universidad de chile · 2009-04-07 · rodrigo alejandro morales vera profesor guía: ing....
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UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES
ESCUELA DE CIENCIAS FORESTALES
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA DE LA MADERA
MEDIOS DE CULTIVO LIQUIDOS PARA EL DESARROLLO DE
INOCULOS DE HONGOS DE PUDRICION BLANCA APLICABLES EN BIOPULPAJE KRAFT
Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero en Maderas
RODRIGO ALEJANDRO MORALES VERA
Profesor Guía: Ing. Forestal, Dr., Sr. Ricardo Silva Soto
SANTIAGO - CHILE 2006
UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES
ESCUELA DE CIENCIAS FORESTALES
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA DE LA MADERA
MEDIOS DE CULTIVO LIQUIDOS PARA EL DESARROLLO DE INOCULOS DE HONGOS DE PUDRICION BLANCA APLICABLES
EN BIOPULPAJE KRAFT
Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero en Maderas
RODRIGO ALEJANDRO MORALES VERA
Calificaciones: Nota Firma Prof. Guía Sr. Ricardo Silva S. 6,9 .................................... Prof. Consejero Sr. Javier González M. 7,0 ................................... Prof. Consejero Sr. René Carmona C. 6,7 ....................................
SANTIAGO - CHILE 2006
AGRADECIMIENTOS En este capitulo me gustaría dar las gracias en forma muy sincera y afectuosa a mis
padres, que durante toda mi vida me han entregado todo lo necesario, tanto el sustento
económico, pero lo mas importante, su apoyo e incondicional amor que me han dado a lo
largo de mi vida, GRACIAS GLORIA Y TOÑO LOS QUIERO MUCHO !!!!!!!!
Por otro lado, no puedo dejar de mencionar a mi queridísimo hermano SERGIO, que
siempre ha estado a mi lado en todos los procesos importantes de mi vida, y con sus
conversaciones energéticas y astrales me han ayudado a tener claro mi camino, además
gracias por tu apoyo como traductor, el cual se hace presente en el summary de esta
memoria, a ti SERGIO gracias !!!
Al gran y estimado profesor RICARDO SILVA, excelente académico, gran persona, el cual
siempre estuvo cuando necesite su ayuda, muy motivador y cercano con sus alumnos,
pero no por ello dejando de lado su alto grado de exigencia con sus alumnos, lo cual
siempre ha demostrado en todas sus evaluaciones, RICARDO siga así, puesto que ayuda
a obtener lo mejor de cada uno de sus alumnos.
Al Sr. JAVIER GONZALÉZ, gran profesor y excelente académico, con el cual conté
siempre que lo necesité, por todos los momentos compartidos con él, manteniendo
siempre su gran sencillez y gran altura de miras, mucha suerte en su nuevo cargo y
muchas gracias por todo.
A todos los profesores que con su ayuda pude culminar este trabajo, en especial al Sr.
RENÉ CARMONA por cumplir con los plazos acordados en la corrección de esta
memoria, al Sr. ALEJANDRO BOZO gran profesor siempre dispuesto ha ayudar, y a
todos los profesores del Dpto. de Ingeniería de la Madera: Misael Gutiérrez, Tomás
Karsulovic, Aldo Cisternas, Rose Marie Garay, etc.
Al mejor de todos los técnicos de laboratorio a Don LUIS FRIAS, gran compañero de
trabajo y excelente persona, siempre está ahí para una buena conversación, consejo, etc.
No cambies nunca LUCHITO muchas gracias por todo!!!!
A todos mis compañeros de ANTUMAPU, sigan disfrutando de la vida y de las ventajas de
estar en este gran ANTUMAPU querido.
A todas las secretarias de la facultad MARIELA, PANCHITA, gracias por ayudarnos con
los trámites engorrosos de la burocracia de la U. de CHILE, y a ti GIANINA gracias por tu
ayuda en la realización de extensión de la facultad, siempre cuenta conmigo.
Y por supuesto a mi queridísima guachita más linda…..SOLE, siempre he sentido tu
apoyo en todo este largo proceso de titulación, sigamos disfrutando de esta vida que
contigo es mucho más bella y espero que nos vayamos juntitos a donde realmente
queremos estar, ya falta poquito…I LOVE YOU.
Gracias a impresiones ABACO S.A., los cuales me realizaron todo el trabajo de impresión
de esta memoria.
A la Energía Suprema o más conocida como DIOS, gracias por darme todas las
oportunidades que se me han abierto a lo largo de la vida.
A todos los nombrados y a los que por algún motivo no se encuentran en los párrafos
anteriores GRACIAS !!!
RODRIGO MORALES VERA
RESUMEN
El presente trabajo, el cual fue desarrollado en el Departamento de Ingeniería de la
Madera de la Facultad de Ciencias Forestales de la Universidad de Chile, está inserto
dentro del marco del proyecto FONDEF DO2I – 1086: Factibilidad de biopulpaje Kraft
aplicado a especies del género Eucalyptus.
Esta memoria de título consistió en el estudio de dos tipos de medios de cultivo líquidos,
con el fin de ser utilizados en biopulpaje Kraft. El constituyente básico de estos medios fue
extraíbles de Eucalyptus globulus; diferenciándose uno de otro por la incorporación de
nutrientes adicionales N-P-K.
Estos medios de cultivo se evaluaron mediante la viabilidad de ellos para el desarrollo de
inóculos de dos hongos de pudrición blanca (167 y 140) a través de pruebas
microscópicas. Además se cuantificó la pérdida de peso de material leñoso, producida por
estos inóculos en “pin chips” de Eucalyptus globulus en dos tiempos de exposición, 30 y
45 días. También se midió el crecimiento radial miceliar de estos inóculos en un medio
estacionario agar-malta, y finalmente se determinó el potencial enzimático oxidativo que
poseían estos inóculos mediante una prueba en medios estacionarios, denominados
ácido gálico.
Los resultados obtenidos indican que ambos medios de cultivo líquidos propuestos, son
viables para el desarrollo de las cepas 167 y 140, sin embargo, el medio de cultivo sin
nutrientes adicionales resultaría el más conveniente para su aplicación en el campo del
biopulpaje por ser más económico.
La mayor pérdida de peso de material leñoso (13,36%) se logró con el hongo 140
cultivado sobre un medio con nutrientes adicionales, sin embargo, el hongo 167 logró un
crecimiento radial mayor que el presentado por la cepa 140, y además posee un potencial
enzimático mayor que el obtenido por el hongo 140; lo cual sería un indicio que el sistema
enzimático del hongo 140 es menos selectivo sobre la lignina que el del hongo 167.
Esta investigación permitió obtener antecedentes relevantes respecto a los medios de
cultivo líquidos utilizados, los cuales fueron una efectiva fuente energética para el
desarrollo de las dos cepas estudiadas (167 y 140). Estos hongos mostraron, además,
una efectiva pérdida de peso de material leñoso, crecimiento radial de micelio y capacidad
enzimática, por lo cual son factibles de utilizar en el proceso de biopulpaje Kraft.
PALABRAS CLAVES
Medios de cultivo
Pudrición blanca
Sistemas enzimáticos
Biopulpaje
Biotecnología
SUMMARY
This research, which was made at the Wood Engineering Department of the Forest
Sciences Faculty of the University of Chile, is part of the FONDEF DO21 – 1086 project’s
frame: Factibility of Kraft biopulping, applied to species of the Eucalyptus genre.
This investigation consisted on the study of two types of liquid culture media, in order to be
used in Kraft biopulping; the main basis of these culture media was extractives from
Eucalyptus globulus; the difference between one culture medium and another was the
incorporation of additional nutrients N-P-K.
These culture media were evaluated through their own viability for the inoculs
development, from two white rot fungi (167 and 140), by means of microscopy tests.
Furthermore, the weight loss of wood material in pin chips of Eucalyptus globules,
obtained by these inoculs, was quantified in two exposure times (30 and 45 days). The
radial growth of these inoculs was also measured in agar malt stationary medium, and
finally, the enzymatic oxidative potential that these inoculs had was obtained by means of
a test in a stationary medium called galic acid.
The obtained results indicated that both of the proposed liquid culture media are viable for
the development of the fungi 167 and 140; however, the culture medium, without additional
nutrients, results more convenient for it application in biopulping due to it has a low
elaboration cost.
The highest weight loss of wood material (13,36%) was obtained with the fungus 140
coming from a medium with additional nutrients; however, the fungus 167 obtained a radial
growth higher than the one shown by the fungus 140, and also has an enzymatic potential
higher than the one obtained by the fungus 140, which could indicate that the enzymatic
system of the fungus 140 is less selective on the lignin than the one of the fungus 167.
Through this research, it was possible to obtain relevant antecedents with regard to the
liquid culture media, which were an effective energetic source for the development of the
two used fungi (167 and 140) which subsequently showed an effective weight loss of wood
material, radial growth and enzymatic capacity, with the aim of being used in the Kraft
biopulping process.
KEY WORDS Culture media
White rot fungi
Enzimatic system
Biopulping
Biotechnology
INDICE 1 INTRODUCCION 1
2 REVISIÓN BIBLIOGRAFICA 3
2.1. Pudrición blanca 3
2.1.1. Hongos participantes 3
2.1.2. Sistemas enzimáticos 5
2.2. Medios de cultivo 8
2.2.1 Generalidades respecto a la composición de los medios de cultivo 8
2.2.2 Condiciones físico-químicas de los medios de cultivo 9 2.2.3 Principales tipos de medios de cultivo 10
2.2.3.1 Medios de cultivo según el sustrato 10
• Medios sólidos 10
• Medios semisólidos 10
• Medios líquidos 10
2.2.3.2 Medios de cultivo según su utilización 11
• Medios para aislamiento 11
• Medios para crecimiento 11
• Medios de identificación 11
• Medios de mantenimiento de cepas 12
2.2.3.3 Medios de cultivo según su composición 12
• Medios naturales 12
• Medios semi-sintéticos 12
• Medios sintéticos 12
• Medios complejos 12
2.2.3.4 Medios de cultivo según su presentación 13
• Medios deshidratados 13
• Medios ya preparados 13
• Medios sólidos en placas Petri 13
• Medios sólidos en tubo 13
• Medios líquidos en tubo 13
2.2.4 Efecto de algunas sustancias sobre la actividad enzimática ligninolítica 14
de los HPB
2.3 Pulpaje y biopulpaje 19
2.3.1 Pulpaje convencional 19
2.3.2 Biopulpaje 21
2.4 Eucalyptus globulus 25
2.4.1 Generalidades 25
2.4.2 Extraíbles en Eucalyptus globulus 26
3 MATERIALES Y MÉTODOS 28
3.1 Materiales 29
3.2 Métodos 30
3.2.1 Diseño experimental 30
3.2.1.1 Factibilidad de medios de cultivo líquidos 30
3.2.1.2 Pérdida de peso de material leñoso 31
3.2.1.3 Crecimiento radial del micelio 33
3.2.1.4 Capacidad enzimática 34
3.2.2 Metodología de laboratorio 35
3.2.2.1 Preparación del medio de cultivo inicial 35
3.2.2.2 Preparación de medios de cultivo líquidos 36
3.2.2.3 Evaluación de la viabilidad de los medios de cultivo formulados 37
3.2.2.4 Medición de variables respuesta 38
• Pérdida de peso de material leñoso 38
• Crecimiento radial del micelio 39
• Capacidad enzimática 41
4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 43
4.1 Evaluación de la viabilidad del cultivo líquido 44
4.2 Pérdida de peso de material leñoso 45
4.3 Crecimiento radial de micelio 51
4.4 Capacidad enzimática 55
5 CONCLUSIONES 59
6 BIBLIOGRAFÍA 60
7 APÉNDICES 68
1 INTRODUCCION
Hoy en día, el desarrollo de la actividad industrial requiere no sólo la optimización de
factores productivos y económicos, sino también la disminución de la contaminación
ambiental asociada a los procesos de producción. Prueba de ello es la existencia de
normas específicas al respecto, como las ISO 14000 y otras, las que de una u otra forma
obligan a las industrias a emplear tecnologías respetuosas con el medio ambiente, si se
quiere competir adecuadamente en mercados cada vez más globalizados. En este
sentido, las industrias forestales no son la excepción, presentándose la biotecnología
(tecnologías limpias) como una buena herramienta para cumplir con tales objetivos.
En el año 2006, las exportaciones forestales chilenas en el periodo enero-octubre
alcanzaron la cifra de US $ 3.208 millones, lo que representa un aumento de 8,9%
respecto a igual período de 2005. La pulpa blanqueada de pino consolida su liderazgo, al
alcanzar una participación de 33,7% en el total exportado por el sector forestal, junto a la
producción de pulpa de fibra corta, la cual está en constante aumento, y a las
producciones de papel periódico y cartulinas. La industria de celulosa y papel en las
exportaciones forestales es, sin lugar a dudas, la más importante de este sector.
En este contexto, una de las principales biotecnologías que se podrían aplicar en la
industria de la celulosa y papel se denomina biopulpaje; ésta se define como el
tratamiento de astillas de madera con hongos degradadores de lignina, previo al pulpaje
(Akhtar et al, 1996). Los resultados de los estudios aplicando esta técnica muestran una
reducción en los requerimientos energéticos y mejoramiento del producto final, como por
ejemplo mejoras en las propiedades mecánicas del papel (Scott et al, 1998a). Otros
logros obtenidos son la reducción de los contaminantes sólidos, líquidos y gaseosos,
generados principalmente en la cocción, lavado y blanqueo en el proceso Kraft (González
et al, 1996).
No obstante, existen problemas que se deben superar para llevar a cabo el biopulpaje a
una escala industrial, entre los cuales se pueden mencionar: lograr el grado de asepsia
necesario que permita evitar contaminaciones; reducir los costos del inóculo, tanto en su
producción como en su aplicación, y mantener un ambiente no contaminado en la pila de
astillas (Scott et al, 1998b). Por las dificultades anteriormente descritas, la presente
memoria propone diversos medios de cultivo líquidos, cuya utilización permitiría minimizar
los problemas de contaminación y reducir tanto los costos de producción como de
aplicación de los inóculos, pudiendo emplearse métodos simples como son la aspersión
de las trozas o la inmersión de ellas en piscinas con inóculo, contribuyendo de este modo
a optimizar el proceso de biopulpaje en su conjunto. De este modo, los objetivos
planteados en la siguiente memoria fueron:
Objetivo general
• Proponer y evaluar medios de cultivo líquidos para el desarrollo de inóculos a
nivel masivo, de dos hongos de pudrición blanca, con el fin de ser utilizados
en procesos de biopulpaje Kraft de Eucalyptus globulus Labill.
Objetivos específicos
• Formular medios de cultivo líquidos, que permitan el desarrollo de dos hongos
de pudrición blanca (140 y 167).
• Determinar la variable pérdida de peso de material leñoso, como respuesta
a los factores presencia de nutriente y tiempo de incubación.
• Determinar las variables, crecimiento radial de micelio y capacidad
enzimática, como respuesta al factor presencia de nutriente.
2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1 Pudrición blanca La pudrición blanca es una forma de degradación biológica de la madera cuyo resultado
es el blanqueamiento de ésta. El término es comúnmente utilizado para describir la
apariencia macroscópica de la madera degradada (Eaton et al, 1993).
2.1.1 Hongos participantes El mayor grupo de hongos causantes de pudrición blanca pertenece a la clase
Basidiomicetes, que comprende cientos de especies que causan pudrición en coníferas y
latifoliadas en todo el mundo. También, algunos hongos pertenecientes a la clase
Ascomicetes y, particularmente a los géneros Daldinia, Hypoxylon, Ustulina y Xilaria,
producen pudrición blanca en latifoliadas (Eriksson et al, 1990; Eaton et al, 1993).
