CARATULA

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS

Determinación de cipermetrina mediante cromatografía de gases en cultivos de tomate de

árbol (Solanum betaceum Cav) en la comunidad de Tababela-Pichincha - Ecuador

Autora: Ávila Ramírez Mireya Cristina

e-mail: avilamireya2ab@hotmail.com

Tesis para optar por el título profesional de

QUÍMICA DE ALIMENTOS

Tutor: Dr. Luis Iván Tapia Calvopiña, MSc.

E- mail: ivan_tapia_c@hotmail.com

Quito, Noviembre de 2015

ii

Ávila Ramírez, Mireya Cristina (2015), Determinación de

cipermetrina mediante cromatografía de gases en cultivos de tomate

de árbol (Solanum betaceum Cav) en la comunidad de Tababela-

Pichincha – Ecuador. Trabajo de Investigación para optar por el

grado de Químico de Alimentos. Carrera de Química de Alimentos.

Quito: UCE. 114 pág.

iii

Dedicatoria

Todo el crédito es para Dios, al darme la vida me dio la oportunidad de concluir esta meta y ha sido

gracias a su infinito amor que pude continuar esta carrera y así trabajar por su obra y por mi país.

A mi madre, Sra. María Erlinda Ramírez, por ser incondicional en todos los aspectos, es mi

ejemplo a seguir.

A mi padre, Sr. Melecio Draucín Ávila, que siempre confió en mis decisiones. Gracias por

apoyarme.

Todo lo que he logrado ha sido gracias a su constante amor, paciencia y lucha.

A mis hermanos Carlos, Miguel y Cristhian por su amor y alegría son mi más grande regalo y una

de mis razones más importantes…..LOS AMO.

iv

Agradecimiento

Mi más sentido agradecimiento a toda mi familia que de manera desconocida y en privado han sido

un apoyo incomparable en mi vida.

Este trabajo no hubiese sido posible sin la cooperación de personas e instituciones que han

proporcionado apoyo de manera desinteresada .Siendo así, es para mí un gran placer utilizar este

espacio para hacer llegar a ellos un justo saludo y agradecimiento.

Mi reconocimiento para la Universidad Central del Ecuador en especial a la Facultad de Ciencias

Químicas que me ha brindado una excelente formación profesional y una visión objetiva para

lograr mis metas.

Agradezco a la Dra. Blanca Estela Bravo, Dr. Marco Moran y el Dr. Alejandro Dutan por su apoyo

y confianza durante mis estudios universitarios. Por ser profesores e investigadores dedicados y

comprometidos.

De manera especial y sincera a mi tutor de Tesis; Dr. Oscar Luzuriaga, por su experiencia y su

tiempo invertido durante el desarrollo de mi proyecto en sus etapas iniciales.

Al Dr. Arturo Batidas que aceptó sin problema colaborar en esta investigación desde el papel de

tutor, sin usted la culminación de mi proyecto no habría sido posible.

A mi tribunal de tesis, los doctores; Dr. Jorge Moncayo y Dr. Wilmer Narváez, por contribuir con

sus observaciones y recomendaciones, su experiencia y su participación ha beneficiado e

enriquecido el trabajo realizado.

Al Laboratorio OSP por prestar los medios, equipos e infraestructuras para llevar a cabo las

actividades programadas durante el desarrollo de esta tesis.

De manera personal y muy afectuosa, a los doctores Dr. Geovany Garofalo y Dr. Fernando Mazón

por su amistad, ayuda y paciencia durante mi estancia en los laboratorios, estoy en deuda con

ustedes eternamente.

v

Por último con un gran cariño quiero agradecer a esas personas que siendo mis amigos se han

mantenido siempre mi lado brindándome apoyo, alegría y concejo .Al padre Henry Calderón , sor

Gertrudis y Sra. Lourdes Martínez han sido los mejores guías para mí , siempre con las palabras

precisas en el momentos más difíciles .

Al grupo Juvenil “Misioneros Reina de la Paz” ; Israel, Jorge, Danny, Fátima, Estefanía, María

Belén , Cristina, Tamara, Jean Carlos, Ariel , Oscar, Vanessa, Jasmina ,Estrellita, Aray, Diego,

Juan ,Majo, Ricardo , Edison , Misahel y especialmente a Charlie Damihan gracias a su compañía y

oraciones , cada cual a su manera hicieron de esta etapa una de las más bellas de mi vida al servicio

de Dios .

A mis amigos y amigas con las que compartí los primeros días en estas aulas; Sandy, Johnny,

Cesar, Iván, Eddy, Andre, Consu y Caro.

A mis amigas y amigos; Emily Aguirre, Isabel Carrillo, Ma. Gabriela Salazar, Alexandra García,

Valeria Reinoso, Jimena Cahuasqui, Danny Farías, Mauricio Mosquera, Jorge, Juan Ochoa y

Andrés Granda , Lorena, Vero y Nathaly que siempre estuvieron apoyándome mientras éramos

estudiantes y mientras realizábamos paralelamente nuestras tesis.

Un agradecimiento de todo corazón a mis amigos que se han mantenido conmigo hasta el día de

hoy Alfredo Moncayo, Stalin Segura, Diego Pacheco de manera muy especial a Jorge Regalado, mi

mejor amigo, tu apoyo y tu cariño son una bendición, Gracias a cada uno de ustedes porque cuando

las cosas parecían ponerse difíciles su alegría y cariño me llenaba de fuerzas para seguir adelante.

vi

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

ESCUELA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS

Yo, Mireya Cristina Ávila Ramírez en calidad de autora del trabajo de investigación o tesis realizada

sobre “Determinación de cipermetrina mediante cromatografía de gases en cultivos de tomate de

árbol (Solanum betaceum Cav) en la comunidad de Tababela-Pichincha – Ecuador”, por la

presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los

contenidos que me pertenecen o de parte de los que contienen esta obra, con fines estrictamente

académicos o de investigación.

Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización, seguirán

vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes

de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.

Quito, a 27 de Octubre del 2015

Mireya Ávila

CI: 1716418361

vii

viii

ix

Contenido

. pág.

CARATULA ....................................................................................................................................... i

Dedicatoria ........................................................................................................................................ iii

Agradecimiento .................................................................................................................................. iv

Contenido ......................................................................................................................................... viii

CAPÍTULO I ...................................................................................................................................... 1

1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 1

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................................... 1

1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ............................................................................... 3

1.3 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 3

1.3.1 Objetivo general ................................................................................................................. 3

1.3.2 Objetivos Específicos ......................................................................................................... 3

1.4 IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN ................................. 3

CAPÍTULO II .................................................................................................................................... 6

2. MARCO TEÓRICO ............................................................................................................... 6

2.1 ANTECEDENTES. ............................................................................................................ 6

2.2 EL CULTIVO DEL TOMATE DE ÁRBOL (Solanum betaceum Cav) ............................ 7

2.2.1. Clasificación botánica .............................................................................................................. 7

2.2.2. Orígenes y distribución ............................................................................................................ 8

2.2.3. Requerimientos agroecológicos ............................................................................................... 8

2.2.4. Producción en el Ecuador ........................................................................................................ 9

2.2.5. Morfología ............................................................................................................................... 9

2.2.6. Composición nutricional del tomate de árbol. ....................................................................... 10

2.2.7. Siembra y cosecha .................................................................................................................. 10

2.2.8. Control fitosanitario del tomate de árbol ............................................................................... 11

2.2.9. Restricciones en el uso de pesticidas y legislación. ............................................................... 11

2.3 GENERALIDADES DE LOS PESTICIDAS .................................................................. 12

2.3.1. Clasificación .......................................................................................................................... 12

2.3.2. Origen .................................................................................................................................... 12

2.3.3. Toxicidad ............................................................................................................................... 13

2.3.4. Naturaleza química ................................................................................................................ 13

2.3.5. Según el hospedante ............................................................................................................... 13

2.4 PESTICIDAS REPRESENTATIVOS ............................................................................. 13

x

2.4.1. Pesticidas organoclorados ...................................................................................................... 13

2.4.2. Pesticidas organofosforados ................................................................................................... 14

2.4.3. Carbamatos ............................................................................................................................ 14

2.5 PESTICIDAS EN ESTUDIO: PIRETRINAS Y PIRETROIDES ................................... 15

2.5.1. Introducción ........................................................................................................................... 15

2.5.2. Estructura ............................................................................................................................... 16

2.5.3. Clasificación de piretroides .................................................................................................... 17

2.5.4. Propiedades físico-químicas. ................................................................................................. 18

2.5.5. Toxicocinética ........................................................................................................................ 18

2.5.6. Farmacodinamia ..................................................................................................................... 18

2.5.7. Toxicidad ............................................................................................................................... 19

2.5.8. Sintomatología y tratamiento ................................................................................................. 20

2.6 CARACTERÍSTICAS DE LA CIPERMETRINA .......................................................... 20

2.6.1. Estructura química y nomenclatura ........................................................................................ 20

2.6.2. Plaguicidas en los Alimentos ................................................................................................. 21

2.7 MÉTODOS DE ANALISIS DE PESTICIDAS EN ALIMENTOS ................................ 22

2.7.1. Muestras ................................................................................................................................. 23

2.7.2. Métodos de extracción de pesticidas en alimentos ................................................................ 23

2.7.3. Extracción en fase sólida (QuEChERS) ................................................................................. 24

2.7.4. Técnicas de separación, identificación y cuantificación ........................................................ 25

2.7.5. Cromatografía de Gases ......................................................................................................... 25

2.8 VALIDACIÓN ................................................................................................................. 29

2.8.1. Importancia de validar un método ......................................................................................... 30

2.8.2. Aplicación .............................................................................................................................. 30

2.8.3. Parámetros.............................................................................................................................. 30

2.8.4. La selectividad ....................................................................................................................... 30

2.8.5. Linealidad .............................................................................................................................. 31

2.8.6. Intervalo lineal ....................................................................................................................... 32

2.8.7. Sensibilidad ............................................................................................................................ 32

2.8.8. Límites ................................................................................................................................... 33

2.8.9. Exactitud ................................................................................................................................ 34

2.8.10. Incertidumbre ................................................................................................................... 37

2.8.11. Normalización de un método ........................................................................................... 38

2.8.12. Acreditación de un laboratorio ......................................................................................... 39

xi

CAPÍTULO III ................................................................................................................................. 40

3. METODOLOGÍA ................................................................................................................ 40

3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN ........................................................................................... 40

3.2 PRIMERA FASE: validación del método para análisis de cipermetrina ......................... 40

3.3 SEGUNDA FASE Determinación de la persistencia de cipermetrina en muestras de

tomate de árbol. ................................................................................................................................ 50

3.4 TÉCNICAS E INSTRUMENTOS ANALÍTICO ............................................................ 56

3.4.1. Análisis de la muestra. ..................................................................................................... 56

3.4.1.1. Método ............................................................................................................................. 56

3.4.1.2. Método de extracción QuEChERS para la determinación de pesticidas en tomate de árbol

y su cuantificación por cromatografía de gases. ............................................................................... 56

3.4.1.3. Equipos – materiales y reactivos. ..................................................................................... 56

3.4.1.4. Preparación de la muestra ................................................................................................ 57

3.4.2. Análisis cromatografíco ................................................................................................... 57

3.4.2.1. Condiciones ...................................................................................................................... 57

3.4.3. Aplicación del método. .................................................................................................... 59

3.4.4. Diagrama de flujo general de la investigación. ................................................................ 59

CAPÍTULO IV ................................................................................................................................. 60

4. ANALISIS E INTERPRETACION DE RESULTADOS .................................................... 60

4.1 PRIMERA FASE: ............................................................................................................ 60

4.1.1. Análisis de resultados para la obtención de las curvas de calibración de cipermetrina ... 60

4.1.2. Límites de confianza ........................................................................................................ 65

4.1.3. Límite de detección (LOD) .............................................................................................. 66

4.1.4. Límite de cuantificación (LOQ) ....................................................................................... 67

4.1.5. Precisión ........................................................................................................................... 67

4.1.6. Incertidumbre. .................................................................................................................. 70

4.2 SEGUNDA FASE: ........................................................................................................... 74

4.2.1 Registro de resultados para la determinación de cipermetrina en tomate de árbol (Solanum

betaceum Cav). ................................................................................................................................. 74

4.2.2 Análisis estadístico ................................................................................................................. 75

4.2.2.1 Con respecto a los días: .................................................................................................... 75

4.2.2.2 Con respecto a las fumigaciones: ..................................................................................... 76

4.2.2.3 Con respecto a la interacción entre fumigaciones y tiempo ............................................. 77

4.2.2.4 Resultado del análisis sobre el cumplimiento del LMP para cipermetrina en tomate de

árbol 78

4.2.2.5 Cinética de degradación ................................................................................................... 79

xii

CAPÍTULO V .................................................................................................................................. 81

5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................................... 81

PRIMERA FASE ............................................................................................................................. 81

SEGUNDA FASE: ........................................................................................................................... 82

6. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 86

7. ANEXOS .............................................................................................................................. 94

xiii

Lista de tablas

Pág.

Tabla 2.1 Clasificación botánica del tomate de árbol ........................................................................ 8

Tabla 2.2 Propiedades de un adecuado grado de madurez ............................................................... 11

Tabla 2.3 Clasificación de los pesticidas según su toxicidad. .......................................................... 13

Tabla 2.4 Propiedades fisicoquímicas de cipermetrina. ................................................................... 21

Tabla 2.5 Tamaño mínimo de muestra para el ensayo, según el producto. ...................................... 23

Tabla 2.6. Técnicas de extracción de pesticidas ............................................................................... 23

Tabla 2.7 Ecuaciones para el análisis de varianza. ........................................................................... 35

Tabla 2.8. Ecuaciones para la determinación del coeficiente de repetitividad y reproducibilidad .. 36

Tabla 3.1. Relación entre el número de árboles a muestrear. ........................................................... 51

Tabla 3.2 Variables dependiente e independiente ............................................................................ 52

Tabla 3.3 Matriz de datos para el análisis de cipermetrina en tomate de árbol. ............................... 53

Tabla 3.4 Análisis de Varianza para dos factores con submuestras por grupo ................................ 54

Tabla 3.5 Ecuaciones cinéticas ......................................................................................................... 55

Tabla 3.6 Condiciones cromatografías establecidas para la cipermetrina. ....................................... 58

Tabla 4.1 Datos experimentales para la obtención de curvas de calibración de cipermetrina ......... 60

Tabla 4.2: Concentraciones obtenidas de las curvas de calibración ................................................. 63

Tabla 4.3: Valores de desviación estándar de a y b, coeficiente de determinación (r2) y error típico

(Syx) ................................................................................................................................................. 64

Tabla 4.4: Análisis de las curvas de calibración de cipermetrina..................................................... 64

Tabla 4.5: Ecuación de la curva global ............................................................................................ 65

Tabla 4.6: Valores para a y considerados para los intervalos de confianza ..................................... 65

Tabla 4.7 Limites de confianza ........................................................................................................ 66

Tabla 4.8 Límite de detección del método ....................................................................................... 66

Tabla 4.9 Límite de cuantificación del método ................................................................................ 67

Tabla 4.10 Datos experimentales para la determinación de la repetibilidad y reproducibilidad. .... 67

xiv

Tabla 4.11 Análisis ANOVA para nivel N °1 concentración 0,2 ppm............................................. 68

Tabla 4.12. Reproducibilidad (R) expresados en coeficiente de variación.. .................................... 69

Tabla 4.13. Parámetros de aceptación para el método por precisión. ............................................. 69

Tabla 4.14. Datos para el cálculo del sesgo ..................................................................................... 70

Tabla 4.15. Incertidumbre por respuesta analítica (uFR). ................................................................ 70

Tabla 4.16. Se Incertidumbre por resolución del equipo (Ur) . ........................................................ 71

Tabla 4.17. Incertidumbre por reproducibilidad (UR) ..................................................................... 71

Tabla 4.18. Incertidumbre por recuperación (U recp) ...................................................................... 71

Tabla 4.19. Incertidumbre del peso de la muestra (Upm) ................................................................ 71

Tabla 4.20. Cálculo de la incertidumbre del Patrón .......................................................... 72

Tabla 4.21 Cálculo de la incertidumbre por dilución U (FD). ......................................................... 72

Tabla 4.22 Incertidumbre balón (10, 5ml). ...................................................................................... 72

Tabla 4.23 Incertidumbre micropipeta (Umicrp). ............................................................................ 72

Tabla 4.24 Cálculo de la incertidumbre combinada (Uc) y la expandida (U) .................................. 73

Tabla 4.25. Datos obtenidos en el estudio del contenido de cipermetrina en los tomates de árbol.. 74

Tabla 4.26. Análisis de varianza para dos factores con submuestras por grupo. ............................. 75

Tabla 4.27. Pruebas de Rangos Múltiples de DMS para cipermetrina en ppm por días. ................. 76

Tabla 4.28. Pruebas de Rangos Múltiples para cipermetrina en ppm por fumigación. .................... 76

Tabla 4.29 Residuos de cipermetrina en muestras de cosecha ......................................................... 78

xv

Lista de Figuras

pág.

Figura 2.1.Porcentaje de superficie plantada y producción, según región y provincia ..................... 9

Figura 2.2. Tomate de árbol. ............................................................................................................ 10

Figura 2.3 Estructura del DDT ......................................................................................................... 14

Figura 2.4 Estructura del Paratión. ................................................................................................... 14

Figura 2.5 Estructura del IPC. .......................................................................................................... 15

Figura 2.6 Fotografía de la planta Chrysanthemum cinerariaefolium, ............................................. 15

Figura 2.7 Estructura general de los piretrinas ................................................................................. 16

Figura 2.8 Estructura general de los piretroides. .............................................................................. 17

Figura 2.9.- Identidad química de los piretroides tipo I. .................................................................. 17

Figura 2.10.- Identidad química de los piretroides tipo I.. ............................................................... 17

Figura 2.11.- Estructura de la neurona ............................................................................................. 18

Figura 2.12 El mecanismo de acción de los piretroides sobre el axón ............................................ 19

Figura 2.13 Molécula de cipermetrina. ........................................................................................... 20

Figura 2.14 Diagrama esquemático de un cromatografía de gases ................................................. 25

Figura 2.15 Esquema de in inyector para columnas empaquetadas. .............................................. 26

Figura 2.16 Espectrómetro de masas ............................................................................................... 29

Figura 2.17 Función respuesta o recta de calibrado. ....................................................................... 31

Figura 2.18 Limites del intervalo lineal .......................................................................................... 32

Figura 2.19 Intervalo lineal de un método analítico. ....................................................................... 33

Figura 3.1. Localización de parcela del cultivo de Tomate de árbol ................................................ 50

Figura 3.2 Cromatógrafo Agilent 5975C Series GC ........................................................................ 58

Figura 3.3 Determinación de cipermetrina en muestras de tomate de árbol. ................................... 59

Figura 4.1 Curva de calibración Nº1. Método cromatográfico ........................................................ 61

Figura 4.2 Curva de calibración Nº2. Método cromatográfico ........................................................ 61

xvi

Figura 4.3 Curva de calibración N3º. Método cromatográfico ........................................................ 62

Figura 4.4 Curva de calibración Nº4. Método cromatográfico ........................................................ 62

Figura 4.5 Curva de calibración Nº5. Método cromatográfico ........................................................ 63

Figura 4.6 Límites de confianza y curva global de calibración. ....................................................... 66

Figura 4.7 Comportamiento de la concentración de cipermetrina en el tiempo luego de cada

fumigación........................................................................................................................................ 74

Figura 4.8 Comparación del contenido de cipermetrina en el tiempo y el número de fumigación con

respecto a lo establecido por la INEN 1 1909 .................................................................................. 78

xvii

Lista de Ecuaciones

pág.

Ecuación 2.1 Ecuación de la recta de calibración ........................................................................... 31

Ecuación 2.2 Criterio de aceptación adecuado de los límites .......................................................... 34

Ecuación 3.1 Límite superior e inferior de la intersección (a) ......................................................... 41

Ecuación 3.2 Límite superior concentración 1 ( ............................................................... 42

Ecuación 3.3 Límite inferior concentración 1 ( ................................................................. 42

Ecuación 3.4. Límite de detección (LOD) ..................................................................................... 42

Ecuación 3.5 LODppm .................................................................................................................... 43

Ecuación 3.6 Limite de cuantificación (LOQ) ................................................................................. 43

Ecuación 3.7 LOQppm ....................................................................................................................... 43

Ecuación 3.8 Porcentaje de recuperación. ........................................................................................ 44

Ecuación 3.9 Prueba t-student .......................................................................................................... 44

Ecuación 3.10 Promedio de la desviación estándares o error tipo ( ) ........................................ 45

Ecuación 3.11 Promedio de la pendiente ( .................................................................................. 45

Ecuación 3.12 Desviación función de la respuesta analítica ( ) ................................................ 45

Ecuación 3.13 Incertidumbre FR .................................................................................................... 46

Ecuación 3.14 Incertidumbre resolución del equipo ....................................................................... 46

Ecuación 3.15 Incertidumbre estándar o de reproducibilidad .......................................................... 46

Ecuación 3.16 Incertidumbre por recuperabilidad ........................................................................... 47

Ecuación 3.17 Incertidumbre de las observaciones .......................................................................... 47

Ecuación 3.18 Incertidumbre del patrón .......................................................................................... 47

Ecuación 3.19 Incertidumbre por peso de la muestra ...................................................................... 47

Ecuación 3.20 Incertidumbre del patrón (umrc) ............................................................................. 48

Ecuación 3.21 Incertidumbre por dilución U (FD). ......................................................................... 48

xviii

Ecuación 3.22 Incertidumbre (balón) ............................................................................................... 48

Ecuación 3.23 Incertidumbre (micropipeta) ..................................................................................... 49

Ecuación 3.24 Incertidumbre ........................................................................................................... 49

Ecuación 3.25 Incertidumbre combinada estándar ........................................................................... 49

Ecuación 3.26 Valor DMS para fumigaciones ................................................................................. 55

Ecuación 3.27 Valor DMS para tiempo ........................................................................................... 55

Ecuación 4.1 Comportamiento de degradación de la cipermetrina .................................................. 79

xix

Lista de Anexos

pág.

