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UNIVERSIDAD AUTÓNOMADE BAJA CALIFORNIA SUR
`rea Interdisciplinaria de Ciencias del Mar
Departamento de Biología Marina
EFECTO DEL TIEMPO DE EMERSIÓN Y DE LA
TEMPERATURA EN LAS ADAPTACIONES FISIOLÓGICAS
DEL SISTEMA INMUNE DE Panulirus Interruptus
SIMULACIÓN DE CONDICIONES DE TRANSPORTE VIVO
TESIS
Que para obtener el título de
BIÓLOGO MARINO
PRESENTA
RAFAEL ORTIZ RODR˝GUEZ
La Paz RCS MØxico Marzo del 2002
UNIVERSIDAD AUTÓNOMADE
BAJA CALIFORNIA SURApartado Postal 19 B
Codigo Postal 23080
La Paz B C S
Tels 1280440 1280569
Y i
Fax 1280801 Y 128 08 80
AREA INfERDISCIPLINARlA
DE CIENCIAS DEL MAR
Departamento de Biología Marina
Fecha t ò c tlo z o Je lO 01
BIOL MAR EMELIO BARJAU GONZALÉZJEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOG˝A MARINA
PRESENTE
Los abajo firmantes comunicamos a Usted que habiendo revisado el Trabajo de Tesis querealizó ron el la pasante s fqt O t z 20 clrr J eL
Con el TituloEf
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fViI Utorgamos nuestro voto aprobatorioy consideramos que dicho Trabajo estÆ listo para
su defensa a finde obtener el titulode Licenciado en Biología
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Agradecimientos
Al Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste por el apoyo y facilidades
otorgadas para la realización de este trabajo
Al Consejo Nacional de Ciencia y tecnología por el apoyo otorgado para mi
sostenimiento por medio de la beca No 1852 referencia J31677B
A la Universidad Autónoma de Baja California Sur por mi formación profesional
A mis papÆs Fallo y Eli Y a mi hermano David por estar siempre
acompaæÆndome en todos los sentidos
A mis abuelos tíos y primos
A Lucy por su apoyo dirección comprensión y paciencia
A Dariel por sus excelentes comentarios para la realización de esta tesis
A CØsar Diana y Adolfo por su tiempo y apoyo
A mis amigos y compaæeros de laboratorio Caty Michel CØsar DØbora Daniel
e Itzel
A todas las personas que de una manera u otra me ayudaron en escribir esta
tesis
y en especial a toda la banda que siempre ha estado allí en lo que llevamos de
camIno
ANadia
Contenido
índice general
índice de figuras
índice de tablas
Abreviaturas
Resumen
iii
iv
v
vi
I ntroducción
El transporte vivo y la langosta roja
El sistema inmune
El sistema antioxidante
Antecedentes
Justificación
Objetivo
Materiales y mØtodos
Origen y mantenimiento de los organismos
experimentales
Simulaciones de condiciones de transporte vivo
Temperatura experimental
Tiempos de emersión
Obtención de la muestra
Preparación de la muestra
1
3
5
9
15
17
19
20
20
21
21
21
22
23
AnÆlisis bioquímico
AnÆlisis estadístico
24
25
26
26
27
30
37
44
46
54
Resultados
Conteos totales de hemocitos
Actividad específica enzímÆtíca
Cuantificación de niveles de Proteínas MDA y 4 HNE
Discusión
Conclusiones
Bibliografía
ApØndice 1
jj
índice de figuras
Figura 1 Conteos totales de hemocitos 26
Figura 2 Relación entre actividad específica de CAT y GPx 29
Figura 3 Niveles de proteína 30
Figura 4 Niveles de MOA a 200C 31
Figura 5 Niveles de MOA a 26 oC 32
Figura 6 Niveles de HNE a 200C 33
Figura 7 Niveles de HNE a 260 34
iìi
índice de tablas
Tabla 1 Actividad enzimÆtica específica en ELH y en Plasma
a 200C y 4 tiempos de emersión 3 6 12 24h
27
Tabla 2 Actividad enzimÆtica específica en ELH y en Plasma
a 260C y 4 tiempos de emersión 3 6 12 24 h
28
Tabla 3 Niveles de Proteína MOA y HNE en Plasma a 200C
y 4 tiempos de emersión 3 6 12 24 h
35
Tabla 4 Niveles de Proteína MOA y HNE en Plasma a 260 e
y 4 tiempos de emersión 3 6 12 24 h
36
iv
Abreviaturas
ATP Adenosin trifosfato
BGBP Beta glucan binding protein Proteína ligante de ß
glucano CA T
Catalasa Cels
CØlulas CTH Conteos Totales de
Hemocitos CDH Conteos diferenciales de
hemocitos dACambio deabsorbancia por intervalo de
tiempo ELH Extracto Usado de
Hemocitos ERa Especie s reactiva soxigenada
s GPx Glutatión
Peroxidasa GSH
Glutatìón Km Constante deMichaelis
Menten MOA
Malondialdehído NAOP NAOPH Fosfato de nicotinamida adenín dinucleótido
trifosfopiridín nucleótido y su forma
reducida NO Óxido
nítrico POFe
loloxidasa ProPO
Profenoloxidasa PRP Pattern Recognition Proteins Proteínas dereconocimiento de
Patrones PUFA Poli Unsaturated Fatty Acid `cido graso
poliinsaturado Px
Peroxidasa SOO Superóxido
dismutasa 4 HNE 4hidroxi 2E
nonenalv
Resumen
La langosta roja Panulirus interruptus soporta una de las pesquerías mas grandes y
provechosas del país Esta se comercializa en varias presentaciones siendo la viva la
de mayor valor Sin embargo durante el transporte vivo las langostas estÆn expuestas
a una serie de trastornos fisiológicos provocados por la manipulación excesiva los
largos períodos de emersión diferencia entre los gases respiratorios en el agua y en el
aire que se reflejan en sus sistemas biológicos Tales condiciones comprometen la
supervivencia y la calidad del producto En este estudio se determina el efecto que
ejercen el tiempo de emersión y la temperatura de aclimatación en las adaptaciones
fisiológicas del sistema inmune y antioxidante en hemolinfa de P interruptus Para esto
se realizaron simulaciones de condiciones de transporte vivo con dos temperaturas de
aclimatación 200 y 260 C y 4 tiempos de emersión 3 6 12 24 h en hieleras de
poliuretano Como indicadores del sistema inmune y antioxidante se analizaron conteos
totales de hemocitos actividad de las enzimas fenoloxidasa superóxido dismutasa
catalasa glutatión peroxidasa y cuantificaciones de proteína malondialdehído e
hidroxinonenal Estos ensayos se realizaron en el plasma y en los extractos lisados de
hemocitos Los resultados obtenidos muestran variaciones significativas P 05 por
efecto de la temperatura de aclimatación en los conteos totales de hemocitos actividad
especifica de Catalasa y niveles de malondialdehído e hidroxinonenal Así tambiØn por
efecto del tiempo de emersión se encontraron variaciones en los conteos totales de
hemocitos actividad especifica de catalasa y glutatión peroxidasa y en niveles de
proteína malondialdehído e hidíOxinonenal Estos resultados muestran cambios en
parÆmetros del sistema inmunE y el antioxidante en la hemolinfa provocado por la
temperatura de aclililatación y el tiempo de emersión del transporte vivo
vi
Introducción
En MØxico existen 7 especies de langostas espinosas que pertenecen al gØnero
Panulirus Gray 1847 y habitan en aguas tropicales y subtropicales de las costas
del país de Østas cuatro se presentan en el OcØano Pacífico P interruptus P
gracilis P inflatus y P petÚcillatlls y tres en el Golfo de MØxico y Mar Caribe P
argus P guttatus y P laevicauda La langosta roja Panulirus interruptus se
distribuye principalmente desde el centro de California EU hasta Cabo San
Lucas Baja California Sur MØxico Usualmente habita de los 2 a los 30 m de
profundidad y ocasionalmente se le encuentra hasta 100 m Las langostas
desarrollan la mayoría de sus actividades en la noche permaneciendo ocultas
durante el día en oquedades que les brindan protección de sus enemigos
naturales Ortiz 1996
De las siete especies cuatro son de importancia comercial de Østas P interruptus
es la principal especie en el noroeste del país En el periodo de 1985 a 1997 junto
con P argus ocuparon el 95 de la captura nacional P interruptus 54 9 y P
inflatus y P penicillatus el 5 restante Briones FourzÆn y Lozano Alvarez 2000
La pesquería de la langosta roja es la mÆs antigua de MØxico remontÆndose a
finales del siglo XIX Su historia moderna data desde 1950 Entre este aæo y 1992
fue parte de un grupo de organismos marinos cuya explotación estaba reservada a
cooperativas de pesca En 1992 la ley Federal concerniente a las pesquerías y
cooperativas fue modificada La pesquería de especies reservadas o exclusivas a
cooperativas fue sujeta a un nuevo esquema basado en concesiones y permisos
para su pesca en Æreas definidas y al cual en teoría cualquier persona u
organización puede aplicar Sin embargo las concesiones concedidas hasta el
momento cuya duración varía de los 5 a los 20 aæos han sido solo para las
cooperativas ya que Østas han demostrado tener suficiente capacidad tØcnica de
organización y económica La regulación de la pesca se ha basado principalmente
