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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANACAMPUS IZTAPALAPA

DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

Nombre: Carolina Pérez Antonel

Matrícula: 98333621

Licenciatura: Biología Experimental

Título del PDI:

Efecto hipoglucémico de las semillas de Plantago major

en ratones sanos y diabéticos.

Asesores: Dr. Francisco J. Alarcón Aguilar Dr. Rodolfo Velasco Lezama

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Efecto hipoglucémico de las semillas de Plantago major

en ratones sanos y diabéticos.

Introducción.

Diabetes mellitus.

Historia.

La descripción más antigua de la diabetes mellitus (DM) se encuentra en los

papiros de Ebers (1550 a.C.) hallados en Egipto. Areteo de Capadocia en el

siglo ll a.C. describió la enfermedad como si la carne y los miembros se

derritieran y se eliminaran por la orina, e introdujo por primera vez el término

diabetes, que en griego significa correr a través de un sifón. Tuvieron que

pasar más de cien años hasta que Thomas Willis redescubriera el sabor dulce

de la orina de un diabético y hallara en ella glucosa en grandes cantidades. A

finales del siglo XVll, J. Rollo y J.P. Frank introdujeron el calificativo de

mellitus (dulce como la miel) para distinguir a los sujetos diabéticos de los que

padecían diabetes insípida (Sanmarti y Lucas, 1991).

La historia de la diabetes transcurre de forma paralela a los conocimientos

progresivos que se van adquiriendo sobre el páncreas. En 1854 R. Wimbow

postuló por primera vez una función endocrina del páncreas. Dá una

descripción morfológica detallada de los islotes pancreáticos, a los que

posteriormente, en 1893 se les atribuiría la función endocrina y se les

denominarían islotes de Langerhans. En 1889 se empezó a vislumbrar la

existencia de una relación entre lesión pancreática y DM. Así, varios años

antes del descubrimiento de la insulina, se consiguió mejorar la clínica de

algunos pacientes diabéticos inyectándoles extractos pancreáticos. En el

verano de 1921 tuvo lugar el hecho más importante en la historia de la DM. F.G

Banting y C. Best, en el laboratorio de J. Macleod de la Universidad de Toronto,

aislaron la sustancia hipoglucemiante pancreática llamada insulina. A partir del

aislamiento de la insulina, cambió totalmente el pronóstico de los individuos

diabéticos, aumentando su esperanza de vida y apareciendo, con los años de

enfermedad, las complicaciones tardías. Así, sucesivas purificaciones y

modificaciones de la hormona para evitar efectos secundarios y prolongar su

tiempo de actividad llevaron a la síntesis sucesiva de las diferentes insulinas en

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la década de los 50. En los años 60, se aisló y cristalizó la insulina de páncreas

de cadáveres humanos que, a partir de 1974, se sintetiza y se utiliza para tratar

pacientes con DM (Sanmarti y Lucas, 1991).

Definición.

La DM es un padecimiento crónico degenerativo que se caracteriza por una

alteración en el metabolismo de proteínas, grasas y carbohidratos. Se

manifiesta principalmente como hiperglucemia, aunque puede coexistir con

hipercolesterolemia e hipertrigliceridemia. En general son necesarias tanto la

resistencia a la insulina como una secreción deficiente de la insulina para que

la enfermedad se manifieste. Actualmente se reconoce que esta enfermedad

es de carácter heterogéneo y multifactorial que comprende un grupo de

anormalidades clínicas y genéticas, en las cuales, la intolerancia a la glucosa

es el común denominador. Todo este conjunto de alteraciones sistémicas

determina el desarrollo de daño microvascular y macrovascular y, por

consiguiente, la manifestación de las complicaciones crónicas del padecimiento

(Alpízar y col., 2001).

Factores de Riesgo.

Factores de riesgo es un término moderno que combina un concepto clásico de

causa directa de enfermedad con conceptos más recientes de probabilidad,

predicción y pronóstico. Los factores de riesgo para la DM se pueden clasificar

en modificables y no modificables. Entre los primeros se encuentra la obesidad,

sobrepeso, sedentarismo, tabaquismo, manejo inadecuado del estrés, hábitos

inadecuados de alimentación y estilo de vida contrario a su salud. Entre los no

modificables está la ascendencia hispánica, edad igual o mayor a los 45 años,

antecedentes de DM en un familiar de primer grado (padres hermanos o hijos)

y antecedentes de haber tenido un hijo con un peso de más de 4 kg al nacer

(Alpízar y col., 2001).

Existen dos factores de riesgo considerados como altamente probables de

evolucionar a DM, por lo que su diagnóstico y tratamiento adecuados podría

ayudar a revertirlos, y por lo tanto, prevenir el desarrollo de DM. Estas dos

alteraciones están involucradas en la homeostasis de la glucosa y son:

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alteración de la glucosa en ayunas (AGA) mayor o igual 110 mg/dl, pero menor

de 126 mg/dl y la intolerancia a la glucosa (IG), medición a las 2 h postcarga de

glucosa mayor o igual 140 mg/dl, pero menor de 200 mg/dl (Alpízar y col.,

2001).

Epidemiología.

Uno de los principales problemas de la DM es su avance silencioso, ya que

puede ser asintomático en etapas iniciales y cursar con lapsos variables en

forma inadvertida. Aproximadamente al 30-50% de los enfermos no se le ha

diagnosticado la enfermedad, por lo que el paciente no sabe que presenta DM,

ya sea por que se encuentran asintomáticos o porque sus signos y síntomas no

han sido identificados como tales (Escandón y col.,1998).

