspendidas en forma coloidal, que se mantienen por las moléculas de pectina. La
disminución de la estabilidad de la turbidez se da principalmente por la desesterificación
de la pectina por parte de la pectinmetilesterasa (PME) (Van den Broeck y col. 2000;
Cullen y col., 2010).
2.4.1 Polifenoloxidasa (PPO) (E.C. 1.14.18.1)
La PPO abunda en frutas como la manzana, el durazno, el plátano, la pera, la
fresa y otras, pero no en productos muy ácidos como la lima, la toronja, el melón y el
limón. Los sustratos más comunes para la PPO son compuestos insaturados,
principalmente los que tienen estructuras de monofenoles o de o-difenoles, entre los que
se destaca la tirosina, flavonoides, taninos, antocianinas, ácido clorogénico, entre otros.
Los productos finales de las reacciones enzimáticas que desencadena la PPO son
macromoléculas con estructuras químicas muy complejas (melaninas), resultado de la
copolimerización de diversos compuestos (quinonas); dependiendo de la intensidad de
esta transformación, las melaninas varían su color desde amarillo hasta café oscuro
(Badui, 2006).
El pardeamiento enzimático y la pérdida de color por acción de la PPO es uno
de los mayores problemas que se enfrentan durante el procesamiento de frutas y
verduras. Se inicia con la oxidación enzimática de los fenoles a difenoles, y en un
segundo paso, la oxidación de orto-di-fenoles a orto-quinonas en presencia de oxígeno.
Las orto-quinonas así formadas pueden polimerizarse fácilmente y producir las
correspondientes melaninas (Bayındırlı y col., 2004, Zhao y col., 2010, Badui, 2006;
Pankaj y col., 2013). La PPO contiene cobre y no es una enzima muy estable al calor, y
la exposición corta a temperaturas entre 70 y 90 °C es suficiente para inactivarla
(O’Donnell y col., 2010, Tiwari y col. 2009a).
____________________________________________________________Introducción
20
2.4.2 Peroxidasa (POD) (E.C. 1.11.1.7)
La enzima POD es parte de un gran grupo de enzimas conocidas colectivamente
como oxidorreductasas. La POD cataliza la oxidación de una amplia gama de sustancias
naturales presentes en los alimentos vegetales, especialmente aquellos que contienen
grupos aromáticos. La peroxidasa es una enzima que cataliza la oxidación de ciertos
compuestos dadores de hidrógeno, como fenoles y aminas aromáticas, por medio de
peróxidos (H2O2). El peróxido de hidrógeno es con frecuencia el agente oxidante,
aunque, en algunos casos, el oxígeno puede también activar la enzima. La POD
contribuye a los cambios de deterioro en el sabor, la textura, el color y calidad
nutricional en frutas y verduras procesadas, también conduce al desarrollo de pigmentos
de pardeamiento y ha sido involucrada principalmente en reacciones que desarrollan
mal sabor en jugos de naranja. La POD es una enzima que se utiliza para evaluar la
eficiencia del escaldado en vegetales debido a su alta estabilidad térmica (Bayındırlı y
col., 2004; Elez-Martínez y col., 2006; Pankaj y col., 2013; Tiwari y col. 2009 a).
2.4.3 Pectinmetilesterasa (PME) (EC. 3.1.1.11)
La pérdida de turbidez en los jugos por acción de PME ha sido bastante
estudiada por numerosos autores, ya que es uno de los principales problemas de calidad
que presentan los jugos. La textura de las frutas y verduras, así como la estabilidad de la
suspensión coloidal (turbidez) de los jugos se debe a la presencia de pectinas (Badui,
2006). La pectina no es el principal constituyente de suspensión coloidal de los jugos de
frutas pero desempeña un papel principal en el mantenimiento de la estabilidad coloidal
a través de un mecanismo complejo y no bien entendido (Carbonell y col., 2005). A
pesar de que la turbidez es deseable para algunos consumidores, es importante
mencionar que para otros grupos, los jugos claros son de preferencia, por tanto la
industria ha invertido en métodos que optimicen el proceso de clarificación de jugos.
Las partículas en suspensión pueden ser retiradas a través de filtración, sin embargo, la
presencia de pectina puede dificultar el proceso. Uno de los procesos que se ha
propuesto para la reducir turbidez en jugos de frutas, es la despectinización a través del
uso de enzimas exógenas (pectinasas). Las preparaciones comerciales de pectinasas son
en realidad mezclas de pectinmetilesterasa, poligalacturonasa y pectinoliasa. Las
pectinasas degradan la pectina, esto causa la reducción de la viscosidad y la formación
____________________________________________________________Introducción
21
de agrupaciones, lo que facilita la separación a través de centrifugación o filtración.
Como resultado, el jugo presenta mayor claridad y un color y sabor más concentrado
(Greice y col., 2011, Badui, 2006).
La pectina contiene moléculas de α-D-poligalacturónicos lineales, con la
preponderancia de restos carboxílicos esterificados con metanol. La PME es una
enzima unida a la pared celular que cataliza la remoción de grupos metoxilo de los
poligalacturonanos metiladas, generando grupos carboxílicos libres; una vez que se
alcanza un grado crítico de esterificación, los cationes divalentes (principalmente Ca)
pueden entrecruzar los grupos carboxílicos libres pertenecientes a cadenas de pectina
adyacentes, dando macropolímeros insolubles que atrapan a otros componentes de la
suspensión coloidal. Por tanto, la PME está involucrada en la pérdida de la estabilidad
de los jugos a través de la deesterificación de las pectinas, seguida por la
coprecipitación de los pectatos con los materiales insolubles presentes en los jugos, y en
consecuencia la desestabilización de los coloides (disminución de la turbidez)
(Carbonell y col., 2005; Badui, 2006).
2.4.4 Influencia del tratamiento de ozono en las enzimas estudiadas
El tratamiento térmico ha sido el método más usado para la inactivación de
enzimas y microorganismos deteriorantes en jugos de frutas. Sin embargo, como se ha
mencionado anteriormente, las altas temperaturas de procesamiento provocan cambios
no deseados como la pérdida de nutrientes, alteraciones en el color y desarrollo de “off
– flavors” (Quintão-Teixerira y col., 2013).
La ozonización representa una alternativa no térmica para el tratamiento
convencional térmico de jugos de frutas y verduras. Hasta nuestro conocimiento, no se
encuentran reportados estudios en los que se haya investigado el efecto del ozono sobre
la actividad de enzimas deteriorativas presentes en jugos de frutas y verduras. Sin
embargo, el efecto del ozono sobre la inactivación enzimática en algunas frutas y
verduras frescas o cortadas ha sido estudiado. Algunos autores observaron que la
aplicación de ozono provocó una disminución significativa en la actividad de las
enzimas POD y PPO presentes en diversas frutas y vegetales (Rico y col., 2006; Yang y
col., 2006; Zhang y col., 2004).
____________________________________________________________Introducción
22
2.4.5 Modelos matemáticos usados para describir la cinética de inactivación
enzimática
La cinética de inactivación de enzimas en función del tiempo, es un proceso que
debe ser expresado o explicado por un modelo matemático para poder explicar el
comportamiento del mismo. La velocidad de inactivación se refleja por los valores
numéricos de las estimaciones de los parámetros cinéticos.
El primer paso del procedimiento de análisis de datos implica la identificación
de una ecuación de velocidad de inactivación adecuada (por ejemplo, de primer orden,
bifásica, entre otras); mientras que el segundo paso es la selección de un método de
regresión para estimar los valores de los parámetros cinéticos (Van Loey y col., 2002)
En general, la ley de velocidad para describir la disminución de la actividad
enzimática (A) como una función de tiempo de procesamiento (t) es la siguiente:
!"!"= −𝑘𝐴! (1-1)
donde A es la actividad enzimática en el tiempo t; k es la constante de velocidad de
reacción, y n el orden de reacción. El orden de reacción puede ser determinada por
distintos métodos, entre ellos tenemos:
1. Modelo de Primer orden
El modelo de primer orden, generalmente se utiliza para describir la cinética de
inactivación de las enzimas que exhiben una tendencia al decrecimiento exponencial en
función del tiempo de tratamiento (ecuación 1-2) (Quintão- Teixeira y col., 2013). La
inactivación de las enzimas es un proceso complejo que implica varios eventos, tales
como la formación y/o la perturbación de diferentes interacciones y/o enlaces, la
descomposición, agregación y/o disociación de los aminoácidos. Se ha sugerido que, en
caso aparente de procesos de inactivación de primer orden, una de estas reacciones
predomina sobre las demás. Si se producen varias reacciones más o menos a la misma
velocidad, se espera que ocurran inactivaciones complejas pero no de primer orden
(Van Loey y col., 2002).
____________________________________________________________Introducción
23
AR = 𝐴! 𝑒!!" (1-2)
donde AR es la actividad enzimática en el tiempo t, Ao es la actividad enzimática inicial,
t es el tiempo de tratamiento, y k es la constante de primer orden de la velocidad de
inactivación.
La validez del comportamiento de inactivación de primer orden puede ser
examinada graficando la actividad residual enzimática versus tiempo de tratamiento en
una escala semilogarítmica y evaluando la calidad de ajuste a través de promedios, por
ejemplo test de falta de ajuste, coeficiente de determinación (R2), análisis de
distribución de residuales. El modelo para la inactivación enzimática en concordancia
con la cinética de primer orden puede aplicarse en muchos casos. Dado que
inactivaciones más complejas pueden ocurrir en procesos paralelos o consecutivos, o
debido a la presencia de otros agentes químicos, se han propuesto otras expresiones
matemáticas para el modelado del comportamiento de inactivaciones diferentes a las de
primer orden, por ejemplo, modelo de inactivación bifásico, modelo de conversión
fraccionada, modelo de pasos consecutivos (Van Loey y col., 2002).
2. Modelo de conversión fraccionada
La conversión fraccionada hace referencia a procesos de inactivación (de primer
orden) que tiene en cuenta una actividad diferente de cero bajo efectos de un tratamiento
prolongado. El modelado de conversión fraccionada se observada en la ecuación 1-3.
AR =𝐴!+(𝐴! -‐ 𝐴!)𝑒!!" (1-3)
donde AR es la actividad enzimática en el tiempo t, Ao es la actividad enzimática inicial,
A∞ es la actividad enzimática residual, t es el tiempo de tratamiento, y k es la constante
de primer orden de la velocidad de inactivación.
Esta relación es válida cuando la fracción lábil de la enzima es inactivada,
mientras que la fracción estable (A∞) no cambie con respecto al tiempo. Esta actividad
diferente de cero puede o no ser función del tratamiento aplicado. Monitoreando la
actividad residual después de diferentes intervalos de tiempo versus tiempo, la constante
____________________________________________________________Introducción
24
de velocidad de inactivación puede ser estimada usando análisis de regresión no lineal
(Van Loey y col., 2002).
3. Modelo de Weibull
El modelo de Weibull (ecuación 1-4) se basa en la hipótesis de que la resistencia
al estrés de una población (en este caso las enzimas) sigue una distribución de Weibull o
primer orden. Según este concepto, cada enzima posee una resistencia al tratamiento,
por tanto las curvas de inactivación representan la distribución de la resistencia del
conjunto de la población de enzimas al tratamiento (Quintão- Teixeira y col., 2013). El
modelo convenientemente da cuenta de la no linealidad observada con frecuencia de las
curvas de supervivencia semilogarítmicas, y el enfoque de primer orden clásico es un
caso especial del modelo de Weibull (Van – Boekel, 2002).
𝐴𝑅 = 𝑒𝑥𝑝 − !!
! (1-4)
donde AR es la actividad enzimática en el tiempo t; t es el tiempo de tratamiento, α es el
parámetro de escala (característico del tiempo) y β el parámetro de forma.
El parámetro de forma representa la concavidad de las curvas de inactivación:
hacia arriba (β < 1), lineal (β = 1), y hacia abajo (β > 1). Cuando β <1 indica que las
enzimas resistentes tienen la capacidad de adaptarse al tratamiento aplicado, mientras
que para β > 1 indica que las enzimas cada vez son más débiles al tratamiento.
2.5 Medición de color en alimentos: evaluación
Como lo mencionamos anteriormente, el color es uno de los atributos
fundamentales que el consumidor evalúa a la hora de la elección de un producto, ya sea
fresco (ej. frutas y verduras) o procesado (ej. jugos de frutas). El color y la apariencia
son fuertes indicadores de la calidad de un alimento.
La sensación de color es un fenómeno psicofísico, que es sólo una parte de la
percepción visual global de la información detectada por el ojo e interpretada por el
cerebro. Se requiere que al menos tres factores interactúen para la medición de la
apariencia del color de cualquier objeto en una escena; estos son: el proceso visual
____________________________________________________________Introducción
25
humano (observador), el efecto de la luz sobre los objetos (fuente luminosa) y la
naturaleza de los materiales observados (objeto) (MacDougall, 2002) (Figura 2-2).
Figura 2-2. Elementos fundamentales condicionantes del color.
! Fuente de Luz
La luz, como se la conoce comúnmente, es una parte del espectro de las ondas
electromagnéticas. El ojo humano es sensible a una determinada gama de radiaciones
electromagnéticas, que constituyen el espectro de luz visible o luz blanca. Dicha gamma
está comprendida entre los rayos ultravioletas (UV) y los rayos infrarrojo (IR), y
comprende el intervalo de longitudes de onda entre 400 y 700 nm (Valero, 2011)
(Figura 2-3).
Figura 2-3. Representación del espectro sensible al ojo humano.
La luz puede provenir de fuentes naturales y artificiales, y para cada caso existen
una serie de características. La luz natural es muy difícil de controlar pues cambia
____________________________________________________________Introducción
26
constantemente de intensidad, dirección, color, etc. En cambio la luz artificial
(iluminantes) se puede controlar, y resulta necesario establecer con precisión las
características de las fuentes de iluminación debido a la existencia de diferencia de color
entre un objeto observado, por ejemplo bajo una lámpara fluorescente o una
incandescente. Es por ello, que se han desarrollado fuentes de luz estandarizadas para
los sistemas de medición establecidos. La Comisión Internacional de la Iluminación
(CIE) ha definido los iluminantes A (lámpara de filamento incandescente), B (luz de
medio día), C (luz diurna promedio), D65 (lámpara natural del día, (iluminante C + UV))
Y F2 (lámpara fluorescente blanca). Estos iluminantes responden a la necesidad de
simular instrumentalmente y de manera normalizada, las condiciones naturales bajo los
cuales se observa el color (Manresa y Vicente, 2007). Inicialmente la CIE definió al
iluminante C como el iluminante que representaba la luz del día o la luz natural, pero
en la actualidad el D65 es el más representativo ya que incluye los componentes del
ultravioleta (MacDougall, 2002).
! Observador
Los detectores comunes de la luz y el color son el ojo, el sistema nervioso y el
cerebro. El ojo se comporta como un receptor captador de energía luminosa. El ojo es
una esfera compuesta básicamente por tres tipos de capas: la esclerótica, las coroides y
la retina. La retina es la superficie sensible a la luz que recibe la imagen. En ella se
proyectan las imágenes y de ahí se transmiten al sistema nervioso central. La retina
contiene neuroreceptores sensibles a la luz: los conos y los bastones. Los bastones son
fotosensibles pero solamente a bajas intensidades de luz o ausencia de luz confieren
sensaciones acromáticas (blanco, negro y gris). Los conos son también fotosensibles,
aunque necesitan intensidades de luz alta y son los responsables de las sensaciones
cromáticas (colores), de la agudeza visual y sensibilidad visual. Hay tres conjuntos de
conos: uno sensible al rojo, el otro al verde y el otro al azul, y la respuesta total es la
combinación de las tres señales en el cerebro (Valero, 2011).
Dependiendo del ángulo de observación la sensibilidad del ojo cambia, la CIE
definió en 1931 un observador a 2 º, y en 1964 definió el observador de 10º. Cuando se
miran objetos la información general proviene de ángulos de 10º (objetos de diámetro =
75 mm), pero cuando se miran detalles el ángulo es de 2° (objetos de 15 mm); en
general en colorimetría de alimentos se emplea este último (MacDougall, 2002).
____________________________________________________________Introducción
27
! Objeto
Cuando la luz incide sobre un objeto ocurren varios fenómenos simultáneamente
(Manresa y Vicente, 2007):
1. Existe una reflexión en la superficie.
2. Ocurre una refracción dentro del objeto.
3. Parte de la luz se transmite a través del objeto.
4. Parte de la luz se difunde.
5. Y otra parte se absorbe.
De esta manera, la luz puede reflejarse, absorberse o transmitirse y la
importancia de cada uno de estos fenómenos determina la apariencia del objeto. En los
alimentos el factor más importante que influye en la reflexión de la luz es la difusión
debido a las características físicas de la superficie. De forma general puede afirmarse
que la reflexión especular ocurre en un ángulo de 90° con respecto a la luz incidente y
es la responsable principal del brillo del material mientras que la reflexión difusa ocurre
a un ángulo de 45° y es la principal responsable del color (Manresa y Vicente, 2007).