en una temporada de veda donde el tamaæo mínimo legal es de 82 5 mm de
longitud de cefalotórax y la prohibición permanente de capturar hembras grÆvidas
Hasta 1993 la temporada de veda era la misma para la costa occidental de la
península Sin embargo debido a las variaciones latitudinales en el ciclo
reproductivo de P interruptlls la costa se ha dividido en 4 zonas que empiezan la
temporada de capturas escalonadamente empezando en septiembre en la zona 1
mas norteæa hasta la zona 4 mas sureæa la cual empieza en diciembre
Briones FourzÆn y Lozano Alvarez 2000
La langosta roja es capturada con trampas que generalmente son rectangulares y
cubiertas de alambre galvanizado que a su vez esta recubierto de plÆstico Las
trampas de madera y de red son menos comunes y sólo son usadas en la parte
sur de la península Estas utilizan pescado o moluscos como carnada
Normalmente se usan pangas con motor fuera de borda y en el centro y norte de
la península estÆn equipadas con cabrestantes hidrÆulicos Lo que se conoce
como unidad bÆsica de pesca o como equipo o campo langostero consiste en una
embarcación menor con moto fuera de borda trampas variables y dos o tres
2
pescadores Las trampas se colocan por la maæana y se recuperan hasta la
maæana del día siguiente Los pescadores mantienen las langostas capturadas
vivas en contenedores o jaulas submarinas llamadas recibas hasta que el
transporte las recoge y las lleva a centros de procesamiento Este transporte se
lleva a cabo dependiendo de los recursos de la cooperativa ya sea una o varías
veces por semana Briones FourzÆn y Lozano Alvarez 2000
P interruptus es un producto altamente cotizado en el mercado nacional e
internacional La langosta roja es vendida en el mercado en forma entera
precocida congelada entera cruda congelada cola congelada carne de langosta
y viva Esta œltima es posible debido a que puede sobrevivir grandes periodos
fuera del agua desde que es capturada hasta que llega al mercado Ortíz 1996
Vega et aL 1996
El transporte vivo y la langosta roja
El transporte vivo de animales acuÆticos es una prÆctica ampliamente usada en la
industria acuícola así como en el mercadeo de crustÆceos y moluscos en todo el
mundo Su origen se remonta hasta el aæo 273 a c en asentamientos Romanos
en Cosa en la costa de Tuscana sur En excavaciones de estos sitios se han
encontrado viveros para peces cuyo uso fue presuntamente para comerciar con
Østos vivos e incluso se cree que se llevaban a Roma en botes especialmente
construidos y equipados con algœn tipo de vivero Schwarz 1995
3
La exportación viva de las langostas en MØxico estuvo prohibida por un gran
período para proteger la industria procesadora nacional como fuente de trabajo
pero desde 1996 ha sido permitida e impulsada por las cooperativas y la iniciativa
privada debido a la gran demanda de los mercados extranjeros y a los altos
precios que llega a alcanzar en algunos de ellos Briones FourzÆn y Lozano
Alvarez 2000 Sin embargo la exportación y mercadeo vivo en P interruptus es
un proceso poco estudiado Existen algunas pesquerías de langostas que son
similares en cuanto la proporción e importancia en Australia CanadÆ India
Nueva Zelanda Reino Unido y Estados Unidos En estos paises los
procedimientos de mercadeo vivo estÆn especialmente diseæados de acuerdo a la
fisiología de las langostas que exportan
Durante el transporte en vivo desde la captura en el mar el mantenimiento en
recibas hasta el empacamiento y envío las langostas estÆn expuestas a una
serie de trastornos fisiológicos provocados por la manipulación excesiva los
largos períodos de emersión la diferencia entre los gases respiratorios en el agua
y en el aire condiciones de hipoxia la desecación el aumento de la actividad e
interacción de los animales por las altas densidades de transporte el aumento en
los niveles de los compuestos nitrogenados que son acumulados la variabilidad
en los mØtodos y procesos de reinmersión Schwarz 1995 Estos procedimientos
afectan negativamente los sistemas biológicos de las langostas tales como el
sistema inmune el sistema respiratorio y excretor la osmorregulación y el
balance hídrico iónico Vijyakumaran y Radh8krishnan 1997 La alteración de
estos sistemas biológicos compromete la calidad y reduce la supervivencia de las
langostas La entrega de langostas en buenas condiciones y con alta
4
supervivencia requiere criterios para el reconocimiento del estrØs y procedimientos
para revertirlo
La langosta roja puede soportar largos períodos de exposición aØrea o emersión
Ortiz 1996 Aunque este comportamiento fisiológico es característico de
especies intermareales es decir que usualmente en su hÆbitat natural estÆn
expuestas a períodos de emersión y reinmersión como Carcinus maenas o
Chasmagnathus granulata la langosta roja puede soportar estos períodos siendo
un habitante submareal Algunas adaptaciones fisiológicas se reflejan en los
cambios químicos de la hemolínfa que han sido estudiadas en varias especies de
organismos que son sujetos a procedimientos de transporte vivo Morris y Oliver
1999a
El sistema inmune
La hemolinfa de los crustÆceos es una solución que contiene iones y gases
disueltos productos de la digestión sustratos y desechos del metabolismo
compuestos orgÆnicos fisiológica mente importantes como aminas y hormonas
esteroideas proteínas y pØptidos y una población de cØlulas circulantes
hemocitos Los niveles en hemolinfa de estos componentes estÆn estrechamente
relacionados con el estadio de muda la edad el estado nutricional el sexo y el
estrØs que afecta al organismo Paterson y Spanoghe 1997
5
Los invertebrados en general carecen de una respuesta inmune humoral basada
en anticuerpos y de una respuesta inmune celular basada en cØlulas
especializadas como los linfocitos por lo que aparentemente carecen de una
especificidad y memoria inmunológica En los decÆpodos y otros artrópodos la
presencia del caparazón o exoesqueleto representa la barrera externa de
protección ante la constante amenaza de patógenos pero su inmunidad estÆ
basada en una población de hemocitos circulante con capacidad de reconocer
material extraæo por medio de molØculas especializadas como lectinas o BGBP s
Beta Glucan Binding Proteins para fagocitarlo encapsularlo o inactivarlo
químicamente a pesar de que la respuesta celular en estos organismos es
bastante limitado ya que en los crustÆceos se han logrado definir sólo tres tipos
de grupos celulares en base a criterios morfológicos y bioquímicos Cada uno de
estos tipos celulares tiene una acción específica en la respuesta inmune cuyas
funciones conjuntas dentro de este sistema son la coagulación fagocitosis y la
lisis de cØlulas externas son tambiØn un sitio de transporte y almacenamiento de
proteínas y participan en el metabolismo de los carbohidratos Cheng y Chen
2001 Los hemocitos son activados por medio del sistema plasmÆtico de
reconocimiento de microorganismos como las lectinas o aglutininas
glucoproteínas sin actividad catalíticØl que tienen la propiedad de reconocer de
manera especifica a los carbohidratos de superficie de membranas o de pared
bacteriana e inducen la aglutinación de estas cØlulas debido a que tienen dos
sitios específicos de enlace o bien desencadenan diversos eventos celulares
como la fagocitosis VÆzquez et aL 1998 Freire y Barraco 2000 Otras
molØculas que tienen la capacidad de reconocer material antígeno de degranular
6
a los hemocitos y activar la fenoloxidasa son las BGBP s las cuales se han
encontrado en una gran diversidad de crustÆceos tanto las lectinas como las
BGBP s se pueden considerar como las molØculas equivalentes a los anticuerpos
en vertebrados pero sin la especificidad de estos œltimos ambas reciben el
nombre de Proteínas de Reconocimiento de Patrones o PRP s Pattern
recognition proteins Vargas Albores y Yepiz Placencia 2000 Los hemocitos
tambiØn estÆn relacionados con la fagocitosis de partículas forÆneas Bachere et
aL 1995 La degranulación exocitosis de los hemocitos es un evento importante
que forma parte de ciertos mecanismos de defensa sobre todo porque es un
sistema que provoca tambiØn la activación del sistema de la profenoloxidasa
pro Po Estud ios sobre la actividad del sistema proPo en el acocil Pacifastacus