Por la magnitud de su trascendencia, la DM1 y DM2 son las más importantes.

La tipo 2 representa aproximadamente el 90% de todas las formas clínicas y

constituye un importante problema de salud pública, tanto a nivel internacional

como nacional e institucional. Es un fenómeno resultante de los cambios en el

comportamiento humano, desarrollo urbano acelerado y aumento en la

esperanza de vida, que se refleja en la modificación de los patrones de

morbilidad y mortalidad (Alpízar y col., 2001).

Clasificación.

De acuerdo con la clasificación recientemente aprobada por la Asociación

Americana de Diabetes, avalada por la Organización Mundial de la Salud en

Julio de 1997, la DM se clasifica y se divide de la siguiente manera:

- Diabetes Mellitus tipo 1 (DM1): Caracterizada por la destrucción de las

células β del páncreas, que suele llevar la deficiencia absoluta de

insulina.

- Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2): Se presenta en individuos que tienen

resistencia a la insulina y en forma concomitante con deficiencia en su

producción.

- Diabetes Mellitus Gestacional (DMG): se define como cualquier grado de

intolerancia a la glucosa que comienza o se detecta por primera vez

durante en el embarazo; suele desaparecer después del parto.

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- Otros tipos específicos de diabetes:

a) Defectos genéticos en la función de las células β (forma de diabetes

que se hereda en forma autosómica dominante)

b) Defectos genéticos en la acción de la insulina, enfermedades del

páncreas exocrino (cualquier proceso que lesione en forma difusa al

páncreas).

c) Endocrinopatías (algunas hormonas como la de crecimiento o cortisol,

antagonizan la acción de la insulina).

d) Diabetes inducida por agentes químicos o por fármacos, infecciones.

e) Diabetes mediada inmunológicamente.

f) Síndromes diabéticos asociados.

- Clases de riesgo estadístico: cobra gran importancia el diagnóstico y

tratamiento oportuno de la DM, con el fin de evitarlo o retrasar la

aparición de esta enfermedad, usando los criterios de AGA e IG (Alpízar

y col., 2001).

Criterios de detección y diagnóstico.

Son candidatos para realizarles un escrutinio a través de una glucosa capilar y

posteriormente una glucosa plasmática en ayuno, a los individuos que tengan

uno o más factores de riesgo de los que a continuación se señalan:

1. 45 años o más de edad.

2. Antecedentes familiares de DM por parte del padre, madre o hermanos.

3. Individuos obesos.

4. Tabaquismo.

5. Mujeres que tienen hijos que al nacer tienen un peso > de 4 Kg.

6. Individuos con hipertensión arterial (140/90 mm Hg.)

7. Individuos con dislipidemia (triglicéridos > 250 mg/dl y DL colesterol <35

mg/dl).

Los síntomas clásicos son la aparición gradual de sed (polidipsia), poliuria y

nicturia, cansancio, infecciones en la piel. Los criterios actuales para el

diagnóstico de la DM toman en cuenta valores de glucemia mayor o igual a 126

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mg/dl en ayunas por dos o más ocasiones, o bien a través de una prueba de

tolerancia a la glucosa oral (Alpízar y col., 2001).

Tratamiento o manejo de la DM.

Hipoglucemiantes orales.

Los hipoglucemiantes orales son un conjunto heterogéneo de drogas que se

caracterizan por disminuir el nivel de glucemia después de su administración

por vía oral, cumpliendo con este propósito a través de mecanismos

pancreáticos y extrapancreáticos.

Según el tipo de hipoglucemiantes orales, éstos ayudan a que:

- Las células beta del páncreas produzcan más insulina.

- Se impida la liberación de la glucosa almacenada en el hígado

- Se reduzca la resistencia a la insulina.

- Mejore la acción de la insulina existente.

- Disminuya la absorción de la glucosa a nivel intestinal.

Existen 5 tipos de hipoglucemiantes orales:

- Sulfonilureas: se les puede utilizar en combinación con otros

medicamentos y sus efectos secundarios son hipoglucemia y aumento

de peso.

- Biguanidas (metformina): pueden usarse solas o junto con sulfonilureas,

pero siempre combinadas con ejercicio y dieta. No provocan aumento

de peso y no son recomendadas para personas con daño renal o

problemas cardíacos.

- Tiazolidinedionas (roziglitazona y pioglitazona): se pueden consumir con

o sin alimentos tardan de 2 a 6 semanas para lograr su efecto. Se

deben usar con cuidado en pacientes con daño renal o problemas

cardíacos. Causan nausea y vómito.

- Inhibidores de la alfa-glucosidasa (acarbosa y miglitol): pueden ser

utilizadas junto con otros medicamentos, insulina, dieta y ejercicio. Para

su mejor efectividad se las debe tomar cuando se comienza a comer.

Los efectos secundarios pueden durar varios meses y son flatulencias,

diarrea e inflamación estomacal.

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- Meglitinidas (repaglinida): pueden usarse junto con dieta, ejercicio y

otros hipoglucemiantes. Es conveniente consumirlas 15 minutos antes

de cada comida. Puede provocar hipoglucemias y no deben mezclarse

con los inhibidores del alfa-glucosidasa.