Los objetos de acuerdo a su comportamiento frente a la radiación se clasifican
en:
- Opacos: absorben y/o reflejan toda la luz.
- Transparentes: transmiten la mayor parte de la luz sin reflejarla ni difundirla
- Translúcidos: parte de la luz es reflejada y parte transmitida, dando lugar a una
importante componente difusa tanto transmitida como reflejada.
El color es una característica tridimensional, la apariencia del color de un objeto
percibido por el observador se basa en tres atributos psicológicos (Badui, 2006;
Hutchings, 2003):
Claridad: es percibida por los bastones (neuroreceptor de la retina) y es el atributo
que hace corresponder a cada color una equivalencia con respecto a una escala de
grises. Es el atributo perceptual que evalúa la sensación visual “claro-oscuro” de un
color.
Tono o matiz: se lo percibe con los conos y es el atributo que adjudica al color una
cualidad que se define como rojo, naranja, amarillo, verde, azul, púrpura o cualquier
combinación de ellos.
Saturación: se lo percibe con los conos; es el atributo que, fijado el tono, describe al
color por su similitud con un color espectral puro, cuanto más parecido a este, tanto más
____________________________________________________________Introducción
28
saturado. Es el atributo perceptual que evalúa la sensación visual “débil-fuerte” o
“pálido-intenso” de un color.
Cada consumidor describe el color de una manera distinta, dando como
resultado una amplia subjetividad. La medición del color es muy importante
económicamente y dió origen a varios métodos colorimétricos y toda una línea de
equipamiento para obtener mediciones objetivas. La categorización del color de manera
objetiva implica la asignación de números que representen atributos del fenómeno
psicológico de lo que llamamos color. La medida del color intenta relacionar el
fenómeno psicológico (color) con el fenómeno físico (flujo luminoso, longitud de onda,
etc.) que provoca la percepción. Actualmente existen diferentes espacios matemáticos
de representación del color.
! Sistemas de medición del color
En 1931 la Comisión Internacional de l'Eclairage (CIE) propuso el espacio CIE-
RGB. El mismo es un modelo de color basado en la síntesis aditiva, con el que es
posible representar un color mediante la mezcla por adición de los tres colores de luz
primarios (azul, rojo y verde). En el mismo año (1931) se propuso el sistema CIE-XYZ,
este se basa en tres colores imaginarios (verde, rojo y azul) con caracterización
espectral (X, Y y Z), que son los que representan el color (ondas electromagnéticas), y
estos se combinan para formar todos los colores representados por el observador patrón
(representativo de un observador de visión normal).
Cuando la luz del estímulo-color alcanza la retina, esta interacciona con los
sensores rojo, verde y azul, para dar las tres respuestas que llegarán al cerebro. Del
mismo modo, el sistema CIE propone que el observador patrón (o estándar) se define
por un conjunto de sensores XYZ y cuyas respuesta son en cierto modo, el número total
de interacciones por cada longitud de onda del estímulo-color y cada sensor (Figura 2-
4). Por construcción, los valores primarios X y Z caen sobre la recta de luminancia cero,
y en consecuencia, sólo el primario Y contribuye a la luminancia total del estímulo.
Mientras que Y corresponde a la claridad, X y Z no se correlacionan con tono o croma
(Capilla y col., 2002).
____________________________________________________________Introducción
29
Figura 2-4. Cálculo de los valores triestímulo XYZ según el observador patrón CIE -
1931.
Las variables X, Y y Z se las conoce como valores triestímulo y son los
números de partida para codificar el color de cualquier objeto, se obtiene multiplicando
los valores para el iluminante, la reflectancia o trasmisión del objeto y las funciones del
observador patrón, y se los representa numéricamente (Figura 2-5). En los
espectrofotómetros actuales este cálculo se realiza automáticamente por un sistema
computacional acoplado al instrumento. De esta manera, el color queda determinado por
un punto en un espacio tridimensional de coordenadas X, Y, Z.
Figura 2-5. Determinación de los valores triestímulo XYZ para un determinado objeto.
Los valores de XYZ pueden cambiar según el tipo de lámpara o según el grado
del observador. Para representar los valores numéricos de XYZ, la CIE propuso un
sistema gráfico en dos dimensiones, se lo denomina diagrama cromático de
____________________________________________________________Introducción
30
coordenadas x e y, dichas coordenadas se las obtiene de los valores triestímulo XYZ
según las siguientes fórmulas:
x= XX+Y+Z
y = YX+Y+Z
(1-5)
En la Figura 2-6 se puede observar el sistema gráfico propuesto por la CIE
(forma de lengua). El extremo curvado corresponde a los colores del espectro visible. El
extremo recto (la línea de color púrpura) corresponde a los tonos de púrpura que están
fuera del espectro. En la parte interior de la figura están los colores menos saturados,
por eso el blanco se sitúa en el centro.
Figura 2-6. Diagrama de cromaticidad CIE 1931 (observador 2°).
Como antes mencionamos la percepción del color es tridimensional, el diagrama
CIE-xy nos permite la representación de color en dos dimensiones, donde solo tiene
lugar la cromaticidad de un color determinado, por tanto es necesario agregar el valor de
____________________________________________________________Introducción
31
Y en un plano perpendicular al plano del papel para que la especificación del color sea
completa.
A pesar de que el sistema CIE XYZ es sencillo de operar y se puede representar
cualquier color en términos de coordenadas xy, este sistema no es homogéneo
(distancias geométricas iguales no suelen representar diferencias de color iguales en la
percepción por el ojo humano). Como consecuencia la CIE ha ido desarrollando y
adaptando nuevos espacios basados en transformaciones del sistema CIE-XYZ, con el
fin de obtener mejores resultados en la evaluación del color.
En 1976 CIE desarrolló un modelo de color más completo, el sistema CIELAB
se usa para describir todos los colores que puede ver el ojo humano. Las diferencias de
color que se perciben como iguales en este espacio de color tridimensional, tienen
distancias iguales entre ellas. El sistema CIE L*a*b* (Figura 2-7) se adoptó como una
buena aproximación de un espacio de color uniforme. Posteriormente, con el objetivo de
lograr un espacio de color más uniforme han sido propuestas modificaciones como el
sistema CIE Luv y CIE L'u'v' (Manresa y Vicente, 2007).
Figura 2-7. Diagrama de CIE L*a*b* y CIELCH.
____________________________________________________________Introducción
32
En el sistema CIELAB se define un espacio de coordenadas rectangulares
(L*a*b*) y otro en coordenadas cilíndricas CIELCH (L*, C*, h*) también conocidos
como parámetros de color sicrométrico. Ambas escalas de color se basan en la teoría de
colores opuestos que establece que un color no puede ser verde y rojo al mismo tiempo.
Para la evaluación de un color diseñaron un círculo cromático con los colores alrededor
de la circunferencia (similar al anillo de Munsell). Sobre él descansan dos ejes
perpendicularmente entre sí (a* (+a-a); b*(+b-b)). Perpendicular al plano a*, b* y en su
centro, se encuentra un eje L* que representa la luminosidad desde el negro al blanco
(Manresa y Vicente, 2007).
El sistema CIE L*a*b* describe el color en términos de dos coordenadas
cromáticas (a* y b*) y una de luminosidad (L*), lo que permite inferir el color de una
muestra a partir de esos atributos y poder determinar la diferencia de color total entre
pares de muestras.
Las ecuaciones de transformación del espacio CIE a CIE L*a*b* son las siguientes:
𝐿!"∗ = 116 𝑌/𝑌! !/! − 16 (1-6)
𝑎∗ = 500 [ 𝑋/𝑋! !/!− 𝑌/𝑌! !/!] (1-7)
𝑏∗ = 200 [ 𝑌/𝑌! !/!− 𝑍/𝑍! !/!] (1-8)
donde L* es el parámetro de luminosidad que va de 0 (negro) a 100 (blanco); a* es la
coordenada cromática en el eje de las abscisas (rojo(+) – verde); b* coordenada
cromática en el eje de las ordenadas (amarillo(+) - azul(-)); X, Y, Z son los valores
triestímulo de la muestra y Xn, Yn, Zn son los valores triestímulo del iluminante
empleado.
Mientras CIELAB utiliza coordenadas cartesianas, para calcular el color en
CIELCH se emplea coordenadas polares tal como se mencionó anteriormente. Este
sistema se deriva de CIELAB y L* define igualmente la luminosidad, C* cromaticidad
o croma métrico y h* ángulo de tono. Este sistema presenta la ventaja de ser fácil de
correlacionar con sistemas basados en muestras físicas como por ejemplo la escala de
Color de Munsell. El cálculo de C* y h* se lo hace mediante las siguientes fórmulas:
____________________________________________________________Introducción
33
𝐶!"∗ = 𝑎∗! + 𝑏∗!!/!
(1-9)
ℎ!"∗ = 𝑎𝑟𝑐𝑡𝑔(𝑏∗ 𝑎∗) (1-10)
2.6 Reología de los alimentos: evaluación de jugos
La reología es la ciencia que estudia el flujo y las deformaciones de sólidos y
líquidos, bajo la influencia de fuerzas mecánicas. El campo de la reología se extiende
desde la mecánica de fluidos newtonianos, hasta la elasticidad de Hooke. La mecánica
clásica hace una clara distinción entre líquidos y sólidos, y las leyes generadas para
describir su comportamiento son la de Hooke para los sólidos y la de Newton para los
líquidos, sin embargo, la mayor parte de alimentos presentan un comportamiento
comprendido entre ambos extremos (materiales pastosos y suspensiones) (Ibarz y
Barbosa, 2005; Ramírez, 2006).
Los alimentos líquidos como la leche, miel, jugos de fruta, bebidas y aceites
vegetales presentan propiedades de flujo sencillas. Los productos más espesos como los
aderezos cremosos, salsas y mayonesa se comportan de una forma más complicada. La
mayor parte de estos alimentos se transportan por medio de bombas en alguna etapa del
procesamiento o el empaque, por lo que sus características de comportamiento de flujo
son importantes para determinar la potencia que se necesita para el bombeo, el tamaño
de tubería, y además de qué manera se relacionan con las propiedades sensoriales como
la textura de los alimentos. El comportamiento de flujo también es importante para
diseñar procesos y operaciones, además sirve para controlar o monitorear dichos
procesos. El transporte de alimentos líquidos por medio de bombas está directamente
relacionado con las propiedades de los líquidos, en particular, la densidad y viscosidad
(Sharma y col., 2003).
La elección de una técnica instrumental para la determinación de las propiedades
reológicas de un alimento dependerá en gran medida de las propiedades de los mismos,
por ejemplo las técnicas usadas para líquidos son distintas de las usadas para sólidos
(Van Vliet, 2001).
____________________________________________________________Introducción
34
2.6.1 Viscosidad
La viscosidad es una propiedad de los fluidos que describe su resistencia a ser
deformados cuando son sometidos a un esfuerzo de corte o de cizalla. Al aplicar un
esfuerzo cortante a un fluido confinado entre dos placas paralelas infinitas, se presentará
una distribución de velocidades que disminuyen su valor conforme se aleja del plano de
aplicación del esfuerzo. El esfuerzo de corte o cizallamiento (τ) se obtiene dividiendo la
fuerza (F) aplicada en la placa sobre el área de la placa (A). El cambio de velocidad en
función de la distancia de aplicación del esfuerzo cortante (coordenada y) se define
como la velocidad de deformación (dv/dy) (Badui, 2006) (Figura 2-8).
Figura 2-8. Representación imaginaria de un fluido newtoniano que fluye entre una
placa fija y una móvil (F: fuerza actuando sobre la placa, V: velocidad del fluido, A:
área de la placa, L: distancia entre las dos placas).
2.6.1.1 Clasificación de fluidos
Según sea el comportamiento de los fluidos con respecto a la velocidad de
deformación se pueden clasificar en newtoniano y no newtoniano. Una segunda
distinción está basada en los fluidos cuyo comportamiento depende del tiempo de
actuación del esfuerzo realizado en ellos. Los fluidos cuyo comportamiento dependen
únicamente del esfuerzo de corte se los denomina “independientes del tiempo”, y su
viscosidad, a una determinada temperatura, sólo depende de la velocidad de
deformación. Los fluidos dependientes del tiempo son aquellos en los que su
viscosidad depende, no sólo del gradiente de velocidad, sino también del tiempo que
actúa dicho gradiente (Ibarz y Barbosa, 2005).
De esta forma la clasificación reológica de fluidos sería la siguiente:
A) Flujo newtoniano
____________________________________________________________Introducción
35
B) Flujos no newtonianos
B.1 Comportamiento independiente del tiempo
a) Fluidos pseudoplásticos
b) Fluidos plásticos: Bingham (plástico ideal)
Herschel y Bulkley (plástico real)
c) Fluidos dilatantes
B.2 Comportamiento dependiente del tiempo
a) Fluidos tixotrópicos
b) Fluidos reopécticos
C) Comportamiento viscoelástico
A) Fluido Newtoniano
Los fluidos presentan este comportamiento cuando el esfuerzo de corte es
proporcional al gradiente de velocidad o velocidad de deformación (Figura 2-9). Estos
fluidos obedecen la ley de Newton de la viscosidad que se expresa como:
𝜏 = ƞ 𝛾 (1-11)
donde τ = esfuerzo cortante (Pa), n = coeficiente de viscosidad (Pa-s), = velocidad de
deformación (1/s).
El agua, la leche, los jugos despectinizados, la miel de abeja pura presentan este
tipo de comportamiento (Badui, 2006).
La viscosidad puede verse afectada por la temperatura y la presión. La variación
de la viscosidad con la temperatura es exponencial y su dependencia es comúnmente
expresada mediante la ecuación de Arrhenius (ecuación 1-12):
𝜂 = 𝜂! 𝑒𝑥𝑝!!!"
(1-12)
donde η: viscosidad, η0 : viscosidad a la temperatura de referencia, Ea: energía de
activación, T: temperatura absoluta y R: constante de los gases.
Se observa que la viscosidad disminuye con la temperatura, esto se atribuye a
que, al aumentar la temperatura, las fuerzas viscosas son superadas por la energía
cinética, dando lugar a una disminución de la viscosidad. Es por esto que la temperatura
____________________________________________________________Introducción
36
se debe mantener constante al momento de realizar su medición. En cambio, la
viscosidad aumenta exponencialmente con la presión, pero a efectos prácticos el efecto
de la presión se ignora a la hora de hacer mediciones en el viscosímetro, ya que las
variaciones en la presión atmosférica son prácticamente despreciables.
B) Fluido no newtoniano
Independientes del tiempo
La mayoría de los alimentos presentan desviaciones marcadas del
comportamiento ideal y, por lo tanto, su viscosidad cambia al aplicar diversos valores
de esfuerzo y/o tasa de corte, y presentan un comportamiento no lineal entre estos dos
parámetros, tal como se observa en la Figura 2-9.
Figura 2-9. Representación de esfuerzo de corte (izquierda) y viscosidad (derecha) vs.
velocidad de deformación para distintos fluidos.
Para los líquidos no newtonianos, la relación entre τ y no es lineal. Se obtiene
una viscosidad dependiente de la velocidad de deformación, llamada viscosidad
aparente (ƞapp). Si la ƞapp disminuye con el aumento de velocidad de deformación se
trata de un fluido pseudoplástico, y si la misma aumenta con el incremento de la
velocidad de deformación, se trata de un fluido dilatante (Van Vliet, 2001). El
comportamiento pseudoplástico es el más común en los líquidos alimenticios, entre
ellos encontramos jarabes, aderezos para ensaladas, dispersiones de gomas, pastas
proteicas diluidas, suero de leche, dispersiones de pectinas, jugos sin clarificar.
Además, algunos fluidos no newtonianos presentan un esfuerzo de corte umbral
que debe alcanzarse antes de que comiencen a fluir (τ0). Los que tienen comportamiento
____________________________________________________________Introducción
37
de flujo lineal luego de alcanzar τ0 se conocen como plásticos de Bingham (Figura 2-9).
Los plásticos tipo Casson son los que tienen un comportamiento pseudoplástico luego
de alcanzar τ0 (plástico real). Estos tipos de fluidos se comportan como un sólido hasta
que se sobrepasa un esfuerzo de corte mínimo (esfuerzo umbral, τ0), y a partir de dicho
valor se comportan como un fluido. La razón de este comportamiento es la gran
interacción entre las partículas debido a las fuerzas de Van der Waals y puentes
hidrógeno (Ramirez, 2006).
Existen varios modelos matemáticos propuestos para describir las curvas de
flujo para fluidos no dependientes del tiempo. Algunos de ellos se detallan en la Tabla
2-2.
Tabla 2-2. Modelos matemáticos que describen las de curvas de flujo de fluidos
independientes del tiempo.
Fluidos newtonianos Ley de Newton 𝜏 = ƞ 𝛾
Fluido no newtoniano Plástico de Bingham 𝜏 = ƞ 𝛾 + 𝜏𝑜
Fluido no newtoniano Ley de la potencia τ =Kγ n
Fluido no newtoniano Herschel-Bulckley τ =Kγ n + 𝜏!
donde k y n son constantes que describen el comportamiento del fluido. k es un
indicador de la naturaleza viscosa del sistema, resultando que a mayor k más viscoso es
el material, y se denomina índice de consistencia.
