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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
TESIS
EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE PULMONAR POR LA
VACUNACIÓN VÍA AEROSOL DE DNA CONTRA WT1 EN UN MODELO DE CÁNCER MURINO
POR
M.C. ANA KARINA CHÁVEZ ESCAMILLA
COMO REQUISITO PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS CON ORIENTACIÓN EN INMUNOBIOLOGÍA
MAYO, 2017
EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE PULMONAR POR LA
VACUNACIÓN VÍA AEROSOL DE DNA CONTRA WT1 EN UN MODELO
DE CANCER MURINO
COMITÉ DE TESIS
_____________________________
DIRECTOR DE TESIS Dr. Pablo Zapata Benavides
___________________________
SECRETARIO Dr. Moisés Franco Molina
____________________________
VOCAL Dra. Cristina Rodríguez Padilla
____________________________
VOCAL Dr. Juan Manuel Alcocer
_____________________________
VOCAL Dr. Edgar Mendoza Gamboa
SAN NICOLÁS DE LOS GARZA, MAYO DE 2017
i
El presente trabajo fue realizado en el laboratorio de Inmunología y Virología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Autónoma de Nuevo León
ii
AGRADECIMIENTOS
Amimarido,mimentor, amigo, cómplice, compañerode aventuras, Santiago Saavedra, gracias
porsembrarenmieseamorporlacienciayeltrabajo,graciasporestarconmigoenlosbuenosy
enlosmalosmomentos,yporenseñarmeasertercaypersistenteenlasmetasquemeplanteo,
sintuapoyo,cariñoypaciencia(sobretodoestaúltimajaja)jamáslohubieralogrado,graciaspor
verlomejordemí,teamo.
AlaDra.CristinaRodríguezPadilla,aquienreconozcosuliderazgo,visiónypasiónporlaciencia,y
que a pesar de saber que estaba pasando por momentos difíciles en la salud de Sarita en su
momento, me dio la oportunidad y la confianza de ingresar al posgrado de Inmunología en el
laboratorio,muchasgraciasDoctora.
Al Dr. Pablo Zapata Benavides, por darme la oportunidad de entrar a su laboratorio desde el
servicio social en la licenciatura y motivarme a cumplir mis metas personales de licenciatura,
maestría y doctorado bajo su asesoría y dirección de tesis. Gracias por no quitar el dedo del
renglón,pormotivarmea sumanerayapoyarmeen losmomentosquemásnecesitaba,gracias
portantasenseñanzasacadémicasypersonalesquehadejadoenmí,graciasporsuamistad.
AmisprofesoreslosDrs.EdgarMendoza,MoisésFrancoyLauraTrejoquesiemprehanestadoal
pendienteyapoyandoaunaservidoracuandohasolicitadosuayuda,graciasporsuamistad.
Amisamigosyhermanosdel LIV:Karlita,Ash, Fer, Liz, Evy,Dany,Edgar, Felipe,Cyn,Beto, Itza,
Caro, el otro Dany, Ramiro, Erikita, Yarys, Amaro, Mario, Mayra, Bertha, Anita, Laura, Perita,
Maricela,uuufff,todostodostoooodos,losquedealgunauotraformahancompartidoconmigo
sutiempo,consejos,enseñanzas,tips,reactivos,kits,alegrías,tristezasyenojos…Graciasamigos,
paramísoncomomifamilia,¡sinustedesnolohubieralogrado!
AlLaboratoriodeInmunologíayVirologíade laFacultaddeCienciasbiológicasde laUniversidad
AutónomadeNuevoLeón,porproveerelapoyofinancieroylainfraestructurarequeridosparala
realizacióndeesteproyecto.
ACONACyTyaque,graciasasuapoyoeconómico,meayudóahacerposibleunametamásenmi
vidaprofesionaldeposgrado.
iii
DEDICATORIA
Atiluzdeluniverso
ASara,
AKenya,
ASantiago
Losamoconinfinitalocura…
iv
ÍNDICE GENERAL
Contenido Página
Contraportada
Comité de tesis
Área de trabajo i Agradecimientos ii Dedicatoria iii Índice general iv Índice de tablas vi Índice de figuras vii Lista de símbolos y abreviaturas
x
Resumen xii Abstract xiii 1. Introducción 1 2. Antecedentes 2.1. Cáncer 3 2.2. Etiología del cáncer 3 2.3. Etapas del cáncer 3 2.4. Terapias contra el cáncer 5 2.5. Inmunoterapia 6 2.6. Inmunoterapia contra el cáncer 6 2.7. Vacunas de DNA 8 2.8. Aplicación de terapia génica 9 2.9. Gen WT1 11 2.10. Gen WT1 en cáncer 14 2.11. Terapia inmunológica contra WT1 16 3. Justificación 18 4. Objetivo general 4.1. Objetivos particulares 19 5. Hipótesis 21 6. Diseño experimental
22
7. Metodología 7.1. Diseño y construcción de una
vacuna de DNA contra WT1 23
7.2. Transformación de bacterias calcio competentes con la vacuna DNA-WT1
24
7.3. Caracterización de la vacuna por enzimas de restricción
24
7.4. Electroforesis en gel de agarosa 24 7.5. Producción a gran escala de 25
v
vacuna de DNA-WT1 7.6. Cultivo celular 26 7.7. Transfección de la línea celular
B16F10 con los plásmidos WT1 y pcDNA3.1(+) en placa de 96 y 6 pozos
26
7.8. Ensayo de viabilidad celular mediante MTT
27
7.9. Animales 27
7.10. Establecimiento del modelo de cáncer murino
27
7.11. Vacunación con DNA contra WT1 por un sistema de aerosol por exposición de nariz.
28
7.12. Evaluación de la carga tumoral 28 7.13. Sangrado y obtención de suero de
ratones inmunizados 29
7.14. Análisis de la respuesta inmune activada por vacunación
29
7.15. Especificidad antigénica de la inmunización vía aerosol con DNA-WT1 in vitro
29
7.16. Extracción de proteínas y western blot
31
7.17. Inmunohistoquímica de WT1 en tejido Pulmonar murino nebulizado
7.18. Análisis de citocinas Th1/Th2/Th17 en suero de ratones nebulizados con la vacuna DNA-WT1.
32 32
8. Resultados 8.1 Caracterización y expresión de la
vacuna de DNA-WT1 in vitro 33
8.2 Secuenciación del inserto de la vacuna DNA-WT1
33
8.3 Análisis de la expresión de la vacuna DNA-WT1 in vitro
36
8.4 Expresión de la vacuna DNA-WT1 administrada vía aerosol en pulmones de ratones C57BL/6
37
8.5 Análisis de la respuesta inmune tras la nebulización de la vacuna DNA-WT1
39
vi
8.6 Evaluación de la actividad
profiláctica de la vacuna DNA-WT1modelo subcutáneo de cáncer
42
8.7 Evaluación de la actividad terapéutica de la vacuna DNA-WT1modelo subcutáneo de cáncer
8.8 Evaluación de la actividad terapéutica de la vacuna DNA-WT1 en modelo de cáncer pulmonar murino
8.9 Análisis del perfil de citocinas Th1/Th2/Th17 en suero de ratones, tras la administración en aerosol de la vacuna de WT1
46 48 50
9. Discusión 51 10. Conclusiones 56 11. Bibliografía 59 12. Autobiografía 65
vii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla Página
Tabla 1 Métodos de aplicación de terapia génica. 9
Tabla 2 Genes blanco de regulación por WT1. 13
Tabla 3. Concentración de citocinas en suero de ratones inmunizados
contra WT1 por vía pulmonar.
50
viii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Página
Figura 1 Activación del sistema inmune por medio de una vacuna de DNA. 10
Figura 2 El gen wt1 y sus isoformas 12
Figura 3 Ranking de antígenos asociados a tumor del proyecto del National
Cancer Institute 2009.
Figura 4 Mapa del plásmido pcDNA 3.1 (+)
15
23
Figura 5. Caracterización de la vacuna DNA-WT1 con enzimas de restricción. 33
Figura 6 Secuencia nucleotídica obtenida tras el análisis de secuenciación
Sanger 34
Figura 7 Análisis de alineamiento de la secuencia peptídica de la vacuna
DNA-WT1 35
Figura 8 Secuencia amino acídica codificada por la vacuna DNA-WT1 35
Figura 9 Expresión de la vacuna DNA-WT1 en la línea celular B16F10 36
Firgura 10 Sistema de nebulización de la vacuna DNA-WT1por exposición de
nariz. 37
Figura 11 Distribución de la vacuna DNA-WT1 en los cuadrantes de pulmones
de ratones nebulizados. 38
ix
Figura 12 Inmunohistoquímica de tejido pulmonar murino nebulizado con la
vacuna DNA-WT1. 39
Figura 13. Actividad citotóxica ex vivo mediada por esplenocitos en contra de
células B16F10. 40
Figura 14. Producción de IFN gamma por esplenocitos co cultivados con
células B16F10 41
Figura 15. Análisis de la producción de anticuerpos específicos para WT1 en
sueros de ratones inmunizados vía aerosol con vacuna DNA-WT1 42
Figura 16 Esquema de inmunización vía aerosol de la vacuna DNA-WT1
evaluando la actividad profiláctica. 43
Figura 17 Cinética de peso en ratones nebulizados con vacuna DNA-WT1
evaluando la actividad profiláctica. 43
Figura 18 Cinética de crecimiento de tamaño tumoral en el modelo de
vacunación profiláctica con vacuna DNA-WT1 45
Firgura 19 Gráfico de supervivencia de ratones C57BL/6 inmunizados vía
aerosol con vacuna DNA-WT1 en el modelo profiláctico.
Figura 20 Cinética de peso en ratones nebulizados con la vacuna DNA-WT1
evaluando la actividad teraéutica.
Figura 21 Cinética de crecimiento tumoral en ratones nebulizados con la vacuna
DNA-WT1
Figura 22 Gráfico de supervivencia de ratones C57BL/6 inmunizados vía
aerosol con vacuna DNA-WT1 en el modelo terapéutico.
Figura 23 Fotografías representativas de los pulmones de los grupos de ratones
nebulizados con los diferentes tratamientos.
46
47
47
48
49
x
LISTA DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS
Ac. Anticuerpo
BCG Bacilo Calmette-Guerin
bFGF Factor de crecimiento de fibroblastos básico
°C Grados Celsius
Caspasa Cisteína-aspartato-proteasa
CO2 Dióxido de carbono
CC50 Concentración citotóxica media.
ELISA Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima
G Gramo
H2O Agua
IL-2 Interleucina-2
IL-8 Interleucina-8
INFα2b Interferón alfa 2b
kDa Kilodalton
Mg Miligramo
µg Microgramo
min Minuto
mL Mililitro
µL Microlitro
mM Milimolar
MTT Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol
NaCl Cloruro de sodio
Ng Nanogramo
Nm Nanómetro
O2 Oxígeno
PARP Poli (ADP-ribosa) polimerasa
PBS Amortiguador fosfato salino
xi
PCR Reacción en cadena de polimerasa
Pg Picogramo
pH Potencial de hidrógeno
Rpm Revoluciones por minuto
SDS Dodecil sulfato de sodio
TBS Amortiguador tris salino
V Volumen
xii
RESUMEN
En la actualidad las terapias que se ofrecen a pacientes con cáncer incluyen la cirugía,
quimioterapia y radioterapia o combinaciones de éstas. Sin embargo, la quimioterapia y la
radioterapia son muy agresivas y poco específicas al blanco tumoral. Hoy en día, se plantea
la posibilidad de desarrollar terapias específicas para generar inmunidad contra antígenos
del tumor, y una de las vías, es utilizando vacunas de DNA que nos permitan una eficaz
respuesta antitumoral. El gen WT1 ha demostrado ser un buen blanco terapéutico contra el
cáncer, incluso ya existen algunas vacunas contra este blanco tumoral en fase clínica para
tratar malignidades hematopoyéticas y tumores sólidos. Actualmente la nebulización de
medicamentos y otras moléculas vía aerosol ha mostrado ser una alternativa para la entrega
directa de terapias en contra de diversas enfermedades. En este trabajo se llevó a cabo el
diseño de una vacuna de DNA contra WT1 basada en administración vía aerosol para
evaluar su efecto anti tumoral en un modelo de cáncer murino. La inmunización vía aerosol
en ratones sanos mostró una distribución homogénea en el tejido pulmonar, así como una
expresión en un periodo de tiempo de hasta 15 días. Células de bazo de ratones
inmunizados con la vacuna DNA-WT1 mostraron una reactividad específica en contra de la
línea celular de melanoma murino B16F10 en un ensayo ex vivo, obteniendo altos títulos de
IFN en los sobrenadantes. Los sueros de ratones tratados con la vacuna mostraron presencia
de anticuerpos específicos contra WT1 en comparación con los sueros de ratones sin
inmunizar, sugieriendo que la vía de inmunización via aerosol en combinación con la
aplicación de una vacuna DNA pueden tener un efecto sistémico en la generación de una
respuesta inmune antígeno específica. Sin embargo, al llevar a cabo el modelo de cáncer in vivo, utilizando la misma línea celular B16F10, la cual sobre expresa WT1, no se
observaron diferencias significativas en las cinéticas de crecimiento tumoral y
supervivencia de los grupos tratados con la vacuna DNA-WT1 con los ratones tratados con
el vector y sin tratamiento. Ha sido reportado que la línea celular B16F10 presenta
resistencia a diferentes tipos de terapias anti tumorales, incluidas las terapias
inmunológicas, se plantea que es debido a una baja en la expresión de moléculas del MHC
sumado a modificaciones en el patrón de expresión de moléculas como las TAP,
señalándola como pobremente inmunogénica e inadecuada para su uso como modelo de
cáncer en terapias inmunológicas de tipo celular. Con los resultados obtenidos, concluimos
que el uso de una vacuna de DNA contra WT1 administrada vía aerosol, promete ser una
alternativa terapéutica efectiva contra el desarrollo del cáncer, debido a que puede fomentar
una respuesta inmune a nivel sistémico.