leniusculus y en el cangrejo Carcinus maenas han demostrado que este sistema
se relaciona de manera específica con la exocitosis de hemocitos que poseen
grÆnulos Sritunyalucksana y Söderhäll 2000 Los hemocitos pueden intervenir
en la formación de radicales libres de oxígeno como sistema microbicida como
sucede en Carcinus maenas y Penaeus vannamei Muæoz et aL 2000 El
sistema fenoloxidasa es el responsable de la melanización en muchos
invertebrados En los artrópodos la síntesis de melanina forma parte del proceso
de la esclerotización y reparación de heridas de la cutícula así como en la
defensa ante microorganismos que ingresan al hemocele Vargas Albores 1995
La enzima involucrada en esta síntesis de melanina es la fenoloxidasa PO
monophenol L Dopa oxígeno oxidoreductasa E C 1 14 18 1 y ha sido
detectada en la linfa o celoma de protostomados o deuterostomados y en grandes
cantidades en la cutícula de artrópodos Vargas Albores 1995 La PO es una
7
enzima que contiene cobre se considera bifuncional pues cataliza tanto la
hidroxilación de monofenoles como la oxidación de fenoles a quínonas Esta
enzima convierte la tirosina a DOPA la DOPA a DOPA quinona seguido de varios
pasos intermedios que llevan a la sintesis del pigmento pardo melanina el cual
puede reconocerse en ocasiones como manchas oscuras en la cutícula de los
artrópodos La fenoloxidasa es la enzima terminal de este sistema fenoloxídasa
que se considera como un sistema de reconocimiento no específico La activación
de este sistema lo ocasiona la presencia de pequeæas cantidades de
lipopolisacÆridos o pØptido glucanos provenientes de membranas celulares de
bacterias La melanina se ha considerado tóxica al igual que los metabolitos
intermedios de su síntesis y se le han atribuido propiedades inhibitorias de
enzimas fœng cas y bacteria les Vargas Albores 1995 CÆrdenas y Dankert 1997
Le Moullac y Haffner 2000 Sritunyalucksana y Söderhäll 2000
Existen tres tipos de hemocitos cuya clasificación se basa de acuerdo a las
diferencias que hay en la presencia de grÆnulos citoplasmÆticos y su proporción
VÆzquez et aL 1997
1 Hialinos se encargan de la fagocitosis y no contienen grÆnulos
2 Semigranulares presuntamente se encargan de la encapsulación y
contienen pocos grÆnulos
3 Granulares alojan grandes grÆnulos de enzimas y contienen el sistema
propa ademÆs de ser de tamaæo considerablemente mayor que los otros
dos tipos
8
Los conteos totales de hernocitos CTH es decir el nœmero total de los tres tipos
de cØlulas y los conteos diferenciales de hemocitos CDH la proporción de cada
uno de estos tipos varían de acuerdo a las especies y a factores intrínsecos del
organismo estadio de muda estado nutricional estrØs Lorenzon et aL 2001
Las variaciones en los nÚmeros de hemocitos circulantes se regulan
principalmente por la iiberación de estos por el tejido hematopoiØtico ademÆs de
que probablemente se almacenan y liberan en otros sitios Johansson et aL
2000 Diversos autores han mencionado el uso de parÆmetros hematológicos
como los conteos de hemocitos y la actividad del sistema profenoloxidasa como
marcadores sensibles de la inmunodepresión inducida por variables ambientales
en crustÆceos decÆpodos Le Moullac et aL 1997 Cheng y Chen 2000 Fotedar
et al 2000 Gómez et al 2000 Cheng y Chen 2001 Lorenzon et aL 2001
El sistema antioxidante
El descubrimiento del radical superóxido por Gershman et aL 1954 y la enzima
superóxido dismutasa por McCord y Fridovich 1969 abrió el camino a un amplio
campo de estudio que comprende la detección caracterización y anÆlisis del papel
que llevan a cabo los radicales libres de oxígeno en procesos normales y
patológicos del metabolismo celular
Los radiclles libres de oxígeno son especies químicas que poseen un electrón no
apareado en su orbital mas externo que como regla hace que se incremente la
reactividad de un compuesto especialmente en reacciones de sustracción de
9
Ætomos de hidrógeno y en la adición de dobles enlaces de compuestos orgÆnicos
Tovar 1998
Esta reducción incompleta del oxígeno se produce en condiciones normales
celulares debido a la incertidumbre en la cadena de transporte electrónico de las
mitocondrias ya que la reducción completa de una molØcula de oxígeno a dos
molØculas de agua precisa de un total de 4 electrones Lehninger 1994 No se
conoce el modo como se coordina el flujo electrónico en la cadena respiratoria
para que rinda cuatro electrones que aseguren la reducción completa de una
molØcula de oxígeno Una sugerencia es la de que los citocromos pueden
funcionar por pares Constituye Østa una cuestión de la mayor importancia ya que
la reducción parcial o univalente del oxígeno da lugar a compuestos tóxicos La
reducción por un solo electrón origina el radical superóxido 02 mientras que la
reducción por dos electrones produce peróxido de hidrógeno H202 y aunque
Østos no son considerados como oxidantes poderosos si pueden formar
espontÆneamente o mediante catÆlisis otros oxidantes mÆs peligrosos como el
radical hidroxilo Ol f Lehninger 1994 Storey 1996 Fridovich 1998 Hermes
Lima et al 1998 En procesos normales se sitœa a la mitocondria como el sitio
de producción de especies reactivas de oxígeno de mayor importancia
generando el radical super6xido a una tasa del 1 al 5 del oxígeno consumido
Boveris y Cadenas 1982 Sin embargo no es el œnico sitio de formación de
Østos sobre todo cuando existen factores externos al organismo que provocan
una mayor liberación de esias especies oxigenadas reactivas EOR por otros
mecanismos entre estos factores tenemos a los mÆs conocidos como isquemia
10
perfusión exceso de hierro e incremento metabólico oxidativo y como cuando se
realiza ejercicio exhaustivo Joanisse y Storey 1996 Hampton 1999 Lopes et aL
1999 Pierre y Fontecave 1999 Hermes Lima et aL 2000
La generación de los radicales libres de oxígeno en los sistemas biológicos se
lleva a cabo por la reducción univalente del oxígeno en las siguientes etapas
1 Producción no enzimÆtica durante la oxidación de sustratos naturales tales
como la oxidación espontÆnea de catecolaminas hidroquinonas
leucoflavinas de grupos tiol y ferredoxinas reducidas
2 Producción enzimÆtica catalizada por reductasas y deshidrogenasas y
aldehído oxidasa
2 Estimulación por compuestos químicos y drogas y
4 La producción de radicales libres por cØlulas enteras macrófagos y
neutrófilos estimuladas por antígenos en el fenómeno conocido como
disparo respiratorio en el que se producen estos EOR s para eliminar al
antígeno Tovar 1998 Babior 2000 Ortuæo et aL 2000
Sin embargo debido al incremento de las concentraciones de oxígeno atmosfØrico
durante la evolución de la tierra los organismos aeróbicos han adquirido un
arsenal complejo de mecanismos antioxidantes Entre estos tenemos una variedad
de pequeæas molØculas como el tocoferol vitamina C glutatión ß Caroteno
y ademÆs ungrupo deenzimas especializadas enelcatabolismo deEOR Las
tres enzima s mÆs importantes son la superóxido dismutasa que cataliza el
radical superóxido y lo convierte en peróxido de hidrógeno este œltimo
siendo11
catabalizada por la enzima catalasa y o alguna peroxidasa Juurlink 1998
Janssens et aL 2000 Hermes Lima et aL 2001
Superóxido dismutasa SOO E C 1 15 1 1 Es una metaloproteína con un grupo
metal en su sitio activo Cu Zn Mn Fe Ni puede presentarse como un dimero
trímero o tetrÆmero cataliza la conversión del radicallíbre superóxido a peróxido
de hidrógeno mediante la siguiente reacción
O2 O2 2H O2 H202 1
Estas son eficientes catalizadores del aníón superóxido presentes en todas las
cØlulas aeróbicas Crapo et aL 1978 Fridovich 1998
Catalasa CAT E C 1 11 1 7 Esta es una hemoenzima que ha sido detectada
en animales y plantas y cataliza la reacción
2H202 O2 H20 2
Estas enzimas son catalizadores eficientes cuando se encuentran con grandes
cantidades de H202 ya que su Km se encuentra en el rango milimolar Whitaker
1994
Peroxidasa Son hemoenzimas que se encuentran en plantas y animales y utilizan
una variedad de donadores de electrones para reducir H202 a 2H20 Entre Østas
tenemos a glutatión peroxidasa E C 1 11 1 7 que utiliza a este tripØptido hallado
en todas las cØlulas animales como donador de electrones y tambiØn previene la