El índice de flujo n es una medida del grado de comportamiento no newtoniano.
Si n < 1 se trata de un fluido pseudoplástico, si n > 1 se comporta como un fluido
dilatante y si n = 1 tiene un comportamiento newtoniano. Cuanto más alejado es el valor
de n de la unidad, mayor es la desviación del comportamiento newtoniano.
Dependientes del tiempo
Para muchos fluidos no newtonianos y productos con carácter plástico, la
relación entre τ y depende de la duración del tiempo de flujo y de la historia de flujo.
____________________________________________________________Introducción
38
Como se mencionó en el apartado 2.6.1.1, se distinguen dos tipos de comportamiento:
tixotrópicos y reopécticos.
En el caso de los fluidos tixotrópicos, la estructura material se rompe conforme
continúa la acción cortante, y la viscosidad aparente disminuye con el aumento del
tiempo. En cambio, en los fluidos reopécticos, la estructura del material se fortalece
conforme continúa el corte y su viscosidad aumenta con el tiempo (Sharma y col., 2003)
(Figura 2-10). Ambos comportamientos son fenómenos reversibles. La ƞapp retorna a
su valor inicial durante el reposo o cizallamiento a velocidades de deformación ( )
bajas (Van Vliet, 2001). El comportamiento tixotrópico es común en muchos alimentos
como gelatinas, crema, manteca vegetal, etc. En cambio el comportamiento reopéctico
es difícil de encontrar en alimentos.
Una forma de evidenciar un fluido dependiente del tiempo es aumentando la
velocidad de corte hasta un determinado valor y luego disminuyéndola hasta el valor
inicial. Si el fluido es dependiente del tiempo se observa un fenómeno de histéresis
(Figura 2-10).
Figura 2-10. Representación de esfuerzo de corte (izquierda) y viscosidad (derecha) vs.
velocidad de deformación para fluidos dependientes del tiempo.
2.6.1.2 Viscosidad en jugos de frutas
El estudio de las propiedades reológicas en los jugos de frutas desempeña un
papel importante en el manejo y procesamiento (diseño y evaluación de equipos),
control de calidad y la evaluación sensorial (Shamsudin y col., 2013; Susetyo y col.,
2008). La variación de viscosidad resulta de algunos efectos operacionales tales como la
____________________________________________________________Introducción
39
concentración por la evaporación y ósmosis inversa, bombeo, homogeneización y
mezcla, la viscosidad de los jugos de fruta se ve influenciada también por factores tales
como la variedad o la madurez de la fruta y el tratamiento aplicado a dichos jugos
(Shamsudin y co.,2013). Ibarz y col., (1992) reportó que en general los jugos de frutas
clarificados tienen un comportamiento pseudoplástico y pueden ser descriptos por la ley
de la potencia. En cambio, los jugos clarificados despectinizados presentan un
comportamiento newtoniano descripto por la ley de Newton.
Saravacos (1970) estudió el comportamiento de la viscosidad de varios jugos de
frutas en función de la concentración y de la temperatura. Se observó un
comportamiento newtoniano para el jugo de manzana despectinizado y filtrado en un
rango de temperatura de 20-70° C y a concentraciones entre 10 y 75 °Brix. En contraste,
los jugos no despectinizados y filtrados tales como el jugo de manzana (50-65 °Brix),
jugo de uva (64 °Brix) y jugo comercial de naranja (34 – 44 °Brix) tuvieron un
comportamiento pseudoplástico. Del mismo modo Ibarz y col. (1992), estudió la
reología de jugo clarificado de durazno entre 5 y 60 ºC y concentraciones entre 40º y
69º Brix, encontrando un comportamiento pseudoplástico y que pudo ser muy bien
representado por la ley de la potencia.
En jugo de sandía (filtrado, no despectinizado) se obtuvieron curvas típicas de
comportamiento pseudoplástico tanto para las muestras control, así como las tratadas
con dióxido de carbono a alta presión (Liu y col., 2012). Las curvas de jugo de manzana
(filtrado, no despectinizado) fresco y tratado con luz pulsada también presentaron un
comportamiento pseudoplástico (Bi y col., 2013). En jugo de manzana fresco (no
filtrado, no despectinizado) y ozonado se encontró un comportamiento pseudoplástico,
la viscosidad disminuyó en función del aumento de la concentración de ozono y el
tiempo de aplicación (Torres y col., 2011).
3. MATERIALES Y MÉTODOS
_____________________________________________________Materiales y Métodos
41
3.1 Materia Prima
Se utilizaron duraznos Prunus persica, variedad Pavía de Verano (sólidos
solubles = 13 ± 1 ºBrix, pH = 4,1 ± 0,2), los cuales fueron adquiridos en un comercio
local de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Para la obtención del jugo, los frutos fueron seleccionados teniendo en cuenta
tamaño, forma y contenido de sólidos solubles (°Brix), de modo tal de trabajar con un
lote homogéneo. Los duraznos fueron almacenados en refrigeración (4 ±1°C) hasta el
momento de su utilización.
3.2 Reactivos
-‐ Albúmina bovina sérica (BSA) (Sigma, Alemania)
-‐ Alcohol etílico absoluto (CH3CH2OH) (Anedra, Argentina)
-‐ Azul de bromotimol (Sigma, Alemania)
-‐ Carbonato de sodio (Na2CO3) (Biopack, Argentina)
-‐ Cloruro de sodio (NaCl) (MERCK, Argentina)
-‐ di-Sodio hidrógeno fosfato 2- hidrato (Na2HPO4 2H2O) (MERCK, Alemania)
-‐ Folin - ciocalteus (MERCK, Alemania)
-‐ Fosfato de potasio (KH2PO4) (MERCK, Argentina)
-‐ Guayacol (Anedra, Argentina)
-‐ Hidróxido de sodio (NaOH) (MERCK, Alemania)
-‐ Ioduro de potasio (IK) (Anedra, Chile)
-‐ Pectina cítrica (Sigma, Alemania)
-‐ Peróxido de hidrógeno (H2O2) (Biopack, Argentina)
-‐ Polivinilpirrolidona (PVPP) (C6H9NO) (Sigma, Alemania)
-‐ Pirocatecol (Sigma, Japón)
-‐ Sodio di-hidrógeno fosfato 1-hidrato (NaH2PO4.H2O) (Baker, México)
-‐ Solución buffer pH 4 (Biopack, Argentina)
-‐ Solución buffer pH 7 (Biopack, Argentina)
-‐ Sulfato de cobre II (CuSO4) (MERCK, Alemania)
-‐ Tartrato de sodio y potasio (COOK(CHOH)2COONa*4H2O) (MERCK,
Alemania)
_____________________________________________________Materiales y Métodos
42
3.3 Preparación de la muestra
Las frutas enteras fueron lavadas y sumergidas en una solución de hipoclorito de
sodio (300 ppm) durante 10 minutos, y posteriormente enjuagadas con abundante agua.
A continuación, fueron peladas, cortadas e inmediatamente procesadas en un extractor
de jugo Modelo BJE 40-10 (Bluesky, China) en condiciones de esterilidad. El jugo
obtenido fue centrifugado en una centrífuga refrigerada Eppendorf modelo 5804R
(Eppendorf AG, Alemania) a 2300 rpm, durante 10 minutos a 5°C. El pellet fue
descartado y el jugo resultante fue almacenado en botellas de vidrio acarameladas de
500 mL y congelado a -80°C en un ultrafreezer modelo MDF-U55V (Panasonic, Japón).
El material utilizado para la obtención del jugo de durazno fue sanitizado y esterilizado
con luz UV-C durante 10 minutos.
Debido a los altos tiempos de procesamiento requeridos para la obtención del
jugo y los grandes volúmenes utilizados en las experiencias, para cada concentración de
ozono evaluada se trabajó con lotes de jugo diferentes.
3.4 Aplicación de ozono gaseoso
3.4.1 Descripción del equipo
El equipo de ozono (Figura 3-1) está provisto de un generador de ozono UTK-
O-4 (Unitek S.A., Argentina), una columna de burbujeo con difusor incluido y un
tanque de oxígeno. El generador UTK-O-4 produce ozono a partir de oxígeno envasado
muy seco (gas base), con una presión de trabajo de 0,62 bar (9 psi), regulada por una
válvula reguladora modelo LRP-1/4-2,5 (Festo, Argentina), y un caudal de alimentación
de 5 L/min medido con un rotámetro (Unitek S.A., Argentina).
Dentro del generador, el oxígeno pasa a través de los tubos de generación, entre
un electrodo y un dieléctrico. En este espacio (cámara de reacción), el gas base es
expuesto a una corriente eléctrica de alto voltaje, consiguiéndose la disociación de las
moléculas de oxígeno y transformándolo en ozono (Figura 3-2). El generador posee un
potenciómetro que regula la generación de ozono entre 0 y 100% de la capacidad
nominal.
_____________________________________________________Materiales y Métodos
43
La columna de burbujeo tiene un diámetro interno de 10 cm y una altura de 24
cm, con un difusor en la base que permite la formación de pequeñas burbujas y
distribución homogénea del ozono en el jugo. El ozono generado entra por la base de la
columna atravesando el líquido con finas burbujas, y el excedente de ozono es
neutralizado en dos trampas colocadas en serie con una solución de ioduro de potasio
(KI) al 2% (p/v). El equipo se encuentra montado dentro de una campana de ventilación
diseñada para eliminar a la atmósfera el ozono excedente y para garantizar un ambiente
seguro de trabajo.
Figura 3-1. Equipo de ozono.
Figura 3-2. Representación de la generación de ozono en el generador UTK-O-4.
Calor
Calor
Electrodo (alto voltaje)
Electrodo (bajo voltaje)
Dieléctrico Cámara de
reacción
Columna de burbujeo
Generador de Ozono
Trampas en serie
Rotámetro
Válvula reguladora
_____________________________________________________Materiales y Métodos
44
3.4.2 Concentración y tiempos de exposición
Las concentraciones del ozono gaseoso y los tiempos de exposición utilizados
fueron seleccionados en base a estudios microbiológicos previos realizados por el grupo
de investigación. Las concentraciones utilizadas fueron 10 y 18 ppm de ozono gaseoso,
burbujeado en 450 mL de jugo a 20°C ± 1. Para la concentración de 10 ppm fue
evaluado el efecto del ozono a 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 y 12 minutos de exposición, y
para la concentración de 18 ppm a 0, 0,33, 0,66, 1, 2, 3, 5, 7,10 y 12 minutos de
exposición.
3.5 Evaluación de parámetros de calidad
3.5.1 Determinación de pH, sólidos solubles y acidez titulable
3.5.1.1 Determinación de pH
Para la medición de pH se utilizó un pHmetro PerpHectLogRmeter modelo 310
(Orion, Beverky, USA). Las mediciones fueron realizadas por triplicado para cada
tratamiento. Antes de cada análisis, el pHmetro fue calibrado con soluciones buffer de
pH 7,0 y pH 4,0.
3.5.1.2 Determinación de sólidos solubles
La concentración de sólidos solubles (°Brix) fue determinada en un
refractómetro digital modelo PR-101 (ATAGO, Japón), calibrado previamente con agua
destilada. Las mediciones fueron realizadas por triplicado para cada tratamiento.
3.5.1.3 Determinación de acidez titulable
La acidez titulable fue determinada por el método de titulación potenciométrico
(AOAC, 2005). Se titularon alícuotas de 10 mL de jugo con una solución de NaOH
(0,1N) hasta alcanzar un valor de pH final de 8,2 ± 0,1. Las mediciones fueron
realizadas por triplicado para cada tratamiento. El resultado fue expresado en gramos de
_____________________________________________________Materiales y Métodos
45
ácido málico presente en 100mL de jugo de durazno (%p/v), de acuerdo a la siguiente
expresión:
% de Acidez= !!"#$∙!!"#$∙!!"# á!"# !á!"#$∙100!!"#$%&'
(3-1)
donde: VNaOH (mL) = volumen NaOH gastados para alcanzar un pH final de 8,2 ± 0,1;
NNaOH = normalidad del NaOH (0,1N); PMeq de ácido málico = peso miliequivalente del
ácido málico (ácido málico: 0,067) y Vmuestra (mL) = volumen de muestra titulado (10
mL).
3.5.2 Determinación del índice de pardeamiento no enzimático (PNE)
El índice de PNE fue medido utilizando la técnica desarrollada por Meydav y
col.(1977). Se tomaron alícuotas de 10 mL de jugo y fueron centrifugadas en una
centrífuga refrigerada Eppendorf modelo 5804R (Eppendorf AG, Alemania) a 2300
rpm, durante 10 minutos a 20°C. Se preparó una mezcla de 5 mL de sobrenadante y
5mL de alcohol etílico al 95% y nuevamente se centrifugó a 2300 rpm durante 10
minutos a 20°C; el pellet fue descartado y el sobrenadante se utilizó para realizar las
determinaciones. La lectura del índice de pardeamiento no enzimático fue realizada en
un espectrofotómetro JASCO V-630 (Jasco, Japón) a 420 nm. Las mediciones del
índice PNE fueron realizadas por triplicado para cada tratamiento.
3.5.3 Medición instrumental de color
El color del jugo fue medido con un espectrofotómetro triestímulo de
reflectancia con esfera integradora modelo CM-508-d (Minolta Co, Japón), usando una
apertura de medida de 1,1 cm de diámetro, iluminante D65 y 2° de ángulo de
observación. Las mediciones fueron realizadas en un recipiente cilíndrico (2,5 cm de
diámetro y 1 cm de altura) de fondo transparente y paredes opacas para evitar la
dispersión de la luz incidente por los laterales. Las determinaciones se realizaron sobre
un fondo blanco, utilizando 4 mL de muestra. Se realizaron cinco replicados por cada
tratamiento y en cada muestra se realizaron dos mediciones.
_____________________________________________________Materiales y Métodos
46
Se registraron los valores de las coordenadas de color del espacio CIE (X, Y, Z)
y los parámetro L*, a* y b* del espacio CIELab, donde L* indica luminosidad, a*
indica cromaticidad sobre el eje que va del rojo (+) al verde (-) y b* indica cromaticidad
sobre el eje que va desde el amarillo (+) hasta el azul (-) (Figura 3-3). A partir de estos
valores numéricos, se calcularon las funciones de color “croma” (C*), “ángulo de tono”
(h*) e “índice de browning” (IB), utilizando las siguientes ecuaciones:
Cab* =(a*2+b*2 )
1/2 (3-2)
hab* =arctg (b*/a*) (3-3)
x=X/(X+Y+Z) (3-4)
IB=[100 (x-0,31)]/0,172 (3-5)
El ángulo de tono h* se ubica en la circunferencia de 360°; puede encontrarse en
uno de los cuatro cuadrantes del plano a*b*; el valor 0° está definido por el rojo-
púrpura, 90° por el color amarillo, 180° por el color azul verdoso, y finalmente 270° con
el color azul. C* representa la pureza de tono (saturación) y se puede distribuir en los
cuatro cuadrantes del plano a*b*; sus valores van desde 0 en el centro (gris neutro)
hasta 100 en los bordes (más saturado) (Figura 3-3).
Figura 3-3. Representación del espacio de color CIELab.
_____________________________________________________Materiales y Métodos
47
3.5.4 Medición instrumental de las propiedades reológicas
Se determinó la viscosidad de las muestras de jugo a 20 ºC, utilizando un
reómetro dinámico Paar Physica modelo CR 300 (Antón Paar GMBH, Alemania)
(Figura 3-4). Para las determinaciones, se utilizó un volumen de muestra de 3,5 mL y
una geometría cono y plato (sensor CP 75-2) con un gap de 0,05 mm. El plato inferior
del equipo o platina (TEK 150P –CF) posee un controlador de temperatura conectado a
un baño termostático (Viscotherm VT2, Physica, Alemania). El calentamiento fue
realizado con un sistema Peltier. Se realizaron cinco replicados por cada tratamiento.
Las curvas de flujo (esfuerzo de corte) y viscosidad aparente fueron registradas
utilizando un barrido de velocidad de deformación (𝛾) de 0 a 100 s-1.
Las curvas esfuerzo de corte (τ) vs velocidad de deformación (𝛾) fueron
ajustadas al modelo de la ley de la potencia:
𝜏 = 𝑘𝛾! (3-6)
donde τ es el esfuerzo de corte, 𝛾 es la velocidad de deformación, k es el índice de
consistencia y n es el índice de comportamiento de flujo.
Figura 3-4.Reómetro Dinámico Paar Physical CR 300 (Antón Paar GMBH,
Alemania) y baño termostático (Viscotherm VT2, Physica, Alemania).
_____________________________________________________Materiales y Métodos
48
3.6 Determinación de la actividad enzimática
Las determinaciones de la actividad enzimática se realizaron por triplicado y en
cada replicado se llevaron a cabo dos mediciones de actividad.