xiii
ABSTRACT
Currently, the therapies offered to patients with cancer include surgery, chemotherapy and
radiation therapy or combinations thereof. However, chemotherapy and radiotherapy are
very aggressive and not very specific to the tumor target. Today, the possibility of
developing specific therapies to generate immunity against tumor antigens is proposed, and
one of the pathways is using DNA vaccines that allow us an effective antitumor response.
The WT1 gene has proven to be a good therapeutic target against cancer, and there are
already some vaccines against this tumor target in the clinical phase to treat hematopoietic
malignancies and solid tumors. Nowadays, nebulization of drugs and other molecules via
aerosol has been shown to be an alternative for direct delivery of therapies against various
diseases. In this work, the design of an aerosol-based DNA vaccine against WT1 was
carried out to evaluate its anti-tumor effect in a murine cancer model. Aerosol
immunization in healthy mice showed a homogenous distribution in lung tissue as well as
expression over a period of up to 15 days. Spleen cells from immunized mice with the
DNA-WT1 vaccine showed specific reactivity against the B16F10 murine melanoma cell
line in an ex vivo assay, obtaining high titers of IFN in the supernatants. Sera from mice
treated with the vaccine showed the presence of specific antibodies against WT1 as
compared to sera from unimmunized mice, suggesting that the route of immunization via
aerosol in combination with the application of a DNA vaccine may have a systemic effect
on the generation of a specific antigen-specific immune response. However, in carrying out
the cancer model in vivo, using the same B16F10 cell line, with WT1 overxpression, no
significant differences were observed in tumor kinetics and survival of the groups treated
with the DNA-WT1 vaccine with the mice treated with the vector and without treatment. It
has been reported that the B16F10 cell line exhibits resistance to different types of anti-
tumor therapies, including immunological therapies, which is thought to be due to a low
expression of MHC molecules coupled with modifications in the expression pattern of
molecules such as TAP, indicating it to be poorly immunogenic and unsuitable for use as a
cancer model in cellular type immunological therapies. With the results obtained, we
concluded that the use of a DNA vaccine against WT1 administered via aerosol, promises
to be an effective therapeutic alternative against the development of cancer, because it can
promote a systemic immune response.
1
1. INTRODUCCIÓN
El cáncer se define como un conjunto de enfermedades cuya característica común
es el crecimiento descontrolado y la diseminación de células anormales en un
organismo. Es causado tanto por factores externos (tabaco, organismos
infecciosos, nutrición deficiente, agentes químicos, radiación, etc.), como por
factores internos (mutaciones heredables, factores hormonales, condiciones
inmunológicas y mutaciones que ocurren en el metabolismo).
En la actualidad existe una diversidad de terapias que se ofrecen a los pacientes
con cáncer, donde los tres pilares fundamentales incluyen la cirugía,
quimioterapia y radioterapia. Sin embargo, estas alternativas son muy agresivas
y poco específicas al blanco tumoral, teniendo una gran variedad de efectos
secundarios nocivos en los que se incluyen la destrucción de células no
cancerosas, deterioro del sistema inmunitario y una muy mala calidad de vida del
paciente. En los últimos años se han buscado terapias alternativas específicas
contra el tumor y que sean menos dañinas al organismo del paciente, generando
un especial interés a la aplicación de terapia génica e inmunoterapia.
Dentro la inmunoterapia contra el cáncer hay trabajos donde se describe una
diversidad de antígenos asociados a tumor (TAA) de distinto origen, incluyendo
cáncer cérvico uterino, leucemias, cáncer de pulmón, cáncer de próstata y cáncer
de mama, donde se observa que se puede llegar a generar una buena respuesta
antígeno específica mediante la generación de anticuerpos efectores del mismo
paciente.
El gen WT1 (gen del Tumor de Wilms) ha sido un blanco importante en el estudio
del cáncer ya que se encuentra sobre expresado en una gran variedad de
neoplasias tanto hematopoyéticas como tumores sólidos. Algunos grupos de
investigación ya lo identifican como un TAA, proponiéndolo como un blanco
terapéutico para la erradicación de la enfermedad.
Hay estudios en fase clínica que utilizan vacunación contra WT1, esto mediante
la utilización de péptidos sintéticos de 9 mers por inoculación intradérmica e
intramuscular, donde se han tenido buenos resultados en cuanto a la disminución
2
del tamaño del tumor, e incluso remisión completa de la enfermedad. Sin
embargo, esta vacunación es exclusiva a un solo tipo de HLA y únicamente los
pacientes que lo expresen son candidatos a su aplicación, sumado a esto se
reporta que hay reacciones adversas en el área de la vacunación tales como
eritema, hinchazón y dolor.
En un trabajo previo se probó el sistema de deliberación vía aerosol de un RNAi
contra WT1 en un modelo de cáncer pulmonar murino, obteniendo una
disminución drástica de la masa tumoral sin mostrar efectos adversos en el tejido
sano, además de emplear dosis bastante bajas de ácido nucleico.
En este trabajo se plantea que la generación de una vacuna de DNA contra WT1
que nos permita generar un péptido antigénico para distintos HLA y que esta
vacuna sea inoculada vía aerosol a dosis bajas, tendrá un efecto antitumoral
profiláctico y terapéutico, además de nulificar los efectos adversos de las
vacunas actuales. Proponemos generar así un producto biotecnológico innovador
y altamente eficiente, de fácil producción, bajos costos y con una amplia gama
de aplicación en el mercado.
3
2. ANTECEDENTES
2.1 Cáncer
El cáncer es un conjunto de enfermedades cuya característica en común es el
crecimiento descontrolado de células anormales y diseminación a otros tejidos
usando la vía linfática o sanguínea. Actualmente es considerado como una
enfermedad moderna emergente ya que representa un problema de salud pública
que ha ido en aumento de una manera alarmante en los últimos 100 años.
Tan sólo en el año 2008 se reportaron 12 millones de nuevos casos de cáncer a
nivel global con una mortalidad superior a los 7 millones de personas y se
pronostica que para el año 2030 existan 27 millones de nuevos casos, sumados a
17 millones de muertes (World Cancer Report, 2008).
2.2 Etiología del cáncer
El cáncer no posee un único origen, estudios hechos en los últimos 60 años
determinan la etiología del cáncer como multifactorial, es decir, es necesaria una
combinación tanto de factores biológicos intrínsecos del organismo, como
factores del medio ambiente y estilo de vida en el que se desarrolla.
Los agentes causales de la enfermedad se podrían agrupar en factores externos
como: tabaquismo, organismos infecciosos, nutrición inadecuada, exposición a
agentes químicos, radiación; factores internos como: mutaciones heredables,
factores hormonales, condiciones inmunológicas entre otras (National Cancer
Institute, 2008).
2.3 Etapas del cáncer
De acuerdo a su grado de invasión los carcinomas se clasifican en:
a) carcinoma in situ.- se define como un estadio del cáncer que se encuentra en
forma localizada sin representar un estadio invasor; normalmente asociado a
etapas tempranas de la enfermedad.
b) carcinoma invasivo.- tipo de estadio del cáncer encontrado en etapas
avanzadas de la enfermedad que se caracteriza por crecer en todas direcciones,
4
por lo que las células tumorales se pueden infiltrar y fijarse en otros órganos,
diseminando la enfermedad a otras partes del cuerpo.
La estadificación describe la extensión o gravedad del cáncer que aqueja a un
individuo en base al tamaño del tumor original (tumor primario) y a la extensión
o diseminación en el cuerpo. Esta clasificación por etapas es muy importante ya
que le permiten al médico planear asertivamente el tratamiento al paciente,
además que funciona para estimar el pronóstico de la enfermedad.
Uno de los métodos de estadificación de neoplasias frecuentemente usado es el
TNM, desarrollado por el Comité Americano Conjunto contra el Cáncer (AJCC
por sus siglas en inglés) junto con la Unión Internacional contra el Cáncer (UICC)
en 1977, es el sistema más utilizado actualmente para la clasificación y
pronóstico de las neoplasias, y se basa en la medición del Tamaño del tumor
(letra T seguida por un número que va del 0- IV), a la cuantificación de Nódulos
linfáticos locales al tumor primario que se encuentran con células malignas (letra
N seguida por un número del 0- 3) y a la Metástasis que expresa si el cáncer se
ha extendido a otros órganos distantes (letra M seguida por un número 0 ó 1).
La metástasis es el aspecto más mortífero del cáncer y consiste en la capacidad
de propagación de un foco tumoral a un órgano o tejido distinto al de origen. La
infiltración y movilidad de estas células tumorales generalmente ocurre por la vía
sanguínea o linfática. El 98% de las muertes por cánceres no detectados son
debidas a la metástasis.
La capacidad que tienen las células tumorales de infiltrar o penetrar en los tejidos
normales y en los vasos sanguíneos no es debida sólo a la presión del crecimiento
tumoral, sino a características fenotípicas que adquieren las células cancerosas.
Estudios realizados en las últimas décadas proponen 4 principios para explicar la
capacidad de infiltración y diseminación de las células cancerosas, estos son:
adherencia celular que es el anclaje de la célula tumoral por medio de la
adquisición de receptores específicos a la membrana basal y a la matriz
extracelular; proteólisis, refiriéndose a la destrucción de la membrana basal y de
la matriz celular mediante la secreción de enzimas, como las colagenasas, que
5
destruyen el colágeno, y así poder abrirse camino entre estas estructuras; a la
movilidad definida como la migración o locomoción de las células malignas a
través de la matriz celular para llegar a un vaso sanguíneo o linfático,
intravasarse, ser transportadas por la corriente sanguínea hasta lechos capilares
distantes, extravasarse, y migrar una cierta distancia para iniciar la formación de
una nueva colonia y a la angiogénesis o neovascularización, que se refiere a la
capacidad de formación de vasos sanguíneos nuevos a partir de vasos sanguíneos
preexistentes por medio de la secreción de factores de crecimiento (National
Cancer Institute, 2008).
2.4.Terapias contra el cáncer
Actualmente las terapias que se ofrecen a los pacientes con cáncer se
fundamentan en tres pilares: cirugía, quimioterapia y radioterapia. Donde la
primera incluye la remoción quirúrgica de la masa tumoral, inclusive según su
diseminación se remueven también los ganglios linfáticos circundantes para
eliminar riesgo de metástasis; la quimioterapia se basa en la utilización de agentes
químicos, esencialmente análogos de nucleótidos, que frenan el ciclo celular; y
la radioterapia utiliza la exposición a rayos ionizantes que tienen un efecto
citotoxico en la célula tumoral.
La cirugía es el método más empleado en contra del cáncer, generalmente es la
primera opción de terapia en una gran diversidad de neoplasias y seguido de esta
se complementa con la quimioterapia o la radioterapia según el origen y la
severidad de la enfermedad.
Ya es conocido que estas tres opciones de tratamiento antitumoral tienen efectos
secundarios bastante nocivos para el paciente, ya que no son específicos y dañan
a células sanas del organismo, deteriorando gravemente el sistema inmunológico,
generando daños en órganos, en general, el paciente tiene una mala calidad de
vida.
