tutorial sobre pipetas automáticas

7/31/2019 Tutorial sobre pipetas automticas

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PIPETAS AUTOMTICAS

Las pipetas son dispositivos que se caracterizan porcarecer de depsito y que se utilizan para medir o transvasarpequeos volmenes de lquido de un recipiente a otro con granexactitud. Inicialmente se fabricaron en vidrio pero hoy en daexisten una gran variedad de opciones. Podramos hacer unaprimera divisin enpipetas de volumen fijo ypipetas de volumenvariable. Las de volumen fijo son ms precisas que las devolumen variable, aunque cuando en un anlisis se usa una de

volumen variable habiendo ajustado el volumen requerido y sinvariarlo ms, su precisin es comparable a la de una pipeta devidrio graduada de clase A.

Tambin podramos dividirlas en pipetas manuales yelectrnicas, aunque estas ltimas son mucho menos abundantesdebido fundamentalmente a su precio mucho ms elevado, por loque nos centraremos en las manuales. A su vez tambin

podramos distinguir entre pipetas monocanal y multicanal.


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La pipeta mecnica o de pistn funciona generalmentetransmitiendo la fuerza que un operador, de forma manual, ejercesobre un mbolo que se encuentra unido a un pistn mediante uneje que lo desplaza a lo largo de un cilindro de longitud fija,

forzando un volumen predefinido de lquido fuera de la pipeta.

Las pipetas a pistn son en general de dos tipos comohemos visto antes: las de volumen fijo, que dispensan un volumenpredeterminado de lquido, el cual es conocido como volumennominal (Vn) y las de volumen variable que permiten ajustar elvolumen dispensado dentro de un rango determinado en lasespecificaciones de la pipeta. La variacin en el volumen se logra

modificando la longitud de la carrera del pistn dentro del mbolomediante un micrmetro. En estas de volumen variable elvolumen nominal es el lmite superior del rango de volumen de lapipeta, de acuerdo con las especificaciones dadas por elfabricante.

Cada uno de los tipos mencionados se puedensubdividir en dos subtipos: A y B. Las pipetas del subtipo A se

denominan pipetas de desplazamiento por aire o neumticas,debido a que existe un volumen de aire entre la cabeza del pistny el lquido en el cilindro (este es el tipo ms corriente). A laspipetas del subtipo B se les denomina pipetas de desplazamientopositivo o de desplazamiento directo porque el pistn seencuentra en contacto directo con el lquido.


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Las pipetas de desplazamiento directo se recomiendanpara lquidos con alta densidad, alta viscosidad o alta presin devapor. Presentan el inconveniente de que las puntas a utilizar sonmucho ms caras puesto que cada punta lleva su pistn

incorporado (a la manera de una jeringuilla). Es por estacaracterstica que tambin evitan contaminaciones cruzadasprovenientes de la pipeta o de aerosoles y muestras. Laspipetasneumticas usan puntas mucho ms baratas pero no son tanexactas como las de desplazamiento positivo cuando se trabajacon volmenes muy pequeos de lquido debido a lacompresibilidad del aire.

Todas las pipetas de pistn disponen de puntasdesechables para minimizar los riesgos de contaminacin. Parafacilitar el uso del tipo de punta adecuado los fabricantes hanadoptado un cdigo de color segn el volumen a dispensar y que

en las de uso ms general coincide con el color de las puntasutilizadas.


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Instrucciones para el manejo de una pipeta automtica

Ajustar el volumen girando la rueda hasta que en laescala aparezca el volumen deseado.

Colocar una punta de plstico (adecuada) en la punta de lapipeta haciendo una leve presin para lograr un buen ajuste.

1.Oprimir el botn pulsador con el dedo pulgar,hasta el primer tope y sin soltarlo introducirverticalmente la pipeta, hasta que la punta sesumerja de 2 a 5 mm dentro del lquido.

2.Liberar lentamente la presin sobre el botn.Despus de 23 segundos retirar, siempreverticalmente, la pipeta del lquido deslizando lapunta contra la pared del recipiente.


