UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANAIZTAPALAPA

__________________________________________________________________DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUDLICENCIATURA EN BIOLOGÍA EXPERIMENTAL

“DETERMINACIÓN DE LA CURVA TEMPORAL DELEFECTO ANTIOXIDANTE DE LA QUERCETINA EN UN

MODELO DE LESIÓN TRAUMÁTICA DE MEDÚLA ESPINAL”

PRESENTA:JULIO CÉSAR CÁRDENAS PÉREZ.

Asesores:Dra. Hermelinda Salgado Ceballos.

M.en B.E. Mina Konigsberg Fainstein.

México, D. F. Junio del 2004

2

RESUMEN

Objetivo: Evaluar a diferentes tiempos la capacidad de la quercetina para

disminuir el proceso de lipoperoxidación (LP) en un modelo animal de lesión

traumática de médula espinal (LTME) y comparar su efecto con el de antioxidantes

como la superóxido dismutasa (SOD) y la catalasa (CAT).

Material y métodos: Se estudiaron 108 ratas Long-Evans, adultas, divididas en 6

grupos: Ratas sham; Ratas con LTME sin tratamiento; Ratas con LTME y

vehículo; Ratas con LTME SDO+CAT; Ratas con LTME y quercetina; Ratas con

LTME y quercetina+SDO+CAT. La LTME se realizó con el equipo de cirugía

estereotáxica NYU impactor. Los tratamientos se administraron como dósis única

5 minutos después de la LTME a razón de 1.2 y 2.5mg/ml/Kg de peso corporal

para SDO y CAT respectivamente y la quercetina a 0.5 y 1.0 mg/ml/Kg de peso

corporal. Los animales fueron sacrificados por decapitación 1, 2 y 24 horas

después de la LTME. Se obtuvo la médula espinal y se analizó por

espectofotometría el proceso de LP mediante la concentración de bases de Schiff.

Resultados: Se estudiaron 6 animales por grupo para cada tiempo,

encontrandose que una sola dósis intraperitoneal de quercetina tiende a disminuir

la LP 1 hora y 24 horas después de la LTME, pero no a 2 horas. La administración

combinada de quercetina con SDO y CAT produce mejores resultados.

Conclusiones: La quercetina disminuye la LP después de una LTME, pero deben

administrarse varias dósis para obtener una neuroprotección óptima y duradera.

La combinación de quercetina/SDO+CAT tiene mejor efecto sobre la LP que

cuando se administran por separado.

3

INTRODUCCION

La lesión traumática de la médula espinal (LTME) es un problema de salud pública

que pone en riesgo la vida de los pacientes en fase aguda y en los que sobreviven

puede producir incapacidad a largo plazo con pérdida permanente del control

voluntario en la locomoción y el soporte corporal, además de generar una gran

variedad de disfunciones sensitivas y autonómicas con devastadoras

repercusiones personales, económicas y sociales (Whiteneck et. al., 1992; Dituno,

1994 y Fehlings, 2001).

De acuerdo a la intensidad con la que se produce el daño, la LTME ocasiona

alteraciones estructurales y funcionales que oscilan desde el bloqueo transitorio de

la conducción de los impulsos nerviosos, hasta la pérdida total de las funciones

motora y sensitiva por debajo del sitio dañado, traduciéndose en paraplejia si solo

afecta miembros inferiores o en tetraplejia si afecta miembros inferiores y

superiores (Tator y Fehlings, 1991).

A nivel mundial la LTME presenta una incidencia anual que oscila entre 12 y 40

casos por millón (Whiteneck et al., 1992; Dixon et al., 1993; Dituno y Formal, 1994;

Tator, 1995 y Fehlings, 2001), reportándose específicamente para nuestro país, en

el único estudio que existe hasta la fecha, una incidencia anual para la zona

metropolitana de 12 casos por millón (Ibarra et al., 1990).

Aproximadamente, el 80% de las personas con LTME son del sexo masculino

(Bracken et al., 1992 y Fehlings, 2001) y al momento de la lesión alrededor del

75% se encuentra entre los 15 y los 35 años de edad (Eisenberg y Tierney, 1985;

Tator y Fehlings, 1991 y Fehlings, 2001), ubicándose entre las principales causas

de esta patología a los accidentes de tránsito en vehículos motorizados, los

accidentes en la práctica deportiva, los accidentes en el trabajo y en actividades

4

de recreación, la violencia y las caídas (Tator y Fehlings, 1991; Tator, 1995 y

Fehlings, 2001).