acumulación de productos tóxicos de Iipoperoxidación como malondialdehído
12
hidroxinonenal e hidroperóxidos lipídicos Lushchak et aL 2001 Su reacción se
representa de esta manera
GSH H202 2H20 GSH oxidado 3
Esta enzima se considera eficiente debido a su alta afinidad al sustrato pero lenta
debido a la dependencia del reciclamiento rnetabólico del glutatión y del alto costo
energØtico Eaton 1991
El concepto conocido como estrØs oxidativo se considera como aquel estado
fisiológico donde la tasa de generación de especies oxigenadas reactivas
sobrepasa la capacidad del sistema antioxidante para amortiguar esta oxidación
Joanisse y Storey 1996 Este estrØs oxidativo estÆ compuesto por el ataque de
EOR s a diversas biomolØculas como proteínas lípidos principalmente PUFA y
Æcidos nucleicos quienes son modìficados en su estructura perdiendo
funcionalidad Las reacciones ocasionadas por las EOR s pueden dar como
resultado productos citotóxicos de bajo peso molecular en este sentido ocasionan
daæo a nivel molecular celular y tisular Estos pueden producir inactivación de
enzimas daæo al genoma por mutaciones despolimerización de polisacÆridos y
pØrdida de función membranal debido al daæo a Iípidos de membrana
Iipoperoxidación La abundancia de fosfolípidos en los sitios de formación de
radicales provoca que sean afectados en mayor proporción por Østos siendo así
la lipoperoxidación el proceso mediado por radicales libres mÆs estudiado La
oxidación de estos lípidos provoca a su vez una cascada de reacciones que
producen alquenos y compuestos carbonadas Entre algunos de estos
13
compuestos encontramos a algunos severamente tóxicos como los
hidroxialquenos Los productos derivados de la peroxidación de Iípidos son
parÆmetros eficaces para monitorear el daæo por radicales libres los mas usados
son el malondialdehído MDA y el 4 hidroxi 2 E nonenal 4 HNE Cohen y
Teomi 1995 Hermes Lima et aL 1995 Joanisse y Storey 1996 Beckman y
Ames 1997 Hermes Lima et aL 1998 Lehotsky 1998 De Zwart et al 1999
Dandapat et aL 2000 Gabbita et al 2000 Winterbourn et al 2000 Downs et al
2001
14
Antecedentes
Las respuestas fisiológicas a la emersión han sido extensamente estudiadas en
organismos intermareales y submareales como cangrejos del gØnero Petrolisthes
por Stillman y Somero 1996 el cangrejo Caneer magister por Airriess y
McMahon 1996 el cangrejo dulceacuícola Potamonautes warreni por Monis y
Van Aardt 1998 en Chasmagnatus granulata por Schmìtt y Santos 1993
Luquet et al 1998 y Halperin et al 2000 en Munida rugosa y Lioearcinus
depurator por Bergman et al 2001 en Callinectes sapidus Cardisoma guanhami
y Geearcinus lateralis por Henry et al 1994
Diversos crustÆceos han sido estudiados en su fisiología durante el transporte
vivo En MØxico solo existen dos estudios sobre P interruptus Ortiz en 1996 que
utilizó la variación en la tasa metabólica y la excreción de amonio molecular ante
cambios en las condiciones ambientales Comparó los cambios metabólicos de P
interruptus al variar la temperatura dentro y fuera del agua y obtuvo el mayor
cambio dentro del agua este estudio nos indica que el cambio metabólico fuera
del agua no corresponde con el cambio de temperatura El otro estudio realizado
por Gómez JimØnez et aL 2000 utiliza los conieos de hemocitos y la actividad de
la enzima fenoloxidasa como indicadores de inmunocompetencia en P interruptus
sometida a enfriamiento a diversas tasas y emersión reportando altos niveles de
CTH y actividad enzimÆtìca deprimida de la fenoloxidasa conforme aumenta el
tiempo de emersión Sin embargo es escasa la información relacionada con el
15
efecto que tiene el transporte vivo en el sistema inmune de P interruptus y no
existe información acerca del efecto en el sistema antioxidante y cómo estos
sistemas estÆn relacionados con la capacidad de la langosta para soportar largos
períodos de emersión En India Vijayakumaran y Radhakrishnan 1997 reportan el
estudio de cuatro especies de langostas del gØnero Panulirus que se pescan en
sus costas y son sometidas a procesos de transporte y mercadeo vivo P ornatus
P homarus P polyphagus y P versicolor En CanadÆ y EU la langosta quelada
Homarus amerieanus ha sido extensamente estudiada en varios aspectos entre
ellos su fisiología relacionada con el transporte vivo esta langosta soporta una
gran pesquería así como a una industria procesadora dedicada al mercadeo vivo
McDonald 1996 Riley et aL 1996 En Australia y Nueva Zelanda las langostas
P eygnus P ornatus y Jasus edwardsii Jussila 1997 Paterson et aL 1997
Paterson y Spanoghe 1997 Spanoghe y Bourne 1997 Taylor et aL 1997 Taylor
y Waldron 1997 Morris y Oliver 1999a Morris y Oliver 1999b En Cuba la
langosta caribeæa P argus Diaz et aL 1975 En Europa los crustÆceos Maia
squinado Maerobraehium rosenbergii Neeora puber Nephrops norvegicus
Caneer pagurus y Homarus gammarus Schwarz 1995 Webster 1996 Durand
et aL 2000 En Japón el camarón Penaeus japonieus y la langosta Panulirus
japonicus Furusho et al 1988 Kuramoto y Tani 1997 Chen y Chen 1998
16
Justificación
La langosta roja espinosa Panulirus interruptus es un apreciado recurso que
soporta una de las mÆs importantes pesquerías del país En 1999 la producción
alcanzó 1 047 ton tan sólo en Baja California Sur SEPESCA 2000 El producto
comercializado congelado o vivo es apreciado en todos los mercados a nivel
mundial En particular la demanda por el producto vivo ha incrementado en los
œltimos aæos debido a los altos precios que alcanza en el mercado en
comparación con otras presentaciones Sin embargo los mØtodos de transporte y
el manejo de las langostas vivas aunado a las condiciones medioambientales que
se presentan a lo largo de la temporada de captura de P Inferruptus en Baja
California Sur provocan serios trastornos en la fisiología y el desempeæo
adecuado de las langostas Las cooperativas se enfrentan a la problemÆtica de
realizar prÆcticas adecuadas de transporte vivo para evitar el deterioro del
producto y poder optimizar los rendimientos Por tal razón es importante estudiar
la fisiología de la langosta roja cuando es sometida a diferentes períodos de
emersión
El estudio del sistema inmune de la langosta resulta necesario ya que es aquel
que lleva a cabo la función de defensa en contra de microorganismos de
naturaleza bacteriana fœngica o viral que amenazan la supervivencia y la calidad
de las langostas El sistema antioxidante debido es aquel que nos indica el estrØs
oxidativo que ocurre con la sobreproducción de especies oxigenadas reactivas
17
Los parÆmetros seleccionados de ambos sistemas nos dan una idea acerca de los
cambios en la inmunocompetencia y en el sistema antioxidante que ocurren como
consecuencia de factores como tiempo de emersión temperatura de aclimatación
manipuleo y estrØs en general
Estos indicadores fisiológicos nos permitirÆn entender las adaptaciones que posee
la langosta roja para sobrevivir en grandes períodos de emersión y poder
desarrollar las bases biotecnológicas adecuadas para garantizar un producto de
calidad en el mercado
18
Objetivo
Determinar el efecto del tiempo de emersión y de la temperatura de aclimatación
en las adaptaciones fisiológicas del sistema inmune de Panulirus interruptus
Objetivos particulares
1 Determinar el efecto de 4 tiempos de emersión y de 2 temperaturas de
aclimatación en el nœmero total de hemocitos de Panulírus interruptus
2 Determinar el efecto de 4 tiempos de emersión y de 2 temperaturas de
aclimatación en la actividad catalítica de las enzimas fenoloxidasa
sLlperóxido dismutasa catalasa glutation peroxidasa y proteina en
hemolinfa de Panulirus interruptus
3 Determinar el efecto de 4 tiempos de emersión y de 2 temperaturas de
aclimatación en los niveles de malondialdehído y 4 hidroxi 2 E nonenal en
hemolinfa de Panulírus interruptus
19
Materiales y mØtodos
Origen y mantenimiento de los organismos experimentales
Las langostas utilizadas en los experimentos fueron donadas por la cooperativa
Bahía Magdalena y la cooperativa Puerto Chale que realizan sus actividades en la
región de Baja California Sur Las langostas provienen de la región de Bahía
Magdalena y son transportadas en costales secos desde los campos pesqueros