3.6.1 Determinación de la actividad enzimática de la peroxidasa (POD)
3.6.1.1 Extracción de POD
La extracción y medición de la actividad POD en el jugo de durazno se realizó
de acuerdo a la metodología descripta por Montero-Prado y col. (2011) con leves
modificaciones. Para la extracción de la enzima, se homogenizaron 10 mL de muestra
con 20 mL de una solución buffer fosfato de sodio (100 mM, pH 6,4) que contenía
PVPP (1 % (p/v)). El homogenizado se agitó durante 30 minutos a 4-5 ºC en un agitador
orbital (Decalab S.R.L, Argentina), y luego se centrifugó a 11000 rpm en una centrífuga
modelo 5804R (Eppendorf AG, Alemania) durante 20 minutos a 4 ºC (Figura 3-5). Se
recolectó el sobrenadante que fue utilizado para la medición de la actividad POD.
Figura 3-5. Esquema de los pasos involucrados en la extracción de la enzima POD.
3.6.1.2 Determinación de la actividad POD
La actividad POD fue estimada a partir de una mezcla de reacción que contenía
2 mL de buffer fosfato de sodio (100 mM, pH 6,4), guayacol (8 mM) y 0,5 mL de
extracto enzimático. La mezcla se incubó a 30°C durante 2,5 minutos. Posteriormente,
Homogenización (Jugo de durazno + buffer de extracción +PVPP)
Agitación (30 min, 4-5 °C)
Centrifugación (11000 rpm, 20 min, 4 °C)
Extracto enzimático
Precipitado
_____________________________________________________Materiales y Métodos
49
se adicionó 1 mL de H2O2 (12 mM) disuelto en buffer fosfato de sodio (100mM, pH
6,4) e inmediatamente se registró el incremento de la absorbancia, debido a la oxidación
de guayacol, a 460nm en un espectrofotómetro modelo V-630 (JASCO, Japón) durante
120 segundos. La velocidad inicial de reacción se estimó de la porción lineal de la curva
Absorbancia vs Tiempo. Una unidad de actividad (U) fue definida como la cantidad de
enzima requerida para incrementar 0,001 unidades de absorbancia por minuto.
3.6.2 Determinación de la actividad enzimática de la polifenoloxidasa (PPO)
3.6.2.1 Extracción de PPO
El procedimiento utilizado para la extracción de la enzima PPO fue el mismo
descripto en la sección 3.6.1.1 para la extracción de la enzima POD.
3.6.2.2 Determinación de la actividad PP0
La actividad PPO fue evaluada de acuerdo a la metodología descripta por
Montero-Prado y col. (2011) con leves modificaciones. La mezcla de reacción contenía
2 mL de buffer fosfato de sodio (100 mM, pH 6,4) y 0,5 mL de extracto enzimático. La
mezcla se incubó a 30°C por 2,5 minutos, y luego se adicionó 1 mL de catecol (500
mM) disuelto en buffer fosfato de sodio (100 mM, pH 6,4). Inmediatamente, se registró
el incremento de la absorbancia debido a la formación de compuestos pardos producto
de la oxidación del catecol, a 400 nm durante 120 segundos. La velocidad inicial de
reacción se estimó de la porción lineal de la curva Absorbancia vs Tiempo. Una unidad
de actividad (U) fue definida como la cantidad de enzima requerida para incrementar
0,001 unidades de absorbancia por minuto.
3.6.3 Determinación de la actividad enzimática de la pectinmetilesterasa (PME)
3.6.3.1 Extracción de PME
La extracción de la enzima PME en el jugo de durazno se realizó de acuerdo a la
metodología descripta por Pombo y col. (2009) con algunas modificaciones. Para llevar
_____________________________________________________Materiales y Métodos
50
a cabo la extracción, se homogenizaron 10 mL de muestra con 30 mL de cloruro de
sodio (1M) y PVPP (1% (p/v)). La mezcla se mantuvo en agitación durante 3 horas a 4
ºC en un agitador orbital (Decalab S.R.L, Argentina), y luego se centrifugó a 11000 rpm
en una centrífuga modelo 5804R (Eppendorf AG, Alemania) durante 20 minutos a 4 ºC.
Se descartó el sólido y se ajustó el pH del sobrenadante a 7,5 con NaOH (0,1 N o 1N)
(Figura 3-6). El extracto resultante se utilizó para determinar la actividad PME.
Figura 3-6. Esquema de los pasos involucrados en la extracción de la enzima PME
3.6.3.2Determinación de la actividad PME
La actividad PME fue determinada por espectrofotometría utilizando el método
descripto por Hagerman y Austin (1986) con leves modificaciones. La mezcla de
reacción contenía 2 mL de solución de pectina cítrica (0,5 % (p/v), pH 7,5) y 0,15 mL
de azul de bromotimol (0,01 % (p/v)) disuelto en buffer fosfato (0,003 M, pH 7,5). La
mezcla se incubó a 30°C durante 5 minutos, y posteriormente, se adicionaron 0,85 mL
del extracto enzimático. Se monitorearon los cambios en la absorbancia a 620 nm
durante 15 minutos. Los cambios en el color se producen como consecuencia de la
hidrólisis de los grupos ésteres de las pectinas catalizada por la PME, lo que provoca
una disminución del pH del medio, y en consecuencia, el viraje del indicador de pH
(desde el azul hacia el amarillo). Se realizó una curva de calibración utilizando una
Homogenización (Jugo de durazno + buffer de extracción +PVPP)
Agitación (3 h, 4-5 °C)
30 min
Centrifugación (10000 rpm, 20 min, 4 °C)
Extracto enzimático
Precipitado
Ajuste de pH del extracto, con NaOH
_____________________________________________________Materiales y Métodos
51
solución estándar de ácido galacturónico (1mM). La actividad PME fue expresada en
micromoles de ácido galacturónico producidos por minuto.
Los valores obtenidos de la actividad enzimática para POD, PPO y PME fueron
expresados como actividad específica. La misma se refiere a las unidades de actividad
enzimática por miligramo de proteína (U/mg).
Las actividades enzimáticas obtenidas en las muestras tratadas fueron
comparadas con respecto al control (sin tratamiento), y expresadas como actividad
residual de acuerdo a la siguiente ecuación:
𝐴𝑅 = !!!!∙ 100 (3-7)
en donde At es la actividad enzimática de la muestras tratadas con ozono a un tiempo t y
Ao es la actividad enzimática de la muestra control (sin tratamiento).
3.6.4 Determinación del contenido de proteínas
El método de Lowry fue utilizado para cuantificar la concentración de proteínas
totales en los extractos enzimáticos (Potty, 1969). Este es un método colorimétrico de
valoración cuantitativa, en donde el reactivo de Folin-Ciocalteau es añadido a la
muestra, de manera que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la
intensidad del color proporcional a la concentración de proteínas.
Las soluciones utilizadas en las determinaciones fueron: una solución de
carbonato de sodio (2 % (p/v)) disuelto en NaOH (1 N) (reactivo A), una mezcla del
reactivo A con una solución de sulfato de cobre (0,5 % p/v)) disuelto en tartrato de
sodio (1 % (p/v)) (relación 50:1) (reactivo B) y la solución de Folin-Ciocalteau (2 N)
diluida al medio (reactivo C). Para realizar la curva de calibración fue usada albúmina
sérica bovina (BSA) como proteína patrón en un rango de concentraciones entre 0,05 y
0,5 mg/ mL. La lectura de las muestras fue realizada a 550 nm en un espectrofotómetro
JASCO V-630 (Jasco, Japón).En la Figura 3-7 se esquematiza el procedimiento
seguido en la determinación de proteínas de las muestras.
_____________________________________________________Materiales y Métodos
52
Figura 3-7. Esquema del procedimiento utilizado en la determinación de proteínas.
3.6.5 Análisis de la cinética de inactivación de las enzimas POD y PPO
Para describir la inactivación enzimática de POD y PPO, las curvas de actividad
residual (AR) vs tiempo fueron ajustadas a diferentes modelos matemáticos. Los
modelos evaluados fueron los siguientes:
Modelo de primer orden (ecuación 3-8): se utiliza generalmente para describir la
cinética de inactivación de las enzimas que exhiben una tendencia al decrecimiento
exponencial en función del tiempo de tratamiento (Quintão- Teixeira y col., 2013).
Reposar 10 min en oscuridad
Mezclar: 1 mL muestra + 5 mL de
reactivo B
Agregar 1mL de reactivo C
Reposar 30 min en oscuridad
Tomar lectura 550nm
Mezclar: 1 mL muestra + 5 mLde
reactivo A
_____________________________________________________Materiales y Métodos
53
𝐴𝑅 = 𝐴!𝑒!! ! (3-8)
donde AR es la actividad residual (variable dependiente), A0 actividad inicial, k es la
constante de velocidad de inactivación y t tiempo de tratamiento.
Modelo de conversión fraccionada (ecuación 3-9): es un caso especial de la
cinética de primer orden, y es especialmente aplicado cuando una fracción es inactivada
y otra fracción restante es constante, y su actividad residual no es igual a cero después
de un tratamiento prolongado (Sampedro y col., 2007).
𝐴𝑅 = 𝐴! + (𝐴! − 𝐴!)𝑒!!" (3-9)
donde AR es la actividad residual, A0es la actividad inicial, A ͚ es la actividad residual
después de un tiempo prolongado de tratamiento, k es la constante de velocidad de
inactivación y t tiempo de tratamiento.
Modelo de Weibull (ecuación 3-10): este modelo ha sido utilizado por
numerosos autores en la descripción de la inactivación de microorganismos.
Actualmente algunos autores lo han propuesto en la evaluación de la inactivación de
enzimas (Elez-Martínez y col., 2006; Giner y col., 2005; Pankaj y col.,2013; Quintão-
Teixeira y col., 2013; Rodrigo y col., 2003).
𝐴𝑅 = exp − !!
! (3-
10) donde AR es la actividad residual, t el tiempo de tratamiento, α y β son constantes; el
valor de α se define como factor de escala y β como factor de forma.
Los valores de α y β fueron utilizados para graficar las curvas de distribución de
frecuencia de resistencias de las enzimas a la exposición de ozono (ecuación 3-11).
𝑓 𝑡 = !!
!!
!!!exp − !
!
! (3-11)
_____________________________________________________Materiales y Métodos
54
Para cada distribución de frecuencia de resistencias se determinaron la moda
(tcm), la media (tc), la varianza (σ2tc) y el coeficiente de asimetría (υ1). Los mismos se
calcularon utilizando las siguientes ecuaciones:
𝑡!" = 𝛽 − 1 /𝛽(𝛼!!)!! (3-12)
𝑡! = 𝛤 (𝛽 − 1)/𝛽 /( 1/𝛼) (3-13)
𝜎!"! = 𝛤 𝛽 + 2 /𝛽 − 𝛤 𝛽 + 1 /𝛽 ! /(1/𝛼)! (3-14)
𝜐! = ! !!!/! /(!/!)!
! !!!/! /(!/!)! !/! (3-15)
donde Γ es una función gamma, tcm representa el tiempo del tratamiento donde la mayor
parte de enzimas son inactivadas, tc representa el tiempo promedio de inactivación con
su varianza (σ2tc), y υ1 representa el sesgo de la distribución.
La bondad del ajuste de cada uno de los modelos fue evaluada utilizando el
coeficiente de determinación (R2), y la raíz del cuadrado medio del error (RMSE)
(ecuación 3-16).
𝑅𝑀𝑆𝐸 = (!!"#$%&'(!!!!"#$%&!!)!
!!!!!
(3-16)
donde µobservada son los valores de las observaciones experimentales, µpredicho son los
valores de las predicciones de los modelos, nt es el número de observaciones y np es
número de parámetros a ser estimado.
También el ajuste fue evaluado con el criterio de información Akaike (AIC) y
Bayesiano (BIC), según las ecuaciones 3-17 y 3-18, respectivamente. Estos criterios
fueron usados para detectar un sobreajuste del modelo. De acuerdo a la teoría del
criterio de Akaike y Bayesiano, el modelo que mejor ajusta es aquel que tiene menor
valor en estos criterios (Quinn y Keough, 2002).
𝐴𝐼𝐶 = 𝑁 ln !!!!
!+ 1 + 2 (3-17)
_____________________________________________________Materiales y Métodos
55
𝐵𝐼𝐶 = 𝑁 ln !!!!
!+ 1 + 𝑃 ln(𝑁)
(3-18)
donde N es el número de observaciones, P es el número de parámetros del modelo y σ2
es la varianza calculada del cuadrado medio del error (MSE).
3.7 Análisis estadístico
Los resultados fueron expresados como la media ±la desviación estándar y se
analizaron utilizando el software estadístico Infostat v.2008 (Universidad Nacional de
Córdoba, Argentina).
Los sólidos solubles, pH, acidez titulable (AT), pardeamiento no enzimático
(PNE) e índice de pardeamiento (IB) fueron analizados a través de un análisis de
varianza (ANOVA) para buscar diferencias significativas entre los tratamientos. Se
aplicó un test de Tukey (con un nivel de confianza del 95%) cuando se encontraron
diferencias significativas.
Los resultados de color y viscosidad (parámetros del modelo) fueron analizados
mediante un análisis de varianza multivariado (MANOVA) para buscar diferencias
significativas entre las muestras. Se aplicó un test de Hotelling corregido por Bonferroni
(con un nivel de confianza del 95 %) cuando se encontraron diferencias significativas.
Para realizar el ANOVA y MANOVA se verificaron los supuestos de normalidad y
homocedasticidad y se analizaron posibles outliers con la distancia de Mahalanobis (p≤
0,001) para los análisis multivariados.
4. RESULTADOS
______________________________________________________________Resultados
57
4.1 Efecto del ozono sobre pH, sólidos solubles y acidez titulable en jugo de
durazno.
Las determinaciones de pH, sólidos solubles y acidez titulable fueron realizadas
de acuerdo a lo establecido en Materiales y Métodos sección 3.5.1.
Los resultados obtenidos de las determinaciones de sólidos solubles (°Brix), en
las muestras tratadas con una concentración de ozono de 10 ppm y 18 ppm a distintos
tiempos de exposición, se detallan en la Tabla 4-1 y Figura 4-1. Para ambas
concentraciones de ozono, se observaron ligeras variaciones en el contenido de sólidos
solubles de los jugos tratados con respecto al control (jugo no ozonado). En general, las
muestras ozonadas con una concentración de 10 ppm presentaron una disminución leve
pero significativa (F9,20 = 432,04; p<0,0001) en los sólidos solubles, incrementándose
ligeramente la variación después de los 5 minutos de tratamiento. En el caso de las
muestras tratadas con una concentración de 18 ppm, la disminución se evidenció a partir
de los 5 minutos de tratamiento (F9,20 = 23,40; p<0,0001).
Tabla 4-1. Valores promedio de los sólidos solubles (°Brix) y sus correspondientes desviaciones estándar de jugo de durazno fresco y tratado con ozono a distintos tiempos y diferentes concentraciones.
Tratamiento (min)
[O3] = 10 ppm Tratamiento (min)
[O3] = 18 ppm
0 14,37 ± 0,21 a 0 12,30 ± 0,17 a,b 1 12,63 ± 0,06 b 0,33 12,13 ± 0,15 a,b,c 2 14,47 ± 0,12 a 0,66 11,97 ± 0,12 b,c 3 12,67 ± 0,15 b 1 12,27 ± 0,12 a,b 4 12,77 ± 0,06 b 2 12,37 ± 0,21 a 5 13,27 ± 0,06 c 3 12,10 ± 0,10 a,b,c 6 11,73 ± 0,06 d 5 11,87 ± 0,06 c 8 11,57 ± 0,06 d 7 11,77 ± 0,15 c,d 10 11,07 ± 0,06 e 10 11,47 ± 0,12 d,e 12 11,13 ± 0,06 e 12 11,23 ± 0,06 e
Medias de una misma columna identificadas con igual letra no presentan diferencias significativas con un 95% de nivel de confianza.
______________________________________________________________Resultados
58
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 125
10
15
20
t (min)
° B
rix
Figura 4-1. Valores promedio de los sólidos solubles (°Brix) de jugo de durazno fresco y tratado con ozono a distintos tiempos y diferentes concentraciones. Las barras verticales representan las desviaciones estándar.
En las Tabla 4-2 y Figura 4-2 se muestran los valores de pH de las diferentes
muestras analizadas. A pesar de que el análisis estadístico marcó para algunos
tratamientos diferencias significativas en el pH de los jugos tratados con respecto al
control (F9,20 = 65,48 y F9,20 = 14,48 para la concentración de ozono de 10 y 18 ppm,
respectivamente), los cambios observados fueron leves o prácticamente despreciables.
Los valores de acidez titulable (AT) de los jugos de durazno analizados se
observan en la Tabla 4-3 y Figura 4-3. En general, para las concentraciones de ozono
evaluadas, no se observaron diferencias significativas en los valores de acidez titulable
entre los jugos tratados y fresco (control).
