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67An. Sist. Sanit. Navar. 2007 Vol. 30, Suplemento 2

Microbiología de la tuberculosis

Microbiology of tuberculosis

I. Dorronsoro1, L. Torroba2

RESUMENDurante un siglo, el diagnóstico microbiológico de

la tuberculosis, basado en la baciloscopia y en el aisla-miento e identificación de Mycobacterium tuberculosisen los cultivos, ha sido poco sensible y lento lo queobligaba en ocasiones a iniciar de forma empírica tra-tamiento con tuberculostáticos.

La incorporación rutinaria de medios de cultivolíquidos y técnicas de genética molecular, en la últimadécada del siglo XX, ha supuesto un avance importan-te al aumentar claramente la sensibilidad, precisión yrapidez en el diagnóstico.

La actual eclosión de las técnicas moleculares estápermitiendo un mejor conocimiento de la epidemiolo-gía de la enfermedad, de los factores de virulencia y delos mecanismos de resistencia lo que dará lugar, en unfuturo inmediato, a nuevas estrategias de prevención ytratamiento de la enfermedad.

Palabras clave. Mycobacterium tuberculosis. Diag-nóstico microbiológico. Medios líquidos. Genéticamolecular.

ABSTRACTFor a century, the diagnosis of tuberculosis, based

on bacilloscopy and the isolation and identification ofMycobacterium tuberculosis in cultures, has been slowand not very sensitive. This has made it necessary onoccasions to initiate treatment with tuberculostatics inan empirical way.

The routine incorporation of liquid mediums andmolecular genetic techniques in the final decade of theXX century brought an important advance by clearlyincreasing the sensitivity, precision and rapidity ofdiagnosis.

The present blossoming of molecular techniquesis making possible a better understanding of thedisease’s epidemiology, the factors of virulence and themechanisms of resistance, which in the near future willgive rise to new strategies of prevention and fortreating the disease.

Key words. Mycobacterium tuberculosis.Microbiological diagnosis. Liquid mediums. Moleculargenetics.

Correspondencia:Luis Torroba ÁlvarezLaboratorio de MicrobiologíaHospital Virgen del CaminoC/ Irunlarrea, 431008 PamplonaE mail: [email protected]

1. Servicio de Microbiología. Hospital de Nava-rra. Pamplona.

2. Servicio de Microbiología. Hospital Virgendel Camino. Pamplona

An. Sist. Sanit. Navar. 2007; 30 (Supl. 2): 67-84.

I. Dorronsoro y L. Torroba

68 An. Sist. Sanit. Navar. 2007 Vol. 30, Suplemento 2

INTRODUCCIÓNEn 1882, Robert Koch describió el agen-

te etiológico de la tuberculosis (TB) y lodenominó Bacterium tuberculosis1. El nom-bre inicial fue sustituido por el de Myco-bacterium tuberculosis en 1896 por Leh-mann y Neumann2. El término Mycobacte-rium significa hongo-bacteria, y esta deno-minación se debe al aspecto de los culti-vos, que en ciertos aspectos recuerdan alos de los hongos.

El descubrimiento de M. tuberculosiscausó y sigue causando admiración dadaslas características del microorganismo. M.tuberculosis es una bacteria que requieretécnicas especiales de tinción y medios decultivo distintos a los empleados habitual-mente en bacteriología. Además, parapoder aislarla, y debido a su lento creci-miento, hay que realizar una decontamina-ción previa de la mayoría de las muestras,con el fin de destruir la flora acompañanteque crece más rápidamente.

Con la llegada de nuevas técnicas dediagnóstico están siendo descritas nuevasespecies de Mycobacterium no tuberculo-sis (MNT), algunas de las cuales estánimplicadas en la patología humana. Con-viene disponer de métodos de identifica-ción rápidos y eficaces pero, debido a lacomplejidad de las mismas, el nivel del ser-vicio y la elección de los métodos deben iren función de la población atendida y delos medios disponibles.

GÉNERO MYCOBACTERIUMEl orden de los Actinomycetales incluye

la familia Mycobacteriaceae, Actinomyceta-ceae, Streptomycetaceae y Nocardiaceae.La familia Mycobacteriaceae contiene unsolo género, el género Mycobacterium, delque en sus orígenes sólo se conocían dosespecies: El bacilo de la lepra o Mycobacte-rium leprae (A. Hansen 1874) y el bacilotuberculoso o M. tuberculosis.

Hoy en día, dentro del género Mycobac-terium se han descrito más de 120 especiesde micobacterias diferentes. Se caracteri-zan por ser bacterias ácido-alcohol resis-tentes (BAAR) debido al alto contenido enlípidos que tienen en su pared celular. Estehecho impide que penetren los colorantes

habituales de anilina, por lo que no se pue-den ver en la tinción de Gram, y hace quepara poder visualizarlas sean necesarioscolorantes especiales (arilmetanos), peroque una vez teñidas no se decoloran conuna mezcla de alcohol y ácido.

Las micobacterias son capaces de sobre-vivir durante semanas o meses sobre obje-tos inanimados, siempre que estén protegi-das de la luz solar, y son más resistentes alos ácidos, álcalis y desinfectantes que elresto de las bacterias no formadoras deesporas. Resisten la desecación y la conge-lación, pero la luz ultravioleta y el calor(>65º C durante 30 minutos) las inactiva3.

Mycobacterium tuberculosiscomplex

Engloba a un grupo de micobacteriasque presentan >95% de homología en suDNA y que se designa como “complejo M.tuberculosis“ (o MTC). Está compuesto, ade-más de M. tuberculosis, por Mycobacteriumbovis, M. bovis BCG (una cepa variante delaboratorio utilizada en vacunación y en ins-tilaciones vesicales en pacientes con neo-plasia de vejiga), Mycobacterium africanum(principal causante de la TB en África tropi-cal), Mycobacterium microti (causante de laTB en roedores, llamas y otros mamíferos) yMycobacterium canetii. Habitualmente se uti-liza el termino de M. tuberculosis o bacilotuberculoso como sinónimo de todas ellas,ya que se identifican, en la mayoría de loslaboratorios, mediante la hibridación conuna sonda de DNA, común para todo el com-plejo, y porque el aislamiento de cualquierade ellas en muestras clínicas establece, porsí mismo, el diagnóstico de TB en el pacien-te. Sin embargo, entre ellas existen caracte-rísticas diferenciales importantes para elmanejo de los pacientes (p. e., M. bovis esresistente a pirazinamida) y por su interésepidemiológico.

