UNIVERSIDAD AUTóNOMA METROPOLITANA /

UNIDAD: IZTAPALAPA

DIVISIóN: CIENCIAS BASICAS DE LA SALUD

CARRERA: LICENCIATURA EN BIOLOGÍA

MATERIA: SEMINARIO DE INVESTIGACI~N

TÍTULO: “OBTENCI~N DE MONOCONIDLALES Y CUANTIPICACI~N DE ESPORAS DE COLLETROTRICHUM GLOESPOROIDES, PENZ; SPHACELOMA PERSEA, JENKIN, CAUSANTES DE LA ANTRACNOSIS Y ROÑA DEL AGUACATE PERSEA AMERICANA, MILL VAR EíASS EN EL ESTADO DE MICHOACÁN”

FECHA: 12 DE ENERO DE 1998

ALUMNO: PATRICIA W A S VALENCIA

IMATRÍCULA: 92231400

ASESOR: ING. ROSA MARíA GALICLA CABRERA

“OBTENCIóN DE MONOCONIDIALES Y CUANTIFICACIÓN DE ESPORAS DE COLLETOTRICHUM GLOESPOROIDES, PENZ; SPHACELOMA PERSEA, JENKIN, CAUSANTES DE LA ANTRACNOSIS Y ROÑA DEL AGUACATE PERSEA AMERICANA, MILL VAR. HASS EN EL ESTADO DE MICHOACÁN”

INTRODUCCI~N El aguacate en México se ha aprovechado desde antes del tiempo de la colonia.

La tecnología utilizada para mejorar la producción antes del presente siglo se basó en la propagación del aguacate criollo selecto. El mejoramiento genético del aguacate criollo decreció paulatinamente a inicio de la década de los 60’s con la introducción de la variedad “Fuerte” traída de los Estados Unidos, y las huertas criollas fueron sustituidas, por variedades como H a s , Choquette, Booth 8, Collins, Nábal, Atlixco, Bacón, Puebla, Zutano, entre otras. El mercado pronto determinó como preferida a la variedad Hass y actualmente ocupa el primer lugar en superficie plantada (Gómez, 1984).

México es considerado como el principal productor de aguacate a nivel mundial, con un promedio de producción de 730 000 ton durante los últimos cinco años. La superficie cultivada de aguacate en México es de 124 829 ha. con una producción estimada de 1 100 O00 ton ( S M , 1994). México junto con la República Dominicana ocupa el primer lugar mundial en consumo per capita, estimada alrededor de 8 kg./año.

Además de México, solo los Estado Unidos de América, la República Dominicana y Brasil producen más de 100 000 ton anuales. Los dos últimos consumen casi la totalidad de su producción, mientras que México y Estados Unidos son importantes exportadores junto con Sudáfiica, Israel y Chile. A pesar de que México es el principal productor de aguacate a nivel mundial solo exporta alrededor del 3% de su producción total. (FAO, 1994 y SARH, 1994). Las exportaciones mexicanas se realizan a países como Francia, Estados Unidos, Canadá y Japón principalmente.

Michoacán es el principal estado productor de aguacate a nivel nacional, desde la década de los ~ O ’ S , aporta alrededor del 83% de la produccibn nacional. Los municipios que cultivan aguacate en mayor superficie son alrededor de 25, 10s de mayor producción son de Uruapan, Peribán, Tancítaro, San Juan Nuevo, Tacámbaro, Ario de Rosales, Tingüindin, Zitácuaro, Atápan, Salvador Escalante, Ziracuaretiro entre otros.

Los factores de calidad que mas han limitado la exportación actual son: corte de fruta tierna con porcentajes inadecuados de aceite o contenido de materia seca, un volumen alto de producción con tamaño chico y mediano que no alcanzan los calibres preferidos para la exportación, y la presencia de k t a manchada, este manchado de fruto es debido principalmente por la antracnosis, infección que provienen del campo o contaminaciones que se dan durante la cosecha, proceso, empacado, almacenamiento y transporte. (Lázaro 1985 y Martinez, 1995).

En el Estado de Michoacán la antracnosis se encuentra distribuida en el total de los municipios donde se cultiva el aguacate; los daflos por este hongo se presentan desde que los fi-utos se forman, durante su desarrollo en al árbol, en el traslado, almacenaje y comercialización. Esta enfermedad requiere de un gran numero de aplicaciones de pesticidas para su control y en algunas localidades afecta la producción hasta un 64 %. Los municipios más afectados son: Tacámbaro 74%, Tingiiindín 67%, Uruapan 57%, Peribán 50% y Zitácuaro 42%. (Morales y Vidales, 1994).