• 10 ppm O3 ■ 18 ppm O3
______________________________________________________________Resultados
59
Tabla 4-2. Valores promedio de pH y sus correspondientes desviaciones estándar de jugo de durazno fresco y tratado con ozono a distintos tiempos y diferentes concentraciones.
Tratamiento (min)
[O3] = 10 ppm Tratamiento (min)
[O3] = 18 ppm
0 4,36 ± 0,06 a 0 4,08 ± 0,03 a 1 4,25 ± 0,01 b 0,33 4,07 ± 0,03 a 2 4,40 ± 0,03 a,c 0,66 4,06 ± 0,03 a,b 3 4,36 ± 0,01 a 1 4,00 ± 0,01 c 4 4,45 ± 0,05 c 2 4,02 ± 0,01 b,c 5 4,24 ± 0,03 b 3 4,01 ± 0,02 b,c 6 4,21 ± 0,02 b 5 3,99 ± 0,01 c,d 8 4,19 ± 0,01 b 7 3,98 ± 0,01 c,d 10 4,08 ± 0,02 d 10 3,99 ± 0,01 c,d 12 4,04 ± 0,01 d 12 3,99 ± 0,01 c
Medias de una misma columna identificadas con igual letra no presentan diferencias significativas con un 95 % de nivel de confianza.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 123
4
5
t (min)
pH
Figura 4-2 Valores promedio de pH de jugo de durazno fresco y tratado con ozono a distintos tiempos y diferentes concentraciones. Las barras verticales representan las desviaciones estándar.
• 10 ppm O3 ■ 18 ppm O3
______________________________________________________________Resultados
60
Tabla 4-3. Valores promedio de la acidez titulable (% p/v de ácido málico) y sus correspondientes desviaciones estándar de jugo de durazno fresco y tratado con ozono a distintos tiempos y diferentes concentraciones.
Tratamiento (min) [O3] = 10 ppm Tratamiento
(min) [O3] = 18 ppm
0 0,38 ± 0,01 a,b 0 0,43 ± 0,01 a 1 0,38 ± 0,01 b 0,33 0,42 ± 0,01 a 2 0,36 ± 0,01 c 0,66 0,44 ± 0,01 a,b 3 0,37 ± 0,01 b,c 1 0,45 ± 0,01 a,b 4 0,40 ± 0,01 a 2 0,43 ± 0,01 a 5 0,38 ± 0,01 b,c 3 0,44 ± 0,01 a,b 6 0,37 ± 0,01 b,c 5 0,45 ± 0,01 b,c 8 0,38 ± 0,01 b,c 7 0,44 ± 0,01 a,b 10 0,39 ± 0,01 a,b 10 0,44 ± 0,01 a,b 12 0,39 ± 0,01 a,b 12 0,48 ± 0,01 c
Medias de una misma columna identificadas con igual letra no presentan diferencias significativas con un 95% de nivel de confianza.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.2
0.4
0.6
t (min)
,
,
,
AT (%
)
Figura 4-3 Valores promedio de la AT de jugo de durazno fresco y tratado con ozono a distintos tiempos y diferentes concentraciones. Las barras verticales representan las desviaciones estándar.
• 10 ppm O3 ■ 18 ppm O3
______________________________________________________________Resultados
61
El comportamiento observado en el pH, °Brix y AT en los jugos ozonados fue
similar al reportado por otros autores. Tiwari y col. (2009 b, e) no encontraron
variaciones significativas en el pH, °Brix y AT por efecto de la aplicación de ozono en
jugo de tomate y uva tratados con concentraciones entre 1,6-7,8 % (p/p) y tiempos de
exposición entre 0-10 minutos. Choi & Nielsen (2005), al evaluar la aplicación de
ozono en sidra de manzana sin alcohol, también encontraron cambios leves o no
significativos en estos parámetros fisicoquímicos a lo largo de 21 días de
almacenamiento. En este estudio la ozonización se realizó a 20 ºC con una
concentración de ozono y tiempo de exposición mucho mayor a los aplicados en este
trabajo (860 ppm; flujo: 0,5 L/min; 28 min).
4.2 Determinación del índice de pardeamiento no enzimático (PNE)
Los resultados obtenidos de la evaluación del índice de PNE se muestran en la
Tabla 4-4 y Figura 4-4. Para la concentración de 10 ppm, los valores de PNE del jugo
fresco (control) y de los jugos tratados hasta el minuto 3 no presentaron diferencias
significativas entre ellos, mientras que a partir del minuto 4 fue observada una leve
disminución significativa (F9,20 = 37,48; p<0,0001) con respecto al control.
Tabla 4-4. Valores promedio del índice de PNE y sus correspondientes desviaciones estándar de jugo de durazno fresco y tratado con ozono a distintos tiempos y diferentes concentraciones.
Tratamiento (min)
[O3] = 10 ppm Tratamiento (min)
[O3] = 18 ppm
0 0,83 ± 0,09 a 0 0,54 ± 0,03 a 1 0,78 ± 0,04 a,b 0,33 0,62 ± 0,01 b,c 2 0,81 ± 0,03 a,b 0,66 0,62 ± 0,01 b 3 0,74 ± 0,02 a,b,c 1 0,65 ± 0,01 c 4 0,70 ± 0,01 b,c 2 0,70 ± 0,02 d 5 0,65 ± 0,04 c,d 3 0,71 ± 0,01 d 6 0,55 ± 0,02 d,e 5 0,61 ± 0,01 b 8 0,51 ± 0,01 e 7 0,59 ± 0,01 b 10 0,51 ± 0,01 e 10 0,59 ± 0,01 b 12 0,50 ± 0,03 e 12 0,59 ± 0,00 b
Medias de una misma columna identificadas con igual letra no presentan diferencias significativas con un 95% de nivel de confianza.
______________________________________________________________Resultados
62
Las muestras tratadas con una concentración de ozono de 18 ppm mostraron un
comportamiento diferente al descripto anteriormente para la dosis de ozono de 10 ppm.
Todas las muestras tratadas presentaron un ligero incremento significativo con respecto
al control (F9,20 = 45,75; p<0,0001). En general, no se observaron diferencias
significativas entre los diferentes tiempos de tratamiento, excepto para tiempos de
exposición de 2 y 3 minutos donde el aumento fue superior.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.0
0.5
1.0
t (min)
,
,
,
PNE
Figura 4-4 Valores promedio de PNE de jugo de durazno fresco y tratado con ozono a distintos tiempos y diferentes concentraciones. Las barras verticales representan las desviaciones estándar.
El pardeamiento durante el procesamiento de jugo de durazno es un problema
habitual, debido a que presenta un alto contenido de hidratos de carbono, ácidos
orgánicos y compuestos fenólicos que son altamente propensos a la oxidación (Versari y
col., 2002). Como se mencionó en la introducción, el pardeamiento puede desarrollarse
mediante la acción de enzimas (PPO y POD) que catalizan la oxidación de fenoles, o
pardeamiento no enzimático, que incluye reacciones de Maillard, caramelización,
degradación de ácido ascórbico y oxidación química de fenoles (Cullen y col., 2010,
Manzocco y col., 2001). El ozono, por su alto poder oxidante, podría también oxidar a
los compuestos fenólicos contribuyendo en la aparición de compuestos pardos.
• 10 ppm O3 ■ 18 ppm O3
______________________________________________________________Resultados
63
En los tratamientos evaluados en este trabajo no se observaron cambios
importantes en el índice de pardeamiento no enzimático por efecto de la aplicación de
ozono, y contrariamente a lo esperado, en las muestras tratadas con la concentración de
ozono de 10 ppm, el PNE tendió a reducirse al aumentar el tiempo de tratamiento.
Tiwari y col. (2008b, 2009b) no encontraron cambios significativos en el índice de PNE
por efecto del tratamiento con ozono en jugo de naranja y tomate, respectivamente.
4.3 Estudio de los cambios de color por efecto del ozono en el jugo de durazno.
Se analizaron los cambios en el color del jugo de durazno por efecto de la
ozonización a distintas concentraciones y tiempos de exposición.
Los parámetros y funciones de color obtenidos para el jugo fresco y las muestras
tratadas con una concentración de ozono de 10 ppm se muestran en la Tabla 4-5. El
jugo fresco presentó un color inicial naranja pardo, representado por los valores de L*,
a*, b*, C* y h* informados en la Tabla 4-5 para tiempo 0. Para todos los tiempos de
tratamiento evaluados, las muestras ozonadas presentaron variaciones significativas
(F9,30 = 218,75; p<0,0001) en el color en relación al jugo no ozonado. Las diferencias
encontradas dependieron de los tiempos de tratamiento evaluados.
Los valores del parámetro L* aumentaron en función del tiempo de exposición
del jugo de durazno al ozono. Esto indicaría un aumento de la luminosidad de las
muestras tratadas con respecto al control (Figura 4-5 a). Respecto a los parámetros a* y
b*, el parámetro a* en las muestras ozonadas disminuyó sus valores levemente (menos
rojo) durante los primeros minutos (0 - 4 minutos), y de manera más pronunciada luego
del minuto 4 (Figura 4-5 b). Por el contrario, el parámetro b* no presentó un
comportamiento uniforme durante los tiempos establecidos para el ensayo experimental;
hasta el minuto 4 aumentó sus valores (más amarillo) y a partir del minuto 5 se
mantuvo relativamente constante (Figura 4-5c).Los valores de C*, relacionados con la
saturación del color, presentaron un incremento gradual hasta el minuto 4, y
permanecieron relativamente constante a tiempos mayores (Tabla 4-5, Figura 4-6, a).
El incremento de los valores de C* indicó un aumento de intensidad del color en
función del tiempo de ozonización (máximo incremento observado 11 %). Los valores
de h* aumentaron conforme aumentó el tiempo de exposición de las muestras al ozono
(62 a 76°) (Tabla 4-5, Figura 4-6 b). Por lo tanto, las muestras ozonadas presentaron
un mayor cambio en la tonalidad que en la saturación.
Tabla 4-5. Valores promedios y sus correspondientes desviaciones estándar de los parámetros y funciones de color del jugo de durazno fresco y tratado con una concentración de ozono de 10 ppm a distintos tiempos.
Tratamiento (min) L* a* b* C* h*
0 19,96 ± 0,52 15,15 ± 0,18 29,06 ± 0,85 32,77 ± 0,76 62,45 ± 0,71 a 1 22,88 ± 0,79 12,74 ± 1,50 29,68 ± 2,07 32,31 ± 2,31 66,79 ± 1,92 b 2 23,46 ± 0,43 14,42 ± 0,10 32,56 ± 0,70 35,61 ± 0,64 66,10 ± 0,50 c 3 26,32 ± 0,18 12,93 ± 0,29 34,65 ± 1,10 36,98 ± 1,00 69,52 ± 0,84 d 4 26,07 ± 0,50 13,11 ± 0,39 35,31 ± 0,61 37,66 ± 0,64 69,64 ± 0,53 d 5 27,35 ± 0,66 11,92 ± 0,37 33,19 ± 0,71 35,27 ± 0,62 70,24 ± 0,83 d,e 6 28,11 ± 0,45 11,10 ± 0,37 33,79 ± 0,89 35,57 ± 0,82 71,81 ± 0,82 e,f 8 28,22 ± 0,43 10,80 ± 0,32 35,71 ± 0,28 37,31 ± 0,24 73,17 ± 0,55 f 10 31,35 ± 0,92 8,82 ± 0,41 32,88 ± 1,98 34,04 ± 2,01 74,97 ± 0,19 g 12 30,90 ± 0,31 8,64 ± 0,41 35,46 ± 0,51 36,50 ± 0,55 76,31 ± 0,58 h
Tratamientos identificados con la misma letra no presentan diferencias significativas con un 95% de nivel de confianza
______________________________________________________________Resultados
65
a)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1215
20
25
30
35
t (min)
L*
b)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
5
10
15
20
t (min)
a*
c)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1225
30
35
40
t (min)
b*
Figura 4-5. Valores promedios de los parámetros L* (a), a* (b) y b* (c) de jugo de durazno fresco y tratado con una concentración de ozono de 10 ppm en función del tiempo de tratamiento. Las barras verticales representan las desviaciones estándar.
______________________________________________________________Resultados
66
a)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1225
30
35
40
t (min)
C*
b)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1255
60
65
70
75
80
t (min)
h *
Figura 4-6. Valores promedios de los parámetros C* (a) y h* (b) de jugo de durazno fresco y tratado con una concentración de ozono de 10 ppm en función del tiempo de tratamiento. Las barras verticales representan las desviaciones estándar.
______________________________________________________________Resultados
67
En la Figura 4-7 se observa que el índice de pardeamiento (IB) de las muestras
tratadas con ozono (10 ppm) tendió a reducirse en función del tiempo de exposición. En
general, las muestras ozonadas durante los primeros minutos de tratamiento no
presentaron diferencias significativas en relación al control, mientras que las muestras
tratadas después de tres minutos mostraron reducciones significativas (F9,30 = 34,42;
p<0,0001) en los valores del IB (Tabla 4-6).
Tabla 4-6. Valores promedios y sus correspondientes desviaciones estándar del índice de pardeamiento (IB) de jugo de durazno fresco y tratado con una concentración de ozono de 10 ppm a distintos tiempos.
Medias identificadas con igual letra no presentan diferencias significativas con un 95% de nivel de confianza.
Numerosos autores han reportado que un decrecimiento en el valor de L* y un
incremento en el valor de a* son indicativos de pardeamiento (Goupy y col., 1995;
Lopéz-Nicolás y col., 2007; Monsalve-Gonzalez y col., 1993; Rocha & Morais, 2003).
Por lo tanto, el incremento en la luminosidad y la disminución en el parámetro a*
observado en las muestras ozonadas se relacionarían con una disminución del
pardeamiento por efecto de los tratamientos. Sapers y Douglas (1987) sugirieron
también que el pardeamiento enzimático podría ser monitoreado midiendo los cambios
en los valores de L* y a*, mientras que el parámetro b* no estaría relacionado con la
extensión del pardeamiento. Estos resultados se correlacionaron con la disminución del
IB que presentaron las muestras ozonadas en función del tiempo de tratamiento.
Tratamiento (min) IB*
0 121,8 ± 1,3 a 1 109,9 ± 7,4 b,d,e 2 117,7 ± 2,1 a,c 3 111,6 ± 1,7 b,c,d 4 113,5 ± 1,0 b,c 5 105,1 ± 1,4 d,e 6 102,9 ± 2,2 e,f 8 105,1 ± 1,2 d,e 10 91,2 ± 5,3 g 12 95,7 ± 1,7 f,g
______________________________________________________________Resultados
68
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1280
90
100
110
120
130
t (min)
IB*
Figura 4-7. Valores promedios del índice de pardeamiento (IB*) de jugo de durazno fresco y tratado con una concentración de ozono de 10 ppm en función del tiempo de tratamiento. Las barras verticales representan las desviaciones estándar.
Aunque el diagrama CIE x-y sólo permite observar en dos dimensiones, nos es
útil para corroborar la información antes mencionada. La Figura 4-8 muestra la
evolución del color del jugo de durazno tratado con ozono en el diagrama de
cromaticidad CIE x-y. La muestra control se situó en la región de color naranja pardo, y
a medida que aumentó el tiempo de ozonización (ver dirección de la flecha), las
muestras se movieron gradualmente hacia la región amarillo-naranja. Los resultados
encontrados con este diagrama indicaron, de igual forma a lo obtenido en el diagrama
del espacio CIE Lab, una disminución en el pardeamiento de la muestras por efecto del
ozono.
______________________________________________________________Resultados
69
Figura 4-8. Evolución de los parámetros de color del sistema CIExy de jugo de durazno tratado con una concentración de ozono de 10 ppm. Tiempo de exposición (minutos): 0 (•), 1 (•), 2 (•), 3 (•), 4 (•), 5 (•), 6 (•), 8 (•), 10 (•), 12 (•). La flecha indica el aumento del tiempo de ozonización.
______________________________________________________________Resultados
70
Los resultados de color para la concentración de 18 ppm se muestran en la
Tabla 4-7. El jugo fresco presentó valores más altos en L* y más bajos en a*
comparados con el jugo fresco utilizado para la tratamientos de ozono de 10 ppm, lo que
indicaría que se partió de un jugo menos pardeado.
Si bien es cierto que en los valores de los parámetro L*, a*, b*, C* y h* no hubo
una gran variación, el análisis estadístico realizado evidenció diferencias significativas
(F9,40 = 69,31; p<0,0001) entre las muestras tratadas con ozono y el control (muestra sin
tratamiento). En general, entre las muestras ozonadas a diferentes tiempos no se
encontraron diferencias significativas.
Los valores del parámetro L* en las muestras tratadas disminuyeron levemente
hasta el minuto 3 de exposición del jugo al ozono. A partir del minuto 5 hasta el minuto
12 los valores permanecieron prácticamente constantes. Este comportamiento indicaría
un ligero oscurecimiento de las muestras (Figura 4-9, a).