En la última década se empezaron a desarrollar terapias alternativas altamente
específicas para la remisión del cáncer, la generación de la terapia génica e
inmunoterapia abrieron una nueva perspectiva sobre el tratamiento de la
6
enfermedad con una disminución drástica de los efectos secundarios además de
una alta eficiencia en la erradicación de la patología.
2.5.Inmunoterapia
En la medicina tradicional la inmunoterapia se refiere al conjunto de estrategias
de tratamiento para estimular o reponer el sistema inmunitario frente al cáncer,
infecciones u otras enfermedades así como aminorar los efectos secundarios de
tratamientos muy agresivos usados contra los tumores (National Institute of
Health, 2013).
La forma en que puede funcionar la inmunoterapia incluye la profilaxis,
previniendo la enfermedad, o la terapéutica, siendo un tratamiento curativo o de
estabilización de la enfermedad.
Algunos ejemplos de tratamientos biológicos son los anticuerpos monoclonales,
las vacunas y los denominados factores de crecimiento.
2.6. Inmunoterapia contra el cáncer
En la inmunoterapia contra el cáncer se intenta estimular el sistema inmune para
rechazar y destruir tumores. El primer caso de inmunoterapia en cáncer fue en
1890, cuando con la inyección de Streptococcus pyogenes en un tumor se inducía
su regresión. Sin embargo, no se habló de inmunoterapia contra el cáncer hasta
casi 100 años después, cuando Rosenberg publicó un artículo en el que se
informaba de una baja tasa de remisión del tumor en 1205 pacientes con cáncer
que fueron sometidos a diferentes tipos de inmunoterapia (Rosenberg, 1984).
Hasta el día de hoy existen dos grandes ramas de inmunoterapia contra el cáncer,
donde la fase efectora de cada una involucra una vía biológica distinta, pero con
el mismo efecto antitumoral (Overes, 2009). Estas dos grandes ramas son:
• Inmunoterapia basada en células dendríticas
• Inmunoterapia de transferencia adoptiva de células T
7
Para ambos tipos de inmunoterapia es necesaria la utilización de antígenos
asociados a tumor (TAA), los cuales son secuencias peptídicas altamente
inmunogénicas y específicas de células neoplásicas.
La inmunoterapia basada en células dendríticas utiliza éstas células para activar
una respuesta citotóxica hacia un antígeno. La manera de funcionar de ésta
terapia es la siguiente: Las células dendríticas (célula presentadora de antígeno)
son creadas por organismo del paciente. Estas células son activadas con un
antígeno (TAA) o transfectadas con un vector viral. Las células dendríticas
activadas son entonces puestas de nuevo en el paciente y presentan los antígenos
a los linfocitos efectores (células T CD4+, células T CD8+, en células dendríticas
especializadas y también en células B). Esto inicia una respuesta citotóxica que
ocurre contra estos antígenos y cualquier cosa que pueda presentar estos
antígenos.
Los antígenos tumorales son presentados a las células dendríticas que causan que
el sistema inmunitario tenga como objetivo estos antígenos, que a menudo están
expresados en células cancerosas (Rotrosen, 2002). La vacuna Provenge es un
ejemplo de este tipo de terapia, actualmente está en fase clínica III y es utilizada
específicamente contra cáncer de próstata mostrando buenos resultados.
La inmunoterapia basada en células T usa las respuestas citotóxicas para atacar
al cáncer. En resumen, las células T que tienen una reactividad natural o
manipulada genéticamente al cáncer de los pacientes son expandidas in vitro y
entonces transferidas adoptivamente en un paciente con cáncer. Las células T con
una reactividad que ocurre de manera natural hacia el cáncer de los pacientes
pueden encontrarse infiltradas en los propios tumores del paciente. El tumor es
creado, y estos linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) son expandidos in vitro
usando altas concentraciones de interleucina-2 (IL-2), anti-CD3 y alimentadores
alorreactivos. Estas células son entonces transferidas de nuevo al paciente junto
con administración exógena de IL-2. Hasta este momento, ha sido observada una
tasa de respuesta objetiva del 51%; en algunos pacientes, los tumores se encogen
a tamaños no detectables. En el caso de las células T manipuladas, los receptores
8
de células T (TCR) que han sido identificados por tener reactividad contra los
antígenos asociados a los tumores, son clonados en un virus incompetente para
la replicación que es capaz de la integración genómica. Los linfocitos propios de
un pacientes son expuestos a estos virus y entonces expandidos no
específicamente o estimulados usando los TCR manipulados. Y finalmente, las
células son transferidas de nuevo en el paciente. Esta terapia ha sido aplicada con
éxito s en pacientes con cáncer refractario en fase IV. La rama de cirugía del
National Cancer Institute está investigando activamente esta forma de
tratamiento del cáncer para pacientes que padecen melanomas agresivos
(Rotrosen, 2002).
La terapia génica es la herramienta más comúnmente utilizada para la activación
de células dendríticas y células T para que tengan una actividad específica contra
un antígeno tumoral determinado. Generalmente la transfección con DNA, virus
recombinantes o péptidos sintéticos son las metodologías más exploradas.
2.7. Vacunas de DNA
Este tipo de terapia génica es de desarrollo reciente, consiste en la inyección
directa de DNA a través de un plásmido o un vector de expresión. Este DNA
codifica una proteína antigénica de interés, que inducirá la activación del sistema
inmune. De esta forma se puede inducir tanto anticuerpos neutralizantes
(respuesta humoral) como inmunidad medida por linfocitos T citotóxicos
(respuesta celular) (Figura 1).
Para generar una vacuna de DNA se inserta la secuencia nucleotídica que codifica
para el antígeno esperado, ya sea de bacterias, virus o células tumorales, dentro
de células humanas o animales. Algunas células del sistema inmunitario van
reconocer la proteína surgida del DNA extraño y atacan tanto a la propia proteína
como a las células que la expresen. Si la respuesta generada contra el antígeno es
efectiva, se podrán generar anticuerpos de memoria que combatirán la
enfermedad en dado caso que se volviese a presentar en el individuo.
9
Las ventajas que proporcionan el uso de vacunas de DNA son la fácil producción
y almacenaje, la expresión endógena del antígeno es semejante a la infección
natural, además de que se produce una estimulación antigénica continua, esto es,
permite una inmunidad duradera en el individuo.
2.8.Aplicación de la terapia génica
Se han desarrollado diversos protocolos de deliberación de acido nucleico en
células animales (Tabla I). Las dos metodologías más populares son la inyección
de DNA en solución salina usando una jeringa convencional y la pistola génica
(Weiner, DB., 1999).
Método de deliberación Formulación DNA Aplicación Cantidad de DNA
Parenteral
Inyección
Solución salina Intramuscular,
Intradermica,
Intraperitoneal,
Subcutanea
Grandes cantidades (100-
200ug)
Pistola
génica
DNA con partículas de oro Epidermal, vaginal, tejido
expuesto quirúrgicamente
Cantidades pequeñas
(16ng)
Inyección
Neumática
Solución acuosa Epidermal Alta (hasta 300ug)
Aplicación tópica Solución acuosa Ocular, intravaginal Cantidades pequeñas
(hasta 100ug)
Mediada por Citofectina
Liposomas, microesferas,
adenovirus recombinantes,
lípidos catiónicos aerosolizados
Intramuscular,
Intravenosa,
Intraperitoneal, Oral,
Nasal/Pulmonar
Variable
Tabla I. Métodos de aplicación de terapia génica.
La principal desventaja de la aplicación intramuscular, intradérmica, subcutánea
es la baja respuesta inmune generada, es necesaria la utilización de grandes dosis
para tener una respuesta mejor, mientras que la pistola de genes requiere
forzosamente el uso de partículas de oro inerte.
La deliberación génica por medio de liposomas, adenovirus y aerosoles ha
mostrado mejores resultados ya que genera una respuesta inmune potenciada
específica del antígeno, el espectro de tejidos que pueden llegar a ser
10
transfectados es más amplio, además de que podría ser menos invasivo (Lewis,
1999).
El mecanismo de acción de una vacuna de DNA se basa en la respuesta
inmunitaria hacia una molécula de naturaleza extraña, se reconoce al ácido
nucleico y su producto peptídica como ajeno y se activan diversas vías de
señalización celular que culminan en la activación de linfocitos T citotóxicos
antígeno- específicos y la producción de anticuerpos de memoria (Figura 1).
Figura 1. Activación del sistema inmune por medio de una vacuna de DNA.
Imagen tomada de Nature Reviews, 2013.
El éxito de una vacunación con DNA radica en la generación de una amplia
respuesta tanto celular como humoral contra el antígeno problema.
Existen ya en estudios de fase clínica y en mercado una variedad de vacunas
recombinates desarrolladas para combatir distintos tipos de neoplasias podemos
citar Stimuvax para cáncer de mama, CimaVax-EGF para cáncer de pulmón,
11
CVAC en cáncer de ovario, Onncophage para cáncer de riñón, entre otros
(Giarelli, 2007).
2.9.Gen WT1
El gen WT1 codifica para un factor de transcripción involucrado en proliferación,
diferenciación celular y apoptosis (Menke et al., 1998). Se encuentra localizado
en el cromosoma 11p13 y codifica para un RNA mensajero de 3 kb formado por
10 exones (Call et al., 1990).
El dominio N-terminal de WT1 está compuesto de secuencias ricas en prolina-
glutamina y está involucrado en interacciones RNA y proteínas, este dominio es
crítico para la función de regulación transcripcional ya que contiene dominios de
represión y activación. El dominio C-terminal está formado por 4 dedos de zinc
tipo Krüpple, que representan su dominio de unión al DNA pero también está
involucrado en interacciones RNA y proteínas (Menke et al., 1998).
La primera función asignada a WT1 fue como regulador de la transcripción
debido a la presencia de los dedos de zinc en el extremo C-terminal (Roberts,
2005).
Se han descrito alrededor de 24 isoformas de WT1 resultado de los procesos de
splicing y/o edición del RNA e inicio de traducción diferencial (Figura 2).
Otras isoformas alternativas se derivan del uso del codón de inicio CTG que se
encuentra río arriba del codón de inicio ATG interno localizado al final del exón
1 y un residuo en el exón 6 para la edición del RNA.
12
Figura 2. El gen WT1 y sus isoformas
Los splicing del RNAm de wt1 son dos: uno en el exón 5 donde se insertan o no
17 aminoácidos (51 pb) y otro donde se da o no la inserción de tres aminoácidos
KTS (lisina-treonina-serina) entre los dedos de zinc 3 y 4. Bajo condiciones
fisiológicas normales, la expresión de KTS+/ KTS- se mantiene
aproximadamente 2:1 (Hohenstein y Hastie, 2006). En general la isoforma KTS
+ está asociada con procesos de maduración del RNAm, mientras que la isoforma
KTS – está asociada al proceso de transcripción.
Otras isoformas alternativas se derivan del uso del codón de inicio CTG que se
encuentra río arriba del codón de inicio ATG interno localizado al final del exón
1 y un residuo en el exón 6 para la edición del RNA.
Existe un largo listado de genes que son blanco de la activación / represión por
parte de WT1, destacando los involucrados en el crecimiento y metabolismo
celular, como son componentes de matriz extracelular, factores de crecimiento y
factores de transcripción, incluyéndose el mismo gen wt1 (Tabla II).
13
Función represora Función activadora
EGFR
IGF-II
IGFR
c-myc, n- myc
PDGF
TGF
RAR
CSF
Bcl-2
EGR1
WT1
MIS
SRY
Dax-1
E-cadherina
P21
Amphiregulina
Bcl-2
Ciclina- E
ETS-1
WT1
Tabla 2. Genes blancos de regulación por WT1.
Hay resultados paradójicos en el papel exacto de wt1 en la transcripción ya que
parece que puede ser tanto activador como represor transcripcional dependiendo
del contexto celular y experimental. El hecho de que WT1 pueda ser activador o
represor puede ser influenciado por los niveles de expresión de WT1, las
isoformas de WT1 que se estén expresando (principalmente KTS+ ó KTS-), la
localización del sitio de inicio de la transcripción en relación con el sitio de unión
a DNA y el tipo celular en el que se realice el experimento (Reddy et al., 1995;
Wang et al., 1995; Laity et al., 2000).