hasta las instalaciones de las cooperativas Estos viajes tienen una duración de 3
a 6 horas Todas las langostas donadas fueron adultos de talla mayor a la mínima
legal 82 5 mm y entre los 514g y 800g de peso Las langostas fueron trasladadas
desde las instalaciones de las cooperativas en la ciudad de La Paz al Centro de
Investigaciones Biológicas del Noroeste S C en hieleras de poliuretano rellenas
de aserrín hœmedo semejantes a las usadas en las simulaciones de transporte
vivo y depositadas en una tina de fibra de vidrio ovalada de 1 000 L de capacidad
con una profundidad de 0 5 m y tapadas con red negra de Nylon malla sombra
para mantenerlas tranquilas La tina fue llenada con agua de mar previamente
filtrada por filtros de cartucho 5 micras y se realizó un recambio diario por las
maæanas del 70 al 80 Al momento de los recambios se sifoneaba el alimento
no ingerido se limpiaban las heces y los escondrijos La aireación se realizó por
medío de difusores de sílica y el oxígeno disuelto se mantuvo superior al 80 de
saturación el cual nunca decayó por el constante flujo de aire La temperatura
fue mantenida por medio de calentadores elØctricos con termostato integrado y
20
con ayuda de aire acondicionado La temperatura se mantuvo entre los 18 y los
230C excepto durante los periodos de aclimatación previos a los experimentos 20
y 260C
Las langostas fueron alimentadas diariamente por las maæanas con calamar
picado debido a la preferencia de las langostas
Simulación de condiciones de transporte vivo
1 Temperatura experimental
Se seleccionaron dos temperaturas de aclimatación 20 y 260C La selección de
temperaturas se realizó de acuerdo al promedio de la temperatura del agua en
Bahía Magdalena al inicio de la temporada Octubre 26 2rC y a la mitad de
Østa Febrero 20 210C Vargas 1999 La aclimatación se llevó a cabo tres días
antes de cada simulación de transporte vivo modificando la temperatura del agua
de la tina con ayuda de un calentador elØctrico de 500 W y del aire
acondicionado El día anterior a las simulaciones se interrumpió la alimentación
para evitar variaciones debidas al metabolismo post prandial
2 Tiempos de emersión
Se seleccionaron cuatro tiempos de emersión 3 6 12 Y 24 horas para simular
condiciones de transporte vivo que corresponden a períodos de traslado cortos 3
6 h hasta períodos que involucren traslados aØreos 12 24 h Los períodos de
21
OI4f Sh r
f
transporte vivo se llevaron a cabo introduciendo 8 langostas escogidas al azar sin
diferenciación de sexo y en periodo de intermuda en hieleras de poliuretano con
aserrín de madera Antes de introducir a las langostas la tina en donde se
encontraban fue vaciada aproximadamente a un 80 de su capacidad y los
escondrijos fueron removidos un dia antes para facilitar la toma de las langostas y
evitar estrØs debido a la manipulación Cada hielera correspondió a un tiempo de
emersión En cada hielera se colocó en la tapa un sensor de temperatura y
humedad electrónicos Data loggers HOBO ProSeries RHTemp BC3 6 DL
calibrados para registrar lecturas aproximadamente cada segundo durante la
duración de cada período de emersión Al final se colocó un paquete de hielo
seco y se selló la hielera con cinta adhesiva
Obtención de la muestra
Al final de cada tiempo de emersión se tomaron 4 langostas al azar de cada
hielera y se les extrajeron a cada una 6 mi de hemolinfa con jeringa hipodØrmica
de 3 mI La hemolinfa se extrajo de la región del perícardio a travØs de la
membrana localizada en la región dorsal entre el cefalotórax y la cola Esta
membrana fue previamente lavada con una piseta de agua destilada Se utilizaron
dos diferentes anticoagulantes previamente enfriados a 40C uno compuesto de
EDTA al 10 con agua destilada en la proporción 1 5 con la hemolinfa para los
ensayos bioquímicos y otro compuesto por NaCI 450 mM KCI 10mM Hepes
10mM y EDTA 10mM pH 7 3 en proporción 1 5 con la hemolinfa para los conteos
de hemocitos De acuerdo a resultados preliminares este œltimo antícoagulante fue
22
seleccionado debido a que permitía mantener las cØlulas adecuadamente para su
conteo otros anticoagulantes sugeridos en la literatura referente a crustÆceos no
sirvieron para este propósito ya que la muestra se coagulaba antes de los conteos
Las extracciones para los ensayos bioquímicos y para los conteos de hemocitos
se realizaban una seguida de otra los conteos se realizaron al momento en un
microscopio 40 x en una cÆmara de Neubauer modificada por cuatruplicado La
hemolinfa utilizada para los ensayos bioquímicos se centrifugó inmediatamente en
una microcentrífuga VWR Scientific para 6 tubos eppendorf a 4 000 rpm durante 4
minutos para obtener dos fases Østas se separaron en tubos de microcentrífuga
por medio de pipetas Tanto el sobrenadante fase acuosa o plasma como el
paquete celular fase sólida se congelaron en un ultracongelador a 70 oC para
su posterior anÆlisis
Preparación de la muestra
Los ensayos bioquímicos que se le realizaron a la hemolinfa de las langostas se
llevaron a cabo tanto en el plasma como en el paquete celular La fase acuosa fue
utilizada como extracto crudo solamente diluyØndola con agua destilada cuando
fue necesario para las lecturas en el espectrofotómetro Beckman Mod DU640
debido a que en ocasiones se encontraban muy densas ópticamente La fase
celular fue resuspendida en 400 d de amortiguador de fosfatos 50mM pH 7 frío
4oe y sometida a un proceso de lisis celular mediante cavitación por ultrasonido
Ultrasonic Homogeneizer serie 4710 a 24 watts de potencia durante 15
23
segundos DespuØs de la lisis se volvió a centrifugar con el fin de separar los
restos celulares provenientes de la Iisis y el sobrenadante lisado de hemocitos fue
el utilizado para los ensayos Este extracto debe usarse inmediatamente sin
posibilidades de preservación por congelamiento debido a la naturaleza lÆbil de los
compuestos a determinar provenientes del interior de las cØlulas Para la
cuantificación de los compuestos de Iipoperoxidación la segunda centrífugacíón se
llevó a cabo hasta despuØs de la incubación con los agentes cromogØnicos a
450C
AnÆlisis Bioquímicos
A estas muestras se les realizó determinación de actividad enzimÆtica para
Superóxido dismutasa
Catalasa
Glutatión peroxidasa
Fenoloxidasa
Así como cuantificación de
Proteína
MDA Y 4 HNE
Los detalles de los anÆlisis bioquímicos se encuentran en el ApØndice 1
24
AnÆlisis Estadistico
Los datos fueron analizados por pruebas de normalidad y homogeneidad de
variancias Kolmogorov Smirnoff y Barttlet respectivamente Estas pruebas
demostraron que los datos satisfacían los supuestos para utilizar estadística
paramØtrica Se estableció el efecto del tiempo de emersión y de la temperatura
en los diferentes indicadores fisiológicos seæalados mediante AnÆlisis de Varianza
de dos vías con un nivel de significancía de 0 05 Las diferencias entre
tratamientos fueron establecidas por la prueba de honestidad de Tukey con ayuda
del paquete estadístico Statistica 5 1 edición 97 1984 1998 por Statsoft Inc
25
Resultados
Conteos totales de hemocitos
Los datos de los CTH variaron para los organismos aclimatados a 200C de 408 a
6 272 cØls mm3 Para los aclimatados a 260C variaron de 1 280 a 10 112
cØls mm3 Existe un efecto significativo debido a la temperatura de aclimatación
P O 05 Siendo los valores de los organismos aclimatados a 200C menores
que aquellos de los organismos aclimatados a 260C
9000A
8000
7000 aA
M6000
E 5000 IIJ 20 CE
Cìi 4000 tJ 26 CªU 3000
2000
1000
O
O 3 6 12 24
Tiempo de emersión h
Figura 1 Conteos totales de hemocitos media desviación estandar a 2
temperaturas de aclimatación 20 26 o C y 4 tiempos de emersión 3 6 12 24
h Los datos estÆn expresados en cØlulas por milimetro cœbico Grupos
homogØneos se representan con letras Tukey P 0 05
26
Actividad específica enzimÆtica
Tabla 1 Actividad enzimÆtica especifica media 1 desviación estandar de SOD
CAT GPx y PO en Extractos Lisados de Hemocitos ELH y en plasma a 20 o C
y 4 tiempos de emersión 3 6 12 24 h Los datos estÆn expresados en U mg
proteína Tratamientos diferentes significativamente del control O h
Tiempode
emersión
h Fracción SOD CAT GPx PO
O ELH 23 5524 1 54 0 160 0140 14t0 014
Plasma 2 18 O O O
3 ELH 0 14t0 02
Plasma O
6 ELH 0 110 03