Anexo 1 .- Norma INEN 1.1990 Para frutas frescas. Tomate de árbol. (Requisitos) ...................... 94

Anexo 2.- Residuos de plaguicidas en alimentos y piensos detalles sobre el plaguicida cipermetrina

.......................................................................................................................................................... 98

Anexo 3 . Información del cultivo de tomate de árbol y su manejo ................................................. 99

Anexo 4 . Hoja de seguridad química –cipermetrina ..................................................................... 100

Anexo 5.- Cromatógrama de cipermetrina .................................................................................... 105

xx

Lista de Siglas

IAASTD La Evaluación Internacional De Las Ciencias Y Tecnologías Agrícolas Para

El Desarrollo

CIATOX Centro de Información y Asesoramiento Toxicológico

UE Unión Europea

LMRs Límites máximos residuales.

ESPAC Encuesta de Superficie y Producción Agropecuaria Continua

dSPE Fase Sólida Dispersiva

OMS Organización Mundial de la Salud

FAO Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y Alimentación

ONG organización no gubernamental

SAICM Enfoque Estratégico para la Gestión de Productos Químicos a Nivel

Internacional

CAN Comunidad Andina de Naciones

DDT dicloro difenil tricloroetano

BHC hexachlorociclohexano

INEC El Instituto Nacional de Estadística y Censos

CORPEI Corporación de Promoción de Exportaciones e Inversiones

IICA Instituto Interamericano de Cooperación para la Agricultura

MAGAP Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca

AGROCALIDAD Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de Calidad del Agro

PAN Pesticides Action Network

INSHT Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo de España

INECC Instituto Nacional de Ecología y Cambio Climático

CEN Comité Europeo de Normalización

AOAC Association of Official Agricultural Chemists Asociación de Químicos

Analíticos Oficiales

GC Cromatografía De gases

LC Cromatografía liquida

ua unidades arbitrarias

FSOT Fused –silica open tubular

FID Detector de ionización de llama

ISO International Organization for Standardization

xxi

ICONTEC El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación

ASECAL Asesoría y Consultoría de Calidad.

LOQ límite de cuantificación

LOD límite de detección

IUPAC La Unión Internacional de Química Pura y Aplicada

OSP Oferta de Servicios y Producto

EN Comité Europeo de Normalización.

ANOVA análisis de varianza

SC suma de cuadrados

g.l grados de libertad

MC mínimos cuadrados

F F de Fisher-Snedecor

t t-student

desviación de la repetividad

variabilidad intermedia

variabilidad total

coeficiente de variación de repetibilidad

coeficiente de variación de reproducibilidad

xxii

Lugar donde se realizó la investigación

El presente tema “DETERMINACIÓN DE CIPERMETRINA MEDIANTE

CROMATOGRAFIA DE GASES EN CULTIVOS DE TOMATE DE ÁRBOL (Solanum

betaceum Cav) EN LA COMUNIDAD DE TABABELA-PICHINCHA – ECUADOR”, se

realizará en la provincia de Pichincha, Parroquia Quinche, los análisis se realizarán en la ciudad de

Quito, en las instalaciones de los laboratorios de Oferta de Servicios y Productos (OSP) Área de

Alimentos, de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, calle

Francisco Viteri s/n y Gato Sobral.

xxiii

Resumen documental

En el presente trabajo se evaluó en contenido del pesticida cipermetrina en muestras de tomate de

árbol (Solanum betaceum Cav) provenientes de una parcela de ensayo ubicada en el barrio

Tababela, Parroquia del Quinche, provincia de Pichincha.

La extracción del pesticida se realizó por la técnica de extracción en fase solida QuEChERS y

el análisis cuantitativo por cromatografía de gases (CG) acoplado a un detector de masas (MSD).

Previo a este proceso se validó el método de análisis con el fin de brindar confiabilidad a los

resultados conseguidos.

De un total de 6 cosechas investigadas 4 presentaron residuos de cipermetrina que superaron el

límite máximo permisible (LMP). Como variables de estudio se tomaron el número de

fumigaciones y el tiempo transcurrido después de estas. El análisis estadístico mostró que el

tiempo desde de la última aplicación y la cosecha, así como la frecuencia de aplicación y la

interacción entre estos dos factores influyen drásticamente en la presencia de residuos.

Tomando en cuenta los resultados obtenidos, se estudió persistencia de la cipermetrina en el

cultivo lo que brindo información sobre su cinética de degradación esto ayudo a concluir

resultados que permitirían asegurar que el control químico aplicado no adicionaría pesticida en el

producto a niveles que irrespeten la norma.

Palabras Clave:

CIPERMETRINA, PICHINCHA, PESTICIDA, QUECHERS, RESIDUOS DE PESTICIDA,

PERSISTENCIA, VALIDACIÓN.

xxiv

Document Summary

This research paper evaluated the cypermethrin pesticide in tree tomato plant samples, a variety of

local fruit (solanum betaceum cav) which came from a trial lot located in

the Tababela region Quinche sector, Pichincha Province in the country of Ecuador.

The extraction technique of the pesticide was accomplished in a solid stage QuEChERS and the

quantitative analyses was made by the process of chromatography of gases (CG) connected to a

mass detector (MSD). Previous to this process we evaluated the analyses method with the

objective to bring forward the reliability of the obtained results.

A total of six crop harvested researched, four of them showed remains of Cypermethrin which went

above the maximum limit permitted. As research variables we took the number of fumigations as

well at the time lapsed after these applications. The statistical analyses showed that the time from

the last application and the last crop harvested, the application frequency, including the interaction

between these two factors, drastically influenced in the presence of these residues.

Taking in consideration the results obtained, we studied the persistence of the cypermethrin on the

crop which gave us information over a kinetic energy degradation. This helped us to conclude the

results which will allow us to ensure that the chemical control applied will not add the pesticide on

the crop to levels which will deviate from the norm.

Key words:

CYPERMETHRIN, PICHINCHA, PESTICIDE, QUECHERS, PESTICIDE REMAINS,

PERSISTENCE, VALIDATION, KYNETIC.

xxv

“Y enseñándoles a guardar todo lo que yo os he mandado.

Y he aquí que yo estoy con vosotros todos los días

hasta el fin del mundo.”

Mateo 28,

1

CAPÍTULO I

1. INTRODUCCIÓN

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El uso de compuestos orgánicos sintéticos como los pesticidas es en la actualidad imprescindible

para satisfacer las necesidades de la industria alimentaria. Lo que se evidencia en el crecimiento de

las importaciones de agroquímicos durante los primeros cuatro meses del 2012, respecto al año

2011, aumentaron en un 6% y sumaron cerca de 70 millones de dólares, hubo un mayor dinamismo

en el mercado interno de agroquímicos en el que, por línea de productos, los fungicidas dominaron

con un 55%, seguidos de los herbicidas (25%) e insecticidas (15%), entre otros (GÓMEZ, 2012)

El uso de plaguicidas aporta muchos beneficios para la agricultura ya que mejoran el rendimiento

y la calidad de los productos agrarios, reducen la necesidad de mano de obra, además contribuyen a

limitar la erosión del suelo al reducir los cultivos de laboreo y ayudan a garantizar el suministro

fiable de una amplia variedad de productos agrícolas a precios razonables. Estos productos

constituyen como medio importante para cumplir los requisitos fitosanitarios que permiten el

comercio internacional.

Sin embargo a pesar de los beneficios que da la utilización de pesticidas, estos han generado

problemas debido principalmente a sobredosis y aplicación inadecuada; como resistencia de la

plaga, además de daños causados a especies benéficas que conduce alteraciones en el ecosistema

afectando el medio ambiente y la salud humana, dado que algunos de estos compuestos se

acumulan en la biosfera (aire, agua o suelo) y pueden entrar en la cadena alimentaria de animales,

llegando en último término a alcanzar la cadena alimenticia humana, donde varios de ellos se

acumulan en algunos órganos vitales y provocando intoxicaciones de distinta gravedad (Cardona,

Chaparro, Calderón, Peláez, & García, 2011) .

Los riesgos alcanzan a los agricultores y todas las personas que trabajan en contacto con pesticidas

llegando a los consumidores de productos agrícolas, expuestos diariamente a la ingesta de dosis

combinadas es estas sustancias presentes en los alimentos como de los tratamientos de siembra,

cosecha y pos cosecha.

El mayor costo social son las muertes y las intoxicaciones agudas y crónicas. Según La evaluación

Internacional de las ciencias y tecnologías agrícolas para el desarrollo (IAASTD) se estima que las

enfermedades transmitidas por los alimentos afectan anualmente al 30% de la población de los

2

países industrializados y son responsables de aproximadamente 2,1 millones de muertes en los

países en desarrollo. Se conocen más de 200 enfermedades transmitidas por los alimentos entre las

que se encuentran las intoxicaciones agudas y las muertes asociadas a los residuos de plaguicidas.

En Ecuador el Centro de Información y Asesoramiento Toxicológico (CIATOX) reporta que la tasa

de intoxicaciones por 100.000 habitantes subió de 14,4 en 2010 a 17,4 en 2011, en ese mismo año

el 49% de las intoxicaciones registradas –por cualquier agente– lo fueron por plaguicidas.

Un informe elaborado por investigadores de la Universidad de Río Cuarto, Córdoba, confirmó la

que la vinculación entre daño genético y cáncer es clara”, El estudio revelo que los productos más

encontrados y que provocan más daño son el glifosato, atrazina, cipermetrina, clorpirifós y

endosulfan. “En diversas investigaciones confirmamos daños genéticos en personas expuestas a

agroquímicos. (Marubanta, 2014)

Como consecuencia de esta problemática, las normativas legales respecto a su uso son cada vez

más estrictas, en particular en Estados Unidos, Canadá y países de la Unión Europea. El Comité del

Codex sobre Residuos de Plaguicidas se encarga de establecer los límites máximos residuales

(LMRs,) y en estos se basan numerosos países para el comercio internacional como es el caso de

Ecuador, en donde hace muy poco se comenzaron los estudios sobre esta problemática; sin

embargo, no existe seguimiento de la aplicación de la normativa existente.

El cultivo del tomate de árbol en Ecuador, constituye una actividad agrícola en desarrollo, según la

ESPAC para el 2013 se sembraron 4462 hectáreas; 4233 en monocultivo y 229 en asociación,

cosechándose 12.260 y 327 toneladas métricas respectivamente.

Este fruto es atacado por diversas plagas, las cuales son controladas mediante la aplicación de

productos entre ellos piretroides, carbonatos y organofosforados principalmente, solos o en

mezclas, sin existir un programa de manejo establecido. Las aplicaciones de estos productos

dependen de la presencia de las plagas según la experiencia de productores de la zona y

recomendaciones de los fabricantes de las pesticidas.

La cipermetrina es uno de los piretroides más usados para controlar una gama amplia de insectos

en campos agrícolas, invernáculos, tratamiento de poscosecha y en viviendas. (Fortin, Bouchard,

Carrier, & Dumas, 2008). El objetivo de este estudio fue documentar la presencia de cipermetrina

en un cultivo de tomate de árbol desde el día de su fumigación hasta el día de su cosecha, tiempo

en el cual se considera listo para el consumo.

3

1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

Inexistencia de estudios en cuanto al nivel residual del cipermetrina presente en tomate de árbol

Solanum betaceum Cav.

1.3 OBJETIVOS

1.3.1 Objetivo general

1.3.1.1 Determinar residuos de cipermetrina en tomate de árbol, empleando el método

QuEChERS que se basa en la extracción en Fase Sólida Dispersiva (dSPE),

seguida de cromatografía de gases , y comparar las concentraciones detectadas con

los LMRs establecidos por la norma INEN 1 909: REQUISITOS PARA FRUTAS

FRESCAS. TOMATE DE ARBOL.

1.3.2 Objetivos Específicos

1.3.2.1 Validar el método analítico para la determinación de cipermetrina en tomate de

árbol, estableciendo las condiciones de laboratorio óptimas necesarias por el

método de cromatografía de gases.

1.3.2.2 Procesar las muestras del tomate de árbol para el análisis según el método

QuEChERS.

1.3.2.3 Determinar cuantitativamente la persistencia de cipermetrina en las muestras en un

tiempo de 15 y 30 días después de cada fumigación.

1.3.2.4 Comparar los resultados de los residuos encontrados en tomates de árbol con el

límite máximo residual según el Codex Alimentarius.

1.3.2.5 Determinar la cinética de degradación para la cipermetrina en tomates de árbol.

1.4 IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN

El presente trabajo se realizó con la intención de evaluar el cumplimiento de la norma INEN 1

909:2009 REQUISITOS PARA FRUTAS FRESCAS. TOMATE DE ARBOL en una plantación

ubicada al norte de la ciudad de Quito, esta norma menciona los parámetros en cuanto al contenido

de pesticidas en la fruta para ser considerada como apta para el consumo.

Las normas INEN son documentos normativos necesarios acorde con el avance tecnológico, estos

constituyen el punto de referencia técnico-legal que garantiza orden en las actividades a

4

desarrollarse y se elaboran tomando en cuenta normas internacionales como las del Codex

Alimentario.

La Comisión del Codex Alimentarius es un organismo subsidiario de la Organización de las

Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y de la Organización Mundial de la

Salud (OMS). Actualmente estos organismos y los gobiernos además de varias ONG´s como el

Enfoque estratégico para la gestión de productos químicos a nivel internacional (SAICM ) trabajan

por mantener la vigilancia de residuos de plaguicidas en los alimentos y en el medio ambiente.

Comunidades como la Comunidad Andina de Naciones (CAN) forman comisiones para tratar este

tema y elaborar acuerdos.

En la Unión Europea se ha prohibido la aplicación pesticidas como el Fipronil, un pesticida que ha

disminuido la población de abejas se suma a otros que ya están fuera de los cultivos por la misma

causa. Investigaciones efectuadas por la Universidad Regional de los Andes mencionan a los

pesticidas como el Furadán (principio activo: carbofurano), Curacrón (profenofos) y Manzate

(mancozeb) como causantes de envenenamientos a nivel según nacional (Andrade, 2011) .

En ese mismo aspecto la cipermetrina se ha convertido en uno de los insecticidas más importantes

de uso a gran escala, tiene amplitud de usos en el algodón, los cereales, los vegetales y las frutas,

para el almacenaje de la comida, en salud pública y en la cría de los animales. Su actividad

biológica es alta y es muy estable, tóxicamente está clasificada por la Organización Mundial de la

Salud (WHO), como "moderadamente dañina" (clase II)5. (1. Leahey, 1985)

Debido al alto grado de consumo de cipermetrina se pone en evidencia un potencial riesgo para el

consumidor, según el Centro de información y Asesoramiento Toxicológico del Ministerio de

Salud Pública en Ecuador (CIATOX) , ha asesorado un total de 374 casos, lo que significa un

promedio de 65 casos mensuales en materia de intoxicaciones en el primer semestre del año 2009,

causados por sustancias químicas diversas.

Los productores de tomate de árbol se encuentran con un sin número de complicaciones entre ellas

la alta incidencia de plagas y enfermedades, sumado a la escasa asistencia técnica e inadecuados

controles fitosanitarios que conllevan bajos rendimientos y esto afecta directamente a la población

que consume ampliamente este producto

Del tomate de árbol es elaboran jugos y conservas y se la consume como fruta fresca o como

complemento de ensaladas de frutas, helados, jaleas, mermeladas, dulces y en platos de carne

(Lucas, Maggi, & Yagual, 2010).Por ello es de gran importancia la información obtenida en este

5

estudio, ya que permitirá conocer el estado real en el cual se consume este producto, y al no

registrar estudios previos en este tema servirá de base para futuras investigaciones y como

referencia para entidades pertinentes y a la sociedad en general.

6

CAPÍTULO II

2. MARCO TEÓRICO

2.1 ANTECEDENTES.

La era de los insecticidas modernos en la agricultura inicia inmediatamente después de terminada la

Segunda Guerra Mundial en donde insecticidas como el DDT (1939) y el BHC (1941) permitieron

combatir insectos vectores de enfermedades que afectaron a las tropas aliadas, rápidamente su uso

se extendió al combate de plagas agrícolas y del ganado (Cisneros, 2003).

Así se inicia el desarrollo, la producción y el uso de plaguicidas a gran escala, años más tarde su

uso se generalizó en casi todos los países del mundo. A este grupo de insecticidas clorados pronto

se unió el grupo de los fosforados; posteriormente los carbamatos y más recientemente los

piretroides estables.

Lo que no se imaginó fue que en muchos de los países en donde se dio el uso intensivo y masivo de

estos productos sintéticos se comenzará a cuestionar su eficacia y rentabilidad a corto plazo lo que

luego llevaría a prohibir y restringir la venta de muchos plaguicidas (ILA, 2006).

Habitualmente, el uso estos agentes de control deja residuos en los alimentos pero al ser aplicados

adecuadamente estos no se convierten en un riesgo para la salud. En Ecuador el mercado interno y

el de las exportaciones de tomate de árbol se rige por la norma INEN 1 909: “Requisitos para frutas

frescas. Tomate de árbol”, en esta se menciona que los residuos de plaguicidas no deben exceder

los niveles máximos establecidos en el Codex Alimentarius que es de 0.2 mg por Kg de tomate,

limite que se adoptó en el 2009.

Aunque en el país no exciten estudios acerca de los posibles efectos de los piretroides

investigaciones afines mencionan que pruebas hechas con ratones han sugerido que los piretroides

en general pueden tener un efecto de supresión inmunológica en ratas. La WHO concluye que "se

debería poner más atención a ese aspecto, pero a la fecha, no se puede formular ninguna opinión

acerca de su relevancia en la extrapolación de esta información para el ser humano.

En este aspecto cabe mencionar el reporte sobre una epidemia de ginecomastia (hinchazón del

pecho en el sexo masculino) entre los refugiados de Haití que toma en cuenta el contacto con

fenotrón, un piretroide sintético, como una posible causa para este padecimiento, de la misma

7

manera se vincula a la leucemia y al cáncer linfoide con los insecticidas piretroides, aun y cuando

sólo se encontraron índices muy bajos de actividad carcinogénica en estudios toxicológicos. Más de

20% de los casos de leucemia en mujeres y 10% en hombres estaban posiblemente ligados al

contacto con los piretroides (Pesticides News , 1995)

Una realidad más cercana es la de Colombia, en donde se realizó una investigación similar en la

que se evaluaba el nivel residual de permetrina en tomate riñón, se observó que un 96% de las

muestras presentaron residuos que superaron el límite máximo de residuos (LMR). El análisis

estadístico mostró que la frecuencia de aplicación es el factor de uso que más influye en la

presencia de residuos, así como su interacción simple con el tiempo transcurrido entre la última

aplicación y la cosecha (Farias, Gerrero, Lozano, & Piedrahita, 2004)

Sin embargo la gran mayoría de investigaciones se fundamenta en técnicas de extracción y análisis

tradicionales en donde la extracción en su mayoría utiliza solventes orgánicos con sus consabidas

particularidades. La separación y la determinación se sirven en particular de la cromatografía de

gas acoplada con una variedad de detectores específicos.

Este estudio se vale de un novedoso método de extracción denominado QuEChERS que se está

extendiendo muy rápidamente en el análisis de residuos de pesticidas para alimentos simplificando

enormemente los procedimientos analíticos volviéndolos más económicos y rápidos.

2.2 EL CULTIVO DEL TOMATE DE ÁRBOL (Solanum betaceum Cav)

Se cree que el tomate de árbol es originario de los Andes. en América del Sur es sembrado

extensamente en Colombia y Ecuador, y de manera secundaria en Perú, Chile, Bolivia, Argentina,

Brasil, Venezuela, Costa Rica, Guatemala, Jamaica, Puerto Rico y Haití. Los principales

productores de este producto son: Nueva Zelanda, Kenia, Sri Lanka, India, Colombia, Zambia y

Zimbabwe.

2.2.1. Clasificación botánica

El tomate de árbol (Solanum betaceum Cav) pertenece a la familia de las Solanáceas. Es una

especie perenne y suculenta, de hoja persistente. Ha sido descrito en tres cepas de acuerdo al color

de piel y pulpa de sus frutos: amarillo, rojo (piel roja y pulpa amarilla-naranja) y púrpura (piel roja-

púrpura y pulpa suavemente anaranjada. (Boyes & Strubi, 1997). En la tabla 2.1 tenemos la

clasificación botánica del tomate de árbol de manera completa.

8

Tabla 2.1 Clasificación botánica del tomate de árbol

Taxón Nombre

Reino

División

Subdivisión

Clase

Subclase

Orden

Familia

Género

Especie

Vegetal

Fanerógamas

Angiospermas

Dicotiledóneas

Metaclamideas

Tubiflorales

Solanaceae

Solanum

Solanum betaceum Cav

Fuente: Tomado de Bohs (1995) Transfer of Cyphomandra (Solanaceae) and Its Species to Solanum.