Se ha demostrado que la expresión exógena de WT1 en las líneas celulares de
cáncer de mama MDA-MB-468 y MCF-7 y en la línea leucémica K562 puede
activar el promotor de c-myc y estimular la proliferación celular (Han et al.,
2004). En contraste, en la línea HeLa sea mostrado una represión del promotor
14
de c-myc por WT1 (Hewitt SM et al., 1995). Otro ejemplo relevante es el del gen
antiapoptótico Bcl-2, en células HeLa y DHL-4 una co-transfección transiente de
WT1 con el promotor de Bcl-2 ligado a un gen reportero resulta en una represión
significativa del promotor de Bcl-2 (Heckman, 1997), mientras que en la línea
celular G401 conlleva a un incremento endógeno de la proteína Bcl-2 (Mayo,
1999).
Genes como la anfirregulina (Lee, 1999), sprouty1 (Gross , 2003), TrkB
(Wagner, 2005), nefrina (Wagner, 2006) y pou4f2 (Wagner, 2003) parecen ser
activados por WT1 mas que reprimidos, algunos cofactores como BASP1 y
WT1P (Srichai, 2004) han sido descritos que específicamente actúan como co-
supresores transcripcionales para WT1.
2.10. Gen WT1 en cáncer
El gen wt1 fue caracterizado originalmente como un gen supresor de tumor que
se encontraba inactivado en su función en un grupo de niños con predisposición
genética a nefroblastomas o también llamados Tumores de Wilm´s, del cual
deriva el nombre del gen.
La primera evidencia que apoya su papel de oncogén es la sobreexpresión de wt1
silvestre en una variedad de canceres humanos, tanto de origen hematológico
como no hematológico. Estudios recientes en leucemia, cáncer de pulmón,
sarcoma de hueso y tejido blando, carcinoma de células escamosas en cabeza y
cuello además de cáncer de tiroides y mama muestran evidencia de la importancia
biológica o clínica de WT1 en la sobrevivencia celular, diferenciación y
proliferación; partiendo del principio que estos tejidos normalmente no expresan
WT1 y además no se encontraron mutaciones, sugiriendo que la expresión de
wt1 puede jugar un rol de oncogen en estos tejidos (Oji, 2003).
Desde el año 2000 se comenzaron a realizar estudios para evaluar al gen WT1
como un antígeno tumoral. Se ha determinó que para neoplasias tales como la
leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda y síndrome mielodisplásico
la expresión de este gen se encontraba en niveles muy superiores a los
encontrados en tejido oseo-medular sano o en sangre periférica (Oka, 2000).
15
A partir de estos descubrimientos se empezó a estudiar la respuesta inmune
humoral contra WT1 en los pacientes con malignidades hematopoyéticas,
encontrando que de manera natural su sistema inmune reaccionaba en contra de
WT1, generando anticuerpos específicos que combatían el foco tumoral; sin
embargo, esta producción de anticuerpos no era suficiente para poder erradicar
la enfermedad (Elisseeva, 2002).
El NCI ( National Cancer Institute) de los Estados Unidos, realizó un proyecto
piloto de proiorización de antígenos tumorales, con base a criterios objetivos y
preponderados, donde se selecionó 75 antígenos asociados a tumor
representativos para su comparación y puntaje. Los criterios `pnderados en orden
descendiente fueron los siguientes: a) función terapéutica, b) inmunogenicidad,
c) oncogenicidad, d) especificidad, e) nivel de expresión y porcentaje de células
positivas al antígeno, f)expresión en células estaminales, g) número de pacientes
con tumores positivos al antígeno, h) número de epítopes antigénicos y i)
localización celular del antígeno. Los recultados del proyecto ubicaron a WT1 en
el primer lugar del listado, lo que lo propone como el antígeno tumoral más
importante para el desarrollo de inunoterapias en cáncer (Cheever et al., 2009)
Figura 3. Ranking de antígenos asosiados a tumor del proyecto del National Cancer
Institute 2009. Con base a criterios objetivos predefinidos y preponderados, se rankearon
antñigenos tumorales. Se muestran los primeros 14 antígenos del listado reportados, siendo WT1
el antígeno asociado a tumor número 1 del ranking general, así como los criterios elegidos para
llevar a cabo el estiudio. Grafico tomado de: Cheveer, 2009.
16
2.11. Terapia Inmunológica contra WT1
Después de que se determinó que WT1 es un buen antígeno tumoral, por lo menos
en malignidades hematológicas, se procedió a llevar a cabo estudios en ratones a
los cuales se inmunizaba mediante vacunación intradérmica con un péptido
sintético de 9 mer (9 aminoácidos) de la porción amino terminal de WT1,
encontrando que al ser retados con las células tumorales, estas fallaban para
establecerse en el ratón en comparación con los ratones que no habían recibido
vacunación (Oka, 2000).
Se ha probado la acción de la vacuna peptídica contra WT1 en la activación de
la respuesta inmune de las células T citotóxicas en fases clínicas I/II, obteniendo
una reducción de la masa tumoral e inclusive la remisión de la enfermedad en
algunos pacientes con cáncer de mama y cáncer de pulmón (Oka, 2004).
Aunque los resultados de la vacuna peptídica son muy prometedores, los
candidatos a este tipo de terapia son pocos, ya que el péptido es específico a el
HLA-A*2402 para poder llevar a cabo la activación de los linfocitos T CD8+.
Otra desventaja que se presenta es una intensa inflamación e induración del área
donde se lleva la aplicación de la vacuna, aunque no se reportan citotoxicidades
graves que pongan en riesgo la vida (Morita, 2006).
En nuestro laboratorio se estandarizó un método de deliberación de material
genético via aerosol en un modelo murino, donde se transfectaban células
pulmonares tumorales con un RNAi contra WT1, mostrando un efecto citotóxico
especifico al blanco tumoral, sin mostrar efectos nocivos al tejido sano
circundante además de que permitía el uso de dosis bajas del acido nucleico
(Zamora-Avila, 2009).
Actualmente no existen reporte de la utilización de una vacuna de DNA contra
WT1 donde se inocule vía aerosol, por todo esto nosotros planteamos la
generación de una vacuna de DNA que codifique un fragmento de 325 amino
ácidos de la porción amino terminal del gen WT1, el cual podrá transfectar
17
células presentadoras de antígeno, así como células somáticas permitiendo el
inicio de una respuesta celular y humoral en contra del antígeno transfectado.
En este trabajo pretendemos obtener una vacuna de bajos costos de producción,
sencilla obtención, fácil aplicación, sin efectos secundarios y que tenga una
acción profiláctica y terapéutica contra las neoplasias que sobre expresen el
antígeno asociado a tumor WT1.
18
3. JUSTIFICACIÓN
El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial. Las terapias
utilizadas comúnmente contra el cáncer son poco específicas y con efectos
citotóxicos potentes, que en ocasiones son los causantes de la muerte del
paciente. Es necesaria la búsqueda de nuevas alternativas terapéuticas
antitumorales que sean altamente específicas y efectivas contra el foco tumoral,
además de disminuir drásticamente sus efectos secundarios y aumentar la calidad
de vida del paciente. Ya que el gen WT1 es considerado como un antígeno
asociado a tumor, y que está sobre expresado en una gran variedad de neoplasias
que incluyen tumores hematopoyéticos y sólidos, promete ser un buen candidato
para el desarrollo de una terapia inmunológica contra el tratamiento del cáncer.
Es por esto que nosotros proponemos la generación de una vacuna de DNA en
aerosol contra WT1, la cual tendrá características profilácticas y terapéuticas
contra el desarrollo del cáncer, teniendo una mejor respuesta inmunológica en
comparación de las vacunas anti-cáncer actuales, además de ser la única en su
tipo planteando seguir con la investigación para lanzarla en el mercado.
19
4. OBJETIVO GENERAL
Evaluar el efecto antitumoral local y sistémico, inducido por la administración
en aerosol de una vacuna de DNA contra WT1, en un modelo de cáncer murino.
4.1 OBJETIVOS PARTICULARES
1. Diseñar un vector plasmídico codificante de epítopes inmunogénicos de
la proteína WT1, para su empleo como vacuna de DNA.
2. Caracterizar y determinar la expresión de la secuencia aminoacídica
correspondiente a WT1 in vitro.
3. Determinar la distribución y nivel de expresión de WT1 en tejido
pulmonar de ratones Balb/c, tras la administración por aerosol de la
vacuna.
4. Evaluar la especificidad de la respuesta inmune citotóxica, inducida por
la vacuna de WT1.
5. Analizar la producción de anticuerpos IgG específicos de WT1 en suero
de ratones inmunizados.
6. Evaluar la especificidad de la respuesta inmune inducida por la
vacunación contra WT1, a través de la cuantificación de IFN-g.
7. Analizar el perfil de citocinas Th1/Th2/Th17 en suero de ratones, tras la
administración en aerosol de la vacuna de WT1, en los grupos de
tratamiento.
8. Evaluar el efecto de la vacunación profiláctica contra WT1, sobre el
crecimiento de tumores B16F10 pulmonares.
9. Evaluar el efecto de la vacunación terapéutica contra WT1, sobre el
crecimiento de tumores B16F10 pulmonares.
10. Evaluar el efecto de la vacunación profiláctica contra WT1, sobre el
crecimiento de tumores B16F10 subcutáneos.
20
11. Evaluar el efecto de la vacunación terapéutica contra WT1, sobre el
crecimiento de tumores B16F10 subcutáneos.
21
5. HIPÓTESIS
Es posible genrar una respuesta inmune específica contra el tumor
implementando una vacuna de DNA contra WT1 administrada vía
aerosol en un modelo de cáncer murino.
22
6. DISEÑO EXPERIMENTAL
23
7. METODOLOGÍA
7.1 Diseño y construcción de una vacuna de DNA contra WT1
A) Selección de la secuencia inmunogénica de WT1
Para la obtención de la vacuna se seleccionó una secuencia de WT1 murino (815
pb) que codifica para 265 aminoácidos del extremo amino terminal, región que
está reportada como la más inmunogénica. Para esto nos basamos en la secuencia
completa del gen en ratón reportada en el GenBank con el número de acceso
M55512.
Se añadieron las secuencias adaptadoras de EcoRI y XhoI para integrar la
secuencia inmunogénica de WT1 en el vector de clonación y expresión eucariota
pcDNA3.1 (+) (Cat no. V790, Invitrogen), esto para darle direccionalidad al
inserto y para que posteriormente pudiera ser caracterizada la construcción
mediante una digestión con enzimas de restricción.
Las características del vector de expresión se pueden observar en la siguiente
imagen:
Figura 4. Mapa del plásmido pcDNA3.1 (+).
24
7.2 Transformación de bacterias calcio competentes con la vacuna
DNA-WT1
Se llevó a cabo la transformación bacteriana de E. coli cepa TOP10 del kit One
Shot TOP10 Competent Cells (No. Cat C4040-10) de Invitrogen, según el
protocolo del fabricante.
Se llevó a cabo la selección de las clonas transformadas sembrando en placas de
agar LB adicionado con ampicilina 100 ug/mL e incubando por 24 horas a 37
ºC. Las clonas obtenidas bajo la selección del antibiótico fueron picadas y
crecidas en 3 mL de caldo LB adicionado con ampicilina 100 ug/mL e incubado
en un agitador por 24 hrs a 37 ºC a 250 rpm. Finalmente se llevó a cabo la
centrifugación de estos tubos a 6000 g por 15 minutos y el pellet bacteriano fue
procesado para la extracción del DNA plasmídico utilizando el kit QIAGEN
Plasmid Purification (Quiagen), el cual correspondía a la vacuna DNA-WT1,
para la consecuente caracterización.
7.3 Caracterización de la vacuna por enzimas de restricción
Para determinar la correcta construcción de la vacuna DNA-WT1 se realizó la
digestión del plásmido previamente purificado con las enzimas de restriccón que
flanqueaban la secuencia nucleotídica de interés: EcoRI y XhoI.
Se preparó en un tubo eppendorf cada reacción utilizando 2 uL de la enzima
EcoRI, 2 ug del plásmido, 4 uL de buffer y se aforó a 20 ul de volumen total.
Para la digestión con XhoI se realizó la reacción utilizando 2 uL de la enzima, 2
ug del plásmido, 4 uL de buffer y se aforó a 20 uL. Se incubó el mix por 1 hora
a 37 ºC y finalmente se visualizaron los productos de la digestión enzimática en
un gel de agarosa al 0.8 %.
7.4 Electroforesis en gel de agarosa
Se preparon geles de agarosa al 0.8 % en buffer SB para el corrimiento y
visualización del producto de digestión enzimática de la vacuna DNA-WT1. Las
condiciones de electroforesis fueron de 110 volts por 20 – 40 minutos. Los geles
25
se analizaron bajo la luz UV en un transiluminador, se fotodocumentaron y se
llevó a cabo la purificación de la banda de interés para su posterior análisis de
secuenciación.