Plasma O
12 ELH 5 71 9 145 1 04 0 020 009 0 1 070 05
Plasma O O 029 O
24 ELH
Plasma
27
Tabla 2 Actividad enzimÆtica específica mediadesviación estandar de 800
CAT GPx y PO en Extractos Lisados de Hemocitos ELH y en plasma a 26 o C
y 4 tiempos de emersión 3 6 12 24 h Los datos estÆn expresados en U mg
proteína Tratamientos diferentes signifícatívamente del control O h
Tiempode
emersión
h
O
Fracción SOD CAT GPx PO
ELH 11 25t1 8 26 1t14 0 180 0 0 1210 04
Plasma 7 14 1 54 O 041tO 01
3 ELH
Plasma
0 090 06
0 39t0 36
6 ELH
Plasma
0 140 04
0 5t0 07
12 ELH
Plasma
0 09t0 02
0 640 12
24 ELH
Plasma
847 3 6
6 3310 61
0
O
0 17 0 170 14
O 14tO 03 O 55íO 29
En los datos de actividad enzimÆtica específica se encontraron diferencias
significativas P 0 05 por efecto de la temperatura solo en la enzima CAT
Siendo los valores de los organismos aclimatados a 200C menores que aquellos
de los organismos aclimatados a 260C
28
Las actividades específicas de las enzimas CAT y GPx en ELH de organismos
aclimatados a 200C mostraron tendencias antagónicas es decir cuando la
actividad de CAT disminuía la de GPx aumentaba y viceversa
1 8
1 6
14
1 2
Cl 1E
0 8
0 6
04
0 2
o
1
1
0 2
0 18
0 16
0 14
0 12Cl
0 1 Œ0 08
0 06
0 04
0 02
O
CATl
Figura 2 Relación entre actividad específica de CAT y GPx en ELH
O 3 126
Tiempo de emersión h
24
29
Cuantificación de niveles de Proteínas MDA y 4 HNE
Extractos lisados de hemocitos
6
A a a
5b
Bb B
4JE 3en 0260CE
2
o 3 6 12 24
Tiempo de emersión h
Figura 3 Niveles de proteína media tdesviación estandar a 2 temperaturas de
aclimatación 20 26 o C y 4 tiempos de emersión 3 6 12 24 h Los datos
estÆn expresados en rníligramos de proteína pOí mililitro de muestra Grupos
homogØneos se representan con letras Tukey P O 05
30
8
7
6
U 5o
4
g 3u
2
1
O
ab
cb
cb
T T
o 3 6 12 24
Tiempo de emersión h
Figura 4 Niveles de MDA mediadesviación estandar a 20 o e y 4 tiempos de
emersión 3 6 12 24 h Los datos estÆn expresados en Microgramos de MDA
por mililitro de muestra Grupos homogØneos se representan con letras Tukey
P O 05
31
0 9
0 8 b b
0 7 abE 0 6 bIII
o
E 0 5lII
a 04
O0 3
E 02
0 1
O
3 6 12 24
Tiempo de emersión h
Figura 5 Niveles de MDA mediadesviación estandar a 26 o e y 4 tiempos de
emersión 3 6 12 24 h Los datos estÆn expresados en Microgramos de MOA
por mililitro de muestra Grupos homogØneos se representan con letras Tukey
P O 05
En los niveles de MDA existe diferencia significativa P O 05 por efecto de la
temperatura siendo los valores para los organismos aclimatados a 200C mayores
que aquellos de los organismos aclimatados a 260C
32
250
a
1200
Eab ab11I 150o
ECIl
g 100
bo
50b
O r r
O 3 6 12 24
Tìempo de emersión h
Figura 6 Niveles de HNE media tdesviación estandar a 200C y 4 tiempos de
emersión 3 6 12 24 h Los datos estÆn expresados en Microgramos de HNE
por mililitro de muestra Grupos homogØneos se representan con letras Tukey
P O 05
33
120
a
100JE
80fII
o
E 60113lo
01o
40lo
e
20
ab
e
omLLl
o 3 6 12 24
Tiempo de emersión h
Figura 7 Niveles de HNE media tdesviación estandar a 26 o e y 4 tiempos de
emersión 3 6 12 24 h Los datos estÆn expresados en Microgramos de HNE
por mililitro de muestra Grupos homogØneos se representan con letras Tukey
P O 05
En los niveles de HNE existe diferencia significativa P O 05 por efecto de la
temperatura siendo íos valores para los organismos aclimatados a 200C mayores
que aquellos de los organismos aclimatados a 260C
34
Tabla 3 Niveles de Proteína MDA y HNE media t Desviación estandar en
Plasma a 200C y 4 tiempos de emersión 3 6 12 24 h Los datos de proteína se
encuentran expresados en rniligramos de proteína por mililitro de muestra Los de
MDA y HNE en Microgramos de MDA o HNE por mililitro de muestra
TIempoI de
emersión
iÌ Proteína MDA HNE
o
3 35 98 4 8
6 35891 4 8
12 27 251 74
24 37 912 2
35
Tabla 4 Niveles de Proteína MDA y HNE media 1 desviación estandar en
Plasma a 260C y 4 tiempos de emersión 3 6 12 24 h Los datos de proteína se
encuentran expresados en miligramos de proteína por mililitro de muestra Los de
MOA y HNE en Microgramos de MDA o HNE por mililitro de muestra
Tiempode
emersión
11 Proteína MOA HNE
o 185t84 2
e39 3t10 7
12 36toJ j04 to 2 37 63t8
112 r2 37Q UÜ3 9t12 2
4 J23Q ı o I 1 23tQ 19 45 19t6 3
Los datos de cuantìficación de proteínas MDA y HNE de los extractos lisados de
hemocitos se encuentran j epresentados en figuras para demostrar el patrón que
siguieron estas cuantificaciones Los de las cuantificaciones en el plasma se
encuentran en tablas debido a que no se identificaron patrones o tendencias
claras en estos datos
36
Discusión
En el presente estudio se encontraron variaciones en los componentes del sistema
inmune y antioxidante en relación al período de emersión o exposición aØrea y
entre las dos temperaturas de aclimatación El nœmero total de hemocitos
incrementa conforme se prolonga o aumenta el período de emersión y la
temperatura de aclimatación Sin embargo solo se encontró diferencia
estadísticamente significativa P 05 entre temperaturas de aclimatación y no
entre períodos de emersión excepto en el tratamiento de 12 horas a ambas
temperaturas como se observa en la Figura 1 Este patrón ascendente relacionado
a los períodos de emersión solo se ha reportado para esta especie en otro estudio
efectuado por Gómez et al 2000 y en P Cygnus reportado por Jussila et aL
1997 Sin embargo Gómez et al 2000 argumentan que los altos niveles de
CTH que reportan se pueden deber a la acumulación de los hemocitos en los
senos perifØricos por la disminución de la tasa metabólica y por lo tanto del flujo de
hemolinfa Cabe resaltar que en su estudio el sitio de extracción de la muestra se
encuentra en la base de los pereiópodos los cuales son irrigados principalmente
por los senos perifØricos TambiØn sugiere como sitio de extracción de la muestra
la cÆmara perícÆrdica adonde llega hernolinfa postbranquial y donde no se espera
una acumulación de hemocitos por la disminución el flujo de hemolinfa En
cambio Jussila et aL 1997 sugiere a la manipulación y exposición aØrea como
factores que provocan estos incrementos en CTH En C maenas Truscott y
White 1990 el cambio eje temperatura ambiental de 10 a 200C ocasiona un
37
incremento en los CTH al igual que en Emerita asiatica si se le efectœa un cambio
rÆpido en la temperatura ambiental Ravindranath 1997 Truscott y White 1990
mencionan una mejor inmunocompetencia con los CTH elevados durante períodos
de estrØs en este sentido Cheng y Chen 2001 reportan susceptibilidad a
Enterococcus en M rosenbergii cuando los CTH y la actividad de la PO son
bajos Sin embargo no se debe asumir una inmunocompetencia acrecentada solo
mediante el anÆlisis de los CTH ya que algunas características de los hemocitos
como la capacidad de fagocitosis es reducida por el incremento de la temperatura
Le Moullac y Haffner 2000 Por su parte Smith y Crisholm 1992 sugieren que
una reducción en la inmunocompetencia es parte de la respuesta fisiológica al
estrØs tØrmico Cabe resnltar la dificultad que conllevan los conteos de los
hemocitos ya que la capacidad de coagulación de la hemolinfa de P interruptus es
muy alta por lo que deben realizarse casi al momento de la extracción AdemÆs el
sitio de extracción es muy importante debido a la presencia de bacterias en este
estudio se observaron bacterias en hemolinfa extraída de las base de los
periópodos por lo que los conteos se realizaron exclusivamente en hemolínfa
extraída de la cÆmara pericÆrdica
La actividad de la enzima fenoloxidasa PO no mostró variaciones significativas
P O 05 ni en el plasma ni en el extracto lisado de hemocitos relacionados con los
períodos de emersión o la temperatura por lo que se sugiere que estos no la
afectan significativamente Górnez et al 2000 reporta decremento de la
fenoloxidasa al someter a la langosta roja a bajas temperaturas y a incrementos
en el período de emersión Sin embargo en esta tesis la actividad de la
38
fenoloxidasa al no variar significativarnente a lo largo de los períodos de emersión
y de las dos temperaturas de aclimatación demuestra que la langosta roja tiene la
capacidad fisiológica de mantener esta actividad incluso bajo este estrØs
ambiental Mas estudios se requieren para evaluar el papel que representan estos
