universidad central del ecuador … · diseño factorial 2k. ... se utilizó un diseño factorial...

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

CARRERA DE INGENIERÍA QUIMÍCA

PRODUCCIÓN DE BIODIESEL A PARTIR DE GRASA DE RES POR VÍA ENZIMÁTICA

TRABAJO DE GRADO PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERO QUÍMICO

AUTOR: ANDREA GISSELLE CASTELLANOS BECERRA

TUTORA: ING. LORENA ELIZABETH VILLARREAL VILLOTA, M. Sc.

QUITO

2015

iii

APROBACION DEL TUTOR

Certifico que el trabajo de grado titulado: “PRODUCCIÓN DE BIODIESEL A PARTIR

DE GRASA DE RES POR VÍA ENZIMÁTICA”, es original y ha sido desarrollada por la Srta.

Andrea Gisselle Castellanos Becerra, bajo mi dirección y conforme a todas las observaciones

realizadas.

En la ciudad de Quito, a los 27 días del mes de Febrero de 2015

iv

AUTORIZACION DE LA AUTORIA INTELECTUAL

Yo, ANDREA GISSELLE CASTELLANOS BECERRA en calidad de autor del trabajo

de grado realizado sobre PRODUCCION DE BIODIESEL A PARTIR DE GRASA DE

RES POR VIA ENZIMATICA, por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD

CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o

de parte de los que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de

investigación.

Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente

autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los

artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su

Reglamento.

En la ciudad de Quito a los 27 días del mes febrero de 2015

v

Con todo mi amor a mi madre Lucía,

a mis abuelos Hernando y Gloria,

a toda mi familia

vi

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Central del Ecuador por ser el establecimiento que abriga un gran

conocimiento y cultura donde generaciones de profesionales se han formado. A la muy querida

Facultad de Ingeniería Química donde he obtenido todos los conocimientos necesarios para mi

formación profesional.

A la Ing. Lorena Villarreal por su generosa y paciente colaboración el la realización de este

trabajo y los conocimientos compartidos.

A la empresa Granotec por la gentil donación de las enzimas necesarias para los ensayos

realizados en esta tesis.

A mi familia, por su incondicional apoyo en todas las etapas de este gran proyecto, en especial a

mi madre, pilar fundamental que me ha guiado y alentado en cada emprendimiento, sin su

paciencia y entrega nada de esto seria posible.

A David por su paciencia y comprensión durante este viaje, por iluminar mis días y siempre

estar ahí para mi.

A todos mis compañeros y amigos que me apoyaron durante todo el curso de mis estudios.

vii

CONTENIDO

pág.

LISTA DE TABLAS .................................................................................................................... xi

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................. xii

LISTA DE ANEXOS ................................................................................................................. xiii

RESUMEN ................................................................................................................................. xiv

ABSTRACT ................................................................................................................................ xv

INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 1

1. MARCO TEORICO .............................................................................................................. 3

1.1. Biodiesel ............................................................................................................................ 3

1.1.1. Definición. ........................................................................................................................... 3

1.1.2. Características. ................................................................................................................... 3

1.1.3. Requisitos. ........................................................................................................................... 4

1.1.4. Antecedentes del uso del biodiesel. ..................................................................................... 5

1.1.5. Demanda de Biodiesel en el Ecuador. ................................................................................ 5

1.1.6. Producción de Biodiesel. ..................................................................................................... 5

1.1.7. Materias primas utilizadas para la elaboración de biodiesel. ............................................ 5

1.2. Grasa de Res ........................................................................................................................... 7

1.2.1. Características. ................................................................................................................... 7

1.2.2. Composición teórica. .......................................................................................................... 7

1.2.3. Fundamentos del análisis físico químico de la grasa de res. .............................................. 8

1.3. Combustibles de primera, segunda y tercera generación. ...................................................... 9

1.4. Tecnologías para obtención de biodiesel.............................................................................. 10

1.4.1. Micro emulsiones. ............................................................................................................. 10

1.4.2. Pirólisis. ............................................................................................................................ 10

1.4.3. Transesterificación. ........................................................................................................... 11

1.4.3.1. Transesterificación química. .......................................................................................... 12

1.4.3.2. Transesterificación enzimática. ..................................................................................... 13

viii

1.4.3.3. Uso de co-solvente. ........................................................................................................ 13

1.4.3.4. Condiciones de operación supercríticas. ....................................................................... 13

1.4.3.5. Método de reacción ultrasónica. .................................................................................... 13

1.4.3.6. Método de microondas. .................................................................................................. 14

1.5. Variables que afectan la transesterificación ......................................................................... 14

1.5.1. Relación molar alcohol – grasa. ....................................................................................... 14

1.5.2. Temperatura. ..................................................................................................................... 14

1.5.3. pH. ..................................................................................................................................... 15

1.5.4.Tipo de alcohol. .................................................................................................................. 15

1.5.5. Uso de solvente. ................................................................................................................ 15

1.5.6. Contenido de agua. ........................................................................................................... 15

1.5.7. Desactivación enzimática por alcohol. ............................................................................. 16

1.6. Enzimas ................................................................................................................................ 16

1.7. Lipasas .................................................................................................................................. 17

1.7.1. Lipasas vegetales............................................................................................................... 17

1.7.2. Lipasas de microorganismos. ............................................................................................ 18

1.7.2.1. Lipasa Extracelular. ....................................................................................................... 18

1.7.2.2. Lipasa Intracelular. ........................................................................................................ 18

1.7.3.Selectividad de las lipasas. ................................................................................................. 18

1.7.4. La lipasa de Rhizopus oryzae. ........................................................................................... 19

1.8. Reactores para la transesterificación enzimática. ................................................................. 20

1.9. Glicerol ................................................................................................................................. 20

1.10. Espectroscopia infrarroja .................................................................................................... 21

1.11. Cromatografía de gases ...................................................................................................... 22

1.12. Diseño factorial .................................................................................................................. 23

1.12.1. Diseño factorial 2k. ......................................................................................................... 23

1.12.2. Metodología de superficie de respuesta. ......................................................................... 24

2. MARCO EXPERIMENTAL ............................................................................................... 26

2.1. Materiales y equipos............................................................................................................. 26

2.2. Sustancias y reactivos........................................................................................................... 27

2.3. Diagrama de Flujo ................................................................................................................ 27

2.4. Caracterización de la grasa de res ........................................................................................ 29

2.5. Extracción de la grasa de res ................................................................................................ 29

2.6. Preparación de la solución de enzima .................................................................................. 29

2.7. Obtención del biodiesel ........................................................................................................ 29

ix

2.8. Separación del biodiesel ....................................................................................................... 29

2.9. Diseño experimental ............................................................................................................. 30

2.10. Influencia de la cantidad de agua en la reacción de transesterificación ............................. 31

2.11. Espectroscopía infrarroja .................................................................................................... 32

2.12. Cromatografía de gases ...................................................................................................... 32

3. DATOS ............................................................................................................................... 33


3.2. Rendimiento de biodiesel ..................................................................................................... 33

4. CALCULOS ............................................................................................................................ 36



4.2.1. Cálculo modelo para N=1 usando metanol. ...................................................................... 37

5. RESULTADOS ....................................................................................................................... 38




5.4. Caracterización del Biodiesel ............................................................................................... 43

5.4.1 Espectroscopía infrarroja. ................................................................................................. 43

5.4.2. Cromatografía de gases. ................................................................................................... 44

5.5 Análisis Estadístico ............................................................................................................... 46

5.5.1. Regresión múltiple de los datos obtenidos. ....................................................................... 46

5.5.1.1. Regresión múltiple para la reacción usando metanol. ................................................... 47

5.5.1.2. Regresión múltiple para la reacción usando etanol. ..................................................... 48

5.6. Optimización del método ..................................................................................................... 49

5.6.1. Optimización del método para la reacción con metanol................................................... 49

5.6.2. Optimización del método para la reacción con etanol. .................................................... 52

6. DISCUSION ........................................................................................................................... 55

6.1. Extracción de grasa de res .................................................................................................... 55


6.3. Obtención de Biodiesel ........................................................................................................ 56

6.4. Rendimiento de Biodiesel .................................................................................................... 57

6.5. Análisis estadístico ............................................................................................................... 57

x


7. CONCLUSIONES .................................................................................................................. 59




7.4. Caracterización del biodiesel ............................................................................................... 60

7.5 Rendimiento de Biodiesel ..................................................................................................... 60

7.6. Análisis estadístico ............................................................................................................... 60


8. RECOMENDACIONES ......................................................................................................... 62



8.3. Rendimiento de Biodiesel .................................................................................................... 63

CITAS BIBLIOGRAFICAS ....................................................................................................... 64

BIBLIOGRAFIA ......................................................................................................................... 69

ANEXOS..................................................................................................................................... 70

xi

LISTA DE TABLAS

pág.

Tabla 1. Requisitos para Biodiesel: norma ASTM D6751 ........................................................................ 4

Tabla 2. Composición teórica de la grasa de res ........................................................................................... 8

Tabla 3. Fundamentos del análisis físico químico ....................................................................................... 9

Tabla 4. Factores constantes del proceso ...................................................................................................... 31

Tabla 5. Datos Experimentales generados en Statgraphics ..................................................................... 31

Tabla 6. Datos experimentales de la extracción de la grasa de res ....................................................... 33

Tabla 7. Peso de biodiesel obtenido ................................................................................................................ 34

Tabla 8. Pesos moleculares ................................................................................................................................ 34

Tabla 9. Porcentaje de rendimiento de biodiesel usando diferentes proporciones de agua ........... 35

Tabla 10. Porcentaje de Rendimiento de la extracción de la grasa de res .......................................... 38

Tabla 11. Propiedades Fisicoquímicas de la Grasa de Res ...................................................................... 39

Tabla 12. Perfil Lipídico de la Grasa de Res ............................................................................................... 40

Tabla 13. Porcentaje de Rendimiento de Biodiesel ................................................................................... 41

Tabla 14. Porcentaje de Rendimiento de Biodiesel variando la proporción de agua ...................... 42

Tabla 15. Regresión múltiple para la reacción usando metanol ............................................................. 47

Tabla 16. Regresión múltiple para la reacción usando etanol ................................................................ 48

Tabla 17. Variables respuesta a ser medidas ................................................................................................ 49

Tabla 18. Factores experimentales que van a variar .................................................................................. 49

Tabla 19. Selección del diseño experimental ............................................................................................... 49

Tabla 20. Modelo a ajustar a los resultados del experimento ................................................................. 49

Tabla 21. Factores establecidos y Óptimo para la reacción con metanol ........................................... 50

Tabla 22. Factores establecidos y Óptimo para la reacción con etanol ............................................... 52

xii

LISTA DE FIGURAS

pág.

Figura 1. Reacción de transesterificación de un aceite con alcohol. .................................................... 11

Figura 2. Esquema ilustrativo de la concentración de componentes durante la

transesterificación. ................................................................................................................................................ 12

Figura 3. Representación tridimensional de la lipasa de Rhizopus oryzae. ....................................... 19

Figura 4. Diagrama de bloques de un espectrómetro infrarrojo de transformadas de

Fourier de haz simple. ......................................................................................................................................... 22

Figura 5. Diagrama de bloques de un cromatógrafo de gases típico .................................................... 23

Figura 6. Representación del diseño factorial 22 ....................................................................................... 24

Figura 7. Representación y construcción del diseño de composición central para

k=2 factores ............................................................................................................................................................ 25

Figura 8. Diagrama de Flujo del proceso de transesterificación enzimática ...................................... 28

Figura 9. Diagrama de Bloque .......................................................................................................................... 30

Figura: 10. Cromatograma correspondiente al perfil lipídico de la grasa de res .............................. 39

Figura 11. Resumen de resultados del porcentaje de rendimiento de Biodiesel ............................... 42

Figura 12. Resumen de resultados del porcentaje de rendimiento de biodiesel

usando diferentes proporciones de agua ........................................................................................................ 43

Figura 13. Espectrograma del Biodiesel obtenido ...................................................................................... 44

Figura 14. Espectrograma del Diesel de petróleo ....................................................................................... 44

Figura 15. Cromatografía de gases de la grasa de res ............................................................................... 45

Figura 16. Cromatografía de Gases del Biodiesel ...................................................................................... 46

Figura 17. Efectos principales para el porcentaje de rendimiento de la reacción con

metanol ..................................................................................................................................................................... 50

Figura 18. Superficie de respuesta estimada de la reacción con metanol ........................................... 51

Figura 19. Contornos de la superficie de respuesta estimada de la reacción con

metanol ..................................................................................................................................................................... 52

Figura 20. Efectos principales para el porcentaje de rendimiento de la reacción con etanol ....... 53

Figura 21. Superficie de respuesta estimada de la reacción con etanol ............................................... 53

Figura 22. Contornos de la superficie de respuesta estimada de la reacción con etanol ................ 54

xiii

LISTA DE ANEXOS

pág.

ANEXO A. Hoja Técnica de la Enzima de Rhizopus Oryzae .................................................71

ANEXO B. Resultados del Análisis Fisicoquímico de la grasa de res ....................................73

ANEXO C. Resultados del índice de yodo de la grasa de res ..................................................74

ANEXO D. Resultados del perfil lipídico de la grasa de res ...................................................75

ANEXO E. Reporte fotográfico ...............................................................................................77

xiv

PRODUCCIÓN DE BIODIESEL A PARTIR DE GRASA DE RES POR VÍA

ENZIMÁTICA

RESUMEN

Obtención de biodiesel a partir de grasa de res, usando, como biocatalizador una solución de

lipasa de Rhizopus Oryzae, hexano como solvente para a mejorar la solubilidad del alcohol con

los demás componentes de la reacción y dos tipos de alcohol: etanol y metanol.

Se utilizó un diseño factorial 22, en donde las variables evaluadas fueron: la cantidad de enzima

y la temperatura, en 10 pares experimentales. La temperatura varió de 32,76°C a 41,2°C y la

cantidad de enzima de 1,95% a 10% en peso. Usando el software Statgraphics se obtuvieron las

condiciones óptimas de operación para cada alcohol, siendo el metanol el que proporcionó la

mayor conversión. Con las condiciones óptimas se hicieron nuevos ensayos con metanol,

variando la concentración de agua de la solución: 0%, 30%, 50% y 70%. Se realizaron análisis

de espectroscopia infrarroja y cromatografía de gases al biodiesel para determinar

cualitativamente la presencia de esteres en el mismo.

El mejor rendimiento de la experimentación fue del 71,34%, utilizando alcohol metílico, a 37°C

y 0,85 g de enzima y las condiciones óptimas de operación calculadas mediante el programa

estadístico fueron usando metanol; 0,60 g de enzima y a 39°C.

PALABRAS CLAVE: GRASA DE RES / LIPASAS / RHIZOPUS ORYZAE

/TRANSESTERIFICACIÓN ENZIMÁTICA/ BIODIESEL/OPTIMIZACIÓN/AGUA/

xv

THE PRODUCTION OF BIODIESEL FROM LIVESTOCK FAT THROUGH

ENZYMATIC CHANNELING

ABSTRACT

This research project considers the extraction of biodiesel from livestock fat, using lipase

solution called Rhizopus Oryzae as a biocatalyst, a solvent hexane un order to improve the

alcohol’s solubility with the rest of the reacting components, and two types of alcohol: ethane

and methane.

A 22 factorial design was employed, where the variables being assessed were: the quantity of

enzyme and temperature, down in 10 experimental pairs. The temperature varied from 32,76°C

to 41,2°C, and the amount of enzyme varied from 1,95% to 10% in weight. Using Statgraphics

software, the optimal operating conditions were obtained for each alcohol, methane being the

one that provide a higher level of conversion. New test were performed with methane in optimal

conditions, varying the concentration of water in the solution: 0%, 30%, 50% and 70%. Infrared

spectroscopy and chromatography of gas to biodiesel were analyzed in order to qualitatively

determine the presence of esters.

The best result of the experiment was 71,34%, using methylated spirits at 37°C and 0,85 g of

enzyme, and the optimal operating conditions calculated by a statistic program were with

methane: 0,60 g of enzyme at 39°C.