Mycobacterium no tuberculosis(MNT)

Hoy en día, el 10-30 % de las micobac-terias aisladas en laboratorios clínicoscorresponden al grupo de las micobacte-rias no pertenecientes al complejo M.tuberculosis. Este grupo heterogéneo demicobacterias ha recibido históricamente


MICROBIOLOGÍA DE LA TUBERCULOSIS

otros nombres como micobacterias atípi-cas, “Mycobacterium other than tuberculo-sis” (MOTT), micobacterias ambientales omicobacterias oportunistas. Inicialmente,la nomenclatura de estas especies se reali-zó atendiendo a su poder patógeno paralas distintas especies animales como Myco-bacterium simiae o Mycobacterium avium.Posteriormente se fueron aislando otrasmicobacterias a partir de muestrasambientales (aguas de lagos o ríos, cañerí-as de los hospitales, suelo, polvo, etc.).Constituyen un grupo muy numeroso,heterogéneo y difícil de sistematizar. Algu-nas especies son muy ubicuas y poco pató-genas; otras son menos ubicuas y su aisla-miento tiene un alto valor predictivo deenfermedad; otras no tienen significadoclínico conocido y cada vez es más fre-cuente la descripción de nuevas especies

no conocidas previamente. Durantemuchos años (primeros 2/3 del siglo XX),apenas se les dio importancia, no obstan-te, ya en 1954, Timpe y Runyon realizaronun primer intento de clasificación de lasMNT aisladas de pacientes, basada en suscaracterísticas de crecimiento y pigmenta-ción (Tabla 1). Tras el declive progresivode la TB en los países desarrollados y lairrupción del SIDA, se fue acumulando másexperiencia sobre casos clínicos debidos aMNT. En cualquier caso, y a diferencia deMTC, el aislamiento de MNT en muestrasde pacientes no es criterio suficiente paraestablecer el diagnóstico de enfermedadpor micobacterias y son poco o nada con-tagiosas entre las personas.

Debido a la frecuencia con que produ-cen enfermedad (micobacteriosis) o bien

Tabla 1. Principales micobacterias aisladas de muestras clínicas*.

Mycobacterium tuberculosis complexMycobacterium tuberculosisMycobacterium africanumMycobacterium bovisMycobacterium bovis BCG

Micobacterias No Tuberculosas (MNT)De crecimiento lento: De crecimiento rápido:

Micobacterias no cromógenas: Micobacterias no cromógenas:Mycobacterium avium complex Mycobacterium abscesusMycobacterium celatum Mycobacterium chelonaeMycobacterium gastri Mycobacterium fortuitumMycobacterium genavense Mycobacterium mucogenicumMycobacterium haemophilum Mycobacterium smegmatisMycobacterium malmoenseMycobacterium shigmoideiMycobacterium terrae complexMycobacterium trivialeMycobacterium ulceransMycobacterium xenopi

Micobacterias cromógenas: Micobacterias cromógenas:Mycobacterium asiaticum Mycobacterium phleiMycobacterium flavescens Mycobacterium vacaeMycobacterium gordonae Mycobacterium kansasiiMycobacterium marinumMycobacterium scrofulaceumMycobacterium simiaeMycobacterium szulgaiMycobacterium xenopi

*Según un esquema modificado, tomado Vicent y col4.



porque se aíslan con relativa frecuencia enlos laboratorios clínicos vamos a reseñaralgunas de ellas:

Mycobacterium avium

Se ha aislado del agua, plantas, tierra yotras fuentes ambientales. Tienen baja pato-genicidad y conocer el verdadero significa-do clínico de su aislamiento a partir demuestras respiratorias suele ser muy difícil.Cuando se aíslan repetidamente ante cua-dros clínicos similares a TB y no se encuen-tran otros patógenos puede ser que tengansignificación clínica. Entre 1983 (aparicióndel SIDA) y 1997 (eclosión de la terapia anti-retroviral intensiva) fue la causa mas fre-cuente de infección por micobacterias enlos Estados Unidos. Solía afectar a pacientescon recuentos de CD4 inferiores a 50/mm3,dando lugar a un cuadro diseminado (conaislamiento en hemocultivos) que podíaafectar a cualquier órgano. Cuando fue des-crito este cuadro, la TB en EEUU se hallabamuy controlada y la infección por M. aviumfue una de las formas más frecuentes de pre-sentación del SIDA5,6. En otros países comoes el caso de España, la incidencia de TB aldescubrirse el SIDA era alta y la principalinfección por micobacterias en los pacien-tes coinfectados con el VIH, siempre ha sidola tuberculosis, siendo la infección por M.avium mucho menos frecuente7. La morfolo-gía del microorganismo en las tinciones escocobacilar y sus colonias en los medios decultivo son muy heterogéneas.

Mycobacterium kansasii

Es una de las especies que se aísla conmás frecuencia en casos de micobacteriosis.Produce cuadros clínicos semejantes a latuberculosis y su aislamiento a partir demuestras respiratorias casi siempre sueletener significado clínico. Pese a ello, antesde atribuirle un significado clínico definitivose debe procurar su aislamiento repetido, aligual que ocurre con todas las MNT8. Sumorfología en la baciloscopia suele sercaracterística.

Mycobacterium gordonae

Se aísla con frecuencia y no suele tenersignificación clínica. Hay muy pocos casos,

aproximadamente 20, documentados deenfermedad producida por M. gordonae.

En cuanto al resto de micobacterias,hay algunas a las que se atribuyen cuadrosclínicos específicos, como las infeccionesde piel debidas a M. marinum y M. ulcerans(causante este último de la úlcera de Buru-li), y otras que precisan enriquecimientosespeciales de los medios de cultivo parapoder crecer (Mycobacterium haemophi-lum y Mycobacterium genavense).

DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICOEl diagnóstico microbiológico de la

tuberculosis exige la detección, aislamien-to e identificación de M. tuberculosis, asícomo la determinación de su sensibilidadfrente a las drogas tuberculostáticas. Ladetección precoz del individuo bacilíferoes uno de los pilares básicos de una buenaorganización en la lucha contra la tubercu-losis.

La sensibilidad y especificidad de losdistintos métodos de detección es variabley depende mucho de la experiencia e idio-sincrasia de cada laboratorio en particular yde cómo los adapte a su rutina de trabajo.En general, el examen microscópico directode las muestras clínicas, mediante técnicasespecíficas de tinción (baciloscopia), es latécnica menos sensible pero la más rápida.Los cultivos son las más sensibles y más len-tas, mientras que las técnicas molecularesbasadas en amplificaciones genómicas tie-nen una sensibilidad menor que los cultivospero son más rápidas.

La sensibilidad de la baciloscopiaaumenta cuando las muestras se concen-tran. El cultivo aumenta la sensibilidad dela baciloscopia en un 30-60%, dependiendodel laboratorio, del tipo de muestra, y delos medios utilizados. La utilización demedios líquidos ha mejorado notablemen-te los resultados del cultivo por lo que enla actualidad, resultan imprescindibles. Enel laboratorio del Hospital de Navarra seempezó en 1996, a utilizar un medio líqui-do (BACTEC 460TB, Becton Dickinson),junto con el medio sólido clásico deLöwenstein-Jensen (L-J). Posteriormente,se observó que el 18,6% de los aislamien-tos de M. tuberculosis se realizaron exclusi-vamente en el medio líquido y el tiempo



medio de diagnóstico se acortó a 14,2 días,frente a 22,7 días que tardaban en aparecerlas colonias en L-J.

Se han desarrollado una variedad depruebas inmunológicas, que ponen demanifiesto la respuesta específica del hués-ped frente al agente infeccioso. La pruebade la tuberculina fue la primera empleada yha sido la más utilizada, aunque no permitediferenciar la infección de la enfermedad. Sehan descrito una variedad de pruebas “invitro” (QuantiFERON-TB Gold and T-SPOT.TB) que miden la producción de inter-feron-gamma frente a antígenos específicosde micobacterias para ver la respuestainmune y de las que se ha tratado en el ante-rior capítulo de este tratado9.

ORGANIZACIÓN DE LOSLABORATORIOS

La American Thoracic Society recomien-da que el diagnóstico microbiológico de latuberculosis se lleve a cabo, únicamente,en laboratorios con las adecuadas medi-das de seguridad y cuyo volumen de tra-bajo y competencia en el área de las mico-bacterias esté asegurada10.

En 1993, ante el resurgir de la tubercu-losis en Estados Unidos, los “Centers forDisease Control and Prevention” (CDC) deAtlanta, dieron las siguientes recomenda-ciones para los laboratorios de micobacte-rias:

Proporcionar a los laboratorios losmedios para que puedan informar de losresultados de los exámenes directos en 24horas.

Exigir que los laboratorios utilicen téc-nicas de tinción fluorescentes, más sensi-bles que las clásicas de Ziehl-Neelsen.

Utilizar medios líquidos en el cultivoprimario, conjuntamente con el clásico deL-J.

Utilizar medios rápidos de identifica-ción como sondas.

Realizar los estudios de sensibilidad enmedio BACTEC o similares, que proporcio-nen resultados fiables y rápidos.

La finalidad de estas recomendacioneses proporcionar al clínico informaciónrápida que le sirva para la toma de deci-

siones, de modo que: los exámenes direc-tos no se demoren más de 24 h, el aisla-miento e identificación de M. tuberculosispueda realizarse en 10-14 días y los resul-tados del estudio de sensibilidad puedanestar disponibles en 15-30 días11. La conse-cución de estos objetivos es hoy factibleen muchos laboratorios.

Recogida y transporte de muestrasUn concepto clásico en el diagnóstico

de la tuberculosis es que la eliminación debacilos, en muchos casos puede ser inter-mitente. Este concepto lo avala el hechode que en ocasiones, entre varias muestrasprocesadas, sólamente una resulta positi-va. Si bien es verdad que el estudio devarias muestras incrementa las posibilida-des de diagnóstico, en la actualidad, conlas mejoras introducidas y la necesidad derentabilizar los procedimientos de diag-nóstico, hay laboratorios que han reduci-do de 3 a 2 el número de muestras respira-torias recomendadas para un procesa-miento rutinario12,13. La mejor muestra es laprimera expectoración de la mañana. Lasmuestras una vez obtenidas, bien cerradoel frasco y bien identificadas, se transpor-tan al laboratorio lo mas rápidamenteposible. Si va a transcurrir más de unahora entre la expectoración y la recepciónen el laboratorio deberá permanecer enfrío (5-8ºC) y no a temperatura ambiente.Se desaconseja la práctica de recomendaral paciente que guarde 3 esputos y loslleve a la vez al laboratorio ya que es muyprobable que se contaminen los cultivos yno sean útiles ni para descartar ni paraconfirmar el diagnóstico. Se deben extre-mar las medidas en la identificación de lasmuestras para que no se produzcan erro-res en el diagnóstico microbiológico.

Técnicas de tinción o baciloscopiasTienen por objeto, poder visualizar en

el microscopio la presencia o no de BAARen las muestras. Actualmente siguen cons-tituyendo la forma más rápida y económi-ca para diagnosticar la TB. No obstante,dado que su sensibilidad (40-70% en mues-tras respiratorias) y su especificidad noson absolutas, es necesario realizar siem-pre cultivos para un diagnóstico de certe-



za. Existen multitud de variantes descritasde técnicas para las baciloscopias; inclusolas hay para observadores daltónicos14. Noobstante las dos más utilizadas son:

• La tinción de Ziehl-Neelsen. Utilizafucsina y fenol junto con el calenta-miento de las preparaciones. Las mico-bacterias se tiñen de rojo, coloranteque perdura pese a la posterior decolo-ración con una mezcla de alcohol-clor-hídrico, sobre un fondo azul o verde,según se utilice como colorante de con-traste el azul de metileno o el verdemalaquita. Exige la observación con elobjetivo de inmersión (1.000 aumen-tos), por lo que, debido a que enmuchas preparaciones la presencia debacilos puede ser escasa, es necesarioun mínimo de 10 minutos de observa-ción antes de valorar el examen comonegativo.