marcadores celulares y bioquímicos como indicadores del sistema inmune en este
crustÆceo así como su relación con la actividad antifœngica y antibacteriana que
se le atribuye TambiØn son necesarios mas estudios acerca de la dinÆmica de las
poblaciones de hemocitos respecto al estrØs y estadio fisiológico de P interruptus
ya que la alta variabilidad en los resultados sugiere un factor no identificado en
este estudio Cabe seæalar que ninguno de los organismos experimentales sufrió
ninguna patología asociada a los experimentos antes durante o despuØs de Østos
El sistema antioxidante fue analizado para conocer parte de las adaptaciones
bioquímicas que presenta esta langosta al estrØs ocasionado por el manejo
Aunque la langosta se encuentre en un ambiente hipóxico debido a la incapacidad
de esta de ventilar adecuadamente en el medio aØreo y por lo tanto se reduce la
adquisición del oxígeno y la excreción nitrogenada se ha demostrado en otros
estudios que una de las consecuencias fisiológicas de esta hipoxia es la
generación de ERO s Al igual que el sistema inmune el sistema antioxidante
sufrió variaciones en solo algunos de sus componentes La actividad específica de
la SOD no sufrió variaciones significativas P O 05 por efecto de temperatura ni
emersión Janssens et al 2000 menciona que debido que la reacción entre SOD
y el radical superóxido depende de la tasa de difusión de este œltimo y que esta
tasa es poco modificada por la temperatura este factor no afecta
significativamente a actividad de esta enzima excepto cuando sobrepasa los
39
650C temperatura a la cual pierde su actividad catalítica Cohen y Teomi 1995
Esto sugiere que a cualquier tasa de producción del radical superóxido la SOD
mantuvo su actividad catalítica produciendo peróxido de hidrógeno
constantemente a lo largo de los períodos de emersión y en las dos temperaturas
de aclimatación Para el catabolismo del peróxido de hidrógeno encontramos dos
enzimas con propiedades distintas cuyas actividades específicas fueron
cuantificadas en este estudio La eAT mostró variaciones estadísticamente
significativas P 0 05 en su actividad y no asi la GPx La temperatura tuvo un
efecto marcado en la actividad específica de la CAT siendo Østa mayor a 260C
que a 200C P O 05 Los periodos de emersión no provocaron variaciones
excepto a las 3 horas donde las langostas aclimatadas Cl 20 oC presentaron
actividad específica baja 070 f1 06 aunque no estadíslicamente significativa ya
24 horas de emersión en que no se encontró actividad de la enzima o mÆs bien el
mØtodo que empleamos no es tan sensible como para detectar esta baja
actividad en ninguna de las langostas aclimatadas a ambas temperaturas
Aunque la actividad de CAT se observó disminuida en algunos tratamientos se
sugiere que el daæo oxidativo que se pudiera haber presentado por la deficiencia
en el catabolismo del Peróxido de hidrógeno no fue significativa debido a dos
razones principales a que en todos los tratamientos se observó al menos
actividad enzimÆtica de una de las dos enzimas que lo catabolizan y a que el
peróxido de hidrógeno no es en si un oxidante poderoso aunque puede dar lugar
a la formación de otros En este sentido Janssens et al 2000 menciona que en
mamíferos estas dos enzimas se encuentran correlacionadas negativamente es
40
decir cuando la actividad de GPx es reducida la de CA T es aumentada
catabolizando de esta manera el peróxido de hidrógeno y viceversa Sin embargo
la eficiencia catabólica de GPx es menor debido a la dependencia del
recicamiento metabólico y estado de oxido reducción del Glutatión ademÆs este
reciclamiento es energØlicamente caro debido la dependencia de NADPH por la
enzima que reduce al glulatión Glutatión reductasa Por su parte Eaton 1991
sugiere que la CATes parte de un sistema de defensa ante la sobreproducción de
peróxido de hidrógeno mediada por factores externos como estrØs ambiental o
bien por la incorporación exógena de Øste Janssens et aL 2000 y que la GPx
forma parte de la maquinaria metabólica para la eliminación de peróxido de
hidrógeno de origen endógeno el peróxido de hidrógeno es producido
normalmente en una cØlula como segundo mensajero o para mantener el balance
óxido reducción Gabbita et al 2000 Cabe resaltar la multifuncionalidad de la
enzima GPx ya que no solo interactœa con oxidantes como el peróxido de
hidrógeno sino tambiØn con productos tóxicos derivados de la peroxidación
efectuada por otras ERO s tales como MDA HNE e hidrolipoperóxidos Lushchak
etal 2001
Para cuantificar el daæo ocasionado por el estrØs oxidativo es decir por la
deficiencia de defensas antioxidantes en relación a las ERO s y sus derivados se
cuantificaron los niveles de MDA y 4 HNE Estos compuestos han sido
extensamente utilizados en la literatura concerniente probando ser buenos
indicadores de lipoperoxidación provocada por ERO s Pannunzio y Storey 1998
Winterbourn et aL 2000 Lushchak et aL 2001 El MDA en particular es mas
estable que los ERO s y capaz de difundirse hacia dentro o fuera de la cØlula
4
daæando a distancia de su formación este compuesto así como el 4 HNE son
considerados cito y genotóxicos De Zwart et aL 1999 En este estudio los
niveles de estos compuestos se incrementaron conforme aumentó el tiempo de
emersión y o la temperatura de aclimatación Sin embargo los mayores niveles de
MDA y 4 HNE fueron mayores a 200C que a 260C de temperatura de aclimatación
contrario a lo que se esperaba Este fenómeno no ha sido reportado en la
literatura y se sugiere que es necesaria la evaluación de otros órganos ademÆs de
la hemolinfa para conocer la dinÆmica de estos compuestos con respecto al
tiempo de emersión y a temperatura de aclimatación en P Interruptus En la fase
humoral de la hemolinfa de P Interruptus se observa un incremento gradual de los
niveles de ambos compuestos no significativo entre los períodos de emersión o
entre Østos y los contro es En la fracción celular se observa un marcado
incremento en los niveles con diferencias estadísticamente significativas P O 05
entre los períodos de emersión y entre Østos y los controles Sin embargo existen
dos razones para este fenómeno la primera es el incremento en las
concentraciones intracelulares de estos compuestos debido a la lipoperoxidación
de las membranas externas e internas de las cØlulas hemolinfÆticas o hemocitos y
la otra es que este incremento se debió a la acumulación de restos celulares
hemocitarios correlacionado con el incremento en los CTH y no al incremento en
la concentración de estos intracelularmente La formación de estos productos es
sin duda la peroxidacìón por especies reactivas sin embargo es difícil discernir si
fueron las especies re2lctivas de oxígeno las que la ocasionaron ya que tambiØn
pudieron ocasionarla la formación del radical libre NO óxido nítrico el cual
42
aunque no es un oxidante poderoso pudo conducir a la formación de otras
especies reactivas en este caso de nitrógeno como el radical peroxinitrito que es
un poderoso oxidante involucrado en varias patologías asociadas con el estrØs
oxidativo La formación de Øste se pudo haber dado mediante la reacción entre el
NO el radical superóxido y los compuestos de excreción nitrogenada amonio
principalmente formados y acumulados en la hemolinfa de esta langosta debido a
la restricción que ocasiona el medio aØreo en su excreción
43
Conclusiones
El sistema inmune de P Interruptus es modificado por el estrØs ocasionado por el
tiempo de emersión y la temperatura de aclimatación Sin embargo es necesario
evaluar si esta modificación disminuye la inmunocompetencía ylo predispone al
organismo a infecciones fœngicas bacterianas o virales durante su reinmersión
Con respecto al sistema antioxidante existe una deficiencia en el mantenimiento
del balance óxido reductor en la hemolinfa de P interruptus provocada por el
tiempo de emersión y la temperatura de aclimatación Sugiero que el mayor daæo
oxidativo no se dio debido a la deficiencia de las enzimas antioxidantes SOO
GPx y por lo tanto por los radicales libres superóxido o peróxido de hidrógeno
específicamente ya que estas enzimas no perdieron su actividad catalítica Se
sugiere que el mayor daæo oxidativo fue debido a la formación de otras especies
