UNIDAD DE TRABAJO Nº 10PROCEDIMIENTOS DE IDENTIFICACIÓN Y RECUENTO

DE MICROORGANISMOS(15 HORAS)

MÉTODOS CONVENCIONALES DE IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

PRUEBA DE CATALASA

Durante la respiración aeróbica, los microorganismos producen peróxido de hidrógeno y, en algunos casos, un superóxido extremadamente tóxico. La acumulación de estas sustancias termina en la muerte los organismos a menos que puedan ser degradados enzimáticamente. Estas sustancias son producidas por los aerobios, anaerobios facultativos y los microaerobios usando la ruta de la respiración aeróbica, en la que el oxígeno es el aceptor final de electrones, durante la degradación de los carbohidratos para la producción de energía. Los organismos capaces de producir catalasa rápidamente degradan el peróxido de hidrógena como se ilustra: catalasa

2H2O2 2H2O + O2

La superóxido dismutasa es la enzima responsable de la degradación del especialmete tóxico superóxido en los organismos aeróbicos catalasa-negativos.

La incapacidad de los anaerobios estrictos para sintetizar catalasa, peroxidasa, o superoxidasa dismutasa puede explicar por qué el oxígeno es venenoso para estos microorganismos. En ausencia de estas enzimas, la concentración tóxica de H2O2 no puede ser degradada cuando estos microorganismos son cultivados en presencia de oxígeno.

La producción de catalasa puede ser deterninada añadiendo al sustrato H2O2 para un tripticaso apropiadamente incubado sobre un cultivo de agar inclinado. Si la catalasa está presente, la reacción química mencionada es indicada por burbujas de gas oxígeno libre (O2 ). Esto es ub test de catalasa positivo; la ausencia de formación de burbujas de oxígeno es un test de catalasa negativo.

UTILIZACIÓN DE CITRATO

En ausencia de lactosa o glucosa fermentables, algunos microorganismos son capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono para obtener su energía. Esta capacidad depende de una citrato permeasa que facilita el transporte del citrato dentro de la célula. El citrato es el intermedio principal en el ciclo de Krebs y

es

producido por la condensación del acetilo activado con el ácido oxalacético. En la destrución del citrato interviene la enzima citrasa, la cual produce ácido oxalacético y acetato. Estos productos son entonces convertidos enzimáticamente en ácido pirúvico y dióxido de carbono. Durante esta reacción el medio se

hace alcalino (el dióxido de carbono generado se convina con sodio y agua para formar carbonato sódico, un producto alcalino. La presencia de carbonato sódico cambia el color del indicador de pH (bromotimol) incorporado dentro del medio de verde a azul. La reacción de la degradación enzimática del ácido cítrico se puede observar en la figura 10.1.

Tras la incubación, los cultivos citrato-positivos son identificados por la presencia de crecimiento en la superficie del agar inclinado, el cual está acompañado por la coloración azul. Los cultivos citrato-negativos no mostrarán crecimiento , y el medio permanecerá verde.

El medio de crecimiento que se suele emplear es el agar citrato de Simpson sobre cultivos en tubos de agar inclinado

PRUEBA DE COAGULASA

Esta prueba permite diferenciar Staphylococcus aureus, que es coagulasa positivo, del resto de especies de Staphylococcus, que son coagulasa-negativos. Sólo S. intermedius y S. hyicus subsp. hyicus dan también esta prueba positiva, aunque estas especies son de origen animal y no se aislan de seres humanos.

Esta prueba se puede realizar siguiendo dos técnicas: técnica en portaobjetos, que detecta la coagulasa ligada o factor de agregación, y técnica en tubo, que detecta coagulasa libre y coagulasa ligada.

Uno de los posibles mecanismos de acción de la coagulasa libre se basa en la reacción de una enzima extracelular bacteriana, la procoagulasa, con un factor activador presente en el plasma de conejo similar a la protrombina. Esta reacción da lugar a un complejo análogo a la trombina, la coagulasa propiamente dicha, que a su vez reacciona con el fibrinógeno dando lugar a un coágulo de fibrina en ausencia de Ca++.