A pesar de los avances en los cuidados médicos e incluso en los centros de

atención especializados, la mortalidad en individuos con LTME se reporta entre 6 y

17% (DeVivo et al., 1990; Burney et al., 1993) y la frecuencia del suicidio entre los

pacientes parapléjicos rebasa 10 veces la reportada en poblaciones similares pero

sin este tipo de lesión (Rish et al., 1997).

Por todo lo anterior, la LTME representa un gasto económico elevado que

comprende el ocasionado por el tratamiento inicial y el del manejo para reintegrar

socialmente a los pacientes, incluyendo las terapias de rehabilitación, los aparatos

ortopédicos, las sillas de ruedas y las adaptaciones especiales requeridas

(Stripling, 1990 y Fehlings, 2001).

Fisiopatología de la Lesión Traumática de Médula Espinal.El principal problema en una LTME radica en su complejidad, ya que su

fisiopatología involucra tanto al daño mecánico primario como, a los mecanismos

secundarios de lesión. Lo relevante es que la mayor parte de la destrucción del

substrato anatómico necesario para la recuperación neurológica, y el déficit

funcional total, son el resultado de los mecanismos secundarios de lesión más que

del daño mecánico primario (Young y Flamm, 1982; Stokes et al., 1983; Iizuka et

al., 1986; y Fehlings, 2001).

Entre los mecanismos secundarios de lesión se considera a la isquemia como uno

de los más relevantes, ya que suele estar seguido por una fase de reperfusión

tisular la cual puede incrementar el daño en la médula espinal al promover el flujo

de especies reactivas de oxigeno (ERO) y otros productos tóxicos que

desencadenan numerosos procesos autodestructivos y producen déficit funcional

permanente (Tator y Fehlings, 1991; Lu et al., 2000 y Fehlings, 2001).

5

La acidosis resultante de la isquemia, interfiere con la función enzimática normal

(Ganong, 1980), proporciona un medio ambiente favorable para la formación de

ERO (Hogg, 1998) y la subsecuente lipoperoxidación (LP), que se ve

incrementada por la presencia de hierro (Thomas et al., 1985; Gutteridge, 1986).

Especies reactivas de oxigeno (ERO)Las ERO presentan una alta reactividad y son capaces de reaccionar con una

amplia gama de estructuras celulares. Se conoce que sus blancos fundamentales

son los ácidos grasos insaturados de las membranas fosfolipídicas, proteínas y

ácidos nucleicos. Estas especies, altamente reactivas, una vez formadas dan lugar

a una serie de reacciones en cadena que pueden dañar todas las moléculas de

importancia biológica ya sea por una alteración directa de la estructura y función,

por la aceleración de la proteólisis endógena selectiva o por el incremento de la

función enzimática (Zorrilla A., et.al. ,1999).

Como se señalo anteriormente, la LP es uno de los mecanismos de la

degeneración neuronal secundaria postraumática (Demopoulos et. al.,1980), pues

si ésta es suficientemente severa, lisa las membranas a través de la formación de

ERO en los fosfolípidos estructurales de la mielina, en los de las membranas de

las células gliales y en los de las neuronas, lo cual genera la disolución del tejido

nervioso debido a que los lípidos de las membranas son especialmente ricos en

colesterol y ácidos grasos poli-insaturados, quienes son blanco predilecto de los

compuestos activos de oxigeno y de peróxido de hidrógeno (Hall y Wolf,1986; Hall

et. al.,1992). La formación de ERO en el sitio de lesión también es resultado de la

respiración mitocondrial en la etapa de isquemia-reperfusión, de la conversión

irreversible de la deshidrogenasa de xantina a oxidasa de xantina, la auto-

oxidación de las catecolaminas, la activación de la cascada del ácido araquidónico

y de neutrófilos, los cuales dañan las membranas de los lisosomas dando por

resultado la liberación de enzimas hidrolíticas (Hammond B., 1985).