KEY WORDS: /LIVESTOCK FAT / LIPASES / RHIZOPUS ORYZAE

/TRANSESTERIFICATION/ ENZYMES/ BIODIESEL/OPTIMIZATION/

1

INTRODUCCIÓN

En la actualidad, la dependencia de los combustibles fósiles representa un gran problema para el

planeta en cuanto a contaminación y a la limitada cantidad de este recurso, esto hace que la

búsqueda de nuevas tecnologías para la producción de energía limpia sea una prioridad para las

nuevas generaciones de investigadores. Actualmente, aunque existen muchos trabajos sobre la

producción de biodiesel a través de diferentes procesos, la elaboración de este producto a nivel

industrial aun necesita mejorarse. Este es un campo que requiere mucha investigación para

poder obtener biodiesel de manera sostenible, aprovechando de ser posible desechos de otras

industrias y causando el menor impacto ambiental.

El producir biodiesel proveniente de grasa de res tiene algunas ventajas sobre las fuentes

tradicionales de triglicéridos como los aceites vegetales. La grasa de res es un recurso que

generalmente es descartado sin darle un uso posterior, está disponible todo el año y cada vez en

mayor cantidad por la creciente demanda de cárnicos. Al no constituir una fuente de alimento

para los humanos, no se vulnera la seguridad alimentaria.

El uso de enzimas tiene algunas ventajas sobre los procesos que usan catalizadores

homogéneos, la principal es que el desperdicio del agua es mínimo en contraste con la

transesterificación homogénea que necesita gran cantidad de agua para eliminar el catalizador

del biodiesel.

El objetivo del trabajo es obtener biodiesel mediante transesterificación por vía enzimática,

usando grasa de res como fuente de triglicéridos y lipasa de Rhizopus Oryzae como catalizador.

Analizar el uso de alcohol etílico y metílico como reactivos; buscar las condiciones de

temperatura y cantidad de enzima que proporciona el mejor rendimiento de la reacción de

transesterificación; finalmente determinar la influencia que tiene el agua sobre el rendimiento de

la reacción.

Previo a obtener el biodiesel por vía enzimática, se realizó la caracterización de la grasa, esto se

hizo determinando propiedades como: densidad, índice de refracción, índice de yodo, índice de

peróxido, índice de saponificación, índice de acidez y perfil lipídico. Con el fin de encontrar la

mejor condición de operación, se utilizó un modelo factorial 22, tomando como factores la

2

cantidad de enzima y la temperatura, manteniendo constante el resto de variables: tiempo de

reacción, pH, cantidad de alcohol, solvente y grasa. Cada ensayo se hizo usando primero

alcohol etílico y luego alcohol metílico. Para el análisis de los datos se empleó el método de

superficie de respuesta y con la ayuda del programa Statgraphics se encontró la condición de

operación que proporciona el mejor porcentaje de conversión de triglicéridos a ésteres de ácidos

grasos.

Finalmente se planteó el estudio de la influencia del agua en la reacción. Una vez obtenida la

mejor condición de operación, se adicionó agua en distintas proporciones, de 0% a 70%, para

establecer la cantidad agua que brinda una mayor conversión. Con el uso de la espectroscopia

infrarroja y cromatografía de gases se determinó que, en efecto, la sustancia resultante del

proceso al cual fue sujeta la grasa de res, es biodiesel.

Se puede afirmar que es posible obtener biodiesel por vía enzimática con los recursos

disponibles en el país. Es un proceso que si bien es amigable con el medio ambiente y puede ser

aplicado a grasas con alto contenido de ácidos grasos libres tarda mucho tiempo en realizarse y

aún debe resolver algunos problemas para poder ser llevado a escala industrial.

3

1. MARCO TEORICO

1.1. Biodiesel

1.1.1. Definición. Según la norma ecuatoriana INEN 2482:2009, se define al biodiesel como

una mezcla de ésteres monoalquílicos de ácidos grasos, de cadena larga y media, derivados de

aceites vegetales o grasas animales [1]. Este combustible puede ser utilizado en motores de

ignición con pocas modificaciones. La técnica más utilizada para producir biodiesel es la

transesterificación, esta reacción se puede llevar a cabo con distintos tipos de catalizadores y

condiciones de operación variadas [2]. Dependiendo del alcohol que se utilice, metanol o etanol,

la mezcla será de ésteres metílicos o etílicos respectivamente [3].

1.1.2. Características. El biodiesel es una fuente de energía limpia muy importante y una

alternativa al diésel de petróleo. Algunas de las ventajas de este combustible son su fácil

transportación por su alto punto de inflamación, siendo éste de alrededor 130°C frente al del

diesel que es de aproximadamente 60°C, el contenido de oxígeno es del 10 al 11% en masa lo

que ayuda a la combustión, presenta mejores propiedades lubricantes que el diésel generando

menos partículas de desgaste, posee un bajo contenido de aromáticos y azufre, alta eficiencia de

combustión y número de cetano mayor que el diésel, además es biodegradable y no tóxico.

Las desventajas del biodiesel son su alto precio, mayor viscosidad, menor contenido energético

que los derivados de petróleo, altos puntos de nube y vertido, mayor emisión de óxidos de

nitrógeno, produce una baja potencia y velocidad del motor, al ser un compuesto orgánico

puede absorber hasta 40 veces más agua que el diésel lo que genera oxidación en el sistema de

inyección, aumenta la conductividad eléctrica del combustible y puede crear un medio para la

proliferación de microorganismos, esto ocasiona corrosión y taponamientos [4].

La combustión del biodiesel produce gases que son menos nocivos para la salud, en

comparación con los derivados de petróleo, las emisiones de monóxido de carbono,

hidrocarburos no combustionados, sulfatos, material particulado, aromáticos policíclicos y

policíclicos nitrogenados son significativamente menores [5].

4

1.1.3. Requisitos. Existe una variedad de normas internacionales a partir de las cuales se rigen

distintos países del mundo para normalizar sus prácticas y productos, unas de las más conocidas

y aceptadas son las normas ASTM. En éste trabajo se tomará en cuanta estas normas como guía

en cuanto a los requisitos del biodiesel. La Tabla 1 muestra los requisitos para el biodiesel

según la norma ASTM D6752.

Tabla 1. Requisitos para Biodiesel: norma ASTM D6751

Fuente: st n y oan-Adrian (2011). Biodiesel Quality, Standards and

Properties, Biodiesel- Quality, Emissions and By-Products. Disponible en: http://www.intechopen.com/

books/biodiesel-quality-emissions-and-by-products/biodiesel-quality-standards-and-properties, p7.

Propiedad Método de

ensayo

Limites Unidades

min. máx.

Calcio y Magnesio, combinados EN 14538 – 5 ppm

(μg/g)

Punto de Inflamación (copa cerrada) D 93 93 – °C

Control de Alcohol (una debe coincidir):

1. Contenido de Metanol EN 14110 – 0.2 % (m/m)

2. Punto de Inflamación D93 130 – °C

Agua y Sedimentos D 2709 – 0.05 % (v/v)

Viscosidad Cinemática, a 40 °C D 445 1.9 6.0 mm2/sec.

Ceniza Sulfatada D 874 – 0.02 % (m/m)

Azufre: S Grado 15 D 5453 – 0.0015 % (m/m)

S Grado 500 D 5453 – 0.05 % (m/m)

Corrosión a la Lámina de Cobre D 130 – 3 No.

Cetano D 613 47 – –

Punto de Nube D 2500 reportar °C

Residuo de Carbón , 100% de la muestra D 4530 – 0.05 % (m/m)

Número de Acidez D 664 – 0.05 mg KOH/g

Glicerina Libre D 6584 – 0.020 % (m/m)

Glicerina Total D 6584 – 0.240 % (m/m)

Contenido de Fósforo D 4951 – 0.001 % (m/m)

Destilación Atmosférica equivalente

a la temperatura del 90% de recuperado D 1160 – 360 °C

Sodio/Potasio, combinados EN 14538 – 5 ppm

(μg/g)

Estabilidad de oxidación EN 15751 – 3 horas

http://www.intechopen.com/

5

1.1.4. Antecedentes del uso del biodiesel. Desde los años 1900 se tiene registro del uso de

biodiesel como combustible, en la feria de París se presentó un motor a diésel que funcionaba

con aceite de maní. Durante las siguientes décadas, a causa del bajo costo del diésel de petróleo,

la investigación en el campo del biodiesel no tuvo adelantos significativos. El 31 de agosto de

1937, el científico de la universidad de Bruselas, G. Chavanne obtuvo una patente para el

“Procedimiento para la transformación de aceites egetales y su uso como combustibles”

(Patente Belga 422,877). Esta patente describe la alcohólisis de aceites vegetales usando etanol

para separar los ácidos grasos del glicerol, reemplazando el glicerol por cadenas cortas de

alcoholes lineales. En 1970 la crisis energética hizo que los estudios relacionados al biodiesel

aumentaran y tuvieran relevancia rápidamente. En el período entre 2001 y 2009, la producción

de biodiesel en el mundo se incrementó mas de 16 veces [6].

1.1.5. Demanda de Biodiesel en el Ecuador. En el tercer trimestre del año 2013 la demanda

de derivados del petróleo en el país llegó a 22,5 millones de barriles; de esto, el 35,3%

corresponde a la demanda de diésel, es decir, que 7,94 millones de barriles de diésel fueron

necesarios para cubrir la demanda nacional [7]. Según el Decreto Oficial número 1303 firmado

el 17 de septiembre del 2012, el Presidente de la República, estableció que a partir de esa fecha

el diésel de petróleo comercializado en el país deberá contener un 5% de biodiesel y esta mezcla

aumentará en porcentaje hasta llegar al 10% en función de la oferta nacional. Se puede afirmar

entonces que la demanda de biodiesel en una mezcla al 5% con diésel de petróleo al tercer

trimestre del año 2013 fue de aproximadamente 1,13 millones de barriles.

1.1.6. Producción de Biodiesel. En los últimos años la producción de biodiesel se ha

incrementado aceleradamente. Para el año 2011, la U.S Energy Information Administration

informó que la producción mundial de éste combustible llegó a ser de 403,74 mil barriles por

día. En el Ecuador, la empresa La Fabril desde el año 2005 ha exportado a Estados Unidos,

Alemania y Perú 16,6 millones de galones de biodiesel, perfilándose como el principal

proveedor del país. Esta empresa instaló dos plantas de producción, una en Guayaquil y otra

Montecristi con una capacidad de producción de 12000 toneladas métricas de combustible al

mes. Solo en el año 2012, La Fabril exportó 20000 toneladas de biodiesel, siendo su principal

comprador PetroPerú [8].

1.1.7. Materias primas utilizadas para la elaboración de biodiesel. Tradicionalmente el

biodiesel es producido a partir de aceite vegetal. En países desarrollados, más del 95% de

materia prima es aceite comestible ya que el biodiesel producido a partir de estos aceites tiene

propiedades más similares al diésel [9]. Sin embargo, la producción de biodiesel a partir de

6

materias primas alternativas ha ido haciéndose más notoria. Estos materiales incluyen residuos

grasos animales y aceite de fritura, siendo más utilizadas en Canadá, México e Irlanda. Este

tipo de materia prima es ideal ya que tiene la ventaja de ser más barata, considerando que

solamente el aceite vegetal representa cerca del 85% del valor total de producción de biodiesel.

Las grasas animales por naturaleza son más viscosas y la mayoría sólidas a temperatura

ambiente. Con la transesterificación se obtiene biodiesel con un número de cetano más alto y

contenido calórico cercano al del diésel, el contenido de oxígeno mejora la combustión y la

relación aire/combustible es menor. Esta materia prima resuelve muchos conflictos relacionados

con la seguridad alimentaria, ya que al ser un desecho, ésta no se vería vulnerada [10]. La

síntesis de biodiesel a partir de aceite de algas se ha vuelto un tema de investigación muy

difundido al ser materia prima barata con una tasa de crecimiento y productividad elevadas. El

contenido de aceite en las algas oscila entre 20 y 40 %. Toleran la baja calidad del agua y

necesitan un espacio reducido para crecer. Aún así, la inversión tecnológica que se debe hacer

para la optimización del cultivo y extracción del aceite aún es elevada [11].

En el Ecuador, para la producción de biodiesel se utiliza principalmente aceite de palma. Existe

un excedente de producción de palma que sirve para la elaboración de este combustible. Según

la Fundación de Fomento de Exportaciones de Aceite de Palma y sus Derivados de Origen

Nacional (Fedepal), en el 2012 se produjeron 480 000 toneladas métricas, con un excedente de

270 000 toneladas; casi 100 000 más que el 2010, lo que da una tendencia al alza [12]. La

mayoría de materias primas para la producción de biodiesel pueden dividirse en las siguientes

categorías:

a) Aceites vegetales comestibles: girasol, soya, colza, palma, canola, coco, maní, mostaza,

salvado de arroz, etc.

b) Aceites vegetales no comestibles: piñón, micro algas, cártamo y linaza, etc.

c) Aceites residuales reciclados: aceite residual de fritura y aceite residual acidificado.

d) Grasas animales: grasa de matadero de animales, sebo de res, manteca de cerdo, grasa de

cordero, grasa de animales de corral, grasa de pollo, sebo de pato, etc. [13]

e) Aceites de microorganismos: Chlorela vulgaris, Botryococcus braunii, Chlorela

pyrenoidosa, etc [14].

7

1.2. Grasa de Res

La grasa de res se emplea ampliamente en margarinas y aceite de fritura, para aportar energía en

alimento para animales y en la industria oleoquímica como fuente de ácidos, ésteres, alcoholes,

jabones, para la producción de cosméticos, productos de cuidado personal, etc.

En el Distrito Metropolitano de Quito, en el año 2013 se faenaron 71476 reses. Se considera que

en promedio una res pesa 750 kg y que entre el 6 y el 12 % del peso del animal esta constituido

por grasa, cada año se puede disponer de aproximadamente 4,8 toneladas de grasa, lo que hace

que esta sea una gran fuente de materia prima que puede ser aprovechada. El uso que se le dé

dependerá principalmente de la calidad de la grasa. La grasa de res se encuentra dividida en

diferentes categorías de acuerdo con el punto de fusión de los ácidos grasos que la componen,

su color, contenido de ácidos grasos libres y contenidos de humedad, impurezas y material

insaponificable [15].

1.2.1. Características. La gran cantidad de ésteres de glicerol saturado que tiene la grasa

hace que el punto de fusión sea mayor, lo que es una cualidad importante para aplicaciones

donde la estructura y el cuerpo del producto son importantes. La grasa de res, por su contenido

de ácidos grasos saturados muestra una estabilidad oxidativa alta, pero por tener poco o ningún

contenido antioxidante puede deteriorarse más rápidamente que materiales derivados de aceites

vegetales con puntos de fusión parecidos. La grasa de res puede ser sometida a un extenso rango

de técnicas para desarrollar su uso como producto alimenticio. Esto incluye mezcla,

hidrogenación, fraccionamiento e interesterificación. Para propósitos oleoquímicos, es

comúnmente transformada en ácidos grasos libres que pueden ser fraccionados para producir

fracciones palmíticas, esteáricas y oleicas a varios niveles de pureza [16].

1.2.2. Composición teórica. Típicamente la grasa de res contiene ácido palmítico, esteárico

y oléico. Los componentes que principalmente se encuentran en menor proporción incluyen al

ácido mirístico y ácido linoléico.

Los ácidos de cadena impar, ramificados y con insaturaciones tipo trans están también

presentes. La grasa de res contiene cantidades pequeñas de fosfolípidos (<0,07%) y tocoferoles

(0,001%), esteroles; de 94 a 140 mg/100g de grasa, son casi enteramente colesterol [17].

En la Tabla 2 se detallan las proporciones de los ácidos grasos presentes en la grasa de res.

8

Tabla 2. Composición teórica de la grasa de res

Fuente: Norma Del Codex Para Grasas Animales Especificadas, CODEX STAN 211 (1999).

Disponible en: http://www.codexalimentarius.org/standards/list-standards/es/?no_cache=1

1.2.3. Fundamentos del análisis físico químico de la grasa de res. Por medio del análisis

fisicoquímico es posible conocer las propiedades de la materia prima que se va a utilizar. La

aplicación de ensayos como la determinación de la densidad, el punto de fusión y el índice de

refracción son propiedades físicas.