La coagulasa ligada o factor de agregación actúa directamente sobre el fibrinógeno y lo convierte en fibrina. No requiere la presencia de activadores plasmáticos.La encima actúa dentro de los tejidos hospedadores para convertir el fibrinógeno en fibrina. Teóricamente la maraña de fibrina que es formada rodea a las células bacterianas o a los tejidos infectados, protegiéndo el organismo de los mecanismos de resistencia del hospedador no específico como la fagocitosis y la normal actividad antiestafilococal del suero. La técnica de tubo de coagulasa sirve para detectar tanto la coagulasa libre como la ligada. La técnica consiste en una suspención de los microorganismos prueba en plasma citratado o con EDTA que es periódicamente examinado para detectar la presencia de fibrina o coágulación.

En la técnica del portaobjetos una prueba positiva viene dada por la aportación de aglutinación o grumos en los primeros 30 seg. Cuando la aglutinación requiere un tiempo superior, debe confirmarse con la prueba en tubo. Si una colonia es altamente sospechosa y la prueba es negativa, se debe confirmar mediante la técnica en tubo, ya que un 10-15% de las cepas de S. aureus dan la técnica de la coagulasa en portaobjetos negativa.

En la técnica de tubo la ausencia de coagulación después de 24 horas (el medio permanece líquido) de incubación es un resultado negativo y es un indicativo de la presencia de una línea celular no virulenta. La formación de coágulos, que no pueden ser resuspendidos por agitación, dentro de las 4 horas es interpretado como un resultado positivo e indicativa de una línea celular de S. aureus virulenta.

PRUEBA DE DNasa

La desoxirribonucleasa (DNasa) es un enzima hidrolítico extracelular que producen determinadas bacterias Gram negativas (Serratia marcescens, Branhamella catarralis) y Gram positivas (Staphylococcus aureus).

En Staphylococcus esta prueba parece correlacionarse con la prueba de la coagulasa y puede ser usada para reconfirmar su identificación. El microorganismos problema se hace crecer en un medio agar sólido donde se ha incorporado el ADN.Después de incubar, la actividad de la DNasa es determinada por la adición de 0,1% de azul de toluidina a la superficie del agar; o por la adición de HCl que precipitará el ADN íntegro, mientras que en la zona donde se ha hidrolizado aparece un halo transparente.

La técnica se basa en la demostración de la hidrólisis del ADN alrededor de la zona donde se inocula la bacteria sospechosa. La reacción se puede visualizar dependiendo del indicador que se haya suministrado. En el caso de usar azul de toluidina la lectura se realiza directamente; la positividad viene dada por una zona rosada alrededor de la zona inoculada donde se ha producido la hidrólisis del ADN, mientras el resto de la placa permanece azul. La ausencia de este halo es indicativa de un resultado negativo y la incapacidad del microorganismo para producir DNasa. En el caso de haber añadido HCl, la prueba positiva viene dada por la aparición de un halo transparente alrededor de la zona inoculada, mientras que el resto de la placa aparecerá opaca como consecuencia de la precipitación del ADN. La ausencia del halo transparente significa que la prueba es negativa.

ENSAYOS DE FERMENTACIÓN OXIDACIÓN

Muchos microorganismos obtienen su energía mediante una serie ordenada e integrada de reacciones enzimáticas conducentes a la biooxidación de un sustrato, frecuentemente un carbohidrato. En la fig 10.3 se muestran las principales rutas biooxidativas.

Los microorganismos emplean carbohidratos diferentes dependiendo de su complemento enzimtico. Algunos organismos son capaces de fermentar los azúcares como la glucosa anaeróbicamente, mientras otros usan la ruta aeróbica. Otros aún, anaerobios facultativos, son competentes enzimáticamente para usar tanto las vías aeróbicas como anaeróbicas, y algunos microorganismos carecen de la capacidad de

oxidar la glucosa por cualquiera de las dos vías.

En la fermentación, los sustratos como los carbohidratos y los alcoholes experimentan asimilación orgánica y producen ácidos orgánicos (por ejemplo láctico, acético o fórmico) que pueden ir acompañados por gases como el hidrógeno o dióxido de carbono. Los anaerobios facultativos son llamados usualmente fermentadores de los carbohidratos. La fermentación es descrita mejor considerando la degradación de la glucosa por la vía de Embden-Meyerhof, también conocida como la ruta glucolítica descrita en la figura 10.4.