Se mantienen esfuerzos para conseguir el fármaco ideal, pero en vista de la

fisiopatología de la enfermedad, esto no parece ser una tarea fácil. Por lo que

está en espera de comprobar el verdadero papel de los nuevos medicamentos

en la respuesta terapéutica a largo plazo (Flores y col., 1996). Como una

alternativa terapéutica se utilizan plantas medicinales.

Tratamiento con plantas medicinales.

Se conoce que desde hace 4000 años a.C. ya existían descripciones de cómo,

qué partes y en qué dosis tenían las plantas propiedades curativas. Hasta

finales del siglo XVlll, el arte de sanar estuvo estrechamente ligado a las

plantas medicinales. Desde hace años, en centros universitarios se están

realizando estudios farmacológicos de plantas con propiedades medicinales,

además y gracias al progreso de las técnicas analíticas, se han aislado nuevos

constituyentes en las plantas, se ha determinado su estructura química y sus

propiedades fisiológicas. Todo ello ha servido para sentar las bases científicas

de su uso terapéutico (Fernández, 1994).

El uso de plantas medicinales antidiabéticas en varios países es una práctica

común. Esto ha motivado la realización de estudios experimentales y clínicos

encaminados a la validación científica de las propiedades medicinales que la

población en forma empírica atribuye a muchas plantas. Varios artículos

científicos tratan de la investigación experimental y clínica de las plantas

usadas por la población mexicana en el control de la DM (Román y col., 1992).

Así, con la finalidad de fundamentar científicamente el uso de las plantas

medicinales, es necesario profundizar en el conocimiento de su acción con

estudios farmacológicos y químicos, ya que estas representan una fuente

potencial de materia prima para la obtención de nuevos hipoglucemiantes

orales (Alarcón y col., 2002).

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Plantago major es una planta medicinal de uso muy antiguo y conocida desde

hace varios siglos. La planta ha sido usada en casi todas partes del mundo en

el tratamiento de varias enfermedades, siendo las hojas y las semillas los

órganos más estudiados desde el punto de vista químico de la planta

(Samuelsen, 2000). A nivel nacional, la mayoría de los usos reportados para P.

major corresponden a padecimientos digestivos, sin embargo se pueden

distinguir otros usos, de acuerdo con las propiedades que se le han atribuido:

acción desinflamante, analgésica, para disentería, como febrífugo, antitumoral,

para infecciones vaginales, antiabortivo e hipoglucemiante (Argueta y col.,

1994).

Argueta y col. (1994) y Márquez y col. (1999) dan la siguiente descripción

general de P. major.

Nombre Científico: Plantago major L.

Nombres comunes: antena, cancerina, diantén llantén, lenteja, mucílago,

plantén, valeriana.

Familia: Plantaginaceae.

Distribución en México: Estados de Sonora, Baja California Sur, Guanajuato,

Michoacán, México, Tlaxcala, Veracruz, Chiapas, Yucatán, Morelos, Puebla,

Tabasco, Quintana Roo y Ciudad de México.

Características Botánicas: Plantago major es una planta anual o perenne de 10

a 30 cm de altura con pequeños camotes. Tiene las hojas en roseta (surgen

desde el nivel del suelo), envolviendo parte del tallo, el envés de la hoja es más

ancho que el haz. Las flores son diminutas y de color blanco-verdosas,

acomodadas en una espiga larga, dando la apariencia de una mazorca

delgada. Sus semillas son de color café. Es originaria del Norte de Europa y

Centro de Asia.

Antecedentes

Estudios etnofarmacológicos recientes muestran que P. major es usada para

curar enfermedades; de la piel, infecciones, de los aparatos digestivo,

respiratorio, reproductivo, y circulatorio, contra los tumores, como analgésico,

febrífugo e hipoglucemiante en la DM.

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Esta especie contiene compuestos biológicamente activos como polisacáridos,

lípidos, derivados de ácido cafeico, flavonoides, glucósidos, terpenoides,

alcaloides y muchos ácidos orgánicos. Varias investigaciones farmacológicas

han probado algunas de sus actividades biológicas, principalmente con

extractos crudos (sin haber investigado la naturaleza de los compuestos

activos), obteniéndose tanto resultados positivos como negativos. Así, se ha

reportado una gama de actividades biológicas de la planta, incluyendo la

actividad antiulcerogénica, anticancerígena, antibiótica, antifúngica,

antidiarréica, antiinflamatoria, analgésica, citotóxica, hipocolesterolemiante e

hipoglucemiante, entre otras más. La mayoría de estos efectos fueron

descubiertos gracias al uso que esta planta tiene en la medicina popular

(Samuelsen, 2000).

Un estudio dirigido a la investigación de la actividad hipoglucemiante de P.

major fue realizado, con base en el uso tradicional que en la India y en Chile

tiene la infusión de P. major para la DM (Houghton y Manby, 1985). Se ha

reportado que en ratas con glucemia normal, el extracto EtOH-H2O 7:3 de la

planta completa fue administrado oralmente (500 mg/kg), sin mostrar efectos

significativos sobre la glucemia (Rodríguez y col., 1994).

Sin embargo, algunas plantas de la familia Plantaginaceae han sido reportadas

como drogas crudas con efecto hipoglucémico, efecto atribuido principalmente

a su alto contenido de fibra (Kuklinski, 2000). Las fibras dietéticas son las

substancias vegetales que no se digieren en el aparato gastrointestinal humano

por falta de enzimas adecuadas. Desde hace varios años se han utilizado

dietas ricas en fibra para facilitar el control de la DM, ya que con este tipo de

dietas se ha logrado disminuir los niveles de glucosa en sangre y los

requerimientos de insulina. Una fibra dietética empleada como medicamento

convencional es el mucílago derivado de la cáscara de las semillas de Plantago

psyllium, la cual fue previamente estudiada a nivel experimental y clínico (Frati-

Munari y col., 1989).