7.5 Producción a gran escala de vacuna de DNA contra WT1
Posterior a la validación de la correcta clonación se llevó a cabo la producción a
gran escala dela vacuna DNA-WT1.
Se empleó la cepa de E.coli TOP10 la cual fue previamente transformada con
cada uno de los plásmidos: el plásmido pcDNA3.1(+) /WT1, el cual posee la
inserción de la secuencia de DNA vacunal contra WT1 y el plásmido pcDNA3.1
(+) /-, el cual no tiene el inserto y se utilizó como control experimental.
Cada cultivo fue crecido en matraces con 25 mL de caldo LB adicionando
ampicilina como antibiótico de selección, posteriormente se incubaron durante
14 hrs a 37ºC en agitación continua de 250 rpm. Pasado el tiempo de crecimiento,
se procedió a centrifugar el medio a 5000 rpm por 10 minutos, para formar la
pastilla para cada una de las clonas.
Ya obtenida la pastilla se procedió según instrucciones del protocolo de
purificación a gran escala Pure Link Hi Pure Plasmid Midi Prep Kit (Invitrogen).
A cada pastilla celular se le agregaron 4 mL del Buffer R3 hasta homogenizar,
después se agregaron 4 mL del Buffer L7 y mezclando por inversión el tubo 5
veces, después se agregaron 4 mL del Buffer N3 y se mezclaron por inversión el
tubo hasta verse homogéneo. Posteriormente se centrifugaron los tubos a 20,000
x g por 10 minutos a temperatura ambiente, después se tomó el sobrenadante y
este fue pasado por gravedad a través de una columna provista por el fabricante
, después la columna fue lavada 3 veces con buffer W8 y después se agregaron 5
mL de Buffer E4 a la columna para eluir el DNA y recuperarlo en un tubo estéril,
después para precipitar el DNA plasmídico se agregaron 0.7 volúmenes de
isopropanol y esta mezcla se centrifugó a 12000 rpm por 15 minutos a 4°C,
después se descartó el sobrenadante y se agregaron 5 mL de etanol al 70 % para
después pasar a centrifugar a 7500 rpm por 10 minutos, después se decantó el
sobrenadante y se procedió a secar la pastilla por inversión a temperatura
26
ambiente. Pasados 30 minutos de secado de la pastilla, se procedió a resuspender
el DNA en 2 ml de buffer TE1X y este se cuantificó en nanodrop 2000 (Thermo
Scientific) y fue almacenado a -80°C hasta su uso.
7.6 Cultivo celular
Para los ensayos in vitro, in vivo y ex vivo, se empleó la línea celular de melanoma
murino B16F10 (ATCC, Manassas, VA, USA), la cual fue cultivada en medio
DMEM-F12 (Life Technologies, Invitrogen, Burlington, Ontario, Canadá)
suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) a 37ºC en una atmósfera de
95% de O2 y 5% de CO2.
7.7 Transfección de la línea celular B16F10 con los plásmidos WT1
y pcDNA3.1(+) en placa de 96 y 6 pozos .
Para evaluar el efecto de la vacuna en la proliferación celular en la línea celular
B16F10, se cultivaron 3000 células por pozo en una placa de 96, a las 24 horas
del plaqueo se colocaron diferentes concentraciones del plásmido vacunal y del
plásmido sin inserto por triplicado se agregaron medio fresco junto con cada una
de las concentraciones (0.2, 0.4, 0.6, 0.8 µg/mL) de los plásmidos acomplejadas
con la PEI correspondiente según la siguiente ecuación:
µL PEI = [ µg DNA x 3 x (N/P) ] / 150
y posteriormente a las 48 horas después de la transfección se llevó a cabo el
análisis de proliferación mediante MTT.
Para determinar si el plásmido expresaba el polipéptido vacunal de interés fue
necesario realizar ensayos en placas de 6 pozos con distintas concentraciones de
los plásmidos, para ello se sembraron 100,000 células por pozo en placa de 6
pozos, pasadas las 24 horas se procedió a retirar el medio y agregó medio fresco
junto con cada una de las concentraciones ( 0.6, 0.8 µg/mL.)
27
Cada tratamiento se realizó por triplicado incluyendo como control de agente de
transfección PEI 150 mM. Pasadas las 48 horas, las células serán sometidas a
extracción total de proteínas para Western Blot.
7.8 Ensayo de viabilidad celular mediante MTT
Para la determinación de la viabilidad celular se empleó la técnica de
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT), que consta de la
preparación en solución de 5mg/mL de MTT en buffer PBS estéril,
posteriormente se agregaron 20µL de esta solución a cada pozo y la placa fue
incubada de 35 a 45 minutos a 37°C; pasado el tiempo de incubación se procedió
a decantar el sobrenadante para después agregar 200 µL de DMSO para
solubilizar las sales precipitadas; finalmente la placa fue llevada al lector de
ELISA empleando la longitud de onda 570nm. Finalmente, los resultados fueron
graficados incluyendo la desviación estándar.
7.9 Animales
Se utilizaron ratones macho de la cepa C57/BL6 de 6 a 10 semanas de edad (20-
25g), los cuales fueron obtenidas de Harlan México (México, D.F.). Los animales
se mantuvieron en ciclos de 12 horas luz y 12 horas de oscuridad, siendo
alimentados con dieta para roedores y agua ad libitum.
7.10 Establecimiento del modelo de cáncer murino
Para el establecimiento del modelo murino se utilizó la línea celular B16F10. Se
emplearon cultivos confluentes y se inocularon 500,000 células disueltas en
medio DMEMF12 sin suero vía subcutánea en el flanco derecho de la pata
posterior del ratón.
Para el caso de los ensayos realizados en el modelo de cáncer pulmonar, se
inocularon 5x106 células B16F10 diluidas en 150 uL de medio DMEM/F12 sin
suero, en la vena caudal de ratones C57BL/6. Al tercer día post inducción de
tumor se formaron aleatoriamente los grupos experimentales para nebilización
con la vacuna DNA-WT1 acomplejada con PEI, vector acomplejado con PEI
como control, PEI y ratones sin tratamiento como controles negativos,
28
nebilizados solamente con solución salina. Se llevó a cabo el esquema de
inmunización terapéutico, para verificar la funcionalidad de la vacuna en este
modelo de distribución directa de la terapia sobre el tejido tumoral. Con forme
los grupos experimentes iban muriendo, el tejido pulmonar fue diseccionado y
almacenado en formalina o congelado a -80º C hasta su uso. De igual manera los
sueros de los ratones fueron colectados según el esquema de inmunización
previamente descrito.
7.11 Vacunación con DNA contra WT1 por un sistema de aerosol
por exposición de nariz.
Se utilizó un sistema de liberación por aerosol controlado de exposición de nariz
para 4 ratones, el cual fue estandarizado para el uso con un RNA de interferencia
(Zamora-Ávila, 2009), empleando un compresor comercial Pulmo-Aide modelo
5650D, el cual incluye un nebulizador Micro-Mist de 115V (DeVilbiss Health
Care Crop; Somerset, PA).
Se administraron 40 µg de la vacuna DNA-WT1 acomplejado con
Polietilenimina (PEI) por ratón re suspendidos en solución salina estéril, se
colocó la mezcla en el nebulizador y se nebulizaron los ratones hasta que se
consumiera el contenido del frasco. El esquema de inmunización constaba en una
nebulización al día 0 y 14 para evaluar la actividad profiláctica de la vacuna y a
los días 7 y 14 post inducción tumoral según lo reportado por Sandoval, F. 2013.
7.12 Evaluación de la carga tumoral
Para determinar el efecto profiláctico y terapéutico de la vacuna se llevó a cabo
la medición de la carga tumoral de la siguiente manera:
Vacuna profiláctica: A los 21 días después de la primera inmunización se
inocularon células B16F10 al grupo de ratones por la metodología antes descrita,
y se realizó el monitoreo del crecimiento tumoral hasta el día 36 (contando como
1° día el día de reto).
Vacuna terapéutica: Se llevó a cabo la inducción de la tumoración por la
metodología antes descrita en el día 0, y al día 4 se comenzó con la aplicación de
29
la vacuna vía aerosol 2 veces por semana por 6 semanas. Cumplido el lapso de
tiempo se llevó a cabo la necropsia para analizar el tejido tumoral.
Para ambos casos se contabilizó el número de focos tumorales y se medió con un
Vernier el tamaño de estos, sacando un promedio, se llevó a cabo un registro de
peso, tamaño tumoal y supervivencia para cada ensayo, haciendo lecturas de
medición y conteo cada tercer día. Mediante un análisis estadístico por T de
student se determinó si existe o no diferencias significativas entre los
tratamientos.
7.13 Sangrado y obtención de suero de ratones inmunizados.
Se llevó a cabo el sangrado y obtención de suero de los diferentes grupos de
ratones cada 7 días por punción retro orbital utilizando un capilar de vidrio.
Obtenida la sangre se procedió a centrifugar cada muestra a 1500 rpm por 10
minutos, al finalizar se tomó el suero, se pasó a un tubo eppendorf nuevo y se
almacenó a -80ªC hasta su uso.
7.14 Análisis de la respuesta inmune activada por vacunación
Para determinar el efecto de la vacunación en la respuesta inmune innata, se
analizaron cortes de tejido pulmonar de ratones C57BL6 que fueron inmunizados
con la vacuna de DNA-WT1. Se determinó la presencia de infiltrados celulares
mediante tinción con hematoxilina-eosina por microscopia.
7.15 Especificidad antigénica de la inmunización vía aerosol con
DNA-WT1 in vitro.
A) ProducciónIFN-γ
Se nebulizaron 40 µg de la vacuna DNA-WT1 acomplejada con PEI a ratones
C57Bl6, 6 días después se sacrificaron. Se extrajeron esplenocitos totales del
bazo de ratón con el protocolo antes mencionado y se colocaron en una placa
para separar los linfocitos (no adherentes), se co-cultivaron con células B16F10
(con expresión de WT1) en un radio de 10:1 (celulas efectoras: celulas blanco)
durante 4 horas, posteriormente se tomó el sobrenadante, se centrifugó para
30
separar los linfocitos remanentes y se analizaron en un kit de ELISA para IFN-γ
(Invitrogen Cat. BMS606) siguiendo el protocolo del fabricante.
B) Citotoxicidad celular
Paralelamente, para determinar la capacidad citotóxica específica al antígeno de
wt1 se extrajeron esplenocitos de bazo de ratón con el protocolo antes
mencionado y se colocaron en una placa y se co-cultivaron con células B16F10
(con expresión de WT1) en un radio de 10:1 (celulas efectoras: celulas blanco),
pasadas 24 horas se llevó a cabo un análisis de viabilidad celular mediante MTT.
C) Generación anticuerpos específicos para WT1 en suero
Para la medición de producción de anticuerpos específicos contra wt1, se utilizó
una placa de 96 pozos (Nunc), la cual se recubrió con 1ug/50 uL de anticuerpo
monoclonal IgM contra WT1 (WT1 Anticuerpo (H-1): sc-393498, Santa Cruz) e
incubó toda la noche a 4º C. Posteriormente el exceso de anticuerpo se eliminó
realizando 3 lavados con buffer de lavado (TBS-Tween 0.5%). Seguido de esto,
se bloqueó la placa usando BSA al 5% por 1 hora a temperatura ambiente.
Finalizada la incubación se realizó un lavado extensivo y se incubó la placa con
10ug/mL de proteínas totales de la línea celular B16F10 durante 2 horas a
temperatura ambiente. Después se llevaron a cabo 3 lavados con el buffer de
lavado y se llevó a cabo la incubación de la placa con la curva estándar de
anticuerpo monoclonal de WT1 (WT1 Anticuerpo (F-6): sc-7385, Santa Cruz) y
los sueros de los ratones inmunizados con los diferentes tratamientos, esto por
toda la noche a 4º C. Posteriormente, se llevaron a cabo 3 lavados con buffer de
lavado y se realizó el revelado de la placa usando 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine
(TMB)(Sigma-Aldrich, Cat. 0440 SIGMA) por 15 minutos y deteniendo la
reacción con H2SO4 0.2M. Finalmente se llevó a cabo la lectura de absorbncias a
450nm en un espectofotómetro y se procedió a graficar y analizar los resultados.