La producción de enzimas del tipo fenol-oxidasas es lo que distingue a los hongos de
pudrición blanca (HPB) de los demás basidiomicetes degradadores de madera y
causantes de otros tipos de pudrición (Eaton et al, 1993).
Los hongos basidiomicetes de pudrición blanca son los únicos organismos que poseen la
capacidad de degradar lignina completamente en CO2 y H2O. Bajo condiciones
ligninoliticas, los hongos de pudrición blanca producen enzimas extracelulares
(peroxidasas y oxidasas) y un metabolito secundario (veratril alcohol). De todos los grupos
de microorganismos ligninoliticos, los basidiomicetes de pudrición blanca son
probablemente los más eficientes y los más estudiados.
Según Zabell y Morrell (1992), los HPB pueden atacar todos los componentes de la
madera consumiendo tanto Polisacáridos (celulosa y hemicelulosa) como lignina. Sin
embargo, una gran cantidad de especies causan una degradación selectiva de la lignina y
poliosas en la lamela media, como también, en la pared celular. Su estrategia es
descomponer la lignina de la madera para tener acceso a las poliosas y celulosa que
están integrados en la matriz lignocelulósica (Highley y Dashek, 1998). Esta habilidad de
los hongos de pudrición blanca los convierte en organismos altamente deseables en las
industrias papeleras, donde la lignina debe removerse o modificarse, sin alterar
significativamente la celulosa.
Durante la acción de los HPB en la degradación de los componentes estructurales de la
madera, es posible distinguir tres procesos: el primero es la alteración simultánea de los
constituyentes de la pared celular (holocelulosa y lignina); otro tipo de proceso es la
degradación de la lignina y luego holocelulosa, y por último la modificación primeramente
de holocelulosa y posteriormente la lignina. (1)
Los HPB penetran la madera, mayoritariamente, a través de los radios parenquimáticos,
para posteriormente con sus hifas penetrar a los lúmenes de las fibras a través de las
puntuaciones (simples o areoleadas), como también en campos de cruce o causando
erosiones o perforaciones, a través de acciones enzimáticas en la pared celular. La
degradación de la lignina propiamente tal, va desde el lumen de la fibra hacia la capa S2
de la pared celular, con posterior degradación de la lámela media, lo cual conduce a la
separación de las fibras (Silva, 2002a).
En fases avanzadas de pudrición, las paredes celulares son erosionadas extensamente, y
con frecuencia se observan numerosas perforaciones en las paredes de células
adyacentes. Una forma diferente de ataque a la pared celular se puede observar en los
hongos de pudrición blanca que degradan selectivamente la lignina. La hifa en el lumen
de la célula degrada progresivamente la lignina, desde el lumen junto a la pared
secundaria hacia la lámela media. Como el proceso de deslignificación continúa, la lámela
media es degradada y las células son separadas. La deslignificada pared secundaria; rica
en celulosa, permanece relativamente inalterada. La degradación de la lignina se hace
extensa a lo largo de las paredes de la célula, originándose de sólo uno o dos filamentos
hifales en cada lumen de célula. La disposición del parénquima radial facilita el acceso
dentro de la madera, y permite una distribución extensa del hongo (Akhtar et al, 1997).
(1): Comunicación personal Dr. Juan Donoso G. Teléfono: 02 – 314 29 297
La apariencia de la madera atacada por HPB es de tono fuertemente decolorado y
blanquizco, sin embargo, en las etapas tempranas de la pudrición se pueden presentar
matices café. En un número pequeño de casos, la degradación puede presentarse en
áreas discretas y pequeñas; cuando esto ocurre, se ocupa el término “bolsillos de
pudrición blanca”, o pudrición en forma de grano de arroz. En alguna variedad de casos la
madera con pudrición blanca se vuelve de apariencia fibrosa, debido a la separación de
las células en la porción de la lámela media, sin embargo, en otras formas de pudrición
blanca la apariencia es mas bien algodonosa. Las especies latifoliadas, en general, son
más susceptibles a la pudrición blanca que las coníferas (Eaton et al, 1993).
2.1.2 Sistemas enzimáticos
El sistema enzimático revela que los hongos de pudrición blanca producen enzimas
oxidativas e hidrolíticas, que actúan en la degradación de ciertos componentes de la
pared celular, tales como lignina y holocelulosa (Silva, 2002a).
Akhtar y colaboradores (1997) señalan diversos estudios que indican tres enzimas
oxidativas, lignina peroxidasas (LiP), manganeso peroxidasas (MnP), y lacasas son
responsables de la fragmentación inicial del polímero de lignina y producción de
compuestos de bajo peso molecular en hongos de pudrición blanca (solubilización). No
todos estos hongos producen aparentemente las tres enzimas, aunque algunos,
incluyendo Trametes versicolor, si lo hacen. Otros, como Phanerochaete chrysosporíum,
producen sólo LiP y MnP, mientras que Ceriporíopsis subvermispora produce sólo MnP y
lacasa, y Phlebia ochraceofulva produce sólo LiP y lacasa.
Según Eaton y colaboradores (1993), una gran variedad de enzimas resultan ser
importantes en la depolimerización de la lignina, entre estas: lignina peroxidasas, lacasas,
manganeso peroxidasas, demetoxilasas, enzimas generadoras de H2O2 y enzimas
degradadadoras de monómeros tales como: celobiosa dehidrogenasa, ácido vanílico
hidroxilasa y dioxigenasa trihidroxibenceno. Sin embargo, indudablemente las más
importantes son lignina peroxidasas, manganeso peroxidasas y lacasas.
Según Zabel y Morrel (1992), los mayores cambios estructurales que ocurren por la
acción de los HPB incluyen, demetilación, oxidación de átomos de carbono α,
modificación de las cadenas entre carbono α y carbono β de las unidades fenil propano,
modificaciones directas de una cadena de arilglicerol - β - aryl éter e hidroxilación y
modificación de los anillos aromáticos. Estos autores, además, señalan que en el análisis
de lignina residual, en diversos estados de pudrición, se aprecia una constante pérdida de
grupos metoxilo e incrementos en oxígeno y contenido hidroxil. Numerosos estudios han
demostrado que la actividad ligninolítica en varios HPB, se inicia en respuesta a diversos
eventos fisiológicos, los cuales son incitados principalmente por la carencia de algún
nutriente en el medio de cultivo como nitrógeno, carbono, azufre o fósforo (Tapia, 1994).
En estudios realizados en medios de cultivo líquidos con hongos como Phanerochaete
chrysosporium y condiciones óptimas de pH (4,5), sin agitación y presiones parciales altas
de oxígeno, limitaciones de nutrientes esenciales, como la del nitrógeno, incrementan la
lignólisis. Limitaciones de carbono y de azufre también arrojan similares resultados. Sin
embargo, en Pleurotus ostreatus y Lentinus edodes no arrojó el mismo comportamiento
dado que altas concentraciones de nitrógeno en el medio no deprimieron la actividad
ligninolítica, por lo tanto, la relación entre el nivel de nitrógeno y el grado de actividad
ligninolítica no es universal entre los hongos de pudrición blanca (Eaton et al, 1993).
Las LiP son glicoproteinas monoméricas que contienen un grupo hemo (hierro-
protoporfirina IX) como grupo prostético (Tien y Kirk, 1984). Tienen un peso molecular de
entre 38 y 43 KDa y un punto isoeléctrico (pI) que varía entre 3,3 y 4,7 (Kirk et al., 1986).
Para su actividad dependen de la presencia de H2O2, y catalizan la oxidación de
compuestos fenólicos y no fenólicos, hidrocarburos aromáticos policiclicos y otros
compuestos que son resistentes al ataque microbiano; habiéndose demostrado su
capacidad para oxidar una amplia variedad de compuestos modelo de lignina (Glenn et
al., 1983).
Las MnP son glicoproteinas que contienen el grupo hemo como grupo prostético. Tienen
un peso molecular de entre 40 y 47 KDa y un pI que fluctúa entre 3 y 4. Por ser una
peroxidasa requiere para su actividad la presencia de H2O2 pero además lo es de Mn2+,
siendo este último el sustrato principal ya que MnP lo oxida a Mn 3+, siendo el Mn3+
generado un agente capáz de oxidar modelos fenólicos (originando radicales fenoxilo) y
no fenólicos de lignina (Gold et al, 1989). Además, y dado su pequeño tamaño, este ion
puede actuar en zonas internas de la lignina, inaccesibles a un ataque enzimático directo.
Las lacasas (p-difenol oxígeno reductasa) son enzimas del tipo fenoloxidasa, que continen
varios átomos de cobre en su estructura. Son glicoproteinas con un peso molecular entre
60 y 140 KDa y un contenido en carbohidratos que fluctúa entre 15 y 20%, siendo las
variaciones de tamaño debidas sobre todo a las diferencias en el contenido glucídico. Las
lacasas se incluyen dentro del pequeño grupo de enzimas llamadas "proteinas de cobre
azules" u "oxidasas azules", denominadas así por el color azul intenso que les confiere la
presencia de cobre. Este grupo de oxidasas incluye, además de las lacasas, la ascorbato
oxidasa, presente en plantas, y la proteina plasmática de mamíferos ceruloplasmina
(Reinhammar y Malmström, 1981).
Diferentes compuestos fenólicos y proteínas han sido probadas como inductores de
lacasa en diferentes hongos. La lacasa del hongo Polyporus sanguineus, causa una
demetilación y oxidación de determinados compuestos aromáticos de la lignina, liberando
CO2. Sandhu y Arora (1984), realizaron inducción de lacasa en Polyporus sanguineus con
distintos compuestos fenólicos, tales como, ácido galico, resorcinol y orcinol a una
concentración de 0,1%, y ácido tánico y ácido salicílico, a una concentración de 0,05%.
Los resultados indican, que la mejor respuesta se logra en medios con agar malta más el
inductor ácido tánico, con un incremento de actividad lacasa de 38,5 % respecto al
control.
Shin et al (1998), en un estudio utilizando al hongo Coriolus hirsutus, realizó una
caracterización de las propiedades de lacasa en un cultivo líquido con limitaciones de
nitrógeno; Coriolus hirsutus creció en frascos erlenmeyer de 200 ml, con 50 ml de medio
de cultivo a 28º C y con agitación de 200 rpm. El medio de cultivo contenía, por litro: 7,2 g
glucosa, 5,0 g de KH2PO4, 0,2 CaCl2(H2O), 0,5 g MgSO4(7H2O), 54 mg NH4Cl, 5 µg biotin,
100 µg tiamina y 20 ml de una traza de solución mineral. Finalmente, la caracterización
bioquímica fue: la masa molecular de lacasa nativa fue estimada en 80 kDa, indicando
que la enzima es una proteína monómerica.
2.2 Medios de cultivo 2.2.1 Generalidades respecto a la composición de los medios de cultivo
Los medios de cultivo pueden definirse como un conjunto de elementos o sustancias que
garantizan a un microorganismo, célula, o a un grupo de ellos, los nutrientes necesarios
para su conservación, crecimiento y desarrollo (Vázquez, 2002).
En general, los medios de cultivo son una mezcla equilibrada de nutrientes que, en
concentraciones adecuadas y con condiciones físicas óptimas, permiten un buen
crecimiento de los microorganismos. Contienen una base mineral, fuente de carbono, de
nitrógeno y azufre; atmósfera adecuada y los factores de crecimiento necesarios. Pueden
ser de origen natural o artificial y posibilitan, además, la identificación o diferenciación de
una célula o microorganismo dentro de un conjunto de ellos, e incluso inhiben el
desarrollo de otros (Vázquez, 2002).
El elevado ritmo de desarrollo de la industria biofarmacéutica y de la biotecnología abrió
nuevas perspectivas en el diseño de los medios de cultivo y sus componentes, pero
también ha impuesto conceptos referentes a los requisitos de calidad de estos
productos (Vázquez, 2002).
Por su naturaleza y función, los componentes fundamentales de estos medios pueden
agruparse como agua, bases nutritivas, extractos, infusiones y otros, carbohidratos
(azúcares, agar y sus derivados, almidones y varios más), sales minerales (orgánicas e
inorgánicas) y colorantes e indicadores (Vázquez, 2002).
Los medios de cultivo para el desarrollo de los microorganismos deben cumplir con
requerimientos energéticos y no energéticos. Dentro de los requerimientos energéticos
encontramos elementos que serán fuentes de energía para el microorganismo en cultivo;
éstas pueden ser fuentes más energéticas, como carbono (glucosa, lactosa, maltosa,
almidón), y menos energéticas como el nitrógeno (en forma de proteínas, péptidos o
aminoácidos). Con respecto a los requerimientos no energéticos existen fuentes tales
como azufre, fósforo y iones metálicos, entre los que se cuentan el sodio, potasio,
magnesio y hierro (Granados y Villaverde, 1997).
En cuanto al nitrógeno, es necesario considerar que en la madera existen muy bajos
niveles de este elemento. La relación carbono/nitrógeno (C:N) en la madera, es
aproximadamente (300–1200):1. En el micelio de los hongos, el nitrógeno contenido
puede ser más de 100 veces superior al que se encuentra en la madera. Es claro que los
HPB deben conservar y reciclar constantemente el nitrógeno celular, y que la fuente de
nitrógeno disponible para la hifa puede ser suplementada, ya sea en forma de nitritos,
nitratos, amoniacos o también nitrógeno orgánico en la forma de aminoácidos (Eaton,
1993).
2.2.2 Condiciones físico-químicas de los medios de cultivo
Según Granados y Villaverde (1997) aparte de las condiciones nutritivas que debe cumplir
un medio de cultivo, existen las condiciones físico-químicas apropiadas que permiten el
crecimiento adecuado del microorganismo en estudio. De acuerdo a esto se deben
considerar las siguientes condiciones:
Temperatura: Todo microorganismo necesita una temperatura óptima para su adecuado
desarrollo, ya sea para su crecimiento o sobrevivencia. Según Eaton and Hale (1993), la
mayoría de los hongos son organismos mesófilos, es decir, crecen en un rango de
temperatura de 10 y 40º C, con una temperatura óptima de entre 20 y 30º C.
Humedad: Corresponde a la cantidad de agua que va a necesitar el microorganismo para
su crecimiento. En general, cualquier medio sólido o líquido requiere una cierta proporción
de agua. En el caso de los hongos, la humedad adecuada para su desarrollo según Eaton
and Hale (1993) se encuentra entre 30% y 80%.
pH: La presencia de iones hidrógeno libres que se encuentran en el medio es relevante
para el desarrollo de los microorganismos en cultivo. En el caso de los hongos, la mayoría
de ellos crece en un rango de pH de 4 y 7, con un óptimo de 5 y 6. Es importante
mencionar que en un medio de cultivo pueden existir variaciones del pH, como
consecuencia de las reacciones que se producen durante la degradación de los nutrientes
por parte de los hongos.
Oxígeno: En el caso de los microorganismos aeróbicos, es fundamental la presencia de
oxígeno en el medio de cultivo. Como los hongos son organismos aerobios, su respiración
se produce cuando existe presencia de oxígeno.
2.2.3 Principales tipos de medios de cultivo Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, así como diferentes clasificaciones
de estos. A continuación se describen los principales medios de cultivo clasificados según
el sustrato, utilización, composición y presentación (Granados y Villaverde, 1997).
2.2.3.1 Medios de cultivo según el sustrato
• Medios sólidos
Corresponden a aquellos medios donde la proporción en agar está siempre por encima
del 1,5%. Este tipo de medios es muy importante en la actualidad ya que permite el
aislamiento, purificación, y visualización del crecimiento en colonias, así como
identificarlos a través de medios específicos.
• Medios semisólidos Son medios intermedios entre los líquidos y sólidos, donde su proporción en agar suele
ser inferior al 0,5% pero suelen presentar una cierta cantidad de sustrato sólido que les
proporciona una consistencia semisólida.