La degradación vegetativa bajo condiciones anaeróbicas es llevada en tubos con caldos de fermentación que contengan una campana Durham (vial invertido para la detección de producción de gas). Un medio típico de fermentación de carbohidratos contiene:

1. Caldo nutritivo de ingredientes para soportar el crecimiento de todos los microorganismos.2. Un carbohidrato específico que sirva como sustrato para la determinación de la capacidad

fermentativa del organismo.3. El indicador del pH rojo de fenol, el cual es rojo a pH neutro (7) y cambia a amarillo con pequeñas

variaciones de pH (6,8).

La crítica naturaleza de la reacción de fermentación y la actividad del indicador hacen imperativo que todos los cultivos sean observados dentro de 48 horas. La incubación extendida puede enmascarar la producción de ácidos por producción de álcalis debido a la acción enzimática en otros sustratos diferentes al carbohidrato.

En la siguiente incubación, los carbohidratos que han sido fermentados con la connsiguiente producción de ácidos de deshecho causará que el fenol rojo torne a amarillo, indicando una reacción positiva. En algunos casos, la producción de ácidos es acompañada de un gas (CO2) que será visible como una burbuja en el

tubo invertido (campana de Durham). Los cultivos que no son capaces de fermentar un sustrato carbohidratado no cambiarán el indicador, y los tubos opermanecerán rojos; no hay una concomitante evolución de gas. Esta es una reacción negativa.La necesidad de fermentación de los carbohidratos de algunos organismos no significa ausencia de crecimiento. Los microorganismos usan otros nutrientes en el medio como fuentes de energía. A veces estos nutrientes son peptonas presentes en el caldo de cultivo. Las peptonas son degradadas por enzimas microbianas a aminoácidos que son en cambio enzimáticamente convertidos por desaminación oxidativa en cetoaminoácidos. Estos son entonces metabolizados en el ciclo de Krebs para producción de energía. Estas reacciones liberan amonio, que se acumula en el medio, formando hidróxido de amonio (NH4OH) y produciendo un medio alcalino. Durante estos sucesos el rojo fenol cambia a rojo intenso en el ahora medio

básico. Esta ruta alternativa de respiración aeróbica es ilustrada en la figura 10.6.

Para este tipo de identificación se suele emplear otro medio de cultivo, el Agar de Kliger (KIA). Este medio diferencial complejo (de color rojo) es muy útil, ya que demuestra varias características enzimáticas de las bacterias. Está compuesto principalmente por dos azúcares en distinta proporción (glucosa al 0,1% y lactosa al 1%), tiosulfato sódico, citrato férrico y rojo fenol como indicadores de pH. Para estudiar el comportamiento de las bacterias en aerobiosis y anaerobiosis, la siembra en este medio de cultivo se realizará tanto en la superficie del agar (aerobiosis) como en la profundidad de éste (anaerobiosis)(Fig 10.7). La información que podemos obtener es la siguiente:

1. Fermentación de la glucosa: viraje a fondo amarilo en el fondo del slant. Si la bacteria fermenta sólo la glucosa, en la superficie del slant la utilizará por vía respiratoria y, donde la tensión de oxígeno disminuya lo suficiente, empleará una pequeña proporción por vía fermentativa. Esto generará una pequeña cantidad de ácidos que serán neutralizados por las aminas derivadas de la descarboxilación oxidativa de las proteínas (proceso que depende del oxígeno). Como resultado, el medio mantendrá su color rojo en la superficie, al no haber cambiado el pH. Por el contrario, las bacterias crecidas en la profundidad emplearán desde el primer momento la glucosa por vía fermentativa, generando ácidos que no serán neutralizados, provocándose un descenso del pH y el color del medio en el fondo del tubo cambiará a amarillo.

2. Fermentación de la lactosa: viraje a color amarillo en la superficie del slant. Si la bacteria, además, fermenta la lactosa, los ácidos producidos modifican también el pH de la superficie del medio. En este caso las aminas no son capaces de neutralizar la cantidad de ácidos producidos en esta fermentación, ya que la lactosa se encuentra en el medio a mayor concentración que la glucosa. Como consecuencia, el color del medio en la superficie cambiará a amarillo.

3. No fermentación de los azúcares: el slant no cambia de color. Si la bacteria es aerobia estricta (no fermentadora), como, por ejemplo, el género Pseudomonas, el medio permanecerá rojo. En este caso, los azúcares son respirados, degradándose completamente hasta CO2, que se elimina y no modifica el pH.