2.2.2. Orígenes y distribución

Se creía que era una planta procedente de la región andina, principalmente de la vertiente oriental

del Ecuador con el Perú sin embargo investigaciones recientes señalan que el tomate de árbol

cultivado está estrechamente relacionado con un complejo de materiales silvestres bolivianos de

acuerdo a evidencias moleculares, estudios morfológicos y datos de campo, por lo cual los ecotipos

cultivados se cree se originaron en esa región (Bohs y Nelson, 1979, citados por León J, et al.,

2004)

También se cultiva en las zonas montañosas de África, India y Australia. Los frutos del tomate de

árbol se han hecho tan populares que en Nueva Zelanda han desplazado al kiwi fruit, lo que

demuestra el potencial internacional de esta fruta. (Calvo I. , 2009)

2.2.3. Requerimientos agroecológicos

Es una planta de climas templados y fríos. La temperatura la óptima esta entre 16° y 19°C. La

humedad debe ser de alrededor del 70 %, razón por la cual se cultiva frecuentemente en zonas

altas entre los 1,800 a 2,200 msnm. El suelo debe ser del tipo franco arenoso con un pH entre

5,5 – 6 ,5. (García, 2008)

La distancia de siembra recomendada es de 3×3 metros, lo cual conduce a una densidad de siembra

de 1.111 árboles por hectárea (Rivera J., 2001).

La producción empieza a los ocho meses o un año después de la siembra, siendo intensa solamente

por 4 ó 5 años (5 meses /año) pudiendo durar de 10 a 12 año (Amaya & José, 2006)

9

2.2.4. Producción en el Ecuador

En el Ecuador las provincias donde se cultivan esta fruta son: Tungurahua, Carchi, Imbabura,

Pichincha, Chimborazo, Bolívar, Cañar, Azuay y Loja. Según la gráfica elaborada por la ESPAC

la mayor producción se encuentra en la región de la sierra como observamos en la figura 2.1.

.Estos datos fueron obtenidos de la Encuesta de Superficie y Producción Agropecuaria Continua,

ESPAC actualizada al 2103.

Figura 2.1.Porcentaje de superficie plantada y producción, según región y provincia

Fuente: .ESPAC ( 2013).

Ecuador se proyecta como un principal competidor, pues cuenta con condiciones adecuadas de

suelo y temperatura demás de que las organizaciones gubernamentales buscar vincularse

activamente al mercado internacional. (García, 2008)

2.2.5. Morfología

Planta arbustiva de una altura de 2 a 3 m. Las hojas son cordiformes. Las flores son de color rosa y

lavanda, agrupadas en racimos terminales, las cuales florecen de manera escalonada. Los frutos son

solitarios Y se encuentran agrupados de colores variables, del amarillo al rojo, de forma ovoidal

con ápices puntiagudos ver figura 2-2. (Calvo I. , 2009).

10

Figura 2.2. Tomate de árbol.

Fuente: CORPOICA.2010.

2.2.6. Composición nutricional del tomate de árbol.

El tomate de árbol tiene e buenas cualidades físicas, nutritivas y organolépticas (Encavalada &

Larriva, 1999) Esta fruta tiene un alto contenido de ácido ascórbico (más de 60 mg/100g) y es rico

en pectinas. Además, es una excelente fuente de vitamina A, B6 y E (Boyes & Strubi, 1997)

Los frutos de tomate de árbol son fuente excelente de provitamina A (caroteno-150 UI por 100 g),

vitamina B6, vitamina C (25 mg. por 100 g), vitamina E, e hierro. Esta especie es baja en hidratos

de carbono, una media fruta contiene menos de 40 calorías .Es rico en minerales, especialmente

calcio, hierro y fósforo; contiene niveles importantes de proteína y caroteno. Fortalece el sistema

inmunológico y la visión, además de funcionar como antioxidante. Es además una buena fuente de

pectina. (Amaya & José, 2006).

2.2.7. Siembra y cosecha

La siembra conlleva prácticas eficientes y eficaces se recopilo toda la información

correspondiente en el anexo 3.

Previo al consumo; la cosecha es una operación de mucha importancia al ser la fruta es apartada

de su fuente de alimento. Para alcanzar tiempos extendidos sin deterioro en la calidad, se deben

considerar aspectos tanto inherentes a la fruta como también aspectos logísticos que aseguren la

disminución de posibles causas de daño.

Para esta investigación en particular se estableció el cumplimiento de la Norma Técnica

Ecuatoriana INEN 1 1909:2009 Frutas Frescas Tomate de árbol. En esta norma se toma en cuenta

el carácter climatérico de la fruta, la tasa de respiración, estado sanitario y mecánico de la fruta

11

además del grado de madurez , este último cuenta con los parámetros que se mencionan en la

tabla 2.2 (García, 2008)

Tabla 2.2 Propiedades de un adecuado grado de madurez

Propiedades Rangos

Tiempo Desde la semana 23 a la 25

Peso mayor a los 120 g

Diámetro mayor a 55 mm

Longitud 65-75 mm

sólidos solubles °Brix 8 ° de a 10 °

firmeza entre 4 y 5 kgf/cm2

acidez 1.5 y 1.4

índice de madurez Entre 6 y 8. ( Según Norma )

color morado o naranja intenso con visos verdes

Fuente: Requisitos de la madurez del fruto .;INEN 1 1909.

2.2.8. Control fitosanitario del tomate de árbol

Según el Censo Nacional Agropecuario (CNA) se perdieron por estas causas 36,00 hectáreas

(ESPAC, 2013). Este cultivo responde muy bien a la aplicación de productos pesticidas y prácticas

culturales de tipo fitosanitario.

Entre las plagas y enfermedades más comunes que afectan a este cultivo se puede nombrar el

gusano trozador, pulgones, mosca blanca y la lancha. Para controlar estos factores se aplica

controles biológicos y químicos entre ellos la cipermetrina.

2.2.9. Restricciones en el uso de pesticidas y legislación.

La Constitución de la República del Ecuador es considerada como la norma de máxima jerarquía,

en ella se hace mención sobre las responsabilidades en la regulación de los plaguicidas y sustancias

químicas, en ella “se reconoce el derecho de la población a la salud y a vivir en un ambiente sano y

ecológicamente equilibrado que garantice la sustentabilidad y el buen vivir, sumakkawsay"

(Constitución De La Republica Del Ecuador, 2008)

Otro parámetro legal es la Ley Orgánica de la Salud Ecuatoriana 2008 que regula las actividades

encabezadas por el Ministerio de Salud en coordinación con el MAGAP, y más Organismos

competentes como AGROCALIDAD, dictarán e implementarán las normas de regulación para la

utilización y control de Plaguicidas, fungicidas y otras sustancias químicas de uso doméstico,

agrícola e industrial.

12

Dicha ley consta del artículo 115 que habla acerca del cumplimento de las normas y regulaciones

nacionales e internacionales para la producción, importación, exportación, comercialización, uso y

manipulación de plaguicidas, fungicidas, y otro tipo de sustancias químicas cuya inhalación,

ingestión o contacto pueda causar daño a la salud de las personas. Entre las normas nacionales se

pueden mencionar el Código de la Salud, Ley para la Prevención y Control de la Contaminación

Ambiental, Ley del Codex alimentario y las Normas Técnicas del INEN.

Las regulaciones específicas de Ecuador para tomate de árbol Solanum betaceum Cav están

regidas por la norma INEN 1 909, esta establece los requisitos que debe cumplir el producto

destinado para consumo en estado fresco acondicionado o envasado para su comercialización

dentro del territorio nacional, en su literal 6.1.3 menciona que los residuos de plaguicidas no deben

exceder los límites máximos establecidos en el Codex Alimentarius que es de 0,2 mg por

kilogramo de fruta.

Después de la cosecha, cada fruta se limpia manualmente con un paño ligeramente húmedo y se la

deja secar al aire libre. Por tener una cáscara gruesa, es una fruta relativamente resistente al tiempo

y almacenamiento. Sin embargo, si se mantiene bajo temperaturas menores a 5º C, sufrirá de daños

por enfriamiento sin refrigeración la fruta se mantiene hasta por 2 semanas, bajo atmósfera

controlada se prolonga la vida de la fruta hasta por 10 semanas (IICA, 2001).

2.3 GENERALIDADES DE LOS PESTICIDAS

Los términos pesticidas o plaguicidas son sinónimos, su única diferencia es una traducción

incorrecta de la palabra del idioma inglés al español (pesticida), ambos términos provienen de la

palabra “plaga” (Zhunaula, 2011).

Según el diccionario de la Real Academia Española el término pesticida se refiere “a algo que se

dedica a combatir plagas”. Desde un punto de vista operacional esta definición se amplía al incluir

aspectos como el control, la prevención, la atenuación y la regulación de cualquier forma de vida

animal o vegetal que afecte las plantas útiles sus productos y derivados. (Trujillo, 2006)

2.3.1. Clasificación

Los pesticidas son utilizados principalmente en el sector agrícola para el manejo de suelos, cultivos

y protección de animales y se clasifican en función de diferentes factores como:

2.3.2. Origen

Pueden clasificarse en insecticidas naturales que se elaboran a partir de plantas que contengan

metabolitos secundarios capaces de ser utilizados como agentes de control, y en plaguicidas

13

sintéticos que son el resultado de un proceso industrial de síntesis química que poseen alta

estabilidad química y de óptima producción.

2.3.3. Toxicidad

Para el año de 1987 la OMS implantó la clasificación basada en su grado de toxicidad aguda,

definida como la capacidad del plaguicida de producir daño agudo a la salud a través de una o

múltiples exposiciones, en un período de tiempo relativamente corto. (OMS, 1993). La toxicidad se

encuentra en función de la Dosis letal media como se observa en la ver tabla 2.3.

Tabla 2.3 Clasificación de los pesticidas según su toxicidad.

Categoría Definición Dosis letal 50

(oral aguda en Ratas)

I Extremadamente tóxicos 0 - 50 mg/Kg

II Altamente tóxicos 5 - 50 mg/Kg

III Medianamente tóxicos 50 - 500 mg/Kg

IV Ligeramente tóxicos Mayor de 500 mg/Kg

Fuente: Modificado de Instituto Nacional de Salud Colombia – Subdirección de Vigilancia y Control.

Intoxicación aguda por plaguicidas. Primer semestre de 2007.

2.3.4. Naturaleza química

Se basa en los diversos grupos químicos. Esta clasificación es sumamente compleja como extensa,

entre los principales están los organoclorados, organofosforados, carbamatos, piretroides y entre

otros.

2.3.5. Según el hospedante

Según el organismo sobre el cual actúa el agroquímico, se clasifica en: acaricidas fungicidas,

bactericidas, herbicidas, nematicidas, molusquicidas, rodenticidas, alguicidas, esterilizantes,

defoliantes atrayentes.

2.4 PESTICIDAS REPRESENTATIVOS

2.4.1. Pesticidas organoclorados

La importancia ambiental de los pesticidas organoclorados estriba en su persistencia ambiental y su

capacidad de dañar al hombre, razones por las cuales han sido prohibidos o severamente

restringidos en muchos países (Trujillo, 2006). Uno de los más representativos es el DDT cuyo

nombre técnico es 2,2-bis (p- clorofenil)-1 tricloroetano (ver figura 2.3).

14

Figura 2.3 Estructura del DDT

Fuente: Trujillo, 2006

Son de bajo costo y amplio espectro sus residuos se encuentran en el ambiente y en los seres vivos.

Son liposolubles, solubles en compuestos orgánicos de baja polaridad. Se acumulan en el tejido

graso y se metabolizan lentamente. Son estables química y bioquímicamente. Se caracterizan por

tener una estructura cíclica y átomos de cloro (Zhunaula, 2011).

2.4.2. Pesticidas organofosforados

Poco persistentes en el medio ambiente, son esteres orgánicos de ácidos fosforosos (ver figura 2.4)

la mayoría son líquidos de carácter lipofílico y de baja volatilidad, en general son menos estables

que los organoclorados y se rompen fácilmente por agentes químicos y biológicos, tienen un

tiempo de vida en el ambiente relativamente corta y la peligrosidad ambiental está asociada con

toxicidad aguda.

Figura 2.4 Estructura del Paratión.

Fuente: Trujillo, 2006

2.4.3. Carbamatos

Estos compuestos son amidas que tienen la tienen la formula general RHNCOOR (ver figura 2.5).

Uno de los más conocidos es el IPC o isopropil N- fenilcarbamato que se utiliza como herbicida en

el control de pastos sin afectar las cosechas de hoja ancha.

15

Figura 2.5 Estructura del IPC.

Fuente: Trujillo, 2006

2.5 PESTICIDAS EN ESTUDIO: PIRETRINAS Y PIRETROIDES

2.5.1. Introducción

Las propiedades insecticidas de las piretrinas, de las cuales se derivan los piretroides, se conocen

desde alrededor de 2 000 años en la antigua China; pero no fue hasta los años 70 y 80 del siglo XX

cuando comenzó a incrementarse el uso de estos compuestos (Cullen & F., 1999)

Figura 2.6 Fotografía de la planta Chrysanthemum cinerariaefolium,

Fuente : Pam, 2000

De las flores secas del Chrysanthemum cinerariefolium (Ver figura 2-6) se obtiene un pesticida

natural llamado pelitre, una oleorresina con 6 ingredientes activos llamados piretrinas. Estas

moléculas constan de una parte acida y otra alcohólica a la cual se pueden hallar acoplados ácidos

(R1) y cetonas (R2).

La estructura general de las piretrinas así como las cadenas laterales (r1, r2) se muestran en la

figura 2.7.

16

Figura 2.7 Estructura general de los piretrinas

Fuente: González Machín, 2003

Nota: R1 y R2 son ácidos o cetonas.

Las piretrinas individuales son piretrina I, piretrina II, jasmolina I, jasmolina II, cinerina I y

cinerina II , que resultan de la combinación de dos ácidos (crisantemico y pirétrico) y tres cetonas,

piretrolona, cinerolona y jasmolona, derivadas de la ciclopentanona, con pequeñas diferencias de

cadena lateral. (Juan, Picó, & Font, 2003)

Uno de los principales inconvenientes es su inestabilidad en la luz y al aire, esto limita su

efectividad si se refiere a efectos en su residualidad. Así en los esfuerzos por incrementar su

fotoestabilidad, manteniendo la actividad insecticida y la baja toxicidad, se provocó el desarrollo de

los piretroides. Estos se producen partiendo de la sustitución secuencial de los elementos

estructurales de las piretrinas.

Actualmente, uno de los piretroides más usados es la cipermetrina, insecticida sintetizado en 1974 e

introducido al mercado en 1977. Según la OMS está clasificado como “moderadamente peligroso”

(clase II); sin embargo, estudios recientes muestran que los efectos de la cipermetrina y de los

piretroides en la salud pueden ser más severos de lo que indican evaluaciones toxicológicas previas

(Jiménez, Quilodrán, & Miranda, 2008).

2.5.2. Estructura

Generalmente los piretroides se consideran como ésteres sintéticos derivados de las piretrinas,

aunque también hay un grupo de éteres oxima (ver figura 2.8) que exhiben una actividad

insecticida similar a la de las piretrinas y los ésteres piretroides, pero se dispone de escasos datos

acerca de estos compuestos y no se han elaborado productos comerciales de los mismos (ATSDR,

2003) Se clasifican según su química y su actividad en dos grupos: Tipo I y Tipo II. (Fernández,

2009).

17

Figura 2.8 Estructura general de los piretroides.

Fuente: Modificado de (Loayza, 2007)

2.5.3. Clasificación de piretroides

Tipo I.- Carentes de grupo α - ciano en su molécula. En la figura 2.9 se incluye un ejemplo de la

estructura química de los piretroides tipo I, su nombre común, su número y nombre CAS.

El número de registro CAS es una base de datos elaborada por la American Chemical Society,

otorga una identificación numérica única para compuestos químicos, secuencias biológicas,

preparados y aleaciones.

Nombre

común

[nº CAS]

Nombre CAS

Estructura química

Aletrina

[584-79-2]

2-metil-4-oxo-3-(2-propen-1-il)-2-ciclopenten-1-il éster del

ácido2,2-dimetil-3-(2-metil-1-propen-

il)ciclopropanocarboxílico

Figura 2.9.- Identidad química de los piretroides tipo I.

Fuente: (Fernández, 2009)

Tipo II.- Poseen el grupo α - ciano en su molécula .En la figura 2.10 se incluye un ejemplo de la

estructura química de los piretroides tipo I I, su nombre común , su número y nombre CAS.

Nombre

común

[nº CAS]

Nombre CAS

Estructura química

Cifenotrina

[39515-40-7]

ciano(3-fenoxifenil)metil éster del ácido 2,2-

dimetil-3-(2-metil-1-propen-1-

il)ciclopropanocarboxílico

Figura 2.10.- Identidad química de los piretroides tipo I..

Fuente: (Fernández, 2009)

18

2.5.4. Propiedades físico-químicas.

Dentro de las características (Junquera, 2013) se pueden destacar que:

Son insecticidas sintéticos

Se disuelven mejor en agua

Su fórmula química modificada para mejorar la estabilidad

Son más persistentes. poseen bajas presiones de vapor

Se hidrolizan por álcalis

En las formulaciones se utilizan derivados del petróleo como disolventes.

2.5.5. Toxicocinética

Son absorbidos en un 40 a 60 % de la dosis de exposición por vía oral ,y por vía dérmica es

absorbida menos del 2 %. Son de naturaleza lipófilica por lo que se distribuyen a los tejidos

grasos, como los tejidos nerviosos central y periférico, además del hígado y el riñón. En estos

tejidos se secretan las enzima llamadas oxidadas de función mixta que producen una la hidrólisis

del enlace central éster, la oxidación de varios sitios, y reacciones con glicina, sulfato, glucurónido,

o conjugados de glucósido para originar metabolitos solubles en agua que se eliminan fácilmente

(Mahecha, 2013).

Los piretroides muestran una cinética de primer orden de eliminación, con la mayoría eliminado

entre las 12 a 48 horas. Las rutas principales de excreción son la orina y las heces en una mezcla

de compuesto original y metabolito.

2.5.6. Farmacodinamia

Son neurotóxicos que se adhieren a la membrana de las células nerviosas (ver figura 2.11)

llamadas neuronas y principalmente a nivel del axón, que es una prolongación de estas. El axón se

especializa en conducir el impulso nervioso entre neuronas.

. Figura 2.11.- Estructura de la neurona

Fuente: Fernández, 2009

.

19

Los piretroides se introducen en la membrana ocasionando que los canales de Na+

se mantengan

abiertos permanentemente, esto provoca una transmisión del impulso nervioso permanente. Este

efecto es más intenso con los piretroides con grupo “ciano”. El mecanismo de acción de los

piretroides sobre el axón se observa en la figura 2.12.

Figura 2.12 El mecanismo de acción de los piretroides sobre el axón

Elaborado por: Mireya Ávila (2015).

Los efectos se diferencian entre piretrinas y piretroides tipo I y tipo II , estas últimas son más

potentes al inducir al canal de Na+ por más tiempo, lo que conlleva un mayor grado de potencial

de membrana en reposo y dan lugar a un importante bloqueo final de la conducción nerviosa.

2.5.7. Toxicidad

La toxicidad de los piretroides es mayor que la de las piretrinas (la DL5s del deltametrín en ratas es

de 80 mg/kg). Se hallan dentro de los grupos de plaguicidas Categoría Toxicológica III y IV.

(SESVER, 2012).

La baja toxicidad en los mamíferos de estos compuestos en comparación con los insectos se debe

a diversas causas (Mahecha, 2013).

Los piretroides son más potentes en el canal de sodio a baja temperatura que a alta

temperatura(Los insectos poseen alrededor de 25 ° C y los mamíferos a 37 ° C).

Los canales de sodio de mamíferos son al menos 1.000 veces menos sensible a los

piretroides que los canales de los insectos, haciendo que estos se recuperen más

rápidamente de la despolarización.

20

El Tamaño corporal, los mamíferos son mucho más propensos a desintoxicar piretroides

antes de que alcancen su sitio de acción a diferencia de insectos.

2.5.8. Sintomatología y tratamiento

Las piretroides del tipo I y II presentan diferente sintomatología (Bonne Hernadez, Peréz Infante,

Rojas Vasques, & Marín Sánchez, 2003):

Tipo I: desarrollan el síndrome “T”, reflejo de hiperexcitabilidad y temblores,

excitabilidad del sistema nervioso central o convulsiones.

Tipo II: como la cipermetrina, producen salivación, hiperexcitabilidad, coreoatetosis

(estado caracterizado por movimientos coreicos y atetóticos), además de ser

sensibilizantes, lo cual se conoce como el síndrome “CS”.

2.6 CARACTERÍSTICAS DE LA CIPERMETRINA

La cipermetrina pertenece al grupo de los piretroides sintéticos que posees el grupo -ciano.

2.6.1. Estructura química y nomenclatura

Su nombre ISO es Cipermetrina, comprende un compuesto racémico de ocho estereoisómeros,

donde las relaciones de isómeros cis-trans varían de 50:50 a 40:60.

En análisis cromatográfico se asocia fragmentación junto al grupo ciano, también se abserva

la relación de iones característica de moléculas conteniendo cloro (m/z=206,5; m/z=208,5),

por la abundancia isotópica 35Cl/37Cl presente en la naturaleza

En la Figura 2.13 se presenta la molécula general de cipermetrina.

Figura 2.13 Molécula de cipermetrina.

Fuente: Álvarez ,2009

Según los datos recopilados de la tesis doctoral realizada por Marino Damián en marzo de 2009, las

Fichas Internacionales de Seguridad Química del INSHT, el INECC además de la hoja de

21

seguridad de los productos de PROFICOL fabricante y distribuidor de RAMBLER (ver anexo 4)

producto utilizado en esta investigación se resumió la siguiente información en la tabla 2.4.

(INSHT, 2012). (Proficol, 2011), (INECC, 2013)

Tabla 2.4 Propiedades fisicoquímicas de cipermetrina.