• Medios líquidos
Corresponden a los también denominados caldos. No contienen agar y su composición
además suele tener una fuente de carbono, sales minerales y, en algunas ocasiones,
según las características del medio, factores de crecimiento, vitaminas, peptonas, etc.
Son muy importantes para la realización de múltiples pruebas bioquímicas, como también
para la realización de inóculos.
2.2.3.2 Medios de cultivo según su utilización
• Medios para aislamiento Son medios muy diversos pero con la particularidad común de obtener a partir de ellos
colonias aisladas. Éstos según su composición, se pueden dividir a su vez en:
Medios enriquecidos: Son medios a los cuales se les añade además de los componentes
básicos, uno o varios elementos que facilitan el crecimiento de algún tipo de
microorganismo generalmente exigentes, lo que nos permite aislar el microorganismo que
buscamos.
Medios selectivos: Son medios en cuya composición presentan algún componente o
componentes que van impedir el crecimiento de algún otro tipo de microorganismo,
estableciendo con ello una selección del tipo de microorganismo que sí puede crecer.
Medios diferenciales: Corresponden a aquellos medios que presentan las mismas
propiedades de los medios selectivos, pero presentan sustancias que al ser utilizadas, o
no, por el microorganismo que va a crecer en dicho medio, dan una información
suplementaria y específica, es decir diferencial.
• Medios para crecimiento Son medios ya sea en forma líquida o sólida que sirven para el cultivo de la mayoría de
los microorganismos. Su composición va a corresponder a una fuente de carbono, una de
nitrógeno, sales y agua.
• Medios de identificación Son medios que pueden tener las mismas características que los diferenciales, por tanto,
nos van a servir para identificar el crecimiento y características de algún tipo de
microorganismo.
• Medios de mantenimiento de cepas Son medios que suelen tener los nutrientes necesarios para mantener a las cepas vivas
durante períodos de tiempo relativamente largos manteniéndose tales medios
generalmente a temperaturas lo suficientemente bajas en cada caso como para impedir
su crecimiento.
2.2.3.3 Medios de cultivo según su composición
• Medios naturales
Son aquellos cuyos componentes orgánicos e inorgánicos se encuentran en la naturaleza,
se suelen preparar artesanalmente y, en general, pueden estar constituidos por ciertos
tejidos, líquidos orgánicos, etc.; por ejemplo la leche, el huevo, la patata, sangre, etc.
• Medios semi-sintéticos Son medios donde parte de su composición corresponde a extractos naturales como
levadura, malta, patata, sangre, leche, etc., a los que se añaden constituyentes sintéticos
o químicamente definidos para el crecimiento del microorganismo.
• Medios sintéticos Corresponden a estructuras sintéticas más o menos puras y químicamente definidas, que
están o pueden estar disueltas en agua destilada en proporciones determinadas de forma
que se obtenga una solución adecuada para permitir el crecimiento del tipo o tipos de
microorganismos que se desee.
• Medios complejos
Su composición no está exactamente definida como sucede con los medios sintéticos, es
decir, no es rigurosamente constante, y sus materias primas se originan a partir de tejidos
animales y vegetales, entre ellas podemos encontrar carne de músculo, de hígado, de
corazón, clara o yema de huevo, azúcares, peptonas, etc.
2.2.3.4 Medios de cultivo según su presentación • Medios deshidratados
Son medios que se comercializan tal cual y una vez en el laboratorio deben ser
preparados adicionando la cantidad de agua correspondiente en condiciones totalmente
asépticas o una vez preparados se esterilizarían en un autoclave. Su composición es muy
variable y puede ser de tipo básico o más complejo.
• Medios ya preparados Son medios que han sido elaborados por las casas comerciales presentando un
determinado control de calidad y características específicas adecuadas a cada tipo de
cultivo. Este tipo de medios pueden presentarse en forma de placas, en tubo, como
formas sólidas, en frascos, como medios semisólidos o líquidos, en doble fase, etc.
• Medios sólidos en placas Petri Son medios sólidos que ocupan una superficie lo suficientemente grande como para
poder visualizar perfectamente las colonias de microorganismos en cultivo (mucho mejor
que en tubo). Estos medios se utilizan mucho para obtener cultivos puros partiendo de
una colonia previamente aislada. En general, el sistema en placa es uno de los medios
que permiten mejor el aislamiento de microorganismos que puedan crecer en él.
• Medios sólidos en tubo Los medios sólidos en tubo corresponden a tubos con agar inclinado y solidificado con el
fin de aumentar la superficie donde se va a producir el crecimiento del microorganismo
una vez sembrado. Estos tipos de medio son útiles para la conservación de cepas, porque
la desecación es menor en medios sólidos en tubo que en las placas Petri.
• Medios líquidos en tubo Estos medios nos permiten visualizar colonias pero tienen muchas aplicaciones como por
ejemplo, pruebas bioquímicas que permiten la determinación del indol, la reducción de
nitratos a nitritos, la fermentación de la glucosa, lactosa u otro tipo de azucar , etc.
2.2.4 Efecto de algunas sustancias sobre la actividad enzimática ligninolítica de los HPB
Numerosos estudios dan cuenta de la incidencia de los niveles de nitrógeno en el medio
de cultivo sobre la actividad ligninolítica; sin embargo, si el efecto es positivo o negativo
depende del hongo. Para algunas cepas, altos niveles iniciales de nitrógeno en el medio
reprimen la actividad ligninolítica, la que sólo se activa durante el metabolismo secundario
(Kirk et al., 1978). Por el contrario, en otros hongos se ha demostrado que altas
concentraciones de nitrógeno estimulan la producción de actividad enzimática ligninolítica,
particularmente lacasa (Buswell y Odier, 1987).
Según Reddy (1992), en estudios con Phanerochaete chrysosporíum la producción de las
enzimas LiP y MnP, tanto en cantidad como en tipos, responde directamente a los
cambios realizados en los medios de cultivo. Por ejemplo, limitaciones de nitrógeno
favorecen la producción de enzimas degradadoras de lignina (LiP y MnP), mientras que
un exceso de nitrógeno en el medio reprimen la producción de estas enzimas. Esta
relación inversa se extiende también a los nutrientes carbono y azufre. En cultivos
limitados en nitrógeno se han detectado al menos seis isoenzimas diferentes de LiP (H1,
H2, H6, H7, H8 y H10) y cuatro isoenzimas de MnP (H3, H4, H5 y H9) (Kirk et al., 1985).
Kaal y colaboradores (1995), estudiaron cinco especies de hongos de pudrición blanca
con respecto a su crecimiento en masa de micelio y actividad enzimática en tres medios
de cultivo, peptona - N, baja concentración de N y alta concentración de N. Los resultados
en cuanto a crecimiento, mostraron que altas concentraciones de N mejoran la capacidad
generadora de micelio. Con respecto a la capacidad enzimática: LiP fue producida por
Phanerochaete chrysosporíum en medios con limitaciones de N, mientras que en
Bjerkandera spp la producción de LiP se presentó en medios con altas concentraciones
de N; la producción de MnP se presentó en todos los casos en el medio con peptona – N
y lacasa fue detectada sólo en los cultivos de Pleurotus ostreatus y Lentinula edodes,
ambos en medios con altas concentraciones de N.
Vares y Hatakka (1997) estudiaron la capacidad degradadora de lignina sintética y
producción de enzimas ligninoliticas en medios de cultivo líquidos y bajo variadas
condiciones de crecimiento, en varias especies de hongos basidiomicetes. La
mineralización de la lignina no excedió el 14% en 29 días de tratamiento. Hubo diferentes
respuestas de los hongos al elevar la concentración de Mn 2+ y de sodio malonate. Esta
respuesta estuvo marcada por los distintos sistemas enzimáticos de cada hongo. Se
observó una producción de LiP en Trametes gibbosa y Trametes trogii. Producción de
distintos tipo de MnP se observó en los hongos Trametes gibbosa, Trametes trogii,
Trametes hirsuta y Abortipurus biennis. Además, se detectaron dos de tres tipos de
lacasa.
Wuyep y colaboradores (2003) investigaron la influencia de iones metálicos en la
producción y regulación de ligninasa y la extensión del micelio en dos tipos de
basiodiomicetes, Lentinus squarrosulus y Psathyrella atroumbonata, cultivados sobre
residuos lignocelulósicos. Encontraron que los iones Mn2+ y Ca2+ estimularon el
crecimiento de ambos hongos y la extensión del micelio significantemente. La producción
de lignina peroxidasa se incrementó de 2 a 12 veces bajo la influencia de los iones Mn2+ y
Ca2+ a concentraciones de 20 a 80 mM respectivamente. Los iones Mg2+ y K+ no
estimularon el crecimiento ni la extensión del micelio fúngico, por el contrario, los cultivos
fúngicos se desactivaron después de 6 días.
Wuyep y colaboradores (2003) encontraron que la degradación de las astillas de madera,
medida a través de ensayos de pérdida de peso, en presencia de los hongos Lentinus
squarrosulus y Psathyrella atroumbonata alcanzó un 35 - 50% en la concentración 60 – 80
mM, para Mn2+, y 40 - 60 mM para Ca2+. La biodegradación de la madera fue
significativamente más baja, alrededor de un 2 a 5% en presencia de Mg2+ y K+.
Collins y colaboradores (1997), en estudios realizados con el hongo de pudrición blanca
Trametes versicolor, encontraron que la producción de lacasa no está regulada
necesariamente por el gen del hongo, a través de enzimas constitutivas, sino que además
esta puede ser activada por la presencia de ciertos nutrientes, tales como nitrógeno,
cobre y un número importante de inductores aromáticos.
Shuttleworth et al (1986), examinaron la habilidad del hongo Rhizoctonia praticola de
producir e inducir lacasa. Potenciales inductores fueron utilizados, tales como:
compuestos fenolicos, anilinas y ácidos benzoicos, los que fueron adicionados a una
concentración de 1 mM en el medio de cultivo. El medio, antes de la adición de los
inductores, fue mantenido a temperatura ambiente (22 y 25º C), y una vez agregados los
inductores se mantuvo a una temperatura de 15º C. De los 11 compuestos probados, sólo
5 tuvieron un efecto inductor (p-Aminofenol, o-metoxianilina, ácido 2,4-Dihidroxibenzoico,
p-Toluidina y p-metoxianilina). El inductor más efectivo fue p-anisidina (p-metoxianilina),
obteniendo 30 veces mayor actividad de lacasa que el control. También se encontraron
otros parámetros que influyen en la producción de lacasa, como la temperatura,
concentración de los inductores y tiempo de adición de los inductores.
El desarrollo de actividad enzimática extracelular en los cultivos del hongo basidiomicete
Trametes versicolor fue estudiado por Johansson y Nyman (1992). Ellos probaron medios
de cultivo líquidos estacionarios con limitaciones de carbono y nitrógeno, cuya
temperatura de incubación fue de 27º C. Con la adición de MnSO4 en una concentración
de 200 uM, se obtuvo producción de MnP; la mayor actividad MnP se obtuvo en el décimo
día de incubación de los medios.
Por otra parte, algunos autores han reportado que, entre otros parámetros, la tasa de
agitación y en menor grado el tipo de agitación (circular o elíptica) pueden tener un efecto
importante sobre la cantidad y tipo de enzimas producidas (Ashter et al., 1988).
Nerud y colaboradores (1991) encontraron que cultivos de Trametes hirsuta en estático,
suficientes en nitrógeno y limitados en carbono, favorecían la producción enzimática de
LiP. Los mismos autores reportan además una fuerte dependencia de la actividad LiP,
MnP y lacasa, de la presencia de alcohol veratrílico en el medio de cultivo.
Eggert et al (1996), estudiando el sistema ligninolítico del hongo Pycnoporus
cinnabarinus, probaron diversos inductores para la producción de las distintas enzimas.
Para la producción de LiP utilizaron alcohol veratrílico, para la inducción de MnP
emplearon MnSO4 y para lacasa 2,5 xilidina, ácido veratrico, guaiacol y lignosulfato. Los
resultados no mostraron actividad LiP ni MnP; en cambio, la actividad lacasa aumentó
cerca de nueve veces, con concentraciones de 10 -19 µM de 2,5 xilina; sin embargo, un
aumento de estas concentraciones disminuyen la actividad lacasa.
Szklarz et al, 1989 estudiaron la producción de actividad extracelular de fenol-oxidasas y
peroxidasas en ocho tipos de hongos basidiomicetes degradadores de la madera.
Coriulus versicolor, Phellinus igniarius y Lycoperdon sp. mostraron altas actividades de
lacasa. Phanerochaete chrysosporium y Piptoporus betulinus manifestaron actividad de
MnP, mientras que Chaetomiun piluliferum y Chaetomiun celullolyticum expresaron bajas
actividades de peroxidasas. En Lenzites trabea no se encontró ningún tipo de actividad
extracelular de enzimas oxidasas ni peroxidasas. Los autores encontraron marcadas
diferencias en las actividades de fenol-oxidasas entre dos tipos de Coriulus versicolor,
uno de ellos aislado más recientemente que el otro. Este resultado sugiere que los
hongos pueden perder su capacidad de producción de enzimas cuando son cultivados por
largos periodos de tiempo. Bajo las condiciones experimentales desarrolladas durante el
estudio no se encontró ninguna actividad de ligninasa en ninguno de los hongos
estudiados.
Muñoz y colaboradores (1996), realizaron estudios con el hongo de pudrición blanca
Pleurotus eryngii en relación a la producción de lacasa en medios de cultivo líquidos,
cuyo extracto principal era glucosa-amonio y tartrato de levadura, con o sin inductores. Se
obtuvieron los siguientes resultados: en el medio base se observaron una mayor y una
menor banda de lacasa. La intensidad de la mayor banda de lacasa no mostró cambios
con la adición de inductores. Sin embargo, la menor banda de lacasa fue intensamente
inducida por paja de trigo, alcali lignina y ácidos vainillinico y verátrico.
Por otra parte, Garzillo et al (1998) desarrollaron investigaciones con el hongo Trametes
trogii y su relación con la inducción de lacasa, crecido en medio líquido sintético GB7
suplementado con extracto de levadura, glucosa, (NH4)2SO4, K2HPO4 y KH2PO4. Los
cultivos de mantuvieron a una agitación constante de 180 rpm y a una temperatura de 28º
C. En algunos medios se le adicionaron por separado, como potenciales inductores, paja
de trigo (desde 1% a 6%) o 2,5 xililidina (0,2 mM o 0,5 mM). Los resultados obtenidos
indican que la paja de trigo aumenta la actividad lacasa. Por el contrario, la xilidina no
muestras efectos en la actividad lacasa.
Palmieri et al (1999), estudiaron la inducción de Lacasa en Pleurotus ostreatus con CuSO4
en medios de cultivo líquido. La composición base del cultivo era dextrosa potato 24 g/l,
extracto de paja 5 g/l y la adición del suplemento cúprico a una concentración de 150 uM.
Transcurridos 6 días de incubación se incrementó 50 veces la actividad máxima del
control. Además, el incremento de la actividad enzimática sería proporcional a la cantidad
de Cu adicionado. Así también la cantidad de Cu no afecta el crecimiento en biomasa del
hongo.
2.3 Pulpaje y biopulpaje 2.3.1 Pulpaje convencional El pulpaje o pasteo persigue la separación de las fibras celulósicas que constituyen la
madera desde la matriz lignocelulósica, lo que puede realizarse por diferentes métodos
implicando, según éste, diferentes grados de remoción de la lignina. En la actualidad,
prácticamente el 100% de las pastas producidas en el mundo se obtienen por procesos
de pulpaje químicos o mecánicos (Silva, 2006).