4. Producción de gas en la fermentación: aparición de burbujas, rotura o elevación del agar del fondo del tubo.

5. Producción de ácido sulfhídrico: aparición de un precipitado de color negro en el fondo del tubo. Algunas bacterias respiradoras anoxibiónticas son capaces de emplear el tiosulfato sódico como aceptor final de electrones en la cadena transportadora. Como consecuencia, este compuesto se reduce a ácido sulfhídrico, que, a suvez, reacciona con el hierro (Fe2+) presente en el medio fornando un precipitado negro de sulfuro de hierro (Fig. 10.7). Los iones Fe2+ provienen de los

iones Fe3+ del citrato férrico y aparecen debido a los cambios en los potenciales redox producidos al someter al autoclave el medio de cultivo.

PRODUCCIÓN DE SULFURO DE HIDRÓGENO

Son dos rutas fermentativas principales para las que algunos microorganismos son capaces de producir sulfuro de hidrógeno (H2S).

Ruta 1: El H2S gaseoso puede ser producido por la reducción (hidrogenación) del azufre orgánico presente en el aminoácido cisteína, que es un componente de las peptonas contenidas en el medio. Estas peptonas son degradadas por enzimas microbianas. Este aminoácido en presencia de una de cisteína desulforasa pierde el átomo de azufre y es entonces reducido por la adición de hidrógeno desde el agua para formar el gas de sulfuro de hidrógeno (Fig. 10.9).

Ruta 2: El H2S gaseoso puede ser producido por la reducción de los compuestos inorgánicos de azufre como los tiosulfatos (S2O3

=), sulfatos (SO4=), o sulfitos (SO3

=). El medio contiene tiosulfato sódico, con el que ciertos microorganismos son capaces de reducirlo a sulfito con la liberación de sulfuro de hidrógeno. Los átomos de azufre actúan como aceptores de hidrógenos durante la oxidación de los compuestos inorgánicos (Fig. 10.10).

En este método se suele emplear el medio SIM que contiene peptona y tiosulfato de sodio como sustratos de azufre; sulfato ferroso, Fe SO4, el cual se comporta como indicador del H2S; y suficiente agar para hacer el medio semisólido y de este modo intensificar la respiración anaeróbica. A pesar de que la ruta sea utilizada, el gas de sulfuro de hidrógeno es incoloro y por tanto no visible. El sulfato ferroso de amonio en el medio sirve como un indicador por combinación con el gas, formando un precipitado insoluble negro de sulfuro ferroso que es visto a lo largo del pinchazo de inoculación y es indicativo de la producción de H2S. La ausencia de precipitado evidencia una reacción negativa.

El medio de cultivo agar SIM puede también ser utilizado para detectar la movilidad de los organismos. La movilidad es reconocida donde el crecimiento del cultivo (turbidez) de microorganismos flagelados no se restringe a la línea de inoculación. El crecimiento de los microorganismos no móviles está confinado a la línea de incubación.

PRODUCCIÓN DE INDOL

El triptófano es un aminoácido esencial que puede sufrir oxidación por vía de actividades enzimáticas de algunas bacterias. La conversión del triptófano en productos metabólicos es mediada por la enzima triptofanasa (Fig. 10.12). Esta capacidad para hidrolizar el triptófano con producción de indol no es una característica de todos los microorganismos y a menudo sirve como un marcador bioquímico.

En este método también se puede emplear el medio agar SIM, suplementado con triptófano. La presencia de indol es detectable por adición del reactivo de Kovac, el cual produce un reactivo final rojo cereza. Este color es producido por el reactivo, el cual se compone de p-dimetilaminobenzaldehído, butanol, y ácido clorhídrico. El indol es extraído del medio como reactivo final por el componente butanol acidificado y forman un complejo con el p-dimetilaminobenzaldehído, produciendo el color rojo cereza (Fig. 10.12). Los cultivos en los que se haya producido un anillo rojo en la superficie del tubo tras la adición del reacivo de

Kovac son indol-positivos. La ausencia de coloración roja demuestra que el sustrato de triptófano no ha sido hidrolizado e indica una reacción indol-negativa. El ácido p-dimetilaminobenzaldehído se puede unir tanto al indol como al propio triptófano; para evitar el posible enmascaramiento que produciría el triptófano, el p-dimetilaminobenzaldehído está disuelto en alcohol isoamílico (también en butanol y ácido clorhídrico) inmiscible en agua. A diferencia del triptófano, el indol es soluble en alcohol isoamílico y, por tanto, sólo el reaccionará con el aldehído produciendo el anillo coloreado característico de esta prueba.