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Hoy se conoce que un alto contenido de polisacáridos no absorbibles en la

dieta disminuye los niveles de colesterol y glucosa en la sangre, debido

principalmente a la formación de una barrera de reabsorción intestinal y a la

inactivación de la amilasa. Varios experimentos se han realizado en ratones

machos para probar varios polisacáridos y su actividad hipoglucemiante,

bajando efectivamente el nivel de glucosa en la sangre de los ratones(Franz.,

1989). Los autores de dicho experimento demostraron que este efecto es dosis

dependiente, baja la glucosa un 50%. Sin embargo las explicaciones

fisiológicas para este fenómeno no fueron dadas

Por lo que, es necesario realizar más estudios sobre el efecto hipoglucémico de

plantas consideradas como antidiabéticas. Dichos estudios serían útiles para

tratar de caracterizar adecuadamente esta actividad; estudiando los posibles

efectos tóxicos a largo plazo y finalmente llegar a conocer la naturaleza de los

compuestos hipoglucémicos y sus mecanismos de acción. Dentro de los

remedios tradicionales para la DM, P. major puede considerarse como una

fuente potencial para el descubrimiento de nuevos agentes hipoglucemiantes,

así como un remedio tradicional al alcance de la mayoría de la población.

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Justificación

En México, la DM constituye uno de los problemas más importantes de salud

pública con características de epidemia. Anualmente se registran más de

180,000 casos nuevos y aproximadamente 36,000 defunciones por causa

directa de la diabetes, aunque el número de fallecimientos se relaciona con los

efectos secundarios de la enfermedad y esto incrementa la tasa de muerte.

En años recientes la importancia de las plantas medicinales en el control

empírico de la DM ha sido reconocida. Varias especies han sido reportadas con

actividad hipoglucemiante. Sin embargo, hasta hoy sólo unos cuantos agentes

hipoglucemiantes han sido aislados y caracterizados químicamente de estas

plantas.

Plantago major es una planta de origen europeo, de uso frecuente y muy

antiguo en México. A nivel nacional, la mayoría de los usos reportados para

esta planta corresponden a padecimientos digestivos, sin embargo, se puede

usar para otros padecimientos, dentro de los cuales se encuentra la DM.

En investigaciones anteriores se ha empleado la planta completa para la

detección de actividad hipoglucemiante En el presente proyecto se pretende

determinar la actividad hipoglucemiante de las semillas de P. major debido a

que estas estructuras son ricas en polisacáridos y sacáridos, los que

frecuentemente se han relacionado con la actividad hipoglucemiante e

hipercolesterolemiante. Nos planteamos, por lo tanto, estudiar el efecto

hipoglucémico de las semillas de P. major a partir de la obtención y evaluación

farmacológica de tres extractos orgánicos y un extracto acuoso en ratones

sanos y diabéticos.

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Objetivo General:

Determinar la actividad hipoglucemiante de tres extractos orgánicos y un

acuoso obtenidos de las semillas de Plantago major.

Objetivos particulares:

• Obtener los extractos hexánico, diclorometánico, metanólico y acuoso de

las semillas de Plantago major.

• Evaluar el efecto hipoglucémico de los extractos orgánicos y acuoso de

las semillas de Plantago major en ratones sanos.

• Evaluar el efecto hipoglucémico del extracto o de los extractos activos

en ratones diabéticos.

Hipótesis:

Si las semillas de Plantago major tienen sustancias con propiedades

antidiabéticas, entonces los extractos obtenidos a partir de ellas deben mostrar

efecto hipoglucémico en animales sanos y diabéticos.

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Material y Método.

1. Material vegetal: el material empleado consistió en plantas completas de P.

major, las cuales fueron adquiridas en el Mercado Sonora, de la ciudad de

México. La identificación de las plantas se realizó con la ayuda de un experto

en botánica del Herbario Metropolitano de la UAM-I y por medio de

comparaciones con ejemplares de P. major de diferentes herbarios, en los

cuales se depositó un ejemplar. En total se adquirieron díez manojos de la

planta completa.

2. Preparación de la planta: las espigas con semillas (3.95 kg/peso fresco)

fueron puestas a secar en una cama de papel absorbente. El material fue

colocado en un sitio libre de humedad y a la sombra. Una vez que se

encontraron secas las espigas (394.7g/peso seco) se procedió a desgranar las

semillas para separarlas de aquellas, las semillas secas fueron molidas con

ayuda de un mortero de porcelana, obteniendo un rendimiento de 185 g de

semillas pulverizadas.

3. Preparación de extractos.

- Extracto hexánico.

Se colocaron 185 g del polvo de semillas de P. major y se extrajo dos veces a

temperatura ambiente con hexano (1000 ml) durante una semana. Pasado este

tiempo, se filtró con la ayuda de una bomba de vacío y el disolvente fue

evaporado en un rotavapor hasta obtener el extracto, el cual fue concentrado

obteniéndose un rendimiento de 0.9329% (1.726g).

- Extracto diclorometánico.