Propiedad

Valor

Nombre IUPAC

Carboxilato de RS-9-alfa-ciano-3-fenoxibenzil

(1RS)cis-trans-3-(2,2-diclorovinil)-2,2- dimetil-

ciclopropano

Estado físico Líquido

Color Ambar

Olor Solvente

Formula Molecular C22H19O3NCl2

Peso Molecular 416,3

Densidad ≈ 0.944 gr/l

Solubilidad en agua (200°C) 4 ppb (μg/litro) Forma una emulsión

Presión de agua (200°C) 1,3x10-9

mmHg

Coeficiente de partición octanol- agua (Kow)° 3,98x106

Categoría toxicológica Clase III Medianamente tóxico

Fuente: Modificado de ficha técnica de cipermetrina (Proficol, 2011)

Es especialmente tóxica en el caso de especies acuáticas las concentraciones letales del medio que

afectan al 50% de la población (CL50), como por ejemplo las truchas, caen al orden de la ppb

(1ppb=0,001ppm=μg/litro). Para los peces, mientras para especies terrestres como ratas los

valores de dosis letales que afectan al 50% de la población (DL50, patos o pollos los valores están

en el orden porcentual (10.000ppm =1%) (Siegfried, 1993)

2.6.2. Plaguicidas en los Alimentos

Los pesticidas en los alimentos se encuentran normados por el Límite Máximo Permitido (LMP),

conocido también como Límite Máximo Residual (LMR), estas sustancias se presentan como

consecuencias del uso de estos en su cadena de producción. Incluye cualquier tipo de compuesto

derivado como producto de conversión, degradación y reacción, metabolitos e impurezas que

pueden ser consideradas tóxicamente significativas (Trujillo, 2006).

22

Los residuos de plaguicidas que contienen los alimentos varían según la dosis aplicadas, la

naturaleza del plaguicida, morfología y naturaleza de la superficie vegetal, naturaleza de la

formulación, características de la aplicación y condiciones climáticas (Zamora, 2004)

Según la Organización Mundial de la Salud la cipermetrina, está clasificada como moderadamente

peligroso (clase II); sin embargo, estudios recientes muestran que los efectos de los piretroides en

la salud pueden ser más severos de lo que indican evaluaciones toxicológicas previas (Jiménez,

Quilodrán, Miranda, & Rodríguez, 2008)

Con la cipermetrina se presentan los típicos problemas de la aplicación de pesticidas, por ejemplo

se encuentra en los pastos donde se observa el aumento en las dosis y las aplicaciones a frecuencias

innecesarias, así como la utilización incorrecta de las formulaciones, lo que convierte a estas

sustancias en un riesgo potencial para la salud humana (Loaiza, 2003). Se sabe por investigaciones

que se ha encontrado residuos de 0,2 ppm a los 21 dias despues de la aplicación en lechugas y

según (Colange & et, 2002) demostrando una cinetica de primer grado .

El límite máximo permitido (LMP) para la cipermetrina es 0,2 ppm y esta normado por el codex

alimentario ver anexo 2.

2.7 MÉTODOS DE ANALISIS DE PESTICIDAS EN ALIMENTOS

Los métodos de análisis de residuos deberán proporcionar una precisión y exactitud adecuadas

siendo a la vez rápidos y simples de manera que proporcione resultados fiables para el análisis de

alimentos complejos en un tiempo razonable. (Juan, Picó, & Font, 2003)

La preparación de la muestra es el paso más complejo en la determinación de residuos,

representando más de 50% del tiempo del análisis. Este proceso se compone de extracción de los

plaguicidas desde la matriz y purificación del extracto (Seiber, 1999).

La selección del método depende de la naturaleza del pesticida estudiado, sin embargo una gran

mayoría de procedimientos se fundamenta en las técnicas cromatografías, en particular la

cromatografía de gases acoplada con una variedad de detectores. (Trujillo, 2006)

En las siguientes secciones se describen los procesos de extracción y los métodos de separación e

identificación de residuos de pesticidas en diversas matrices alimentarias.

23

2.7.1. Muestras

El procedimiento se aplica a muestras de tomate de árbol, las mismas que fueron recogidas al azar

cubiertas con papel aluminio en cajas térmicas o “coolers” diferentes y debidamente rotulados, el

tamaño mínimo necesario se indica en la tabla 2.5, valor del cual se tomará 20 gr para el análisis.

Tabla 2.5 Tamaño mínimo de muestra para el ensayo, según el producto.

Tamaños y

formas

Nombre Tamaño mínimo de cada

muestra para el ensayo Vulgar Científico

Frutas medianas

Tomate de

árbol

Familia :solanáceae

Género: Cyphomandra

Especia : Betaceae Sendt

2kg

Fuente: Modificado de INEN 1 1909:2009

2.7.2. Métodos de extracción de pesticidas en alimentos

Debido a que los pesticidas se encuentran en los alimentos en concentraciones mínimas y las

muestras son complejas, es imprescindible someterlas a un proceso en el cual se obtengan

fracciones concentradas con los compuestos de interés y libres de sustancias como lípidos

proteínas, carbohidratos y pigmentos, que pueden causar interferencia.

Fácilmente puede deducirse que la etapa determinante del análisis lo constituye la extracción esta

debe ser selectiva basada en las diferentes características de la matriz además de las propiedades

químicas y físicas del analíto como: peso molecular, carga, solubilidad, polaridad, volatilidad. En la

tabla 2.6 se mencionan las técnicas de extracción más utilizadas en el análisis cromatográfico

Tabla 2.6. Técnicas de extracción de pesticidas

Técnica de

Extracción Disolvente

Pasos de

Limpieza

QuEChERS

Acetonitrilo

Acetato de Etilo

Extracción

dispersiva en

fase sólida

Sólido - Líquido

Acetonitrilo

Diclorometano

Acetona

Extracción

dispersiva en

fase sólida

24

Tabla 2.6 Técnicas de Extracción de pesticidas. Continuación

Técnica de

Extracción Disolvente

Pasos de

Limpieza

Fluidos

Supercríticos

CO2 ---

Asistida en

microondas

---

Micro

extracción en

fase sólida

Fuente: Modificado de determinación de pesticidas en vegetales mediante cromatografía de gases-

espectrometría de masa/masa (GC-MS/MS) Ramírez L. , 2009

2.7.3. Extracción en fase sólida (QuEChERS)

La determinación de pesticidas en frutas y vegetales ha sido simplificada mediante el método de

preparación de muestras, QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe).

Actualmente se emplean de manera habitual dos métodos tamponados:

1. Norma Europea (EN) disponible a través de los distintos países miembros del Comité

Europeo de Normalización (CEN).

2. Un estándar reconocido por la asociación de comunidades analíticas (AOAC 2007.01) que

se emplea en los Estados Unidos y otros países.

El método según la norma europea se realiza en dos etapas: la preparación y la extracción, en esta

última se homogeneiza con el solvente de extracción. Se añaden sales, ácidos, tampones para

mejorar le eficacia de la extracción y proteger compuestos sensibles, se pueden añadir estándares

de fortificación o patrones internos para comprobar la eficiencia de la extracción.

Le sigue la limpieza de la muestra, una alícuota del extracto se limpia mediante extracción en fase

sólida dispersiva (dSPE). Se preparan unos tubos de polipropileno de centrífuga con cantidades

precisas de MgSO4 y solventes de extracción en fase sólida para eliminar el exceso de agua y

contaminantes no deseados de las muestras, de tratarse de alimentos que contengan altos niveles de

pigmentos y esteroles se utiliza además C18 para eliminar estos compuestos del disolvente de

extracción. Se transfiere la muestra a un vial para inyector y se analiza por GC o LC.

Este método se está extendiendo tan rápidamente, presenta también una gran ventaja ambiental

pues disminuye sustancialmente el consumo de solventes orgánicos y acorta los tiempos de

preparación de la muestra lo, esto simplifica enormemente el procedimiento de extracción y

purificación de residuos de pesticidas volviéndolo efectivo y económico además de ser u producto

fiable en un formato cómodo.

25

2.7.4. Técnicas de separación, identificación y cuantificación

Una vez obtenido el extracto orgánico, la mezcla de pesticidas se separa analiza mediante métodos

clásicos como gravimétricos y volumetría, además de métodos instrumentales como espectrometría

y diversas formas de cromatografía. La identificación y cuantificación de los pesticidas se realiza

con detectores selectivos que se encuentran acoplados al equipo. Las técnicas cromatografías

permiten una aproximación eficiente en el análisis. (Rubinson & Rubinson, 2001)

2.7.5. Cromatografía de Gases

La cromatografía de gases es de las técnicas analíticas de separación que ha experimentado un

desarrollo espectacular desde sus inicios en los años cincuenta. En esta se hace pasar un analíto en

forma gaseosa a través de la columna, arrastrado por una fase móvil gaseosa, llamada gas portador.

En cromatografía gas líquido de reparto la fase estacionaria es un líquido no volátil que recubre la

pared interior de una columna o un soporte sólido. En gas -solido de adsorción el analíto se adsorbe

directamente sobre las partículas sólidas de la fase estacionaria. (Harris, 2003)

Figura 2.14 Diagrama esquemático de un cromatografía de gases

Fuente Requena, y otros, 2015

En la figura 2.14, se muestra un diagrama esquemático de un equipo de cromatografía de gases.

Para el análisis de la muestra de un líquido volátil o de un gas se inyecta a través de un septo en un

inyector caliente, en cuyo interior se evapora rápidamente. El vapor es arrastrado a través de la

columna por el gas portador que puede ser helio, hidrógeno o nitrógeno los analítos se separan de

acuerdo a su afinidad entre la fase estacionaria y la móvil, después de esta separación llegan al

detector, cuya respuesta aparece en la pantalla de ordenador.

26

La columna y el detector deben estar lo suficiente calientes para que los analítos alcances en la

columna la presión necesaria y se produzca una elución adecuada y en los detectores se encuentren

en forma gaseosa.

Sistema de inyección de la muestra

La eficacia de la columna demanda un volumen adecuado de muestra. La inyección de muestras

de volúmenes grandes conlleva un ensanchamiento de las bandas y una inadecuada resolución.

En la figura 2-15 muestra un modelo de cámara de inyección para columnas empaquetadas.

.

Figura 2.15 Esquema de in inyector para columnas empaquetadas.

Fuente :Requena, y otros, 2015

El uso de micro jeringas para la inyección de muestras a través del septum es el método más eficaz.

La muestra se traslada a una cámara de vaporización instantánea ubicada en la cabeza de la

columna.

Gas portador

El gas portador tiene la función de trasladar el analíto por la fase estacionaria, debe ser

químicamente inerte además de no reaccionar con los analítos en estudio ni con la fase

estacionaria de la columna, frecuentemente se utiliza el helio, el nitrógeno y el hidrógeno. La

elección del gas portador queda establecida por el tipo de detector a utilizar y por la eficiencia de

la separación. Siendo así el hidrógeno al tener la más baja viscosidad de todos los gases

proporciona una mejor movilidad originando tiempos de análisis cortos, sin embargo es el helio el

que suministra en la mayoría de los análisis las mejores resoluciones por ello es el más usado.

La pureza es otro limitante en la elección del gas portador. Los hidrocarburos originan ruido en

análisis reduciendo la sensibilidad y los límites de detección de la separación, las trazas de agua y

el oxígeno suelen dañar la fase estacionaria en la columna. Es importante la correcta adaptación

27

de materiales necesarios para la incorporación de los gases al cromatógrafo (reguladores de

presión, manómetros y caudalímetros). (MNCN, 2015)

Columnas:

Las columnas del GC se encuentran dentro de un horno de temperatura controlada. Por lo general,

un extremo de la columna está unido al inyector y el otro extremo está unido al detector. Las

columnas varían en longitud, diámetro y recubrimiento interno. (Trujillo, 2006) Cada columna está

diseñada para su uso con diferentes compuestos por una fase estacionaria y de acuerdo a como

está se encuentra dentro del su envase contenedor se clasifica en:

Columnas empacadas: tienen de dos a tres metros de largo con un diámetro de 2 a 4 mm,

se enrollan en espiral y se instalan dentro de un horno termostatizado. La fase empacada

puede ser de dos clases :sólida, como la sílice gel y, líquida que va adherida a un soporte

inerte que no intervine en la separación , así cuando la muestra es polar y la carga de fase

liquida es baja , se debe desactivar completamente .

Columnas capilares o tubulares abiertas: estas columnas contienen la fase estacionaria

adherida a las paredes de un tubo dejando abierto el centro de la columna. Actualmente

las más usadas son el tipo FSOT estas columnas se preparan cuidadosamente y requieren

tratamientos de superficie para mejorar su desempeño.

El propósito de la columna y del horno es separar la muestra inyectada en sus compuestos

individuales a medida que pasa por la columna. Para contribuir a este proceso, el horno del GC.

Puede programarse para acelerar el flujo de la muestra a través de la columna (Trujillo, 2006).

Detectores:

Los detectores identifican la presencia de compuestos cuando éstos salen de la columna. A medida

que cada uno de los compuestos entra en el detector, se genera una señal eléctrica proporcional a la

cantidad de compuesto detectada. Esta señal se envía normalmente a un sistema de análisis de

datos, como ChemStation de Agilent, donde aparece como pico de un cronograma. El GC 7890A

de Agilent llevo un detector MS de cuadrupolo triple y ICP-MS).

El requisito fundamental de un detector para CG es que su perfil de repuesta electrónica coincida

con el perfil de concentración del analíto a la salida de la columna. Teóricamente el

funcionamiento del detector no debe afectar el número de platos, los tiempos de retención ni las

características del flujo. Dependiendo del uso que brinde (Trujillo, 2006) cada detector, se tiene la

siguiente clasificación:

28

Detector de ionización de llama FID: funciona a partir de una llama de aire e hidrógeno

que descompone las moléculas orgánicas produciendo iones que son atraídos hacia un electrodo

cargado dando como resultado una corriente eléctrica.

Detector de captura de electrones: se manipula casi de la misma forma que un contador

proporcional para la medida de radiación X. El efluente de la columna pasa por un emisor β. Un

electrón del emisor provoca la ionización del gas portador y la producción de una ráfaga de

electrones de esto resulta una corriente constante entre un par de electrodos y esta señal se registra

Detector de nitrógeno y fosforo o detector de emisión termoiónica: utiliza una boquilla y

un colector semejante a los del FID, sin embargo el colector contiene una pequeña cerámica

recubierta con sal alcalina colocada encima de la boquilla y calentada eléctricamente entre 600 y

800 °C .

Detector de fotométrico de llama (FPD):s detector específico para azufre y fosforo dado

que aquellos hidrocarburos que contienen estos elementos producen una especie

quimioluminiscente en un quemador similar al FID.

Conductor de conductividad eléctrica: funciona con base en el aumento de conductividad

eléctrica en el agua desionizada , causada por electrolitos como NH3, HCl o H2S que son generados

a partir de los analítos orgánicos originales.

Detector de fotoionización (PID): basa su funcionamiento en la ionización de los

componentes de la muestra por medio de una lámpara UV. Las partículas cargadas resultantes se

detectan entre dos electrones con un potencial entre 50 y 200 V.

Detector de emisión atómica (AED): permite la detección de cierto tipo de elementos con

base en la radiación emitida por estos al regresar a su estado fundamental de energía después de

haber sido excitados apropiadamente.

Espectrómetro de masas (MSD): es considerado como un excelente detector, permite

registrar los espectros de masas de los picos a medida que emergen de la columna. En el

espectrofotómetro de masas de sector magnético, las moléculas vaporadas se bombardean con

electrones rompiendo enlaces y produciendo la ionización de la molécula. La clase y cantidad de

los fragmentos obtenidos son características de cada compuesto.

29

En la figura 2.16 tenemos un diagrama de un espectrómetro de masas.

Figura 2.16 Espectrómetro de masas

Fuente :Gómez,Santiago; Sierra , María Isabel, 2010

A continuación, los fragmentos con carga positiva se aceleran por medio de un campo magnético

en una trayectoria curva cuyo radio depende de la raíz cuadrada de las masas iónicas. Al cambiar

el campo magnético se logra que los iones de igual relación masa / carga lleguen sucesivamente al

colector donde los iones se descargan produciendo una corriente que depende de la abundancia de

los iones. Al registrar estas corrientes se obtiene el espectro de masas correspondiente al compuesto

que género iones.

2.8 VALIDACIÓN

Según la norma ISO 17025 que tiene por título Requisitos generales para la competencia de los

laboratorios de ensayo y calibración, define a la validación como “ la confirmación, a través del

examen y el aporte de evidencia objetiva de que se cumplen los requisitos particulares para un uso

específico”.

El alcance de la validación o la revalidación requerida dependerá de la naturaleza de los cambios

hechos al aplicar un método a diferentes laboratorios, instrumentación, operadores y circunstancias

en las cuales el método va a ser utilizado. Siempre es apropiado algún grado de validación, aun

cuando se usan métodos aparentemente bien caracterizados ya sean de referencia o publicados.

30

Está implícito que los estudios para determinar los parámetros de aptitud del método se hacen

usando equipamiento que funciona y que está calibrado correctamente, y contando con operadores

competentes en el campo de trabajo y que posean el conocimiento suficiente.

2.8.1. Importancia de validar un método

Es importante validar un método por cuanto esto permite a cualquier entidad asegurar los

resultados que emite a la vez que se brinda al analista datos acerca de un método, sin contar con el

hecho de que este procedimiento es una obligación profesional, hoy en día todo cliente espera

confiar en los resultados analíticos.

2.8.2. Aplicación

Un método debe validarse cuando sea necesario verificar que sus parámetros de desempeño son

adecuados para el uso en un problema analítico específico.

El laboratorio deberá validar: (ICONTEC, 2005)

métodos no estandarizados

métodos diseñados o desarrollados internamente

métodos estandarizados usados fuera del alcance propuesto

ampliaciones o modificaciones de métodos estandarizados

cuando se realizan algunos cambios en los métodos no estandarizados ya validados.

2.8.3. Parámetros

Para demostrar que un método es adecuado para la aplicación es preciso determinar algunos

parámetros, estos difieren según el alcance del método de ensayo a validar. Los ensayos o

mediciones realizadas (ASECAL, 2005) serán con el fin de poder realizar las siguientes pruebas de:

Selectividad

Linealidad

Sensibilidad

Limites

Precisión

Robustez

Aplicabilidad

2.8.4. La selectividad

La selectividad (ASECAL, 2005) es el “grado en que un método puede cuantificar o cualificar al

analíto en presencia de interferentes”. Estos interferentes normal o frecuentemente se encuentran en

la matriz de interés.

.

31

Una prueba de selectividad comúnmente utilizada, consiste en analizar un mínimo de tres testigos

, tres blancos de matriz y tres muestras o estándares de concentración conocida del analíto de

interés. Se deben comparar las lecturas (señales de medición) obtenidas para cada caso, y observar

si existen variaciones entre los testigos reactivos, blancos de matrices y estándares o muestras con

analíto.

2.8.5. Linealidad

La linealidad es la capacidad de un método dentro de un determinado intervalo, de dar resultados

instrumentales que sean proporcionales a la cantidad del analíto que se habrá de determinar en la

muestra de laboratorio.

Figura 2.17 Función respuesta o recta de calibrado.

El rango lineal se puede realizar mediante un gráfico de concentración versus respuesta función

respuesta o curva de calibración (figura 2.17) Se establece cada día con una cantidad de

valores formados por un blanco y los patrones de trabajos limpios de valor teórico conocido, que

cubran el intervalo de trabajo. Se recomienda incluir valores cercanos al cero y valores superiores

al valor de interés. El número de puntos a analizar deberá ser establecido por el analista, se deben

evaluar los estimadores de regresión lineal del gráfico es decir la pendiente (b), el coeficiente de

correlación (r) y el punto de corte (intercepto) con el eje de las Y (a), según la ecuación 2.1

Ecuación 2.1 Ecuación de la recta de calibración

𝑦 = 𝑏𝑥 + 𝑎

32

Dónde:

y respuesta

x concentración

b pendiente de la curva

a intersección con el eje, cuando x=0

rcoeficiente de correlación

r2 coeficiente de determinación

El valor de los coeficientes de correlación es muy importante debe ser igual o mayor a 0.999, esto

indica que existe una relación lineal entre áreas de los picos y la concentración de cipermetrina.

(ISPCH, 2010). Se efectúa la evaluación estadística de prueba t-student, como un indicador del

modelo lineal en donde se espera que exista correlación significativa entre concentración vs señal.

2.8.6. Intervalo lineal

Se ilustra en la figura 2-18 la definición del intervalo lineal de un método analítico, que va desde la

concentración más pequeña a la que se puede realizar medidas cuantitativas (límite de

cuantificación, LOQ) hasta la concentración en la que la curva de calibrado se desvía de la

linealidad (límite de linealidad, LOL).

LOQ= límite de cuantificación,

LOL = límite de linealidad.

Figura 2.18 Limites del intervalo lineal

Fuente: Skoog, Douglas. 2001.

2.8.7. Sensibilidad

La sensibilidad (ISPCH, 2010) es el cociente entre el cambio en la indicación de un sistema de

medición y el cambio en el valor de la cantidad objeto de la medición.

33

En una regresión lineal la sensibilidad corresponde a la pendiente (b) de la recta de calibración.

Figura 2.19 Intervalo lineal de un método analítico.

Fuente: Skoog, Douglas. 2001.

El valor de sensibilidad obtenido [m] debe permitir una adecuada discriminación de los valores de

concentración en base a la lectura.