También se puede cultivar la bacteria en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (este digerido de proteínas animales es especialmente rico en triptófano). La reacción que se obserba es similar.PRUEBA DE ROJO DE METILENO

La hexosa monosacárida glucosa es el sustrato principalmente oxidado por todos los microorganismos entéricos para la producción de energía. Los productos finales de este proceso variarán dependiendo de las rutas enzimáticas específicas presentes en la bacteria. En esta prueba el indicador de pH rojo de metilo detecta la presencia de grandes cantidades de de ácido como productos finales. Si bien todos los microorganismos entéricos fermentan la glucosa y producen ácidos orgánicos, esta prueba es de valor en la separación de E.coli y E. aerogenes.

Cada uno de estos microorganismos inicialmente producen ácidos orgánicos y otros productos durante el primer período de incubación. El bajo valor de pH (4, ácido ) es estabilizado por E.coli hasta el fin de lla incubación. Durante el último período de incubación, E.aerogenes convierte enzimáticamente estos ácidos en productos no ácidos como el 2,3-butanediol y acetoína (acetilmetilcarbinol), lo que resulta en un pH elevado a aproximádamente 6. Es decir, las bacterias anaeróbicas facultativas que fermentan los azúcares como la glucosa, pueden, como es el caso de las enterobacterias utilizarla en dos fases: primero la metabolizan aerobiamente (respiración oxidobióntica) consumiendo rápidamente el oxígeno del medio, para en segundo lugar, continuar metabolizándola por vía anaeróbica anaerobia (fermentación). Esta fermentación puede ser de dos tipos: ácido mixta, los productos finales son ácidos orgánicos (fórmico, acético, láctico y succínico) y etanol; y butilén glicólica, los productos finales son compuestos neutros como

el butenodiol y el etanol, produciéndose acetoína como intermediario (Fig. 10.13).El indicador rojo metilo en el rango de pH (4) torna a rojo, lo que indica una prueba positiva. Hasta un pH de 6, aún indicando la presencia de ácido pero con una baja concentración de iones hidrógeno, el indicador vira a amarillo y es una prueba negativa. La producción y detección de los productos finales no ácidos de la

fermentación de la glucosa por E. aerogenes será ampliada en el siguiente apartado, la prueba de Voges-Proskauer, la cual es realizada simuláneamente con la prueba del rojo de metilo.Reacción de Voger Prouskauer.

La prueba de Voger-Prouskauer determina la capacidad de algunos microorganismos para producir productos finales no ácidos o neutrales, como el acetilmetilcarbainol, a partir de los ácidos orgánicos que resultan de la fermentación de la glucosa de E. aerogenes.El reactivo usado en esta prueba, reactivo de Barritt, consiste en una mezcla del alcóhol alfa-naftol y un 40% de la solución de hidróxido potásico. La detección del acetilmetilcarbinol requiere que este producto final sea oxidado hacia un compuesto diacetilo. Esta reacción ocurre en presencia catalítica del alfa-naftol y un grupo guanidina que está presente en la peptona del medio MR-VP. Como resultado se forma un complejo rosa, impartiendo un color rosa al medio. El desarrollo de un color rojo intenso en el cultivo en los 15 minutos siguientes a la adición del reacctivo de Barritt es indicativo de la presencia de acetilmetilcarbinol y significa un resultado positivo. La ausencia de coloración rosa es un resultado negativo.

Prueba de oxidasa

Las enzimas oxidasas juegan un nimportante papel en la operación del sistema transportador de electrones durante la respiración aeróbica. La citocromo oxidasa cataliza la oxidación de un citocromo reducido por el oxígeno molecular (O2), resultando en la formación de de agua o peróxido de hidrógeno. Las bacterias aerobias al igual que algunos anaerobios facultativos y microaerófilos exhiben actividad oxidasa. La prueba de oxidasa ayuda a diferenciar entre los miembros de los géneros Neisseria y Pseudomonas, los cuales son oxidasa-positivos por poseer citocromo c, y las Enterobacteriaceae, las cuales son oxidasa-negativas por no poseer los citocromos c.