• La s tinciones con fluorocromos.Emplean como primer colorante laauramina-rodamina. Se tiñen en frío y,como en el caso anterior, tampoco sedecolora con la mezcla de alcohol-clor-hídrico. Al observarlos en un microsco-pio de fluorescencia, las micobacteriasemiten una luz fluorescente. Esta luzemitida puede ser detectada rápida-mente. Las preparaciones se observancon un objetivo de menor aumento,con lo que la superficie visualizada esmayor, lo cual hace que la tinción resul-te más sensible y requiera menos tiem-po de observación (1-2 minutos). Losinconvenientes de esta técnica son ladificultad del enfoque, que requiere unmicroscopio de fluorescencia, quealgunas MNT de crecimiento rápidopuede que no se tiñan, que puede a lalarga dañar la vista del observador y,sobre todo, que es necesario personalcon suficiente experiencia para visuali-zarlas. La decisión de utilizar una uotra en cada laboratorio está en fun-ción del número de baciloscopias quese realizan, la dotación de personal (sunúmero y su experiencia) y del materialdisponible. En una jornada laboral unsolo observador es prácticamenteimposible que pueda ver más de 15-20tinciones de Ziehl con garantías, mien-

tras que podría ver 50-60 tinciones fluo-rescentes.

Cuantificación de las baciloscopias

El número de bacilos ácido-alcoholresistentes presentes en una muestra esun índice de la severidad de las lesiones ydel grado de infectividad, por lo que lacuantificación de las muestras positivas esuna práctica habitual pero hay que teneren cuenta si la tinción se ha realizado de lamuestra directa o tras el proceso de HDC.En muchos laboratorios, como en el nues-tro, no se realiza rutinariamente una baci-loscopia a la muestra directamente sinoque se hace siempre tras el proceso dedecontaminación ya que se consiguemayor sensibilidad. Cuando se utiliza unfluorocromo3 y si únicamente se observanhasta 9 bacilos en toda la preparación, seinforma como Dudosa. Entre 1-9 bacilos en10 campos, se informa: Positiva 1+. Entre 1-9 bacilos por campo, se informa: Positiva2+. Entre 10-90 bacilos por campo, se infor-ma: Positiva 3+; y si se observan mas de 90bacilos por campo, se informa: Positiva 4+.

Morfología de los BAAR

Habitualmente la morfología de losBAAR en las tinciones no permite diferen-ciar si se trata de una micobacteria u otra.No obstante un observador experimenta-do puede sospechar que no se trata deMTC cuando no aprecia su forma alargaday su dishomogeneidad en la coloración.Hay que tener en cuenta que la morfologíadel bacilo se altera durante el tratamientotuberculostático. M. kansasii puede obser-varse como muy largo y con morfologíaacebrada lo que, aunque no definitivo, esmuy característico. M avium se ve comobacilos muy cortos y con tinción uniforme.Mycobacterium fortuitum y Mycobacteriumchelonae pueden ser muy polimorfos.

Causas de falsos positivos

Existen una serie de circunstancias téc-nicas que pueden dar lugar, en personal noexperimentado, a errores al informar comoBAAR acúmulos de pigmento debidos: a lapresencia de restos de comida, aceites, cerao fibras en la muestra, a la reutilización deportas con fisuras en las que se acantona el



colorante o a la no filtración de los reacti-vos. Otras veces se ven verdaderos BAARpero puede tratarse de MNT en vez de MTCy ser saprofitos o colonizantes del paciente.También se dan casos de falsos positivos enlos que los BAAR visualizados no pertene-cen al paciente; así, si las cañerías del hos-pital están colonizadas con MNT y utiliza-mos esta agua para preparar la solucióndecontaminante luego podremos visualizar-las en la baciloscopia, o bien cuando trans-ferimos BAAR de un porta a otro con el acei-te contaminado utilizado con el objetivo deinmersión, en la microscopía óptica.

Causas de falsos negativos

Pueden encontrarse falsos negativos porrealizar un frotis demasiado grueso o dema-siado fino, por desprendimiento del frotis sicalentamos excesivamente el porta. La faltade tiempo, la impaciencia o el cansancio delobservador es la más importante. En el casode tinción con fluorocromos la exposiciónexcesiva a la luz UV pude hacer perder lacapacidad de emitir fluorescencia. Hay quetener en cuenta que al hacer una extensióndel material en el porta para la realizaciónde la baciloscopia se utilizan 0,01 ml. Cuan-do en 1 ml de esputo hay un millón de BAARla baciloscopia siempre suele ser positivamientras que si hay 10.000 BAAR sólo espositiva en el 60%. La sensibilidad clara-mente disminuye cuando el nº de BAAR/mlde esputo es menor.

Persistencia de baciloscopias positivasen pacientes recibiendo tratamientoadecuado

A los 30 días de tratamiento el nº deBAAR visualizados en la tinción debe ser cla-ramente inferior al de la baciloscopia inicial.Hasta el 50% permanecen con baciloscopiaspositivas al final del segundo mes y menosdel 20% son positivos al final del tercer mes.Esta persistencia de baciloscopias positivasno debe hacer pensar en fracaso del trata-miento siempre que los cultivos sean nega-tivos. Estos deben ser negativos a partir delos 30 días de tratamiento14.

TÉCNICAS DE CULTIVOLos cultivos siguen siendo los métodos

más sensibles para la detección de MTC en

pacientes que no están recibiendo tubercu-lostáticos. Pueden detectar entre 10 y 100bacilos/ml de esputo. A pesar del gran desa-rrollo y revolución que han supuesto, desde1990, las técnicas moleculares, sobre todolas basadas en amplificación de ácidosnucleicos (AAN), ninguna de ellas, a fechaactual, ha conseguido en estudios clínicosser tan sensible como los cultivos. Sinembargo, precisaremos de medios de culti-vo específicos ya que con la inoculacióndirecta de la muestra en los medios de cul-tivo habituales no crecen las micobacterias.El microbiólogo por tanto debe ser informa-do de si a una muestra respiratoria se ledesea buscar una micobacteria o no.