31
7.16 Extracción de proteínas y Western blot
Las pastillas celulares que se obtuvieron de cada ensayo, se lavaron con PBS para
después tener un paquete celular, el cual se re suspendió en 100 µL de buffer de
lisis (Tritón 1%, NaCl 150mM, Tris 25mM, pH 7.6) y se incubó en hielo por 30
minutos. Posteriormente las células fueron centrifugadas a 7,500 rpm por 5
minutos y el sobrenadante fue transferido a un tubo estéril y almacenados a -80
°C hasta su uso.
En el caso de tejido pulmonar obtenido, proteínas totales de tejido pulmonar
seccionado proveniente de ratones nebulizados con 40 µg de vacuna DNA-WT1
y analizados a los días 5,10 y 15 posterior a la administración se colectaron con
un saca bocados muestras tejido del tamaño de un pellet celular, se congelaron
con nitrógeno liquido, y se maceraron en mortero estéril, para finalmente llevar
a cabo el protocolo de extracción de proteínas totales utilizando Trizol
(Invitrogen, No. Cat. 15596026), una vez obtenidas las proteínas, se
colectaron en tubos eppendorf de 1.5 mL y se almacenaron a -80º C hasta
su uso.
A) Cuantificación de proteínas
La concentración de proteínas se determinó usando el Kit Bio-Rad DC Protein
Assay siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la cuantificación de los
extractos proteínicos se prepararon diluciones de 1:5 utilizando como diluyente
el buffer de lisis; después se prepararon las diluciones 1:20 con los reactivos S y
A; posteriormente se agregaron 177µL de reactivo B para después incubar por
10 minutos a temperatura ambiente. Después se pasó a leer la placa en el lector
de ELISA a una longitud de 595 nm.
B) Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS
Se tomaron 50 µg de proteína total y se desnaturalizaron en buffer de carga que
contiene SDS y β-mercaptoentanol, se colocaron a 95°C por 5 minutos y después
se cargaron en geles de acrilamida-SDS page al 12%, se corrieron a 40 volts por
20 minutos y posteriormente se incrementó el voltaje a 100 volts por 90 minutos,
32
después se procedió a transferir las proteínas del gel a una membrana de
nitrocelulosa usando un casete de transferencia de proteínas en condiciones de
25 volts por 2.5 horas, finalizando con la trasferencia de proteínas se continuó
con el bloqueo de la membrana con una solución de TBS con leche al 5 % y
Tween al 5 % por una hora.
C) Inmunodetección
Para la inmuno detección se emplearon anticuerpos primarios: anti-WT1
monoclonal F-6 (Santa Cruz Biotechnology) y β-actina monoclonal (Sigma-
Aldrich); y como segundos anticuerpos se emplearon anti-ratón proveido por
BIORAD; para su detección se empleó el Kit de quimioluminisencia de Roche y
los resultados se visualizaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
7.17. Inmunohistoquímica de WT1 en tejido pulmonar murino nebulizado
El tejido pulmonar de ratones nebulizados con los diferentes tratamientos
previamente diseccionado y almacenado en formalina, fue llevado al
departamento de Patología del Hospital Universitario de la Universidad
Autónoma de Nuevo León para su posterior embebimiento en parafina, corte y
montaje en laminillas, que fueron marcadas con anticuerpo monoclonal murino
contra WT1.
7.18. Análisis de citosinas Th1/Th2/Th17 en suero de ratones nebulizados con la vacuna DNA-WT1.
La medición de citosinas se realizó por citometría de flujo usando el kit comercial
BD Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 kit (Cat.no. 560485,
BD Biosciences, San Jose, CA, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante.
La adquisición de las muestras se realizó en un citómetro Accuri CD6 (BD
Biosciences, San Jose, CA, USA) y el análisis de datos se realizó en el programa
CFlow plus proporcionado por la misma compañía. La concentración individual
de cada citosina se estimó a partir de la intensidad media de fluorescencia para
cada muestra. El valor obtenido corresponde al promedio de tres experimentos
independientes +/- la desviasión estándar.
33
8. RESULTADOS
8.1 Caracterización y expresión de la vacuna de DNA ontra WT1 in
vitro
Inicialmente la construcción de la vacuna de DNA-WT1 fue verificada mediante
el corte con las enzimas de restricción EcoRI y XhoI, las cuales flanquean al
inserto de la secuencia codificante. El producto de la digestión fue visualizado en
gel de agarosa al 0.8%. El producto de la digestión corresponde a una banda de
alrededor de 800 pb la cual coincide con el producto esperado. (Figura 5).
pb
Figura 5. Caracterización de la vacuna DNA-WT1 con enzimas de restricción. Carril 1
corresponde al plásmido DNA-WT1 sin enzimas de restricción, el carril 2 corresponde a la
digestión con EcoRI y XhoI, y el carril M corresponde al marcador de peso molecular (pb=pares
de bases)
8.2 Secuenciación del inserto de la vacuna DNA-WT1.
Posterior a la caracterización mediante la digestión enzimática, el plásmido
DNA-WT1 fue enviado a Genescript para realizarle la secuenciación de Sanger.
Cabe destacar que la secuencia seleccionada fue optimizada por la compañía
GenScript, la cual modifico el uso de codones preferenciales, por ello mismo no
se realizó un análisis comparativo entre las secuencias de nucleótidos reportadas
34
en el GenBank (Figura 6). El análisis in silico de la secuencia de nucleótidos se
realizó mediante el software CLC Main WorkBench, el cual detectó el ORF
correspondiente a la vacuna de DNA-WT1. Posteriormente, la secuencia fue
convertida a secuencia de aminoácidos para posteriormente compararla con la
base de datos de Protein Blast del National Center for Biotechnology Information
(NCBI). El resultado del análisis nos arrojó un porcentaje del 96 de homología
con las secuencias murinas reportadas (Figura 7).
En la Figura 8 se observa el esquema de la secuencia seleccionada de WT1, y
el contenido de los epítopes de clase I y clase II incluidos dentro del inserto de la
vacuna DNA-WT1. Estos epítopes corresponden a clase I: SGQARMFPRAPYL
y KRYFKLSHLQMHSRKH; clase II RMFPRAPYL y CMTWNQMNL.
Figura 6. Secuencia codificante de la vacuna DNA-WT1. El segmento obtenido con los cortes
enzimáticos de caracterización de la vacuna, fue secuenciado mediante la técnica Sanger y
analizado in silico para evaluar su correcto marco de lectura y que correspondiera a los péptidos
de interés de WT1.
35
Figura 7. Análisis de alineamiento de la secuencia peptídica de la vacuna DNA-WT1. La secuencia de aminoácidos traducida in silico de la vacuna DNA-WT1 fue alineada en el programa BLAST del NCBI.
Figura 8. Secuencia de aminoácidos codificada por la vacuna de DNA-WT1. En el esquema
se describe la selección de la secuencia de la vacuna de WT1, la cual contiene los epítopes de
clase I (en negritas) y clase II (subrayados).
36
8.3 Análisis de la expresión de la vacuna DNA-WT1 in vitro.
Para determinar la expresión de la proteína vacunal de DNA-WT1 en la línea
celular de melanoma murino B16F10, fue realizada mediante la selección de
clonas previamente transfectadas y seleccionadas con G418. Las proteínas totales
de las clonas con 2 semanas de selección fueron analizadas mediante western
blot, mostrando como resultado la visualización de la proteína silvestre de WT1
de 52-54 kDa y la proteína codificada por la vacuna DNA-WT1, a la cual le
corresponde un peso aproximado de 25 kDa. (Figura 9).
Figura 9. Expresión de la vacuna de DNA-WT1 en la línea celular B16F10. El carril 1 corresponde a la línea celular B16F10 sin transfección, el carril 2 corresponde a la clona transfectada con la vacuna DNA-WT1. La expresión de β-actina se utilizó como control endógeno.
12
WT 1 SILVESTRE
52-54 kDa
DNA-WT1 25-30 kDa
b-Actina 42 kDa
37
8.4 Expresión de la vacuna DNA-WT1 administrada vía aerosol en
pulmones de ratones C57BL/6
Para analizar la expresión de la vacuna DNA-WT1 “in vivo”, fueron nebulizados
dos grupos de 3 ratones: grupo 1) 40 µg de plásmido DNA-WT1 acarreado con
PEI y grupo 2) solución salina. Posteriormente fueron sacrificados a los 5, 10 y
15 días posteriores a la administración. Los pulmones fueron divididos en 4
partes (IS = izquierdo superior, II = izquierdo inferior, DS = derecho superior, y
DI = derecho inferior) tal y como se muestra en la Figura 10 B. El resultado
muestra que la más alta expresión se observa al día 5, y la expresión de la proteína
de 25 kDa de la vacuna DNA-WT1 tiende a disminuirse conforme avanza el
tiempo, sin embargo, la expresión puede observarse levemente expresada en la
parte IS y DI al día 15. (Figura 11)
Figura 10. A) Sistema de nebulización de la vacuna de DNA-WT1 por exposición de nariz.
B) Nomenclatura de los segmentos en que se dividieron los pulmones de los ratones
incluidos en el tratamiento.
38
Figura 11. Distribución de la vacuna DNA-WT1 en los cuadrantes de pulmones de ratones.
Western blot con proteínas totales de tejido pulmonar seccionado proveniente de ratones
nebulizados con 40 µg de vacuna DNA-WT1 y analizados a los días 5,10 y 15 posterior a la
administración. Como control negativo se emplearon pulmones de ratones nebulizados con
solución salina.
Posteriormente, para visualizar la expresión de la vacuna DNA-WT1 en el tejido
pulmonar de ratones C57BL/6, dos grupos de ratones fueron nebulizados; uno de
los grupos fue nebulizado con 40 µg de vacuna DNA-WT1 y el otro grupo con
solución salina. Los ratones fueron sacrificados a las 48 horas post-nebulización
y el tejido pulmonar fue analizado mediante inmunohistoquímica (Figura 12).
En la figura se puede observar un incremento en la marca positiva (color café) en
comparación al tejido pulmonar control negativo. La marca se caracteriza por ser
uniforme y se observa que tiene localización preferentemente citoplasmática. En
el tejido pulmonar del control negativo puede observarse el ruido de fondo de la
inmunohistoquímica.
39
Figura 12. Inmunohistoquímica de tejido pulmonar murino nebulizado con la vacuna DNA-
WT1. Imagen de IHQ de ratones nebulizados con 40 µg de vacuna DNA-WT1 y B) IHQ de
tejido pulmonar de murino nebulizado con solución salina.
8.5 Análisis de la respuesta inmune tras la nebulización de la vacuna
DNA-WT1.
Con la finalidad de analizar la respuesta inmune citotóxica específica tras la
inmunización con la vacuna DNA-WT1, fue planeado un ensayo “ex-vivo”
donde se extrajeron esplenocitos de ratones previamente nebulizados, y
posteriormente se incubaron en co-cultivo con células de melanoma murino
B16F10, en relación 10:1. Los grupos de ratones nebulizados fueron: vacuna
DNA-WT1+PEI, vector+PEI, PEI solo y control negativo (solución salina). En
la Figura 13 se observa una alta actividad citotóxica en el grupo de DNA-
WT1+PEI que corresponde al 96% de citotoxicidad, en comparación a los grupos
vector+PEI, PEI solo y control negativo los cuales obtuvieron porcentajes de
36%, 32% y 19 %, respectivamente.
Con la finalidad de confirmar si en el evento citotóxico observado en la Figura
13, fue realizado el ensayo anteriormente descrito, a diferencia que fue colectado
el sobrenadante a las 4 horas de incubación en co-cultivo, posteriormente las
muestras colectadas fueron analizadas por ELISA para obtener la cuantificación
de IFN-γ en picogramos. Los resultados de este experimento se pueden observar
40
en la Figura 14 en la cual se observa una alta producción de IFN-γ en la muestra
del grupo DNA-WT1+PEI, el cual presentó la concentración de 198 pg/mL, y
para los grupos vector+PEI fue de 69 pg/mL, PEI solo de 42 pg/mL y el control
negativo (solución salina) de 23 pg/mL.
Adicionalmente se realizó un análisis de IgG específica en contra de WT1, tras
la inmunización con la vacuna DNA-WT1. Para ello, fueron sangrados el día 21
a cada uno de los grupos de ratones que previamente fueron nebulizados al día 0
y 14 con 40 µg de vacuna DNA-WT1+PEI. Los grupos incluidos fueron DNA-
WT1+PEI, vector+PEI, PEI solo y control negativo (solución salina). En la
Figura 15 se observa un incremento en las unidades relativas de anticuerpos en
el grupo DNA-WT1+PEI en comparación a los otros grupos, sugiriendo que la
administración vía aerosol de la vacuna DNA-WT1 promueve la generación de
anticuerpos específicos contra WT1 a nivel de suero, es decir a nivel sistémico.