En la producción de la pulpa mecánica se utiliza prácticamente toda la fibra de madera
que existe en el tronco en la que se incluyen tanto los carbohidratos (celulosa y
hemicelulosa) como la lignina. En este tipo de procesos, el grado de extracción de la
lignina es mínimo, obteniéndose rendimientos muy altos, por sobre el 90%. (Silva, 2006)
La pulpa mecánica tradicional se obtiene presionando la madera contra una superficie
abrasiva de un cilindro rotatorio. Este proceso de fabricación de la pulpa mecánica se
inicia con la entrega a la fábrica de los troncos de madera para pulpa limpios y
descortezados en longitudes de 40 a 150 cm, dependiendo del tipo de molino a utilizar:
Luego los troncos se colocan dentro del molino, y son reducidos a pasta mecánica por la
piedra del mismo. Para obtener una temperatura apropiada, se agrega agua a la piedra y
la pulpa va entonces de la fosa del molino hacia los depuradores gruesos o de astillas, en
donde se separan pedazos de madera relativamente grandes y astillas. Posteriormente, la
suspensión diluida se bombea a los depuradores finos, y la pulpa aceptada, a los
espesadores o a los prensa pastas en donde, respectivamente, se prepara para su uso en
la fábrica de papel, o para su embarque en forma de hojas o paquetes húmedos (Libby,
1967).
El pulpaje mecánico tradicional ha experimentado numerosas modificaciones a lo largo
del tiempo. Entre estas se cuentan la incorporación de los refinadores, que permitió
trabajar con astillas en vez de troncos, y la inclusión de una etapa de tratamiento térmico
(con vapor) antes del pulpaje (pulpas termomecánicas) (Silva, 2006).
En cuanto a los procesos químicos, el más utilizado es el proceso al sulfato o kraft,
mediante el cual se genera casi el 70% del total de pastas de madera producidas en el
mundo. Este procedimiento permite eliminar cerca del 95% de la lignina presente en la
madera (Silva, 2006).
El pulpaje Kraft permite separar las fibras de la madera extrayendo la lignina mediante la
acción de ciertos reactivos químicos, específicamente sulfuro de sodio e hidróxido de
sodio, bajo determinadas condiciones de temperatura y presión, reactivos que constituyen
el licor de cocción. Se produce además, una extracción y disolución de gran parte de las
hemicelulosas, sin lograrse la extracción total de la lignina, quedando un remanente de
ésta en la pasta (lignina residual).
Figura Nº 1: Proceso de producción de pulpa Kraft. (Fuente: www.papelnet.cl)
El pulpaje Kraft (figura Nº 1) se resume en cuatro etapas fundamentales (Vial, 1989):
Una saturación completa de las astillas de licor de cocción acompañado de un aumento
de la temperatura y presión dentro del digestor. Esta fase inicial alcanza temperaturas
cercanas a los 150º C, donde se disuelve entre el 20 y el 25% del total de la lignina.
Una segunda fase, de cocción, que comienza cuando se detiene el suministro de calor al
proceso, manteniéndose estas condiciones por un tiempo determinado, permitiendo que
se produzcan las reacciones de deslignificación. Esta etapa se denomina fase gruesa y se
desarrolla aproximadamente a 170º C, lo que produce la disolución de cerca del 60% de
la lignina presente en la madera.
La tercera etapa consiste en someter las astillas cocidas a una violenta baja de presión, lo
que provoca la separación de las fibras. Esta etapa se denomina fase residual de
deslignificación, y durante ella se produce la disolución de aproximadamente un 10 a 15%
de la lignina originalmente presente en la madera.
La cuarta etapa consiste en la extracción del licor de las fibras mediante un lavado,
realizado generalmente en un tambor rotatorio vacío.
2.3.2 Biopulpaje El rápido desarrollo de la producción industrial coincide con un interés creciente en la
biotecnología, la cual involucra la utilización de procesos biológicos o enzimáticos en
diversas áreas industriales. Esta ha llegado a ser posible por el desarrollo de
microorganismos altamente especializados, los que pueden ser directamente empleados
en los procesos o a través del aislamiento de las enzimas que ellos producen (Zaid,
2004).
El biopulpaje es definido como el tratamiento de astillas o trozas de madera con hongos
de pudrición blanca que degradan selectivamente lignina antes del pulpaje, es un proceso
experimental que ha sido investigado extensamente durante los últimos años. Éste ha
sido estudiado principalmente como un pre-tratamiento para el pulpaje mecánico. La
aplicación de este pre-tratamiento trae consigo una serie de ventajas, como la reducción
del consumo de energía, la cual para el caso del pulpaje termo-mecánico, corresponde al
mayor costo; un aumento en la calidad del papel mejorando sus propiedades, y la
reducción del impacto medio ambiental negativo del proceso de pulpaje Kraft, debido a la
disminución en el uso de reactivos (Akhtar et al, 1997).
Aunque se ha mostrado la potencial aplicación de tratamientos fúngicos en el pulpaje,
falta aún incorporar muchos aspectos de ingeniería y procesos para poder explotar esta
tecnología. Sin embargo, en los últimos años los grandes avances de la biotecnología
forestal se han centrado en el mejoramiento genético y en la industria de la celulosa y
papel (biopulpaje y bioblanqueo), demostrando que estos procesos pueden tener una baja
tasa de contaminación, ser más limpios y económicos (González y Donoso, 1999).
Con el conocimiento más acabado de la influencia de los factores ecológicos u otros como
el hibridismo, se ha podido determinar cuales son las condiciones (físicas, químicas y
biológicas) más favorables para el crecimiento y el comportamiento degradador de los
HPB en la madera, los cuales son aspectos importantes que se deben considerar al
momento de llevar el pre-tratamiento a una escala industrial (Donoso et al, 1999).
Según Messner et al (1998), existen dos mecanismos que están involucrados en el
biopulpaje: primero, existe una modificación de la pared celular, probablemente a causa
de un agente difusor, y segundo una clara mejora en la penetración y difusión de los
agentes químicos de cocción efectos causados por la acción del hongo sobre el chip.
Gomez (1995), concluye que no se manifiesta una alta biodegradación de los
componentes químicos de la madera, sin embargo, se supone un desdoblamiento de las
cadenas moleculares para los casos de la lignina, celulosa, y sustancias pécticas; lo cual
se traduce en mayores rendimientos de pulpaje.
Oriarán y colaboradores (1991) postulan que el proceso mejora, por que existe una mejor
penetración del licor de cocción durante la digestión. Esto puede deberse al aumento de
la porosidad, consecuencia de la remoción de biomasa por las enzimas, que mejoran la
accesibilidad del licor a los componentes de la pared celular, o por una mejor relación
holocelulosa/lignina que entra al digestor.
El pretratamiento de astillas de madera con hongos de pudrición blanca a escala de
laboratorio ha demostrado varios beneficios, entre ellos un ahorro de energía y mayor
resistencia del papel en pulpaje mecánico, un incremento en el rendimiento y mayor
resistencia del papel en pulpaje kraft y una reducción en el número kappa e incremento en
la blancura del papel en pulpaje al sulfito (Wall et al, 1994; Gonzalez et al, 1998; Gonzalez
et al, 2001).
Messner et al, (1998) demostraron que para hongos basidiomicetes, existen reducciones
del número kappa entre 30% y 50%; mientras tanto, con hongos ascomicetes se han
observado reducciones de entre 7% y 10% para el pulpaje denominado al biosulfito. Sin
embargo, para el pulpaje biokraft las reducciones del número kappa fueron sólo un poco
mejor para hongos basidiomicetes que para el hongo ascomicete Ophiostoma piliferum.
Para un experimento con trozas de Pinus resinosa, sometido a un ataque de Phlebiopsis
gigantea, Blanchette y colaboradores, (1998) observaron un aumento de la porosidad de
la pared celular y una reducción del consumo de energía (9 a 27% menos) en pulpaje
mecánico. Akhtar et al, (1998) revelan ahorros energéticos en pulpaje mecánico de entre
27% y 40% con distintas especies de HPB enriquecidas con licor de maíz, sobre chips de
álamo.
Según González y colaboradores (2001), en experiencias realizadas en Chile, trabajando
con pino radiata y Pleurotus ostreatus, se logró disminuir el número kappa en un 9%,
obteniendo mejores rendimientos y altos grados de polimerización en la fibra de celulosa.
El proceso de blanqueo es mucho más fácil en el biopulpaje, usando menos productos
clorados y con mejores grados de brillo en el papel. El biopulpaje puede ser aplicado sin
restricciones tanto en latifoliadas como en coníferas.
Chen y colaboradores (1999), lograron una disminución del tiempo total de pulpaje kraft
de un 20% al tratar astillas de Pinus banksiana en paquetes compactados con el hongo
Ceriporiopsis subvermispora.
Según González y colaboradores (1996) en la industria de celulosa, los principales
factores de contaminación provienen de las etapas cocción, lavado y blanqueo. Scott et
al, (1995), hallaron que los efluentes de un pulpaje al sulfito de Pinus taeda redujeron en
gran parte su toxicidad al haber tratado la madera con un HPB.
Debido a las actuales presiones en torno al tema de la protección ambiental,
especialmente provenientes del mercado internacional, en los últimos años se han
realizado importantes avances en el diseño de ingeniería de los procesos de producción
de celulosa. Los cambios se han centrado en la introducción de mecanismos para la
disminución en la generación de residuos, ya sea de manera preventiva (cambios y
mejoras de tecnología e insumos) o incluyendo tratamiento previo a su disposición final.
Entre estas mejorías se incluyen el descortezado en seco, la cocción modificada y
extendida, la deslignificación con oxígeno y ozono, y el blanqueo con dióxido de cloro
(proceso ECF) o sin cloro (proceso TCF); los siguientes pasos a seguir apuntan a la
incorporación de mejoras biotecnológicas, como es el caso del biopulpaje y bioblanqueo
(Silva, 2002b).
Actualmente se plantean desafíos de desarrollo sustentable, que involucren objetivos
sociales y económicos sin afectar el ambiente ni los recursos naturales, siendo esta una
de las principales metas de la industria de celulosa y papel para el siglo XXI. Una serie de
convenciones ya se han adoptado para el desarrollo sustentable, entre éstas, políticas
que integran aspectos productivos y prevención de la polución (IPPC), mejorando las
expectativas medioambientales futuras. Los principales problemas a abordar son el
cambio climático, la acidificación y la disminución de recursos naturales (González, 2003).
2.4 Eucalyptus globulus
2.4.1 Generalidades El género Eucalyptus corresponde botánicamente a la clase Angiospermas, subclase
dicotiledóneas y familia Mirtaceae. Existen en el género más de 500 especies originarias
de Australia y de algunas islas cercanas, encontrándose variadas formas y tamaños dada
su amplia distribución natural y gran número de especies. En particular, Eucaliptus
globulus es originario del sudeste de Australia y Tasmania (Prado y Barros, 1991).
Las plantaciones de Eucalyptus globulus presentan en general, un incremento volumétrico
anual de 20 a 30 metros cúbicos por hectárea, pudiendo llegar a los 45 metros cúbicos en
las condiciones más favorables (Vita, 1990). Los árboles poseen corteza rugosa y
persistente en la parte baja, y en la parte alta se desprende en tiras largas dejando una
superficie lisa de color gris azulado. La madera es de color café amarillento claro, textura
gruesa, normalmente de grano entrelazado, con anillos de crecimiento bastante
diferenciados, de gran dureza, pesada y moderadamente durable. Su peso especifíco
promedio es de 689 kg/m3 (INFOR, 1986).
Las propiedades fisicoquímicas de la madera inciden en los procesos de la celulosa
obtenida de ella. Entre estas se encuentran la densidad básica, contenido de extraíbles,
presencia de vasos, contenido de lignina, edad de los árboles y características de las
fibras. En el caso de las fibras, tienen gran importancia la longitud, el diámetro y el
espesor de pared. Eucapytus globulus presenta una longitud de fibra entre 0,81 y 1,06
mm, diámetros de fibra de 19,59 um, y espesor de pared de 2,36 um, valores que
aumentan con la edad (Prado y Barros, 1991).
Según Consuegra (1994) el interés por diversificar las plantaciones actuales
considerando, entre otros, el rápido crecimiento, su menor contenido de lignina, y
aspectos fitosanitarios, hace que se vea al Eucalyptus como el género más viable para su
utilización en la industria de celulosa y papel.
2.4.2 Extraíbles en Eucalyptus Globulus
Los extraíbles representan un gran número de compuestos orgánicos. El grupo más
importante en términos de cantidad son los polifenoles y las resinas. Los polifenoles están
presentes en angiospermas y gimnospermas, e incluyen a un gran número de
componentes químicos orgánicos, entre estos los taninos. Estos materiales de origen
orgánico están presentes en formas mezcladas (Panshin y De-Zeeuw, 1970).
Los extraíbles se pueden agrupar de acuerdo al solvente utilizado para la extracción. Es
así como se reconocen extracciones en agua fría, en agua caliente, en etanol-tolueno y
en soda (Diaz-Vaz, 2003).
La extracción en agua fría elimina sales orgánicas presentes en lúmenes celulares. Del
mismo modo, se extraen los azúcares, gomas, galactanos, porciones de taninos y de
pigmentos. Por otra parte, la extracción en agua caliente incrementa los solubles con
agua fría y, además, hidroliza algunos polisacáridos (Diaz-Vaz, 2003).
La extracción con etanol-tolueno elimina de la madera ceras, grasas, resinas, aceites,
colorantes orgánicos, taninos, gomas e incluso materiales solubles en agua (Diaz-Vaz,
2003).
Los solubles en soda, esto es, hidróxido de sodio al 1%, corresponden a poliosas
(pentasanos y hexosanos), productos de degradación de celulosa, de lignina y algo de
resinas (Diaz-Vaz, 2003).
En comparación con muchas otras especies, la madera de Eucalyptus tiene un alto
contenido de extraíbles, que varía considerablemente según la especie. La cantidad de
extraíbles fenólicos aumenta desde la médula hacia el exterior en el duramen, y
disminuye en la albura. El mismo patrón de distribución se encuentra en todo el árbol, aún
cuando los contenidos de extraíbles son menores en la parte superior (Hillis, 1978).
Mansilla et al (1991) analizaron muestras de Eucalyptus globulus provenientes de
individuos con edades de 10 y 25 años y de troncos sin resina ni acumulación de nudos,
obteniendo cerca de un 5,1% de extraíbles.
Por otra parte Peredo (1999) realizó estudios de contenido de extraíbles en Eucalyptus
globulus sobre material proveniente de rodales pertenecientes a Bosques Arauco y
Forestal Valdivia, pero sólo con el solvente etanol tolueno. Los resultados obtenidos se
muestran en el cuadro Nº 1.
Cuadro Nº 1: Contenido de extraíbles según edad y procedencia para Eucalyptus globulus, según
Peredo (1999)
Especie Edad % Extraíbles (años) Bosques Arauco Forestal Valdivia 5-7 0,35 -
E.globulus 8-10 0,44 0,58 11-13 0,37 0,42 14-16 0,36 0,36
Paz y Pérez (1999) realizaron estudios químicos a Eucalyptus globulus y Eucalyptus
nitens, detectando un menor contenido de lignina y un mayor contenido de holocelulosa
en Eucalyptus globulus, lo cual sería una característica favorable a esta especie desde el
punto de vista de aptitud pulpable. En cuanto a los extraíbles, su presencia fue mayor en
Eucalyptus globulus, los valores obtenidos se muestran en el cuadro Nº 2
Cuadro Nº 2: Contenido de extraíbles en individuos con entre 10 -13 años con distintos solventes
para Eucalyptus globulus, según Paz y Pérez (1999)
Tipo de solvente Extraíbles (%) Agua Fría 1,5 Agua Caliente 4,5 Alcohol-Benceno 2
Total 8
3 MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Materiales Para llevar a cabo este trabajo se utilizó como materia prima inicial “pin chips” de
Eucalyptus globulus Labill, provistos por la empresa Celulosa ARAUCO S.A. Se entiende
por “pin chip” a una partícula de madera de entre 3 y 9 mm de longitud, la cual es
desclasificada por subdimensión en el proceso de astillado para el pulpaje (figura Nº 2).