La mayoría de las muestras respirato-rias (excepto el líquido pleural obtenidopor toracocentesis) contienen otros micro-organismos que crecen rápidamente y quees preciso eliminar para que puedan desa-rrollarse las micobacterias. Para ello se rea-lizan unos procedimientos de decontamina-ción de la muestra que a su vez la homoge-neizan y la concentran (DHC). Estos proce-dimientos empleados para destruir las bac-terias contaminantes deben preservar a lasmicobacterias, sin embargo, no es posibleinactivar los contaminantes sin dañar a lasmicobacterias. Se acepta que el procedi-miento es adecuado si se contaminan (y portanto no son útiles para establecer el diag-nóstico) un 5% de los cultivos realizados. Siel porcentaje de cultivos contaminados esinferior se asume que la decontaminaciónes excesiva y puede hacer que, si la canti-dad de micobacterias presentes en la mues-tra es pequeña, éstas no sean viables y nocrezcan en los cultivos.

Todo el procesamiento, debe llevarse acabo en cabinas de seguridad biológica ypor personal bien entrenado. Deben extre-marse las medidas y los controles para evi-tar tanto la contaminación del personal,como la de otras muestras que se proce-san al mismo tiempo15

.Existen diversos métodos descritos

para decontaminar las muestras. Los másutilizados han sido los del laurilsulfatosódico (descrito por Tacquet y Tison) y elde la N-acetil-cisteína-hidróxido sódico(NALC-NaOH). En Europa se utilizaba másel del lauril y en USA el NALC-NaOH. El



método del laurilsulfato sódico continúamanteniendo su actividad antibacterianadurante todo el periodo de incubación (yno sólo durante la inoculación) cuando seutilizan medios de cultivo líquidos o conbase de agar, lo cual puede disminuir surendimiento. Es muy buena opción cuandose utilizan medios en base de huevo ya quela lecitina inactiva la acción antibacteria-na14. La incorporación rutinaria en los últi-mos 10 años de los medios líquidos hahecho que la mayor parte de los laborato-rios utilicemos el NALC-NaOH siguiendolas recomendaciones de los proveedores yde los CDC16.

Estos métodos de DHC son muy labo-riosos y tediosos para los trabajadoresdurando varias horas y en ellos hay unaserie de variables que pueden incidir enque luego podamos recuperar o no el MTC.La concentración del decontaminante, eltiempo que está en contacto con la mues-tra, las revoluciones y la temperatura de lacentrífuga son las más importantes.

Una vez que las muestras se han decon-taminado y concentrado, se procede a larealización de las extensiones para tincióny a la inoculación de los medios de cultivo.Cada vez es mayor el número de laborato-rios que además hacen técnicas de amplifi-cación de ácidos nucleicos (AAN), bien seade forma inmediata (en el mismo día) o dife-rida (1-3 veces por semana).

La incubación de los medios de cultivose realiza a 35-37ºC que es la temperaturaóptima para el desarrollo de la mayoría delas micobacterias, con excepción de lasmuestras de piel que deben incubarse ade-más a 28ºC ya que muchas micobacteriasque producen infecciones de la piel y teji-do subcutáneo se aíslan a esta temperatu-ra. Los cultivos se mantienen un mínimode 7 semanas antes de descartarlos comonegativos.

Los medios de cultivo pueden ser líqui-dos o sólidos. Éstos a su vez se diferencianen que la base sea agar (las diferentesvariantes del agar Middlebrook son lasmás utilizadas) o de huevo (el medio L-J yel medio Coletsos son los más utilizados).

La detección del crecimiento dependedel tipo de medios empleados. Con losmedios sólidos en base de huevo la detec-

ción se realiza mediante la observaciónmacroscópica 1 vez por semana. Si utiliza-mos medios en base de agar habrá quevisualizarlos con el microscopio (100aumentos) 2-3 veces por semana (Figs. 1 y2). Los medios en base de agar cada vezson menos utilizados de forma rutinaria yaque consumen mucho tiempo de personalexperimentado para poder leerlos y a quela fundamental ventaja que antaño tenían,que era la detección más precoz del creci-miento, es menor desde la incorporaciónde los medios líquidos.

Los medios líquidos son más sensiblesque los sólidos y además detectan el creci-miento más precozmente. Antiguamentesólo se utilizaban en muestras muy con-cretas como líquidos cefalorraquídeos. Aprincipios de la década de los 80 salió almercado un sistema denominado BACTEC460, hoy en día comercializado por BectonDickinson (BD), que consiste en unos fras-cos con medio líquido Middlebrook 7H9modificado (denominado Middlebrook7H12) en que el ácido palmítico del medioestá marcado con un isótopo del carbono.Los viales son leídos 2-3 veces por semanalas dos primeras semanas y 1 vez porsemana las cinco restantes en un aparatoque pincha el frasco y detecta si hay o nocrecimiento bacteriano en función de laradiactividad medida. Constituye el patrónde referencia con el que se comparantodos los medios antes de ser aprobadospara su uso diagnóstico. Sólo algunos hos-pitales dotados de infraestructura paratrabajar con material radiactivo lo introdu-jeron en su rutina de trabajo.

A partir de 1995 empiezan a salir almercado medios líquidos que obvian elproblema de la radiactividad y del tenerque pinchar el frasco (con la teórica posi-bilidad de contaminar un frasco con bacte-rias del frasco anterior). Estos medios seintroducen en unos aparatos que incubanlos frascos y a su vez realizan una monito-rización continua de la actividad metabóli-ca que hay en su interior para ver si haycrecimiento o no. Los más utilizados son elMGIT (Mycobacterial Growth IndicatorTube, BD), el ESP Culture System II (TrekDiagnostic Systems) y el MB/BacT ALERT3D (BioMerieux). MGIT utiliza un sensor defluorescencia, ESP de presión y MB/BacT



Figura 1. Imagen de Mycobacterium tuberculosis en medio Middlebrook 7H11 tras crecimiento en mediolíquido MGIT.