El índice de acidez y saponificación indican la cantidad de ácidos grasos libres, el índice de

yodo permite conocer el grado de instauración de la muestra y el índice de peróxido el

contenido de compuestos oxigenados en ésta, los cuales son una medida de la rancidez de la

muestra. En la Tabla 3 se encuentra la definición de cada parámetro del análisis fisicoquímico.

Ácido Graso %

Caproico C 6:0

< 0,5 en total Caprílico C 8:0

Cáprico C 10:0

Láurico C 12:0

Mirístico C 14:0 2-6

Miristoléico C 14:1 0,5-1,5

Pentadecanoico C 15:0 0,2-1,0

Palmítico C 16:0 20-30

Palmitoléico C 16:1 1-5

Margárico C 17:0 0,5-2,0

Esteárico C 18:0 15-30

Oléico C 18:1 30-45

Linoléico C 18:2 1-6

Otros C 18:1-C22:0 < 1,5

9

Tabla 3. Fundamentos del análisis físico químico

1.3. Combustibles de primera, segunda y tercera generación.

Los biocombustibles que inicialmente se produjeron fueron aquellos provenientes de materia

prima alimenticia como maíz y caña de azúcar en la producción de etanol, soya y aceite de

Parámetro Definición Ref.

Densidad

Es la relación entre la masa de un volumen dado de una

sustancia a 25⁰C y la masa de un volumen igual de agua

a 25⁰C.

[18]

Punto de fusión

Es la temperatura mínima a la cual una muestra de grasa

o aceite previamente solidificada dentro de un tubo

capilar se vuelve líquida o transparente en el capilar

cerrado y se desliza en el tubo capilar abierto.

[19]

Índice de

refracción

Es la relación entre la velocidad de una luz

monocromática en el aire y su velocidad en la sustancia

considerada y es la relación entre los senos de los

ángulos de incidencia y de refracción, cuando la luz pasa

del aire a la sustancia.

[20]

Índice de

acidez

Es, en una grasa o aceite, el contenido de ácidos grasos

libres, expresado convencionalmente como gramos de

ácido oléico, laúrico o erúcico por cada 100 g de

sustancia.

[21]

Índice de yodo

Es la medida del grado medio de insaturación de ciertas

sustancias orgánicas, expresando como centigramos de

yodo absorbidos, bajo condiciones determinadas, por

cada gramo de sustancia

[22]

Índice de

peróxido

Es el número de miliequivalentes de oxígeno por

kilogramo de muestra [23]

Índice de

saponificación

Es el número de miligramos de hidróxido de potasio

requeridos para saponificar 1 gramo de grasa o aceite [24]

10

palma para la producción de biodiesel. A estos combustibles de los denominó de primera

generación. A través del impulso a la producción de biocombustibles los gobiernos pretenden

conseguir una reducción de las importaciones de derivados de petróleo, desarrollo rural,

mitigación del cambio climático y sobretodo una mayor seguridad energética. En la producción

de biocombustibles de primera generación surgieron algunos problemas como la seguridad

alimentaria e impacto en el medio ambiente.

De esto ha nacido la necesidad de producir carburantes a partir de biomasa que no esté

destinada a la alimentación y sean menos intensivos en el uso de recursos como agua y suelo,

sino que provengan de residuos agrícolas. A estos combustibles se les conoce como de segunda

generación. La materia prima para estos biocombustibles incluye residuos como cáscara de

arroz o de maíz y plantas no comestibles. Con los primeros es posible producir etanol, mientras

que de las plantas que no compiten por el suelo, como el piñón y las micro algas, se puede

obtener aceites para la producción de biodiesel [25].

Los combustibles de tercera generación son producidos a partir de materia prima modificada

genéticamente de modo que facilita los procesos subsecuentes. Los agentes de conversión

(microorganismos, algas) también son modificados genéticamente para que le proceso sea más

eficiente [26].

1.4. Tecnologías para obtención de biodiesel

1.4.1. Micro emulsiones. Una micro emulsión es una dispersión coloidal de microestructuras

de un fluido isotrópico, con un tamaño alrededor de 1 a 150 nm, que se origina

espontáneamente por dos líquidos inmiscibles entre sí. Regularmente este tipo de biodiesel es

una mezcla de aceite y un solvente orgánico como el alcohol con la ayuda de un surfactante, con

esto se logra la disminución de la viscosidad del aceite [27].

1.4.2. Pirólisis. Consiste en modificar una sustancia orgánica por medio del calor, en ocasiones

se utiliza un catalizador para este fin. La pirólisis de triglicéridos y ácidos grasos es un proceso

parecido a la obtención del diésel de petróleo y produce sustancias con características similares.

Sin embargo, los equipos y el costo energético son muy elevados [28].

11

1.4.3. Transesterificación. En la producción de biodiesel la reacción de transesterificación se

lleva a cabo entre el aceite (triglicérido) y el alcohol en presencia de un catalizador. Es una

secuencia de tres reacciones reversibles en las que el triglicérido es convertido en diglicérido y

luego el diglicérido es transformado en un monoglicérido el cual finalmente se transforma en

glicerol, tal como se muestra en las ecuaciones 1, 2 y 3. Comúnmente se utilizan alcoholes de

cadena corta como metanol o etanol [29].

1

2

3

Normalmente la transesterificación se produce utilizando un catalizador básico o ácido, el cual

está limitado por impurezas como agua y ácidos grasos libres. Otro método para la producción

de biodiesel es a través de reacciones en condiciones supercríticas, a elevadas presiones y

temperaturas que implican el uso de una gran cantidad de energía y altos costos de operación.

Un último método es la utilización de lipasas, éstas pueden realizar la esterificación de ácidos

grasos libres y la transesterificación de triglicéridos sin la formación de jabones. La principal

barrera en el uso de lipasas es su costo, pero éste puede ser reducido con la inmovilización de

las mismas para poder ser reutilizadas [30]. A continuación se muestra en la Figura 1 la reacción

global de transesterificación y la Figura 2 una gráfica del tiempo versus la composición de

ésteres, monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos y glicerol durante la reacción de

transesterificación.

Figura 1. Reacción de transesterificación de un aceite con alcohol.

Fuente: Guomin Xiao and Lijing Gao (2011). First Generation Biodiesel, Biofuel Production-

Recent Developments and Prospects, Dr. Marco Aurelio Dos Santos Bernardes (Ed.), ISBN:978-

953-307-47-8-8, InTech, Disponible en: http://www.intechopen.com/books/biofuel-production-

recent-developments-and-prospects/first-generation- biodiesel. p. 47

12

Figura 2. Esquema ilustrativo de la concentración de componentes durante la

transesterificación.

Fuente: FEDDERN Vivian, et al. (2011). Animal Fat Wastes for Biodiesel Production, Biodiesel - Feedstocks and

Processing Technologies, Dr. Margarita Stoytcheva (Ed.), ISBN: 978-953-307-713-0, InTech, DOI: 10.5772/26691.

Disponible en: http://www.intechopen.com/books/biodiesel-feedstocks-and-processing-technologies/animal-fat-

wastes-for-biodiesel-production. p.56

1.4.3.1. Transesterificación química. Por medio de la transesterificación química se obtienen

altas conversiones de producto en tiempos de reacción cortos. Este método tiene varias

desventajas, utiliza gran cantidad de energía por realizarse la reacción a altas temperaturas,

además demanda una gran cantidad de agua ya que el catalizador debe ser retirado del producto,

el glicerol obtenido contiene impurezas de catalizador y las reacciones no deseadas como la

saponificación de aceites con un contenido elevado de ácidos grasos libres en presencia de una

base [31]. Se pueden utilizar diferentes tipos de catalizadores:

a) Catalizadores básicos homogéneos: hidróxido de sodio (NaOH), hidróxido de potasio

(KOH).

b) Catalizadores ácidos homogéneos: ácido sulfúrico (H2SO4), ácido clorhídrico (HCl).

c) Catalizadores básicos heterogéneos: zeolitas básicas, óxidos metálicos como el óxido de

calcio (CaO) e hidrotalcitas.

d) Catalizadores ácidos heterogéneos: óxido de zirconio (ZrO2), óxido de titanio (TiO2),

óxido de estaño (SnO2), zeolitas, resinas sulfónicas de intercambio iónico [32].

http://www.intechopen.com/books/biodiesel-feedstocks-and-processing-technologies/animal-fat-wastes-for-biodiesel-production

http://www.intechopen.com/books/biodiesel-feedstocks-and-processing-technologies/animal-fat-wastes-for-biodiesel-production

13

1.4.3.2. Transesterificación enzimática. La transesterificación enzimática es un proceso que

soluciona los principales problemas que se presentan en la transesterificación química como el

desperdicio de agua en el proceso de separación del catalizador y la dificultad al separar la

glicerina. Esto hace que el costo del biodiesel aumente, así como su impacto en el medio

ambiente. La transesterificación enzimática no genera productos secundarios, la separación de

los productos es fácil, la reacción se lleva a cabo a temperaturas bajas y trabaja muy bien a

elevadas concentraciones de ácidos grasos libres e incluso si la enzima está inmovilizada puede

reutilizarse. Todas estas ventajas hacen de la transesterificación enzimática una alternativa

amigable con el ambiente y una alternativa a la transesterificación química; sin embargo, se

presentan algunos problemas al llevar este proceso a escala industrial como el alto costo de la

enzima, los tiempos largos de reacción y la desactivación de la enzima [33].

1.4.3.3. Uso de co-solvente. La reacción de transesterificación requiere entre 30 minutos y

algunas horas, dependiendo del catalizador que se use, ya que los reactivos no son miscibles

entre sí, ocasionando una limitada transferencia de masa, particularmente al inicio de la

transesterificación. Para agilitar este proceso se emplean solventes como tetrahidrofurano,

hexano y dietiléter en la mezcla con el objetivo de incrementar la solubilidad y mejorar la

transferencia de masa entre el alcohol y el aceite. Una de las desventajas de este sistema es que

el co-solvente debe ser separado del producto final por destilación, este proceso es fácil si el

punto de ebullición del alcohol y el co-solvente son bastante lejanos, dificultándose cuando los

puntos de ebullición son muy cercanos entre sí [34].

1.4.3.4. Condiciones de operación supercríticas. En condiciones supercríticas, la mezcla de

reactivos se transforma en una sola fase homogénea, lo que acelera la reacción por la ausencia

de interface de transferencia de masa que limite la reacción. La transesterificación supercrítica

es realizada en un reactor a alta presión, con calentamiento externo. La reacción ocurre durante

el período de calentamiento. La síntesis de biodiesel en condiciones supercríticas tiene la

desventaja del alto costo de los aparatos a causa de las altas temperaturas y presiones que deben

soportar, lo cual no los hace viables a escala industrial [35].

1.4.3.5. Método de reacción ultrasónica. Las ondas ultrasónicas causan que la mezcla aceite y

alcohol produzca burbujas constantemente. Esta cavitación proporciona la mezcla y el calor

necesarios para que la reacción de transesterificación se produzca. De esta manera al usar un

reactor ultrasónico para la síntesis de biodiesel, se reduce significativamente el tiempo,

separación, temperatura y energía necesaria para la reacción. Mediante esta técnica el proceso

14

de transesterificación puede realizarse en línea en lugar de utilizar el lento método de

procesamiento por lotes. Los dispositivos ultrasónicos de escala industrial permiten el

procesamiento de varios miles de barriles por día. Sin embargo, es una tecnología sumamente

costosa en la actualidad [36].

1.4.3.6. Método de microondas. A través de las microondas se reducen los tiempos de reacción

y se aumentan los rendimientos. Las microondas trabajan al mínimo nivel de las moléculas e

iones del alcohol, generando incrementos de temperatura muy rápidos que ayudan al trabajo del

catalizador. Sin embargo, la síntesis por microondas es difícil de llevar a escala industrial,

además que la penetración de las microondas en materiales absorbentes no es muy profunda y la

seguridad de los reactores es muy difícil de manejar [37].

1.5. Variables que afectan la transesterificación

1.5.1. Relación molar alcohol – grasa. La reacción de transesterificación por estequiometría se

produce bajo una relación molar alcohol:grasa de 3:1 para convertir los triglicéridos a

alquilésteres. Pero esta reacción es reversible, así que se debe adicionar un exceso de alcohol

para favorecer la formación de ésteres.

En biocatálisis se emplean relaciones menores a 4:1, porque el alcohol insoluble en el aceite

puede inactivar las enzimas [38]. Aun con la cantidad estequiométrica de alcohol, la enzima se

inhibe aunque esté inmovilizada.

Hay enzimas que soportan mayor concentración de alcohol que otras como la P fluorescens, que

mantiene su actividad hasta una relación 4,5:1. Para evitar la desactivación de las lipasas por el

alcohol, éste se adiciona a diversos tiempos durante la reacción, como es el caso donde se

realizan tres adiciones sucesivas de 1/3 del equivalente molar del alcohol [39]. La inactivación

de las lipasas ocurre por contacto con el alcohol insoluble debido a que es altamente

hidrofóbico, éste elimina la capa esencial de agua de la enzima, así la adición poco a poco del

alcohol es una aproximación potencial para optimizar la relación molar en sistemas libres de

solvente. Mientras que una velocidad de reacción más alta puede ser obtenida con un ligero

exceso de alcohol en sistemas con solventes orgánicos [40].

1.5.2. Temperatura. La transesterificación enzimática se realiza generalmente a bajas

15

temperaturas para prevenir la disminución de la actividad de la enzima. La temperatura óptima

para varias lipasas usadas para síntesis de biodiesel está en el rango de 30 a 55°C. La

temperatura óptima de transesterificación dependerá de la interacción entre la estabilidad

operacional de la lipasa y el grado de transesterificación de la reacción [41]. Por lo general, al

inicio la velocidad de reacción aumenta con la temperatura, debido a un incremento en las

constantes cinéticas y una menor limitación en la transferencia de masa, sin embargo, el

aumento de la temperatura luego del óptimo, provoca la desnaturalización, desactivación por

altas temperaturas de la enzima y disminución de la actividad enzimática [42].

1.5.3. pH. Los iones hidronio juegan un papel importante en las reacciones catalizadas por

enzimas, generando un equilibrio entre aspectos como la desnaturalización de la enzima a pH

alto o bajo. Muchas moléculas proteicas solo retienen su actividad biológica en un rango

limitado de temperatura y pH. Al exponer las proteínas globulares a pH y temperaturas extremas

fuera de este rango, se da la desnaturalización, siendo el efecto más visible un descenso en la

solubilidad, y la consecuencia más significativa es la pérdida de su actividad biológica

característica [43].

1.5.4.Tipo de alcohol. Distintos tipos de alcoholes pueden ser utilizados en la transesterificación

enzimática. Alcoholes primarios, secundarios y de cadena ramificada pueden participar de este

tipo de reacción, pero por su costo y disponibilidad, el metanol y etanol han sido los alcoholes

más usados en la industria de producción de biodiesel, pero estos dos alcoholes tienen una

fuerte acción desnaturalizante comparada con alcoholes alifáticos más largos [44]. Entre el

metanol y el etanol, el segundo es el alcohol con el que se han obtenido mayores conversiones

debido a la mejor tolerancia de las enzimas a este alcohol, siendo notorio que las enzimas actúan

de mejor manera en sistemas con alcoholes de cadena larga, además, desde el etanol puede

producirse de fuentes renovables y es menos peligroso que el metanol [45].

1.5.5. Uso de solvente. En la catálisis enzimática se presentan dificultades como la baja

solubilidad del alcohol con los demás componentes de la reacción, inhibición de la enzima por

el alcohol y el recubrimiento de la enzima por la glicerina. Para evitar estos inconvenientes se

utilizan solventes como hexano, terbutanol, octano, acetona y éter de petróleo [46]. Solventes

orgánicos hidrofílicos pueden interactuar con la molécula de agua en la enzima y esto puede

afectar la actividad catalítica de la enzima [47].