6

Los radicales superóxido(O2°-), el peroxido de hidrógeno (H2O2) y los radicales

hidroxilo(°OH) son ERO implicadas en el daño de la medula espinal, la mielina y la

muerte de los oligodendrocitos después de una LTME (Watson y Ginsberg, 1987;

Farooqui y Horrocks,1998). La susceptibilidad del sistema nervioso central al

daño inducido por las ERO no sólo está dada porque sus lípidos de membrana

son especialmente ricos en colesterol y ácidos grasos poli-insaturados, sino

también, porque el SNC es pobre en la actividad de catalasa (CAT) y de glutatión

peroxidasa y tiene una cantidad moderada de superóxido dismutasa (SOD),

antioxidantes naturales que en otras partes del organismo son eficaces

neutralizando el proceso de LP (Cohen,1994). Además, el SNC es rico en hierro y

éste es el principal inductor de la producción de ERO en el sistema (Anderson et.

al.,1985; Hall et. al.,1994).

AntioxidantesTodos los seres vivos que utilizan el oxigeno para obtener energía, liberan ERO, lo

cual es incompatible con la vida a menos que existan mecanismos celulares de

defensa que los neutralice. A estas defensas se les denomina antioxidantes,

dentro de los antioxidantes endógenos se encuentran 3 enzimas que son

fundamentales en esta actividad; la CAT, la SOD y la glutation peroxidasa (Gilgun-

Sheki Y.,et. al.;2001).

La CAT es una hemoproteína tetramérica que presenta hierro en su núcleo, esta

localizada en los peroxisomas, con una doble actividad (dismutasa y peroxidasa)

la cual cataliza la reacción de reducción del peroxido de hidrógeno.

H2O2 + H2O2 ----------- 2H2O + O2 Actuando como dismutasa

H2O2 + RH2 ---------- 2H2O + R Actuando como peroxidasa

La catalasa ha sido utilizada a tratar procesos en los cuales el H2O2 ha sido

involucrado como agente deletéreo en lesiones inflamatorias (Till, et.al.,1982).

7

La SOD fue la primer enzima que se conoció que actuaba sobre una ERO. De esta

enzima se conocen tres diferentes tipos: la citoplasmática, mitocondrial y una de tipo

extracelular. El tamaño y características de esta enzima evita que se transporten a

través de las membranas celulares, por lo que en la actualidad se han desarrollado

compuestos miméticos que tienen una actividad similar y además, si pueden atravesar

las membranas celulares.

La SOD mimética es una molécula con la capacidad de atravesar a las membranas

celulares, tiene la misma función que la SOD, dismutando el anión superóxido (O2°-) y

formando peroxido de hidrógeno (H2O2) y oxigeno molecular (O2).

O2°- + O2°- ------------- H2O2 + O2

Estudios realizados en hepatocitos de ratas indican que el 20% de O2°- que se forma

en la mitocondria puede pasar al citosol, mientras que el 80% restante puede ser

neutralizado por la SOD mitocondrial, dejando ver la importancia de esta enzima

evitando el estrés oxidativo. La SOD ha mostrado efecto protector en diferentes

patologías como son, procesos inflamatorios (Frank.,1983), en tejidos sometidos a

isquemia (Mc Cord.,1985), e incuso en LTME (Santoscoy, et. al.,2002).

En fecha reciente se han investigado compuestos externos con propiedades

antioxidantes buscando una mejor protección de la integridad y de la función

nerviosa en algunos modelos experimentales de lesión por ERO en el sistema

nervioso central, destacando entre dichos compuestos los flavonoides (Gilgun-

Sherki Y., et . al.,2001).

Actualmente se sabe que los flavonoides poseen numerosos efectos

farmacodinámicos en el organismo animal, de los cuales sobresale su potente

actividad antioxidante, ya que participa en numerosos procesos de oxido

reducción catalizando las reacciones debido a que tienen la particularidad de

perder fácilmente sus electrones. La utilidad terapéutica de la capacidad

antioxidante de los flavonoides se ha convertido en uno de los campos de mayor

8

interés en el estudio de compuestos vegetales medicinales (Chen, et. al.,2001;

Kim, et. al.,2001; Bastianetto, 2002).