La habilidad de las bacterias para producir citocromo oxidasa puede ser determinada por la adición a las colonias en un medio de placa de un reactivo, p-aminodimetilanilina oxalato. Este reactivo rosa claro sirve como sustrato artificial, donando electrones y en consecuencia siendo oxidado a un compuesto negruzco en presencia de la oxidasa y el oxígeno libre. A continuación de la adición del reactivo, el desarrollo de coloración desde el rosa, pasando por el marrón hasta el negro en la superficie de las colonias es indicativo de la producción de citocromo oxidasa y representa una prueba positiva. La ausencia de cambio de color o una coloración rosa clara en las colonias, es indicativa de la ausencia de actividad oxidasa y es una prueba negativa.

Otras veces el reactivo que se emplea es el tetrametil-p-fenilendiamonio, a menudo abreviado como TMPD o reactivo de la oxidasa, por producir un producto intensamente coloreado de color azul en menos de 10 segundos. Se basa en la capacidad del reactivo colorante para oxidarse al ceder electrones al citocromo c. Este colorante es incoloro en estado reducido y puede oxidarse rápidamente en presencia del citocromo c, produciéndose formas coloreadas de azul. Si el TMPD es tetrametil-p-fenileno diamino clorhídrico el color resultante en el caso de resultado positivo es el púrpura.

Prueba de ureasaMicrobiolgy, SHERMAN, pag. 161

La ureasa es producida por algunos microorganismos pero sirve de ayuda en la identificación de Proteus vulgaris. En otros microorganismos que también la sintetizan su acción en el sustrato tiende a ser similar a la observada en Proteus sp. A pesar de todo esta prueba sirve para distinguir rápidamente distintos miembros de este género de otros microorganismos entéricos lactosa-negativos.

La ureasa es un enzima hidrolítico que ataca el nitrógeno y los enlaces carbono en las amidas como urea y forma productos finales alcalinos como el amonio (Fig. 10.16).

La presencia de ureasa es detectable cuando se hacen crecer los microorganismos en un caldo con urea conteniendo un indicador del pH como el rojo fenol. Como el sustrato urea es dividida en los productos antes mencionados, la presencia de amoniaco crea un medio alcalino que causa le viraje del rojo fenol a rosa intenso. Esta es una reacción positiva para la presencia de la ureasa. La falta de coloración rosa durante el desarrollo evidencia una reacción negativa y, por tanto, no hay producción de ureasa.

Proteolisis (Peptonización).

La incapacidad de algunos microorganismos para obtener su energía por la vía de la fermentación de la lactosa hace que usen otras fuentes de nutrientes como proteínas para este propósito (ver figura 10.6). Por medio de enzimas proteolíticas, estos microorganismos hidrolizan las proteínas de la leche, primeramemte caseína, en sus ladrillos básicos de construcción, los aminoácidos. Esta digestión de las proteínas está acompañada por la producción de gran cantidad de aminiaco que origina un pH alcalino en el medio. El indicador de oxidación-reducción tornasolado se torna a púrpura intenso en la zona superior del tubo, mientras el medio continúa perdiendo cuerpo y produce una traslucidez, castaño, este suero aparece como consecuencia de que la proteína es hidrolizada a aminoácidos.

Una reacción alcalina es evidente cuando el color del medio no cambia o cambia a azul intenso. Esta indicación es indicativa de la degradación parcial de la caseína en cortos cadenas polipeptídicas, con la liberación simultánea de productos finales alcalinos que son responsables del cambio de color observable.

La caseína es la principal proteína de la leche, es una macromolécula compuesta de subunidades aminoacídicas unidas por enlaces peptídicos (CO - NH). Para su asimilación dentro de las células, las proteínas son degradadas paso a paso en peptonas, polipéptidos, dipéptidos y finalmente en sus ladrillos de construcción, los aminoácidos. Este proceso es llamado peptonización o proteolísis, y es mediado por enzimas extracelulares llamadas proteasas. La función de estas proteasas es romper los enlaces peptídicos introduciendo agua dentro de las moléculas (Fig 10.17).