El residuo vegetal del extracto hexánico, se extrajo dos veces a temperatura

ambiente con diclorometano (1000 ml) durante una semana. Pasado este

tiempo se filtró con la ayuda de una bomba de vacío y el disolvente fue

evaporado en un rotavapor hasta obtener el extracto, el cual fue concentrado

obteniéndose un rendimiento de 1.1007% (2.036g).

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- Extracto Metanólico.

El residuo vegetal del extracto diclorometánico se extrajo dos veces a

temperatura ambiente con metanol (1000 ml) durante una semana. Pasado

este tiempo, se filtró con la ayuda de una bomba de vacío y el disolvente fue

evaporado en un rotavapor hasta obtener el extracto, el cual fue concentrado

obteniéndose un rendimiento de 5.4017% (9.993g).

- Extracto acuoso.

El residuo vegetal del extracto metanólico se extrajo a temperatura ambiente

con agua destilada (2000 ml) durante 24 h. Pasado este tiempo se filtró,

obteniéndose 350 ml. este filtrado fue sometido a un proceso de liofilizado

durante 8 h por día, obteniendo el extracto acuoso con un rendimiento de

0.5770% (1.067g).

4. Animales de experimentación.

Se trabajó con ratones CD-1 machos, adultos, con un peso 25-35 g del bioterio

de la UAM-I. Los animales fueron incluidos en dos grupos experimentales: uno

de ratones sanos y otro de ratones diabéticos

La diabetes experimental se indujo por una inyección intravenosa de aloxana a

una dosis de 100 mg/kg de peso corporal. A los siete días después de la

administración se determinó la glucemia, obteniendo muestras sanguíneas de

cada animal por punción de la vena de la cola. La determinación de la glucemia

fue realizada utilizando tiras reactivas y un glucómetro Roche. Los animales

que presentaron más de 250 mg/dl de glucosa en sangre fueron considerados

con diabetes experimental.

5. Ensayos biológicos.

I. Efecto hipoglucémico de las semillas de P. major en ratones sanos.

Los ratones sanos fueron distribuidos en dos lotes:

v Lote 1. Se formaron 3 grupos de ratones de 5 animales cada uno

(numerados I al lll). Al grupo I se le administró solución salina isotónica

como control (4 ml/kg). Los grupos restantes fueron tratados con los

extractos solubles en solución salina isotónica (S.S.I.) (500 mg/kg):

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extracto metanólico y extracto acuoso. En todos los casos las

preparaciones fueron disueltas en 4 ml/kg de solución salina isotónica

como vehículo.

v Lote 2. Se formaron 3 grupos de ratones de 5 animales cada uno

(numerados IV al Vl). Al grupo IV se le administró aceite de maíz como

control (4 ml/kg). Los grupos restantes fueron tratados con los extractos

oleosos (500 mg/kg): extracto hexánico y extracto diclorometánico. En

todos los casos las preparaciones fueron disueltas en 4 ml/kg de aceite

de maíz como vehículo.

II. Efecto hipoglucémico de las semillas de P. major en ratones diabéticos.

Se formaron 4 grupos de ratones de 6 animales cada uno (numerados VlI al X).

Al grupo VlI se le administró aceite de maíz como control (4 ml/kg). Al grupo

VIII se le administró tolbutamida como control positivo (80 mg/kg) y, finalmente,

a los dos grupos restantes se les administraron los extractos hexánico y

diclorometánico, los cuales fueron los que resultaron con actividad en ratones

sanos.

En todos los animales se realizó lo siguiente: determinación previa de la

lucemia en ayunas de 18 h, las sustancias control y las sustancias problema

fueron inyectadas intraperitonealmente (ip). Después de la administración de

las sustancias, la glucemia fue determinada a los 120, 240 y 360 minutos. Las

muestras sanguíneas fueron obtenidas por punción de vena de la cola,

determinándose la glucemia por el método de glucosa-oxidasa peroxidasa

usando tiras reactivas y glucómetro Accutren Sensor de Laboratorios Roche.

6. Pruebas fitoquímicas preliminares.

Con la finalidad de detectar cualitativamente los principales compuestos

presentes en los extractos activos se realizó un análisis fitoquímico preliminar

para detectar terpenos, flavonoides, esteroles, saponinas, alcaloides, azúcares

y taninos. Las pruebas se basan en reacciones de precipitación, aparición de

color, formación de anillos, liberación de gases, etc. En el caso de las

cumarinas se utilizó un método de fluorescencia para detectarlas (Barba, 1997)

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7. Análisis estadístico.

Los resultados se expresan como los valores de la glucemia ± el error

estándar. La significancia de las diferencias de los grupos estudiados fue

evaluada por un análisis de varianza con la prueba complementaria de

Duncan, considerándose como datos significativos los valores de p<0.05.

Resultados.

I. Efecto hipoglucémico de las semillas de P. major en ratones sanos.

Los efectos de P. major en los niveles de glucosa en sangre de ratones sanos

se muestran en las tablas 1 y 2; donde se muestra el efecto hipoglucémico

producido por la administración ip (500 mg/kg) de los extractos acuosos y

oleosos en ratones sanos con un ayuno previo de 18 h. Los niveles de glucosa

basales de los dos lotes de animales sanos fueron diferentes (p<0.01). Los

valores de los grupos control, S.S.I. y aceite de maíz, fueron de 74.8±1.82

mg/dl y 92.8±7.57 mg/dl, respectivamente. Ambos valores glucémicos no

tuvieron diferencia estadísticamente significativa con respecto a las glucemias

basales de los grupos problema dentro del mismo lote y durante la prueba,

tampoco fueron diferentes (p>0.01) con respecto a los niveles de glucosa en

sangre en los tiempos 120, 240 y 360 minutos después de la administración ip

de cada una de las sustancias control.