La quercetina (Fig 1) es un flavonoide natural que se encuentra presente en todas

las plantas. Se trata de un compuesto polifenólico, que tiene actividad

antioxidante, cardiovascular, antiinflamatoria, antitumoral, inmunológica,

antibacteriana y antiviral (Hirono, 1987; Pietta, 2000; Russo, et al., 2000; árka

Ozgová, et. al.,2003). Entre las muchas propiedades descritas para la quercetina

resalta su capacidad antioxidante al reducir la LP en la célula nerviosa in vitro e

inhibiendo la activación de la caspasa-3, promotora de la muerte celular por vía

apoptótica (Bisland, 2002 Spencer, et. al.,2003), por lo que la quercetina bien

podría ser utilizado como un agente neuroprotector en LTME.

Figura 1. Estructura bioquímica de la quercetina

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OBJETIVO GENERAL

Evaluar a diferentes tiempos la capacidad de la quercetina para disminuir el

proceso de lipoperoxidación (LP) en un modelo animal de lesión traumática de

médula espinal (LTME) de intensidad moderada y comparar su efecto con el de

antioxidantes como la superóxido dismutasa (SOD) y la catalasa (CAT).

Objetivos particulares

1. Evaluar si se obtiene un mejor efecto al utilizar la quercetina purificada o

cuando se emplea en forma de extracto.

2. Evaluar con que dosis de quercetina se obtiene mejores resultados sobre el

proceso de LP, si con 50 ó con 100 µmol/Kg de quercetina administrada a

diferentes tiempos (1,2 y 24h).

3. Determinar la curva temporal del efecto antioxidante de la quercetina

después de una LTME tomando como puntos de corte 1,2 y 24 horas

después de su administración.

4. Comparar la capacidad antioxidante de la quercetina con el de la SOD y el

de la CAT al inhibir el proceso de LP en un modelo de LTME.

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MATERIAL Y MÉTODO

Los estudios piloto se realizaron en 35 ratas de la cepa Long-Evans, hembras,

adultas (12 a 14 semanas de edad) con peso de entre 200 y 300 g, divididas en

7 grupos:

Grupo 1. Ratas sanas a las que se les realizó la misma maniobra quirúrgica que a

los demás grupos pero no se les produjo la LTME y no se les administro

tratamiento alguno (Sham)

Grupo 2. Ratas con LTME y sin tratamiento.

Grupo 3. Ratas con LTME y administración de vehículo (Polietilenglicol).

Grupo 4. Ratas con LTME y quercetina (0.5 mg/ml/kg de peso corporal)

Grupo 5. Ratas con LTME y quercetina pura (1.0 mg/ml/kg de peso corporal)

Grupo 6. Ratas con LTME y extracto de quercetina (0.5 mg/ml/kg de peso

corporal)

Grupo 7. Ratas con LTME y extracto de quercetina a razón de 1.0 mg/ml/kg de

peso corporal

El estudio experimental propiamente dicho, se realizó en 108 ratas de la cepa

Long-Evans, hembras, adultas (12 a 14 semanas de edad) con peso de entre

200 y 300 g, las cuales se dividieron en 6 grupos, constituidos por 6 ratas cada

uno.

Grupo 1. Ratas sanas a las que se les realizó la misma maniobra quirúrgica que a

los demás grupos pero no se les produjo la LTME y no se les administro

tratamiento alguno (Sham)

Grupo 2. Ratas con LTME y sin tratamiento.

Grupo 3. Ratas con LTME y administración de vehículo (Polietilenglicol).

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Grupo 4. Ratas con LTME y administración de SOD + CAT.

Grupo 5. Ratas con LTME y administración de quercetina

Grupo 6. Ratas con LTME y administración de quercetina+SOD+CAT.

Todos los procedimientos quirúrgicos y experimentales se realizaron con apego a

las normas de la Ley General de Salud (1990) y de acuerdo a las

recomendaciones del capítulo referente al manejo de animales en proyectos de

investigación y ciencia, así como de la norma oficial mexicana para animales de

laboratorio (Aluja., 2002).

Criterios de inclusión.Se incluyeron todas las ratas con las características referidas previamente y que al

ser sometidas a la LTME presentaron un hematoma en la zona central de la

médula espinal.