Los valores del parámetro a* aumentaron levemente durante los primeros
minutos (hasta el minuto 3) y posterior a ello, de igual forma que el parámetro L*, se
mantuvieron casi invariables hasta el minuto 12. El aumento de los valores de a* y la
disminución de L* reflejarían un leve aumento del pardeamiento de las muestras
ozonadas (Figura 4-9, b). Con respecto al parámetro b*, las muestras tratadas no
presentaron variaciones importantes con respecto al control. En la Figura 4-9 c
claramente se observa que el valor de b* a partir del minuto 1 hasta el 12 permanece
casi invariable.
En la Figura 4-10 se observa la evolución de las variables del color croma (C*)
y ángulo de tono (h*). Los valores obtenidos para croma claramente muestran que no
hay una variación importante entre las muestras ozonadas y la muestra del jugo fresco
(sin tratamiento). Los valores disminuyeron mínimamente en un inicio hasta el minuto 1
y después se mantuvieron constantes en los siguientes minutos de tratamiento con
ozono, indicando de esta forma que la saturación no se vió afectada (reducción máxima
observada < 1 %) (Figura 4-10, a). Los valores de h* también disminuyeron levemente
conforme aumentó el tiempo de exposición de las muestras al ozono (reducción máxima
encontrada < 3%) (Figura 4-10, b); al igual que el resto de parámetros hubo una
variación hasta los 3 minutos y luego se mantuvo constante.
Tabla 4-7. Valores promedios y sus correspondientes desviaciones estándar de los parámetros y funciones de color de jugo de durazno fresco y tratado con una concentración de ozono de 18 ppm a distintos tiempos.
Tratamiento (min)
L* a* b* C* h*
0 29,83 ± 0,24 8,89 ± 0,28 35,11 ± 0,87 36,21 ± 0,90 75,79 ± 0,26 a 0,33 27,42 ± 0,22 10,53 ± 0,32 34,84 ± 0,43 36,39 ± 0,49 73,18 ± 0,34 b,c 0,66 27,11 ± 0,36 10,79 ± 0,20 35,38 ± 0,23 36,99 ± 0,20 73,04 ± 0,35 c,d
1 26,69 ± 0,46 10,70 ± 0,39 34,11 ± 0,57 35,75 ± 0,63 72,60 ± 0,45 c,d 2 25,70 ± 0,44 11,39 ± 0,27 34,10 ± 0,92 35,95 ± 0,92 71,52 ± 0,48 e 3 25,57 ± 0,36 11,38 ± 0,33 33,97 ± 0,26 35,83 ± 0,31 71,48 ± 0,46 e 5 26,26 ± 0,21 10,45 ± 0,65 34,31 ± 0,26 35,87 ± 0,20 73,06 ± 1,08 d 7 26,55 ± 0,55 10,46 ± 0,55 34,24 ± 0,36 35,80 ± 0,23 73,01 ± 0,99 c,d 10 26,48 ± 0,46 10,73 ± 0,57 34,69 ± 0,61 36,31 ± 0,74 72,82 ± 0,62 c,d 12 27,63 ± 0,25 9,54 ± 0,32 34,64 ± 0,59 35,93 ± 0,59 74,60 ± 0,49 b
Tratamientos identificados con la misma letra no presentan diferencias significativas con un 95% de nivel de confianza.
______________________________________________________________Resultados
72
a)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1215
20
25
30
35
t (min)
L*
b)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
5
10
15
20
t (min)
a*
c)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1225
30
35
40
t (min)
b*
Figura 4-9. Valores promedios de los parámetros L* (a), a* (b) y b* (c) de jugo de durazno fresco y tratado con una concentración de ozono de 18 ppm en función del tiempo de tratamiento. Las barras verticales representan las desviaciones estándar.
______________________________________________________________Resultados
73
a)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1225
30
35
40
t (min)
C*
b)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1255
60
65
70
75
80
t (min)
h *
Figura 4-10. Valores promedios de los parámetros C* (a) y h* (b) de jugo de durazno fresco y tratado con una concentración de ozono de 18 ppm en función del tiempo de tratamiento. Las barras verticales representan las desviaciones estándar.
______________________________________________________________Resultados
74
La Figura 4-11 muestra la evolución de índice de pardeamiento (IB), los valores
aumentaron de 95 a 109 conforme las muestras fueron expuestas a mayores tiempos de
exposición al ozono. El IB aumentó hasta el minuto 3, mientras que a partir del minuto
5 hasta el 12 los resultados disminuyeron levemente hasta alcanzar valores similares a
los encontrados en las muestras tratadas con ozono durante periodos muy cortos (30 y
60 segundos) (Tabla 4-8).
Las muestras ozonadas presentaron diferencias significativas (F9,40 = 17,84;
p<0,0001) con respecto al control en los valores del índice de pardeamiento. Sin
embargo, entre tratamientos prácticamente no hubo diferencias significativas (Tabla 4-
8).
Tabla 4-8. Valores promedios y sus correspondientes desviaciones estándar del índice
de pardeamiento (IB) del jugo de durazno fresco y tratado con una concentración de
ozono de 18 ppm a distintos tiempos.
.
Medias identificadas con igual letra no presentan diferencias significativas con un 95% de nivel de
confianza.
Tratamiento (min) IB*
0 97 ± 2,1 a 0,33 105 ± 1,6 b,c 0,66 107 ± 0,7 c,d 1 105 ± 2,3 b,c,d 2 109 ± 1,6 d 3 109 ± 1,3 d 5 106 ± 1,2 c,d 7 105 ± 1,6 b,c,d 10 107 ± 3,0 c,d 12 102 ± 1,2 b
______________________________________________________________Resultados
75
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1280
90
100
110
120
130
t (min)
IB*
Figura 4-11. Valores promedios del índice de pardeamiento (IB*) de jugo de durazno fresco y tratado con una concentración de ozono de 18 ppm en función del tiempo de tratamiento. Las barras verticales representan las desviaciones estándar.
La Figura 4-12 muestra la evolución del color del jugo de durazno fresco y
tratado en el diagrama de cromaticidad CIE x-y. En la misma se puede observar que el
jugo control (sin tratamiento) se situó en la región de color amarilla-naranja y conforme
se incrementó el tiempo de exposición al ozono (ver dirección de la flecha) hubo una
evolución del color de las muestras hacia la región naranja. También se observa que no
hubo una distribución gradual, más bien las muestras se aglomeraron en una zona
estrecha; esto coincide con lo descripto anteriormente relacionado con que, en general,
no se presentaron diferencias significativas entre tratamientos. Si comparamos el
diagrama de cromaticidad CIE x-y y el diagrama de espacio CIE Lab existe una
similitud en los resultados obtenidos para las muestras tratadas con una concentración
de 18 ppm durante distintos tiempos.
______________________________________________________________Resultados
76
Figura 4-12. Evolución de los parámetros de color del sistema CIExy de jugo de durazno tratado con una concentración de ozono de 18 ppm. Tiempo de exposición (minutos): 0 (•), 0,33 (•), 0,66 (•), 1 (•), 2 (•), 3 (•), 5 (•), 7(•), 10(•), 12 (•). La flecha indica el aumento del tiempo de ozonización.
______________________________________________________________Resultados
77
Los carotenoides se encuentran en forma abundante en algunas frutas y verduras.
En el durazno y sus derivados (jugos y pulpas) estos pigmentos orgánicos son los
principales responsables del color amarillo-rojo. Debido a que su estructura es
insaturada la presencia de agentes que favorezcan la producción de radicales libres los
afecta y en casos extremos se oxidan y decoloran (Badui, 2006). El ozono tiene un alto
potencial oxidante lo cual provoca la degradación de muchos compuestos orgánicos
(Patil y Bourke, 2012). Se ha reportado que la aplicación de ozono en pigmentos
orgánicos provoca una pérdida de color debido la escisión oxidativa de los cromóforos
al atacar los dobles enlaces conjugados. Los carotenoides contienen uno o más anillos
aromáticos; la presencia del ozono y sus radicales hidroxilo (-OH) generados en la
solución acuosa pueden abrir esos anillos y conducir a la oxidación parcial de productos
tales como ácidos orgánicos, aldehídos, y cetonas (Cullen y col., 2010). Pese a que no se
ha relacionado en otras investigaciones al ozono como un agente que facilite la
isomerización de compuestos, tampoco puede descartarse algún mecanismo que
conlleve a ello.
Si evaluamos las variables L*, a*, b*, C*, h* e IB* del jugo para ambas
concentraciones ozono a lo largo del tiempo de tratamiento (0-12 minutos), las muestras
tratadas con 10 ppm de ozono mostraron un comportamiento diferente al de las
muestras tratadas con 18 ppm. Dichas diferencias podrían atribuirse a que se partió de
un jugo fresco con diferente nivel de pardeamiento. Como mencionamos en párrafos
anteriores, el poder oxidativo del ozono puede resultar en la decoloración de ciertos
pigmentos orgánicos (pérdida de color). Al partir de un jugo pardeado, la aplicación del
ozono (10 ppm) causó un cierto aclaramiento (decoloración) en las muestras. Este
aclaramiento podría estar asociado a una degradación de los carotenoides y de los
productos pardos generados en las reacciones de pardeamiento.
En cambio, para el segundo lote de jugo tratado con una concentración de 18
ppm en donde se partió de un jugo que presentaba un menor pardeamiento, el ozono
provocó inicialmente un leve incremento en el pardeamiento (hasta el minuto 3). Para
tiempos mayores no se observó una tendencia clara en función del tiempo y los cambios
fueron prácticamente despreciables.
Diferentes autores han reportado cambios significativos en el color debido a la
aplicación de ozono. En jugo de naranja, los valores de L*, a*,b*, C* y h* se
incrementaron en función de la concentración de ozono (1,2 - 4% p/p) y del tiempo de
tratamiento (2 - 10 minutos) (Tiwari y col., 2008c). Para jugo de frutilla, Tiwari y col.
______________________________________________________________Resultados
78
(2009d) observaron un ligero aclaramiento, es decir los valores de L* aumentaron; sin
embargo los valores de a* y b* disminuyeron con el incremento de la concentración de
ozono (0-7,8 % p/p) y el tiempo de exposición (0-10 minutos). En jugo de mora los
cambios de color fueron similares a los reportados en frutilla, es decir hubo un aumento
en los valores de la luminosidad (L*), mientras que los valores de a* y b* disminuyeron
a medida que aumentó la concentración de ozono (0-7,8 % p/p) y el tiempo de
procesamiento (0-10 minutos) (Tiwari y col., 2009c). El jugo de manzana ozonado
también presentó un color más claro; los valores de L* y b* se incrementaron, mientras
que los valores de a* decrecieron (Torres y col., 2011; Patil y col., 2010a). El jugo de
tomate ozonado fue ligeramente más claro que la muestra control, los valores de L*
crecieron, mientras que los parámetros a* y b* disminuyeron con el aumento del tiempo
de procesamiento y la concentración de ozono (Tiwari y col., 2009b).
4.4 Efecto del tratamiento de ozono en las propiedades reológicas del jugo de
durazno
Para la caracterización reológica del jugo de durazno, la viscosidad aparente y el
esfuerzo de corte (τ) en función de la velocidad de deformación fueron evaluadas
mediante ensayos rotacionales, tal como se describe en Materiales y Métodos sección
3.5.4.
En la Figura 4-13 se visualiza la tendencia de la viscosidad aparente (ηapp) en
función de velocidad de deformación para la muestra control y las muestras ozonadas a
distintos tiempos, para la concentración de 10 ppm.
Las curvas de esfuerzo de corte (τ) en función de la velocidad de deformación
que se muestran en la Figura 4-14 fueron ajustadas según la ley de la potencia, de
acuerdo a la ecuación 3-6 detallada en la sección 3.5.4 de Materiales y Métodos. El
ajuste de las curvas fue bueno obteniéndose coeficientes de determinación (R2) en un
rango de 0,92 a 0,99.
______________________________________________________________Resultados
79
0.1 1 10 1000.0
0.1
0.2
0.3
0.4,
,
,
,
,
,γ (s-1)
• 0 min • 1 min • 2 min • 3 min • 4 min
ηap
p (P
a.s)
0.1 1 10 1000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
γ (s-1)
,
,
,
,,
, • 5 min • 6 min • 8 min • 10 min • 12 min
ηap
p(Pa
.s)
Figura 4-13. Valores promedio de viscosidad aparente (ηapp) en función de la velocidad de deformación de jugo de durazno tratado con una concentración de ozono de 10 ppm a distintos tiempos.
______________________________________________________________Resultados
80
0 20 40 60 80 1000.0
0.1
0.2
0.3
0.4,
,
,
,
,
γ (s-1)
• 0 min • 1 min • 2 min • 3 min • 4 min
τ (Pa)
0 20 40 60 80 1000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
γ (s-1)
,
,
,
,
,
• 5 min • 6 min • 8 min • 10 min • 12 min
τ (Pa
)
Figura 4-14. Valores promedio de esfuerzo de cizalla (τ) en función de la velocidad de deformación de jugo de durazno tratado con una concentración de ozono de 10 ppm a distintos tiempos.
______________________________________________________________Resultados
81
Los parámetros del modelo, índice de consistencia (k) e índice de flujo (n), de las
muestras tratadas con 10 ppm de ozono se muestran en la Tabla 4-9. En general, las
muestras ozonadas hasta el minuto 4 no presentaron diferencias significativas con
respecto al control. A partir del minuto 4 se observó una disminución significativa (F9,30
= 32,86; p<0,0001) en k y un aumento en los valores de n, indicando un pérdida de la
viscosidad y un acercamiento al comportamiento newtoniano (n = 1). Estos cambios
fueron más relevantes para las muestras tratadas durante 10 y 12 minutos. En la Figura
4-15 se observa como el índice de flujo aumenta y el índice de consistencia disminuye
en función al tiempo de exposición al ozono.
Tabla 4-9. Valores promedio del índice de consistencia (k), índice de flujo (n) y sus
correspondientes desviaciones estándar de jugo de durazno tratado con una
concentración de ozono de 10 ppm a distintos tiempos.
Tratamiento k (Pa.sn) n
0 0,030 ± 0,005 0,523 ± 0,053 a 1 0,024 ± 0,007 0,569 ± 0,056 a,b 2 0,016 ± 0,002 0,667 ± 0,038 b,c 3 0,024 ± 0,004 0,552 ± 0,012 a,b,c 4 0,018 ± 0,002 0,628 ± 0,016 a,b,c 5 0,015 ± 0,004 0,648 ± 0,039 b,c 6 0,016 ± 0,003 0,629 ± 0,007 b,c 8 0,012 ± 0,001 0,664 ± 0,063 c 10 0,005 ± 0,001 0,837 ± 0,010 d 12 0,003 ± 0,001 0,979 ± 0,052 e
Tratamientos identificados con igual letra no presentan diferencias significativas con un 95% de nivel de confianza.
______________________________________________________________Resultados
82
a)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.00
0.01
0.02
0.03
0.04
t (min)
,
,
,
,
,
k(P
a.sn )
b)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4
0.6
0.8
1.0
t (min)
,
,
,
,
n
Figura 4-15. Valores promedio de: a) índice de consistencia (k) y b) índice de flujo (n) vs tiempo de exposición de las muestras de jugo de durazno a una concentración de ozono de 10 ppm. Las barras verticales representan las desviaciones estándar.
______________________________________________________________Resultados
83
Las curvas de viscosidad aparente y esfuerzo de cizalla en función de la
velocidad de deformación para las muestras ozonadas con una concentración de 18 ppm
presentaron un comportamiento de un fluido pseudoplástico en los tiempos de
tratamiento evaluados (0-3 minutos) (Figura 4-16 y 4-17, respectivamente). De la
misma forma que lo observado para la concentración de 10 ppm, la viscosidad aparente
para bajas velocidades de deformación tendió a disminuir con el aumento del tiempo de
exposición al ozono.
0.1 1 10 1000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
γ (s-1)
,
,
,
,
,
,,
• 0 min • 0,33 min • 0,66 min • 1 min • 2 min • 3 min
ηapp(Pa.s)
Figura 4-16. Valores promedio de viscosidad aparente (ηapp) en función de la velocidad
de deformación de jugo de durazno tratado con una concentración de ozono de 18
ppm a distintos tiempos.
El comportamiento de la viscosidad aparente del jugo para ambas
concentraciones de ozono fue similar, es decir presentaron un comportamiento típico de
los fluidos pseudoplásticos (0 < n < 1) durante los primeros minutos de tratamiento. En
el caso de la concentración de 10 ppm donde se analizaron tiempos de exposición más
prolongados (hasta 12 min), las muestras fueron asemejándose a un comportamiento de
fluido newtoniano.
______________________________________________________________Resultados
84
0 20 40 60 80 1000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
γ (s-1)
,
,
,
,
,
,
τ(Pa)
• 0 min • 0,33 min • 0,66 min • 1 min • 2 min • 3 min
Figura 4-17. Valores promedio de esfuerzo de cizalla (τ) en función de la velocidad de
deformación de jugo de durazno tratado con una concentración de ozono de 10 ppm
a distintos tiempos.