Después de la administración ip de los extractos metanólico y acuoso solubles

en S.S.I de las semillas de P. major (Tabla 1), se observaron diferencias

significativas con respecto a la glucemia basal y con respecto al grupo control.

El extracto metanólico únicamente mostró reducción de los niveles de glucosa

en sangre en el minuto 240 (p<0.01), la cual cambió de 77.2±4.00 mg/dl a

48.8±5.25 mg/dl, con respecto a la glucemia basal, y de 69.4±2.46 mg/dl a

48.8±5.25 mg/dl, con respecto al grupo control. En cuanto al extracto acuoso, la

reducción fue únicamente en el minuto 360 (p<0.01), de 81.6±9.11 mg/dl a

43.6±6.26 mg/dl, con respecto a la glucemia basal, y de 69±3.42 mg/dl a

43.6±6.26 mg/dl, con respecto al grupo control.

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Por su parte, en la evaluación de los extractos solubles en aceite de maíz (tabla

2), tanto el extracto hexánico como el extracto diclorometánico, mostraron

diferencias significativas con respecto a la glucemia basal y al grupo control,

mostrándose reducciones de los niveles de glucosa en sangre a partir del

minuto 120. En el extracto hexánico la reducción fue de 87±7.91 a 40.6±2.90,

36.4±5.18 y 37±3.20 mg/dl a los minutos 120, 240 y 360, respectivamente

(p<0.01), con respecto a su glucemia basal; con respecto al grupo control para

el minuto 120 fue 90.2±6.20 mg/dl a 40.6±2.90 mg/dl, para el minuto 240 fue

85.4 ± 4.95 mg/dl a 36.4 ± 5.18 mg/dl y, finalmente, para el minuto 360 fue de

83.2±4.72 mg/dl a 37±3.20 mg/dl (p<0.01). En el caso del extracto

diclorometánico la reducción fue de 81±3.79 mg/dl a 49±4.33 mg/dl, 38.4±3.77

mg/dl y 40.4±3.41 mg/dl a los minutos 120, 240 y 360, respectivamente

(p<0.01) con respecto a su glucemia basal. Con respecto al grupo control, para

el minuto 120 fue de 90.2±6.20 mg/dl a 49±4.33 mg/dl, para el minuto 240 fue

de 85.4±4.95 mg/dl a 38.4±3.77 mg/dl y, finalmente, para el minuto 360 fue de

83.2±4.72 mg/dl a 40.4±3.41 mg/dl (p<0.01).

En la figura 1 y 2 se puede observar que las glucemias basales de los grupos

experimentales permanecieron sin variaciones significativas con respecto a los

mismos valores en los grupos control (S.S.I y aceite de maíz). También se

puede observar la representación gráfica del efecto hipoglucémico producido

por los extractos de las semillas de P. major a dosis de 500 mg/kg.

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Tabla 1. Efecto hipoglucémico producido por la administración ip (500 mg/kg) de los extractos

acuoso y metanólico de las semillas de P. major en ratones sanos.

Glucosa en sangre mg/dl ( media ± E.S )

Problema Dosis t = 0 120 min 240 min 360 min

Control (S.S.I.)(n = 5) 4 ml/kg 74.8 ± 1.82 73.2 ± 2.22 69.4 ± 2.46 69 ± 3.42

Extracto Metanólico(n = 5) 500 mg/kg 77.2 ± 4.00 59 ± 6.64 48.8 ± 5.25 *º 52.2 ± 8.41

Extracto Acuoso(n = 5) 500 mg/kg 81.6 ± 9.11 70.8 ± 12.39 49.2 ± 7.90 43.6 ± 6.26 *º

* Diferencia significativa con respecto ala glucemia inicial (p<0.01)

° Diferencia significativa con respecto al grupo control (p<0.01)

19

Tabla 2. Efecto hipoglucémico producido por la administración ip (500 mg/kg) de los extractos

hexánico y diclorometánico de las semillas de P. major en ratones sanos.

Glucosa en sangre mg/dl ( media ± E.S )

Problema Dosis t = 0 120 min 240 min 360 minControl (Aceite de maíz)

( n = 5) 4 ml/kg 92.8 ± 7.57 90.2 ± 6.20 85.4 ± 4.95 83.2 ± 4.72

Extracto Hexánico (n = 5) 500 mg/kg 87 ± 7.91 40.6 ± 2.90 *º 36.4 ± 5.18 *º 37 ± 3.20 *º

Extracto Diclorometánico

(n = 5)500 mg/kg 81 ± 3.79 49 ± 4.33 *º 38.4 ± 3.77 *º 40.4 ± 3.41 *º

* Diferencia significativa con respecto ala glucemia inicial (p<0.01)

º Diferencia significativa con respecto al grupo control (p<0.01)

20

* Diferencia significativa con respecto a la glucemia inicial (p<0.01)

Figura1. Efecto hipoglucémico producido por la administración de los extractos solubles en S.S.I. en ratones sanos (n=5)

20

30

40

50

60

70

80

90

0 120 240 360

Tiempo (min)

Glu

cem

ia (m

g/dl

)

S.S.I Metanol Acuoso

**

21

* Diferencia significativa con respecto ala glucemia inicial (p<0.01)

Figura 2. Efecto hipoglucémico producido por la administración de los extractos solubles en aceite de maíz en ratones sanos (n=5).