reactivas que se formaron mediante la reacciÓn entre las especies reactivas de
oxígeno y la gran cantidad de compuestos nitrogenados como amonio que se
formaron y acumulamn debido a la restringida capacidad de excretarlos en el
medio aØreo
Así mismo es necesario conocer la fisiología de esta langosta para el diseæo de
prÆcticas adecuadas de transpOlie vivo y con esto garantizar la calidad del
producto en el mercado de deslino Propongo tambiØn el estudio de la regulación
de las defensas antioxidantes relacionada con las variables ambientales y el
efecto que tienen los productos derivados de la peroxidación en la calidad del
producto Con esto concluyo que el estudio y conocimiento generado de este
44
organismo permitirÆ un uso manejo y conservación adecuado de este apreciado
recursO natural
45
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53
ApØndice 1
1 5uperóxido dismutasa 500 EC 1 15 1 1
La superóxido dismutasa es una enzima cuyo sustrato es un radical libre inestable
por lo que medición de su actividad catalítica debe ser indirecta Normalmente un
ensayo para esta enzima consiste en dos componentes un generador del radical
superóxido y un detector de Øste Un detector es una sustancia que resulta
modificada debido al poder reductor del radical superóxido El generador del
radical debe producirlo a una tasa constante El radical reaccionarÆ con el detector
en ausencia de la SOD Si la SOD estÆ presente competirÆ con el detector por el
radical superóxido Un ensayo confiable de entre los ensayos disponibles es el
espectrofotomØtrico inicialmente descrito cuando la función de SOD fue
identificada McCord y Fridovicl1 1969 En este ensayo la reacción
xantina xantina oxidasa es la generadora del radical libre y el citocromo e es el
detector de Øste Por lo tanto este ensayo es una tØcnica basada en la inhibición
de la reducción del citocromo c por la SOO
Soluciones
1 Amortiguador de fosfatos 50mM pH 7 8
EOTA O 1mM
Xantina 50flM
Citocromo e 1 QumI
4
2 Xantina oxidasa preparada antes de usar en agua destilada o deionizada fría
con aproximadamente 0 05 unidades
Ensayo
Calibrar el espectrofotómetro con celdas de plÆstico yagua destilada a una
longitud de onda de 550nm
Poner en la cuveta A 1 980 I de la solución 1 20fl de la solución 2 agitar y
graficar el cambio de absorbancia por minuto dA mín
El valor obtenido del cambio de absorbancia Imin SerÆ el control
El dA min del control deberÆ estar entre 0 025 1 0 005 si no es así ajustar la
concentración de xantina oxidasa
Poner en la cuveta B 1970 d de la solución 1 10pl de muestra y graficar el
dA mino Si el dA rnin fuera un valor positivo restÆrselo a la siguiente medición
A la misma muestra agregar 20 L1 de la sol 2 agitar y volver a graficar
CÆlculo de la actividad de la muestra
de inhibiciónA BI A 100
U mi de inhibición 50 rnl de la muestra
i i
Umg Unidades ml mg ml de proteína en la muestra
Una unidad U se define como la cantidad necesaria de muestra para inhibir en
un 50 la reducción del citocromo c
2 Catalasa CAT E C 1 11 1 7
Esta enzima cata liza la reacción
catalasa
2H202 O2 H20
Por lo tanto el cambio en la densidad óptica desaparición del peróxido de
hidrógeno por unidad de tiempo es una medición de la actividad catalasa
Soluciones
1 Amortiguador de fosfatos 50mM ph 7 0
2 8mM de peróxido de hidrógeno en la solución 1 ajustar la concentración de
peróxido en el espectrofotómetro a una absorbancia de 0 5 0 01 a 240nm
56
Ensayo
Calibrar el espectrofotómetro en 240nm con la solución 1
Agregar a una celda de cuarzo 1 mi de sol 2 20ld de muestra agitar y graficcu
dA min
Los valores negativos de la pendiente dA min indican actividad de la catalasa
U mi dA min dilución 60 seg
U mg U mi mg ml proteína
Una unidad se considera como la descomposición de 1 lmole de peróxido por
minuto a 250 bajo estas condiciones controladas
3 Glutatión peroxidasa GPx EC 1 11 1 7
La actividad de esta enzima se mide espectrofotomØtricamente mediante el
seguimiento de la desaparición de glutatión reducido a 356 nrn en una solución
amortiguadora de fosfatos y peróxido
57
Soluciones
1 Amortiguador de fosfatos 50mM pH 7 0
2 Sol 1 con peróxido ajustando la concentración a 0 5 de Absorbancia en el
espectrofotómetro a 240nm en cuveta de cuarzo
3 G utatión reducido 5 mM en agua destilada
Ensayo
Ajustar la concentración de peróxido en la sol 1 a 240 nm
Calibrar el espectrofotórnetro a 356 nm con la sol 1
Agregar a una cuveta de 1 mi 940 pl de sol 2 mas 50 ul de sol 3 y observar si
existe un dA min negativo si es negativo restÆrselo a cada una de las mediciones
de las muestras si es positivo no se resta
Por cada muestra agregar a una cuveta 940pl de sol 2 mas 50 ul de sol 3 mas 10
d de muestra y observar el dA min los valores negativos indican la actividad GPx
El cÆlculo de la actividad se obtiene
U1m dA min60
U mg U mi mg ml de proteína
58
4 Fenoloxidasa PO E C 1 14 18 1 la actividad de esta enzima se mide
espectrofotometricamente mediante la formación de dopacromo a partir de L
dihidroxifenilalanina lDOPA
Soluciones
1 Amortiguadora de Cacodilatos 0 01 M pH 7 0
CaCl2 10mM
2 L DOPA 3mg ml en agua destilada
Ensayo
Calibrar el espectrofotómetro a 490 nm con 501 1
En una cuveta de 1 mi se 3gregan 1 00 ll de muestra 1 00 tI de sol 2 y se incuba
a temperatura ambiente por 10 minutos
A esa cuveta se agregan 800 fd de sol 1 para detener la reacción y se lee en el
espectrofotómetro a 4ØO nm
U mg Abs I mg m de proteína de la muestra
C q
5 Proteína
El ensayo para determinar la cantidad de proteína soluble se realiza por medio del
kit Bio Rad el cual esta basado en el mØtodo de Bradford 1976 Este es un
ensayo en el cual el colorante azul de Coomasie cambia de coloración en
respuesta a diferentes concentraciones de proteína Este colorante se enlaza
principalmente con residuos de arninoÆcidos como arginina La determinación de
la coloración del pigmento se realiza espectrofotometricamente previa elaboración
de una curva estandar de Albœmina sØ rica bovina
Soluciones
1 Bio Rad Protein Assay dye diluida 1 4 en agua destilada
2 Albœmina Bovina sØrica a 5 concentraciones mg ml conocidas
Ensayo
En Clvetas de 1 mI Agregar 200 Ll de cada una de las 5 concentraciones de la
albœmina y 800pl de la solución 1 y medir en el espectrofotómetro para la curva
std
DespuØs de obtener la curva estandar agregar 200 pl de muestra a una cuveta y
800 d de sol 1 y determinar la concentración en el espectrofotómetro en base a
60
Østa Observar que los valores se encuentren en el intervalo de la curva std En
caso de que no sea así diluir la muestra con agua destilada hasta que se ajusten
Los datos son expresados en mg ml
6 MaJondialdehído MOA y 4 hidroxi 2 E nonenal 4 HNE
Estos compuestos son algunos de los productos derivados de la peroxidación de
Æcidos grasas poliinsaturados y Østeres La cuantificación de estos aldehídos
provee un índice confiable de lipoperoxidación Se utiliza un Kit de CALBIOCHEM
Cal No 437634 llamado Lipid peroxidation Assay Kit Este ensayo utiliza un
compuesto cromogØnico sol 1 que reacciona con el MOA y 4 HNE a 450C La
condensación de una molØcula de MOA o 4 HNE con 2 molØculas de la sol 1 crea
un cromóforo con absorbancia mÆxima a 586 nm Previamente al ensayo se crea
una curva standard con las soluciones de MOA y 4 HNE proporcionadas por el kit
Soluciones
1 10 3 mM N metil 2 fenílindol en acetonitrilo proporcionada por el kit preparar
en fresco 3 1 con metanol esto es estable por 2 días a 4 oC
2 154 M de Æcido metanosulfónico proporcionada por el kit
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Ensayo
En un tubo de ensaye aæadir 650 d de sol 1 a 200 t1 de muestra y mezclar con
vOliex por 3 4 segundos
æadir 150 d de sol 2 agitar y sellar el tubo e incubar a 450C por 40 minutos en
baæo maría
1 concluir el tiempo enfriar los tubos en hielo y vaciarlos en cuvetas de 1 mi y
medir ia absorbancia en el espectrofotómetro a 586 nm En caso de que la
solui6n sea opticamente densa centrifugar previamente a la lectura en el
espectro1otÓme ira
Los rfsL lØ C S obtenidos se encuentran expresados en pg de MeA o 4 HNE por
miUitro de IT cestra Ll i mlì Previa curva estanclar definidaI
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