Los materiales y equipos restantes se encuentran en los laboratorios de Biodeterioro y
Preservación de la Madera, Química de la Madera y Celulosa y Papel, todos ellos
pertenecientes al Departamento de Ingeniería de la Madera de la Facultad de Ciencias
Forestales de la Universidad de Chile. Su listado es el siguiente:
Cepas de HPB, 140 y 167. (Basidiomycetes, Aphyllophorales).
Agar - Agar
Extracto de malta
Complejo nutritivo (N-P-K)
Ácido gálico
Material de vidrio (Matraces, vasos, pipetas, etc)
Cámara de flujo laminar (Figura Nº 3)
Agitador orbital (Figura Nº 4)
Autoclave (Figura Nº 5)
Estufa de secado
Balanza digital
Cámara de incubación (Figura Nº 6)
Microscopio óptico (Figura Nº 7)
Rota-vapor (Figura Nº 8)
Figura Nº 2: Muestra de “Pin-chip” Eucaliptus globulus.
Figura Nº 3: Cámara de flujo laminar
Figura Nº 4: Agitador orbital
Figura Nº 5: Autoclave
Figura Nº 6: Cámara de incubación a 25 ºC
Figura Nº 7: Microscopio óptico
Figura Nº 8: Rota-vapor
3.2 Métodos 3.2.1 Diseño experimental Para cumplir con los objetivos planteados en el estudio, se diseñó un experimento en dos
fases. La primera de ellas dice relación con la formulación de medios de cultivo líquidos,
con o sin la incorporación de nutrientes adicionales N-P-K, y la evaluación de la capacidad
de tales medios de servir como sustrato de crecimiento de dos hongos de pudrición
blanca (cepas 140 y167).Tal capacidad, se determinó desde un punto de vista cualitativo,
a través de la observación del prendimiento de los hongos en el medio, es decir, de la
presencia de micelio fúngico. En la segunda fase y una vez comprobada la capacidad de
los medios como sustrato de crecimiento para los hongos en estudio, se determinó
cuantitativamente, de acuerdo a las variables respuesta pérdida de peso de material
leñoso, crecimiento radial de micelio y capacidad enzimática, la potencialidad de los
hongos crecidos en los distintos medios estudiados para biodegradar la madera y,
particularmente, su potencial producción de enzimas ligninolíticas ( a través de la variable
respuesta capacidad enzimática).
La descripción del experimento, desde el punto de vista de su diseño, se presenta en los
apartados 3.2.1.1 al 3.1.1.4; los cuales se presentan a continuación.
3.2.1.1 Factibilidad de medios de cultivo líquidos Este punto se relaciona con la viabilidad de los medios de cultivo líquidos en cuanto a
permitir el desarrollo de los hongos en estudio (140 y 167). Para ello se prepararon los
diferentes medios líquidos, tanto con la incorporación de nutrientes adicionales N-P-K
(cultivo Nº 2) como sin ellos (cultivo Nº 1). En el cuadro Nº 3 se indican los dos medios
formulados.
Cuadro Nº 3: Resumen de medios de cultivo formulados
Nº Incorporación Nºcultivo N - P - K Replicas
1 NO 32 SI 3
612
Subtotal (un hongo)Total (dos hongos)
Como se observa en el cuadro Nº 3 se realizaron tres repeticiones de cada medio de
cultivo formulado, con el fin de enfrentar una potencial contaminación, para así tener la
posibilidad de eliminar alguna de ellas. Una vez probada la factibilidad, a través de la
observación de micelios en un microscopio óptico, estos medios fueron utilizados en todos
los ensayos posteriores de este estudio.
3.2.1.2 Pérdida de peso de material leñoso
La pérdida de peso del material leñoso, fue la primera variable cuantificable que se
estableció como variable respuesta. Para determinar las diferencias en la variable
respuesta pérdida de peso del material leñoso se estableció un análisis de varianza
(ANDEVA) con diseño trifactorial, que incluyó las siguientes variables de entrada: tipo de
hongo, presencia o ausencia de nutrientes adicionales N-P-K y tiempo de incubación. En
el cuadro Nº 4 se detallan los ensayos realizados para evaluar la pérdida de peso de
material leñoso provocada por los hongos en estudio, con sus respectivas repeticiones.
Cuadro Nº 4: Resumen de ensayos para evaluar la perdida de peso de material leñoso
Nº Tiempo de Nºcultivo incubación (días) Repeticiones
1 30 51 45 52 30 52 45 5
2040
Subtotal (un hongo)Total (dos hongos)
De esta manera se tiene un conjunto de 2 x 2 x 2 = 8 tratamientos distintos, con cinco
repeticiones de cada uno. El modelo general asociado a este diseño experimental, donde
el factor A corresponde a tipo de hongo, el factor B corresponde a presencia o ausencia
de nutrientes adicionales y el factor C corresponde a tiempo de incubación, es:
Y ijkl = µ + α i + β j + γ k + (αβ) ij + (αγ) ik + (βγ) jk + (αβγ) ijk + З ijkl
Con i = 1,…, a (a=2)
j = 1,…, b (b=2)
k = 1,…, c (c=2)
l = 1,…, n (n=5)
Donde:
Y ijkl : l-ésima observación de pérdida de peso (%) para el tratamiento (i,j,k)
µ : Efecto de la media
α i : Efecto principal causado por el i-ésimo nivel del factor A (tipo de hongo)
β j : Efecto principal causado por el j-ésimo nivel del factor B (presencia o ausencia de
nutrientes adicionales)
γ k : Efecto principal causado por el k-ésimo nivel del factor C (tiempo)
(αβ) ij : Efecto de la interacción del i-ésimo nivel del factor A con el j-ésimo nivel del factor
B
(αγ) ik : Efecto de la interacción del i-ésimo nivel del factor A con el k-ésimo nivel del
factor C
(βγ) jk : Efecto de la interacción del j-ésimo nivel del factor B con el k-ésimo nivel del
factor C
(αβγ) ijk : Efecto de la interacción del i-ésimo nivel del factor A con el j-ésimo nivel del
factor B y el k-ésimo nivel del factor C
З ijkl : Error aleatorio
Al existir diferencias estadísticamente significativas al 95% de confianza, se utilizó la
prueba de intervalos múltiples de Duncan, para comparar las medias de los diferentes
tratamientos.
3.2.1.3 Crecimiento radial del micelio La segunda variable cuantificable que se estableció como variable respuesta fue el
crecimiento radial que presentó el micelio inoculado en un medio estacionario. Para
determinar las diferencias en esta variable respuesta, se estableció un análisis de
varianza (ANDEVA) con diseño bifactorial, que incluyó las siguientes variables de entrada:
tipo de hongo y presencia o ausencia de nutrientes adicionales N-P-K. El cuadro Nº 5
especifica los ensayos realizados para evaluar el crecimiento radial de los hongos en
estudio, con sus respectivas repeticiones.
Cuadro Nº 5: Resumen de ensayos para evaluar el crecimiento radial
Nº Nºcultivo Repeticiones
1 52 5
Subtotal (un hongo) 10Total (dos hongos) 20
De esta manera se tiene un conjunto de 2 x 2 = 4 tratamientos distintos, con cinco
repeticiones de cada uno. El modelo general asociado a este diseño experimental, donde
el factor A corresponde a tipo de hongo, el factor B corresponde a presencia o ausencia
de nutrientes adicionales, es:
Y ijl = µ + α i + β j + (αβ) ij + З ijkl
Con i = 1,…, a (a=2)
j = 1,…, b (b=2)
l = 1,…, n (n=5)
Donde:
Y ijl : l-ésima observación de crecimiento radial de micelio para el tratamiento (i,j)
µ : Efecto de la media
α i : Efecto principal causado por el i-ésimo nivel del factor A (tipo de hongo)
β j : Efecto principal causado por el j-ésimo nivel del factor B (presencia o ausencia de
nutrientes adicionales)
(αβ) ij : Efecto de la interacción del i-ésimo nivel del factor A con el j-ésimo nivel del factor
B
З ijkl : Error aleatorio
Al existir diferencias estadísticamente significativas al 95% de confianza, se utilizó la
prueba de intervalos múltiples de Duncan, para comparar las medias de los diferentes
tratamientos.
3.2.1.4 Capacidad enzimática La capacidad enzimática fue la última variable cuantificable que se estableció como
variable respuesta para determinar la eficacia de los medios líquidos formulados. Para
determinar las diferencias en esta variable respuesta, se estableció un análisis de
varianza (ANDEVA) con diseño bifactorial, que incluyó las siguientes variables de entrada:
tipo de hongo y presencia o ausencia de nutrientes suplementarios N-P-K. El cuadro Nº
6 especifica los ensayos realizados para evaluar la capacidad enzimática de los hongos
en estudio, con sus respectivas repeticiones.
Cuadro Nº 6: Resumen de ensayos para evaluar la capacidad enzimática
Nº Nºcultivo Repeticiones
1 52 5
Subtotal (un hongo) 10Total (dos hongos) 20
De esta forma se tiene un conjunto de 2 x 2 = 4 tratamientos distintos, con cinco
repeticiones de cada uno. El modelo general asociado a este diseño experimental, donde
el factor A corresponde a tipo de hongo, el factor B corresponde a presencia o ausencia
de nutrientes adicionales, es:
Y ijl = µ + α i + β j + (αβ) ij + З ijkl
Con i = 1,…, a (a=2)
j = 1,…, b (b=2)
l = 1,…, n (n=5)
Donde:
Y ijl : l-ésima observación de capacidad enzimática para el tratamiento (i,j)
µ : Efecto de la media
α i : Efecto principal causado por el i-ésimo nivel del factor A (tipo de hongo)
β j : Efecto principal causado por el j-ésimo nivel del factor B (presencia o ausencia de
nutriente)
(αβ) ij : Efecto de la interacción del i-ésimo nivel del factor A con el j-ésimo nivel del factor
B
З ijkl : Error aleatorio
Al existir diferencias estadísticamente significativas al 95% de confianza, se utilizó la
prueba de intervalos múltiples de Duncan, para comparar las medias de los diferentes
tratamientos.
3.2.2 Metodología de Laboratorio
Las experiencias se realizaron en el Laboratorio de Biodeterioro y Preservación,
perteneciente al Departamento de Ingeniería de la Madera. Estas se dividen en cuatro
etapas.
3.2.2.1 Preparación del medio de cultivo inicial Para la génesis de las cepas de los hongos, se procedió a preparar un medio sólido
estacionario en discos Petri, denominado agar-malta. Su formulación corresponde a 2 g
de agar – agar y 3 g de extracto de malta, diluidos en 100 ml de agua destilada. Este fue
preparado de la siguiente manera:
En una balanza se pesaron las cantidades correspondientes de agar – agar y de extracto
de malta. Con la ayuda de una probeta se midieron 100 ml de agua destilada caliente
para la disolución de los componentes, luego se procedió a mezclar ambos componentes
y se homogeneizaron mediante agitación con una varilla de vidrio. Posteriormente se
vació en cada uno de los discos Petri de 9 cm de diametro, un volumen de 12,5 ml de
medio, el cual lentamente solidificó al enfriarse.
Una vez solidificado el medio, las placas fueron esterilizadas en autoclave a una
temperatura de 121º C y presión 15 lb/cm2 durante 20 minutos. Posteriormente se
inocularon los hongos en las placas Petri, utilizando para ello la cámara de flujo laminar.
Después de sembrados los inóculos, las placas fueron llevadas a la cámara de
incubación, a 25º C, hasta que el micelio completó la superficie de la placa, lo cual se
logró aproximadamente en 7 días. Para evitar un crecimiento excesivo, las placas fueron
colocadas en un refrigerador a una temperatura de 5º C.
3.2.2.2 Preparación de medios de cultivo líquidos En esta etapa se prepararon dos diferentes medios de cultivo líquidos, cuya composición
básica fue agua destilada y extractos de Eucalyptus globulus Labill, a un 5% de
concentración volumen/volumen, diferenciándose uno de otro en la incorporación del
complejo nutritivo N-P-K. Estos tres nutrientes se adicionaron a través de los compuestos
NaNO3, Ca (H2PO4)2 H2O y KCl respectivamente.
Los medios de cultivo líquidos fueron preparados en matraces de 500 ml, conteniendo
150 ml totales de compuesto. En el cuadro Nº 7 se presenta la concentración porcentual
de cada componente del medio de cultivo líquido.
Cuadro Nº 7: Concentración % de cada componente del medio de cultivo líquido
Nº Extracto N P Kcultivo (%) (%) (%) (%)
1 5 0 0 02 5 0,500 0,250 0,125
Para la obtención del extracto, se procedió a mezclar, en una relación 2:1 (solvente,
sustrato) los “pin chips” de Eucalyptus globulus Labill con agua caliente en un vaso de
precipitado; posteriormente se agitó la mezcla hasta que se homogenizó, y se llevó a un
baño termostático por 45 minutos aproximadamente a una temperatura de 90 º C. Una
vez transcurrido el tiempo, la mezcla se filtró con ayuda de un matraz kitasato, papel filtro
y bomba de vacío. A continuación y una vez vaciada la mezcla completamente, se
procedió a lavar los residuos de “pin chip” con 200 ml de agua destilada, la que finalmente
formó parte del extracto que aun estaba dentro del kitasato. Para obtener un extracto con
el pH apropiado (5,5 - 6), se le adicionaron algunas gotas de ácido clorhídrico 1M.
Finalmente, utilizando un rota-vapor, se llevó el extracto a una concentración del 50%
volumen/volumen.
Obtenido de esta forma el extracto, se vació la cantidad correspondiente en el matraz de
500 ml y luego se agregó agua destilada hasta completar los 150 ml requeridos. Luego de
esto, se agregó la porción de complejo nutritivo y se colocaron 2 perlitas de vidrio para
que durante la agitación del medio, el micelio inoculado permaneciera disgregado en la
solución. El matraz fue tapado con algodón y se procedió a esterilizar en autoclave a una
temperatura de 121º C y presión 15 lb/cm2 durante 20 minutos.
En la cámara de flujo laminar se sembró el medio líquido con el inóculo del hongo en
estudio. Para esto, se extrajo con un asa metálica una porción de micelio del hongo (de
aproximadamente 1 cm2 de superficie) desde el disco Petri que contenía la cepa madre
desarrollada sobre agar-malta, y se introdujo en el matraz previamente esterilizado. El
matraz se tapó con algodón y fue dispuesto en un agitador orbital para la incubación, el
cual se mantuvo a una temperatura aproximada de 25º C y con agitación constante de
150 r.p.m. durante 20 días.
3.2.2.3 Evaluación de la viabilidad de los medios de cultivo formulados
Una vez transcurridos los 20 días, se determinó la viabilidad como medio de desarrollo de
los hongos 140 y 167, de los medios de cultivo líquidos formulados según se describe en
el punto 3.2.2.2 del capítulo de Materiales y Métodos. Se procedió a tomar una muestra
de los medios, y se observó en un microscopio la presencia o ausencia de micelio. La
existencia de micelio en esta muestra fue considerada como la evidencia de la viabilidad
del medio formulado para el desarrollo de los hongos. Esta actividad permitió cumplir con
el primer objetivo específico del estudio.
3.2.2.4 Medición de variables respuesta.
• Pérdida de peso de material leñoso
La pérdida peso de material leñoso se midió a través de la degradación que causa el
micelio inoculado sobre “pin chip” de Eucalyptus globulus Labill en dos tiempos de
incubación, 30 y 45 días. En el cuadro Nº 8 se detallan los ensayos realizados para
evaluar la pérdida de material leñoso provocada por los dos hongos en estudio.