En figura 2.19, se puede observar que mientras más próxima al eje de las Y este la recta, significa

que a ligeros cambios en las concentraciones esperadas habrá grandes variaciones en los resultados

de las lecturas observadas [m2] En el caso de [m3] grandes cambios en la concentración no son

significativos para la lectura.

Se dice, que un método es sensible cuando una pequeña variación de concentración determina una

gran variación de respuesta. La sensibilidad permite observar la capacidad de respuesta

instrumental frente a una determinada cantidad de analíto. En el tiempo, visualiza cómo se

comporta el instrumento.

2.8.8. Límites

Límite de detección (LOD): cuando se realizan mediciones a niveles bajos del analíto o de la

propiedad relacionada, como en el análisis de trazas, es importante saber cuál es la concentración

más baja del analíto o el valor de su propiedad relacionada, que puede detectarse confiablemente

por el método. La importancia de determinar esto y los problemas implícitos, surgen del hecho que

la probabilidad de detección no cambia repentinamente de cero a la unidad cuando se cruza un

umbral. Los problemas han sido investigados estadísticamente con detalle y se ha propuesto una

gama de criterios de decisión. Surgen confusiones adicionales debido a que no existe actualmente

34

un acuerdo universal sobre la terminología aplicada “valor mínimo detectable de la variable de

estado definida” el cual en química se traduce como “concentración neta mínima detectable”. La

IUPAC es cautelosa en el uso de “límite de detección” prefiriendo “valor (verdadero) mínimo

detectable”. (Eurachem, 2005).

Límite de cuantificación (LOQ): el límite de cuantificación se define como la magnitud mínima

que puede estimarse con un nivel aceptable de exactitud.

2.8.9. Exactitud

El manual del Codex Alimentarius define la exactitud como el “grado de concordancia entre el

resultado de un ensayo y el valor de referencia”.

Un criterio de aceptación adecuado de los límites es se expresa en la ecuación 2.2, donde LPM es

límite máximo permisible (ISPCH, 2010)

Ecuación 2.2 Criterio de aceptación adecuado de los límites

Cuando se aplica a un método de ensayo, el término “exactitud” se refiere a una combinación de:

precisión y veracidad.

Precisión

La precisión se podrá establecerse en términos de repetibilidad y reproducibilidad. Estos factores

permiten calcular la variabilidad dentro de cualquier tipo de proceso y determinar si esta variación

es aceptable o no, se calcula como desviación estándar de los resultados (Manual Codex

Alimentarius 18o Ed.).

Existen varios métodos para realizar el estudio de repetividad y reproducibilidad pero el método

ANOVA es el más exacto para calcular la variabilidad dentro de un proceso.

Método de Análisis de Varianza (ANOVA): conocido también como análisis de varianza es el

método más exacto para calcular la variabilidad debida a la interacción simultanea entre los

diferentes factores que participan de un sistema de medición (Botero, Arbelaez, & Mendoza,

2007). Se analizan los datos obtenidos por un estudio en niveles. El análisis de varianza se calcula

aplicando las fórmulas que se mencionan en la tabla 2.7.

𝐿𝑂𝐷 < 𝐿𝑂𝑄 < 𝐿𝑃𝑀

35

Tabla 2.7 Ecuaciones para el análisis de varianza.

Origen de

las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados

de

libertad

Promedio de los

cuadrados

Fcal Valor

crítico

para F

Entre

grupos

SC inter

r-1 * =

=

F tabla

Dentro de

grupos

SC intra

n-r * =

Total

SC total

n-1 *

Nota: F se distribuye según F con repeticiones (r), lecturas (n) y probabilidad al 99%.

Fuente: (Conexionismo, 2015)

Se utiliza la prueba estadística de F o F de Fisher-Snedecor que se considera como el cociente de

la varianza entre grupos respecto a la varianza dentro de los grupos a lo que se llama Fcalculada,

este valor se compara con cierto valor crítico o F critica que se encuentra en tablas y que servirá

para evaluar las hipótesis formuladas.

Hipótesis nula H 0: =

Hipótesis alternativa H1: >

Normalmente en una validación se acepta debería aprobarse la hipótesis alternativa al cumplirse

que y en caso contrario debería existir razones que lo justifiquen (ASECAL,

2005).

Calculados los valores de F se verifica que si F calculada < F critica, se demuestra la linealidad

entre los resultados obtenidos, no hay diferencia significativa y como conclusión el grupo es

homogéneo.

Con los datos de varianza se calculan la desviación de la repetividad ( , variabilidad intermedia

, variabilidad total ( , coeficiente de variación de r , coeficiente de variación de R

aplicando las fórmulas que se mencionan en la tabla 2.8. Se considera que por efectos

aleatorios la variabilidad intermedia ; debe asumirse

= .

36

Tabla 2.8. Ecuaciones para la determinación del coeficiente de repetitividad y reproducibilidad

Parámetro

Desviación de la repetividad

= √

Variabilidad intermedia

=

Variabilidad total

= √ +

+

Coeficiente de variación de r *

=

Coeficiente de variación de R*

=

*Nota: x =promedio de las mediciones por cada nivel.

Repetibilidad (r): se estima mediante el coeficiente de variación de la repetibilidad (% CVr), es

una medida de dispersión de la distribución bajo condiciones de análisis bajo donde los resultados

de análisis independientes se obtienen con el mismo método, en ítems de análisis idénticos, en el

mismo laboratorio, por el mismo operador y utilizando el mismo equipamiento dentro de intervalos

cortos de tiempo. Se calcula dividiendo la desviación estándar de la repetibilidad para la media y

por 100.

Para esta investigación se registró las mediciones en seis niveles diferentes de concentración con

5 repeticiones bajo las mismas condiciones (mismo operador, mismo aparato, mismo laboratorio y

en corto intervalo de tiempo) de un analíto en un material de referencia durante 4 días. Los criterios

de aceptación son un % CVr < 12 % en análisis de pesticidas en alimentos (Gómez & Sierra,

2010)

Reproducibilidad (R): se estima mediante el coeficiente de variación de la reproducibilidad

(% CVR), es una medida de dispersión de la distribución de resultados de análisis bajo condiciones

donde los resultados de los análisis se obtienen, con el mismo método, en ítems idénticos de

análisis en distintos laboratorios, con diferentes operadores y usando distintos equipos. Se calcula

dividiendo la desviación estándar de la reproducibilidad para la media y por 100.

Se puede determinar registrando a lo menos 5 mediciones en días distintos, o en un mismo día

cambiando a lo menos una condición analítica (ejemplo: operador, aparato, reactivos y largo

intervalo de tiempo). Los criterios de aceptación son un % CVR reproducibilidad < 20 % en

análisis de pesticidas en alimentos. (Gómez & Sierra, 2010)

37

Veracidad

Determina el grado de coincidencia existente entre el valor medio obtenido de una serie de

resultados y un valor de referencia aceptado. La veracidad puede ser determinada por el sesgo y la

recuperación

Sesgo: Desviación consistente de valores calculados a partir del valor verdadero, causada por

errores sistemáticos a lo largo de un procedimiento.

Se determina por medio de material de referencia se debe medir un analíto de concentración

conocido y se determina la diferencia en valor absoluto entre el valor conocido y la media del valor

obtenido. Se espera que no exista diferencia significativa entre el valor promedio de las lecturas

obtenidas (x) vs o valor esperado (xa)

Recuperación (R): Es la fracción de la sustancia agregada a la muestra (muestra fortificada) antes

del análisis, .permite ver el rendimiento de un método analítico en cuanto al proceso de extracción

y la cantidad del analíto existente en la muestra original. La recuperación esta intrínsecamente

relacionada a las características de la matriz de la muestra.

Los porcentajes de recuperación de muestras fortificadas generalmente deben oscilar entre 95 –

105 %. Se recomienda realizar a lo menos 5 mediciones de cada uno en lo posible en niveles. Se

debe considerar al elegir estos niveles el rango de la curva de calibración del método, el LOD y el

LMP establecido. De manera que los niveles seleccionados permitan entregar la mejor información

posible respecto a la capacidad de recuperación del método, en cuanto a estos valores críticos.

2.8.10. Incertidumbre

La incertidumbre de una medición es el parámetro asociado al resultado, es decir, caracteriza la

dispersión de los valores que razonablemente pueden ser atribuidos al mesurando. En este sentido,

es importante que para un método validado o verificado por el laboratorio, se realice la

determinación de las diferentes fuentes o componentes de la incertidumbre de la medición

presentes. Algunos de estos pueden ser evaluados por tipo. Para este fin el laboratorio realiza una

evaluación de las incertidumbres tipo A y B que están presentes en el método. (CEM, 2008)

Evaluación de incertidumbre tipo A: Evaluación de un componente por un análisis estadístico

de los valores de mediciones obtenidos en condiciones de medición definidas, por ejemplo realizar

varias mediciones en condiciones de repetibilidad.

38

Evaluación de incertidumbre tipo B: Evaluación de un componente incertidumbre de la medición

realizada por otros medios distinto a los del tipo A. Ejemplos: La evaluación basada en la

información, obtenidos a partir de un certificado de calibración.

Esta metodología requiere que se identifiquen todas las posibles fuentes de incertidumbre asociadas

con el proceso de medición y que se estime su valor. Los parámetros para la estimación de

incertidumbre son: incertidumbre estándar, incertidumbre estándar combinada e incertidumbre

expandida.

Parámetros para la estimación de incertidumbre

Incertidumbre estándar (u): cada componente de la incertidumbre (y‟), expresada como

desviación estándar.

Incertidumbre estándar Combinada (Uc): para el resultado y (Ley de propagación de errores)

Incertidumbre expandida (U) Proporciona un intervalo dentro del cual se cree que está el valor

del mesurando, cuando por razones de seguridad o salud se necesite expresar la incertidumbre con

un alto nivel de confianza, se multiplica esta incertidumbre combinada por un factor de cobertura o

seguridad (K).

Componentes de la incertidumbre.

La incertidumbre de un resultado puede originarse por diferentes causas, algunas de ellas son:

• Inadecuada definición del mesurando

• Muestreo

• Efectos de la matriz e interferencias

• Contaminación durante el muestreo o la preparación de la muestra

• Incertidumbre de pesas y material volumétrico

• Pureza de reactivos

• Valores asignados a patrones y materiales de referencia

• Calibración de equipos, etc.

2.8.11. Normalización de un método

RAMOS Ramis, (2001. p 109) especifica que es una actividad colectiva que consiste en la

elaboración, difusión y aplicación de normas referidas a situaciones repetitivas.

Las normas son documentos con las siguientes características:

Contiene aplicaciones técnicas.

Son elaboradas por consenso entre las partes interesadas: fabricantes, administraciones

públicas, usuarios y consumidores, centros de investigación, laboratorios de servicios etc.

39

Están basados en los resultados de la experiencia y el desarrollo tecnológico.

Son aprobados por un organismo nacional, regional o internacional de normalización

reconocido.

Están disponibles al público.

Las normas ofrecen un lenguaje común de comunicaciones entre las empresas, las

administraciones, y los usuarios, proporcionando mecanismos de referencia en los que se

fundamenta la confianza entre el cliente y el proveedor del servicio.

2.8.12. Acreditación de un laboratorio

Es la acción llevada a cabo por una entidad independiente de las partes interesadas, por ejemplo

una empresa de acreditación, mediante la cual se manifiesta que se dispone de la confianza

adecuada en que un producto, proceso o servicio es conforme a una norma, los laboratorios

analíticos prestan servicios, y como tales servicios pueden beneficiarse de las ventajas de la

acreditación. Existe un gran número de empresas públicas y privadas, independientes y sin ánimo

de lucro, reconocida en ámbitos nacionales y supranacionales, que desarrollan actividades de

acreditación. Gran parte de las actividades de estas empresas consiste en certificar la adecuación de

otras empresas incluyendo los laboratorios a las normas de gestión de calidad ISO 9001, 9002 y

9003.

40

CAPÍTULO III

3. METODOLOGÍA

3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN

El presente trabajo fue una investigación de tipo científico – experimental se realizó en dos fases

de ensayo en el laboratorio, una en la que se validó el método analítico y otra en la que se

identificó y determinó la persistencia de cipermetrina en tomate de árbol.

La parte experimental se realizó en el Laboratorio de Alimentos Oferta de Servicios y Productos

(OSP) de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador.

3.2 PRIMERA FASE: validación del método para análisis de cipermetrina

La intención principal de este documento es apoyar en la cuantificación de cipermetrina por

cromatografía de gases utilizando el método QuEChERS mediante la implementación de la Norma

Europea (EN 15662).

3.2.1 Linealidad

Procedimiento

Se realizaron 5 curvas de calibración con 5 niveles distintos de concentración (Gómez &

Sierra, 2010):

Se registró la señal obtenida en función de la concentración

Se ha calculado con cada curva los siguientes parámetros:

a Intersección

b Pendiente

R2

Coeficiente de determinación

r Coeficiente de correlación

Para el análisis estadístico de linealidad se calculó el valor promedio y la desviación

estándar de a y b.

Mediante el programa de excel (Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas

desiguales); el valor de t exp con (n-2) grados de libertad y se comparó con el valor t de

tablas para el nivel de confianza requerido (α=0.05), para dos colas, en este caso para un

“n” que depende de los niveles de calibración.

41

Hipótesis:

Hipótesis nula Ho: no existe correlación entre concentración vs señal

Hipótesis alternativa Ha: existe correlación significativa entre concentración vs señal

Se aprobará la hipótesis correspondiente tomando en cuenta la siente afirmación:

T-calculado > t-tablas se rechaza la hipótesis nula Ho, siendo aceptada la Ha correlación

lineal significativa al 95%.

Calcular los criterios de aceptación y rechazo para la curva global.

Se realizó un análisis de estimación lineal empleando Excel con los datos de concentración

(ppm ) y áreas (ua) de las 5 curvas de calibración y se obtuvo los parámetros de la recta

global de calibración siendo n número de total de observaciones (25) al 95% de confianza:

Intersección a

Pendiente b

Desviación de a Sa

Desviación de b Sb

Coeficiente de correlación r

Coeficiente de determinación R2

Error Tipo Syx

Grados de libertad n -2

3.2.2 Límites de confianza

Procedimiento

Se calculó los valores del límite superior de a (Lsup. a) y límite inferior de a ( Linf. a)

utilizando las ecuaciones 3.1. Donde a es la ordenada origen, Syx error tipo de la curva

global de calibración.

Se calculó t ( gl = N -2) ;N =25.

Ecuación 3.1 Límite superior e inferior de la intersección (a)

𝐿𝑠𝑢𝑝.𝑎 = 𝑎 + 𝑡𝑆𝑦𝑥 𝐿𝑖𝑛𝑓.𝑎 = 𝑎 𝑡𝑆𝑦𝑥

42

Límite superior nivel estándar 1 (

Ecuación 3.2 Límite superior concentración 1 (

Dónde:

. .

Límite inferior nivel estándar 1 (

Ecuación 3.3 Límite inferior concentración 1 (

Dónde:

. .

Se calcularon los límites superiores e inferiores por cada concentración de la curva de

calibración y se graficaron los resultados.

3.2.3 Límite de detección.

Procedimiento

Se estimó el límite de detección (ua) con los parámetros de la curva global de calibración:

intersección (a) y la desviación estándar de la intersección (Sa) y el valor de t de Student

( t ) con grados de libertad (n-2), aplicando la ecuación 3.4.

𝐶 𝐿𝑠𝑢𝑝 𝐶1 = 𝐿𝑠𝑢𝑝.𝑎 + 𝑏 𝑥 𝐶 1

𝑳𝑶𝑫 = 𝒂+ 𝒕𝑺𝒂

Ecuación 3.4. Límite de detección (LOD)

𝐶 𝐿𝑖𝑛𝑓. 𝐶1 = 𝐿𝑖𝑛𝑓.𝑎 𝑏 𝑥 𝐶 1

43

Calculando la pendiente (b) de la curva global, utilizando la ecuación 3.5 se reportó los

límites estimados estadísticamente en las unidades establecidas por el método (ppm).

Ecuación 3.5 LODppm

3.2.4 Límite de cuantificación

Procedimiento

Se estimó el límite de cuantificación (ua) con los parámetros de la curva global de

calibración: intersección (a) y la desviación estándar de la curva (Syx) y el valor de t de

Student (t) con grados de libertad (n-2) aplicando la ecuación 3.6.

Ecuación 3.6 Limite de cuantificación (LOQ)

Calculando la intersección con el eje (a) y la pendiente (b) ;utilizando la ecuación 3.7 se

reportó los límites estimados estadísticamente en las unidades establecidas por el método

(ppm).

Ecuación 3.7 LOQppm

3.2.5 Exactitud

Precisión: Repetibilidad (r) y reproducibilidad (R)

Procedimiento

Se analizaron seis niveles diferentes de concentración (0,2 ppm; 0,5 ppm; 0,8 ppm; 1.00

ppm; 1,5 ppm; 2,00 ppm) estimados en el intervalo de trabajo, cada nivel por

quintuplicado. Se analizaron por medio de un ANOVA de un factor con Excel..

𝐿𝑂𝐷𝑝𝑝𝑚 = 𝐿𝑂𝐷 𝑎

𝑏

𝐿𝑂𝑄𝑝𝑝𝑚 = 𝐿𝑂𝑄 𝑎

𝑏

𝑳𝑶𝑸 = 𝒂 + 𝒕 𝑺𝒚𝒙

44

Porcentaje de recuperación.

Procedimiento

Se analizaron de 10 muestras con concentración conocida ( valor esperado) y se registró la

concentración medida (valor obtenido )

Se determinó la recuperación expresada en porcentaje aplicando la ecuación 3.8

Ecuación 3.8 Porcentaje de recuperación.

Se reportó los datos de coeficiente de variación de r , coeficiente de variación de

R y % recuperación como intervalos acompañado del análisis ANOVA

considerando la uniformidad de grupos o niveles, se reporta el % CVR mas alto .

Veracidad

Sesgo

Procedimiento

Se calculo el valor promedio de las lecturas obtenidas ̅̅ ̅̅ y su desvicion estándar (Sr med)

Aplicando la ecuación 3.10 Se realizó una evaluación estadística de prueba t-student. Se

calculó un t exp con (n-2) grados de libertad y se comprará con el valor t de tablas para el

nivel de confianza requerido (α=0.05), en un análisis bilateral, en este caso para un “n” que

depende de los numero de mediciones y xa corresponde al valor esperado

Hipótesis

Hipótesis nula Ho: no existe diferencia significativa entre el valor promedio de las

lecturas obtenidas (x) vs o valor esperado (xa)

Hipótesis alternativa Ha: existe diferencia significativa entre el valor promedio de las

lecturas obtenidas (x) vs o valor esperado (xa)

𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 =𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜

𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜 𝑥

𝑡𝑒𝑥𝑝 =𝑥 𝑥𝑎

𝑛

𝑆𝑟 𝑚𝑒𝑑

Ecuación 3.9 Prueba t-student

45

Se comprobó la hipótesis correspondiente tomando en cuenta la siguiente afirmación

Si el valor observado es:

T-calculado < t-tablas se acepta la hipótesis nula Ho, no existe diferencia significativa

entre el valor promedio de las lecturas obtenidas (x) vs o valor

esperado (xa) significativa al 95%.

3.2.6 Incertidumbre

CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE TIPO A

Incertidumbre por respuesta analítica (UFR)

Procedimiento

Se calculó el promedio de la desviación estándares o error tipo ( ̅ ) y pendiente (b),

tomando en cuenta Syx y b de cada una de las 5 curvas de calibración aplicando la

ecuación 3.10 y 3.11 :

Ecuación 3.10 Promedio de la desviación estándares o error tipo ( ̅ )

Ecuación 3.11 Promedio de la pendiente (

Se calculó la desviación de la respuesta analítica (Sxy) a partir del error tipo ( ̅ ) y la

pendiente ( ̅) aplicando la ecuación 3.12:

Ecuación 3.12 Desviación función de la respuesta analítica ( )

𝑆𝐹𝑅 =𝑆 𝑦𝑥̅̅ ̅̅ ̅̅

�̅�

𝑆 𝑦𝑥 =𝑆𝑥𝑦 + ⋯+ 𝑆𝑦5

5

�̅� =𝑏 + ⋯+ 𝑏5

5

46

Se tomó el valor de como incertidumbre de la ecuación global (u) aplicando la

ecuación 3.13 en donde (n) es el número de observaciones realizadas para la determinación

de linealidad (n=25)

Ecuación 3.13 Incertidumbre FR

Incertidumbre por resolución del equipo (Ur)

Procedimiento

Con resolución de equipo (r-eqp) se calculó la u resolución aplicando la ecuación 3.14.

donde como r-eqp se toma el valor del límite de detección.

Ecuación 3.14 Incertidumbre resolución del equipo

Incertidumbre por reproducibilidad

Procedimiento

Se analizaron seis niveles diferentes de concentración (0,2) ppm; 0,5 ppm ; 0,7 ppm; 1.00

ppm; 1,5 ppm ; 2,00 ppm )estimados en el intervalo de trabajo, cada nivel por

quintuplicado .

Se analizaron las muestras por un mismo analista (analista 1) en 4 días diferentes

Se calculó el % de recuperación para cada nivel y el promedio final.

Se calculó la desviación estándar para cada nivel y se tomó el más alto en valor absoluto

(SR).

Se calculó la incertidumbre estándar promedio aplicando la ecuación 3.15 en donde (n) es

el número de observaciones por nivel que se analizó.

Ecuación 3.15 Incertidumbre estándar o de reproducibilidad

𝑈𝑅 =𝑆𝑅

𝑛

𝑈 𝐹𝑅 =𝑆𝐹𝑅

𝑛

𝑈𝑟 =

𝑟 𝑒𝑞𝑝

47

Incertidumbre por recuperación.