Figura 13. Actividad citotóxica ex vivo mediada por esplenocitos en contra de células
B16F10. Después de la administración de la vacuna DNA-WT1+PEI a los ratones, los
esplenocitos fueron colectados y sembrados en co-cultivo con las células B16F10, empleando
30,000 esplenocitos por cada 3000 células B16F10 sembradas en placa de 96 pozos y con 24
horas de incubación previa a la combinación. El ensayo se analizó a las 24 horas de incubación.
El experimento se realizó por triplicado y en el gráfico se incluyó la desviación estándar.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
DNA-WT1+PEIVector+PEI PEI Control (-)
Via
bili
dad
celu
lar
(%)
Grupos
41
Figura 14. Producción de IFN-γ por esplenocitos incubados con células B16F10. Para
cuantificar la producción de IFN-γ fueron incubados los esplenocitos previamente colectados y
estos fueron incubados con las células B16F10, empleando 30,000 esplenocitos por cada 3000
células de melanoma sembradas en placa de 96 pozos y con 24 horas de incubación previa a la
combinación. Los sobrenadantes de cada uno de los pozos fueron colectados a las 4 horas de
incubación y analizados mediante un kit de ELISA de Invitrogen, siguiendo las instrucciones de
acuerdo al fabricante. El experimento se realizó por triplicado y en el gráfico se incluyó la
desviación estándar.
42
Figura 15. Análisis de la producción de IgG específica para WT1 en suero de ratones
inmunizados vía aerosol con la vacuna DNA-WT1+PEI. Los sueros de ratones inmunizados
vía aerosol con la vacuna DNA-WT1 colectados al día 7 de iniciada la inmunización y
posteriormente fueron analizados mediante un ELISA tipo sándwich. El experimento se realizó
por triplicado y en el gráfico se incluyó la desviación estándar.
8.6. Evaluación de la actividad profiláctica de la vacuna DNA-WT1
modelo subcutáneo de cáncer.
Se realizó el esquema de inmunización descrito en la metodología, nebulizando
los grupos de ratones los días 0 y 14 como se muestra en la línea de tiempo de la
figura 16 empleando 40 µg de vacuna DNA-WT1 acomplejada con PEI, 40 µg
de vector acomplejado con PEI, PEI solo y un grupo de ratones control negativo
(solución salina).
-0.3
-0.2
-0.1
0
0.1
0.2
0.3
0.4
Vec+PEI PEI DNA-WT1-PEI
OD
P.C.
43
Figura 16. Esquema de inmunización vía aerosol de la vacuna DNA-WT1 evaluando la
actividad profiláctica.
Posteriormente a cada ratón se le retó con 500,000 células B16F10 al día 21 y se
llevó a cabo el análisis de la evolución del peso en los diferentes grupos de
estudio (Figura 16), la cinética de crecimiento tumoral (Figura 17), así como y
el análisis de supervivencia (Figura 18).
En el análisis de la evolución del peso en los diferentes grupos de estudio no se
encontró diferencia significativa en el peso final de los ratones entre los
diferentes grupos de experimentación (Figura 17).
Figura 17. Cinética de peso en ratones nebulizados con la vacuna DNA-WT1 evaluando la
actividad profiláctica. La gráfica presenta el record de los pesos promedio de cada uno de los
44
grupos incluidos en el experimento (DNA-WT1+PEI, vector+PEI, PEI solo y control negativo)
conforme se desarrolla el experimento (días transcurridos post- inoculación de las células
B16F10). En el gráfico se incluye la desviación estándar
A los 7 días después del reto (28 días post inmunización) con células tumorales
fue posible visualizar y palpar la masa tumoral en el flanco posterior derecho de
los ratones. A partir de ese día se llevó a cabo semanalmente la medición (largo
x ancho) para cada individuo con un vernier digital. El grupo de ratones sin
tratamiento fue el que mostró un mayor desarrollo tumoral, alcanzando los 600
mm2 al día 42, en comparación con los grupos nebulizados con los diversos
tratamientos. El grupo de ratones nebulizados con la vacuna DNA-WT1 fue el
que tuvo un menor tamaño tumoral, además de mostrar un desarrollo más lento
con respecto a los días. Al día 42 no se observó una diferencia significativa entre
el grupo vacunado con DNA-WT1 y los inmunizados con el vector vacío y
usando solamente PEI (Figura 18).
45
Figura 18. Análisis del crecimiento del tamaño tumoral en el modelo de vacunación
profiláctica con la vacuna DNA-WT1. Durante el desarrollo del experimento fuero recolectados
los datos del tamaño de los tumores subcutáneos, estos grupos de ratones fueron previamente
nebulizados y divididos en cada uno de los grupos (DNA-WT1+PEI, vector+PEI, PEI y el control
negativo (solución salina). En el gráfico se observan los promedios de los tamaños de tumor
incluyendo su desviación estándar.
El resultado final del análisis de supervivencia en el ensayo profiláctico
aplicando la vacuna DNA-WT1 y posteriormente la inoculación de las células de
melanoma murino B16F10, no presentó diferencia significativa entre los otros
grupos analizados (Figura 19).
DNA-WT1+PEI, 7, 86.5
DNA-WT1+PEI, 14
, 170.8
DNA-WT1+PEI, 21,512.9
vector+PEI,7,89.8
vector+PEI,14,319.3
vector+PEI,21,642.9
PEI,7,85.7
PEI,14,292.4
PEI,21,773.6
control(-), 7, 87.7
control(-), 14, 366.2
control(-), 21, 883.1
tamañotumor(m
m2)
tiempo(días)
DNA-WT1+PEI
vector+PEI
PEI
control(-)
46
Figura 19. Gráfico de supervivencia de ratones C57BL/6 inmunizados vía aerosol con
vacuna DNA-WT1 en el modelo profiláctico. El análisis de los datos se realizó mediante el
estimados no paramétrico Kaplan Meier, en el programa SPSS Satistics versión 20.
8.7. Evaluación de la actividad terapéutica de la vacuna DNA-WT1
modelo subcutáneo de cáncer.
Para analizar el efecto terapéutico de la inmunización con la vacuna DNA-
WT1, fue realizado el siguiente experimento con grupos de ratones
inoculados con 500,000 células B16F10 en el extremidad posterior derecha,
y después fueron nebulizados con cada uno de los tratamientos al día 0 y 14
contando como referencia el día de la inoculación de las células B16F10.
En la Figura 20 se puede observar la cinética del promedio de los pesos de
cada uno de los grupos incluidos en el experimento. Como resultado no se
observa diferencia significativa en el incremento del peso de los ratones, de
los cuales oscilan entre un mínimo de aproximadamente de 24 gramos y un
máximo de 27 gramos.
47
Figura 20. Cinética de peso en ratones nebulizados con la vacuna DNA-WT1 evaluando la
actividad terapéutica. Como Control negativo se incluyó a ratones nebulizados con solución
salina, grupo inmunizado con DNA-WT1+PEI, grupo inmunizado con la vacuna vector+PEI y el
grupo inmunizado con PEI.
En el análisis del tamaño promedio de la masa tumoral (Figura 21), se puede
observar un incremento uniforme en todos los grupos incluidos en el experimento
y no observandose así diferencia significativa. El resultado muestra una nula
respuesta inmune en contra de las células tumorales debido a que se comportan
muy similar al control negativo.
Figura 21. Cinética de crecimiento tumoral en el modelo de vacunación terapéutica con
vacuna DNA-WT1. Como control negativo se incluyó ratones nebulizados con solución salina,
48
grupo inmunizado con DNA-WT1+PEI, grupo inmunizado con la vacuna vector+PEI y el grupo
inmunizado con PEI. En el gráfico se visualiza el promedio del tamaño tumoral incluyendo su
respectiva desviación estándar.
En el analisis de la supervivencia en el experimento de la aplicación de la vacuna
de DNA-WT1, no se observó diferencia significtiva entre los diferentes grupos
de tratamiento al ser comparados con la vacunacion terapéutica de nuestra
construcción.
Figura 22. Gráfico de supervivencia de ratones C57BL/6 inmunizados vía aerosol con
vacuna DNA-WT1 en el modelo terapéutico. El análisis de los datos se realizó mediante el
estimado no paramétrico Kaplan Meier, en el programa SPSS Satistics versión 20.
8.8. Evaluación de la actividad terapéutica de la vacuna DNA-WT1
en tumores modelo de cáncer pulmonar murino.
Debido a la ineficacia de la vacunación profiláctica y terapéutica en el modelo
de cáncer subcutáneo, pero con el soporte de los resultados ono bservados in
vitro, se planteó analizar si la administración directa de la vacuna de DNA-
WT1 vía aerosol era funcional en un modelo de cáncer pulmonar murino
haciendo uso del mismo tipo celular.
Se inocularon 5x105 células B16F10 de melanoma murino en la vena caudal
de la cola de los ratones, pues se ha comprobado en estudios anteriores que
la administración de esta línea celular por esta vía produce metástasis directa
a pulmón. Posteriormente, a los 3 días post-inoculación de las células
49
tumorales, se administraron por aerosol en grupos de 3 ratones c/u los
siguientes tratamientos: PBS 1X (grupo control), PEI, 40µg Vector-PEI y
40µg de DNA-WT1-PEI. Adicionalmente se incluyó un grupo de ratones que
fueron nebulizados con 40µg del plásmido que codifica para la isoforma H+/-
de WT1.
A partir del día 20 del experimento, iniciaron los decesos de los ratones, que
fueron diseccionados para obtener los pulmones. Al finalizar el ensayo, el
análisis, número y tamaño de focos tumorales no mostró diferencias entre los
diferentes grupos, con respecto al grupo control (Figura 15). No se
observaron diferencias en el peso de los pulmones ni en la sobrevivencia de
los animales.
Figura 23. Fotografías representativas de los pulmones de los grupos de ratones nebulizados
con los diferentes tratamientos. Al registrarse el deceso de los animales, se realizó la disección
y obtención de los pulmones para determinar diversos parámetros y evaluar la eficacia de los
tratamientos.
50
8.9. Análisis del perfil de citocinas Th1/Th2/Th17 en suero de ratones, tras
la administración en aerosol de la vacuna de WT1
La concentración de citocinas Th1, Th2 y Th17 fue analizada en suero de
ratones con tumor control e inmunizados con el péptido de WT1-9mer para
determinar si éste era capaz de generar una respuesta inmunológica a nivel
sistémico. La inmunización con dicho péptido incrementó significativamente
los niveles de IL-10 (5 veces más en comparación al grupo control PBS)
(p=0.006). Por otro lado, se observó una disminución significativa en el nivel
de IL-4 (p=0.037) y TNF-a (p=0.027). Además se observó una disminución
no significativa en los niveles de IFN-γ e IL-17. La concentración sérica de
las citocinas analizadas (expresada en pg/mL se presenta en la Tabla 3.
Tabla 3. Concentración de citocinas en suero de ratones inmunizados
contra WT1 por vía pulmonar.
Grupo Concentración de citocina (pg/mL)
IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 IL-17
TNF-
a IFN-g
PBS 1.9 71.0 42.4 457.9 37.6 196.0 22.9
WT1-
9mer
DNA-WT1
Tumor sin
tratamient
o
1.8
55.49*
49.0*
12.5*
36.32
24.5
8.8
0.0
0.0
3050.7**
60.93
43.02
9.9
13.46
15.57
11.8*
29.28*
25.48*
9.1
12.51
2.12
* p<0.05, ** p<0.01, en comparación al grupo control PBS
51
9. DISCUSIÓN
El impacto que tiene el cáncer como una de las principales causas de muerte a
nivel mundial, aunado a que las terapias convencionales contra este grupo de
enfermedades, en su mayoría son ineficientes en etapas progresivas de la
enfermedad, fomenta a la investigación científica y a la propuesta de alternativas
terapéuticas efectivas y menos nocivas a los pacientes.
La terapia inmunológica ha demostrado ser una opción terapéutica de primera
línea en el tratamiento de neoplasias, debido a su plasticidad para generar una
respuesta celular altamente específica a un antígeno en particular y a que esta
respuesta se puede generar en el mismo sistema inmune del paciente o de un
donador, siendo totalmente funcional y con menores efectos secundarios que las
terapias tradicionales.