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3.Apoyando la punta contra la pared del recipientedonde se quiere colocar el lquido, presionarlentamente el botn pulsador hasta el primertope. Despus de un segundo, y sin soltar el

botn pulsador, terminar de vaciar la pipetapresionando hasta el segundo tope.

4.Retirar la pipeta deslizando la punta contra lapared del recipiente.

RECOMENDACIONES GENERALES AL PIPETEAR

El empleo de una buena tcnica al utilizar las pipetas puedeincrementar la exactitud hasta en un 5 %. Hay tanto aspectosinstrumentales y de condiciones ambientales como de tcnica demanejo de la pipeta.

EN LA TCNICA EMPLEADA+ PROFUNDIDAD DE INMERSIN DE LA PUNTA

La profundidad de inmersin de la punta es especialmenteimportante en el uso de volmenes pequeos. Si la punta sesumerge demasiado, se aspirar ms lquido debido al aumento dela presin. Si por el contrario, la punta no se sumerge losuficiente, se puede cargar aire con las consiguientes burbujas y


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volumen inadecuado. Sumergir la punta a una profundidadadecuada puede mejorar la precisin hasta un 5%.

+ UNIFORMIDAD AL PIPETEAR

Es fundamental mantener un ritmo, velocidad y tcnicaadecuada al mover el mbolo. Una aspiracin demasiado rpida eincontrolada puede llevar a la formacin de aerosoles,salpicaduras y posible contaminacin del eje y del pistn,pudindose producir incluso prdida de volumen de la muestra.Una velocidad de pipeteo uniforme puede mejorar la precisintambin hasta un 5%.


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+ ANGULO DE INMERSION VERTICAL

Se ha de procurar mantener el ngulo de inmersin de lapipeta lo ms cercano a la vertical posible. De otra forma, la

columna vertical de lquido ser ms pequea y se aspirardemasiada muestra. Por el contrario, al dispensar el lquido, lapunta se ha de mantener en un ligero ngulo frente a la pared delvaso para asegurar un correcto vaciado. Se estima que pipetear deforma vertical o como mximo dentro de un ngulo menor de 20de sta, puede mejorar la precisin hasta en un 2,5%.

+ TCNICA DE DISPENSACIN

Para la mayora de aplicaciones se recomienda dispensarcon el extremo de la punta apoyado contra la pared del recipiente.As se reduce o elimina el hecho de que se quede algo de muestra

en el interior de la punta despus de acabar la dispensacin.Retirad la pipeta deslizando el extremo de la punta hacia arribapor la pared lateral para liberar cualquier gotcula restante en elorificio de la punta. Esta tcnica puede mejorar la precisin hastaen un 1%.

Otra tcnica consiste en dosificar directamente en lasuperficie del lquido. Es crucial usar una punta de pared fina paraque no quede ninguna gotcula en el interior de la punta. Si se

dispensa directamente dentro del lquido tendremos que sacar la


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pipeta mantenindola en el segundo tope para evitar una toma demuestra despus de la dispensacin.

+ ENJUAGE PREVIO DE PUNTAS

Se recomienda enjuagar previamente las puntas comomnimo dos veces con el lquido a pipetear para compensar la

pelcula de lquido en el interior de la punta. El enjuage previotambin tiene otras ventajas: ayuda a neutralizar los efectos decapilaridad e iguala la temperatura y humedad del aire del interiorde la pipeta con la temperatura y humedad de la muestra.

Todo esto puede suponer una mejora de hasta el 0,2% de laprecisin.(No es necesaria en pipetas a pistn de desplazamiento

positivo).