La roña al igual que la antracnosis, se reporta en toda la región aguacatera. El hongo afecta hojas, ramas jóvenes, pedúnculo y fi-utos, los daños son unicamente en el pericarpio y no afecta la pulpa los daños se reducen a la calidad del h t o y su valor hasta en un 50 %. Humedades relativas de 80 a loo%, temperaturas de 22 a 26OC, altas densidades de plantación, daños mecánicos por viento y por insectos favorecen la infección. El fruto es más susceptible desde la etapa de cuajuado y hasta la mitad de su desarrollo (Morales y Vidales, 1994). Los municipios más afectados son: Tacámbaro, Los Reyes, Tingambato y Villa Escalante.

DURACIóN Y ETAPAS

La realizacibn de este trabajo tuvo una duración de tres trimestres, se organizó en las siguientes etapas:

1. Muestre0 en campo.

2. Identificación, cuantifícación de esporas y aislamiento del agente patbgeno.

3. Realización de monoconidiales.

OBJETIVOS GENERALES

Aislamiento y obtención de monoconidiales del agente causal de la antracnosis y rofia; así corno determinar su dinámica poblacional en las principales localidades aguacateras del Estado de Michoach.

Determinar la distribución geográfica de los aislamientos de Colletotrichum gloeosporioides, Penz y Sphaceloma persea, Perkin.

OBJETIVOS ESPECiFICOS

l . Realizar visitas al Estado de Michoach a las principales localidades aguacateras: Uruapan, Peribán, Tancítaro, San Juan Nuevo, Tacámbaro, Ario de Rosales, Tingtlindín, Zitácuaro, Atápan, Salvador Escalante, Ziracuaretiro, para conocer e identificar los hongos causantes de la antracnosis.

2. Recolectar frutos infectados con Colletrotrichm gloeosmrioides de las distintas localidades.

3. Conocer y aplicar las técnicas de muestre0 de esporas por el método de sedimentación: gravedad e inercia.

4. Cuantificación del número de esporas atrapadas por l a s trampas colocadas en l a s localidades.

5. Realizar aislamientos y reaislamientos de los hongos causantes de la antracnosis de los huertos aguacateros de Michoacb.

6. Obtención de monoconidiales por localidad.

METODOLOGÍA UTILIZADA

Colocación de la Trampa: Se colocó una trampa para colectar esporas en cada una de las huertas seleccionadas; estas fueron tres huertas situadas en la tres diferentes zonas ecológcas de Michoacán: alta, media y baja. Conectada a una &ente de corriente eléctrica y se pondrá a fúncionar una semana por mes. La cinta diurex que se colocó se cubre con una delgada cinta de vaselina sólida y ahí quedaron atrapadas las esporas.

La cinta se corta en siete pedazos iguales, los cuales corresponden a los siete días de la semana, dichas secciones se colocan en un portaobjetos al cual previamente se la adicionara glicerina. Las esporas atrapadas se cuantifican observando bajo el microscopio de l u z un cm cuadrado escogido al azar en el día correspondiente.

Muestre0 de frutos: Se visitaron diferentes localidades aguacateras de l a s cuales se tomaron fiutos al azar y cuantificando la incidencia de las enfermedades y así mismo de estos fi-utos se obtuvieron cultivos de los hongos.

Preparacih de medios de cultivos: Para la preparación del medio Papa- Dextrosa-Agar ( I litro):

Se esterilizan 40 cajas de Petri, en paquetes de 10 cajas envueltos en papel aluminio a 120°C por 15 min. En dos matraces Erlenmeyer se hace una mezcla de 500 m1 de agua destilada con 19.5 g de PDA, por cada uno (39 g/l) y se esterilizan a 12OOC por 15 min.; y se le agregan 6 gotas de ácido láctico al 85% a cada uno de los matraces y se agitan uniformemente; posteriormente se vacía una capa delgada del FDA en las cajas de Petri, se dejan enfriar y así están listas para ser utilizadas.

Preparación Papa-Dextrosa PD ( 1 litro)

Se requieren de 200 g de papa pelada y cortada en cuadritos por litro de medio de cultivo, y se coloca en un vaso de precipitado de 1 1, con 500 m1 de agua destilada, se pone a hervir y una vez que la papa ya esta cocida se filtra, el líquido obtenido se afora a 1 O00 m1 con agua destilada agregándosele 12 g de dextrosa, esta mezcla es repartida en 4 matraces Erlenmeyer con 250 m1 de éSta; se esterilizan y se dejan enfriar, y de esta manera tenemos el medio que se utilizara para obtener los monoconidiales.