Al ser los aminoácidos moléculas de bajo pero molecular son solubles y pueden ahora ser transportados a través de la membrana celular hacia el interior de ésta formando el conjunto de aminoácidos para utilizar en la síntesis de proteínas estructurales y funcionales de la célula.

En esta prueba se demuestra la actividad hidrolítica de estas exoenzimas. El medio puede estar compuesto de agar nutritivo suplementado con leche que contiene la proteína caseína como sustrato. Similar a otras proteínas, la proteína de la leche es una suspensión coloidal que da al medio su color blanco y su opacidad, debido a que refleja los rayos de luz antes que transmitirlos.

Tras la inoculación y la incubación del cultivo de placa de agar, los microorganismos secretan proteasas que exhibirán una zona de proteolisis, la cual es demostrada por un área clara rodeando la colonia bacteriana. Este pérdida de opacidad es el resultado de una reacción hidrolítica produciendo aminoácidos no coloidales y solubles, y representa una reacción positiva. En ausencia de actividad proteasica, el medio que rodea a

las colonias del microorganismo permanece opaco, lo cual es una reacción negativa.Aunque el valor de la gelatina como una fuente nutricional es cuestionable ( es una proteína incompleta, necesitando el aminoácido esencial triptófano), su valor en identificación de especies bacterianas está bien establecido. La gelatina es una proteína producida por la hidrólisis del colágeno, un componente principal del tejido conectivo, tendones en humanos y otros animales. A temperaturas inferiores a 25 ºC la gelatina mantendrá su propiedad gel y existe como sólido; hasta temperaturas superiores a 25 ºC, la gelatina es líquida.

La licuefacción es iniciada por algunos microorganismos capaces de producir una encima extracelular proteolítica llamada gelatinasa, la cual actua hidrolizando las proteínas a aminoácidos. Una vez que esta degradación sucede, manteniendo de forma constante la temperatura a valores inferiores a 4 ºC, el estado de gel característico no se restaura.

En este caso se puede emplear gelatina nutritiva en tubos profundos para demostrar la actividad hidrolítica de esta enzima gelatinasa. El medio consiste en un caldo nutritivo suplementado con gelatina al 12%. Esta alta concentración de gelatina se traduce en un medio rígido y también sirve como sustrato para la actividad de la gelatinasa.

Tras inoculación e incubación durante 48 horas, los cultivos son situados en un refrigerador a 4 ºC durante 30 minutos. Los cultivos que permanecen licueficados producen gelatinasa y muestran una rápida hidrólisis de la gelatina.. Reincubando todos los cultivos solidificados durante cinco días más. Refrigerar durante 30 minutos y obervar la licuefacción. Los cultivos que permanecen líquidos son indicativos de una baja hidrólisis de la gelatina.

Metabolismo fermentativo de la glucosa (Hugh y Leifton)

Pruebas con tiras de papel

Disco de papel

Sistemas más importantes de identificación por "kits".

MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE CÉLULAS Y DE LA MASA BACTERIANA

Entre el incremento en el número de células y de la masa no tiene que haber una relación fija durante el crecimiento de una población bacterian en un cultivo discontinuo o por cargas, como es por ejemplo una suspenxión de bacterias en un matraz Erlenmeyer. Tras la inoculación en el medio de cultivo de algunas bacterias se dividen más rápidamente que el incremento en la masa; las células son inicialmente más pequeñas. En una fase posterior del crecimiento, la tasa de crecimiento de la masa puede sobrepasar a la del número de bacterias. En la consideración de las fases del crecimiento, en las que el incremento del número de células y de la masa son en cierto modo iguales, no es necesario diferenciar entre ambas magnitudes. Se habla entonces de "células estándar" o de "crecimiento balanceado". En este caso, en lugar del número de células puede determinarse también la masa celular, o alguna dimensión proporcional, como la extinción (absorción, densidad óptica). La masa celular referida a una unidad de volumen (litro o mililitro) se denomina también densidad celular o densidad bacteriana (g/l; g/ml).

Determinación del número de bacterias.

En una población bacteriana no todas las células son viables. Se consideran células vivas a aquellas que son capaces de formar colonias sobre medios con agar, o de formar suspensiones en caldos líquidos. Las células viables se establecen mediante los métodos para determinar el número células viables. En el número total de células se incluyen todas las células que pueden verse o demostrarse de otro modo, esto es, se incluyen también las células muertas y las lesionadas. Veremos a continuación dos métodos.