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OTROS FACTORES QUE TAMBIN AFECTAN A LOSRESULTADOS DEL PIPETEO

+ TRABAJAR SIN CAMBIOS BRUSCOS DETEMPERATURA

Procurad pipetear a una temperatura constante. Latemperatura ptima sera: que como veremos despussera tambin adecuada para calibrarlas. Debemos evitarrepentinos o grandes cambios de temperatura ya que el aire delinterior de la pipeta no se puede adaptar rpidamente y esto puede

afectar al volumen. Pipetear a una temperatura constante puedemejorar la precisin hasta en un 5%. Es por este motivo quecuando pipeteamos durante un largo rato nuestra mano puedecalentar el aire del interior de la pipeta, expandindose y pudiendoreducir la precisin hasta en un 1%. Es por esta razn que serecomienda no sostener continuamente la pipeta en las manos yentre ciclos, dejarla en su soporte o en la mesa.

+UTILIZACIN DE UNA PIPETA ADECUADA PARA ELVOLUMEN QUE SE ASPIRA

La aspiracin al 50% del volumen nominal de las puntas

consigue mejores resultados. Se recomienda trabajar entre el 35%y el 100% del volumen mximo de la pipeta. Seguir este consejo


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puede hacernos mejorar los resultados hasta en un 1%.Cometemos mucho mayor error trabajando por debajo del 10%del volumen nominal de la pipeta que estamos utilizando.

+ AJUSTE CORRECTO DEL MICROMETRO PARA EVITARLOS EFECTOS DEBIDOS A LA HOLGURA MECANICA

Cuando cambiemos el volumen de uno superior a otroinferior simplemente hay que girar la rueda del micrmetro haciaabajo hasta el volumen deseado. Por el contrario, cuandoincrementamos el volumen a pipetear, hay que subir la ruedaligeramente por encima del volumen deseado para luego bajarlahasta el deseado. Esto evitar el juego mecnico de las piezas ycontribuir a una mejora del 0,5% en la precisin.

+ FACTORES ERGONMICOS

Para todos aquellos que pipeteen de forma repetitiva lamayor parte de la jornada se recomienda usar pipetasespecialmente suaves de accionamiento porque es fundamentalque las manos estn lo ms descansadas posibles. Normalmentecada fabricante importante tiene en su gama algn modelo de estetipo.


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PARTE PRCTICA.

Nos centraremos en los dos tipos ms comunes depipetas que podemos encontrar en los laboratorios, que sonpipetas tipo Gilson o tipo Eppendorf. Cada tipo tiene susparticularidades, pero el procedimiento de calibracin es el mismopara ambas.

Partes especificadas:A.- Botn de controlB.- Tuerca de conexinC.- Junta de teflnD.- Anillo de goma (O-ring)E.- CaaF.- Expulsor de la punta

Como diferencia fundamental las de tipo Gilson tienen elpistn de acero inoxidable, una junta de tefln (C) y un anillo degoma (D) que son los que garantizan el sello hermtico. En las detipo Eppendorf, el mbolo es de un polmero orgnico (Fortron)altamente resistente al calor, cidos y bases, envejecimiento y

abrasin, y no lleva ni junta de tefln ni anillo de goma. Es unaligera capa de silicona de vaco alrededor del mbolo la queasegura la estanqueidad en este caso.

Para el caso en que pipeteemos cidos es mejor usar unade tipo Eppendorf puesto que slo se nos deteriora con el tiempola capa de grasa. En una de tipo Gilson, acaba corroyndose elmbolo a pesar de acero (ver foto) con lo que tendremos que

sustituirlo para que la pipeta no gotee. Para evitar en lo posible


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este efecto de los cidos, Gilson ha sacado un kit de proteccinanticorrosin para la P 1000 que consiste en una caa especial quelleva acoplado un filtro anticidos, siendo ste intercambiable (aligual que el filtro de proteccin anti-salpicaduras de las P 5000).

Si no disponemos de este kit especial la casa recomienda una vezdespus de haber usado la pipeta con lquidos cidos o corrosivosque emitan vapores, desmontar la caa y lavar el pistn, el anillode goma y la junta de tefln con agua destilada y una vezcompletamente secas montar y comprobar funcionamiento.

