universidad central de venezuela facultad de medicina ...presencia o ausencia de una proteína y sus...

ELISA y WesternBlot

Prof. Edwin [email protected]

Universidad Central de VenezuelaFacultad de Medicina

Escuela de Medicina “José María Vargas”Cátedra de Inmunología

Práctica 12018

Aplicaciones Diagnósticas de las InteraccionesAg/Ac

ELISA

ELISAEnsayo de Inmunadsorción Ligado a Enzima

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

• Mide la cantidad de complejo Ag/Ac formado• Utiliza reactivo detector conjugado a una enzima• Reacción colorimétrica en presencia de sustrato

cromógeno• Intensidad de color proporcional a cantidad de complejo

Ag/Ac

https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a9/ELISA.jpg

ELISA Indirecto•Detección de anticuerpos específicos en el suero del paciente•Aplicaciones:

•Diagnóstico de Infección o exposición a microorganismos•Detección de Autoanticuerpos•Respuesta a Inmunizaciones/Vacunas

Fase deCaptura

Ag de VIH-1Proteínas

Recombinantes

Diagnóstico de Infección por VIH-1

Fase deDetección

Anti-IgGConjugados a

Enzima

Lavado

Revelado

Reacción de ColorSustrato Cromógeno

Lavado

MarcadorIdentificado

IgG anti-VIH-1Anticuerpos en

Suero del Paciente

Agregar

Inmunología de Kuby

ELISA Tipo Sándwich

•Detección de antígenos específicos en el suero del paciente•Aplicaciones:

•Detección de Ag microbianos•Determinación de Hormonas, Citoquinas, Drogas, Marcadores Tumorales, etc.

Fase deCaptura

Ac Anti-HBsAg

Determinación de Antígeno de Superficie del Virus de Hepatitis B

Fase deDetección

Anti-HBsAgConjugados a

Enzima

Lavado

Revelado


Lavado


HBsAgAntígeno en

Suero del Paciente

Agregar


Anti-h-CG

ELISA Competitivo•El antígenos específico en el suero del paciente compite con elantígeno unido a la fase sólida para unirse al anticuerpo. La intensidadde color es inversamente proporcional a la cantidad de Ag en la muestra•Aplicaciones:

•Determinación de Hormonas, Citoquinas, Drogas, Marcadores Tumorales, etc.

Determinación de Gonadotropina Coriónica Humana (h-CG)

Fase deCaptura

h-CGProteínas

Recombinantes

IgGFase de

Detección


Enzima

Lavado

Revelado


Lavado


h-CGHormona en

Suero del Paciente

Agregar


Técnica de

ELISA

Ventajas

Alta sensibilidad y altaespecificidad

Cuantitativa

Relativamente económica

Se pueden procesar hasta96 muestras por placa

Gran estabilidad.

Positividad Vs. Infecciónactiva: depende del tipo de

anticuerpo evaluado. Amenos que se evalúe

presencia de antígenos en lamuestra problema

Dificultad de detección deAcs en pacientes con alguna

inmunodeficiencia, enperíodo de ventana oinfectados por cepas

desconocidas.

Limitaciones

Técnica de ELISA

ELISADiagnóstico de la Infección por VIH-1

Infección por VIH-1

http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf

Infecciónpor VIH-1

p24 de VIH-1

ARN de VIH-1 Anticuerpos anti-VIH-1

Díasde Infección

Infección Aguda Infección Crónica

Ventana de Seroconversión

Período de Eclipse


ELISA de 1ra. Generación


Sensibilidad LimitadaProteínas Celulares Contaminantes

Reactividad Cruzada

Fase deCaptura

Ag de VIH-1Lisado Viral

(Cultivo Celular)


IgG anti-VIH-1Anticuerpos en

Sangre del Paciente

Fase deDetección


Enzima

Revelado

Reacción de ColorSustrato Apropiado


Infecciónpor VIH-1

p24 de VIH-1


Díasde Infección



Período de Eclipse

Diagnóstico de la Infección por VIH-1



ELISA de 2da. Generación


Fase deCaptura

Ag de VIH-1/VIH-2Péptidos Sintéticos

Proteínas Recombinantes


IgG anti-VIH-1/VIH-2Anticuerpos en

Sangre del Paciente

Fase deDetección

Anti-IgGProteína A

Conjugados aEnzima

Revelado


VIH-1, VIH-2Mejora Sensibilidad

No Proteínas Celulares ContaminantesMejora Especificidad


Infecciónpor VIH-1

p24 de VIH-1


Díasde Infección



Período de Eclipse




ELISA de 3ra. Generación


Fase deCaptura

Ag de VIH-1/VIH-2Péptidos Sintéticos



IgM e IgG anti-VIH-1/VIH-2

Anticuerpos enSangre del Paciente

Fase deDetección

Ag ViralesConjugados a

Enzima

Revelado


VIH-1, VIH-2Detecta IgM e IgG

Detección más Temprana


Infecciónpor VIH-1

p24 de VIH-1


Díasde Infección



Período de Eclipse




ELISA de 4ta. Generación


Revelado


Fase deCaptura

Anti-p24Ag de VIH-1/VIH-2Péptidos Sintéticos



Ag p24IgM e IgG

anti-VIH-1/VIH-2Ac y Ag en

Sangre del Paciente

VIH-1, VIH-2Detecta Antígeno Viral (p24)

Detecta IgM e IgGDetección más Temprana

Fase deDetección

Anti-p24Ag Virales

Conjugados a Enzima

E


Infecciónpor VIH-1

p24 de VIH-1


Díasde Infección



Período de Eclipse


http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdfNeonatos

de madres infectadas

WESTERN BLOTDiagnóstico de la Infección por VIH-1

Western Blot

Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, técnica analíticaaltamente específica utilizada para identificar proteínas específicasen una mezcla compleja de proteínas, presente en extractoscelulares o de tejidos.

Etapas:1. Preparación de la muestra

2. Separación de la muestra por tamaño (Electroforesis en gel depoliacrilamida)

3. Transferencia a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa )

4. Visualización mediante marcaje de proteínas con el uso deanticuerpos primarios o secundarios apropiados.

Western blot

Aplicaciones:

Investigación: Es una de las técnicas más usadas en el estudio de labiología molecularPermite identificar antígenos inmuno-dominantes para vacunas.Estudiar perfil de citocinas.Presencia o ausencia de una proteína y sus niveles en una muestra.Factores de crecimientoNiveles de fosforilación, modificaciones post-traduccionales, etc.

Diagnóstico:Prueba confirmatoria de VIH

Prueba de la encefalopatía espongiforme bovina, comúnmentellamada “enfermedad de las vacas locas”

Enfermedad de Lyme.

http://images.slideplayer.es/1/121053/slides/slide_53.jpg

Diagnóstico de la Infección por VIH-1Algoritmo Recomendado – CDC 2014


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