Cuadro Nº 8: Resumen de ensayos para evaluar la perdida de peso de material leñoso
Nº Tiempo de Nºcultivo incubación (días) Repeticiones
1 30 51 45 52 30 52 45 5
2040
Subtotal (un hongo)Total (dos hongos)
La preparación de cada tratamiento se realizó de la siguiente manera:
En un matraz de 500 ml se vació la cantidad de “pin chips”, a un 66% de contenido de
humedad (en base húmeda), equivalente en peso a 10 g secos. Para ello se mezcló una
parte de “pin chips” anhidro por dos partes de agua destilada. Luego, el matraz fue tapado
con algodón y se procedió a esterilizar en autoclave a una temperatura de 121º C y
presión 15 lb/cm2 durante 20 minutos.
En una campana de flujo laminar se realizó la inoculación de una alícuota de medio de
cultivo líquido. Esto se llevó a cabo extrayendo, con una pipeta 1 ml de medio de cultivo,
el que fue introducido en el matraz previamente esterilizado. El matraz se tapó con
algodón y fue llevado a la cámara de incubación a 25º C durante el tiempo de duración del
ensayo, 30 o 45 días.
Transcurrido el tiempo de tratamiento se llevó el material biodegradado a una estufa a
103º C para eliminar el agua y el micelio del “pin chips”. El porcentaje de pérdida de peso
se calculó mediante la relación:
Donde:
p.p. (%): Porcentaje de pérdida de peso
Pi: Peso anhidro inicial de “pin chips”
Pf: Peso anhidro final de “pin chips”
• Crecimiento radial del micelio La segunda forma de medir la eficacia del medio de cultivo líquido fue mediante la prueba
de crecimiento radial que presentó el micelio inoculado en un medio estacionario de
agar/malta. El cuadro Nº 9 especifica los ensayos realizados para evaluar el crecimiento
radial de los dos hongos en estudio.
Cuadro Nº 9: Resumen de ensayos para evaluar el crecimiento radial
Nº Nºcultivo Repeticiones
1 52 5
Subtotal (un hongo) 10Total (dos hongos) 20
La prueba de crecimiento radial se realizó de la siguiente manera:
Se procedió a preparar un medio sólido estacionario en discos Petri, cuya formulación fue
de 2 g de agar – agar y 3 g de extracto de malta, diluidos en 100 ml de agua destilada.
Este medio fue preparado igual que el medio descrito en el apartado 3.2.2.1, con la
diferencia que las placas Petri utilizadas para este ensayo (crecimiento radial de micelio)
eran de 15 cm de diámetro, y a cada una de ellas se le vació un volumen de 50 ml de
medio.
p.p. (%) = (Pi – Pf) x 100
Pi
Posteriormente, se procedió a la inoculación de los hongos. Se tomó, con la ayuda de un
gotario, una gota de cultivo líquido que contenía al hongo ya desarrollado, y se dejó caer
en el centro de la placa Petri con agar-malta. Una vez inoculados los hongos, las placas
se llevaron a la cámara de incubación a 25º C. Transcurridos 3 días aproximadamente, se
comenzó a medir, con una regla, diariamente su crecimiento, obteniendo así un registro
completo del desarrollo del micelio en su crecimiento radial. En la figura Nº 9 se muestra
la forma en que se midieron dos radios de crecimiento perpendiculares (R1 y R2), para
luego tener un promedio de ellos, obteniendo así un radio de crecimiento más
representativo.
Figura Nº 9: Muestra de mediciones de radios de crecimiento en placa con el hongo ya
desarrollado.
• Capacidad enzimática Para evaluar la capacidad enzimática, es decir, la producción de enzimas ligninolíticas, se
procedió a medir el radio del halo de oxidación generado por tales enzimas en un medio
sólido estacionario que hemos denominado ácido gálico. Su formulación consta de 0,5 g
de ácido gálico, 1,5 g de agar – agar y 3 g de extracto de malta, diluidos en 100 ml de
agua destilada. El cuadro Nº 10 especifica los ensayos realizados para evaluar la
capacidad enzimática de los hongos en estudio.
Cuadro Nº 10: Resumen de ensayos para evaluar la capacidad enzimática
Nº Nºcultivo Repeticiones
1 52 5
Subtotal (un hongo) 10Total (dos hongos) 20
La prueba de capacidad enzimática se realizó de la siguiente manera:
En una balanza se pesaron las cantidades correspondientes de ácido gálico, agar – agar
y extracto de malta. Con la ayuda de una probeta se midieron 100 ml de agua caliente
para la disolución de los componentes, los que se mezclaron y homogeneizaron con una
varilla de vidrio; posteriormente se procedió a vaciar en cada uno de los discos Petri un
volumen de 12,5 ml de medio, el cual lentamente solidificó al enfriarse.
Una vez solidificado el medio, las placas fueron esterilizadas en autoclave a una
temperatura de 121º C y presión 15 lb/cm2 durante 20 minutos. Posteriormente, se
procedió a la inoculación de los hongos. Se tomó, con la ayuda de un gotario, una gota de
cultivo líquido que contenía al hongo ya desarrollado y se dejó caer en el centro de la
placa Petri con el medio ácido gálico-agar-malta. Una vez inoculados los hongos, las
placas se llevaron a la cámara de incubación a 25º C. Luego, iniciado el crecimiento del
hongo, se comenzó a medir con una regla, el tamaño radial del halo de oxidación, durante
un período de 7 días. En la figura Nº 10 se muestra como se midieron dos radios
perpendiculares de halos oxidativos (R1 y R2), para luego obtener un promedio de ellos,
teniendo así un radio oxidativo más representativo.
Figura Nº 10: Muestra de mediciones de radios de halos oxidativos en placa con el hongo ya
desarrollado.
4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 Evaluación de la viabilidad de los medios de cultivo líquidos formulados Tal como se indicó en el apartado 3.2.2.3 del capitulo Materiales y Métodos, una vez
obtenidos los potenciales medios de cultivo, estos fueron inoculados con los dos hongos
bajo estudio, procediéndose a su incubación en las condiciones descritas en el
mencionado apartado. Transcurridos 20 días de incubación, se tomó una muestra del
medio y se observó al microscopio la presencia o ausencia de micelio en este. En las
figuras 11 a la 14 se muestran las distintas vistas de los micelios en los diferentes medios
de cultivo líquidos formulados, donde “CN” significa medios de cultivo con nutrientes
adicionales y “SN” corresponde a medios de cultivo sin nutrientes adicionales.
Lente 40/0,65
Lente 10/0,30
Lente 4/0,14
Figura Nº 11: Vistas microscópicas de micelio del hongo 167-CN en medio de cultivo líquido
Lente 40/0,65
Lente 10/0,30
Lente 4/0,14
Figura Nº 12: Vistas microscópicas de micelio del hongo 167-SN en medio de cultivo líquido
Lente 40/0,65
Lente 10/0,30
Lente 4/0,14
Figura Nº 13: Vistas microscópicas de micelio del hongo 140-CN en medio de cultivo líquido
Lente 40/0,65
Lente 10/0,30
Lente 4/0,14
Figura Nº 14: Vistas microscópicas de micelio del hongo 140-SN en medio de cultivo líquido
A través de la observación de los micelios, se comprobó la viabilidad de los distintos
medios de cultivo líquidos formulados, puesto que permiten el desarrollo efectivo de los
hongos en estudio. Cabe hacer notar en este punto, que los extraíbles de Eucalyptus
globulus, incorporados a los medios de cultivo fueron obtenidos por extracción con agua
caliente y correspondieron en peso a un 4,7% de la muestra analizada, valor muy similar
al obtenido por Paz y Pérez (1999). En consecuencia, estos extraíbles, base principal de
los medios de cultivo formulados, y entre cuyos componentes se encuentran sales
orgánicas, azúcares, gomas, taninos y algunos polisacáridos (citados en la bibliografía)
son factibles de emplear en la formulación de medios de cultivo líquidos para el desarrollo
de los hongos estudiados. A través de esta prueba se cumple con el primer objetivo
específico planteado en este trabajo.
4.2 Pérdida de peso de material leñoso En el cuadro Nº 11 se muestran los resultados de la pérdida de peso de material leñoso
con sus respectivas repeticiones, para los dos hongos estudiados, en las condiciones con
y sin nutrientes adicionales N-P-K, a 30 y 45 días de ensayo.
Cuadro Nº 11: Resultados de pérdida de peso con sus respectivas repeticiones para los hongos
167 y 140 bajo las distintas condiciones de nutrientes adicionales y tiempos de ensayo.
Pérdida de Peso (%) Con Nutrientes (CN) Sin Nutrientes (SN) Tipo de hongo 30Días 45 Días 30Días 45 Días
8,00 8,75 9,74 11,72 7,30 8,88 9,79 13,17
167 8,23 9,22 10,48 11,38 8,62 9,24 10,24 11,52 8,07 8,95 11,66 11,47
Prom. (*) 8,05 9,01 10,38 11,85 7,41 12,04 8,73 10,96 7,20 14,74 9,47 11,30
140 7,39 11,50 11,10 12,80 9,63 14,03 9,86 12,07 9,87 14,49 8,83 11,95
Prom. 8,30 13,36 9,60 11,82 (*) Prom. = Promedio
Figura Nº 15: Diagrama de Pareto para pérdida de peso de material leñoso
En el diagrama de Pareto (figura Nº 15) se muestran los efectos de cada variable sobre la
pérdida de material leñoso, en donde se observa una línea paralela al eje de las
ordenadas, indicando el límite a partir del cual los factores que tienen un efecto real sobre
la variable respuesta se extienden a la derecha de ella con un 95 % de confianza.
Además el diagrama de Pareto nos entrega el orden de importancia de los efectos en la
variable respuesta, los cuales son: tiempo, interacción tipo de hongo – nutrientes,
nutrientes, interacción tipo de hongo - tiempo, tipo de hongo y la interacción tipo de hongo
– nutrientes – tiempo.
El análisis de varianza indica que el efecto causado por el tiempo de exposición de las
muestras en el ensayo pérdida de peso, es estadísticamente significativo, al considerar un
nivel de confiabilidad de un 95% (Apéndice Nº 1 y Figura Nº 15). Las pruebas Duncan
indican que a mayor tiempo de exposición son mas altos los porcentajes de degradación
(Figura Nº 16 y Apéndice Nº 2), A 45 días de exposición se obtiene una pérdida de peso
promedio de 11,51%, mientras que a 30 días se tiene un pérdida de peso promedio de
9,08%. Estos resultados son predecibles, puesto que los hongos al estar mayor tiempo en
contacto con su fuente de nutrición, consumirán mayor cantidad ella.
Figura Nº 16: Gráfico de medias para tiempo de exposición
El análisis estadístico con un nivel de confiabilidad de un 95% muestra que el efecto
causado por la ausencia o presencia de nutrientes sobre la pérdida de peso, es
estadísticamente significativo. (Apéndice Nº 1)
Los resultados de las pruebas de comparación múltiple de Duncan, nos revelan que la
ausencia de nutrientes es la mejor alternativa para un mayor porcentaje de pérdida de
material leñoso (Figura Nº 17 y Apéndice Nº 2). Este comportamiento se podría explicar
de la siguiente forma: los hongos al tener una cantidad de nutrientes adicionales
(diferentes a la madera) disueltos en el medio poseen mayores fuentes energéticas y no
energéticas, por lo tanto, no necesitan degradar material leñoso para obtener los
componentes necesarios para la obtención de su energía. Por el contrario, al no tener
nutrientes adicionales disueltos en el medio, los hongos deben degradar el material en
exposición, para acceder a su fuente energética.
9,68
10,91
9,00
9,20
9,40
9,60
9,80
10,00
10,20
10,40
10,60
10,80
11,00
11,20
Con Nutrientes (CN) Sin Nutrientes (SN)
Pérd
ida
de P
eso(
%)
Figura Nº 17: Variación de la pérdida de peso según nutrientes
Al analizar el efecto causado por el tipo de hongo sobre la pérdida de peso, se verifica
que existen diferencias estadísticamente significativas entre éstos, al considerar un nivel
de confianza de un 95%. (Apéndice Nº 1)
En la figura Nº 18 se observa que el hongo 140 logró mayor pérdida de peso de material
leñoso que el hongo 167, con un 10,77% promedio versus un 9,82% promedio
respectivamente. Esto se comprueba con la prueba Duncan entre las medias (Apéndice
Nº 2). Según este resultado, el hongo 140 es mucho más agresivo al momento de
degradar material lignocelulósico que el hongo 165, por lo tanto, suponiendo que ha
mayor degradación de material leñoso se elimina más porcentaje de lignina, el hongo 140
tendría mayor potencial de ser aplicado en el biopulpaje.
Figura Nº 18: Gráfico de medias para tipo de hongo
Las interacciones entre los efectos: Tipo de Hongo-Nutrientes, Tipo de Hongo -Tiempo y
Tipo de Hongo-Nutrientes-Tiempo; son estadísticamente significativas a un 95 % de
confiabilidad (Apéndice Nº 1).
Al observar la figura Nº 19, se puede ver que el comportamiento de los hongos frente a la
incorporación de nutrientes adicionales es distinto: mientras que al hongo 167 lo inhiben
en su comportamiento degradativo, al hongo 140 prácticamente no lo afectan. Esto quiere
decir que el hongo 167, al tener mayor presencia de nutrientes adicionales en el medio,
prefiere tomarlos para su metabolismo y deja en segundo plano la degradación del
material leñoso para obtener su energía, en cambio, el hongo 140 continúa con su
comportamiento degradativo de material leñoso aún con la incorporación de nutrientes
adicionales al medio. Por lo tanto, el metabolismo del hongo 140 es más estable frente a
la incorporación de nutrientes adicionales en comparación al hongo 167.
Figura Nº 19: Variación de la pérdida de peso con la interacción entre tipo de hongo y nutrientes
Figura Nº 20: Variación de la pérdida de peso con la interacción entre tipo de hongo y tiempo
Para ambos hongos, el mejor tiempo de exposición de los “pin chips” para su degradación
es de 45 días (Figura Nº 20). Los niveles de degradación de material leñoso en los
primeros 30 días de incubación son muy similares para ambos hongos, sin embargo, en
los siguientes 15 días de incubación, el grado de pérdida de peso adicional alcanzado por
del hongo 140 (3,64%, entre el día 31 y el 45) es tres veces más alta que el obtenido con
el hongo 167 (1,21%). Puede decirse entonces que el hongo 140, una vez transcurridos
los 30 días de incubación, posee un sistema degradador de material madera más potente
y/o efectivo que los días anteriores, y también que el del hongo 167.
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
30 Días 45 Días
TIEMPO (días)
PÉR
DID
A D
E PE
SO % 167-CN
167-SN140- CN140- SN
Figura Nº 21: Pérdida de peso (%) promedio en los dos tiempos de exposición, por tipo de hongo y
con presencia o ausencia de nutrientes adicionales.
En la figura Nº 21 se puede observar la mejor combinación para la variable pérdida de
peso de material leñoso, entre los factores tipo de hongo, ausencia o presencia de
nutrientes adicionales y tiempo de ensayo. Esta interacción se logra con el hongo 140,
con nutrientes suplementarios y 45 días de exposición, con un 13,36% de pérdida de
peso, seguido por la combinación hongo 167, sin nutrientes y 45 días de incubación,
logrando un 11,85%, y muy cercanamente el 11,82% obtenido por la interacción del
hongo 140, sin nutrición adicional y a 45 días de exposición. Esto comprueba que a
mayores tiempos de incubación se produce una mayor biodegradación de material leñoso.