Por calibracin de pipetas se entiende la comparacin entreel volumen real y el volumen terico. El volumen real sedetermina por va gravimtrica por lo que necesitaremos aguadestilada o desionizada y una balanza adecuada.

Para realizar la calibracin de una pipeta seguiremos lasdirectrices dadas por la norma ISO 8655 (aparatos volumtricosoperados por pistn). Los premisas pricipales de dicha norma secentran en 3 puntos fundamentales:

1.- Condiciones ambientales

2.- Utilizar una balanza adecuada

3.-Minimizar el efecto de la evaporacin en volmenes inferioresa 50 microlitros o tomar medidas adicionales para evitarla.


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- CONDICIONES AMBIENTALES

Las calibraciones se deben realizar en una sala sincorrientes de aire y con una temperatura comprendida entre 20C

y 25C sin variar ms de C5,0 mientras dure el ensayo.Asimismo se necesita una humedad relativa mayor del 50%. Conanterioridad a la calibracin se deber dejar al menos 2 horas todoel material a emplear para que alcance un equilibrio trmico conla temperatura de la sala. Nunca deber estar expuesto al soldirectamente. Necesitaremos disponer de un termmetro ytambin un barmetro si calibramos pipetas de menos de 50 l ydebemos realizar ajustes por el efecto de la evaporacin.

- UTILIZAR UNA BALANZA ADECUADAPara el caso de calibraciones de pipetas de 10 l o

inferiores habr de emplearse una balanza analtica de 5decimales. Para pipetas de volmenes ms grandes es suficienteutilizar una balanza de 4 decimales. Se aconseja el uso de vasosde vidrio para minimizar los efectos de las cargas electrostticas,ms importantes cuanto ms pequeos son los volmenes queestamos midiendo.

- MINIMIZAR EL EFECTO DE LA EVAPORACINPara volmenes pequeos (menores de 50 l ) podemos

usar algn recipiente especfico de vidrio con tapa o situar unvaso de precipitados pequeo con 10 ml de agua en el interior dela balanza para inhibir la evaporacin. Es ms cmodo emplear elrecipiente especial porque nos simplificar los clculos despus.Existen marcas que comercializan su propio juego de recipientespara efectuar las calibraciones de sus distintos modelos.


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PROCEDIMIENTO DE CALIBRACIN

Abriremos la pipeta para comprobar el estado de la juntade tefln y el anillo de goma (Gilson). Si stos presentan juego,los sustituiremos. Tambin verificaremos que la caa no estdoblada y en buenas condiciones. En caso contrario, tambin lacambiaremos.

Para el caso de las Eppendorf, retiraremos la grasa viejadel pistn y procederemos a reengrasarlo ligeramente de nuevo(es importante no poner demasiada).

Tras el enjuage previo de la punta al menos dos veces conagua destilada, haremos un chequeo rpido con 3 medidas delvolumen nominal que nos darn una primera aproximacin delvolumen que dispensa la pipeta. Si ste se desva bastante delesperado, procederemos al ajuste del micrmetro con laherramienta adecuada para cada pipeta (en el caso de Eppendorfse nos suministra al comprarla pero en Gilson tenemos queadquirirla) y volveremos a hacer otra tanda de 3 medidas hastaque stas ya sean ms cercanas a lo esperado. Posteriormente ydespus del cambio de punta y enjuages previos de sta al menosdos veces, realizaremos ya la calibracin propiamente dicha contandas de 10 medidas (4 mediciones sera el nmero mnimonecesario para calcular la exactitud y precisin de una pipeta) delas siguientes series de volmenes:

+ volumen nominal (mximo admitido por la pipeta)

+ volumen inferior (mnimo o 10% del nominal segnespecificaciones del fabricante)

+ volumen medio (del 50% del valor nominal)

Para cada serie de valores obtenidos pasaremos a

calcular el error sistemtico que nos dar la Exactitud


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(proximidad de la medida a su valor real) y el error aleatorio,que nos expresar la Precisin (grado de reproducibilidad de lasmedidas) de la pipeta.