1.5.6. Contenido de agua. El agua tiene una fuerte influencia en la actividad catalítica y en la

estabilidad de la lipasa. La activación de la lipasa con agua involucra cambios conformacionales

16

de la enzima que dependen de la disponibilidad de una interface entre el aceite y el agua.

Además la conversión de la transesterificación depende del tamaño del área interfacial la cual

puede incrementarse por la adición de cierta cantidad de agua. Pero las lipasas son hidrolasas en

medios acuosos y un exceso de agua podría dar lugar a un aumento en la reacción de hidrólisis

causando un decrecimiento de la reacción de transesterificación [48].

La cantidad de agua en el medio de reacción garantiza que la lipasa tenga su conformación

tridimensional y la capacidad de abrir su sitio catalítico, por tanto se conserva su actividad

enzimática predeterminada naturalmente para llevar a cabo su acción catalítica. Sin embargo, un

exceso de fase acuosa genera un aislamiento de la enzima con los sustratos (alcohol y aceite),

por lo tanto se reduce su capacidad de catálisis la reacción [49]. El contenido óptimo de agua se

encuentra entre maximizar la actividad enzimática por el incremento del área interfacial,

minimizando la reacción de hidrólisis y debe ser evaluada para cada lipasa [50].

1.5.7. Desactivación enzimática por alcohol. La desactivación de la enzima se produce por

metanol principalmente, esto es causado por la cadena corta del alcohol. Para resolver este

problema, se han planteado el adicionar poco a poco el alcohol e ingeniería de solventes [51].

Los alcoholes forman gotas que se insolubilizan en el medio de reacción y al entrar en contacto

con la enzima la inactivan [52].

1.6. Enzimas

Las enzimas son proteínas de estructura tridimensional globular que se activan cuando su

conformación espacial permite la exposición de su sitio catalítico. Se componen de dos partes:

apoenzima y cofactor. Para poder actuar las enzimas requieren de ciertas condiciones de

temperatura, pH, concentración del sustrato y de enzima, y el agua disponible en el medio,

etcétera; bajo las cuales la estructura tridimensional es la adecuada para actuar con el sustrato.

Las enzimas son catalizadores biológicos que no se consumen durante la reacción y presentan

un elevado grado de espeficidad. Su estudio es indispensable dentro del campo de los alimentos

ya que son las responsables de cambios en éstos, provocando procesos como maduración,

oxidación, transesterificación, fermentación, etc. Existen varios modelos que explican el

funcionamiento de las enzimas como catalizador, siendo uno de los mas aceptados el

desarrollado por Michaelis y Menten en 1913. [53]

17

1.7. Lipasas

Las lipasas (Ec 3.1.1.3) son hidrolasas que poseen actividad hidrolítica y de síntesis, la reacción

se produce en la interface aceite-agua [54]. Son activadas en presencia de interfaces y

frecuentemente poseen una estructura en el sitio activo, ya que disponen de una cadena

polipeptídica (tapadera o lid) que puede replegarse sobre el sitio activo, bloqueándolo. Esta

característica condiciona la funcionalidad de la enzima a la existencia de un microambiente

hidrofóbico que permita el desplegado de la tapadera dejando accesible el sitio activo. Puede

considerarse que la enzima existe en un equilibrio configuracional entre una forma cerrada

inactiva y una forma abierta. Tal equilibrio puede ser desplazado hacia la forma activa por la

presencia de un micro ambiente hidrofóbico que puede ser una interfaz aceite-agua o una

superficie hidrofóbica activa [55].

Estos catalizadores son muy apreciados por sus propiedades catalíticas, pueden ser aplicadas en

varias reacciones como alcohólisis, acidólisis, aminólisis e hidrólisis [56]. A estas enzimas se

las puede encontrar en todos los organismos vivos y se clasifican según la fuente de las que son

obtenidas. De origen animal como las lipasas pancreáticas, lipasas vegetales como látex de

papaya, lipasa de semilla de avena, microorganismos, etc. La propiedad más apreciada es la

habilidad de catalizar tanto mono, di y triglicéridos, como ácidos grasos libres en la producción

de biodiesel con alta actividad enzimática y conversiones satisfactorias [57].

En medios no acuosos, las lipasas tiene una muy buena estabilidad catalítica. Su especificidad

hace que puedan ser utilizadas en muchas aplicaciones en síntesis orgánica. Las condiciones de

operación en que las enzimas trabajan son menos agresivas, catalizan una gran variedad de

sustratos incluyendo aquellos que tienen alto contenido de ácidos grasos. Además la separación

de biodiesel es más fácil, resultando en un proceso más amistoso con el medioambiente [58].

Durante los últimos años el interés por las lipasas se ha incrementado a causa de sus

propiedades catalíticas, siendo posible su aplicación en industrias como: aditivos, detergentes,

elaboración de productos alimenticios bajos en grasa y colesterol, para eliminar la cera de la

pulpa del papel, obtención de moléculas bioactivas, modificación de grasas y otros lípidos por

hidrólisis y esterificación [59].

1.7.1. Lipasas vegetales. Las lipasas de origen vegetal pueden ser usadas como catalizadores

para la síntesis de biodiesel. Estas enzimas pueden ser extraídas de diferentes partes de la planta.

Los métodos para preparar y procesar cada lipasa dependerá de la fuente que proviene, habiendo

18

sido estudiadas sus reacciones de esterificación y transesterificación. Las lipasas vegetales

pueden ser usadas en forma cruda o como extractos parcial o totalmente purificados. El grado

de purificación dependerá de la parte de la planta de donde se obtiene la lipasa y el grado de

pureza buscado [60]

1.7.2. Lipasas de microorganismos. Las lipasas de microorganismos son las más utilizadas

debido a su corto tiempo de producción y alta conversión a productos. Las condiciones de

cultivo son bastante simples y estas lipasas tienen un gran potencial para la aplicación en otras

industrias distintas del biodiesel como alimentos, farmacéutica, detergentes, textiles,

cosméticos, etc. Este tipo de lipasa son estables en sistemas con solventes orgánicos, posee

especificidad por el sustrato y una alta enantioselectividad [61]. Existen dos categorías de

enzimas biocatalizadoras: lipasas extracelulares y lipasas intracelulares.

1.7.2.1. Lipasa Extracelular. La producción de estas enzimas consiste en la recuperación

de la enzima directamente del caldo de cultivo del microorganismo, para luego proceder a la

purificación de las mismas.Los microorganismos que más producen lipasa extracelular son

Mucor miehei, Rhizopus oryzae, Candida antárctica y Pseudomonas cepacia [62].

1.7.2.2. Lipasa Intracelular. Las lipasas intracelulares se encuentran dentro de la célula

formando membranas, lo que constituye una desventaja por el complejo proceso que se necesita

para purificar este tipo de enzima, incrementando su costo de producción. Como alternativa se

pueden utilizar células completas de los microorganismos que están produciendo lipasas como

catalizador, obteniéndose conversiones aceptables y a menor costo. Hongos filamentosos han

sido identificados como buenos biocatalizadores para la producción de biodiesel, entre estos

están: Rhizopus y Aspergillus [63].

1.7.3.Selectividad de las lipasas. Las lipasas pueden ser divididas basándose en su especificidad

o selectividad:

a) Regio especificidad o posicional: especificidad sn-1,3, hidroliza enlaces éster en la

posición R1 o R3, especificidad sn-2, hidroliza enlaces éster en la posición R2 y sin

especificidad, no distingue entre enlaces éster para actuar [64]. Como ejemplo de las

lipasas especificas sn-1,3 tenemos: Aspergillus niger, Rhizopus oryzae y Mucor miehei

[65].

19

b) La especificidad de sustrato en las lipasas es crucial en la producción de biodiesel, lo que

actúa en la elección de la enzima apropiada para cada materia prima, considerando la

capacidad de distinguir las propiedades estructurales. Las lipasas de Pseudomonas

fluorescens, Pseudomonas cepacia, Candida rugosa, Candida antarctica y Candida

cylindracea actúan de esta manera [66].

1.7.4. La lipasa de Rhizopus oryzae. Rhizopus oryzae es un hongo filamentoso y lipolítico, que

crece en los frutos de la palmera. La lipasa producida por este hongo de forma extracelular

(ROL) posee un elevado interés en biotecnología y en investigación académica debido a su

elevada regioespecificidad. Esta enzima actúa hidrolizando de manera preferente las posiciones

sn-1 y sn-3 de los triglicéridos, ya que pertenece a un grupo de lipasas que son activas frente a

ésteres de alcoholes primarios. La estructura nativa de esta enzima se compone de 392

aminoácidos [67]. En la Figura 3 se observa a la lipasa tridimensionalmente y en color morado

los aminoácidos del centro activo.

Figura 3. Representación tridimensional de la lipasa de Rhizopus oryzae.

Fuente: GUILLÉN, Marina. Caracterización, inmovilización y aplicación en biocatálisis de la lipasa Rhizopus

oryzae expresada en Pichia pastoris, Trabajo de Grado, Grado de Doctor, Universidad Autónoma de Barcelona,

Departamento de Ingeniería Química, Bellaterra, 2012, 205p. p. 16

20

1.8. Reactores para la transesterificación enzimática.

A partir de la industrialización de la producción enzimática de biodiesel es necesario

demostrar la aplicabilidad de las enzimas en sistemas con reactores. Varios reactores

incluyendo reactores batch, de lecho empacado y reactores supercríticos han sido

investigados. La mayoría de investigaciones se han hecho en reactores tipo batch y de

lecho empacado.

Los reactores batch son de diseño simple y se usan en laboratorios. En éstos el metanol muestra

una buena dispersión en la fase del aceite. Pero la agitación puede causar una disminución en la

vida útil de la enzima, también hay que considerar que los reactores batch necesitan mucho

trabajo y no son una buena opción para la automatización. Los reactores de lecho empacado son

una alternativa a los reactores batch, es un reactor continuo, sustancialmente rápido y

económico. La principal ventaja es que se obtiene una mayor estabilidad de la enzima al evitar

los efectos de la agitación, además la adición del alcohol por etapas puede realizarse para

reducir la inactivación de las enzimas causado por un exceso de alcohol. Uno de los problemas

es la inhibición de la enzima por acumulación de glicerol en el fondo der reactor, esto se puede

solucionar adicionando una columna al sistema. En consecuencia, los reactores de lecho

empacado parecen ser una solución práctica con altas conversiones. Estos sistemas brindarán

una forma económica de producir industrialmente biodiesel por vía enzimática [68].

1.9. Glicerol

El glicerol es un alcohol polihídrico, líquido viscoso, claro, inodoro, con sabor dulce y

altamente higroscópico. Se encuentra en la estructura de las triglicéridos de grasas y aceites

entre 9 a 13%. El glicerol se obtiene como subproducto de la fabricación de ácidos grasos,

ésteres grasos o jabones, como una mezcla de glicerol y agua, que recibe el nombre de aguas

dulces. En el proceso de hidrólisis de los aceites para la obtención de ácidos grasos, las aguas

dulces tienen entre 10 y 20% de glicerol, las cuales pueden purificarse hasta glicerol del 99,5%,

por destilación o intercambio iónico. En la saponificación del aceite para formar el jabón, las

aguas dulces contienen entre 4 y 20% de glicerol. Se usa como solvente o vehículo de productos

farmacéuticos, es un humectante en cosméticos, se usa como ingrediente en la fabricación de

explosivos, se emplea en la producción de mono y diglicéridos, como plastificante, como

lubricante en la producción de poliésteres, polioles y poliuretanos, anticongelante o agente

transmisor de calor o como fluido hidráulico [69].

21

1.10. Espectroscopia infrarroja

El espectro infrarrojo esta comprendido en longitudes de onda desde 1 a 100μm, este espectro

se subdivide en tres áreas más pequeñas: el infrarrojo cercano (1 a 25μm), infrarrojo medio (2,5

a 50μm) y el infrarrojo lejano (m s all de 25μm). in embargo, el infrarrojo cercano es pobre

en absorciones específicas, es muy importante en ensayos cualitativos en laboratorios y para

aplicaciones cuantitativas. El infrarrojo medio brinda mayor información acera de la estructura

de las moléculas, por lo que es ampliamente utilizado en la identificación de sustancias. El

infrarrojo lejano necesita de equipos especializados para el desarrollo de los análisis, existe un

amplio rango de instrumentos que incluso permiten un análisis en líneas continuas de

producción [70].

Se emplea para analizar las características vibracionales de las moléculas, estructuras cristalinas

y cristales. Los espectros se muestran en varias bandas características en el espectro infrarrojo,

estas bandas individuales se pueden relacionar con grupos químicos específicos. La energía a

las cuales aparecen las bandas dependen de las propiedades de las moléculas, mientras que se

pueden utilizar las magnitudes de las bandas para determinar las concentraciones. El espectro

infrarrojo se utiliza para análisis cuantitativos de sólidos, líquidos y gases, con excepción de

enantiómeros. Se puede identificar una sustancia desconocida partiendo del hecho que dos

sustancias no tienen el mismo espectro, entonces, se compara el espectro de la sustancia de la

cual queremos saber su identidad con una colección de espectros e identificar de qué se trata.

También se puede obtener información estructural. Los grupos funcionales se pueden identificar

debido a que sus bandas de absorción se encuentran en zonas relativamente estrechas, en

regiones características en la región infrarroja [71]. La Figura 4 ilustra el diagrama de bloques

de un especrtofotómetro.

22

Figura 4. Diagrama de bloques de un espectrómetro infrarrojo de transformadas de

Fourier de haz simple.

Fuente: ROUESSAC, Francis, ROUESSAC, Annick. Chemical Analysis Modern Instrumentation Methods and

Techniques, Segunda Edición, Wiley, Inglaterra, 2007. p. 216

1.11. Cromatografía de gases

En la cromatografía de gases, los componentes de la muestra vaporizada se separan como

consecuencia de que se reparten entre una fase gaseosa y una fase estacionaria contenida en la

columna. Al realizar la separación, la muestra se vaporiza y se inyecta en la cabeza de una

columna cromatográfica. Esto se realiza a través del flujo de una fase móvil de gas inerte. En la

Figura 5 se encuentra representado un diagrama de flujo del proceso de funcionamiento de un

cromatógrafo de gases. La ventaja de este tipo de cromatografía, es que la fase móvil no

interactúa con el analito, su única función es transportarlo a través de la columna [72].

23

Figura 5. Diagrama de bloques de un cromatógrafo de gases típico

Fuente: SKOOG, Douglas, HOLLER, James, CROUCH, Stanley. Principios de Análisis Instrumental, Sexta

Edición, Cengage Learning Editores, México, 2008. p. 790

1.12. Diseño factorial

El diseño experimental se utiliza para estudiar el efecto individual y de interacción de varios

factores sobre una o varias respuestas. Los factores puede ser de carácter cualitativo o

cuantitativo, es indispensable escoger al menos dos niveles de prueba para cada factor para

estudiar la forma en que influye cada factor sobre la variable de respuesta. Un arreglo factorial

es el conjunto de datos experimentales que pueden formarse tomando en cuanta todas las

posibles combinaciones de los niveles de los factores. Así los diseños factoriales 2k se compone

de k factores con dos niveles de prueba [73].

1.12.1. Diseño factorial 2k. Es el diseño que se encarga de estudiar k número de factores, cada

uno con dos niveles y donde se corren 2k tratamientos , este diseño es útil siempre que 2 ≤ k ≤ 5.

Existen seis maneras de notación: notación de signos +, - útil para escribir matrices de diseño, la

notación +1, -1 para hacer cálculos de ajuste por mínimos cuadrados, esta notación se usa en los

paquetes Statgraphics y Minitab. La notación de Yates [(1), a, b, ab] permite representar y

calcular los efectos de interés, la notación con letras A+, A

- se usa para escribir al final del

análisis el mejor punto o tratamiento.

El diseño factorial 22 representado en la Figura 6, es un modelo que estudia el efecto de dos

24

factores considerando dos niveles cada uno. Este diseño se representa mediante los vértices de

un cuadrado, donde cada punto representa un punto de diseño o tratamiento. El área limitada por

los vértices se conocen como región experimental, las conclusiones obtenidas tienen validez en

esta zona [74].