Procedimiento

Al momento de calcular el % de recuperación (Apartado 3.2.5 Exactitud. pág. 69) se

determinó la incertidumbre por recuperación con la ecuación 3.16; la incertidumbre de

las observaciones (u obs) conociendo la desviación estándar de las observaciones (S),

número de observaciones (n) aplicando la ecuación 3.17. . La incertidumbre del patrón

( u mrc) con la ecuación 3.18.

Ecuación 3.16 Incertidumbre por recuperabilidad

Ecuación 3.17 Incertidumbre de las observaciones

Ecuación 3.18 Incertidumbre del patrón

CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE TIPO B

Procedimiento

Incertidumbre del peso de la muestra.

Se tomó el valor de incertidumbre reportado en el certificado de calibración

y el factor de cobertura aprox. K=2 para un nivel de confianza del 95%.

Se calculó de incertidumbre atribuida al peso de la muestra aplicando la ecuación 3.19.

Ecuación 3.19 Incertidumbre por peso de la muestra

𝑈𝑝𝑚 =𝑢 𝑑𝑜𝑐𝑢𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎

𝐾

𝑢 𝑜𝑏𝑠 =𝑠

𝑛

𝑢 𝑚𝑟𝑐 =𝑈

𝑈 = 𝑐𝑒𝑟𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑜

𝑈 𝑟𝑒𝑐𝑝 = √𝑢 𝑜𝑏𝑠 + 𝑢 𝑚𝑟𝑐

48

Cálculo de la incertidumbre del patrón )

Se tomó el valor de incertidumbre reportado en el certificado de calibración

( y el factor de cobertura aprox. K=2 para un nivel de confianza del 95%.

Se calculó de incertidumbre atribuida al estándar aplicando la ecuación 3.20

Ecuación 3.20 Incertidumbre del patrón (umrc)

Cálculo de la incertidumbre por dilución U (FD).

A partir de la ecuación 3.21 se calculó la u de incertidumbre por dilución, siendo u de

material de dilución (u ), volumen total (vt), volumen aforado (Va)

Ecuación 3.21 Incertidumbre por dilución U (FD).

Incertidumbre balón (10,5ml).

Se tomó el valor de incertidumbre reportado en el certificado de calibración

( y el factor de cobertura aprox. K=2 para un nivel de confianza del 95%.

Se calculó de incertidumbre aplicando la ecuación 3.22.

Ecuación 3.22 Incertidumbre (balón)

Incertidumbre micro pipeta (Umicrop).

Se tomó el valor de incertidumbre reportado en el certificado de calibración

( y el factor de cobertura aprox. K=2 para un nivel de confianza del 95%.

𝑈𝑚𝑟𝑐 =

𝑢 𝑑𝑜𝑐𝑢𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎

𝑈 𝐹𝐷 = 𝑉𝑡

𝑉𝑎√𝑢 𝑢/𝑉𝑡 + ……+ 𝑢 𝑢/𝑉𝑎

𝑈𝑏𝑎𝑙𝑜𝑛 =𝑢 𝑑𝑜𝑐𝑢𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎

𝐾

49

Se calculó de incertidumbre aplicando la ecuación 3.23.

Ecuación 3.23 Incertidumbre (micropipeta)

CÁLCULO DEL INCERTIDUMBRE COMBINADA: Uc(y)

Procedimiento

Los valores de la incertidumbre tipo A como la de tipo B se encuentran en sus respectivas

unidades (incertidumbre estándar). Se procede a volverlas adimensionales dividiendo las

incertidumbres obtenidas por su factor correspondiente transformándolas a incertidumbres

relativas, luego de esto se aplicó la ecuación 3.24.

Ecuación 3.24 Incertidumbre

CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE EXPANDIDA (U)

Procedimiento

Calculando el resultado de la incertidumbre combinada estándar (uc) se pudo calcular la

incertidumbre expandida (U) tomando K (factor de cobertura) aproximadamente K=2 para

un nivel de confianza del 95%.

Se calculó de incertidumbre expandida aplicando la ecuación 2.25:

Ecuación 3.25 Incertidumbre combinada estándar

𝑈 = 𝐾 𝑥 𝑢𝑐

𝑈𝑚 =𝑢 𝑑𝑜𝑐𝑢𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎

𝐾

𝑈𝑐 = 𝑢 𝑡𝑖𝑝𝑜 𝐴

𝐴

+ 𝑢 𝑡𝑖𝑝𝑜 𝐵

𝐵

50

3.3 SEGUNDA FASE Determinación de la persistencia de cipermetrina en muestras

de tomate de árbol.

Para la cuantificación de cipermetrina en muestras de tomate de árbol por el método de

cromatografía de gases previamente validado, se trabajó con la siguiente población y muestra

3.3.1 Población y muestra.

3.3.2.1. Población

Esta investigación se realizó en una plantación ubicada en las coordenadas geográficas latitud -

0.192069 y longitud -78.339190, proveedor para la COMPANIA LA FAVORITA S.A., ubicada

en el barrio de Tababela, Parroquia del Quinche, Provincia de Pichincha. La parcela fue localizada

por medio de equipo de posicionamiento satelital (GPS) como se muestra en la figura 3-1.

Figura 3.1. Localización de parcela del cultivo de Tomate de árbol

Fuente: Directorio Cartográfico de España 2014

51

3.3.2.2. Control de la siembra.

El ensayo se desarrolló cuantificando los residuos de pesticida en una parcela modelo, sin control

de factores ambientales simulando la situación real del cultivo. A la parcela se le dieron tres

aplicaciones de pesticida, la primera y segunda fueron en los meses de noviembre y diciembre del

2012 y culminó en febrero del 2013.

Las cosechas se realizaron 15 y 30 días después de cada fumigación, al cabo de 6 cosechas se

culmina la recolección de la plantación. La información detallada acerca de la plantación se

muestra en el anexo 3

3.3.2.3. Muestra analítica

La obtención de las muestras se realizará representativa mediante un muestreo aleatorio simple los

frutos deben cumplir con las siguientes características físicas:

Enteros, sanos y exentos de podredumbre o deterioro que hagan que no sean aptos para el

consumo así como de cualquier materia extraña visible.

Exentos de plagas que afecten es aspecto general del producto

Exentos de humedad anormal

Ser de consistencia firme, tener aspecto fresco, tener piel brillante

Encontrarse en el valor 4 a 6 de la escala de color del tomate para determinar su madurez

(ver norma INEN 1 1909, Anexo 1)

Procedimiento De Muestreo

3.3.2.4. Selección de las unidades de muestreo

Para determinar el número de muestras que se debieron tomar por parcela total se tomó en cuenta el

número de árboles que se habían sembrado en ella. La plantación poseía 2500 árboles de tomates

ver tabla 3.1.

Tabla 3.1. Relación entre el número de árboles a muestrear.

N° de árboles /parcela total Relación N° Arboles a muestrear/

N° arboles parcela

<150

150-250

251-450

451-750

751-1500

1501-2500

1/3

1/5

1/9

1/15

1/30

1/50

Fuente: (Legaz, . Serna, Ferrer, & Primo-Millo1, 1995).

52

Una vez determinada el número de árboles para tomar la muestra se procedió a la selección de los

árboles en los que se efectuó el muestreo de los tomates.

Estos se tomaran al azar procurando que estén suficientemente distribuidos y no se concentren en

una determinada zona.

El número total de árboles seleccionados para el muestreo de la parcela homogénea fue de 50 y de

cada uno, se tomaron cuatro frutos por árbol, dando un total de 200 tomates, estos fueron tomados

aproximadamente a la mitad de la altura del árbol y orientados en la dirección de los cuatro puntos

cardinales.

3.3.2.5. Recolección y transporte de muestras.

El trabajo de investigación se realizó durante los cuatro meses de noviembre del 2012 a febrero del

2013. Cada muestra fue adquirida aleatoriamente tomando en cuenta que cada fumigación cuenta

con 2 cosechas (cada 15 días). Las muestras fueron envueltas en papel aluminio luego en fundas

plásticas además de ser rotuladas con un número asignado dentro de la parcela con la respectiva

fecha, número de cosecha y fumigación después fueron almacenados en culers, cubiertos y

etiquetados.

Una vez que las muestras llegaron al laboratorio se las sometió a un proceso de homogenización.

Se formaron 20 subgrupos cada uno de estos tenía 10 tomates por medio de un sorteo

seleccionamos 3 subgrupos, estos se designaron para el estudio de persistencia a los 0, 7 15, 22 y

30 días después de la fumigación.

3.3.2 Variables de investigación

En la tabla 3.2 Se observa el detalle de las variables dependiente e independiente .

Tabla 3.2 Variables dependiente e independiente

VARIABLE INDEPENDIENTE VARIABLE DEPENDIENTE

Número de

fumigaciones

Fumigación 1

(F1)

Concentración de Cipermetrina

(mg Cipermetrina/kg tomate)

Fumigación 2

(F2)

Fumigación 3

(F3)

Tiempo de

evaluación (días)

Día 2

Día 8

Día 15*

Día 22

Día 30*

* Día de madurez optima del tomate de árbol y cosecha para destinarla a su venta.

53

3.3.3 Diseño experimental

Para evaluar el efecto de las fumigaciones y los tiempos de cosecha en la concentración de

cipermetrina de muestras de tomate de árbol de la parcela, se realizó un arreglo factorial A x B con

replica. Dónde:

Factor T = tiempo (Días)

Factor F = fumigaciones (número de fumigaciones)

n = número de repeticiones por fumigación-tiempo

La matriz de datos se detalla en la tabla 3.3.

Tabla 3.3 Matriz de datos para el análisis de cipermetrina en tomate de árbol.

Tiempo (Días)

(T)

Número de Fumigaciones (F)

Fumigación 1 Fumigación 2 Fumigación 3

1 R1

R2

R3

R1

R2

R3

R1

R2

R3

8 R1

R2

R3

R1

R2

R3

R1

R2

R3

15 R1

R2

R3

R1

R2

R3

R1

R2

R3

22 R1

R2

R3

R1

R2

R3

R1

R2

R3

30 R1

R2

R3

R1

R2

R3

R1

R2

R3

54

La investigación conto con las siguientes hipótesis.

Hipótesis:

Con respecto a F (fumigaciones)

Ho: =

Ha:

Con respecto a T (tiempo)

Ho: =

Ha:

Con respecto a interacción FxT (tiempo)

Ho: =

Ha:

Los datos fueron evaluados por el programa Microsoft Excel 2010, la tabla 3.4 muestra la

metodología de análisis de datos, en un ANOVA de dos factores con replica o submuestreo.

Tabla 3.4 Análisis de Varianza para dos factores con submuestras por grupo

= ∑

FV SC GL CM Fcal*

Fumigaciones

(F) =

∑ ∑

GLA = a-1 =

=

Tiempo (T) =

∑ ∑

GLB = b – 1 =

=

Interacción

FxT =

∑ ∑

GLAB = (a-1) (b-1) =

=

Error = GLEx = GLT – GLA –

GLB - GLAB =

Total = ∑ GLT = (a x b x n ) - 1

*Si la Fcal > Ftabulada(95% ó 99%) se considerada estadísticamente significativo al 95% o 99%

Adaptado de: (Gutierrez Pulido & De la Vara Salazar, 2004)

55

Se aplicó la prueba de la diferencia mínima significativa (DMS) expresada en las ecuaciones 3.17

y 3.18 para la comparar entre medias de los factores fumigación y tiempo.

..

Ecuación 3.26 Valor DMS para fumigaciones

Ecuación 3.27 Valor DMS para tiempo

Dónde:

= Valor tabulado al 95% que depende de:

a = número de tratamientos de cada factor;

glerror = determinados en el ADEVA.

CME = Cuadrado medio del error experimental, determinado en el ADEVA

F ó T = número de tratamientos de cada factor que influye significativamente en los resultados.

n= repeticiones por muestra

3.3.4 Estudio de la persistencia de la cipermetrina

Se evaluó el comportamiento cinético que posee la degradación de la cipermetrina en el tiempo de

cosecha, de manera que se pueda conocer los días aptos de cosecha en los que el contenido de

cipermetrina estén bajo los valores que exigen la normativa INEN 1 1909. Se utilizó la metodología

de análisis de regresión lineal bajo las ecuaciones que se muestran en la tabla 3.5.

En donde Q es el factor de estudio entre valores inicial ) y final , es la la constante

cinética de velocidad y es el tiempo.

Tabla 3.5 Ecuaciones cinéticas

Orden de reacción Ecuación cinética

Cinética de orden cero =

Cinética de primer orden =

Cinética de segundo orden

=

+

Fuente: (Casp & Abril, 2003)

𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝐷𝑀𝑆−𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝐹 = 𝑎 𝑔𝑙𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 𝑥 𝐶𝑀𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟

𝑇𝑥𝑛

𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝐷𝑀𝑆−𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑇 = 𝑎 𝑔𝑙𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 𝑥 𝐶𝑀𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟

𝐹𝑥𝑛

56

3.4 TÉCNICAS E INSTRUMENTOS ANALÍTICO

En el procedimiento analítico para la determinación de pesticidas piretroides se tiene las siguientes

etapas:

3.4.1. Análisis de la muestra.

3.4.1.1. Método

La determinación se basó en el Método de la Norma Europea 15662 (Anexo 8), utilizando como

técnica de extracción QUECHERS y como método de separación e identificación por

Cromatografía de Gases, adaptado y validado en las condiciones de laboratorio del OSP de

Alimentos que pertenece a la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del

Ecuador.

3.4.1.2. Método de extracción QuEChERS para la determinación de pesticidas en tomate

de árbol y su cuantificación por cromatografía de gases.

La muestra se extrae con acetatonitrilo y por adición de sulfato de magnesio, de cloruro de sodio y

de un tampón de sales de citrato. A continuación el extracto es purificado con ayuda de un amino-

adsorbente (SPE) y sulfato de magnesio. El extracto final puede ser utilizado directamente para los

análisis de determinación por GC/MS y LC/MS-MS.

3.4.1.3. Equipos – materiales y reactivos.

Equipos

• Cromatógrafo de gas Agilent 5975C Series GC/MSD

• Sistema de detección MSD

• Computadora -Software

• Balanza analítica de apreciación: 0,1 mg

• Centrifuga Hettich

• Licuadora Oster

• Generador de Hidrógeno, Marca Perkin Elmer

Materiales.

• Pipetas automáticas de volumen variable (100μl a 1ml)

• Tubos de ensayo

• Probetas de vidrio de 10

• Viales para cromatografía color ámbar de 2 ml.

• Cuchillo con mango de plástico negro

57

Reactivos

• Acetato de etilo: Pureza 98.5%, Grado HPLC, Marca Registrada EM SCIENCE,

Merck KGaA, Darmstdt, Alemania.

• MgSO4 , NaCl , NaCitrato , citrato disodico , PSA ,carbón activado.

• CIPERMETRINA 20 %

3.4.1.4. Preparación de la muestra

Según el manual Kits Agilent SampliQ QuEChERS( Anexo 8) el proceso de extracción se realiza

de acuerdo a la Norma Europea 15662 Versión 2007-10 – 24, alimentos de origen vegetal.

Determinación de residuos de pesticidas utilizando GC-MS y/o LC-MS (/MS) seguido de

extracción/ división de acetonitrilo y método de purificación dispersiva SPE-QuEChERS.

(CEN.EU). Esta norma la elaboró la Asociación Española de Normalización y Certificación

(AENOR).

Según la norma se mencionan dos etapas que son:

Extracción por método QuEChERS.- Anadir 2 g de producto triturado en un tubo de

extracción de 2 ml, añadir 10 ml de acetonitrilo como solvente de extracción. Se añade 1 g de

MgSO4, 0,5 NaCitrato, 0.5 g citrato disodico sesquihidratado estas sales y ácidos, tamponados

mejoran le eficacia de la extracción y protegen compuestos sensibles cerrar herméticamente agitar

a mano durante 30-60” y centrifugar a 3.000 rpm durante 3„para separar el material sólido.

Limpieza de la muestra .Tomar un 1 ml del sobrenadante y mezclarla con 0,15 g PSA, con 0.9g

MgSO4 y 15 mg de carbón activado. Agitar a mano durante 30” y centrifugar a 3.000 rpm durante

3„para separar el material sólido. Transferir con pipeta volumétrica 1 ml de sobrenadante a un vial

para inyector.

3.4.2. Análisis cromatografíco

Uno de los objetivos de esta investigación fue analizar la influencia de los diversos parámetros

instrumentales en la identificación y cuantificación de cipermetrina en tomate de árbol.

3.4.2.1. Condiciones

La cipermetrina fue cuantificada mediante cromatografía gaseosa con un espectrómetro de masas.

El uso y manejo del equipo se describen en el instructivo correspondiente (Instructivo de uso y

manejo de equipo cromatógrafo de gases).

58

Las condiciones instrumentales para la cuantificación de cipermetrina en las muestras de tomate de

árbol se recogen en la tabla 3.6.

Tabla 3.6 Condiciones cromatografías establecidas para la cipermetrina.

Detector Espectrómetro de masas Agilent Technologies modelo serie 5975

Gas portador Helio con un flujo constante de 1 ml/min

Inyector Se inyectó 1 µl de muestra en modo splittles a150ºC.

Columna Columna capilar: HP-5 (5% Fenil. Metil Siloxano) de 30 m de longitud,

diámetro interno de 320 µm y espesor de película de 0,25 µm

Rampa de horno

Inicial 50ºC durante 2 min.

1 A continuación, 10 °C / min hasta los 200 °C durante 8 minutos

2 A continuación, 10 c / min hasta 270 °C durante 8 min

Tiempo de lectura 40 min

Identificación espectros de masas registrados en la biblioteca espectral

El equipo de análisis fue un cromatógrafo Agilent 5975C Series GC, equipado con un detector de

masas (MSD) y un sistema de inyección automática como se muestra en la figura 3.2, El Programa

informático fue Agilent MSD Productivity ChemStation distribuida conjuntamente con el quipo

Figura 3.2 Cromatógrafo Agilent 5975C Series GC

59

3.4.3. Aplicación del método.

Los valores de concentración son interpolados y se obtiene la concentración correspondiente a mg

/L de cipermetrina. Este análisis es realizado en el equipo de cromatografía y los resultados se

obtienen de directamente en ppm, concentración en mg cipermetrina /Kg de tomate.

3.4.4. Diagrama de flujo general de la investigación.

La figura 3.3 muestra el diagrama de flujo del procedimiento para la determinación de

cipermetrina mediante cromatografía de gases en cultivos de tomate de árbol.

Limpieza de la Muestra

Figura 3.3 Determinación de cipermetrina en muestras de tomate de árbol.

Añadir 2 g de producto triturado en un tubo de

extracción de 50 ml

ácidos, tamponados mejoran le eficacia de la

Añadir 2 ml de acetonitrilo como solvente de

extracción.

Se añade 1 g de MgSO4, 0,5 NaCitrato ,0.5 g citrato

disodico

Agitar a mano durante 30-60”.

Centrifugar a 3.000 rpm durante 3„para separar el

material sólido

Tomar un 1 ml del sobrenadante

Mezclarlo con 0,15 g PSA, con 0.9g MgSO4

Agitar a mano durante 30”

Centrifugar a 3.000 rpm durante 3„para separar el

material sólido.

Transferir con pipeta volumétrica 1 ml de

sobrenadante a un vial para inyectar

Limpieza de la

Muestra

Análisis de la

muestra

Extracción de la

muestra

60

CAPÍTULO IV

4. ANALISIS E INTERPRETACION DE RESULTADOS

4.1 PRIMERA FASE:

VALIDACIÓN DEL MÉTODO PARA ANÁLISIS DE CIPERMETRINA

De acuerdo al objetivo 1.2.2.1 se planteó las condiciones adecuadas de columna, temperatura y

gases necesarios para el método cromatográfico, al igual que se plantearon las condiciones

necesarias para realizar la extracción del analíto. Para lo cual a continuación se indicarán los

resultados obtenidos en las lecturas de los estándares, usando el método cromatográfico.

4.1.1. Análisis de resultados para la obtención de las curvas de calibración de cipermetrina

Registro de resultados para la obtención de las curvas de calibración de cipermetrina.

Tabla 4.1 Datos experimentales para la obtención de curvas de calibración de cipermetrina

Curva 1 Curva 2 Curva 3 Curva 4 Curva 5

Concentración Área Área Área Área Área

(ppm) (ua) (ua) (ua) (ua) (ua) Promedio Desviación

Estándar

Sensibilidad

analítica

0,2 176012 175985 179470 178780 179985 178046 1917,754 92,841

0,5 341061 351002 345963 336590 331002 341124 7810,359 43,676

1,0 679902 671002 689992 700835 699925 688331 12892,557 53,390

1,5 1110689 1177296 1159925 1113132 1177296 1147668 33414,265 34,347

2,0 1499200 1477296 1457489 1504669 1557489 1499229 37573,615 39,901

Pendiente 746214,7 748382,6 735262,9 748853,5 787439,1

Intersección -14690,54 -7801,73 -1894,41 -12006,49 -29797,24

R 0,998 0,996 0,997 0,998 0,997

R2 0,996 0,991 0,994 0,997 0,994

En la tabla 4.1 se presentan las áreas obtenidas que identifican los picos de cipermetrina y

en el análisis de estándares a 5 niveles de concentración, las áreas de las lecturas están

expresadas en (Ua), de la misma manera se muestran los valores de pendiente (b),

intersección con el eje (a), R2 correspondiente a cada curva de calibración; se indica

también la desviación estándar y la sensibilidad analítica.

Se grafican las cinco curvas y se obtienen las ecuaciones correspondientes a cada una de

ellas según la ecuación 2.1.