Figura 2. Imagen de una colonia de Mycobacterium no tuberculosis (MNT) en medio Middlebrook7H11.



de colorimetría para detectar el crecimien-to. Estos sistemas se han introducido en lamayor parte de los laboratorios y hanconstituido un gran avance.

TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓNUna vez que se ha detectado creci-

miento en alguno de los medios, se realizala tinción de Ziehl-Neelsen para ver si loque ha crecido son BAAR o no (Fig. 3).Caso de ser BAAR, su morfología nospuede orientar, en algunas ocasiones,hacia una especie u otra como en el casode M. avium o de M. kansasii. Además lavisualización de BAAR formando cordones(en medios líquidos) es muy característicadel crecimiento de M. tuberculosis, aunqueno patognomónica (Fig. 4)17.

Lo prioritario para el manejo de lospacientes es saber si se trata de MTC o deMNT. Para ello, hoy en día, la mayoría delos laboratorios realizan la identificaciónde MTC mediante sondas genéticas debidoa su rapidez, precisión y simplicidad.

Tradicionalmente la identificación serealizaba en base a una serie de caracterís-ticas fenotípicas. La velocidad de creci-miento en los cultivos y la temperaturaóptima para ello, la morfología de la colo-nia, su pigmentación y su fotorreactividadorientaban preliminarmente hacia unasmicobacterias u otras y posteriormente serealizaban pruebas bioquímicas a partir dela cepa crecida. Se considera que una mico-bacteria es de crecimiento lento cuando alhacer un subcultivo de una cepa, enmedios de cultivo como el L-J, tardan másde 5-7 días en apreciarse las coloniasmacroscópicamente. Es cromógena cuandola colonia presenta pigmentación (Fig. 5),no cromógena cuando no la presenta y foto-cromógena cuando pigmenta tras exposi-ción a la luz. M. tuberculosis es una mico-bacteria no cromógena (Fig. 6) y de creci-miento lento. Sin embargo, cuando la baci-loscopia es muy positiva, crece en los culti-vos en medios líquidos en menos de unasemana. Algunas de las pruebas bioquími-

Figura 3. Tinción de Ziehl-Neelsen de Mycobacterium no tuberculosis (MNT) tras crecimiento en mediolíquido MGIT.



Figura 5. Crecimiento de colonias de una mico-bacteria cromógena en medioLöwenstein-Jensen.

Figura 6. Crecimiento de colonias de Mycobac-terium tuberculosis en medio Löwens-tein-Jensen.

Figura 4. Tinción de Ziehl-Neelsen de Mycobacterium tuberculosis (MNT) tras crecimiento en mediolíquido MGIT con formación de cordón (“cord factor”).



cas utilizadas en la identificación de lasmicobacterias son el test de acumulaciónde niacina, la reducción de los nitratos, lahidrólisis del Tween, la catalasa, la capta-ción de hierro, la pirazinamidasa, la detec-ción de actividad ureasa, arylsulfatasa, etc.

Estos métodos clásicos, basados enpruebas bioquímicas, son muy lentos,laboriosos y peligrosos para el trabajador(además del riesgo de contagio, ya que serequiere trabajar con inóculos fuertes demicobacterias vivas, hay pruebas bioquí-micas como la de la niacina, que suele serpositiva en M. tuberculosis en la que se for-maban compuestos de cianuro).

Hoy en día, la mayoría de los laborato-rios realizan la identificación de MTCmediante sondas genéticas. A principiosde la década de los 90 se comercializaronsondas muy sensibles y específicas quepermiten la identificación en 2 horas(AccuProbe, Gen-Probe Inc, San Diego,CA). Se trata de una prueba de hibridaciónen la que la sonda está compuesta porDNA de cadena única, complementario delRNA ribosomal de la micobacteria proble-ma, y al que se ha unido un marcador qui-mioluminiscente. El RNA de la bacteria selibera previamente mediante su rotura conultrasonidos. La sonda de DNA marcadocombina con el RNA de la bacteria proble-ma dando un híbrido estable DNA:RNA. Laseñal emitida por el híbrido marcadoDNA:RNA se mide en un luminómetro,dando un resultado positivo o negativo,según alcance o no un umbral establecido.Tiene la limitación de que no permite ladiferenciación entre las diferentes varian-tes del complejo MTC. La diferenciaciónentre ellas se hará mediante pruebas bio-químicas clásicas como la producción denitritos y la sensibilidad a pirazinamida omediante estudios moleculares. Tambiénexisten y se utilizan sondas para la identi-ficación del grupo Mycobacterium avium-intracellulare, M. avium, M. intracellulare,M. gordonae y M. kansasii que son las espe-cies que se aíslan con más frecuencia.

Para la identificación de especies distin-tas de éstas, se recurre a distintos procedi-mientos. Los métodos clásicos de identifi-cación están siendo sustituidos por los cro-matográficos o genético-moleculares18.

Identificación cromatográficamediante análisis de los ácidosmicólicos

Los ácidos micólicos son ácidos gra-sos de alto peso molecular que formanparte de la pared celular de las micobacte-rias y otros géneros relacionados (Nocar-dia, Corynebacterium, Rhodococcus, Tsuka-murella, etc.) El análisis de los ésteres deestos ácidos con diferentes técnicas cro-matográficas permite realizar una identifi-cación rápida, precisa y reproducible. Lacromatografía líquida de alta eficiencia(HPLC) ha sido la que más se ha desarro-llado y estandarizado. No obstante serequiere partir de abundante masa de bac-terias para poder realizarlas lo cual impli-ca que se necesita más tiempo hasta con-seguir que el cultivo alcance la suficientemasa. Son técnicas complejas, que requie-ren una infraestructura costosa, un granentrenamiento del personal por lo que sonpocos los centros con dotación y expe-riencia suficiente para realizarlas.