Figura 6. Representación del diseño factorial 22

Fuente: GUTIÉRREZ, Humberto, DE LA VARA, Román. Análisis y

diseño de experimentos, Segunda edición, McGraw-Hill, México, 2008.

p. 169

1.12.2. Metodología de superficie de respuesta. La metodología de superficie de respuesta es

una estrategia experimental de análisis que permite encontrar las condiciones de operación

óptimas del proceso [75], usando un conjunto de técnicas matemáticas y estadísticas que ajustan

lo datos experimentales en una ecuación polinómica, la cual deberá describir el comportamiento

del conjunto de datos con el objetivo de hacer predicciones estadísticas. Para aproximar

funciones de respuesta a datos experimentales que no pueden ser descritos por funciones

lineales, se debe utilizar diseños experimentales para superficies de respuesta cuadráticas como

el factorial de tres niveles, Box-Behnken, compuesto central y diseño Doehlert. Estos diseños se

diferencian respecto a la elección de puntos experimentales, número de niveles para las

variables y el número de corridas y bloques [76]. La forma de construir un diagrama de bloques

de diseño de composición central se muestra en la Figura 7. Los diseños de superficie de

respuesta de segundo orden permiten estudiar tanto los efectos lineales y de interacción, como

los de segundo orden o de curvatura pura. Se usan cuando se cree que el punto óptimo se

encuentra en la región experimental o se espera que ésta sea compleja. Dentro de este tipo de

diseño se contempla el de composición central como el que se ilustra en la Figura 6 que se

construye a parir de un diseño factorial 2k agregando puntos sobre los ejes y al centro del diseño

[77].

25

Figura 7. Representación y construcción del diseño de composición central para k=2

factores

Fuente: GUTIÉRREZ, Humberto, DE LA VARA, Román. Análisis y diseño de experimentos, Segunda edición,

McGraw-Hill, México, 2008. p. 418

26

2. MARCO EXPERIMENTAL

El modelo que se usó para la obtención de biodiesel consistió en un diseño factorial 22,

considerando como factores la cantidad de enzima y la temperatura de reacción, se mantuvieron

constantes las cantidades de grasa, alcohol, solvente y el pH. A través del modelo estadístico se

obtuvieron las condiciones óptimas de operación y con éstas se hicieron ensayos variando la

concentración de agua con el fin de estudiar el efecto de ésta en el rendimiento de la reacción.

Una vez obtenido el biodiesel se realizaron análisis de espectrografía infrarroja y cromatografía

de gases para verificar la existencia de ésteres en el producto obtenido.

2.1. Materiales y equipos

Cinta de teflón

Gradilla

Jeringa R: 0 a 60mL Ap ± 1mL

Jeringa R: 0 a 10mL Ap ± 0,1mL

Papel aluminio

Pera de caucho

Pipeta R: 0 a 2mL Ap ± 0,02mL

Pipeta R: 0 a 10mL Ap ± 0,1mL

Recipiente de vidrio

Termómetro R:-10 a 110°C Ap ±1°C

Tubos de ensayo simples y con tapa

Vaso de precipitación 100mL Ap ± 10mL

Vaso de precipitación 50mL Ap ± 10mL

Vaso de precipitación 25mL Ap± 2,5mL

Matraz Erlenmeyer 100mL Ap± 25mL

Matraz Erlenmeyer 50mL Ap± 10mL

Vidrio de reloj

Balanza Analítica R: (0-220g) Ap± 0,1mg

Cromatógrafo de gases PAC Agilent Technologies 7890 A

27

Agitador magnético con calefacción AGIMATIC-N R: Motor (60-1600)rpm Ap: ± 200 rpm

R: Calefactor (0-100)% Ap: ± 8%

Espectrofotómetro infrarrojo Perkin Elmer modelo Spectrum Two 97575

Estufa Memert R: (0-300)°C Ap: ± 0,5°C

2.2. Sustancias y reactivos

Acido cítrico (C6H8O7) 0,01M

Agua destilada (H2O)

Alcohol etílico (C2H5OH)

Alcohol metílico (CH3OH)

Bromuro de potasio (KBr)

Grasa de res

Hexano (C6H14)

Lipasa (Rhizopus Oryzae)

Sulfuro de Carbono (CS2)

2.3. Diagrama de Flujo

En la Figura 8 se representa el diagrama de flujo del proceso de obtención de biodiesel a partir

de grasa de res por vía enzimática.

28

Fig

ura

8.

Dia

gra

ma d

e F

lujo

del

pro

ceso

de

tran

sest

erif

ica

ció

n e

nzi

máti

ca

29

2.4. Caracterización de la grasa de res

La grasa de res, fue obtenida en la sección de cárnicos del mercado Iñaquito, de color

blanquecino, textura fibrosa y olor característico. La grasa obtenida principalmente fue aquella

asociada a órganos internos del animal. Se realizó una cromatografía de gases para conocer el

contenido de ácidos grasos que componen la grasa, análisis fisicoquímicos tales como densidad,

índice de refracción, punto de fusión, índice de acidez, índice de peróxidos, índice de

saponificación e índice de yodo, de acuerdo con normas nacionales INEN.

2.5. Extracción de la grasa de res

La extracción se realizó de manera artesanal, sometiendo la grasa a calentamiento en un

recipiente metálico hasta que se observó que la grasa líquida se separaba del tejido circundante,

posterior a esto se filtró para separar el líquido de las partículas de tejido remanentes y se

reservó la grasa tapada y en refrigeración hasta su posterior uso.

2.6. Preparación de la solución de enzima

En un vaso de precipitación se calentaron aproximadamente 6mL de agua hasta 37°C, luego se

agregó la enzima en las cantidades definidas según el diseño experimental y la mezcla se agitó a

200 rpm durante 15 minutos.

2.7. Obtención del biodiesel

En la balanza se pesó la grasa de res. Con el recipiente de vidrio se adecuó un baño María que

se fijó a 37°C, en él se introdujo el vaso de precipitación que contenía la grasa y se añadió el

alcohol, el hexano, la solución de enzima y el ácido. La mezcla se agitó hasta que la grasa se

diluya y todo el sistema esté homogéneo. Este líquido se colocó en un tubo de ensayo con tapa

sellando bien con cinta de teflón y papel aluminio para evitar que el solvente se evapore. A los

tubos de ensayo se los colocó horizontalmente en la estufa a la temperatura fijada para cada

ensayo durante 72 horas.

2.8. Separación del biodiesel

Una vez que transcurrió el tiempo de reacción, el contenido del tubo se colocó en una jeringa

con capacidad de 60mL para retirar la fase acuosa del sistema. El biodiesel obtenido se

introdujo en un tubo de ensayo y se calentó a baño maría hasta 60°C para eliminar el solvente,

una vez hecho esto se dejó enfriar el tubo sin taparlo. Usando la jeringa con capacidad de 10mL

30

se separó el biodiesel de los restos de grasa que precipitaron.

2.9. Diseño experimental

Se utilizó un diseño factorial 2

2, como factores la cantidad de enzima y la temperatura de

reacción, se mantuvieron constantes las cantidades de grasa, alcohol, solvente y el pH. Según el

modelo basado en bibliografía, la temperatura varia desde 32,76°C hasta 41,2°C y la cantidad

de enzima desde 1,95% hasta 10%. Se empleó 7,5 g de grasa para cada ensayo, la relación

molar alcohol grasa de 6:1 y solvente grasa 5:1, el contenido de agua inicialmente fue fijado en

30%, como se detalla en la Tabla 4, luego, con las condiciones óptimas obtenidas a través del

modelo estadístico se hicieron ensayos variando la concentración de agua a 0%, 30%, 50% y

70% con el fin de estudiar el efecto de ésta en el rendimiento de la reacción de

transesterificación. Una vez obtenido el biodiesel se realizaron análisis de espectrografía

infrarroja y cromatografía de gases para verificar la existencia de ésteres en el producto

obtenido. Para encontrar los puntos óptimos con los datos proporcionados por el programa se

construye el diagrama de bloque correspondiente al diseño usado como se muestra en la Figura

9, usando los datos de la Tabla 5.

Figura 9. Diagrama de Bloque

31

Tabla 4. Factores constantes del proceso

Tabla 5. Datos Experimentales generados en Statgraphics

Los datos obtenidos a través del software se utilizaron para hacer los ensayos con los dos

solventes, etanol y metanol. Una vez realizados los ensayos con los datos obtenidos a través del

programa, se calculó el porcentaje de rendimiento de biodiesel y luego se ingresó éstos

resultados al libro de datos del programa Statgraphics para continuar con la búsqueda de las

mejores condiciones de operación para la obtención de biodiesel. El siguiente paso es elegir el

modelo para el ajuste de los datos y los resultados experimentales, para este estudio se eligió el

modelo cuadrático.

2.10. Influencia de la cantidad de agua en la reacción de transesterificación

Una vez obtenidas las mejores condiciones de temperatura, cantidad de enzima y alcohol, se

realizaron las pruebas pertinentes para estudiar de qué manera influye la cantidad de agua en el

rendimiento de la reacción de transesterificación bajo las mejores condiciones de operación.

Para esto se consideró la dosificación entre 0% y 70% en peso de agua.

Factor Valor

Cantidad de grasa 7,5 g

pH 6

Relación molar alcohol grasa 6:1

Relación molar solvente grasa 5:1

Tiempo de reacción 72 h

N Temperatura, °C Cantidad de enzima, g

1 32,75 0,5

2 34,0 0,25

3 34,0 0,75

4 37,0 0,146

5 37,0 0,5

6 37,0 0,5

7 37,0 0,853

8 40,0 0,25

9 40,0 0,75

10 41,24 0,5

32

2.11. Espectroscopía infrarroja

Para determinar la presencia de ésteres en la muestra de biodiesel, se realizó en una

espectrografía infrarroja usando un equipo modelo Perkin Elmer Spectrum. Para esto se elaboró

una pastilla de bromuro de potasio, ésta se colocó en el soporte correspondiente para el análisis,

se le agregó una gota del biodiesel obtenido y se receptó los datos de los ensayos.

2.12. Cromatografía de gases

Para evidenciar la presencia de mono, di y triglicéridos en la grasa de res y el biodiesel, se

realizó una cromatografía de gases en un equipo modelo SIMDIS HT750. Se empezó por diluir

la muestra a ser analizada en sulfuro de carbono, se colocó un vial y éste se ingresó al

cromatógrafo para obtener la gráfica correspondiente a cada una de las sustancias estudiadas.

33

3. DATOS


En la Tabla 6 se muestra el peso de tejido sometido al calentamiento para extraer la grasa y el

peso de grasa extraída.

Tabla 6. Datos experimentales de la extracción de la grasa de res

Literal Peso de tejido adiposo,

g

Peso de grasa extraída,

g

A 184 113

B 126 60

C 53 22

D 36 12

E 74 31

F 101 63

3.2. Rendimiento de biodiesel

En la Tabla 7 se detalla el peso de biodiesel obtenido en cada uno de los ensayos realizados

usando etanol y metanol.

34

Tabla 7. Peso de biodiesel obtenido

En la Tabla 8 se encuentran los pesos moleculares de la grasa de res y de los ésteres de los

ácidos palmítico, esteárico y oleico.

Tabla 8. Pesos moleculares

La Tabla 9 se compone del peso de biodiesel obtenido con las diferentes dosificaciones de agua.

N Temperatura

°C

Enzima

g

Peso de biodiesel

usando Metanol

g

Peso de biodiesel

usando Etanol

g

1 32,75 0,5 3,3004 2,2735

2 34 0,25 0,8391 2,1860

3 34 0,75 2,9430 3,2824

4 37 0,1464 1,6695 3,3261

5 37 0,5 4,9514 3,9881

6 37 0,5 4,7501 4,1887

7 37 0,8535 5,3565 4,2446

8 40 0,25 4,4435 0,0000

9 40 0,75 4,9448 2,3142

10 41,24 0,5 4,5019 1,1617

Sustancia Peso molecular

g/mol

Grasa de res 862,16

Palmitato de etilo 284,40

Palmitato de metilo 270,40

Estearato de etilo 312,48

Estearato de metilo 298,48

Oleato de etilo 310,00

Oleato de metilo 296,00

35

Tabla 9. Porcentaje de rendimiento de biodiesel usando diferentes proporciones de agua

% de Agua Ensayo 1

Peso de Biodiesel, g

Ensayo 2

Peso de Biodiesel, g

0 0 0

30 4,15 4,24

50 4,27 4,34

70 4,52 2,89

36

4. CALCULOS


Para el cálculo del porcentaje de rendimiento de proceso de extracción de la grasa de res se

dividió el peso de grasa extraída para el peso de tejido adiposo y todo esto se multiplicó por

cien, como se muestra en la ecuación (1). Finalmente se calculó el promedio de todos los

porcentajes de rendimiento utilizando la ecuación (2).

Cálculo modelo para el literal A.

(1)

Rendimiento promedio de la extracción de grasa

(2)


Para el cálculo del rendimiento de biodiesel se realizaron las siguientes consideraciones:

- La grasa de res esta constituida por los ácidos palmítico, esteárico y oleico en proporciones

iguales.

- El producto final del proceso de transesterificación esta constituido única y equitativamente

por los ésteres de los ácidos grasos mencionados en el inciso anterior.

- El cálculo es el mismo para obtener el rendimiento de biodiesel usando distintas

dosificaciones de agua.

37

4.2.1. Cálculo modelo para N=1 usando metanol. El porcentaje de rendimiento de la reacción

se realiza utilizando las ecuaciones (3) y (4).

(3)

Cantidad teórica de la fracción Palmitato de metilo obtenida

Cantidad teórica de la fracción Estearato de metilo obtenida

Cantidad teórica de la fracción Oleato de metilo obtenida

Porcentaje de Rendimiento de Biodiesel

(4)

38

5. RESULTADOS


En la Tabla 10 se observa que el rendimiento de la extracción de la grasa fue en promedio del

47,47 %, este valor es representativo de 6 réplicas en las que se realizó la extracción, siendo los

porcentajes de rendimiento más altos aquellos en los que la grasa se cortó en pequeños pedazos,

en ese caso se alcanzó un rendimiento del 62,38%, mientras que cuando se realizó la extracción

con pedazos grandes se obtuvo un rendimiento del 30% .

Tabla 10. Porcentaje de Rendimiento de la extracción de la grasa de res


En la Tabla 11 se encuentran los resultados de la determinación de cada una de las propiedades

fisicoquímicas de la grasa que fueron realizadas siguiendo los procedimientos de las normas

INEN, en el Laboratorio de Alimentos de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad

Central de Ecuador, en el Laboratorio Labolab y en el laboratorio LASA (Ver Anexo B y C),

obteniéndose los siguientes resultados:

Literal % Rendimiento

A 61,41

B 47,62

C 41,51

D 30,00

E 41,89

F 62,38

Promedio 47,47

39

Tabla 11. Propiedades Fisicoquímicas de la Grasa de Res

De acuerdo a la Tabla 12, La grasa de res usada en esta investigación esta constituida

principalmente por tres ácidos grasos: ácido palmítico, ácido esteárico y ácido oleico. Esto

también se puede evidenciar en la Figura 10. Cada uno en una proporción algo menor al 30% en

peso de la grasa. El resto de ácidos característicos de la grasa de res, se encuentran en

proporciones menores al 6%. Así también es notorio que más de la mitad de los ácidos grasos

son saturados.

Figura: 10. Cromatograma correspondiente al perfil lipídico de la grasa de res

Parámetro Resultado Unidad Método

Densidad 0,8863 g/mL INEN 35:1973

Índice de refracción a 20 °C 1,688 INEN 42:1973

Punto de Fusión 46,50 °C INEN 474

Acidez (ácido oleico) 2,89 % INEN 38

Índice de Peróxido 0,00 meq O2/Kg INEN 227

Índice de Saponificación 0,204 mgKOH/100g INEN 40

Índice de yodo 38,50 cg I2/g INEN 37

40

Tabla 12. Perfil Lipídico de la Grasa de Res


Las siguientes tablas proporcionan los porcentajes de rendimiento de biodiesel para cada uno de

los principales ácidos grasos y promedio de éstos tres. La Tablas 13 y Figura 11 brindan los

resultados de usar alcoholes diferentes para la reacción de transesterificación.