61

A continuación se indican las gráficas de las 5 curvas de calibración realizadas para el método

cromatográfico.

Figura 4.1 Curva de calibración Nº1. Método cromatográfico

Donde corresponde a la concentración (ppm) vs. area (ua) y corresponde a la línea de

tendencia de la gráfica.

Figura 4.2 Curva de calibración Nº2. Método cromatográfico

Donde corresponde a la concentración (ppm) vs. area (ua) y corresponde a la línea de

tendencia de la gráfica.

y = 746215x - 14691 R² = 0,9957

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

0 0,5 1 1,5 2

Señ

al (

ua)

Concentración (ppm)

Curva 1

y = 748383x - 7801,7 R² = 0,9915

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

0 0,5 1 1,5 2

Señ

al (

ua)

Concentración (ppm)

Curva 2

62

Figura 4.3 Curva de calibración N3º. Método cromatográfico

Donde corresponde a la concentración (ppm) vs. area (ua) y corresponde a la línea de

tendencia de la gráfica.

Figura 4.4 Curva de calibración Nº4. Método cromatográfico

Donde corresponde a la concentración (ppm) vs. area (ua) y corresponde a la línea de

tendencia de la gráfica.

y = 735263x + 1894,4 R² = 0,994

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

0 0,5 1 1,5 2

Señ

al (

ua)

Concentración (ppm)

Curva 3

y = 748854x - 12006 R² = 0,9967

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

0 0,5 1 1,5 2

Señ

al (

ua)

Concentración (ppm)

Curva 4

63

Figura 4.5 Curva de calibración Nº5. Método cromatográfico

Donde corresponde a la concentración (ppm) vs. area (ua) y corresponde a la línea de

tendencia de la gráfica.

En las figuras 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4,5 se muestra las curvas de calibración individuales de

cipermetrina, con las respectivas ecuaciones lineales (ecuación 2.1) y el coeficiente de

determinación r2 que en cada curva es r2 > 0.99, este valor demuestra la linealidad del

método y la correlación entre la concentración y señal.

Se calcularon las concentraciones de los estándares con las ecuaciones de la recta

obtenidas en cada curva de calibración:

Tabla 4.2: Concentraciones obtenidas de las curvas de calibración

Curva 1 Curva 2 Curva 3 Curva 4 Curva 5

No Concentración

(ppm)

Concentración

Calculada

(ppm)

Concentración

Calculada

(ppm)

Concentración

Calculada

(ppm)

Concentración

Calculada

(ppm)

Concentración

Calculada

(ppm)

1 0,2 0,22 0,22 0,25 0,22 0,19

2 0,5 0,44 0,46 0,47 0,43 0,38

3 1 0,89 0,89 0,94 0,92 0,85

4 1,5 1,47 1,56 1,58 1,47 1,46

5 2 1,99 1,96 1,98 1,99 1,94

y = 787439x - 29797 R² = 0,994

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

0 0,5 1 1,5 2

Señ

al (

ua)

Concentración (ppm)

Curva 5

64

Luego de haber obtenido las ecuaciones correspondientes a cada curva de calibración en la

tabla 4-1, se pudo calcular las concentraciones corregidas de cipermetrina en (ppm),

usando la ecuación de la recta indicada en la ecuación 2-1, se reemplazaron las lecturas de

las áreas en y para despejar x. De esta forma los resultados se indican en la tabla 4-2.

Tabla 4.3: Valores de desviación estándar de a y b, coeficiente de determinación (r2) y error típico

(Syx)

Pendiente Desviación

Estándar (Sb;Sa)

r2

S y x

Curva 1 b 746214,747 28464,574 0,996

a -14690,537 34954,682 41562,177

Curva 2 b 748382,627 40103,957 0,991

a -7801,732 49247,921 58557,271

Curva 3 b 735262,871 33021,623 0,994

a 1894,415 40550,769 48216,093

Curva 4 b 748853,546 25037,867 0,997

a -12006,488 30746,663 36558,715

Curva 5 b 787439,081 35313,860 0,994

a -29797,244 43365,650 51563,073

La tabla 4.3 indica los valores obtenidos para las pendientes (b), la ordenada al origen(a)

con sus respectivas desviaciones estándares (S). Además se encuentra el error tipo S (yx)

de las curvas que representa la incertidumbre por curva de calibración, es decir el grado de

dispersión de los datos respecto al valor esperado.

Tabla 4.4: Análisis de las curvas de calibración de cipermetrina

Curvas Intersección a

(ua)

Pendiente b

(mg ua/Kg) Valor R

2

1 -14690,54 746214,7 0,996

2 -7801,73 748382,6 0,991

3 -1894,41 735262,9 0,994

4 -12006,49 748853,5 0,997

5 -29797,24 787439,1 0,994

Promedio -13238,082 4773,376 0,998

Desviación estándar (σ) 9338,79 306074,63 0,003

t calculada -76,2475268

T tablas 2,44691185

65

La tabla 4.4 indica los valores de la pendiente (m) que representa la sensibilidad del

método, como se sabe a mayor sensibilidad, factor importante al efectuar nuevas

calibraciones.

Al realizar la Prueba t a dos colas en donde t calculado > t tablas, se acepta la hipótesis

alternativa Ha , que menciona que existe una correlación significativa entre concentración

vs señal

Curva global de calibración

Tabla 4.5: Ecuación de la curva global

Ecuación 2.1 y= a + bx

Intersección (a) -12480

Pendiente (b) 753231

Valor R2 0,995

S y x 41757

La tabla 4-5 indica los datos obtenidos del análisis de estimación lineal correspondiente a la

ecuación de la curva global, para obtener esta ecuación se usaron los datos de áreas (ua) y

concentraciones (ppm) de las 5 curvas de calibración indicadas en la tabla 4-1.

Se observa los datos de pendientes (m) que representa la sensibilidad del método, la

ordenada al origen (a) que está relacionado con el error sistemático propio del método,

además se encuentra el error típico Syx que representa la incertidumbre de calibración, es

decir el grado de dispersión de los datos respecto al valor esperado.

4.1.2. Límites de confianza

Los valores del límite superior de a (Lsup. a) y límite inferior de a (Linf. a) utilizando las

ecuaciones 3.1.

Tabla 4.6: Valores para a y considerados para los intervalos de confianza

L sups. L inf.

a 73900.97 -98861.6

66

Los datos de la tabla 4-6, se indican los valores de límite superior e inferior de la ordenada (a),

estos valores se tomaron para obtener los limites superior e inferior según las ecuaciones 3.2 y 3.3.

Tabla 4.7 Limites de confianza

C L sup. L inf.

0.2 224547,1111 51784,4844

0,5 450516,2833 277753,6566

1.0 827131,5704 654368,9437

1.5 1203746,857 1030984,231

2.0 1580362,144 1407599,518

Los datos de la tabla 4-7 indican los valores de límite superior e inferior de la ordenada (a) en

cada nivel de la curva de calibración. A continuación se representan en la figura 4.6 los límites de

confianza acompañados de la ecuación de la curva global de calibración.

Figura 4.6 Límites de confianza y curva global de calibración.

4.1.3. Límite de detección (LOD)

Tabla 4.8 Límite de detección del método

Límite de detección

(ua)

Límite de detección

(ppm) 20009 0,04

Señal del blanco (xb) 0,02

y = 753231x - 12480

R² = 0,9952

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Áre

a (

ua

)

Concentración

Límites de confianza y curva de global de calibración

LS

Curva global

LI

Lineal (Curva global)

67

La tabla 4.8 indica los valores obtenidos para el límite de detección del método de acuerdo a las

ecuaciones 3.4 y 3.5. Además se observa la media de las lecturas del ruido o señal del

blanco (Anexo 5) que muestra que no hay interferencia con el valor del límite de

detección.

4.1.4. Límite de cuantificación (LOQ)

Tabla 4.9 Límite de cuantificación del método

Límite de cuantificación (ua)

Límite de cuantificación (ppm)

73901 0,12

La tabla 4.9 indica los valores obtenidos para el límite de cuantificación del método de acuerdo a

las ecuaciones 3.6 y 3.7.

En las tablas 4.8 y 4.9 se presentan los límites de detección y cuantificación

respectivamente, al tomar en cuenta la consideración al LMP que se menciona en la página

33. podemos indicar que se cumple con los parámetros de validación.

4.1.5. Precisión

Tabla 4.10 Datos experimentales para la determinación de la repetibilidad y reproducibilidad.

Niveles

Valor

Teórico

ppm

Día 1 Dia2 Día 3 Día 4

1 0,2

0,21 0,21 0,21 0,21

0,19 0,20 0,19 0,20

0,20 0,20 0,20 0,20

0,19 0,20 0,19 0,20 Promedio Total

0,20 0,21 0,20 0,21 0,201

2

0,53 0,48 0,49 0,47

0,5

0,52 0,48 0,49 0,46

0,50 0,47 0,52 0,47

0,48 0,50 0,50 0,51 Promedio Total

0,47 0,54 0,51 0,50 0,49

𝐿𝑂𝐷 < 𝐿𝑂𝑄 < 𝐿𝑀𝑃

4𝑝𝑝𝑚 < 𝑝𝑝𝑚 < 𝑝𝑝𝑚

68

Nota: repetibilidad (r); reproducibilidad (R). Por niveles y por días.

Los cálculos que se presentan a continuación deben realizarse por cada nivel que consta en la

tabla 4.10.

Tabla 4.11 Análisis ANOVA para nivel N °1 concentración 0,2 ppm.

Elaborada según tabla 3.1.

Origen de

las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados

de

libertad

Promedio de los

cuadrados

F cal Valor

crítico

para F

Entre grupos 0,000180 3 0,0000600 1,2000 3,238

Dentro de los

grupos 0,000800 16 0,0000500

Total 0,00098 19

En la tabla 4.11 se observa tenemos F, cal < F tabulada tablas esto demuestra la linealidad

entre los resultados obtenidos, no hay diferencia significativa y como conclusión el grupo

es uniforme. Se igual manera se observa los valores y cumple con los

propósitos de la validación.

Tabla 4,10 Datos experimentales para la determinación de la repetibilidad y reproducibilidad. Continuación.

Niveles

Valor

Teórico

ppm

Día 1 Dia2 Día 3 Día 4

3

0,71 0,71 0,72 0,72

0,8

0,71 0,71 0,71 0,72

0,70 0,71 0,71 0,71

0,73 0,70 0,71 0,72 Promedio Total

0,71 0,73 0,73 0,72 0,715

4

1,00 1,02 1,00 1,00

1,0

1,01 1,00 1,02 1,03

1,02 1,01 1,10 1,01

1,02 1,00 1,00 1,00 Promedio Total

1,00 1,01 1,00 1,01 1,013

5

1,53 1,48 1,54 1,51

1,5

1,49 1,49 1,53 1,49

1,53 1,51 1,50 1,53

1,52 1,53 1,51 1,53 Promedio Total

1,51 1,51 1,49 1,52 1,513

6 2

2,00 2,00 2,00 2,00

2,00 2,01 2,00 2,00

2,00 2,00 2,00 2,00

2,00 2,00 2,00 2,00 Promedio Total

2,00 2,00 2,00 2,00 2,001

69

Tabla 4.12. Reproducibilidad (R) expresados en coeficiente de variación..

Parámetros Valores

Desviación de la repetividad

0,0071

Variabilidad intermedia

0,0000

Variabilidad total

0,0072

Coeficiente de variación de R(%CVr)

3,51

Coeficiente de variación de R(%CVR)

3,52

En la tabla 4 .12 reporta los datos obtenidos por reproducibilidad (R) expresados en coeficiente de

variación para nivel N °1 concentración 0,2 ppm.

Cálculo de recuperación para nivel N °1 concentración 0,2 ppm

Se determinó la recuperación expresada en porcentaje aplicando la ecuación 3.9.

Tabla 4.13. Parámetros de aceptación para el método por precisión.

Parámetro Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 4 Nivel 5 Nivel 6

0,2 ppm 0, 5 ppm 0,7 ppm 1,0 ppm 1,5 ppm 2, ppm

%CvR 3,52 2,36 1,13 0,74 0,67 0,39

%CVr 3.51 2.26 1.13 0,70 0,66 0,39

% Recuperación 100,50 98,90 102,07 100,60 99,60 99,93

Test

ANOVA

GRUPO

UNIFORME

GRUPO

UNIFORME

GRUPO

UNIFORME

GRUPO

UNIFORME

GRUPO

UNIFORME

GRUPO

UNIFORME

En la tabla 4.13 se reporta los datos de coeficiente de variación de Repetitividad

, coeficiente de reproducibilidad (% CVr) y % recuperación como intervalos acompañado

b l =

x

b l = 5

70

del análisis ANOVA considerando la uniformidad de grupos o niveles, obteniendo un

criterio de control para la validación.

Tabla 4.14. Datos para el cálculo del sesgo

En la tabla 4.13 se observa el análisis de t. Por t-exp < t-tablas se acepta la hipótesis

nula Ho, no existe diferencia significativa entre el valor promedio de las lecturas

obtenidas (x) vs o valor esperado (xa) significativa al 95%, obteniendo un criterio de

control para la validación.

4.1.6. Incertidumbre.

CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE TIPO A

Tabla 4.15. Incertidumbre por respuesta analítica (uFR).

En la tabla 4.15 se observan los cálculos de obtención de la incertidumbre por respuesta analítica

(UFR) calculada a partir de la ecuación 3.13.

Valor t

t exp. -0,0003557

t tablas 2,4708068

X= 0.7 ppm Cipermetrina

Mediciones Concentración

n ppm

1 0,68

2 0,69

3 0,69

4 0,69

5 0,70

Xa 0,69

s 0,01

u 0,003

U 0,002

U DE FR

Curvas Desviación estándar

(Sxy) Pendiente (b)

1 41562,17708 746214,7467

2 58557,27129 748382,6266

3 48216,09334 735262,8705

4 36558,71485 748853,546

5 51563,07308 787439,0807

X 47291,46593 753230,5741

SFR 0,062784846

U FR 0,013

71

Tabla 4.16. Se Incertidumbre por resolución del equipo (Ur) .

Resolución Ur ppm

0,04 0,012

En la tabla 4.16 se observa el cálculo de obtención de la incertidumbre por resolución del equipo

(Ur) calculada aplicando la ecuación 3.14.

Tabla 4.17. Incertidumbre por reproducibilidad (UR)

SR UR ppm

0,0117 0,0026

En la tabla 4.17 se observa el cálculo de obtención de la incertidumbre por reproducibilidad

calculada aplicando la ecuación 3.15.

Tabla 4.18. Incertidumbre por recuperación (U recp)

u obs ,ppm u mrc, ppm U recp

0,003 0,115 0,013 %

En la tabla 4.18 se observa el cálculo de obtención de la incertidumbre por recuperación calculada

aplicando la ecuación 3.16.

CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE TIPO B

Tabla 4.19. Incertidumbre del peso de la muestra (Upm)

U balanza, mg U recp

0,005 2,5x10-4

En la tabla 4.19 se observa el cálculo de obtención de la incertidumbre por peso de muestra

calculada aplicando la ecuación 3.19.

72

Tabla 4.20. Cálculo de la incertidumbre del Patrón

En la tabla 4.20 se observa el cálculo de obtención de la incertidumbre por el estándar calculada

aplicando la ecuación 3.20.

Tabla 4.21 Cálculo de la incertidumbre por dilución U (FD).

Vt

ml

Va

ml

u balón

ml

u micropipeta,

ml

10 5 0,05 1,0x10-3 0,01

En la tabla 4.21 se observa el cálculo de obtención de la incertidumbre por dilución calculada

aplicando la ecuación 3.21.

Tabla 4.22 Incertidumbre balón (10, 5ml).

Tabla 4.23 Incertidumbre micropipeta (Umicrp).

En las tablas 4.22 y 4.23 se observan los cálculos de obtención de la incertidumbre por precisión

de material volumétrico y por la micropipeta calculada aplicando la ecuaciones 3.22, 3.23.

u mrc Umrc

0,03 0,087

Balón ml u, certificado U, balón

5 0,025 0,215

10 0,075 0,375

u pipeta, ul Umicrop

0,001 0,0005

73

Tabla 4.24 Cálculo de la incertidumbre combinada (Uc) y la expandida (U)

COMPONENTE Unidades Factor

U

Estándar

U

Relativa U2

UFR ppm 2 0,013 0,006 3,942E-05

U Resol. pm 0,2 0,012 0,058 3,333E-03

U. mrc %

0,150 0,087 7,500E-03

VOLÚMEN AFORO

Factor de dilución

0,010 0,010 1,002E-04

peso de la muestra g 2 0,00025 0,000125 1,563E-08

MUESTRA

pipeta ul 100 0,0005 0,00001 0,010

V balón 10ml ml 10 0,0375 0,004 1,406E-05

V balón 5ml ml 5 0,125 0,025 6,250E-04

REPRODUCIBILIDAD ppm 2 0,0026 0,001 1,719E-06

RECUPERACION ppm 0,7 0,013 0,019 3,632E-04

∑ 2,2 E-02

U c 0,15

C1 (curva) ppm 0,2

Uc (ppm) 0,030 ppm

U 0,06 ppm

En la tabla 4.24 se observa el cálculo de obtención para incertidumbre combinada y expandida

aportada al método aplicando las ecuaciones 3.24 y 3.25. El informe de validación se presenta en el

anexo 7.

74

4.2 SEGUNDA FASE:

DETERMINACIÓN DE LA PERSISTENCIA DE CIPERMETRINA EN MUESTRAS DE

TOMATE DE ÁRBOL.

4.2.1 Registro de resultados para la determinación de cipermetrina en tomate de árbol

(Solanum betaceum Cav).

Tabla 4.25. Datos obtenidos en el estudio del contenido de cipermetrina en los tomates de árbol

Fumigación Días R 1

(ppm)

R2

(ppm)

R3

(ppm)

Promedio

(ppm)

Desv.

Estándar

Fumigación 1

1 0,73 0,71 0,69 0,71 0,02

8 0,48 0,48 0,61 0,52 0,08

15 0,26 0,26 0,21 0,24 0,03

22 0,19 0,25 0,21 0,22 0,03

30 0,15 0,13 0,17 0,15 0,02

Fumigación 2

1 0,91 0,86 0,94 0,90 0,04

8 0,6 0,65 0,72 0,66 0,06

15 0,38 0,42 0,46 0,42 0,04

22 0,23 0,29 0,33 0,28 0,05

30 0,18 0,2 0,19 0,19 0,01

Fumigación 3

1 0,98 0,94 0,91 0,94 0,04

8 0,71 0,75 0,64 0,70 0,06

15 0,37 0,39 0,32 0,36 0,04

22 0,27 0,29 0,29 0,28 0,01

30 0,25 0,24 0,23 0,24 0,01

En la tabla 4.25 se presentan los resultados obtenidos en el estudio del contenido de cipermetrina

en ppm en los tomates de árbol, luego del análisis de cromatografía de gases.

Los datos encontrados se ilustran para su mejor interpretación en la figura 4.7.

Figura 4.7 Comportamiento de la concentración de cipermetrina en el tiempo luego de cada fumigación

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

0 15 30

Co

nce

ntr

acio

cip

erm

etri

na

(pp

m)

Tiempo (días)

Fumigación 1

Fumigación 2

Fumigación 3

75

La figura 4.7 muestra como el contenido de cipermetrina en tomates de árbol va

disminuyendo en el tiempo después de cada fumigación. Para evaluar la diferencia

significativa o no del tiempo y de las fumigaciones sobre la concentración se realizó el

análisis estadístico que a continuación se detalla.

4.2.2 Análisis estadístico

Tabla 4.26. Análisis de varianza para dos factores con submuestras por grupo.

Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Promedio

de los

cuadrados

F

calculada

Valor crítico

para F

(95%)

Valor crítico

para F

(99%)

Tiempo 2,762 4 0,690 414,83** 2,690 4.018

Fumigaciones 0,147 2 0,074 44,22** 3,316 5,390

Interacción:

Tiempo x fumigaciones 0,042 8 0,005 3,183** 2,266

3,172

Error 0,050 30 0,002

Total 3,001 44

**Existe una diferencia estadísticamente significativa con un nivel del 95,0% y 99,0% de confianza.

4.2.2.1 Con respecto a los días:

En la tabla 4.26 se muestra la información del análisis de varianza, se observa que existe un efecto

altamente significativo del tiempo sobre la concentración de cipermetrina en los tomates luego de

la fumigación, debido a que la F calculada tiene un valor de 414,83 que es mayor a la Fcrítica tanto

para el 95% cómo para el 99%, lo que indica que el tiempo de cosecha es un factor clave a ser

tomado en cuenta para evaluar el contenido de cipermetrina que será dirigido a la comercialización,

y que cumpla los valores permitidos por la INEN 1 1909

Se acepta entonces la Ha, la que menciona que el cambio en el contenido de cipermetrina entre los

días es significativamente diferente.

Se evaluó entonces que días después de la fumigación son diferentes entre sí, con el uso de la

prueba DMS. La tabla 4.27 muestra los rangos obtenidos para dicho factor

76

Tabla 4.27. Pruebas de Rangos Múltiples de DMS para cipermetrina en ppm por días.

Días Casos Media contenido de

cipermetrina (ppm)

Valor

DMS

Grupos

Homogéneos

30 9 0,193 0,039 E

22 9 0,261 0,039 D

15 9 0,348 0,039 C

8 9 0,633 0,039 B

1 9 0,852 0,039 A

Cómo se observa los datos proporcionan 5 grupos diferentes entre sí, es decir que el

contenido de cipermetrina es diferentes en cada día, a un nivel d significancia del 95%, de

manera que durante el periodo de estudio no existe una fase estacionaria en el cambio de

concentración de cipermetrina.