Además, el hongo 140 es más degradador de material lignocelulósico que el hongo 167,
siendo el comportamiento de ambos hongos frente a los nutrientes adicionales totalmente
antagónico. Estos antecedentes nos permitirían elegir al hongo 140 como la mejor opción
frente al hongo 165, al momento de ser aplicados en el biopulpaje.
4.3 Crecimiento radial de micelio En el cuadro Nº 12 se muestran los resultados, con sus respetivas repeticiones, de
crecimiento radial miceliar (mm), para los dos hongos estudiados, en las condiciones con
y sin nutrientes adicionales.
Cuadro Nº 12: Resultados de crecimiento radial de micelio (mm) para los hongos 167 y 140, bajo
distintas condiciones de nutrición con sus respectivas repeticiones.
Crecimiento Radial de Micelio (mm) Tipo hongo Con Nutrientes (CN) Prom. Sin Nutrientes (SN) Prom.
167 8,25 8,79 8,71 9,33 8,21 8,66 8,58 8,38 8,25 8,58 8,46 8,45 140 8,21 8,63 8,5 8,08 7,92 8,27 7,92 7,88 8,21 8,17 8,17 8,07
Figura Nº 22: Diagrama de Pareto para crecimiento radial de micelio
El principal efecto sobre el crecimiento radial de micelio es el tipo de hongo, lo que se
comprueba con el análisis de varianza, a una confiabilidad del 95% (Apéndice Nº 3). Esto
se observa claramente en el diagrama de Pareto para crecimiento radial de micelio
(Figura Nº 22). Los resultados de comparación de medias de Duncan (Apéndice Nº 4),
nos indican que el hongo de más rápido crecimiento es el hongo 167, con 8,56 mm.
promedio de crecimiento diario, versus 8,17 mm. promedio de crecimiento diario para el
hongo 145 (Figura Nº 23 y Cuadro Nº 12). En experiencias realizadas en el laboratorio de
Biodeterioro y Preservación de la Madera, perteneciente al Departamento de Ingeniería
de la Madera de la Facultad de Ciencias Forestales de la Universidad de Chile, se han
encontrado similares resultados, donde el hongo 167 tiene un crecimiento mayor que el
hongo 140. Esta prueba nos muestra que el hongo 167 posee una mayor colonización en
superficie del medio, que el hongo 140, por lo tanto, si se desea un hongo que se
expanda más rápido en la superficie de la pila de “chips”, la mejor alternativa es el hongo
167.
Figura Nº 23: Gráfico de medias para tipo de hongo
En cuanto al efecto de los nutrientes adicionales y la interacción de los efectos tipo de
hongo y nutrientes suplementarios, no poseen un efecto estadísticamente significativas,
sobre la variable respuesta crecimiento radial miceliar. (Apéndice Nº 3 y Figura Nº 22)
En las siguientes figuras (Nº 24 y Nº 25) se muestran los crecimientos logrados por los
distintos hongos, donde cada uno de ellos provenía de medios de cultivo con nutrientes
adicionales N-P-K o sin ellos. En ellas se puede observar, sin mayores diferencias, que
ambos hongos en estudio crecieron normalmente en los medios estacionarios agar/malta.
167 – CN (medio con nutrientes adicionales)
167 – SN (medio sin nutrientes adicionales)
Figura Nº 24: Crecimiento radial logrado por el hongo 167 proveniente de dos medios distintos.
140 – CN (medio con nutrientes adicionales)
140 – SN (medio sin nutrientes adicionales)
Figura Nº 25: Crecimiento radial logrado por el hongo 140 proveniente de dos medios distintos
En la figura Nº 26, se puede observar que el hongo que mejor se comporta en su
crecimiento radial a lo largo del tiempo es el hongo 167, tanto con como sin nutrientes
adicionales. Esto podría deberse a que el hongo 167 posee en su genética una capacidad
de crecimiento y generación de micelio mayor que la del hongo 140, ya que ambos
hongos fueron sembrados sobre el mismo medio (agar-malta) y tuvieron las mismas
condiciones de incubación.
0
10
20
30
40
50
60
70
Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7
TIEMPO (días)
CR
ECIM
IEN
TO R
AD
IAL
(mm
)
167- CN167- SN140- CN140- SN
Figura Nº 26: Crecimiento radial (mm) a través del tiempo, por tipo de hongo y con presencia o
ausencia de nutrientes adicionales.
4.4 Capacidad enzimática En el cuadro Nº 13 se muestran los resultados, con sus respectivas repeticiones, de la
capacidad enzimática mostrada a través del crecimiento radial del halo de oxidación (mm)
para los dos hongos estudiados, en las condiciones con y sin nutrientes adicionales
Cuadro Nº 13: Resultados de capacidad enzimática de micelio (mm) para los hongos 167 y 140,
bajo distintas condiciones de nutrición con sus respectivas repeticiones.
Capacidad enzimática de micelio (mm) Tipo hongo Con Nutrientes (CN) Prom. Sin Nutrientes (SN) Prom.
167 3,53 3,48 3,53 3,57 3,32 3,48 3,42 3,58 3,67 3,96 4,33 3,79 140 3,38 3,25 3,04 4 3,29 3,39 2,83 3,04 3,27 3,38 3,48 3,2
Figura Nº 27: Diagrama de Pareto para capacidad enzimática
El análisis de varianza (Apéndice Nº 5) y el diagrama de Pareto (Figura Nº 27) indican que
el efecto causado por el tipo de hongo sobre la variable respuesta capacidad enzimática,
es estadísticamente significativo, al considerar un nivel de confiabilidad de un 95%. Con
las pruebas Duncan se demuestra que el hongo con mayor vigor en esta prueba es el
hongo 167, con 3,64 mm de tamaño radial promedio del halo, por sobre los 3,3 mm que
logró el hongo 140 (Figura Nº 28 y Apéndice Nº 6). Esto estaría demostrando que el
hongo 167 posee un sistema enzimático oxidativo más activo que el hongo 140. Dado que
las enzimas fúngicas del tipo ligninolíticas pertenecen fundamentalmente al tipo oxidativo,
y que una de los efectos que se persiguen en el biopulpaje es la degradación de la lignina
por el hongo, la cepa 167 sería una mejor alternativa para su utilización en este
bioproceso.
Figura Nº 28: Gráfico de medias para tipo de hongo
En las siguientes figuras (Nº 29 y Nº 30) se muestran las capacidades enzimáticas
logradas por los distintos hongos, donde cada uno de ellos provenía de medios de cultivo
con nutrientes adicionales N-P-K o sin ellos. Se puede observar un oscurecimiento en
todos los medios, lo que índica una oxidación de los mismos causada por la actividad
enzimática extracelular de los dos hongos en estudio.
167 – CN (medio con nutrientes adicionales)
167 – SN (medio sin nutrientes adicionales)
Figura Nº 29: Capacidad enzimática lograda por el Hongo 167 proveniente de dos medios distintos
140 – CN (medio con nutrientes adicionales)
140 – SN (medio sin nutrientes adicionales)
Figura Nº 30: Capacidad enzimática lograda por el Hongo 140 proveniente de dos medios distintos
En la figura Nº 31 se observa que el mejor comportamiento en relación a la capacidad
enzimática, se logró con el hongo 167 y en ausencia de nutrientes adicionales, lo cual es
muy importante para esta investigación, puesto que la ausencia de nutrientes
suplementarios permite una disminución en los costos de producción de inóculos.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7
TIEMPO (días)
RA
DIO
HA
LO (m
m )
167- CN
167- SN
140- CN
140- SN
Figura Nº 31: Capacidad enzimática (mm.) a través del tiempo, por tipo de hongo con presencia o
ausencia de nutrientes adicionales
Es importante mencionar que el hongo 167 fue la cepa que presentó, en promedio, la
menor pérdida de peso de material leñoso en comparación al hongo 140. Esto indicaría
que los sistemas enzimáticos de ambos hongos son distintos, puesto que el hongo 140, al
degradar más material lignocelulósico y poseer menor actividad enzimática oxidativa,
presentaría menor selectividad frente a la lignina, biodegradando entonces material
holocelulósico, lo cual es un efecto no deseado en relación a su potencial aplicación en el
biopulpaje.
Por lo anteriormente expuesto se recomienda realizar un estudio más acabado y
específico frente a las enzimas generadas por estos hongos (140 y 167), para así
dilucidar qué tipos de enzimas son producidas al momento de biodegradar la madera.
Paralelamente, es necesario realizar un análisis químico de la madera biodegradada, con
el objeto de identificar cuáles de sus componentes son principalmente afectados por la
acción fúngica.
6 CONCLUSIONES Los dos tipos de medio cultivo elaborados permiten el desarrollo adecuado de los hongos
de pudrición blanca ensayados (cepas 167 y 140).
En cuanto a la biodegradación de la madera causada por los hongos en estudio, existen
diferencias significativas en sus efectos, siendo un poco más agresivo el hongo 140, con
un 10,77% de pérdida de peso promedio versus un 9,82% promedio para el hongo 167.
Ambos hongos logran una mayor biodegradación a los 45 días de exposición de los “pin-
chips”.
La condición de ausencia de nutrientes adicionales en los medios de cultivo provee, con
ambos hongos, un mejor resultado en la pérdida de peso, con una diferencia de 1,23% de
pérdida de material leñoso sobre la presencia suplementaria de nutrientes. Sin embargo,
la adición de nutrientes adicionales al medio, tiene un efecto distinto en los hongos
estudiados; mientras que el hongo 140 mantiene su tasa de degradación en el tiempo, por
el contrario, el hongo 167 la disminuye.
Existen diferencias en cuanto al crecimiento radial miceliar de los hongos ensayados,
siendo en promedio el de la cepa 167 un 5% superior al obtenido con la cepa 140.
En relación a la capacidad enzimática, el hongo 167 desarrolla un halo de oxidación más
amplio en comparación al hongo 140, con radios promedio de 3,64 mm y 3,3 mm
respectivamente.
En general, todas las pruebas realizadas (pérdida de peso de material leñoso, crecimiento
radial de micelio y capacidad enzimática), muestran que la ausencia de nutrientes
adicionales constituye la mejor opción con miras al biopulpaje. Sin embargo, existen
diferencias de comportamiento entre ambos hongos estudiados ante esta alternativa,
puesto que al hongo 140 lo estimulan en su comportamiento, mientras que por el
contrario, al hongo 167 lo inhibe en su acción.
Si bien es cierto, la cepa 140 fue la que, en general, produjo mayores niveles de pérdida
de peso de material leñoso que la cepa 167, presentó a su vez menor crecimiento radial y
menor capacidad enzimática oxidativa. Esto indicaría que, muy probablemente, la acción
biodegradativa del hongo 140 es menos selectiva sobre la lignina que la del hongo 167.
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ZAID, L.2004. Estudio del Biodeterioro en madera de Eucalyptus globulus Lab. por el
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ZABEL, R. Y MORRELL, J. 1992. Wood Microbiology. Decay and its prevention. Chapter
8 and 9. Harcourt Brace Jovanovich Publishers. Academic Press, Inc. USA. 476 pp.
APÉNDICES
APENDICE Nº 1 ANALISIS DE VARIANZA PARA PÉRDIDA DE PESO
Análisis de la Varianza paraPÉRDIDA DE PESO % - Sumas de Cuadrados de Tipo III--------------------------------------------------------------------------------Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor--------------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES A:TIPO DE HONGO 8,96809 1 8,96809 10,47 0,0028 B:NUTRIENTES 15,2276 1 15,2276 17,79 0,0002 C:TIEMPO 58,9518 1 58,9518 68,86 0,0000
INTERACCIONES AB 18,4145 1 18,4145 21,51 0,0001 AC 14,6652 1 14,6652 17,13 0,0002 BC 3,41056 1 3,41056 3,98 0,0545 ABC 7,00569 1 7,00569 8,18 0,0074
RESIDUOS 27,397 32 0,856155--------------------------------------------------------------------------------TOTAL (CORREGIDO) 154,04 39--------------------------------------------------------------------------------Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.
APENDICE Nº 2 CONTRASTE DE MUESTRAS MÚLTIPLES DUNCAN PARA PÉRDIDA DE PESO
Contraste Múltiple de Rangos DUNCAN para PÉRDIDA DE PESO % según TIPO DE HONGO
--------------------------------------------------------------------------------Método: 95,0 porcentaje LSDTIPO DE HONGO Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos--------------------------------------------------------------------------------167 20 9,8215 0,2069 X 140 20 10,7685 0,2069 X--------------------------------------------------------------------------------Contraste Diferencias +/- Límites--------------------------------------------------------------------------------140 - 167 *0,947 0,59601 --------------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa. Contraste Múltiple de Rangos DUNCAN para PÉRDIDA DE PESO % según NUTRIENTES
--------------------------------------------------------------------------------Método: 95,0 porcentaje LSDNUTRIENTES Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos--------------------------------------------------------------------------------SI 20 9,678 0,2069 X NO 20 10,912 0,2069 X--------------------------------------------------------------------------------Contraste Diferencias +/- Límites--------------------------------------------------------------------------------NO - SI *1,234 0,59601 --------------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa. Contraste Múltiple de Rangos DUNCAN para PÉRDIDA DE PESO % según TIEMPO
--------------------------------------------------------------------------------Método: 95,0 porcentaje LSDTIEMPO Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos--------------------------------------------------------------------------------30 20 9,081 0,2069 X 45 20 11,509 0,2069 X--------------------------------------------------------------------------------Contraste Diferencias +/- Límites--------------------------------------------------------------------------------30 - 45 *-2,428 0,59601 --------------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa.
APENDICE Nº 3 ANALISIS DE VARIANZA PARA CRECIMIENTO RADIAL Análisis de la Varianza paraCREC RADIAL mm - Sumas de Cuadrados de Tipo III--------------------------------------------------------------------------------Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor--------------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES A:TIPO DE HONGO 0,741125 1 0,741125 8,72 0,0094 B:NUTRIENTES 0,206045 1 0,206045 2,42 0,1391
INTERACCIONES AB 0,000125 1 0,000125 0,00 0,9699
RESIDUOS 1,36056 16 0,085035--------------------------------------------------------------------------------TOTAL (CORREGIDO) 2,30786 19--------------------------------------------------------------------------------Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.
APENDICE Nº 4 CONTRASTE DE MUESTRAS MÚLTIPLES DUNCAN PARA CRECIMIENTO RADIAL
Contraste Múltiple de Rangos DUNCAN para CREC RADIAL mm según TIPO DE HONGO
--------------------------------------------------------------------------------Método: 95,0 porcentaje LSDTIPO DE HONGO Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos--------------------------------------------------------------------------------140 10 8,169 0,0922144 X 167 10 8,554 0,0922144 X--------------------------------------------------------------------------------Contraste Diferencias +/- Límites--------------------------------------------------------------------------------140 - 167 *-0,385 0,276459 --------------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa.
APENDICE Nº 5 ANALISIS DE VARIANZA PARA CAPACIDAD ENZIMÁTICA Análisis de la Varianza paraCAP ENZIMÁTICA mm - Sumas de Cuadrados de Tipo III--------------------------------------------------------------------------------Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor--------------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES A:TIPO DE HONGO 0,588245 1 0,588245 6,94 0,0181 B:NUTRIENTES 0,016245 1 0,016245 0,19 0,6675
INTERACCIONES AB 0,310005 1 0,310005 3,66 0,0740
RESIDUOS 1,35688 16 0,084805--------------------------------------------------------------------------------TOTAL (CORREGIDO) 2,27137 19--------------------------------------------------------------------------------Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.