Preparación Avena-Agar (1 litro)

Los ingredientes necesarios para su preparación son: 60 g de Avena, 12 g de Agar, 2 gramos de Extracto de levadura y agua destilada. En 500 m1 de agua destilada se pone a remojar la avena durante 24 hr, después se hierve durante 30 min., se filtra a través de una manta de cielo. Para clarificar la solución colada se centrihga durante 20 min. a 3 000 r.p.m. se dacanta y se colecta el liquido sobrenadante. Se disuelve el agar y el extracto de levadura en 500 m1 de agua destilada licuado a 15 Ibs/pul2 y 120°C durante diez a quince minutos, finalmente se añade la solución de extracto-levadura a la infusión de avena centrihgada, mezclar bien y aforar con agua destilada a 1 O00 ml.

Obtención del agente patógeno: Se lavan los fi-utos infectados con jabón detergente fiotándolos fuertemente y se enjuagan abundantemente, se seleccionan partes donde existe tejido enfermo y sano y se cortan cuadritos de estas zonas, se lavan en una caja de Petri estkril con hipoclorito de sodio al 3% por 30 seg. y se enjuagan varias veces con agua estéril, se secan con “sanitas” estériles y se siembran cuatro muestras por caja de Petri con PDA o Avena-Agar en la cámara de siembra, en condiciones lo más asépticas posibles; a cada una de la cajas se les pone una clave para identificar de que muestra proceden y se dejan en la estufa de incubación a 28OC, se revisan a los dos días siguientes y si existe algún contaminante se transfieren de inmediato a otra caja de Petri.

Identificación del patógeno: Para poder identificar al patógeno es necesario realizar preparaciones para poder observar al microscopio y determinar si el aislamiento nos interesa y para ello necesitamos colocar una pequefía muestra del hongo que colocaremos dentro de una gota de lactofenol en un portaobjetos y lo diseminamos, lo cubrimos con un cubreobjetos y lo observamos.

Aislamiento del patógeno: Se hicieron aislamientos de Colletrotrichum ploeosporioides y Sphaceloma persea de cada una de las huertas de donde se obtuvieron solo monoconidiales de Colletrotrichum que heron utilizados para ser liofilizados y poder obtener DNA.

Obtención de monoconidiales: Una vez obtuvimos poblaciones de Colletrotrichum gloeosporioides puras, estas son traspasadas al medio de cultivo líquido PD, para promover su espurulación y así con una asa bacteriológica sembrar una alícuota del medio con esporas en una caja de Petri con rayado y a las 24 hrs obtener la colonia rnonoconidial y traspasarla a otra caja de Petri donde también se traspasan a un tubo de ensayo con PDA y aceite mineral para darles una condición anaerobia que nos permite conservarlo por mucho tiempo.

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS

Se realizó una visita al Estado de Michoacán con una duración de cuatro días en los que visitamos diferentes localidades aguacateras en Uruapan, Peribán, Tancítaro, San Juan Nuevo, Tachbaro, Ario de Rosales, Tinguindín, Zitacuaro, Atápan, Ziracuaretiro.

En estas localidades pude observar diferentes patologias que atacan al aguacate y que son también de mucha importancia para este cultivo entre otros, así como tambikn diferentes técnicas de riego y como éste puede ser determinante para el establecimiento de las enfermedades; este recorrido se realizb con varios de los integrantes del proyecto de “manejo integrado del Aguacate” por lo que fueron acarólogos, fitopatólogos, especialistas en el manejo integrado y poscosecha lo que hizo de esta visita muy rica porque pude colaborar con esta gente especializada y a la vez aprender otros problemas a los que se enfrentan estos cultivos tan importantes para México.

Recolecte frutos con síntomas de antracnosis y roña en cada una de estas localidades que heron identificados con una clave para ser materia de estudio en el laboratorio de frutipatología del Colegio de Posgraduados de Chapingo.

En cuanto a la técnica de muestre0 de esporas en las huertas El Durazno, La Loma y El mesón , se observó la trampa de esporas y su colocación, así como también el retiro de las cintas adhesivas de la trampa.

Para la cuantificación de esporas de Colletrotrichum y Sphaceloma se recibió un entrenamiento previo en la Escuela de Agricultura de Uruapan con la gente encargada de recoger estas cintas, para identificar l a s esporas.

Se realizaron siembras con los frutos recolectados previamente para el aislamiento de Colletrotrichum y Sphaceloma, que posteriormente se realizaron para la obtención de monoconidiales.

Al final también se realizaron análisis de regresión múltiple para tratar de definir un modelo de predicción para determinar esporas criticas para el establecimiento de la antracnosis y rofía del aguacatero.