4.2.2.2 Con respecto a las fumigaciones:

El número de fumigaciones ejerce un efecto altamente significativo sobre la concentración de

cipermetrina pues la F calculada tiene un valor de 44,22 que es mayor a la F crítica tanto para el

95% cómo para el 99%, lo que da cuenta que la concentración de cipermetrina en los tomates de la

misma parcela es diferentes, al realizar la segunda y tercera fumigación, que provoca un aumento

de la concentración inicial de cipermetrina y que al tiempo de cosecha este contenido sobrepase los

niveles permitidos en la norma después de la segunda y tercera fumigación, lo que no asegura que

después de cada una de ellas las concentraciones de cipermetrina se mantengan a niveles

adecuados.

El análisis de rango múltiples de DMS mostró los siguientes resultados que se detallan en la tabla

4.28

Tabla 4.28. Pruebas de Rangos Múltiples para cipermetrina en ppm por fumigación.

Fumigación Casos Media Concentración

cipermetrina (ppm)/

fumigación

Valor DMS Grupos

Homogéneos

Fumigación 1 15 0,377333 0,0304 B

Fumigación 2 15 0,490667 0,0304 A

Fumigación 3 15 0,505333 0,0304 A

77

Según el análisis de rango múltiples se observan dos grupos homogéneos A y B, el grupo A está

conformado por las fumigaciones 2 y 3, donde las concentraciones de cipermetrina entre los días no

se diferencian significativamente entre sí, pero dichas fumigaciones provocan un incremento

significativo de la concentración de cipermetrina después de la primera fumigación, lo que

provocará posteriormente que en los días de cosecha el contenido final de cipermetrina no cumpla

con la normativa.

Esto permite presumir que al momento de preparar la solución de pesticida sea acorde a la

concentración final luego de la primera fumigación, de manera que el contenido de la segunda y

tercera aplicación sean aditivas a los residuos de la fumigación anterior.

Tras ellos se acepta la Ha la que menciona que el contenido de cipermetrina es diferente luego de

cada fumigación.

4.2.2.3 Con respecto a la interacción entre fumigaciones y tiempo

Con respecto a la interacción fumigación x tiempo se observa un efecto significativo sobre la

concentración de cipermetrina, debido a que la F calculada tiene un valor de 3,18 que es mayor a la

F crítica tanto para el 95% cómo para el 99%, lo que indica que la concentración de cipermetrina

está influenciada por el tiempo y el número de fumigaciones, confirmándose al análisis anterior,

pues lo óptimo debería ser que únicamente se vea afectada por el tiempo y no por el número de

fumigaciones.

Debido a los resultados anteriormente mencionados, se evaluó la cinética de degradación de

cipermetrina para poder establecer los días óptimos de cosecha, en los que la concentración de

cipermetrina sea menor a 0,2ppm, así como predecir el contenido final de cipermetrina al finalizar

los 30 días de cosecha, de manera que la preparación de la solución de cipermetrina para la segunda

fumigación no adicione pesticida a niveles que irrespeten la norma.

En primero instancia se comparó cada dato obtenido con el valor normado en la INEN 1 1909

como máximo, obteniéndose los resultados que se muestran en la figura 4.8.

78

Figura 4.8 Comparación del contenido de cipermetrina en el tiempo y el número de fumigación con

respecto a lo establecido por la INEN 1 1909

La figura 4.8 muestra cómo la degradación de la cipermetrina en la primera fumigación en la

primera cosecha dada a los 15 días incumplen la normativa establecida en la INEN 1 1909, lo

contrario sucede a los 30 días de cosecha, donde la concentración de cipermetrina cumple con la

normativa. Lo mismo sucede con la fumigación 2, mientras que con la fumigación 3, en ninguno de

los dos días de cosecha (15 y 30 días) el contenido de cipermetrina cumple con la normativa

establecida.

Por ello se debe considerar en primera instancia que la concentración inicial de cipermetrina a ser

aplicada en la fumigación debe ser menor a la que actualmente se coloca.

4.2.2.4 Resultado del análisis sobre el cumplimiento del LMP para cipermetrina en

tomate de árbol

Tabla 4.29 Residuos de cipermetrina en muestras de cosecha

Fumigación

Cosecha Tratamiento

Cipermetrina ,ppm

Tiempo

días

Contenido

residual

LMP

INEN

F1 15 1 T3 0,27

0,2 ppm

F1 30 2 T5 0,15

F2 15 1 T8 0,35

F2 30 2 T10 0,19

F3 15 1 T13 0,46

F3 30 2 T15 0,25

En la tabla 4.29 se registran las concentraciones medias de cipermetrina para cada tratamiento de

cosecha en negrita las cosechas que no cumplen con la norma INEN 1 1909.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

0 15 30

Co

nce

ntr

acio

cip

erm

etri

na

(pp

m)

Tiempo (días)

Comparacion del contenido de cipermetrina con respecto a la norma INEN 1

1909

Fumigación 1

Fumigación 2

Fumigación 3

Limite permitido INEN

79

4.2.2.5 Cinética de degradación

Según la tabla 3.7 de la pág. 54 se evaluó la cinética de degradación para la cipermetrina en frutos

de tomate de árbol en la primera aplicación por observarse ya en está un alto contenido de

cipermetrina que excede el valor permitido por la norma. Los cálculos permitieron determinar que

se ajusta a una cinética de segundo orden, donde el coeficiente de correlación de Pearson (r) fue de

0,9787 y el coeficiente de determinación (R2) fue del 0,9572, la figura 4.9 muestra la linealización

de la cinética.

Figura 4-1: Linealización de la degradación de cipermetrina bajo una cinética de segundo orden.

La ecuación 4.5 describe el comportamiento de degradación de la cipermetrina:

Ecuación 4.1 Comportamiento de degradación de la cipermetrina

De esta manera se procedió a estimar la concentración de cipermetrina en tomates de árbol

destinados a la venta en el momento de su fumigación y en la primera y segunda cosecha, el tiempo

en el cual el contenido de pesticida disminuiría a niveles permisibles así como la concentración

que debió ser aplicada en la primera fumigación, de manera que permita al producto cumplir con

los parámetros establecidos por la INEN 1 1909.

y = 0,1829x + 0,9618 R² = 0,9572

0

1

2

3

4

5

6

7

0 5 10 15 20 25 30

1/c

once

ntr

ació

n c

iper

met

rin

a

(1/p

pm

)

Tiempo (días)

Cinética de degradación cipermetrina en la fumigacion 1

Cinética de degradacióncipermetrina

Lineal (Cinética dedegradación cipermetrina)

𝐶𝑜𝑛𝑐. 𝑐𝑖𝑝𝑒𝑟𝑚𝑒𝑡𝑟𝑖𝑛𝑎 = 96 8 + 8 9 × 𝑡

80

El contenido de cipermetrina aplicada en la primera fumigación se calcula en 1,04 ppm que

disminuye a 0,27 ppm en la primera cosecha, se estimó además que el tiempo en el cual el

producto alcanzaría la concentración máxima residual es de 22 días llegando a la segunda cosecha

con un contenido de pesticida de 0,16 ppm.

La concentración que se debe preparar es de 0,44 ppm, con la que se asegura que en la primera

cosecha la concentración de cipermetrina en los tomates no exceda los 0,2 ppm y la concentración

final sea de 0,16 ppm en la segunda cosecha. Posteriormente se debe aplicar en la segunda y tercera

fumigación soluciones de 0,28 ppm para evitar un incremento de la concentración de cipermetrina.

.

81

CAPÍTULO V

5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

5.1. Conclusiones

PRIMERA FASE

VALIDACIÓN DEL MÉTODO PARA ANÁLISIS DE CIPERMETRINA

En la presente investigación se establecieron las condiciones óptimas para el método de

Cromatografía de Gases/detector de masas MSD condiciones de columna capilar: HP-

5 ( 5% Fenil. Metil Siloxano) de 30 m de longitud, diámetro interno de 320 µm y espesor

de película de 0,25 µm; temperatura límite: - 50ºC a200ºC; temperatura de 270ºC, un flujo

de helio de 1 ml/min, con un volumen de inyección de 0,1µl modo splittles a150ºC. Y las

condiciones necesarias para la preparación de reactivos y tratamiento previo de las

muestras tomate de árbol.

A través del desarrollo de los parámetros de validación establecidos, se establece que el

método para la determinación de cipermetrina por cromatografía de gases con detector

MDS puede ser validado por el método de la Norma Europea 15662 en un intervalo de

trabajo bajo de 0,12 ppm y alto de 2 ppm.

Los parámetros establecidos para la determinación de cipermetrina fueron: Límite de

detección (LOD), límite de cuantificación (LOQ), linealidad y exactitud, establecida por

repetibilidad (r), reproducibilidad (R), recuperabilidad.

A partir del análisis del límite de detección (LOD) 0,04 ppm, el método es capaz de

detectar cantidades mínimas cipermetrina, siempre que estén sobre dicha concentración, el

límite de cuantificación (LOQ) 0,12 ppm de esta forma se estableció que el método es

capaz de cuantificar con precisión y exactitud aceptables concentraciones iguales o

mayores que la dicha concentración.

Se comprobó el cumplimiento de la linealidad del método por su valor del coeficiente de

determinación r2 > 0,99. Existe repetibilidad y reproducibilidad en el método de

determinación de cipermetrina para los rangos altos y bajos con un % 3,59 y un %

CVr de 3,53 valores que se encuentra dentro de los límites aceptables de 20 y 12 %

respectivamente.

82

La exactitud del método analítico cumple con los parámetros y criterios de aceptación

teniendo un rango de recuperación del 95 -105 %, indicado por el MRC utilizado.

La incertidumbre del método está dada por la U expandida de ±0,06 ppm.

SEGUNDA FASE:

DETERMINACIÓN DE LA PERSISTENCIA DE CIPERMETRINA EN MUESTRAS DE

TOMATE DE ÁRBOL.

La parcela en estudio se localizó en una zona ampliamente conocida como productora de

tomate de arbol, esto conlleva que este producto abastesca a una gran cantidad de mercados

de Quito .

El ensayo se desarrolló cuantificando los residuos de pesticida en una parcela modelo, sin

control de factores ambientales a la cual se le dieron tres aplicaciones de pesticida, la

primera fue en el mes de noviembre del 2012 y culminó en febrero del 2013.

La AOAC recomienda utilizar la técnica QuEChERS para la cuantificación de pesticidas

en alimentos, por lo tanto esta investigación se acogió a las recomendaciones de este

organismo adaptando el método a las necesidades del laboratorio de analisis.

Para la determinación cuantitativa de cipermetrina se estableció como método de análisis el

propuesto por la Norma Europea (EN 15662), utilizando como técnica de separación la

cromatografía de gases . Dicho metodo fue adaptado y validado en las condiciones del

Laboratorio de Analisis de Alimentos que pertenece a la Facultad de Ciencias Químicas de

la Universidad Central del Ecuador, en el Cromatógrafo de gas (GC) AGILENT

TECNOLOGIES.

Se determinó cipermetrina en un cultivo de tomate de árbol durante tres meses, mediante

un muestreo completamente al azar. Cada muestra fue adquirida aleatoriamente en cada

una de las tres fumigaciones en un intervalo de tiempo de 0, 7 15, 22 y 30 días después de

la aplicación, en total se obtuvierón 15 tratamientos con tres repeticiones.

Para comparar el contenido de cipermetrina en tomate de árbol obtenido de las lecturas de

las muestras recolectadas, se realizó una gráfica en la cual se pudo observar que la

concentración decayó en función del tiempo. Para estudiar este comportamiento se realizó

83

un análisis de varianza de dos factores con tres muestras por grupo, en el cual se analizaron

las fumigaciones, los tiempos después de cada aplicación y la interacción entre ellos.

Al evaluar los resultados obtenidos por el el análisis de varianza de las lecturas obtenidas

ese determinó que existe un efecto altamente significativo del tiempo sobre la

concentración de cipermetrina en los tomates luego de la fumigación, debido a que la

Fcalculada tiene un valor de 414.83 que es mayor a la F crítica tanto para el 95% cómo

para el 99%, por ello el tiempo de cosecha se consideró como un factor clave a ser tomado

en cuenta para evaluar el contenido de cipermetrina en tomate dirigido a la

comercialización, y que cumpla los valores permitidos por la INEN 1 1909.

Con el uso de la prueba DMS se obtuvo los rangos A, B, C, D y E por contenido de

cipermetrina a los largo de los cinco días de análisis, a un nivel d significancia del 95%,

por lo que se concluyó que durante el periodo de estudio no existió una fase estacionaria en

el cambio de concentración de cipermetrina a lo largo del tiempo.

Con respecto a las fumigaciones, el análisis de varianza muestra que existe un efecto

altamente significativo del número aspersiones sobre la concentración de cipermetrina en

los tomates, debido a que la Fcalculada tiene un valor de 44,22 que es mayor a la Fcrítica

tanto para el 95% cómo para el 99%, por ello el número de cosechas se consideró como un

factor clave a ser tomado en cuenta para evaluar el contenido de cipermetrina en tomate

dirigido a la comercialización, y que cumpla los valores permitidos por la INEN 1 1909.

Con el uso de la prueba DMS para fumigaciones se observó los rangos homogéneos A y

B, la fumigación 1 se encuentra en el rango B siendo la que contiene mayor concentración

de cipermetrina (0,37 ppm) mientras las fumigaciones 2 y 3 se encuentran en el mismo

rango A debido a la concentración residual es semejante entre ellas: 0,49 ppm y 0,5 ppm

respectivamente. Es por ello que la concentración de cipermetrina entre ellas no produjo

una diferencia significativa alta en el análisis de varianza.

Al estudiar conjuntamente la acción de fumigaciones y tiempo se observó un efecto

significativo sobre la concentración de cipermetrina, debido a que la Fcalculada tuvo un

valor de 3,18 que es mayor a la Fcrítica tanto para el 95% cómo para el 99%, por esta

razón se concluye que la concentración de cipermetrina está influenciada por el número de

fumigaciones y el tiempo.

84

Las fumigaciones 2 y 3 provocaron un incremento significativo de la concentración de

pesticida después de la primera aplicación, lo que ocasionó posteriormente que en los días

de cosecha el contenido final de cipermetrina no cumpla con la normativa. Esto permite

concluir que, al momento de preparar la solución de pesticida, su concentración debe

calcularse tomando en cuenta la cantidad residual existente luego de la primera

fumigación, esto debido que su valor final es aditivo.

De la misma manera se estudió los 6 tratamientos de cosecha considerados como aptos

para el consumo (días 15 y 30) y se determinó que únicamente dos de ellos cumplen con el

LMP de 0,2. ppm. Puede indicarse entonces que, para el caso en estudio, producción de

tomate de árbol que ha utilizado las técnicas de aplicación no cumplió con la Norma

Técnica Ecuatoriana INEN 1 1909:2009 Frutas Frescas Tomate de árbol (Requisitos).

El estudio de la cinética aplicado a la primera fumigación permitió determinar que se ajusta

a una cinética de degradación de segundo orden, donde el coeficiente de correlación de

Pearson (r) es de 0,9787 y el coeficiente de determinación (R2) es de 0,9572. Según lo

anterior el contenido de cipermetrina aplicada en la primera fumigación se calculó en 1,04

ppm que disminuyó a 0,27 ppm en la primera cosecha, se estimó además que el tiempo en

el cual el producto alcanzaría la concentración máxima residual es de 22 días llegando a la

segunda cosecha con un contenido de pesticida de 0,16 ppm.

5.2. Recomendaciones

Como se puede observar, en este trabajo se pudo estimar la concentración de cipermetrina en

tomates de árbol destinados a la venta en el momento de su fumigación y en la primera y segunda

cosecha, tiempo en el cual el contenido de pesticida se consideró disminuiría a niveles permisibles,

además de la concentración que debió ser aplicada en la primera fumigación, en estas condiciones

podría considerarse que el producto llegue a cumplir con los parámetros establecidos por la INEN 1

1909, sin embargo es pertinente indicar algunas recomendaciones importantes:

El modelo encontrado para la determinación de la cinética de degradación de cipermetrina

puede aplicarse para calcular las concentraciones residuales de este pesticida, a partir de la

ecuación generada, por ejemplo, se pudo estimar que la concentración inicial para la

primera fumigación debía ser 0,44 ppm para que en la primera cosecha el valor máximo

residual llegase 0,2 ppm y a la segunda cosecha fuese de 1,6 ppm. Después de este

85

tratamiento se puede fumigar con soluciones de concentración de 0,28 ppm, de esta forma

se puede considerar que segunda y tercera fumigación no generen una acumulación de esta

molécula en valores resuduales superiores a los establecidos en la norma.

Se recomienda continuar con la investigación analizando totas las cosechas que se dan a lo

largo del periodo productivo de la parcela que es de 6 meses, tomando en cuenta las

caracteristicas ambeintales de la zona.

Se sugiere el uso de un invernadero como una alternativa para controlar los factores

ambientales lo que deriba en beneficios desde el punto de vista fitosanitario. Tanto para

controlar plagas y enfermedades y por consuguiente contenido de pesticidas .

También es recomendable implementar un sistema de control para residuos de pesticidas

en los lugares de producción, así se podría hacer un estudio más amplio de esta

problemática.

86

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94

7. ANEXOS

ANEXO 1 .- Norma INEN 1.1990 Para frutas frescas. Tomate de árbol. (Requisitos)

95

96

97

98

ANEXO 2.- Residuos de plaguicidas en alimentos y piensos detalles sobre el plaguicida

cipermetrina

99

ANEXO 3 . Información del cultivo de tomate de árbol y su manejo

Ubicación geográfica: Parroquia el Quinche

Sistema de propagación: Semilla Plantas preparadas en pilones

Siembra :

Época de plantación: Durante la época lluviosa y libre de heladas

Distancia de siembra: 3x3 m entre hileras y plantas

Densidad de plantas: 1100 plantas

Etapas del cultivo

Desarrollo de la plantación: La cosecha en un arbusto de tomate de árbol se inicia 10 a 12

meses después de realizado su trasplante.

Fecha de trasplante: Diciembre 2011

Inicio de la cosecha: Noviembre 2012

Vida económica: 4ños

Estacionalidad de la cosecha: disponible todo el año

Técnica de cultivo

Características del terreno: terreno plano alejado de vertientes o fuentes hídricas

Preparación del terreno: con acceso a riego e incorporación de materia orgánica

Trazado de la plantación: La plantación tiene una forma rectangular y su dimensión es de

una hectárea

Hoyado: 20 x 20 x 20 cm

Fertilización de fondo: abono orgánico desinfectado con cal al 40%

Podas: NO

Deshierbado: si

Manejo integrado de plagas

Nombre

común

Nombre

científico

Tratamiento

Producto

Principio

activo

dosis Periodos

Chinche de

las flores y

del fruto

Lrgtoglossus

zonatus

RAMBLER

200 EC

cipermetrina 0,6

ml/Litro

Cada mes

100

ANEXO 4 . Hoja de seguridad química –cipermetrina

101

102

103

104

105

ANEXO 5.- Cromatógrama del blanco (ruido)

Lectura: Blanco 4

Ion M/C

Método: Cromatografía de Gases. Muestra :Tomate de árbol ( productos vegetales con bajo contenido de grasa )

X = mg/Kg (ppm)

A: ua .

Blanco Lectura ppm

1 0,02

2 0,02

3 0,02

4 0,02

5 0,03

6 0,02

7 ND

8 0,02

9 0,02

10 0,02

x 0,02

106

Anexo 6 Cromatógrama cipermetrina

Lectura: Concentración 1.0 ppm.

Ion M/C

Método: Cromatografía de Gases. Muestra :Tomate de árbol ( productos vegetales con bajo contenido de grasa )

X = mg/Kg (ppm)

A: ua .

107

ANEXO 7 Registró de validación de métodos

PESTICIDAS – CIPERMETRINA

RESUMEN DE VALIDACION

Método Cromatografía de Gases

Analíto Cipermetrina

Matriz Tomate de árbol ( productos vegetales con bajo contenido de grasa )

Unidades mg/Kg (ppm)

LIMITES

Limites Valor Unidades

Detección 0,04 mg/Kg (ppm)

Cuantificación 0,12 mg/Kg (ppm)

Recuperación % En cada nivel entre 80 % a 110 %

INCERTIDUMBRE

valor Porcentaje

Acumulada 0,03 0,3% CUMPLE

Expandida 0,05 0,05% CUMPLE

CRITERIOS DE ACEPTACION O RECHAZO

Repetibilidad % SDr ≤ 12 % Menor al 5 % en todos los niveles CUMPLE

Reproducibilidad % SDR ≤ 20% Menor al 5 % en todos los niveles CUMPLE

Incertidumbre

Total

≤ 30 % en todos los

intervalos válidos

0.3%

CUMPLE

Recuperabilidad

95 -105 %

105

CUMPLE

Linealidad 0,995% 0,99 CUMPLE

El método de análisis de CIPERMETRINA en tomates de árbol ha cumplido con todos los criterios

de aceptación por lo que el método se considera como validado

108

ANEXO 8.- Manual kits AGILENT QUECHERS

109

ANEXO 8 .- Manual kits AGILENT QUECHERS Continuación.

110

ANEXO 8 .- Manual kits AGILENT QUECHERS Continuación.

111

ANEXO 8 .- Manual kits AGILENT QUECHERS Continuación.

112

ANEXO 8 .- Manual kits AGILENT QUECHERS Continuación.

113

ANEXO 8 .- Manual kits AGILENT QUECHERS Continuación.

114

ANEXO 9. Certificación de traducción