Ácido Graso Abreviatura Resultado Unidad Método de

Ensayo

Caprílico C8:0 0 %

PEE-LASA-FQ-47

AOAC 996.06

AOAC 963.22

CROMATOGRAFIA

DE GASES

Cáprico C10:0 0,09 %

Láurico C12:0 0,15 %

Tridecanoico C13:0 0 %

Mirístico C14:0 3,77 %

Miristoléico C14:1 (cis n5) 0,25 %

Pentadecanoico C15:0 1,06 %

Palmítico C16:0 24,59 %

Palmitoléico C16:1 (cis n7) 1,18 %

Heptadecanoico C17:0 1,44 %

Esteárico C18:0 27,65 %

Eláidico C18:1 (trans n9) 3,81 %

Oléico C18:1(cis n9) 29,47 %

Linoléico C18:2(cis n6) 0,34 %

Araquídico C20:0 0,26 %

α-Linolénico C18:3 (cis n3) 0,65 %

Eicosenoico C20:1 (cis n9) 5,24 %

Behénico C22:0 0,07 %

Erúcico C22:1(cis n9) 0 %

Ac. Grasos Saturados 59,08 %

Ac. Grasos mono insaturados 36,21 %

Ac. Grasos poli insaturados 0,99 %

Ac. Grasos trans 3,81 %

Grasa 99,9 % AOAC 989.85

41

Tabla 13. Porcentaje de Rendimiento de Biodiesel

N

Alcohol usado Metanol Etanol Metanol Etanol

Éster Peso Peso % R %R

Biodiesel % R

%R

Biodiesel

1

Palmitato 1,65 1,33 70,17

65,94

53,73

50,64

Estearato 1,65 1,33 63,57 48,91

Oleato 1,65 1,33 64,10 49,30

2

Palmitato 1,58 1,40 67,31

63,26

56,44

53,19

Estearato 1,58 1,40 60,98 51,36

Oleato 1,58 1,40 61,49 51,78

3

Palmitato 0,28 0,73 11,89

11,18

29,45

27,76

Estearato 0,28 0,73 10,77 26,81

Oleato 0,28 0,73 10,86 27,02

4

Palmitato 0,98 1,09 41,71

39,20

44,23

41,68

Estearato 0,98 1,09 37,78 40,25

Oleato 0,98 1,09 38,10 40,57

5

Palmitato 1,48 0 62,97

59,18

0

0

Estearato 1,48 0 57,05 0

Oleato 1,48 0 57,52 0

6

Palmitato 1,65 0,77 70,07

65,86

31,18

29,39

Estearato 1,65 0,77 63,48 28,38

Oleato 1,65 0,77 64,01 28,61

7

Palmitato 0,56 1,11 23,66

22,23

44,81

42,24

Estearato 0,56 1,11 21,43 40,79

Oleato 0,56 1,11 21,61 41,11

8

Palmitato 1,79 1,41 75,91

71,34

57,19

53,90

Estearato 1,79 1,41 68,77 52,05

Oleato 1,79 1,41 69,34 52,47

9

Palmitato 1,10 0,76 46,77

43,96

30,63

28,87

Estearato 1,10 0,76 42,37 27,88

Oleato 1,10 0,76 42,73 28,10

10

Palmitato 1,50 0,39 63,80

59,96

15,65

14,75

Estearato 1,50 0,39 57,79 14,25

Oleato 1,50 0,39 58,28 14,36

42

Figura 11. Resumen de resultados del porcentaje de rendimiento de Biodiesel

La Tabla 14 y Figura 12 muestra los resultados de la influencia del agua en la reacción bajo las

condiciones optimas de operación.

Tabla 14. Porcentaje de Rendimiento de Biodiesel variando la proporción de agua

Ensayo % de Agua Éster Peso, g % R % R prom.

1 30%

Palmitato 1,38 58,75 55,22

Estearato 1,38 53,23

Oleato 1,38 53,67

2 30%

Palmitato 1,41 60,10 56,48


Oleato 1,41 54,90

1 50%

Palmitato 1,42 60,47 56,83


Oleato 1,42 55,24

2 50%

Palmitato 1,45 61,49 57,79


Oleato 1,45 56,17

1 70%

Palmitato 1,51 64,04 60,18


Oleato 1,51 58,50

2 70%

Palmitato 0,96 41,01 59,96


Oleato 0,96 37,46

43

Figura 12. Resumen de resultados del porcentaje de rendimiento de biodiesel usando

diferentes proporciones de agua

5.4. Caracterización del Biodiesel

5.4.1 Espectroscopía infrarroja. Luego de someter a la grasa de res a la reacción de

transesterificación, es necesario verificar la presencia de ésteres en el biodiesel obtenido, para

esto se utilizó la espectroscopía infrarroja, la cual nos brinda una gráfica del porcentaje de

transmitancia versus la longitud de onda, a través de la cual, mediante los picos encontrados a

cada longitud de onda se puede identificar la presencia de los compuestos de interés. En la

Figura 13 se puede observar picos de longitud de onda de 1739,49 cm-1

y con una transmitancia

del 9,90%, típicos de la presencia de ésteres en el biodiesel que se obtuvo. Este resultado nos

indica de manera positiva que el uso de enzimas para llevar a cabo la reacción de

transesterificación tuvo éxito. También se puede notar picos importantes de longitud de onda

2925,64 cm-1

, 2856,21 cm-1

y 1175,53 cm-1

.

44

Figura 13. Espectrograma del Biodiesel obtenido

En la Figura 14 se puede observar la ausencia del pico a 1739,49 cm-1

presente en la grafica IR

del biodiesel obtenido, esto es porque el diesel de petróleo esta compuesto por hidrocarburos

saturados, mayormente parafinas y otros hidrocarburos aromáticos. Las similitudes que se

evidencian son los picos cercanos a 2925 cm-1

, 1458 cm-1

, 1375 cm-1

.

Figura 14. Espectrograma del Diesel de petróleo

5.4.2. Cromatografía de gases. Las siguientes cromatografías se realizaron basándose en una

técnica cromatográfica que separa una mezcla de múltiples componentes a través de la

diferencia de sus puntos de ebullición. Este ensayo se realizó a la grasa de res y al biodiesel

obtenido.

45

Version 8,4,1,0

SI M DI S HT750 ASTM D 7169 3

Sample name : Grasa ResAcquired on : 12/19/2014 12:51:42 PM Vial : 103Processed on : 12/19/2014 2:04:15 PM Injection : 1Data File : MUESTRAS 2014-12-19\103F0301.D\

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

13000

14000

15000

Sig

na

l

6 12 18 24 30 36 42 48 5460667278849096 120

Carbon Number

En

d t

ime 2

2.6

10

0

IBP

31

4

FB

P 6

15

Signal: Hydrocarbon - FID1 A, Front Signal

Figura 15. Cromatografía de gases de la grasa de res

En la Figura 15 se encuentra un pico en un tiempo de retención entre 15 y 20 minutos, este pico

corresponde a compuestos que contienen entre 42 y 60 carbonos. De acuerdo a la naturaleza de

la sustancia que se sometió a este análisis el pico representado en la cromatografía corresponde

a los triglicéridos presentes en la grasa de res.

En la Figura 16 se observan tres picos: de derecha a izquierda el primero se ubica antes de 20

minutos de tiempo de retención correspondiente a compuestos que tienen entre 48 y 60

carbonos. El siguiente pico se localiza en 15 minutos de tiempo de retención, que pertenece a

los compuestos entre 42 y 36 carbonos. Por último el pico final que se sitúa entre los 5 y 10

minutos de tiempo de retención que concierne a compuestos que poseen entre 12 y 30 carbonos.

Para el biodiesel los picos presentes en la cromatografía corresponden, de izquierda a derecha;

a triglicéridos, diglicéridos y monoglicéridos. Esto es concordante al número de carbonos que

Triglicéridos

46

cada uno de los picos representa.

Version 8,4,1,0

SI M DI S HT750 ASTM D 7169 3

Sample name : BiodieselAcquired on : 12/19/2014 2:00:45 PM Vial : 104Processed on : 12/19/2014 2:37:24 PM Injection : 1Data File : MUESTRAS 2014-12-19\104F0401.D\

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Retention Time (min)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

13000

Sig

na

l

6 12 18 24 30 36 42 48 5460667278849096 120Carbon Number

En

d t

ime

24

.08

00

IBP

270

Signal: Hydrocarbon - FID1 A, Front Signal

Figura 16. Cromatografía de Gases del Biodiesel

5.5 Análisis Estadístico

5.5.1. Regresión múltiple de los datos obtenidos. Usando el software Statgraphics se realizó

la regresión múltiple de los datos experimentales obtenidos con el fin de llegar a una expresión

que relacione la temperatura y la cantidad de enzima con el porcentaje de rendimiento de la

reacción.

Triglicéridos

Diglicéridos

Monoglicéridos

47

5.5.1.1. Regresión múltiple para la reacción usando metanol.

Variable dependiente: % Rendimiento de la reacción (%)

Variables independientes: Cantidad de enzima (g)

Temperatura (°C)

Número de observaciones: 10

En la Tabla 15 se muestran los valores referentes al cálculo de la regresión múltiple.

Tabla 15. Regresión múltiple para la reacción usando metanol

R-cuadrada = 93,0286 porciento

R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 92,1571 porciento

La salida muestra los resultados de ajustar un modelo de regresión lineal múltiple para describir

la relación entre % Rendimiento de la reacción y 2 variables independientes. La ecuación del

modelo ajustado es:

% Rendimiento de la reacción = 45,6616*Cantidad de enzima + 0,757342*Temperatura

El estadístico R-Cuadrada indica que el modelo así ajustado explica 93,0286% de la

variabilidad en % Rendimiento de la reacción. El estadístico R-Cuadrada ajustada, que es más

apropiada para comparar modelos con diferente número de variables independientes, es

92,1571%.

Error Estadístico

Parámetro Estimación Estándar T Valor-P

Cantidad de enzima 45,6616 22,1791 2,05877 0,0735

Temperatura 0,757342 0,327464 2,31275 0,0495

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

Modelo 26943,5 2 13471,7 53,38 0,0000

Residuo 2019,11 8 252,389

Total 28962,6 10

48

5.5.1.2. Regresión múltiple para la reacción usando etanol.

Variable dependiente: % Rendimiento de la reacción (%)

Variables independientes: Cantidad de enzima (g)

Temperatura (°C)

Número de observaciones: 10

En la Tabla 16 se muestran los valores referentes al cálculo de la regresión múltiple.

Tabla 16. Regresión múltiple para la reacción usando etanol

R-cuadrada = 82,6224 porciento

R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 80,4502 porciento

La salida muestra los resultados de ajustar un modelo de regresión lineal múltiple para describir

la relación entre % Rendimiento de la reacción y 2 variables independientes. La ecuación del

modelo ajustado es:

% Rendimiento de la reacción = 35,601*Cantidad de enzima + 0,428957*Temperatura

El estadístico R-Cuadrada indica que el modelo así ajustado explica 82,6224% de la

variabilidad en % Rendimiento de la reacción. El estadístico R-Cuadrada ajustada, que es más

apropiada para comparar modelos con diferente número de variables independientes, es

80,4502%.

Error Estadístico

Parámetro Estimación Estándar T Valor-P

Cantidad de enzima 35,601 24,7815 1,4366 0,1888

Temperatura 0,428957 0,365887 1,17238 0,2748

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

Modelo 11984,9 2 5992,46 19,02 0,0009

Residuo 2520,74 8 315,092

Total 14505,7 10

49

5.6. Optimización del método

Al igual que en la sección anterior se utilizó el software Statgraphics para realizar los cálculos

deseados, en este caso, la optimización de los resultados se encuentran detallados en las Tablas

17, 18, 19, y 20. Y así encontrar la mejor condición de operación en cuanto a la cantidad de

enzima y temperatura para lograr el mayor porcentaje de rendimiento. Para iniciar se debe

definir las variables de respuesta a ser medidas y a continuación los factores que van a variar. Se

selecciona el diseño experimental y finalmente el modelo para el ajuste de los datos

experimentales.

Tabla 17. Variables respuesta a ser medidas

Tabla 18. Factores experimentales que van a variar

Tabla 19. Selección del diseño experimental

Tabla 20. Modelo a ajustar a los resultados del experimento

5.6.1. Optimización del método para la reacción con metanol. Para la optimización del

proceso se especificó 1 variable respuesta y 2 factores experimentales. El diseño seleccionado

Nombre Unidades Analizar Objetivo Destino Impacto Sensibilidad Bajo Alto

% Rendimiento de

la reacción % Media Maximizar 3,0 Medio

Nombre Unidades Tipo Papel Bajo Alto Niveles

A: Cantidad de enzima g Continuo Controlable 0,25 0,75

B: Temperatura °C Continuo Controlable 34,0 40,0

Tipo de Diseño Puntos Centrales Punto Central Diseño es

Factores Tipo Por Bloque Colocación Aleatorizado

Proceso Diseño de compuesto central:2^2+est 2 Primero No

Factores Modelo Coeficientes Efectos excluidos

Proceso cuadrático 6

50

tiene 10 ensayos, con 1 una muestra para ser tomada en cada ejecución. El modelo por defecto

es cuadrático con 6 coeficientes. En la Tabla 21 se muestran los resultados de la optimización.

Tabla 21. Factores establecidos y óptimo para la reacción con metanol

Mediante el uso de programa Statgraphics se obtuvieron las gráficas de efectos, de superficie de

respuesta y de contorno para el porcentaje de rendimiento de la reacción con metanol, con el

propósito de analizar los datos experimentales obtenidos, relacionando las variables

dependientes e independientes para interpretar de mejor manera la influencia de la cantidad de

enzima y temperatura en el porcentaje de rendimiento de la reacción. Por medio de estas

gráficas es posible identificar el mayor rendimiento de la reacción obtenido usando las

condiciones experimentales proporcionadas por este mismo programa estadístico.

En la Figura 17 se representan los efectos principales para el porcentaje de rendimiento de la

reacción con metanol.

Figura 17. Efectos principales para el porcentaje de rendimiento de la reacción con

metanol

Factor Establecimiento

Cantidad de enzima 0,603589

Temperatura 39,0096

51

La Figura 18 es una representación en tres dimensiones de la relación entre la variable

dependiente y las variables dependientes. Está trazada en un prisma rectangular cuyos ejes X, Y

y Z son la cantidad de enzima, el porcentaje de rendimiento de la reacción y la temperatura

respectivamente, dentro de los límites de operación que son: para la cantidad de enzima de 0,25

a 0,75 y para la temperatura de 37 a 40°C. En esta grafica es visible que el punto de mayor

conversión esta entre el 60% y el 75% según el código de color, este punto es mas notorio en la

gráfica de contornos que se presenta a continuación, esta es un complemento a la gráfica de

superficie de respuesta ya que se deriva de la misma.

Figura 18. Superficie de respuesta estimada de la reacción con metanol

La Figura 19 está representada en dos dimensiones, en ésta se dibujan las áreas correspondientes

a los rendimientos de cada ensayo que refleja el área de superficie de respuesta haciéndose más

evidente la manera en que se distribuyen los resultados experimentales en el área de superficie

de respuesta. En ésta representación se encuentra un punto central que simboliza el mayor

rendimiento alcanzado.

52

Figura 19. Contornos de la superficie de respuesta estimada de la reacción con metanol

5.6.2. Optimización del método para la reacción con etanol. Para la optimización del proceso

se especificó 1 variable respuesta y 2 factores experimentales. El diseño seleccionado tiene 10

ejecuciones, con 1 una muestra para ser tomada en cada ejecución. El modelo por defecto es

cuadrático con 6 coeficientes. En la Tabla 22 se muestran los resultados de la optimización.

R-cuadrado, el cual muestra el porcentaje de variación en la respuesta que ha sido explicado por

el modelo ajustado. Para % Rendimiento de la reacción, R-cuadrado igual as 87,31%.