Identificación mediante estudiosgenético-moleculares

El genoma completo de una cepa deMTC se ha secuenciado y contiene 4,4millones de pares de bases, 4.000 genesque codifican proteínas y 50 que codificanRNA4. Las micobacterias contienen regio-nes bien conservadas de su DNA específi-cas de género y regiones hipervariablesespecíficas de especie. Estas últimas sonlas que se utilizan como dianas, siendo lasmejor estudiadas: el gen hsp65, que codifi-ca la proteína de 65 KDa (heat shock),regiones genómicas de la subunidad ribo-sómica 16S, la región intergénica 16S-23S ylos elementos de inserción. El grupo detécnicas que mayor interés y desarrollotienen hoy en día se basan en la AAN dealgunas de las secuencias citadas. Algunasde las más utilizadas son:

PCR-RFLP (PRA)Consiste en realizar una PCR (reacción

en cadena de la polimerasa), que es una delas técnicas de AAN más utilizada, del genhsp65 seguida de un posterior análisis delpolimorfismo de la longitud de los frag-mentos de restricción (RFLP) tras la apli-



cación de 2 enzimas (BstEII y HaeIII) sobrelo amplificado. Fue descrita en 1992 y, en1993 el asturiano Telenti19,20 la simplificó ymodificó habiendo sido utilizada por mul-titud de centros (en la página webhttp://app.chuv.ch/prasite/index.html sepueden consultar los patrones de los poli-morfismos encontrados). Consigue unaidentificación rápida (en una jornada labo-ral), precisa y económica de múltiplescepas. Tiene muchísima capacidad discri-minatoria, siendo capaz de diferenciarunas 36 especies diferentes y las subespe-cies de los diferentes complejos micobac-terianos, pero no discrimina las diferentesvariantes del MTC. No necesita muchamasa de micobacterias y el equipamientonecesario no es excesivamente caro. Aun-que bastante estandarizado tiene el incon-veniente de que no es un método demasia-do sencillo de realizar y que no estácomercializado ni aprobado por la FDA.

Secuenciación del DNA

La secuenciación completa del 16SrDNA (1.500 pares de bases) o del hsp65(400 pares de bases) está fuera del alcancede la mayoría de los laboratorios. La iden-tificación dentro del 16S rDNA de secuen-cias específicas de especie, permite eldiseño de protocolos sencillos de PCRseguidos de secuenciación de lo amplifica-do. Aunque la mayoría de los laboratoriosno dispone de secuenciadores automatiza-dos se pueden enviar los amplicones obte-nidos a centros de referencia para que lossecuencien. Esta técnica permite la identi-ficación de muchas micobacterias en lasque no es posible hacerlo por métodosfenotípicos y constituye el patrón de refe-rencia de las identificaciones genotípicas.El rápido progreso de la tecnología con laaparición de nuevos secuenciadores capi-lares de microchips de secuenciación, esposible que facilite la difusión en el futurode estas técnicas.

Hibridación en fase sólida

Se basa en la disponibilidad de sondascortas de DNA específicas de especie, pre-sentadas en formatos convencionales (pla-cas con micropocillos, tiras de nitrocelulo-sa, etc.) o novedosos (chips o arrays de

DNA). Se aplica el producto amplificadofrente a diversas sondas en una sola prue-ba. Existen 2 productos comerciales contiras de nitrocelulosa (INNO-LIPA yGenoType). Ambos se basan en la amplifi-cación de una secuencia genética concreta(espacio intergénico 16S-23S y el 23S rDNArespectivamente) y su posterior hibrida-ción. Los resultados se obtienen en 5-6horas, son de fácil lectura e interpretacióny además permiten detectar posibles coin-fecciones. La sensibilidad y especificidadde ambas es muy buena. En la tira deINNO-LiPA hay 16 sondas que permiten ladetección de MTC, M. kansasii (subtipos I,II y III y Mycobacterium gastri), Mycobacte-rium xenopi, M. gordonae, M. genavense, M.simiae, M. marinum / ulcerans, Mycobacte-rium celatum, M. avium complex, M. avium,M. intracellulare (grupo I y II), Mycobacte-rium scrofulaceum, Mycobacterium malmo-ense, M. haemophilum, M. chelonae com-plex (grupo I y II), M. fortuitum complex yMycobacterium smegmatis. GenoType inclu-ye diversas tiras con diferentes niveles deidentificación. Una primera para 14 espe-cies: MTC, M. kansasii, M. xenopi, Mycobac-terium interjectum, Mycobacterium peregri-num, M. marinum / ulcerans, Mycobacteriumabscessus, M. avium, M. intracellulare,Mycobacterium scrofulaceum, M. chelonae,M. gordonae, M. fortuitum y M. malmoense.Una segunda tira dispone de otras 16 iden-tificaciones posibles y una tercera permiteidentificar las diferentes variantes de MTC.

Los chips (arrays) de DNA son los for-matos de hibridación con más futuro(actualmente no esta generalizado su uso)por su flexibilidad tanto para la identifica-ción como para la detección de mecanis-mos genéticos de resistencia a tuberculos-táticos.

Cada método de aproximación taxonó-mica tiene su utilidad y ninguno por sí solopuede dar un resultado seguro al 100%. Lascaracterísticas fenotípicas clásicas son úti-les inicialmente para decidir la cronologíade los medios de identificación a utilizar.

Dentro del complejo M. tuberculosis, ladiferenciación de las distintas variantespuede realizarse mediante pruebas bioquí-micas clásicas como la producción denitritos y la sensibilidad a pirazinamida o



mediante estudios moleculares, comoRFLP con IS6110 u otros.

Siempre hay que intentar la identifica-ción de toda micobacteria, aislada demuestras clínicas, a nivel de especie aun-que no se sepa su valor como patógeno.

PRUEBAS DIRECTAS DE DETECCIÓNDE ÁCIDOS NUCLEICOS DE MTC ENMUESTRAS CLÍNICAS

Tienen por objeto detectar e identificarsobre la muestra (y no sobre los cultivos)la presencia de micobacterias del comple-jo tuberculosis. En teoría serían capacesde detectar la presencia de una sola mico-bacteria en la muestra, pero en la prácticaningún estudio ha demostrado que seantan sensibles como los medios de cultivolíquido. Sí que son más sensibles que lasbaciloscopias y más rápidos que los culti-vos. Habitualmente no se realizan sobre lamuestra directa sino sobre el productoobtenido tras el proceso de DHC. En 24-48horas desde la entrada de la muestra allaboratorio se puede detectar si hay o noMTC en la muestra. Existen varios en elmercado21-23, que a continuación se citan.