Los jugos de frutas no clarificados son una suspensión coloidal que se componen
de una fase insoluble (la pulpa) dispersa en una solución viscosa (fase acuosa). La fase
dispersa o la pulpa se forma del tejido de las células de fruta y sus fragmentos, las
paredes celulares y agrupaciones de polímeros insolubles. La fase acuosa es una
solución de polisacáridos solubles, azúcares, sales y ácidos. Las propiedades reológicas
de los jugos de frutas se definen por las interacciones dentro de cada fase y entre ellas
(Pedro y col., 2012). En el jugo no clarificado sus dos fases se pueden separar mediante
centrifugación. De esta forma se obtiene un jugo clarificado; dicho jugo contiene
solutos de alto y bajo peso molecular (Mizrahi, 1978). Algunos autores mencionan que
los jugos clarificados generalmente muestran un comportamiento pseudoplástico (Ibarz
y col., 1992), lo cual coincide con la presente tesis.
El peso molecular de los polímeros es importante, ya que determina muchas
propiedades físicas como la viscosidad, y la reducción de la misma va depender del tipo
de hidrocoloide y su disposición estructural.
Se observaron cambios significativos en el índice de consistencia y de flujo en
jugo de manzana ozonado en concentraciones entre 1 y 4,8 % (p/p) y tiempos de
______________________________________________________________Resultados
85
exposición de hasta 10 minutos (Tiwari y col., 2008a). El índice de consistencia y la
viscosidad aparente disminuyeron, mientras que los valores del índice de flujo
aumentaron en función del incremento de la concentración de ozono y el tiempo de
procesamiento. La disminución de la viscosidad aparente y del valor de k, y el aumento
en el valor de n, durante la ozonización surgen de una posible descomposición de la
suspensión coloidal del jugo, que puede ser causado por la despolimerización de las
macromoléculas presentes en la suspensión (Tiwari y col., 2008a).
Se sabe que la reducción de la masa molecular de los polímeros está
estrechamente relacionada con la reducción de la viscosidad de la solución de un
polímero. Estudios previos muestran que la despolimerización oxidativa del quitosano
por oxidantes como el ozono reduce significativamente la viscosidad aparente de las
soluciones tratadas con respecto a las soluciones control (sin tratamiento con ozono). La
despolimerización de una macromolécula se atribuye principalmente a la destrucción
oxidativa entre las unidades de los enlaces β-D glucósido por el ataque electrófilo en el
enlace C-H por moléculas de ozono (Seo y col., 2007). La formación de radicales libres
debido al ozono también puede contribuir a la degradación de las macromoléculas
(Tiwari y col., 2008a).
4.5 Actividad enzimática en el jugo de durazno
4.5.1 Efecto del ozono sobre la actividad enzimática de PME, POD y PPO
La velocidad de las reacciones enzimáticas depende de factores tales como el
pH, la temperatura y la concentración del sustrato, entre otros. En la presente
investigación, fueron llevados a cabo inicialmente ensayos variando cada uno de los
parámetros antes mencionados hasta determinar las condiciones óptimas para medir la
actividad de las enzimas analizadas. De este modo, se establecieron las técnicas
descriptas en Materiales y Métodos sección 3.6.
No se encontró actividad de la pectinmetilesterasa tanto en las muestras de jugo
fresco como en las sometidas a los diferentes tratamientos de ozono evaluados. El
ensayo utilizado para medir la actividad PME (Materiales y Métodos sección 3.6.3)
está basado en el cambio de color de un indicador de pH, que vira como consecuencia
de la disminución del pH del medio debido a la hidrólisis de los grupos ésteres de las
pectinas catalizada por la enzima PME. En la Figura 4-19 puede apreciarse que, tanto
______________________________________________________________Resultados
86
en las muestras control como en las tratadas con una concentración de 10 ppm, la
lectura de absorbancia durante todo el periodo de ensayo se mantuvo invariable.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100.16
0.18
0.20
0.22
t (min)
,
,
,
,
• control • 4 min • 6 min • 10 min
Abs (
620
nm)
Figura 4-19. Valores promedio de la actividad enzimática de PME en jugo de durazno tratado con una concentración de ozono de 10 ppm a distintos tiempos de exposición.
El hecho de no encontrar actividad PME apreciable en las muestras podría estar
relacionado con el procedimiento de obtención del jugo. Es sabido que la PME se
encuentra en las células vegetales mayormente unida a las paredes celulares, si bien se
ha encontrado un menor porcentaje de isoformas en forma soluble (Pelloux y col.,
2007). Por lo tanto, durante el paso de centrifugación llevado a cabo para reducir la
presencia de material particulado, gran parte de la enzima podría haber sido removida
junto con la pulpa al momento de apartar el precipitado del sobrenadante. Falguera y
col. (2011) reportaron una actividad PME despreciable en jugo de manzana, y también
atribuyeron la falta de actividad a la remoción de la enzima durante la etapa de
centrifugación a altas velocidades llevada a cabo durante la preparación del jugo.
En las Tablas 4-11 y 4-12 se muestran los valores de actividad obtenidos para
la enzima peroxidasa (POD) en los jugos tratados con una concentración de ozono de 10
ppm y 18 ppm, respectivamente. Los resultados fueron expresados en unidades de
actividad (U x mL-1), actividad específica (U x mg-1 de proteína) y actividad residual
(%). El jugo fresco (control) presentó valores promedio de actividad específica entre
266,7 U/mg proteína y 396,6 U/mg proteína, dependiendo del lote analizado.
______________________________________________________________Resultados
87
Los resultados obtenidos mostraron que la aplicación de ozono, en las
concentraciones y tiempos de tratamiento evaluados, tuvo un efecto inhibitorio sobre la
actividad de peroxidasas presentes en el jugo de durazno.
Para las muestras tratadas con una concentración de ozono de 10 ppm (Tabla 4-
11) durante un minuto, se obtuvo una reducción de la actividad específica de alrededor
de 26 %, equivalente a una actividad residual del 74 %. El jugo ozonado durante 3
minutos presentó una actividad residual de alrededor de 52,1 %. Para tratamientos más
prolongados, la actividad POD continuó reduciéndose paulatinamente, obteniéndose
luego de 12 minutos de exposición una actividad residual de 0,5 %. Por lo tanto, la
actividad enzimática de POD en el jugo de durazno, después del tratamiento con una
concentración de 10 ppm a 20 °C por un período de 12 minutos, fue reducida en un 99,5
% con respecto al control.
En los jugos tratados con una concentración de ozono de 18 ppm (Tabla 4-12),
la actividad de POD se redujo en menor tiempo y de manera más brusca. Por ejemplo,
en las muestras tratadas durante 40 segundos, la actividad específica fue reducida a
valores de más de la mitad, obteniéndose una actividad residual de 40,1 % con respecto
al control. Por otro lado, luego de la aplicación de 12 minutos de tratamiento se observó
una inhibición completa de la actividad.
Tabla 4-11. Valores promedio de actividad enzimática (U/mL), actividad específica (U/mg), actividad residual y sus correspondientes desviaciones estándar de la enzima POD presente en jugo de durazno tratado con una concentración de ozono de 10 ppm a diferentes tiempos.
Tratamiento (min)
Actividad (U/mL extracto)
Actividad específica
(U/mg proteína)
Actividad residual (%)
0 128,76 ± 8,53 266,67 ± 29,35 100,0 ± 0 1 125,53 ± 3,44 197,44 ± 6,24 74,0 ± 2,3 2 124,05 ± 5,20 179,66 ± 12,19 67,4 ± 4,6 3 55,96 ± 0,46 139,00 ± 19,69 52,1 ± 7,4 4 51,49 ± 5,07 87,95 ± 8,10 33,0 ± 3,0 5 25,55 ± 1,26 50,60 ± 4,48 19,0 ± 1,7 6 13,20 ± 0,08 27,60 ± 3,61 10,4 ± 1,4 8 8,94 ± 4,30 16,04 ± 7,89 6,0 ± 3,0 10 3,38 ± 0,37 6,15 ± 2,44 2,3 ± 0,9 12 1,05 ± 1,00 1,35 ± 1,14 0,5 ± 0,4
______________________________________________________________Resultados
88
Tabla 4-12. Valores promedio de actividad enzimática (U/mL), actividad específica (U/mg proteína), actividad residual y sus correspondientes desviaciones estándar de la enzima POD presente en jugo de durazno tratado con una concentración de ozono de 18 ppm a diferentes tiempos.
Tratamiento (min)
Actividad (U/mL extracto)
Actividad específica (U/mg proteína)
Actividad residual (%)
0 61,37 ± 2,08 396,62 ± 3,53 100,0 ± 0 0,33 42,76 ± 1,26 290,91 ± 34,98 73,3 ± 8,8 0,66 30,46 ± 2,42 159,19 ± 16,64 40,1 ± 4,2
1 17,45 ± 0,86 80,77 ± 7,96 20,4 ± 2,0 2 6,22 ± 0,76 32,60 ± 4,64 8,2 ± 1,2 3 3,66 ± 0,99 21,63 ± 6,09 5,5 ± 1,5 5 1,04 ± 1,02 5,31 ± 5,65 1,3 ± 1,4 7 0,44 ± 0,14 2,92 ± 0,64 0,7 ± 0,2 10 0,35 ± 0,31 3,23 ± 2,84 0,8 ± 0,7 12 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,0 ± 0,0
En las Tablas 4-13 y 4-14 se presentan los resultados obtenidos en las
determinaciones de actividad de la polifenoloxidasa (PPO) presente en el jugo de
durazno tratado, a distintos tiempos con una concentración de ozono de 10 ppm y 18
ppm, respectivamente. La actividad específica promedio de la enzima PPO en el jugo de
durazno no tratado fue de 110,8 U/mg y 216 U/mg, dependiendo del lote analizado. En
todas las muestras tratadas, la aplicación de ozono produjo una reducción de la actividad
PPO.
Al comparar las actividades residuales de PPO obtenidas en función de la
concentración de ozono, al igual que lo observado para la enzima POD, para iguales
tiempos de exposición la inactivación de la enzima fue más pronunciada cuando se
aplicó la concentración de ozono mayor. Por ejemplo, en las muestras expuestas a una
concentración de 10 ppm, se obtuvo una actividad remante del 78 % luego de un minuto
de tratamiento, mientras que en las muestras ozonadas con una concentración de 18
ppm, la actividad residual fue del 50 %. Por otro lado, la máxima reducción alcanzada
luego de 12 minutos de ozonización fue de 93,9 % en el caso de las muestras tratadas
con 10 ppm de ozono, y de 97,3 %, para las tratadas con 18 ppm.
______________________________________________________________Resultados
89
Tabla 4-13. Valores promedio de actividad enzimática (U/mL), actividad específica (U/mg proteína), actividad residual y sus correspondientes desviaciones estándar de la enzima PPO presente en jugo de durazno tratado con una concentración de ozono de 10 ppm a diferentes tiempos.
Tratamiento (min)
Actividad (U/mL
extracto)
Actividad específica
(U/mg proteína)
Actividad residual (%)
0 53,34 ± 1,84 110,77 ± 14,66 100,0 ± 0 1 54,97 ± 3,40 86,49 ± 6,15 78,1 ± 5,5 2 55,49 ± 4,43 80,33 ± 7,03 72,5 ± 6,4 3 32,39 ± 1,47 80,16 ± 8,21 72,4 ± 7,4 4 34,16 ± 4,34 59,05 ± 12,58 53,3 ± 11,4 5 24,23 ± 2,96 47,75 ± 3,32 43,1 ± 3,0 6 9,36 ± 3,24 19,79 ± 8,47 17,9 ± 7,6 8 5,16 ± 3,68 9,33 ± 6,62 8,4 ± 6,0 10 4,35 ± 3,00 7,75 ± 5,52 7,0 ± 5,0 12 4,35 ± 5,24 4,94 ± 6,98 6,1 ± 4,0
Tabla 4-14. Valores promedio de actividad enzimática (U/mL), actividad específica (U/mg proteína), actividad residual y sus correspondientes desviaciones estándar de la enzima PPO presente en jugo de durazno tratado con una concentración de ozono de 18 ppm a diferentes tiempos.
Tratamiento (min)
Actividad (U/mL
extracto)
Actividad específica
(U/mg proteína)
Actividad residual (%)
0 33,43 ± 1,37 216,04 ± 3,51 100,0 ± 0 0,33 21,68 ± 1,64 147,41 ± 19,98 68,2 ± 9,2 0,66 21,26 ± 0,84 111,30 ± 11,78 51,5 ± 5,5
1 23,31 ± 2,12 108,40 ± 19,05 50,2 ± 8,8 2 10,76 ± 2,27 55,49 ± 3,79 25,7 ± 1,8 3 8,10 ± 1,43 47,81 ± 9,29 22,1 ± 4,3 5 4,40 ± 0,72 21,10 ± 2,65 9,8 ± 1,2 7 1,34 ± 0,95 10,03 ± 8,57 4,6 ± 3,5 10 1,16 ± 0,93 9,49 ± 7,09 4,4 ± 3,3 12 0,73 ± 0,87 7,42 ± 3,68 2,7 ± 1,7
______________________________________________________________Resultados
90
4.5.2 Modelado de las curvas de inactivación de las enzimas POD y PPO
Las curvas de inactivación, tanto de POD como PPO, obtenidas por el efecto del
ozono fueron no lineales. Tal como se mencionó en Materiales y Métodos sección
3.6.5, las curvas de inactivación fueron modeladas mediante tres modelos matemáticos.
En la Figura 4-20 se observan los valores experimentales y el modelado de las
curvas de POD usando el modelo de primer orden (a), conversión fraccionada (b) y
Weibull (c). La Tabla 4-15 muestra los parámetros característicos de cada modelo.
El modelo de primer orden fue apropiado para el ajuste de las curvas de
inactivación para ambas concentraciones (Figura 4-20 a), obteniéndose R2 de 0,97 y
0,98 (10 y 18 ppm de ozono, respectivamente). La constante de velocidad de
inactivación (k) de la enzima POD mostró dependencia con respecto a la concentración
de ozono, siendo mayor cuando aumentó la concentración (Tabla 4-15). Puesto que el
efecto inhibitorio de la enzima POD con una concentración de 18 ppm fue superior en
periodos de exposición menores (tal como se explicó en párrafos anteriores), fue lógico
el comportamiento del parámetro k.
El modelo de conversión fraccionada como se mencionó en Materiales y
Métodos sección 3.6.5, es un caso especial de la cinética de primer orden y es aplicado
cuando una fracción de la enzima no se destruye (A∞) después de la exposición a
tratamientos prolongados. Las curvas experimentales, también mostraron un buen ajuste
(Figura 4-20 b). El R2 presentó valores de 0,97 y 0,98 para la concentración de 10 y 18
ppm, respectivamente. En la Tabla 4-15 se puede observar los valores de A∞ y k
obtenidos para los tratamientos de ozono analizados. Para la concentración de 10 ppm,
los valores de k de esté modelo son iguales a los valores obtenidos con el ajuste de
primer orden, esto es lógico puesto que la ecuación del modelo de conversión fraccional
es idéntica a la ecuación primer orden cuando A∞= 0. El valor de k para la concentración
de 18 ppm, presentó una mínima diferencia con respecto al valor de k obtenido
mediante el ajuste de la cinética de primer ya que A∞ ≠ 0, lo que indicaría que después
de un tiempo prolongado de tratamiento sobreviviría una leve fracción de enzimas que
no fueron inactivadas.
______________________________________________________________Resultados
91
a)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
t (min)
,
,
,
,
,
,
Act.R
esid
ual P
OD
⎯ 10 ppm⎯ 18 ppm
b)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
t (min)
,
,
,
,
,
,
Act.R
esid
ual P
OD
⎯ 10 ppm⎯ 18 ppm
c)
0.0 0.2 0.40.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12t (min)
,
,
,
,
,
,, ,,
Act.R
esid
ual P
OD
⎯ 10 ppm⎯ 18 ppm
Figura 4-20. Valores promedio obtenidos para la actividad residual de POD en jugo de durazno fresco y tratado con una concentración de ozono de 10 ppm (●) y 18 ppm (■). a) modelo de primer orden, b) modelo de conversión fraccional y c) modelo de Weibull.
______________________________________________________________Resultados
92
Tabla 4-15. Parámetros del modelado de las curvas de inactivación de POD en jugo de durazno con concentraciones de ozono de 10 ppm y 18 ppm, usando los modelos de primer orden (PO), conversión fraccional (CF) y Weibull (W).
Concentración (ppm)
Primer Orden
Conversión fraccionada
Weibull
k (min-1) A∞ (-) k (min-1) α (min) β (-) 10
0,29 (0,03)
0,00 (0,00) 0,29 (0,03)
3,63 (0,16) 1,33 (0,13)
18 1,35 (0,10) 0,01 (0,00) 1,38 (0,01) 0,74 (0,03) 1,34 (0,13) Valores entre ( ) representan la desviación estándar
La Tabla 4-15 (Weibull) muestra los valores de los parámetros de escala (α) y
de forma (β) obtenidos al aplicar el modelo de Weibull a los datos experimentales de la
enzima POD. El ajuste resultó mejor que en los dos modelos anteriores, obteniéndose
R2 de 0,98 y 0,99 (10 ppm y 18 ppm de ozono, respectivamente).