Como se puede observar los objetivos se alcanzaron y se rebasaron las metas obtenidas fueron conocer de manera general la problemhtica a la que enfrentan los productores en este tipo de cultivo y la forma de atacar dichos problemas así como la conviccidn de seguir en este tipo de investigación en el fituro con la realización de una maestría en el esta área del conocimiento.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

De las localidades antes sefialadas podemos observar que para el caso de un síntoma de rofia no encontramos al agente patbgeno como Sphaceloma persea, en su lugar esta Alternaria spp. o Colletrotrichum nloesporoides, aún cuando se trataron a estas muestras con otro tipo de medio de cultivo que según la bibliografia era el más adecuado para su crecimiento, la realidad es que para Sphaceloma persea es dificil poder aislarlo en laboratorio, se trató también de aislar a partir de las esporas que cayeron en la trampa pero tampoco fbncionó; lo que nos permite pensar que tal vez las condiciones nunca heron las adecuadas para lograr el crecimiento del hongo o que en el caso de la roAa éste patógeno no actúe solo y por eso obtenemos Alternaria spp. o C. doesporoides.

En la obtención de monoconidiales se obtuvieron dos por cada una de las localidades de la Tabla 1, a los que se les otorg6 una clave de identificación basándose en el área ecológca a la que pertenecían, posteriormente guardados en tubos de ensaye con PDA y aceite mineral para darles una condición anaerobia que nos permita conservarlos por un largo periodo de tiempo.

Para la cuantificación de esporas se necesito de una capacitación previa, primero reconocer e identificar los conidios o esporas de Colletrotrichum gloesporoides y Sphaceloma persea, esta etapa fue la que representó un mayor tiempo; despuks se realizaron conteos en preparaciones que ya habían sido cuantificadas para saber si el conteo que se realizaba era exacto o se necesitaba de más practica; las cintas que se cuantificaron correspondieron a los meses de septiembre, octubre de 1996; enero, febrero marzo, para Sphaceloma y septiembre, octubre, enero febrero, marzo, abril, mayo y julio para Colletotrichum; que dando las siguientes tablas:

TABLA 2

CONTEO DE ESPORAS COLLETOTRICHUM GLOESPOROIDES, PENZ ZONA ECOL~GICA ALTA HUERTA C L ~ ~ DURAZNO”

TABLA 2

CONTEO DE ESPORAS COLLETOTRICHUM GLOESPOROIDES, PEN2 ZONA ECOLÓGICA MEDIA HUERTA “LA LOMA”

TABLA 2

CONTEO DE ESPORAS COLLETOTRICEIUM GLOESPOROIDES, PENZ ZONA ECOL~GICA BAJA HUERTA “EL ME SON^

TABLA 3

CQNTEO DE ESPORAS SPaACELOMA PERSEA, JENKINS ZONA ECQLÓGICA ALTA HUERTA "EL DURAZNO"

TABLA 3

CONTEO DE ESPORAS SPHACELOMA PERSEA, JENKINS W N A ECOIhGICA MEDIA HUERTA “LA LOMA”

TABLA 3

CONTEO DE ESPORAS SPHACELOMG PERSEA, JENKINS ZONA ECOL~GICA BAJA HUERTA U~~ ME SON^

Para la tabla 3 se hizo un análisis de regresión múltiple para tratar de definir un modelo de predicción y determinar las poblaciones de esporas criticas para el estabIecimiento de la roAa y para ello se necesito de datos climáticos que se habían realizado con Ias estaciones de registro automático (Weather Monitor n>, con las que cuentan estas huertas.

En la zona ecológica alta el trampeo de esporas de roña en correlación con la temperatura mínima presentó una Prob> F= 0.072 lo cual indica que fue significativo, además el ajuste del modelo es bueno ya que se tiene una r2= 0.83. Analizando los parámetros estimados la temperatura mínima y la humedad relativa influyen directamente en la variable respuesta (gráfico l), que es la liberación de las esporas de Sphaceloma persea con un nivel de significancia de 0.032.

Para la zona ecológica media, no se encontró correlación significativa con ninguna de las variables, sin embargo se puede decir que la variable humedad relativa tiene influencia en la liberacih de las esporas. (gráfico 2)

En la mna ecológica baja, tampoco se encontró correlación entre estos factores y la liberación de esporas, pero existe cierta influencia de la temperatura mínima y la humedad relativa con la liberación de las esporas de Sphaceloma; lo anterior puede deberse a que se requiere de un mayor numero de datos para observar la influencia de dichos factores.(gráfico 3)

Con este análisis multivariado concluí mi proyecto de investigación , aunque todavía quedó mucho por hacer; el campo de la fitopatología es muy amplio y variado por lo que se necesita de tiempo completo.

RECOMENDACIONES

El estudio en la investigación de fitopatógenos en los cultivos, es sumamente importante para el desarrollo económico del país por lo que debemos esforzarnos para prepararnos y preparar cada vez más, a gente que se desarrolle en esta área y así contribuir con el desarrollo mismo del país; más aún cuando un biólogo con una visión más amplia del equilibrio ecológico puede llegar a crear un manejo integrado de los recursos, que pueda dejamos un mayor provecho.

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