Tabla 22. Factores establecidos y óptimo para la reacción con etanol

Mediante el uso de programa Statgraphics se obtuvieron las gráficas de efectos, de superficie de

respuesta y de contorno para el porcentaje de rendimiento de la reacción con etanol, con el

propósito de analizar los datos experimentales obtenidos, relacionando las variables

dependientes e independientes para interpretar de mejor manera la influencia de la cantidad de

enzima y temperatura en el porcentaje de rendimiento de la reacción. Por medio de estas

gráficas es posible identificar el mayor rendimiento de la reacción obtenido usando las

condiciones experimentales proporcionadas por este mismo programa estadístico. En la Figura

20 se representan los efectos principales para el porcentaje de rendimiento de la reacción con

etanol.

Factor Establecimiento

Cantidad de enzima 0,83324

Temperatura 36,775

53

Figura 20. Efectos principales para el porcentaje de rendimiento de la reacción con etanol

La Figura 21 es una representación en tres dimensiones de la relación entre la variable

dependiente y las variables dependientes. Está trazada en un prisma rectangular cuyos ejes X, Y

y Z son la cantidad de enzima, el porcentaje de rendimiento de la reacción y la temperatura

respectivamente, dentro de los límites de operación que son: para la cantidad de enzima de 0,25

a 0,75 y para la temperatura de 37 a 40°C. En esta gráfica es visible que el punto de mayor

conversión esta entre el 45% y el 60% según el código de color, este punto es mas notorio en la

gráfica de contornos que se presenta a continuación, esta es un complemento a la gráfica de

superficie de respuesta ya que se deriva de la misma.

Figura 21. Superficie de respuesta estimada de la reacción con etanol

54

En la Figura 22 están representadas en dos dimensiones, en ésta se dibujan las áreas

correspondientes a los rendimientos de cada ensayo que refleja el área de superficie de respuesta

haciéndose más notoria la manera en que se distribuyen los resultados experimentales en el área

de superficie de respuesta. En esta representación se encuentra un punto central que simboliza el

mayor rendimiento alcanzado.

Figura 22. Contornos de la superficie de respuesta estimada de la reacción con etanol

55

6. DISCUSION

6.1. Extracción de grasa de res

El tamaño de los pedazos, de tejido adiposo usado para extraer la grasa de res, influyó en el

rendimiento del proceso. De los pedazos más pequeños se extrajo mayor cantidad de grasa

que de los pedazos grandes, además, en los pedazos de mayor dimensión se podía apreciar

que la grasa se quedaba retenida en el centro y ésta no podía ser removida.


El valor del índice de peróxido igual a cero puede deberse a que el 59% de la grasa está

compuesta por ácidos grasos saturados, haciendo que ésta sea menos susceptible a la

oxidación. El índice de peróxido es una medida de la cantidad de compuestos oxigenados

que contiene la grasa, en otras palabras es una medida de la rancidez, en la muestra que se

analizó el índice de peróxido es igual a 0 meq O2/Kg, esto significa que la grasa no estuvo

expuesta al oxígeno que la deteriora. A pesar de contener ácidos grasos insaturados, que

hacen que la grasa sea mas susceptible a la oxidación, no se hallaron compuestos

oxigenados.

La grasa de res utilizada tiene un índice de acidez de 2,89%, este valor es indicativo de un

bajo contenido de ácidos grasos libres. Lo que la hace ideal para usarla en sistemas con

cualquier tipo de catalizador ya que la formación de jabón como producto secundario de la

reacción de transesterificación es reducida

El índice de saponificación de la grasa de res que se empleó es de 0,204 mg KOH/100g,

este valor implica que los ácidos grasos que la componen son de cadena larga. Lo cual

concuerda con el perfil lipídico, donde se determinó que los ácidos grasos tienen más de 16

carbonos.

El índice de yodo es igual a 38,50 cg I2/g, este valor es una medida del grado de

insaturación de la grasa, el cual no es tan elevado en comparación con el aceite de palma

(50 a 55 cgI2/g) que es la principal materia prima para elaboración de biodiesel en el país.

56

Al igual que en el índice de saponificación, confirma los resultados del perfil lipídico

donde se puede observar que el contenido de ácidos grasos insaturados es del 41%.

Además, un alto índice de yodo implica que son grasas suaves.

A través de la espectroscopía infrarroja es posible identificar grupos funcionales presentes

en una sustancia. Al realizar este análisis al biodiesel obtenido se encontró en el

espectrograma un pico de 1739,49 cm-1con una transmitancia del 9,90%, característico del

grupo éster.

Considerando que el agua favorece la reacción de transesterificación por vía enzimática, no

se evaluó el contenido de agua en la grasa de res. Se prefirió estudiar la influencia que ésta

tienen en el rendimiento de la reacción.

Mediante de la cromatografía de gases se determinó la composición de la grasa de res.

Los ácidos grasos detectados y sus proporciones coinciden con los valores encontrados en

la bibliografía consultada Por ejemplo, el contenido de ácidos saturados es del 59,08%,

ácidos grasos monoinsaturados de 36,21%, ácidos grasos trans de 3,81.

6.3. Obtención de Biodiesel

A pesar de no disponer del reactor adecuado, se logró la conversión de ácidos grasos a

ésteres metílicos y etílicos. El escenario ideal sería el realizar la reacción de

transesterificación en un reactor que mientras mantiene la temperatura constante, agite la

preparación ya que de esta manera las enzimas están más en contacto con el sustrato. Al no

disponer de estas condiciones, se optó por colocar la preparación en tubos de ensayo en

posición horizontal, para aumentar la superficie de contacto entre la grasa y la fase acuosa

que es donde se lleva a cabo la reacción y aumentar el tiempo de reacción.

La cantidad de lipasa a la cual se tuvo acceso fue muy limitada, razón por la cual se debió

hacer los ensayos con una pequeña cantidad de grasa y así administrar la enzima de manera

que sea posible realizar todos los ensayos necesarios para este trabajo.

Se utilizó lipasa en su configuración libre y no inmovilizada, como la gran mayoría de

investigaciones sobre obtención de biodiesel por vía enzimática. Esto se debe a que esta

enzima no es comercializada ordinariamente en el país, es necesario importarla,

aumentando los costos de producción del biodiesel. Sin embargo, con la enzima libre

57

también se obtienen resultados prometedores en cuanto al estudio de la transesterificación

enzimática en el Ecuador. El inconveniente radica en que solo se la puede utilizar una vez y

que pueden quedar trazas de ésta en el producto final, haciendo que no cumpla las

especificaciones requeridas para el biodiesel.

Luego de separar el biodiesel del solvente, se observaron restos de color blanco en las

paredes del tubo de ensayo. Estos remanentes pueden ser de grasa que no reaccionó, siendo

necesario separarlos del producto final.

6.4. Rendimiento de Biodiesel

La grasa de res está constituida principalmente por los ácidos palmítico, esteárico y

oléico, por ello se optó por calcular el porcentaje de rendimiento individual de cada ácido

graso a éster y luego se procedió a realizar un promedio de estos tres porcentajes de

rendimiento para lograr tener un valor representativo del porcentaje de rendimiento de la

grasa a biodiesel y así calcular las condiciones óptimas de operación mediante el método

de superficie de respuesta usando el software Statgraphics.

En el ensayo de la influencia del agua sobre el porcentaje de rendimiento de la reacción,

en la prueba que no se adicionó agua el rendimiento fue igual a cero. Al no haber agitación

durante la reacción la enzima se depositó en el fondo del envase sin poder actuar sobre la

grasa. En los ensayos donde se adicionó agua en diferentes proporciones, los porcentajes de

rendimiento fueron cercanos unos de otros, demostrando que para las condiciones de

operación estudiadas, adicionar más agua no tiene un efecto importante.

6.5. Análisis estadístico

Puesto que el valor-P en la Tabla 15 y 16 es menor que 0,05, existe una relación

estadísticamente significativa entre las variables con un nivel de confianza del 95,0%,

quiere decir que, por ejemplo, la cantidad de enzima no determina la cantidad a la cual se

debe hacer el ensayo y viceversa. El valor-P también indica la probabilidad de que los

resultados obtenidos sean debidos al azar.

Las parejas experimentales escogidas para este estudio proporcionaron resultados que al

realizar la regresión múltiple, el R- cuadrado para la reacción con metanol es de 93,03% y

para la reacción con etanol es de 82,62% lo que indica un buen ajuste.

58


Las Figuras 17 y 20 indican que bajo las condiciones de operación investigadas, se puede

tener una máxima conversión, después de la cual a pesar de aumentar la cantidad de

enzima o la temperatura; el rendimiento baja. Lo que coincide con el esquema de

comportamiento de las enzimas. Al mirar la curva cantidad de enzima versus el porcentaje

de rendimiento de la reacción, ésta llega a un punto máximo y luego desciende. Lo mismo

ocurre con curva temperatura versus porcentaje de rendimiento de la reacción, al elevar la

temperatura la conversión aumenta hasta el punto donde alcanza su punto máximo y luego

a pesar de elevar la temperatura, el rendimiento disminuye, sin tomar en cuenta que a altas

temperaturas la enzima empieza a desnaturalizarse volviéndose mucho menos efectiva. 7.

59

7. CONCLUSIONES


La extracción de la grasa de res de forma artesanal no es un método efectivo de separación

ya el rendimiento fue solamente del 48,02%. El tamaño de los pedazos que se sometieron a

calentamiento influyó en la cantidad de grasa que se obtuvo, siendo los cortes más

pequeños los que ofrecieron mejores resultados.


El bajo índice de saponificación de la grasa de res usada hace posible la transesterificación

usando diferentes catalizadores, minimizando la formación de jabones como producto

secundario de la reacción a causa de un alto contenido de ácidos grasos libres.

Mediante el análisis fisicoquímico de la grasa se conoce que la misma está compuesta

principalmente de ácidos grasos saturados de cadena larga, en ausencia de compuestos

oxigenados y que se trata de una grasa suave.


Las temperaturas de cada uno de los puntos óptimos de operación obtenidos no distan

significativamente de la temperatura a la cual la enzima es más eficaz indicada por el

fabricante que es de 37°C, sobre todo la temperatura de la reacción con etanol. Esto es que

al variar las condiciones de operación, las enzimas lograran mayor conversión a

temperaturas cercanas a su óptima.

La reacción que se realiza usando etanol, necesita mayor cantidad de enzima y menor

temperatura para lograr un alto grado de conversión, siendo necesario suministrar menor

cantidad de energía en comparación con la reacción con metanol la cual, para obtener una

alta conversión se realiza a una temperatura más elevada que en el caso anterior, pero con

menor cantidad de enzima.

60

Tanto para la reacción con metanol como para la reacción con etanol, la relación del

porcentaje de rendimiento frente a la cantidad de enzima tienen una tendencia a llegar a un

punto máximo después del cual el porcentaje de rendimiento disminuye, a pesar de

aumentar la cantidad de enzima utilizada. Esto también ocurre con la temperatura para los

dos casos, sin importar si se aumenta la temperatura el porcentaje de rendimiento llega a un

punto máximo después del cual tiende a disminuir. Esto demuestra que se logra un máximo

rendimiento bajo ciertas condiciones, luego de las cuales este empieza a decaer a causa del

comportamiento natural de las enzimas.

7.4. Caracterización del biodiesel

Las enzimas en efecto tuvieron éxito como catalizadores para la reacción de

transesterificación de la grasa de res. Esto se confirma con la cromatografía realizada al

biodiesel en la cual se observan tres picos en diferentes tiempos de retención, los cuales

corresponden a triglicéridos (48 a 60 carbonos), diglicéridos (36 a 42 carbonos) y

monoglicéridos (12 a 30 carbonos) evidenciando la conversión de los triglicéridos en

diglicéridos y monoglicéridos.

7.5 Rendimiento de Biodiesel

El mejor porcentaje de rendimiento fue del 71,34%, este valor se logró utilizando alcohol

metílico a 37°C y 0,8535 g de enzima. El rendimiento más bajo fue de 0%, usando alcohol

etílico a 40°C y 0,25 g de enzima.

El mayor porcentaje de conversión con metanol fue del 71,34%, se obtuvo con 0,8535 g de

enzima a 37°C y el más bajo de 11,18% se alcanzó con 0,25 g de enzima a 34°C. Para la

reacción usando etanol la mayor conversión fue de 53,90%, con 0,8535 g de enzima a

37°C y el mas bajo de 0% se realizó con 0,25 g de enzima a 40°C.

7.6. Análisis estadístico

R-cuadrado, muestra el porcentaje de variación en la respuesta que ha sido explicado por

el modelo ajustado. Para el porcentaje de rendimiento de la reacción con metanol el R-

cuadrado es igual a 93,03% y para el porcentaje de rendimiento de la reacción con etanol,

R-cuadrado igual a 82,62, lo que significa un buen ajuste y selección del rango de

variables.

61


Las mejores condiciones de operación obtenidas luego de utilizar el método de superficie

de respuesta, fueron: para la reacción usando metanol, 0,6036 g de enzima y 39°C. Para la

reacción usando etanol, 0,8332 g de enzima y 36,8°C.

62

8. RECOMENDACIONES


Para obtener mejores resultados en la extracción de la grasa se debería cortar el tejido

adiposo en pedazos pequeños lo más uniformes posible y probar otros métodos de

extracción como el uso de solventes o realizar la extracción a temperatura constante para

que el sebo se separe del tejido lentamente sin que éste pierda sus propiedades.


Con la enzima de Rhizopus oryzae se obtuvo muy buenos resultados, sin embargo se podría

investigar la conversión que se puede conseguir con otros tipos de enzimas como enzimas

vegetales o de otro microorganismo, así como también con enzimas inmovilizadas.

La reacción de transesterificación enzimática necesita ciertas condiciones que de ser

proporcionadas, incrementan el porcentaje de rendimiento de la reacción. El diseño de un

reactor con agitación y calefacción es de suma importancia para seguir avanzando en este

campo de investigación, ya que de esta manera es posible maximizar la cantidad de

biodiesel por gramo de sustrato que se ingresa.

El hexano se usó como solvente para agilizar la reacción de transesterificación, por lo que

sería recomendable realizar ensayos sin la presencia de este reactivo y determinar su

influencia en la velocidad y efectividad de la reacción.

Un capítulo interesante por investigar es la inmovilización de enzimas para su aplicación

en la transesterificación enzimática de ácidos grasos. Las lipasas inmovilizadas no se

comercializan en el país y además pueden ser reutilizadas varias veces antes de que pierdan

su efectividad, reduciendo de esta manera el costo por este insumo en la obtención de

biodiesel.

La reacción de transesterificación es un proceso que aún necesita resolver varios problemas

63

antes de ser llevado a escala industrial, el primero de estos es el tiempo que se necesita para

obtener el biodiesel, el cual es mucho mayor al necesario para una reacción con

catalizadores tradicionales como el hidróxido de sodio. Otro inconveniente es que la

enzima libre, al no tener certeza de qué cantidad permanece en el biodiesel, deja una huella

de proteína que afecta al desempeño del combustible y solamente se la puede utilizar una

sola vez.

8.3. Rendimiento de Biodiesel

En vista de que los mejores rendimientos fueron obtenidos con el alcohol metílico, seria

recomendable el uso de este alcohol para otras investigaciones usando lipasa de Rhizopus

oryzae y además ampliar las variables a ser analizadas.

64

CITAS BIBLIOGRAFICAS

[1]INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACION. Biodiesel. Requisitos. NTE INEN

2482:2009, Quito, INEN, 2013. p. 1.

[2]GOG Adriana, et al. Biodiesel production using enzymatic transesterification – Current state and

perspectives, Renewable Energy, [en línea], Volumen 39, Número 1, marzo 2012, [Fecha de

consulta: 12 Julio 2014], Disponible en: https://www.deepdyve.com/lp/elsevier/Biodiesel-

production-using-enzymatic-transesteridication-current-state-zwwK2wm700?key=elsevier, ISSN

0960-1481. p. 10.

[3] LAM Man Kee; LEE Keat Teong y MOHAMED Abdul Rahman. Homogeneous, heterogeneous

and enzymatic catalysis for transesterification of high free fatty acid oil (waste cooking oil) to

biodiesel: A review, Biotechnology Advances, [en linea], Volumen 28, Número 4, julio 2010,

[Fecha de consulta: 12 julio 2014], Disponible en:

https://www.deepdyve.com/lp/elsevier/homogeneous-heterogeneous-and-enzymatic-catalysis-for-

p567IP3Liv?key=elsevier. p. 502.