2030405060708090

100110

0 120 240 360Tiempo (min)

Glu

cem

ia (m

g/dl

)

Aceite de maìz Hexano Diclorometano

**

** **

22

II. Efecto hipoglucémico de las semillas de P. major en ratones diabéticos.

Los extractos de P. major que presentaron actividad en ratones sanos, tanto el

extracto hexánico como el extracto diclorometánico, también produjeron

reducciones significativas de los niveles de glucosa en sangre en ratones con

diabetes experimental con respecto a su glucemia basal. El extracto hexánico

únicamente mostró reducción de los niveles de glucosa en sangre en el minuto

360 (p<0.01), la cual fue 568±63.85 mg/dl a 316.67±73.83 mg/dl. En cuanto al

extracto diclorometánico, éste mostró reducción de los niveles de glucosa en

sangre a partir del minuto 240; la reducción fue de 551±49.05 mg/dl a

455.33±36.59 mg/dl y 377.50±62.02 mg/dl en los minutos 240 y 360,

respectivamente (p<0.05).

Por otro lado, la tolbutamida (80 mg/kg) también redujo significativamente la

glucemia a los 240 y 360 minutos (p<0.01) con respecto a su glucemia inicial;

cabe señalar que el efecto presentado fue claramente mayor al producido por los

extractos hexánico y diclorometánico.

En la figura 3 se representa el efecto hipoglucémico producido por la

administración ip de los extractos hexánico y diclorometánico en ratones

diabéticos; mostrándose diferencia significativa en los niveles de glucosa en

sangre en el minuto 360 (p<0.01) para el caso del extracto hexánico, en los

minutos 240 y 360 (p<0.01) para el caso de la tolbutamida y en los mismos

minutos para el extracto diclorometánico (p<0.05), con respecto a su glucemia

inicial. También se puede observar que la glucemia basal del grupo control (aceite

de maíz) permanece constante y sin variaciones estadísticamente significativas.

23

Tabla 3. Efecto hipoglucémico producido por los extractos hexánico y diclorometánicoen ratones diabéticos.

Glucosa en sangre mg/dl ( medias ± E.S )

Problema Dosis t = 0 120 min 240 min 360 min

Control (Aceite de maíz)(n = 5)

4 ml/kg 575 ± 35.91 550.83 ± 31.01 540.83 ± 38.09 539.83 ± 38.62

Tolbutamida(n = 5) 80 mg/kg 537 ± 53.75 474.17 ± 59.77 348.83 ± 55.89**° 272.00 ± 45.58**°Extracto hexánico(n=5) 500 mg/kg 568 ± 63.85 535.50 ± 42.42 434.50 ± 75.31 316.67 ± 73.83**°Extracto diclorometánico(n=5)

500 mg/kg 551 ± 49.05 501.67 ± 48.53 455.33 ± 36.59* 377.50 ± 62.02*

° Diferencia significativa con respecto al grupo control (p<0.05)

* Diferencia significativa con respecto a la glucemia inicial (p<0.05)

** Diferencia significativa con respecto a la glucemia inicial (p<0.01)

24

* Diferencia significativa con respecto ala glucemia inicial (p<0.05)** Diferencia significativa con respecto a la glucemia inicial (p<0.01)

Figura 3. Efecto hipoglucémico producido por la administración de tolbutamida (80 mg/kg) y os extractos hexánico y diclorometánico en ratones diabéticos (n=5).

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

0 120 240 360Tiempo (min)

Glu

cem

ia m

g/dl

A ceite de maìz TolbutamidaHexano Dic lorometano

**

****

**

25

Análisis fitoquímico preliminar de los cuatro extractos obtenidos de las semillas

de P. major.

En la Tabla 4 se presentan los resultados obtenidos de las pruebas

fotoquímicas realizadas a los extractos que fueron obtenidos de las semillas de

P. major, en donde se detectaron los siguientes compuestos: Alcaloides,

taninos, flavonoides, esteroles, saponinas y azúcares.

Tabla 4. Resultados obtenidos en las pruebas fitoquímicas con losextractos de las semillas de P. major.

Tipo de extractoCompuestos

Hexánico Diclorometánico Metanólico Acuoso

Alcaloides negativo negativo positivo negativo

Cumarinas negativo negativo negativo negativo

Taninos positivo negativo positivo negativo

Terpenos negativo negativo negativo negativo

Flavonoides negativo positivo positivo negativo

Esteroles negativo positivo negativo negativo

Saponinas negativo negativo positivo positivo

Azúcares negativo positivo positivo positivo

26

Discusión.

Esta investigación fue realizada con la finalidad de obtener tres extractos

orgánicos y un acuoso de las semillas de P. major para evaluar su efecto

hipoglucémico en ratones sanos y diabéticos, para establecer las bases del

aislamiento y caracterización química de los principios activos

hipoglucemiantes y así validar el uso de ésta planta en el control de la DM.

P. major ha sido estudiada en ratas con glucemia normal, en los que se probó

un extracto EtOH-H2O 7:3 de la planta completa (500 mg/kg), administrando

oralmente, sin efectos significativos sobre la glucemia (Rodríguez y col., 1994).