Actualmente el uso de Antígenos Asosiados a Tumor (AAT) ha facilitado el éxito
de este tipo de terapias, centralizando la respuesta a un determinado tipo celular
o tejido dañado, según sea el origen de la neoplasia. Existen estudios en fase
clínica de investigación y algunas terapias inmunológicas ya aprobadas para su
uso en humanos que utilizan AAT como blancos terapéuticos y son administradas
por vacunación intramuscular y vía intravenosa, sin embargo, la cantidad de
inmunizaciones necesarias para generar una adecuada respuesta anti-tumoral es
elevada, y debido a la naturaleza de la vacuna tiene consecuencias en los altos
costos y dificultades técnicas al momento de aplicar el tratamiento.
La cavidad nasal es uno de los primeros sitios de exposición y ataque hacia
patógenos que ingresan al organismo. La eficacia de esta vía de administración
radica en diversos factores, de los cuales podemos destacar la cantidad de droga
que se deposita más allá de la región orofaríngea, el lugar donde ocurre el
depósito y su distribución; así como el tamaño de las partículas inhaladas, las
condiciones de respirado, la geometría de las vías respiratorias y los mecanismos
52
de limpieza mucociliares (Fernández Tena y Casan Clarà, 2012). En un estudio,
Phua y colaboradores demostraron que la inmunidad tumoral puede ser inducida
tras la administración de mRNA vía nasal, aumentando el potencial de dicha
terapia, así como una aproximación hacia la vacunación tumoral no invasiva
(Phua et al., 2014).
Existen números reportes de inmunización vía respiratoria para diferentes tipos
de enfermedades, incluyendo infecciones virales y bacterianas, además de que el
uso de vacunas de DNA muestran una respuesta celular y humoral en contra del
antígeno codificado, este tipo de terapias se han probado en modelos de infección
de VIH y algunas cepas de virus de Influenza (Yang, 2014; Bivas-Benita, 2010).
Por lo anterior, en el presente trabajo se probó la administración vía aerosol de
una vacuna de DNA que codifica para un péptido del gen del tumor de Wilms
(WT1) , proteína clasificada en primer lugar de los AAT con mejor funcionalidad
y especificidad como blanco terapéutico en cáncer, debido a su alta expresión en
una gran variedad de neoplasias, tanto de origen hematopoyético como tumores
sólidos (Sugiyama, 2010)
El diseño y expresión de la vacuna de DNA-WT1 permitió identificar un péptido
de aproximadamente 25-30 kDa, que contiene los epítopes para la activación de
linfocitos CD8+ y CD4+, por medio de western blot usando un anticuerpo
monoclonal contra WT1, sugiriendo que el funcionamiento de la vacuna como
inmunizante sería el adecuado.
La nebulización de 40 ug de vacuna DNA-WT1 tuvo una distribución
homogénea, y con una expresión detectable hasta los 15 días post inmunización,
esto mediante Western Blot, concordando con lo reportado por Tsuboi, 2000,
donde observan expresión de una vacuna de DNA hasta 20 días después de
administrar en los ratones.
La sola administración de 40 ug de la vacuna mostró ser suficiente para generar
53
una respuesta específica de linfocitos CD8+ en células que sobre expresan el
AAT WT1 en el ensayo in vitro, para la línea celular de melanoma murino
B16F10, mostrando una producción significativa de IFN-γ (200 pg/mL) en los
sobrenadantes de las células tratadas, esto concuerda con lo reportado en la
literatura acerca de la liberación de IFN-γ por parte de los linfocitos T al
reconocer el antígeno, en este caso WT1. Diferentes grupos de trabajo reportan
que linfocitos T obtenidos posterior a inmunización con péptidos sintéticos
contra WT1 y específicos para CTL CD8+, al ser retados con el antígeno tumoral
producen de 150- 300 pg/mL de IFN-γ, siendo estos péptidos utilizados en
pacientes con cáncer en fase clínica de investigación (Osada, 2009). La
producción de IFN-γ se correlaciona con el porcentaje de viabilidad observado
en la línea celular B16F10 co-cultivada con los esplenocitos obtenidos de las
diversas inmunizaciones, resultados apuntan a la especificidad inmunogénica
lograda mediante la vacunación vía aerosol de los grupos de tratamiento (Chaise,
2008).
Sin embargo, al probar el modelo de inmunización vía aerosol en el modelo de
cáncer pulmonar murino, los resultados no fueron los esperados. El modelo de
profilaxis contra desarrollo del tumor tras administrar la vacuna DNA-WT1 vía
aerosol no mostró diferencia significativa en el peso y tamaño tumoral final entre
los diferentes grupos de tratamiento, sin embargo, el porcentaje de supervivencia
de los ratones nebulizados con la vacuna DNA-WT1 fue mayor, alcanzando el
30% de supervivencia a los 34 días post inducción tumoral, en comparación con
los otros grupos de tratamiento cuya mortalidad fue del 100% al día 30.
No se observó diferencias significativas en el peso, tamaño tumoral y
supervivencia entre los ratones nebulizados con la vacuna DNA-WT1 y los
diferentes grupos de estudio.
Recientemente se reportaron resultados similares en modelos de vacunación vía
aerosol usando péptidos sintéticos contra WT1 como blanco terapéuticos, así
como el uso de CpGs en contra del desarrollo de cáncer pulmonar usando la línea
54
celular B16F10 de melanoma murino. Arriaga- Hernández en el 2016, concluyó
que el uso de los péptidos sintéticos de 9 y 16 mers, ya reportados en uso de fase
clínica de investigación en pacientes con diferentes tipos de neoplasias, al ser
nebulizados en ratones con metástasis a pulmón no presentan diferencias
significativas con los grupos de ratones sin tratamiento evaluando tamaño de
tumor, número de focos tumorales, peso de ratones y supervivencia.
Manilla- Muñoz en el 2017, reporta que el uso de una vacuna de DNA que
codifica para la proteína completa de WT1, así como los péptidos sintéticos
específicos para WT1 usados con CpGs con adyuvantes, no son suficientes para
generar una respuesta anti-tumoral en contra del modelo de cáncer pulmonar
generado por la línea celular de melanoma murino B16F10, ya que no se
observan diferencias significativas en la supervivencia entre los grupos de
tratamiento.
La aparente ineficacia de la terapia puede deberse a la baja inmunogenicidad del
melanoma murino B16F10 (Baird, JR., 2012). Algunos estudios adjudican esta
característica a la baja expresión de MHC I de la propia célula, además de
propiciar un microambiente tumoral rico en células T reguladoras, y como
consecuencia la acción de linfocitos citotóxicos se ve afectada (Chen et al., 2015).
La depleción de linfocitos T CD4+, la inmunización con AAT y co-estimulación
con anti–4-1BB, co-estimulación con IL-12, apuntan a ser estrategias
terapéuticas prometedoras para la sensibilización en tumores pobremente
inmunogénicos (Fujiwara, 2014; Wilcox R., 2002; Xu D., 2004).
Adicionalmente, se ha reportado que algunas proteínas transportadoras asociadas
al procesamiento de antígenos como lo son la TAP1 y TAP2, específicamente en
la línea de melanoma murino B16F10 presentan una baja expresión, pudiéndose
asociar a una ausencia en el procesamiento de AAT, a la baja expresión de
moléculas de MHC I en la superficie y como consecuencia a una casi inexistente
inmunogenicidad (Qian et al., 2007).
55
En el caso particular de melanoma, la terapia inmunológica que ha presentado
resultados prometedores es el uso de anticuerpos monoclonales, cuyo uso como
un posible adyuvante en algún otro tipo de terapia anti-tumoral, podría potenciar
el funcionamiento en conjunto de dos o más vías de ataque (Jazirehi, 2016).
El uso de WT1 en la terapia inmunológica anti cáncer sigue siendo una de las
principales líneas de investigación en fase clínica, debido a los resultados tan
favorables que se han obtenido en una gama de neoplasias y en etapas avanzadas
de la enfermedad. Actualmente la FDA (Food and Drug Administration, USA)
se encuentra en proceso de evaluación para la aprobación de una vacuna contra
WT1 como segunda línea de tratamiento para el mesotelioma pleural maligno
para su uso comercial en pacientes humanos (Sellas Life Sciences, 2016).
Por lo anterior, es necesario el estudio del funcionamiento terapéutico y
profiláctico de la vacunación vía aerosol DNA-WT1 en un modelo de cáncer que
presente los factores básicos necesarios para poder levantar una respuesta
inmunológica antitumoral, a partir de la revisión bibliográfica exhaustiva en el
presente trabajo, consideramos al modelo de melanoma murino un modelo
neoplásico de estudio complejo para el tratamiento con terapia inmunológica,
será necesario conocer más a fondo la biología molecular y funcionamiento
inmunológico antes de plantear aplicar una terapia en particular.
56
10. CONCLUSIONES
1. La nebulización de 40 ug una vacuna de DNA-WT1 en ratones C57BL/6
presenta una distribución homogénea en tejido pulmonar y su expresión es
detectable hasta 15 días después de la inmunización por medio de Western Blot.
2. La nebulización de 40 ug de una vacuna de DNA-WT1 no genera efectos
adversos que comprometan el funcionamiento normal del sistema respiratorio
de los ratones tratados.
3. Una sola inmunización de 40 ug de la vacuna DNA-WT1 permitó la generación
de una respuesta celular específica contra el antígeno asociado a tumor al
probarse en co-cultivo con la línea celular de melanoma murino B16F10, por
medio de un ensayo ex vivo.
4. La respuesta celular específica generada a partir de la inmunización vía aerosol
de la vacuna DNA-WT1 mostró un efecto citotóxico en la línea células B16F10,
por medio de un ensayo ex vivo.
5. La inmunización vía aerosol de ratones C57BL/6 con 40 ug de la vacuna DNA-
WT1 semanalmente en un período de un mes, mostró una producción de
anticuerpos contra el AAT WT1 en comparación con los sueros de los ratones
tratados con el vector vacío, PEI y solución salina.
6. El tratamiento profiláctico de la vacuna DNA-WT1 vía aerosol no mostró
diferencias significativas en el peso, tamaño tumoral o supervivencia en
comparación a los grupos tratados con el vector vacío, PEI y solución salina,
esto en un modelo de cáncer subcutáneo de melanoma murino.
7. El tratamiento terapéutico de la vacuna DNA-WT1 vía aerosol no mostró
diferencias significativas en el peso, tamaño tumoral o supervivencia en
comparación a los grupos tratados con el vector vacío, PEI y solución salina,
esto en un modelo de cáncer subcutáneo con melanoma murino.
57
8. El modelo de cáncer subcutáneo de melanoma murino generado a partir de la
línea celular B16F10 no es apropiado para llevar a cabo terapias inmunológicas
basadas en respuesta celular debido a la reportada baja inmunogenicidad de la
célula, baja expresión de moléculas de MHC I y disminución de la expresión de
proteínas TAP.
9. Para validar completamente el funcionamiento in vivo de la vacunación
profiláctica y terapéutica de nuestra construcción (DNA-WT1 administrado vía
aerosol), es necesario aplicar en un modelo de cáncer en el que sea posible que
haya interacción celular entre los componentes del sistema inmune y la célula
tumoral blanco.
10. La vía de inmunización con DNA vía aersol sugiere una alternativa terapéutica
prometedora ya que es capaz de montar una respuesta inmunológica sistémica
contra un antígeno específico, siendo de administración no invasiva, sencilla y
de relativo bajo costo.
BIBLIOGRAFÍA
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12. AUTOBIOGRAFÍA
Ana Karina Chávez Escamilla
Candidata para el título de Doctor en Ciencias con Orientación en
Inmunobiología
Título de Tesis
“EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE PULMONAR POR LA VACUNACIÓN VÍA AEROSOL DE DNA CONTRA WT1 EN UN MODELO
DE CÁNCER MURINO”
Datos Personales
Nacida en la ciudad de Monterrey, Nuevo León, México el 4 de febrero de 1988, hija de la Sra. Bertha Alicia Escamilla Lara y el Sr. Jorge Chávez
Contreras.
Educación
Egresada como Licenciada en Biotecnología Genómica de la Facultad de
Ciencias Biológicas de la Universidad Autónoma de Nuevo León en el 2011.
Egresada como Maestra en Ciencias con Especialidad en Inmunobiología en
Posgrado de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Autónoma de
Nuevo León en el 2013.
Artículos Publicados
Saavedra-Alonso S, Zapata-Benavides P, Chavez-Escamilla AK, Manilla-Muñoz
E, Zamora-Avila DE, Franco-Molina MA, Rodríguez-Padilla C. WT1 shRNA
delivery using transferrin-conjugated PED liposomes in an in vivo model of
melanoma. Exp Ther Med. 2016 Dec;12(6):3778-3784.