Exactitud

Es posible tener datos muy consistentes aunque estnconsistentemente equivocados. La inexactitud es la diferencianumrica entre el valor medio de una serie de medidas y el valorreal. Una elevada exactitud (o pequea inexactitud) significaraque existiera poqusima diferencia entre el valor medio y el real.La exactitud se consigue con una cuidadosa calibracin de un

instrumento preciso.

Precisin

La precisin consistira en la existencia de un buengrado de reproducibilidad de las medidas realizadas. La precisinno tiene un valor numrico, se cuantifica por la imprecisin. Asuna alta precisin (o pequea imprecisin) significara que

existiese muy poca variacin entre medidas repetidas de la mismamuestra. Para conseguir un instrumento preciso se necesita unabuena tcnica de manejo.

Exacto Preciso Exacto ImprecisoPreciso Inexacto Impreciso Inexacto


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- Clculo del Error Sistemtico ( Exactitud )

Para el caso en que trabajemos con volmenes inferiores a50 l deberemos tener en cuenta los efectos de la evaporacinsustituyendo en las anteriores frmulas Xipor: Xi

. Z , donde Z esun factor de correccin dependiente de la temperatura y la presiny cuyos valores podemos obtener de la tabla de la siguientepgina ( Equivalencia: 1000 mbar = 100 kPa ).

Para poder comparar adecuadamente con los datosfacilitados por el fabricante debemos expresar los valoresobtenidos en la balanza en microlitros.


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- Clculo del Error Aleatorio ( Precisin )

Comparando los datos obtenidos con los errorestolerados para las pipetas ensayadas podemos saber si nuestraspipetas se encuentran dentro de las tolerancias especificadas porel fabricante en cuanto a Exactitud y Precisin y por tanto siguensiendo perfectamente utilizables . Lo ms conveniente es llevaruna anotacin de las calibraciones efectuadas y ponerle algnadhesivo pequeo a la pipeta que nos indique la fecha de sultima revisin o calibracin.


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Podemos ajustar una pipeta para un lquido diferente alagua pero en este caso deja de ser una pipeta de volumen variabley pasa a ser una de volumen fijo empleado en la calibracin ysolamente vlida para ese lquido, por lo que si se realiza, hay que

marcar la pipeta convenientemente para que luego no existanconfusiones. Este procedimiento no es vlido para lquidos conpresin de vapor elevada por lo que en estos casos, como se haindicado previamente, es aconsejable el empleo de una pipeta dedesplazamiento positivo o directo. De todas formas, cuando estono sea posible y para minimizar todo lo posible el error cometidosi usamos una pipeta neumtica, se recomienda saturar la cmarade aire de la pipeta aspirando y dispensando repetidamente el

solvente antes de aspirar la muestra y luego operando rpidamenteporque aunque nuestra pipeta habitualmente no gotee consoluciones acuosas s que es muy fcil que lo haga si trabajamoscon un lquido de menor densidad que sta.

Actualmente lo ms avanzado en el tema de lascalibraciones es el sistema de identificacin por radiofrecuenciaque ha sacado Rainin en que la pipeta lleva un chip con el que se

puede seguir toda la vida de cada pipeta como n de serie, fechade calibracin, usuario al que pertenece, para qu se utiliza ocualquier dato que queramos incluir.
http://es.mt.com/es/es/home/supportive_content/specific_overviews.RFID_Reader.oneColEd.html


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Existen varios fabricantes de balanzas que ofrecen ensus gamas de balanzas analticas alguna especialmente adaptadapara la calibracin de micropipetas como es el caso de lamostrada a continuacin que sirve para pipetas de hasta 1 l (tara:

22g, resolucin 1 g), tiene apertura motorizada mediante clulafotoelctrica y presenta colector de evaporacin integrado yrecipiente para residuos de 10 ml de capacidad para pipetear deforma rpida y sin interrupciones.


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