Cabe mencionar que el método experimental utilizado y las partes empleadas

(planta completa) son muy diferentes a los empleados en el presente trabajo.

En este caso se usó la semilla y fueron varios los extractos que fueron

obtenidos por extracciones continuas usando disolventes de polaridad

creciente, detectándose efecto hipoglucémico en tres de los extractos

evaluados en ratones sanos.

Los principales compuestos químicos reportados en la semillas de P. major

(NAPRALERT, 2004) son carbohidratos (fructosa, glucosa, sacarosa y un

polisacárido llamado plantago); lípidos (ácidos como linoléico, linólico, oleico,

palmítico y esteárico); compuestos esteroideos (campesterol, sitosterol y

estigmasterol); alcaloides monoterpenoides (plantagonina e indicaina);

fenilpropanoides (plantamajosido y verbascósido); un compuesto flavonoide

(plantagósido) y monoterpenoides (genipósido y aucubina). Sin embargo, aún

no hay evidencia experimental de la acción hipoglucemiante de la mayoría de

estos constituyentes. Se ha dado a conocer que en animales de

experimentación, un alto contenido de polisacáridos en la dieta disminuye los

niveles de colesterol y glucosa en la sangre y dichos efectos podrían deberse a

la formación de una barrera de reabsorción intestinal y en parte a una

inactivación de la amilasa (Franz., 1989).

Varias plantas de la familia Plantaginaceae poseen actividad hipoglucemiante.

E.stas plantas han sido reportadas como drogas crudas con efecto hipoglucémico

que son utilizadas tradicionalmente por la población para el control de la DM

(Ivorra y col., 1989). De los compuestos aislados de ellas los mucílagos muestran

actividad hipoglucemiante marcada; los polisacáridos muestran actividad

farmacológica debido a que bajan el nivel de glucosa en sangre en animales de

27

experimentación (Rahman y Zaman, 1989). Así, las Plantaginaceae son

importantes por ser consideradas útiles para el control metabólico de los pacientes

diabéticos y son consideradas como fuentes de nuevos agentes hipoglucémicos

(Ivorra y col., 1989).

El presente trabajo muestra que los extractos hexánico y diclorometánico de las

semillas de P. major, producen efecto hipoglucémico en ratones sanos a una dosis

de 500 mg/kg. El extracto hexánico fue el que causó mayor reducción en los

niveles de glucosa en sangre en los ratones con diabetes experimental. Sin

embargo, el efecto detectado fue claramente inferior al producido por la

tolbutamida (80 mg/kg).

La tolbutamida es una sulfonilurea que produce hipoglucemia experimental y

clínica (en animales sanos, en animales con diabetes experimental y en

diabetes tipo 2) ya que induce la liberación de insulina por las células betas

pancreáticas. Sin embargo, en animales con diabetes experimental severa,

semejante a la diabetes tipo 1, no se cuenta con células beta pancreáticas, por

lo que la tolbutamida no produce efectos hipoglucémicos bajo estas

condiciones (Alarcón y col, 2002). Por tanto, es probable que los compuestos

hipoglucemiantes presentes en las semillas de P. major podrían estar actuando

como una sulfonilurea, siendo activos únicamente en presencia de células beta

funcionales.

El estudio fitoquímico realizado a los extractos estudiados de las semillas de P.

major nos permitió conocer que los compuestos que están presentes son:

Alcaloides, taninos, flavonoides, esteroles, saponinas y azúcares. Estos

resultados concuerdan con los compuestos químicos que se han aislado de las

semillas y que han sido reportados (NAPRALERT, 2004). La importancia de

conocer qué compuestos están presentes en los extractos nos facilitará el

diseño de estrategias apropiadas para el aislamiento y la caracterización

química de cada compuesto activo presente en los extractos.

Aún no se conoce con certeza el posible mecanismo de ésta y otras plantas

con actividad hipoglucemiante. Algunos autores atribuyen este efecto a la

disminución en la absorción intestinal de glucosa producido por el contenido de

fibra en las plantas. Las fibras dietéticas son las substancias vegetales que no

se digieren en el aparato gastrointestinal humano por falta de enzimas

adecuadas; la mayoría de ellas están compuestas por carbohidratos no

28

absorbibles (polisacáridos). El mecanismo por el cual las fibras dietéticas

reduce la glucemia esta aún en controversia, pero se ha implicado

principalmente la disminución en la absorción intestinal de la glucosa;

sabiéndose que no se debe a una mayor secreción de insulina (Frati-Munari y

col., 1989).

Con base en los resultados obtenidos, es necesario continuar con el

aislamiento y caracterización química de las sustancias hipoglucemiantes

presentes en la semilla de P. major partiendo del extracto hexánico, ya que

éste fue el que mostró la actividad hipoglucemiante más notable. También es

necesaria la realización de estudios toxicológicos a largo plazo con esta planta,

mismos que podrían contribuir al uso apropiado de remedios compuestos de

mezclas complejas de substancias desconocidas.

Conclusiones.

o Los extractos acuosos y orgánicos de P. major tienen efecto

hipoglucémico en ratones sanos.

o Los efectos producidos por los extractos orgánicos fueron

notablemente mayores que los mostrados por los extractos acuosos.

o Los extractos hexánico y diclorometánico también mostraron actividad

hipoglucemiante en ratones diabéticos.

o En análisis fitoquímico realizado a los extractos evaluados reveló la

probable presencia de alcaloides, taninos, flavonoides, esteroles,

saponinas y azúcares.

29

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