Criterios de exclusiónSe excluyeron todas las ratas cuyo hematoma fue lateralizado con respecto a la

zona central de la médula espinal y las ratas que no completaron el tiempo de

evaluación propuesto.

Técnica anestésica:

Antes de cada procedimiento quirúrgico los animales se anestesiaron con una

mezcla de ketamina (clave 226, sector salud) e hidrocloruro de xilacina (Bayer) a

dosis de 77.5 y 12.5 mg/Kg de peso corporal respectivamente.

Lesión traumática de la médula espinal.

Bajo el efecto de la anestesia, previa asepsia y antisepsia, se realizó una incisión

media sagital en la piel de la región torácica baja y se disecaron los músculos

paravertebrales de las apófisis espinosas. Posteriormente, se separo el periostio

de las láminas vertebrales. Se extirparon tres apófisis espinosas de torácica 8 a 10

(T8-T10) para visualizar ampliamente las láminas correspondientes.

12

Posteriormente se extirpó la lámina a nivel de T9, para exponer la porción dorsal

de la médula espinal sin lesionarla y manteniendo las meninges intactas los

animales programados para LTME, fueron colocados en un equipo de cirugía

estereotaxica (NYU impactor) donde se dejó caer una barra cilindrica de acero

inoxidable de una altura de 2.5cm (lesión de intensidad modera) sobre la médula

espinal expuesta. Se observó el sitio del impacto a través del microscopio

quirúrgico para corroborar la formación de un hematoma a nivel central. La fascia

muscular y la piel en la incisión quirúrgica se suturaron por planos con puntos

simples.

Administración de los tratamientos.Los tratamientos se administraron como dosis única 5 minutos después de la

LTME a razón de 1.2 y 2.5mg/ml/Kg de peso corporal para SDO y CAT

respectivamente y la quercetina a 0.5 y 1.0 mg/ml/Kg de peso corporal.

Obtención de la muestra.Para las determinaciones bioquímicas de Bases de Shift, una vez cumplido el

tiempo de estudio, los animales fueron decapitados y se extrajo la medula espinal

desde T8 hasta T10 y se retiraron las meninges. La muestra se colocó en solución

fisiológica para hacer el homogenizado correspondiente. Posteriormente se

congelaron las muestras con nitrógeno liquido hasta su utilización. Todo el

proceso se efectuó en aproximadamente 30 segundos para evitar la oxidación del

tejido.

Evaluación del proceso de lipoperoxidaciónLos tejidos fueron homogenizados en 3 ml de solución salina. Un ml del

homogenizado fue mezclado con 4 ml en una proporción 2:1 v/v de cloroformo-

metanol y agitado con un vortex por 1min. La mezcla fue colocada en hielo por 30

min para permitir la separación de dos fases. La fase superior fue desechada y los

2ml de la capa de cloroformo fueron aclarados agregando 0.2 ml de metanol. Esta

mezcla se uso para medir la fluorescencia en un espectrofotómetro luminiscente

Perkin-Elmer LS50B a 370 nm (excitación) y 430nm (emisión). La fluorescencia fue

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expresada como unidades de fluorescencia por gramo de tejido. Cada muestra de

tejido fue corrida por duplicado. Hacia el inicio de cada lectura, la sensibilidad del

espectrofotómetro fue probada usando una solución estándar de quinina (1mg/ml)

recién preparada, emitiendo una florescencia de aproximadamente 330 unidades.

ACTIVIDADES REALIZADAS

• Manejo y cuidado de animales de laboratorio

• Manejo de técnicas quirúrgicas en lesión traumática de medula espinal

• Realización de procedimientos bioquímicos, espectrofotométricos y de

cuantificación proteica.

• Revisión bibliográfica especializada en el tema

• Análisis de los resultados obtenidos en cada una de las etapas del desarrollo

experimental.