[4] PERDOMO Jairo. Determinación de los parámetros de trabajo de la lipasa de Pseudomonas

aeruginosa aislada del fruto de la palma aceitera para su uso como biocatalizador en la producción

de biodiesel, Trabajo de Grado, Maestria en Diseño y Gestión de Procesos, Universidad de la

Sabana, Facultad de Ingeniería, Chía, 2012, 137 p. pp. 15-16.

[5] FEDDERN Vivian, et al. Animal Fat Wastes for Biodiesel Production, Biodiesel - Feedstocks and

Processing Technologies, [en linea], Dr. Margarita Stoytcheva (Ed.), 2011. [Fecha de consulta: 12

julio 2014], Disponible en: http://www.intechopen.com/books/biodiesel-feedstocks-and-

processing-technologies/animal-fat-wastes-for-biodiesel-production, ISBN: 978-953-307-713-0.

p. 46.

[6] GUOMIN Xiao y LIJING Gao. First Generation Biodiesel, Biofuel Production-Recent

Developments and Prospects, [en linea], Dr. Marco Aurelio Dos Santos Bernardes (Ed.), 2011.

[Fecha de consulta: 12 julio 2014], Disponible en: http://www.intechopen.com/books/biofuel-

production-recent-developments-and-prospects/first-generation-biodiesel, ISBN: 978-953-307-

478-8. p. 45.

[7] Banco Cental del Ecuador, Reporte del sector petrolero III trimestre 2013, Dirección Estadística

Económica, 2014. Disponible en:

http://contenido.bce.fin.ec/documentos/Estadisticas/Hidrocarburos/ASP201309.pdf. p. 27.

[8] La Fabril llena más tanques con biodiesel, Revista Líderes [en línea], Fecha de consulta: 27 de

febrero de 2015, disponible en: http://www.revistalideres.ec/economia/Fabril-llena-tanques-

biodiesel-Santo-Domingo-Tsachila_0_876512363.html

65

[9]YÜCEL Sevil; E Z ĞL Pınar y ÖZÇ MEN idem. Lipase pplications in iodiesel

Production, Biodiesel - Feedstocks, Production and Applications, Prof. Zhen Fang (Ed.),

2012. [Fecha de consulta: 12 julio 2014], Disponible en:

http://www.intechopen.com/books/biodiesel-feedstocks-production-and-applications/lipase-

applications-in-biodiesel-production-, ISBN: 978-953-51-0910-5. p. 221.

[10]TEJADA Candelaria, et al. Obtención De Biodiesel A Partir De Diferentes Tipos De Grasa

Residual De Origen Animal, [en línea], Luna Azul, Número 36, Enero – Junio 2013, [Fecha

de consulta: 12 julio 2014], Disponible en:

http://lunazul.ucaldas.edu.co/index.php?option=content&task=view&id=790, ISSN 1909-

2474. pp. 11-12.

[11] YÜCEL, Op. Cit., p. 222.

[12] La Fabril llena más tanques con biodiesel, Revista Líderes, [en línea], Fecha de consulta: 27

de febrero del 2015, Disponible en: http://www.revistalideres.ec/economia/Fabril-llena-

tanques-biodiesel-Santo-Domingo-Tsachila_0_876512363.html

[13] CHAKRABORTY Rajat; GUPTA Abhishek y CHOWDHURY, Ratul. Conversion

slaughterhouse and poultry farm animal fats and wastes to biodiesel parametric sensitivity

and fuel quantity assessment, Renewable and Sustainable Energy Reviews, [en linea],

Número 29, 01 Enero 2014, [Fecha de consulta: 12 julio 2014], Disponible en:

https://www.deepdyve.com/lp/elsevier/conversion-of-slaughterhouse-and-poultry-farm-

animal-fats-and-wastes-iAjTzb1DaY?key=elsevier, ISSN 1364-0321, p. 121.

[14] YÜCEL, Op. Cit., p. 222.

[15] GUSTONE Frank; HARWOOD John y DIJKSTRA Albert. The Lipid Handbook. Tercera

Edición. CRC Press Taylor & Francis Group, Boca Raton, 2007. p. 100.

[16] Ibíd., p.100.

[17] Ibíd., p.100.

[18]INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACION. Grasas y Aceites Comestibles.

Determinación de la Densidad Relativa. NTE INEN 35:1973, Quito, INEN, 1973. p. 1.


Determinación del Punto de Fusión. NTE INEN 474:1980, Quito, INEN, 1980. p. 1.


Determinación del Índice de Refracción. NTE INEN 42:1973, Quito, INEN, 1973. p. 1.


Determinación de la Acidez. NTE INEN 38:1973, Quito, INEN, 1973. p. 1.


Determinación del Índice de Yodo. NTE INEN 37:1973, Quito, INEN, 1973. p. 1.

[23] INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACION. Grasas y Aceites. Determinación

http://www.intechopen.com/books/biodiesel-feedstocks-production-and-applications/lipase-applications-in-biodiesel-production-

http://www.intechopen.com/books/biodiesel-feedstocks-production-and-applications/lipase-applications-in-biodiesel-production-

66

del Índice de Peróxido. NTE INEN 277:1978, Quito, INEN, 1978. p. 1. (INEN 277:1978)

[24] INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACION. Grasas y Aceites Comestibles.

Determinación del Índice de Saponificación. NTE INEN 40:1973, Quito, INEN, 1973. p. 1.

[25] MACHADO Cristina. Situación de los Biocombustibles de 2da y 3era Generación en

América Latina y Caribe, [en línea], Agosto 2010, [Fecha de consulta: 12 julio 2014],

Disponible en: http://www.bivica.org/upload/biocombustibles-situacion.pdf. p. 2.

[26] PERDOMO, Op. Cit., p. 9.

[27] Ibíd., p. 9.

[28] NARWAL Sunil y GUPTA Reena. Biodiesel production by transesterification using

immobilized lipase, Biotechnology Letters, [en linea], Volumen 35, Número 4, Abril 2013.

[Fecha de consulta: 12 julio 2014], Disponible en: https://www.deepdyve.com/lp/springer-

journal/biodiesel-production-by-transesterification-using-immobilized-lipase-

e4Xc2AfJGL?key=springer, ISSN 0141-5492, p. 482.

[29] LIU Chien-Hung, et al. Biodiesel production by enzymatic transesterification catalyzed by

Burkholderia lipase immobilized on hydrophobic magnetic particles, Applied Energy, [en

linea], Volumen 100, 01 Diciembre 2012, [Fecha de consulta: 12 julio 2014], Disponible en:

https://www.deepdyve.com/lp/elsevier/biodiesel-production-by-enzymatic-

transesterification-catalyzed-by-8CKOXZQoq1?key=elsevier, ISSN 0306-2619, p. 41.

[30] NARWAL, Op. Cit., p. 482.

[31] LAM, Op. Cit., p. 509.

[32] Ibíd., p. 513.

[33]Ibíd., p. 516.

[34] GUOMIN, Op. Cit., p. 57.

[35] PERDOMO, Op. Cit., pp. 11-12.

[36] Ibíd., p. 12.

[37] ROJAS Andrés y GIRÓN, Erika. Variables de operación en el proceso de transesterificación

de grasas animales: una revisión, Ingeniería y Universidad, [en línea], Volumen 15, Numero

1, enero-junio 2011, [Fecha de consulta: 12 julio 2014], Disponible en:

http://revistas.javeriana.edu.co/index.php/iyu/article/view/1143/809, ISSN 0123-2126. pp.

201-202.

[38] Ibíd., p. 18.

[39] YÜCEL, Op Cit., p. 231.

[40] GOG, Op. Cit., p. 14.

[41] YÜCEL, Op Cit., p. 223.

[42] PERDOMO, Op. Cit., pp. 22-23.

[43] GOG, Op. Cit., p. 13.


67

[45] ROJAS, Op. Cit., p. 18.

[46] YÜCEL, Op. Cit., p. 227.

[47] TAN Tianwei, et al. Biodiesel production with immobilized lipase: A review, Biotechnology

advances, [en linea], Volumen 28, Número 5, 1 Septiembre 2010, [Fecha de consulta: 12

julio 2014], Disponible en: https://www.deepdyve.com/lp/elsevier/biodiesel-production-

with-immobilized-lipase-a-review-ouqJNxxawr?key=elsevier, ISSN 0734-9750. p. 631.


[49] GOG, Op. Cit., p. 14.

[50] TAN, Op. Cit., p. 631.


[52] BADUI Salvador. Química de los alimentos, cuarta edición, Pearson Educación, México,

2006. p. 301.


[54] ILLANES Andrés; ÁLVAREZ Lorena y ÁLVARO Gregorio. Esterificación

quimioselectiva de fitoesteroles de madera mediante lipasas. Revista Colombiana de

Biotecnología, [en línea], Volumen 10, Número 1, Julio 2008 [Fecha de consulta: 12 julio

2014], Disponible en:

http://132.248.9.34/hevila/Revistacolombianadebiotecnologia/2008/vol10/no1/2.pdf, ISSN

0123-3475. p. 19.

[55] YÜCEL, Op. Cit., p. 211.

[56] ZHANG Baohua, et al. Enzyme immobilization for biodiesel production, Applied

Microbiology and Biotechnology, [ en linea], Volumen 93, Número 1, 1 Enero 2012, [Fecha

de consulta: 12 julio 2014], Disponible en: https://www.deepdyve.com/lp/springer-

journal/enzyme-immobilization-for-biodiesel-production-PrEkkiHjLB?key=springer, ISSN

01757598. p. 62.

[57] GOG, Op. Cit., p. 10.

[58]COCA Jany, et al. Producción y caracterización de las lipasas de Aspergillus niger y A.

fumigatus, Biotecnología Aplicada, [en linea], Volumen 18, Número 4, 2001, [Fecha de

consulta: 12 julio 2014], Disponible en: http://es.scribd.com/doc/33014858/Produccion-y-

caracterizacion-de-las-lipasas-de-Aspergillus-niger-y-A-fumigatus#scribd. p. 216.

[59] MOUSSAVOU Rédéo, et al. Are plant lipases a promising alternative to catalyze

transesterification for biodiesel production?, Progress in Energy and Combustion Science, [

en linea], Volumen 39, Número 5, 1 Octubre 2013, [Fecha de consulta: 12 julio 2014],

Disponible en: https://www.deepdyve.com/lp/elsevier/are-plant-lipases-a-promising-

alternative-to-catalyze-HFPw6U9VnX?key=elsevier, ISSN 0360-1285. p. 445.


[61] GOG, Op. Cit., p. 10.

68

[62] Ibíd., p.11.

[63] Ibíd., p.11.

[64] YÜCEL, Op Cit., p. 211.

[65] Ibíd., p. 211.

[66] GUILLÉN Marina. Caracterización, inmovilización y aplicación en biocatálisis de la lipasa

Rhizopus oryzae expresada en Pichia pastoris, Trabajo de Grado, Grado de Doctor,

Universidad Autónoma de Barcelona, Departamento de Ingeniería Química, Bellaterra,

2012. pp. 12-15.

[67] YÜCEL, Op. Cit., pp. 232-233.

[68] JAIMES Diana; ROMERO Carlos y NARVAEZ Paulo. Principales tecnologías para

elaboración de oleoquímicos a partir de los aceites de palma y de palmiste, Palmas, [en

línea], Volumen 24, Número 4, 8 Octubre 2003, [Fecha de consulta: 12 julio 2014],

Disponible en:

http://publicaciones.fedepalma.org/index.php/palmas/article/viewFile/978/978. pp. 68-69.

[69] ROUESSAC Francis y ROUESSAC Annick. Chemical Analysis Modern Instrumentation

Methods and Techniques, Segunda Edición, Wiley, Inglaterra, 2007. p. 207

[70] RUBINSON Kenneth y RUBINSON Judith. Análisis Instrumental, trad. de la ed. en inglés,

Prentice Hall, Madrid, 2001. p. 455.

[71] SKOOG Douglas; HOLLER James y CROUCH Stanley. Principios de Análisis

Instrumental, Sexta Edición, Cengage Learning Editores, México, 2008. p. 788.

[72] GUTIÉRREZ Humberto y DE LA VARA Román. Análisis y diseño de experimentos,

Segunda edición, McGraw-Hill, México, 2008. p. 128.

[73] Ibíd., pp.168-169.

[74] Ibíd., p.386.

[75] ALMEIDA Marcos, et al. Responce surface methodology (RSM) as a tool for optimization

in analytical chemistry, Talanta, [en línea], Volumen 76, Número 5, 15 Septiembre 2008,


https://www.deepdyve.com/lp/elsevier/response-surface-methodology-rsm-as-a-tool-for-

optimization-in-RDqyqk2jkE?key=elsevier, ISSN 0039-3573. p. 966.

[76] GUTIÉRREZ, Op. Cit., p. 415.

69

BIBLIOGRAFIA

KAIEDA Massaru, et al. Effect of Methanol and Water Content son Production of

Biodiesel Fuel from Plant Oil Catalyzed by Various Lipases in a Solvent-Free, System,

Journal of Bioscience and Bioengineering, [en línea], Volumen 91, Número 1, 2001,


http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1389172301801031.

LLOYD Nelson, et al. Lipase-Catalyzed Production of Biodiesel, Journal American Oil

Chemistry Society, [en linea], Volumen 73, Número 9, 1 september 1996, [Fecha de

consulta: 12 julio 2014], Disponible en: https://www.deepdyve.com/lp/springer-

journal/lipase-catalyzed-production-of-biodiesel-VEUkqLQXm6?key=springer, ISSN

0003-021X.

ESPINOSA DA CUNHA Michele, et al. Beef Tallow Biodiesel Produced in a Pilot Scale,

Fuel Processing Technology, [ en línea], Volumen 90, Número 4, 1 April 2009, [Fecha de

consulta: 12 julio 2014], Disponible en: https://www.deepdyve.com/lp/elsevier/beef-

tallow-biodiesel-produced-in-a-pilot-scale-IX4NBpUi6b?key=elsevier#, ISSN 0378-3820.

JAEGER Karl y EGGERT Thorsten. Lipases for Biotechnology, Current Opinion in

Biotechnology, [en línea], Volumen 13, Número 4, 1 Agosto 2002, [Fecha de consulta: 12

julio 2014], Disponible en: https://www.deepdyve.com/lp/elsevier/lipases-for-

biotechnology-bH0WXM0mK3?key=elsevier, ISSN 0958-1669.

RIVERA Ivanna; VILLANUEVA Gerardo y SANDOVAL Georgina. Producción de

Biodiesel a partir de residuos grasos animales por vía enzimática, Grasas y Aceites, [en

línea], Volumen 60, Número 5, Octubre-Diciembre 2009, [Fecha de consulta: 12 julio

2014], Disponible en:

http://grasasyaceites.revistas.csic.es/index.php/grasasyaceites/article/download/600/614,

ISSN 0017-3495.

Y.M. Sani; W.M.A.W. Daud y A.R. Abdul Aziz. Biodiesel Feedstock and Production

Technologies: Successes, Challenges and Prospects, Biodiesel - Feedstocks, Production

and Applications, Prof. Zhen Fang (Ed.), 2012, [Fecha de consulta: 12 julio 2015],

Disponible en: http://www.intechopen.com/books/biodiesel-feedstocks-production-and-

applications/biodiesel-feedstock-and-production-technologies-successes-challenges-and-

prospects-, ISBN: 978-953-51-0910-5

70

ANEXOS

71

ANEXO A. Hoja Técnica de la Enzima de Rhizopus Oryzae

72

Continuación ANEXO A

73

ANEXO B. Resultados del Análisis Fisicoquímico de la grasa de res

74

ANEXO C. Resultados del índice de yodo de la grasa de res

75

ANEXO D. Resultados del perfil lipídico de la grasa de res

76

Continuación ANEXO D

77

ANEXO E. Reporte fotográfico de la experimentación

78

Continuación ANEXO E

universidad central del ecuador … · diseño factorial 2k. ... se utilizó un diseño factorial...

Documents