Para ambas concentraciones β resultó mayor a 1, indicando que las curvas
exhibieron una concavidad hacia abajo (Figura 4-20 c). Además, los valores de β > 1
indican que el remanente de enzimas no inactivadas en los tratamientos aplicados puede
volverse sensible en periodos más largos de tiempo (van–Boekel, 2002). El parámetro β
no demostró dependencia con la concentración de ozono puesto que el valor permaneció
constante. En cambio, los valores de α disminuyeron con el aumento de la
concentración de ozono.
Para lograr una mejor explicación sobre el efecto del ozono en la inactivación
enzimática de POD, los parámetros α y β fueron usados para graficar las curvas de
distribución de frecuencia de resistencia (Figura 4-21) y calcular los parámetros
estadísticos asociados a este modelo (moda (tcm), media (tc), varianza (σ2tc) y coeficiente
de asimetría (υ1)) (Tabla 4-16).
______________________________________________________________Resultados
93
a)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
t (min)
,
,
,
,
,
,
Frec
uenc
ia (1
/min
)
b)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
t (min)
,
,
,
,
,
,
,
Frec
uenc
ia (1
/min
)
Figura 4-21. Distribución de frecuencia de resistencias correspondiente a las curvas de
inactivación de la enzima POD para una concentración de a) 10 ppm (●), b) 18 ppm (●).
______________________________________________________________Resultados
94
Tabla 4-16. Parámetros estadísticos del modelo de Weibull correspondientes a las
curvas de inactivación de POD en jugo de durazno con concentraciones de ozono de 10
ppm y 18 ppm.
Las distribuciones para ambas concentraciones mostraron formas asimétricas y
sesgadas a la derecha. Como se muestra en la Figura 4-21, el tiempo en el que la mayor
parte de la enzima fue inactivada (moda) para una concentración de 10 ppm fue bajo;
cuando la concentración de ozono aumentó a 18 ppm dicho valor fue aún más pequeño
(tiempo de inactivación desplazado más a la izquierda), mostrando de esta forma la
sensibilidad de las enzimas al tratamiento con mayor concentración. De igual forma el
tiempo promedio (tc) de inactivación para la enzima POD fue menor cuando se utilizó la
concentración más alta. Como se puede observar en la Tabla 4-16, la varianza
disminuyó para la concentración de ozono más alta (18 ppm), indicando que la
respuesta de la población de enzimas fue más homogénea. Los patrones de frecuencia
obtenidos en la Figura 4-21 evidencian que la mayoría de enzimas fueron inactivadas
en tiempos cortos de exposición al ozono permaneciendo una fracción pequeña de las
mismas activa después del tratamiento, especialmente para la concentración de 10 ppm.
A pesar de haber mencionado en párrafos anteriores el valor R2 este no fue el
único criterio de evaluación propuesto para analizar la bondad del ajuste de los modelos
y la comparación entre ellos. Los criterios estadísticos establecidos tal como se
menciona en Materiales y Métodos sección 3.6.5 fueron el RMSE, AIC y el BIC, los
que se muestran en la Tabla 4-17.
Los altos valores de R2 (rango de 0,97 a 0,99) y los bajos valores para el RMSE,
AIC y BIC obtenidos para los tres modelos estudiados, dan cuenta de un buen ajuste en
todos los casos. Si comparamos los tres modelos, el modelo que evidenció valores más
altos de R2 y más bajos de RMSE, AIC y BIC fue el modelo de Weibull (W).
En la Figura 4-22 se observa las curvas experimentales de inactivación de la
enzima PPO ajustadas a los diferentes modelos. Los valores de los parámetros obtenidos
del ajuste se muestran en la Tabla 4-18.
Concentración (ppm)
tcm (min)
tc
(min) σ2
tc (min2)
υ1 (-)
10 1,24 3,34 6,53 1,68 18 0,26 0,68 0,26 1,66
______________________________________________________________Resultados
95
a)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
t (min)
,
,
,
,
,
,
⎯ 10 ppm⎯ 18 ppm
Act.R
esid
ual P
PO
b)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
t (min)
,
,
,
,
,
,
Act
.Res
idua
l PP
O
⎯ 10 ppm⎯ 18 ppm
c)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
t (min)
,
,
,
,
,
,
Act
.Res
idua
l PP
O
⎯ 10 ppm⎯ 18 ppm
Figura 4-22. Valores promedio obtenidos para la actividad residual de PPO en jugo de durazno fresco y tratado con concentraciones de ozono de 10 ppm (●) y 18 ppm (■). Las curvas fueron ajustadas (líneas sólidas) a los modelos matemáticos de: a) primer orden, b) conversión fraccional y c) Weibull.
______________________________________________________________Resultados
96
Tabla 4-17. Valores de RMSE, AIC y BIC correspondientes a la cinética de inactivación para la enzima POD en jugo de durazno ajustada por diferentes modelos: primer orden (PO), conversión fraccional (CF) y Weibull (W), para concentraciones de ozono de 10 ppm y 18 ppm.
Concentración (ppm)
RMSE AIC BIC
PO CF W PO CF W PO CF W
10 0,004 0,003 0,002 -23,25 -24,68 -29,72 -22,33 -23,47 -28,81 18 0,002 0,002 0,001 -32,78 -31,16 -37,95 -31,87 -29,95 -37,04
El ajuste de las curvas de inactivación de la enzima PPO con el modelo de
primer orden fue relativamente bueno; los valores de R2 fueron de 0,92 y 0,96 para la
concentración de 10 ppm y 18 ppm, respectivamente (Figura 4-22 a). El valor de k, de
igual forma que lo observado para la enzima POD, fue mayor en las muestras tratadas
con una concentración de 18 ppm, indicando un aumento en la velocidad de
inactivación al incrementarse la concentración de ozono.
El modelo de conversión fraccional también presentó buen ajuste (R2: 0,94 y
0,97 para 10 y 18 ppm, respectivamente) (Figura 4-22 b). Los valores obtenidos del
parámetro de k no difieren mayormente a los alcanzados con el modelo de primer orden.
Para la concentración de 10 ppm, los valores fueron iguales, ya que A∞ = 0, mientras
que para la concentración de 18 ppm se evidenció una mínima diferencia puesto que A∞
≠ 0. Este valor de A∞ indicaría que existe una mínima fracción de actividad enzimática
que no fue desactivada en periodos prolongados de tratamiento.
La Tabla 4-18 muestra los valores de los parámetros de α y β del modelo de
Weibull. Con este modelo se evidenció un mejor ajuste; los valores para R2 obtenidos
fueron 0,95 (para 10 ppm) y 0,99 (para 18 ppm). El valor de β resultó mayor a 1 para la
concentración de 10 ppm y menor a 1 para la concentración de 18 ppm, indicando una
concavidad hacia abajo y hacia arriba, respectivamente (Figura 4-22 c). Para la primera
concentración (10 ppm), el valor de β > 1 indicaría que el remanente de enzimas no
inactivadas en este tratamiento podría volverse sensible en periodos más largos de
tiempo y de esta forma inactivarse completamente, mientras que el valor de β < 1 para
la segunda concentración (18 ppm) indica que la fracción de enzimas no inactivadas
podrían adaptarse al tratamiento durante largos periodos del mismo (Van-Boekel, 2002).
Los parámetros β y α fueron dependientes de la concentración de ozono.
______________________________________________________________Resultados
97
Tabla 4-18. Parámetros del modelado de las curvas de inactivación de PPO en jugo de durazno con concentraciones de ozono de 10 ppm y 18 ppm, usando los modelos de primer orden (PO), conversión fraccional (CF) y Weibull (W).
Concentración (ppm)
Primer Orden
Conversión fraccionada
Weibull
k (min-1)
A∞ (-) k (min-1) α (min) β (-)
10 0,21 (0,03) 0,00 (0,00) 0,22 (0,04) 5,02 (0,32) 1,50 (0,22) 18 0,62 (0,08) 0,06 (0,02) 0,78 (0,11) 1,44 (0,07) 0,65 (0,04)
Valores entre ( ) representan la desviación estándar.
Los parámetros α y β fueron usados para graficar las curvas de distribución de
frecuencia de resistencias (Figura 4-23) y para calcular los parámetros estadísticos
asociados al modelo (Tabla 4-19).
La distribución de frecuencia correspondiente a la concentración de 10 ppm se
mostró sesgada a la derecha, indicando que la mayoría de enzimas fue inactivada en
tiempos bajos (moda: 2,38 min y media: 4,54 min). En cambio, la distribución de
frecuencia correspondiente a la concentración de 18 ppm fue muy sesgada a la derecha
y no exhibió moda; este patrón de distribución evidenció que la mayoría de las enzimas
fue inactivada en un tiempo mucho más corto comparado a la respuesta que presentó la
concentración más baja. La varianza de ambas concentraciones de ozono fue similar,
indicando que la mayor concentración de ozono no logró homogeneizar la respuesta de
la población de PPO como se observó para la POD (Tabla 4-19).
La Tabla 4-20 muestra los valores de RMSE, AIC y BIC correspondiente a los
diferentes modelos analizados para describir las cinéticas de inactivación de PPO. Los
valores de R2 para los tres tipos de modelos matemáticos propuestos estuvieron en un
rango de 0,92 y 0,99. Los valores de RMSE, AIC y BIC indicaron un buen ajuste para
todos los modelos, sin embargo el mejor ajuste se obtuvo con el modelo Weibull.
______________________________________________________________Resultados
98
a)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
,
,
,
t (min)
,
,
,
Frec
uenc
ia (1
/min
)
b)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
t (min)
,
,
,
,
,
,
Frec
uenc
ia (1
/min
)
Figura 4-23. Distribución de frecuencia de resistencias correspondiente a las curvas de inactivación de la enzima PPO para una concentración de a) 10 ppm (●) y b) 18 ppm (●).
______________________________________________________________Resultados
99
Tabla 4-19. Parámetros estadísticos del modelo de Weibull correspondientes a las
curvas de inactivación de POD en jugo de durazno con concentraciones de 10 ppm y 18
ppm.
Concentración (ppm)
tcm (min)
tc (min)
σ2tc
(min2)
υ1 (-)
10 2,38 4,54 9,60 1,55 18 - 1,98 10,01 3,73
Tabla 4-20. Valores de RMSE, AIC y BIC correspondientes a la cinética de inactivación para la enzima PPO en jugo de durazno ajustada por diferentes modelos: primer orden (PO), conversión fraccional (CF) y Weibull (W), para concentraciones de ozono de 10 ppm y 18 ppm.
Numerosos autores han reportaron el modelado de cinéticas de inactivación de
POD, PPO y PME con ecuaciones de primer orden (Pankaj y col., 2013; Sampedro y
col., 2007; Van den Broeck y col., 2000). Varios autores han utilizado el modelo de
primer orden y de conversión fraccional para describir la cinética de inactivación de
PPO en zanahoria, durazno y pera (Zhang y col., 2010; Zhao y col, .2010). El modelo de
Weibull ha sido especialmente empleado para describir la cinética de destrucción de
microorganismos; sin embargo, ha sido utilizado también para modelar las curvas de
inactivación de enzimas utilizando tecnologías no térmicas. Elez-Martínez y col. (2006)
y Quintão- Teixeira y col. (2013) han utilizado este modelo para caracterizar la cinética
de inactivación de POD en jugo de zanahoria y naranja (respectivamente) utilizando
tratamientos de pulsos eléctricos. Pankaj y col. (2013), del mismo modo, utilizaron este
modelo para describir la inactivación de la POD en jugo de tomate tratado con
tecnología de plasma atmosférico frío. Giner y col. (2005) utilizaron el modelo de
Weibull para describir la cinética de inactivación de PME de una solución comercial de
esta enzima.
Hasta nuestro conocimiento no se han reportado en la bibliografía estudios en
donde se analice la influencia del ozono sobre la actividad de enzimas presentes en
Concentración ( ppm )
RMSE AIC BIC PO CF W PO CF W PO CF W
10 0,010 0,011 0,006 -14,42 -12,41 -19,41 -13,51 -11,22 -18,51
18 0,004 0,003 0,001 -22,91 -25,41 -42,59 -22,00 -24,19 -41,68
______________________________________________________________Resultados
100
jugos frutales. En frutos enteros se han llevado a cabo investigaciones en donde el
tratamiento con ozono ha sido reportado como efectivo en la reducción de POD y PPO.
El ozono posee un alto poder oxidante, lo cual podría ser la razón por la que las
muestras ozonadas disminuyan su actividad enzimática (Rico y col., 2006).
Yang y col. (2006) observaron en duraznos almacenados a bajas temperaturas
en una atmosfera con 8 ppm de ozono gaseoso, una inhibición significativa de la
actividad enzimática de POD y PPO. Rico y col (2006) reportaron una disminución
significativa en la actividad de PPO y POD en lechugas frescas tratadas con agua
ozonada (1 ppm) u agua ozonada con lactato de calcio (1 ppm y 15 ppm,
respectivamente) durante 1 minuto y almacenadas (3 a 10 días). Zhang y col (2004)
observaron resultados similares en apio fresco cortado; las muestras tratadas con agua
ozonada en 3 concentraciones diferentes (0,03, 0,08, 0,18 ppm) y sumergidas durante 5
minutos, disminuyeron significativamente la actividad de la PPO con respecto al
control. También señalaron que la efectividad de la inhibición de la actividad de PPO en
apio fresco cortado aumentaba conforme aumentaba la concentración de ozono en el
agua.
5. CONCLUSIONES
____________________________________________________________Conclusiones
102
5. Conclusiones
• Los tratamientos de ozono gaseoso aplicados a la matriz de jugo de durazno no
afectaron de manera relevante el pH, °Brix y acidez titulable del jugo.
• No se observaron cambios importantes en el índice de pardeamiento no
enzimático en las concentraciones de ozono y tiempos de exposición evaluados
en este trabajo.
Dependiendo de la concentración de ozono analizada y del grado de
pardeamiento inicial del jugo, los valores de PNE tendieron a reducirse o
aumentar levemente en función del tiempo de exposición al ozono.
• La aplicación de ozono provocó modificaciones en el color de jugo de durazno.
En general, el jugo ozonado con una concentración de 10 ppm presentó una
decoloración al incrementarse el tiempo de tratamiento, la cual fue relacionada
con una disminución del pardeamiento y degradación de pigmentos orgánicos
debido al alto poder oxidante del ozono. Contrariamente, el jugo tratado con una
concentración de 18 ppm presentó un ligero aumento del pardeamiento. Dichas
diferencias podrían atribuirse a que se partió de un jugo fresco con diferente
nivel de pardeamiento.
• La viscosidad aparente del jugo de durazno se vio afectada por los tratamientos
de ozono gaseoso. Las muestras ozonadas presentaron una reducción en la
viscosidad aparente con el aumento del tiempo de exposición, tendiendo a
presentar un comportamiento newtoniano (aumento de los valores del índice de
comportamiento de flujo) en los tiempos de tratamiento más altos. Dicho
comportamiento de las muestras puede deberse a la posible despolimerización de
las macromoléculas presentes en la suspensión coloidal del jugo, causado por el
efecto oxidativo del ozono.
• Los tratamientos con ozono redujeron la actividad de las enzimas presentes en el
jugo de durazno. El grado de inactivación, tanto para la enzima POD como PPO,
dependió marcadamente de la concentración de ozono y del tiempo de
exposición, observándose mayores tasas de inactivación para la concentración de
____________________________________________________________Conclusiones
103
ozono más alta. La enzima PME no presentó actividad enzimática ni en la
muestra control, ni en las muestras tratadas con ozono.
• Los modelados matemáticos propuestos para evaluar la cinética de inactivación
de las enzimas POD y PPO evidenciaron un buen ajuste en todos los casos. Sin
embargo, según los criterios de bondad de ajuste empleados en esta
investigación, el modelo que mejor describió el comportamiento de inactivación
enzimática para ambas enzimas fue el modelo Weibull. Es importante destacar
que tanto el modelo de primer orden como el modelo de Weibull aportan
informaciones complementarias y son una herramienta útil para entender el
comportamiento de las enzimas frente al ozono.
• Para poder seleccionar una dosis óptima de ozono gaseoso en jugo de durazno
que permita lograr la estabilidad microbiana y la inactivación de enzimas
deteriorativas sin producir un gran deterioro en la calidad, se deberían completar
los estudios analizando otros aspectos, como el efecto de la dosis sobre la
calidad nutritiva y sensorial. Dicho conocimiento permitiría un mejor diseño de
las tecnologías combinadas de conservación, donde se utilicen otros factores de
estrés microbiano para incrementar la estabilidad microbiológica con miras a la
obtención de jugos de vida útil moderada o bien para obtener jugos con menor
vida útil que se destaquen por su calidad de fresco. Esto también resalta la
importancia de hacer estudios en función de la dosis para poder establecer con
exactitud la destrucción en los factores de calidad y en los microorganismos.
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