RESULTADOS

Para determinar si era mejor utilizar la quercetina purificada o la quercetina en

extracto (en conjunto con los demás componentes de la planta de donde se extrae

la quercetina), se realizó un estudio piloto formando 7 grupos. Las ratas de los 6

grupos experimentales fueron sometidas a LTME con el método previamente

descrito. Posteriormente a los animales de los grupos 4 y 6 se les administró la

quercetina pura (E1) y a los de los grupos 5 y 7 el extracto de quercetina (E2), las

dosis administradas fueron de 0.5 mg/ml/Kg de peso corporal para los animales de

los grupos 4 y 5 y de 1.0 mg/ml/Kg para los animales de los grupos 6 y 7.

Al realizar los estudios bioquímico 24 hrs después de la LTME, se observó que los

animales de los grupos 4, 5 y 6 que recibieron tratamiento tanto con quercetina

pura como con el extracto disminuyeron el proceso de LP, especialmente el grupo

que recibió quercetina pura a razón de 1.0 mg/ml/Kg. No obstante lo anterior, los

14

animales del grupo 7 a los que se le administró el extracto de quercetina a razón de

1.0 mg/ml/kg de peso corporal, presentaron un incremento en la LP (fig. 1).

Con base en lo anterior se decidió trabajar con la quercetina pura administrada a

razón de 1.0 mg/ml/kg de peso corporal durante el desarrollo de la fase

experimental del presente trabajo, precediéndose entonces a realizar la

determinación de la curva temporal del efecto antioxidante de la quercetina en un

modelo de LTME. El proceso de LP se evaluó en la médula espinal de los

animales 1, 2 y 24 horas después de la LTME observándose que el mejor efecto

logrado con el tratamiento de una sola dósis de quercetina vía intraperitoneal se

logró en las primeras horas y después este efecto protector disminuyó (fig. 2).

Figura 1. Se muestran los niveles de lipoperoxidación en cada uno de los gruposestudiados expresándolos como promedios + la desviación estándar. Sham=animales conla maniobra quirúrgica sin la lesión y sin tratamiento alguno; LTME=lesión traumática demédula espinal; PEG=polietilenglicol (vehiculo); E1-50=quercetina pura a razón de 0.5mg/ml/kg de peso corporal; E2-50 extracto de quercetina a razón de 0.5 mg/ml/kg de pesocorporal; E1-100=quercetina pura razón de 1.0 mg/ml/kg de peso corporal; E2-100extracto de quercetina a razón de 1.0 mg/ml/kg de peso corporal

Lipoperoxidación

Sham LTME PEG E1-50 E2-50 E1-100 E2-1000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

Grupos

Unid

ades

de

fluor

esce

ncia

/mg

depr

oteí

na

15

Figura 2. En la gráfica se muestra el comportamiento del proceso de lipoperoxidación enlas ratas con lesión traumática de médula espinal (LTME) y como la quercetina (E1) lodisminuye, principalmente 1 y 24 horas después de la lesión. Los datos se presentancomo promedios + la desviación estándar.

Lipoperoxidación

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5LTMEE1

1 hora 2 horas 24 horas

Uni

dade

s de

flu

ore

scen

cia/

mg

depr

ote

ína

Lipoperoxidación

Sham LTME PEG ANT E1 COM0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Grupos

Unid

ades

de

fluor

esce

ncia

/mg

depr

oteí

na

16

Fig 3. En la gráfica se muestra que tanto los antioxidantes (Ant) como la quercetina (E1)disminuyen la lipoperoxidación pero que esto es mas marcado cuando se utilizancombinados (Com). Los resultados se presentan como promedios + la desviaciónestandar.

CONCLUSIONES

• La quercetina purificada (E1) resulto ser la mas efectiva en la disminución

de la lipoperoxidación después de una lesión traumática de médula espinal,

comparada con la quercetina en extracto (E2).

• La quercetina disminuye la lipoperoxidación después de una lesión

traumática de médula espinal, pero deben administrarse varias dosis para

obtener una neuroprotección óptima y duradera.

• La administración por separado de la mezcla de antioxidantes (SOD+CAT)

y quercetina (E1), disminuyen la lipoperoxidación después de una lesión

traumática de médula espinal.

• La combinación de quercetina / SDO+CAT tiene mejor efecto sobre la

lipoperoxidación que cuando se administran por separado.

• La quercetina (E1) tiende a disminuir la lipoperoxidación a 1 hora y 24 horas

después de una lesión traumática de médula espinal, pero no a 2 horas.

17

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