1. Número total de células. El método más extendido par la determinación del número total de células se basa en el contaje al microscopio de las células extendidas en una capa delgada en una cámara de contaje. Si el grosor de la capa es de 0,02 mm y el área cuadrangular tiene un lado de 0,05 mm )volumen 5 x 10-8 cm3) el número de células que allí se encuentran hay que mutiplicarlo por 2 x 107 para obtener el número de células/ml. El contaje relativo frente a cifras conocidas, por ejemplo los eritrocitos de la sangre (aprox. 5 x 106 eritrocitos/ml) es uno de3 los métodos más antiguos. Un contador electrónico supone una significativa simplificación; se basa en la pérdida de

condiuctividad de la disolución de un electrolito cuando pasa una célula bacteriana a través de un orificio estrecho. Para números de células inferiores a 106 células/ml puede utilizarse un método de filtros de membrana. El agua de mar, se un lago o de bebidas se filtra a través de un filtro de membrana, este último se seca, se tiñe, se hace transparente y se cuenta al microscopio.

2. Número de células viables. generalmente se cuentan las células viables que en condiciones favorables de crecimiento llegan a desarrollar colonias. Según el método de vertido en placas de KOCH se toma una parte alícuota de una suspensión celular homogénbea diluida apropiadamente y se mezcla con agar nutritivo líquido (40-45 ºC), para verterlo en placas de Petri. La suspensión puede también extenderse sobre la superficie de agar de una placa de Petri con el asa de Drigalsky; las células pueden también depositarse por filtración sobre un filtro que luego se sitúa sobre agar nutritivo o sobre discos de cartón impregnados de medio. En todos los casos se cuentan las colonias después de la incubación. La utilización del método de Koch de vertido en placa y los métodos deribados, se limitan al contaje de células de la misma especie a partir de suspensiones homogéneas y no deben trasladarse al contaje de individuos de especies distintas en poblaciones mixtas.

Determinación de la masa bacteriana.

La elección del método par la determinación de la masa bacteriana depende de para qué se tome como referencia a la masa bacteriana. Para la determinación de rendimientos se indica frecuentemente la masa húmeda o seca. Para actividades metabólicas o enzimáticas se utiliza el contenido proteico o el nitrógeno. Frecuentemente la elección de un método apropiado se efectúa bajo el punto de vista de la sencillez y la rapidez del método. Después del correspondiente calibrado acostumbra a preferirse en los procesos de rutina los métodos indirectos frente a los directos.

Métodos directos. La masa húmeda se determina mediante centrifugación de las células. Después de la centrifugación de las células lavadas puede determinarse la masa seca. Ambos métodos están sometidos a errores sistemáticos considerables. Significativamente más exactos son el contenido total de nitrógeno (método micro-Kjeldahl y microdifusión del amonio) y el contenido total en carbono. De forma rutinaria se determina frecuentemente la proteína bacteriana. Modificaciones del método de Biuret y otras reacciones coloreadas determinables colorimétricamente dan buenos resultados. Los micrométodos se basan en la medida de componentes representativos de las proteínas (tirosina, triptófano).

Métodos indirectos. Los métodos basados en la determinación de la turbidez son útiles para establecer la masa celular. En los trabajos rutinarios se mide la densidad óptica de una suspensión por su extinción (turbidimetría). En algunas ocasiones la nefelometría es más precisa. La dependencia lineal entre los valores medios y la baja densidad celular. Como la dispersión de la luz depende del diámetro, la forma y el índice de refracción de las partículas dispersantes, también de los componentes internos de la célula, las relaciones entre los valores ópticos y otras magnitudes más directas (masa seca, contenido en nitrógeno o en carbono) hay que establecerlas de nuevo para cada caso. Magnitudes metabólicas que dependan directamente del crecimiento (captación de O2, producción de CO2 o ácido) pueden dar una medida adecuada de la masa de microorganismos. Su medida está indicada en aquellos casos en que fracasan los otros métodos, por ejemplo cuando las densidades celulares son muy bajas. Para la medida pueden utilizarse métodos de titulación, manométricos y electroquímicos entre otros.