APENDICE Nº 6 CONTRASTE DE MUESTRAS MÚLTIPLES DUNCAN PARA CAPACIDAD ENZIMÁTICA
Contraste Múltiple de Rangos DUNCAN para CAP ENZIMÁTICA mm según TIPO DE HONGO
--------------------------------------------------------------------------------Método: 95,0 porcentaje LSDTIPO DE HONGO Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos--------------------------------------------------------------------------------140 10 3,296 0,0920896 X 167 10 3,639 0,0920896 X--------------------------------------------------------------------------------Contraste Diferencias +/- Límites--------------------------------------------------------------------------------140 - 167 *-0,343 0,276085 --------------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa.
APENDICE Nº 7 RESULTADOS EXPERIMENTALES DE PÉRDIDA DE PESO
30 DÍAS HONGO 167
matraz Nutrientes W matraces (g) W chips (g) W total (g) W final (g) W pérdida (g) % Pp. 8 CN 175,08 10 185,08 184,28 0,8 8,00
17 CN 173,98 10,41 184,39 183,63 0,76 7,30 18 CN 161,25 10,08 171,33 170,5 0,83 8,23 21 CN 177,27 10,67 187,94 187,02 0,92 8,62
23 CN 158,95 10,78 169,73 168,86 0,87 8,07
Prom: 8,05
D.Estandar : 0,48
Var: 0,23
matraz Nutrientes W matraces (g) W chips (g) W total (g) W final (g) W pérdida (g) % Pp. 2 SN 141,99 10,68 152,67 151,63 1,04 9,74
11 SN 174,35 10,21 184,56 183,56 1 9,79 12 SN 146,49 10,59 157,08 155,97 1,11 10,48 13 SN 158,33 10,16 168,49 167,45 1,04 10,24
26 SN 148,81 10,12 158,93 157,75 1,18 11,66
Prom: 10,38
D.Estandar : 0,78
Var: 0,61 45 DÍAS HONGO 167
matraz Nutrientes W matraces (g) W chips (g) W total (g) W final (g) W pérdida (g) % Pp. 3 CN 174,01 10,4 184,41 183,5 0,91 8,75 5 CN 144,09 10,36 154,45 153,53 0,92 8,88
10 CN 174,59 10,52 185,11 184,14 0,97 9,22 14 CN 153,54 10,07 163,61 162,68 0,93 9,24
24 CN 179,01 10,06 189,07 188,17 0,9 8,95
Prom: 9,01
D.Estandar : 0,21
Var: 0,05
matraz Nutrientes W matraces (g) W chips (g) W total (g) W final (g) W pérdida (g) % Pp. 6 SN 160,61 10,24 170,85 169,65 1,2 11,72
22 SN 177,66 10,48 188,14 186,76 1,38 13,17 28 SN 178,46 10,37 188,83 187,65 1,18 11,38 29 SN 172,95 10,16 183,11 181,94 1,17 11,52
31 SN 176,21 10,46 186,67 185,47 1,2 11,47
Prom: 11,85
D.Estandar : 0,75
Var: 0,56
30 DÍAS HONGO 140
matraz Nutrientes W matraces (g) W chips (g) W total (g) W final (g) W pérdida (g) % Pp. 4 CN 174,35 10,25 184,6 183,84 0,76 7,41 5 CN 139,9 10,55 150,45 149,69 0,76 7,20 9 CN 175,08 10,42 185,5 184,73 0,77 7,39
14 CN 173,99 10,38 184,37 183,37 1 9,63
20 CN 154,21 10,23 164,44 163,43 1,01 9,87 Prom: 8,30
D.Estandar : 1,33
Var: 1,77
matraz Nutrientes W matraces (g) W chips (g) W total (g) W final (g) W pérdida (g) % Pp. 13 SN 160,6 10,42 171,02 170,11 0,91 8,73 21 SN 177,73 10,14 187,87 186,91 0,96 9,47 24 SN 181,64 10,72 192,36 191,17 1,19 11,10 25 SN 174,59 10,24 184,83 183,82 1,01 9,86
30 SN 177,63 10,08 187,71 186,82 0,89 8,83 Prom: 9,60
D.Estandar : 0,96
Var: 0,92 45 DIAS HONGO 140
matraz Nutrientes W matraces (g) W chips (g) W total (g) W final (g) W pérdida (g) % Pp. 2 CN 149,01 10,3 159,31 158,07 1,24 12,04 6 CN 166,66 10,31 176,97 175,45 1,52 14,74
11 CN 158,95 10,78 169,73 168,49 1,24 11,50 16 CN 153,48 10,48 163,96 162,49 1,47 14,03
22 CN 167,89 10,28 178,17 176,68 1,49 14,49 Prom: 13,36
D.Estandar : 1,49
Var: 2,21
matraz Nutrientes W matraces (g) W chips (g) W total (g) W final (g) W pérdida (g) % Pp. 15 SN 173,11 10,49 183,6 182,45 1,15 10,96 18 SN 153,52 10,62 164,14 162,94 1,2 11,30 26 SN 178,29 10,31 188,6 187,28 1,32 12,80 27 SN 163,04 10,36 173,4 172,15 1,25 12,07
29 SN 154,86 10,88 165,74 164,44 1,3 11,95 Prom: 11,82
D.Estandar : 0,72
Var: 0,51
APENDICE Nº 8 RESULTADOS EXPERIMENTALES DE CRECIMIENTO RADIAL
Crec. Radial Hongo 167 CN Delta CREC RADIAL (mm) Delta 1 Delta 2 Delta 3 Delta 4 Delta 5 Delta 6 Prom muestra
1 8,75 8,75 8 9,25 8,25 8,5 8,58 3 8 9 8,25 8 8,25 8,75 8,38 4 7,75 8 9,5 9 7,25 8 8,25 5 8,75 9,25 7,75 8,75 9,25 7,75 8,58 6 8,5 9,75 7,25 8,75 8,25 8,25 8,46 Prom dispersion
Prom: 8,35 8,95 8,15 8,75 8,25 8,25 8,450 Desv.Estandar 0,45 0,65 0,84 0,47 0,71 0,40 0,585
Varianza: 0,21 0,42 0,71 0,22 0,50 0,16 0,368
Crec. Radial Hongo 167 SN
Delta CREC RADIAL (mm) Delta 1 Delta 2 Delta 3 Delta 4 Delta 5 Delta 6 Prom muestra 2 8 9 8,75 8,25 8,25 7,25 8,25 3 7,75 9,75 9,75 8 8,25 9,25 8,79 5 8,75 9,25 9,25 8,75 8,25 8 8,71 8 10 10,25 9 8 9,5 9,25 9,33 9 8 9 8,5 8,75 7,25 7,75 8,21 Prom dispersion
Prom: 8,50 9,45 9,05 8,35 8,30 8,30 8,658 Desv.Estandar 0,92 0,54 0,48 0,38 0,80 0,91 0,671
Varianza: 0,84 0,29 0,23 0,14 0,64 0,83 0,496
Crec. Radial Hongo 140 CN Delta CREC RADIAL (mm) Delta 1 Delta 2 Delta 3 Delta 4 Delta 5 Delta 6 Prom muestra
1 9,75 6,75 7,75 8,5 8 8,5 8,21 2 10 7,25 8,25 8,25 8,25 9,75 8,63 3 9 8,25 8,25 7,75 8,75 9 8,50 4 9 7,25 6,75 8 8,75 8,75 8,08 6 8,5 7,25 7 8,25 7,75 8,75 7,92
Prom dispersión
Prom: 9,44 7,38 7,75 8,13 8,44 9,00 8,35
Desv.Estandar: 0,52 0,63 0,71 0,32 0,38 0,54 0,51
Varianza: 0,27 0,40 0,50 0,10 0,14 0,29 0,28 Crec. Radial Hongo 140 SN Delta CREC RADIAL (mm) Delta 1 Delta 2 Delta 3 Delta 4 Delta 5 Delta 6 Prom muestra
1 9 7,5 7 8 7,5 8,5 7,92 2 9,75 7,5 6,75 8,5 7,75 7 7,88 3 9,25 7,75 7,75 8 7,75 8,75 8,21 6 9 7,25 8 9 7,75 8 8,17
7 10,25 7,5 7 8,25 7,25 8,75 8,17
Prom dispersión
Prom: 9,25 7,43 7,32 8,36 8,43 7,64 8,07
Desv.Estandar 0,35 0,24 0,49 0,40 1,43 1,14 0,68
Varianza: 0,13 0,04 0,35 0,23 0,02 0,60 0,23
CREC.RADIAL 167-CN
DIA Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7
Nº P.P./ RADIO mm Prom Prom Prom Prom Prom Prom Prom
1 11,5 20,25 29 37 46,25 54,5 63
3 11,5 19,5 28,5 36,75 44,75 53 61,75
4 10,5 18,25 26,25 35,75 44,75 52 60
5 7,5 16,25 25,5 33,25 42 51,25 59
6 12 20,5 30,25 37,5 46,25 54,5 62,75
PROM 10,6 18,95 27,9 36,05 44,8 53,05 61,3
CREC.RADIAL 167-SN
DIA Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7
Nº P.P./ RADIO mm prom prom prom prom prom prom prom
2 10,25 18,25 27,25 36 44,25 52,5 59,75
3 9,75 17,5 27,25 37 45 53,25 62,5
5 16,5 25,25 34,5 43,75 52,5 60,75 68,75
8 7,5 17,5 27,75 36,75 44,75 54,25 63,5
9 13,25 21,25 30,25 38,75 47,5 54,75 62,5
prom 11,45 19,95 29,4 38,45 46,8 55,1 63,4
CREC.RADIAL 140-CN
DIA Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7
Nº P.P./ RADIAL mm prom prom prom prom prom prom prom
1 10 19,75 26,5 34,25 42,75 50,75 59,25
2 10 20 27,25 35,5 43,75 52 61,75
3 9,25 18,25 26,5 34,75 42,5 51,25 60,25
4 10,5 19,5 26,75 33,5 41,5 50,25 59
6 10,25 18,75 26 33 41,25 49 57,75
Prom 10 19,25 26,6 34,2 42,35 50,65 59,6
CREC.RADIAL 140-SN
DIA Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7
Nº P.P./ RADIO mm prom prom prom prom prom prom prom
1 11,25 20,25 27,75 34,75 42,75 50,25 58,75
2 12,25 22 29,5 36,25 44,75 52,5 59,5
3 10 19,25 27 34,75 42,75 50,5 59,25
6 13 22 29,25 37,25 46,25 54 62
7 11,25 21,5 29 36 44,25 51,5 60,25
PROM 11,55 21 28,5 35,8 44,15 51,75 59,95
APENDICE Nº 9 RESULTADOS EXPERIMENTALES DE CAPACIDAD ENZIMATICA
Cap.Enzimática Hongo 167 CN Delta Radio Halo (mm) Delta 1 Delta 2 Delta 3 Delta 4 Delta 5 Delta 6 Prom muestra
2 3,25 4 3,25 3,25 3,15 4,25 3,53 4 3,75 4 3,25 2,25 3,4 4,25 3,48 8 4,25 3,5 3 3 3,9 3,5 3,53 9 4,25 3,5 3,5 3 3,4 3,75 3,57
11 4,5 3 2,75 2,5 3,9 3,25 3,32 Prom.dispersión
Prom: 4,00 3,60 3,15 2,80 3,55 3,80 3,48 Desv.Estandar 0,50 0,42 0,29 0,41 0,34 0,45 0,40
Varianza: 0,25 0,18 0,08 0,17 0,11 0,20 0,16 Cap.Enzimática Hongo 167 SN
Delta Radio Halo (mm) Delta 1 Delta 2 Delta 3 Delta 4 Delta 5 Delta 6 Prom muestra 1 4,25 3,25 2,5 2,75 4,25 3,5 3,42 2 5,25 5 1,75 2,5 4 3 3,58 3 4,75 3,25 2,25 3 4,5 4,25 3,67 5 5,5 2,25 3,5 3,25 5,5 3,75 3,96 8 5,75 3,25 3 4 4 6 4,33 Prom.dispersión
Prom: 5,10 3,40 2,60 3,10 4,45 4,10 3,79 Desv.Estandar 0,60 0,99 0,68 0,58 0,62 1,15 0,77
Varianza: 0,36 0,99 0,46 0,33 0,39 1,33 0,64
Cap.Enzimática Hongo 140 CN Delta Radio Halo (mm) Delta 1 Delta 2 Delta 3 Delta 4 Delta 5 Delta 6 Prom muestra
2 3 3,75 4,25 3 3,5 2,75 3,38 3 3,75 4,25 3,5 2,75 2,5 2,75 3,25 4 3 3,25 3,5 2,75 3,25 2,5 3,04 5 4,75 4,5 3,75 4 3,75 3,25 4,00 7 3,75 2 4 3,5 3 3,5 3,29
Prom dispersion
Prom: 3,65 3,55 3,80 3,20 3,20 2,95 3,39
Desv.Estandar 0,72 0,99 0,33 0,54 0,48 0,41 0,58
Varianza: 0,52 0,98 0,11 0,29 0,23 0,17 0,38
Cap.Enzimática Hongo 140 SN Delta Radio Halo (mm) Delta 1 Delta 2 Delta 3 Delta 4 Delta 5 Delta 6 Prom muestra
1 3,00 3,25 3,75 2,75 2,00 2,25 2,83 2 3,75 3,50 3,75 2,75 3,00 2,75 3,04 3 3,00 4,00 3,75 3,25 2,75 3,00 3,27 4 3,50 4,25 4,00 2,50 3,25 3,25 3,38 6 4,00 3,25 3,50 4,25 2,50 3,50 3,48
Prom dispersion
Prom: 3,45 3,65 3,75 3,10 2,70 2,95 3,27
Desv.Estandar: 0,45 0,45 0,18 0,70 0,48 0,48 0,46
Varianza: 0,20 0,21 0,03 0,49 0,23 0,23 0,23
CAP.ENZIMATICA 167-CN
DIA Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Nº P.P./ RADIO HALO mm Prom Prom Prom Prom Prom Prom Prom
2 9 12,25 16,25 19,5 22,75 25,9 30,15 4 9 12,75 16,75 20 22,25 25,65 29,9 8 8,25 12,5 16 19 22 25,9 29,4 9 7,25 11,5 15 18,5 21,5 24,9 28,65
11 10,75 15,25 18,25 21 23,5 27,4 30,65
PROM 8,85 12,85 16,45 19,6 22,4 25,95 29,75
CAP.ENZIMÁTICA 167-SN
DIA Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Nº P.P./ RADIO. HALO mm prom prom prom prom prom prom prom
1 10 14,25 17,5 20 22,75 27 30,5 2 16,5 21,75 26,75 28,5 31 35 38 3 17,75 22,5 25,75 28 31 35,5 39,75 5 11,75 17,25 19,5 23 26,25 31,75 35,5
8 13,5 19,25 22,5 25,5 29,5 33,5 39,5
prom 13,9 19 22,4 25 28,1 32,55 36,65
CAP.ENZIMATICA 140 -CN
DIA Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Nº P.P./ RADIO HALO Prom Prom Prom Prom Prom Prom Prom
2 10,5 13,5 17,25 21,5 24,5 28 30,75 3 9,25 13 17,25 20,75 23,5 26 28,75 4 9,5 12,5 15,75 19,25 22 25,25 27,75 5 2,75 7,5 12 15,75 19,75 23,5 26,75
7 11,75 15,5 17,5 21,5 25 28 31,5
PROM 8,75 12,4 15,95 19,75 22,95 26,15 29,1
CAP.ENZIMÁTICA 140 - SN
DIA Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Nº P.P./ RADIO HALO prom prom prom prom prom prom prom
1 11,75 14,75 18 21,75 24,5 26,5 28,75 2 7 10,75 14,25 18 20,75 23,75 26,5 3 7,75 10,75 14,75 18,5 21,75 24,5 27,5 4 6,75 10,25 14,5 18,5 21 24,25 27,5
6 10,5 14,5 17,75 21,25 25,5 28 31,5
PROM 8,75 12,2 15,85 19,6 22,7 25,4 28,35