Amplified Mycobacteriumtuberculosis direct (AMTD)

Fue el primero aprobado por la FDA (secomercializó por Gen Probe en 1993) y es elmás ampliamente evaluado y utilizado. Esuna amplificación mediada-transcripciónrealizada a temperatura constante (42ºC).La diana es una secuencia específica del16S rRNA de la cual hay unas 4000 copiaspor cada bacteria de MTC, lo cual es unaventaja ya que en el resto de las técnicas lasecuencia diana es menos frecuente. Unporcentaje importante de los laboratorioslo han incorporado a su rutina diagnóstica,si bien el coste en reactivos de cada deter-minación (a modo orientativo unos 36 € vs8 € que puede costar un medio líquido y 1€ que cuesta un tubo de L-J) ha dificultadosu implantación. Los resultados se obtie-nen en 3-5 horas.

AMPLICOR M. tuberculosis PCR testsBasado en una PCR es similar al ante-

rior, pero ligeramente menos sensible y

específico y además la técnica es algo máslarga (6-8 horas). Ha sido comercializadapor Roche y también aprobada por la FDA.

Otras menos utilizadas son el SDA(Strand Displacement Amplification, comer-cializado por BD como BDProbeTec ET) y laLCR (Ligase Chaín Reaction, comercializa-da por Abbott).

PCR en tiempo realComo norma general, esta novedosa

tecnología permite resultados más rápi-dos, específicos y es más facil de realizarque las técnicas de AAN anteriormentecitadas. En el momento actual y en lo quese refiere a su aplicación al diagnóstico deMTC todavía no hay suficientes evaluacio-nes concluyentes sobre su utilidad pero esde esperar que aparezcan en un futuroinmediato. El hecho de que estas técnicasrequieran inicialmente la extracción de losácidos nucleicos, que en el caso de lasmicobacterias es especialmente difícil porlas características de su pared celular, yque su manejo en el laboratorio presentala dificultad del riesgo de contagio, puedenhaber ralentizado el desarrollo de la PCRen tiempo real.

TÉCNICAS MOLECULARES PARATIPIFICACIÓN DE MTC. INTERÉSEPIDEMIOLÓGICO

Durante mucho tiempo, para el estudiode brotes se han utilizado marcadoresfenotípicos que no tenían suficiente capa-cidad para discriminar las posibles dife-rencias que pudieran existir entre unacepa y otra. El desarrollo, a partir de 1991,de diversos métodos moleculares de tipifi-cación ha permitido comparar las huellasgenéticas de los distintos aislamientos y,por tanto, establecer diferencias entrediversas cepas. Al diferenciar las cepas ais-ladas, ha sido posible obtener nueva infor-mación sobre la epidemiología de la enfer-medad lo que ha cambiado muchos con-ceptos que se habían aceptado durantedécadas. Así, se cree actualmente que latransmisión reciente de MTC puede ser unfactor más importante de lo que se supo-nía, oscilando, en nuestro entorno, entre el28% de Segovia y el 58% de Gran Canaria.Se ha podido demostrar la conexión epide-



miológica en brotes de tuberculosis multi-rresistente en España. Hay datos de epide-miología molecular, referentes a la cepaBeijinj que permite suponer que haycepas más virulentas o bien más transmi-sibles que otras, cosa que antes era impen-sable24. También ha permitido documentarmás contaminaciones cruzadas en loslaboratorios de las que se sospechaban.Las técnicas más conocidas se recogen acontinuación.

IS6110 RFLPLa IS6110 es una secuencia de inserción

de 1.335 pares de bases que se repite entre0 y 25 veces en diferentes lugares del cro-mosoma de cada cepa de MTC. El análisisde los polimorfismos de la longitud de losfragmentos de restricción (RFLP) utilizan-do como secuencia diana la IS6110 es elmétodo más utilizado y el que se conside-ra de referencia. Se realiza siguiendo unprotocolo estandarizado y es una técnicamuy reproducible y útil para distinguirentre los aislamientos relacionados epide-miológicamente de los no relacionados, demodo que se ha utilizado como indicadorde transmisión reciente. Presenta algunaslimitaciones, ya que no puede utilizarse sila micobacteria tiene menos de 6 copias deeste fragmento en su cromosoma, en cuyocaso es preciso la utilización de otras téc-nicas. Además, requiere grandes cantida-des de ADN (lo que implica la realizaciónde subcultivos que precisan varias sema-nas), es técnicamente complejo y caro.

SpoligotypingEs un método muy utilizado por su rela-

tiva simplicidad, rapidez y bajo coste,generalmente como complemento delanterior. Estudia la presencia o ausenciade 43 fragmentos de ADN, llamados espa-ciadores. Requiere menos ADN que el ante-rior y, al expresarse en forma de positivo onegativo (de cada espaciador), puede ana-lizarse en un formato digital. Existe unabase de datos internacional con más de11.000 patrones (“espoligotipos”) de aisla-mientos obtenidos en más de 90 países11.Es muy útil para la confirmación de la iden-tificación de las diferentes variantes den-tro del MTC. Sin embargo, este método no

reemplaza por completo al RFLP por sumenor poder discriminante.

Número variable de repeticiones entándem (variable number tándemrepeat, VNTR)

El método se basa en la detección delnúmero de veces que se repiten de formaadyacente varias secuencias dentro delgenoma de la micobacteria. El más utiliza-do es el Mycobacterial Interspersed Repetiti-ve Unit-variable-number tándem repeatanalysis (MIRU-VNTR), que determina lasunidades repetitivas en 12 loci tras unaPCR. En cada uno de los 12 loci hay de 2 a8 alelos, lo que da lugar a unos 20 millonesde posibles combinaciones de alelos. ElMIRU-VNTR es más discriminante que elspoligotyping y, similar al basado en RFLP-IS61101, se puede automatizar y técnica-mente es más simple, por lo que es previ-sible que se imponga como método dereferencia. Existe una base de datos inter-nacional accesible por Internet para podercomparar los hallazgos.

Métodos que utilizan el genomacompleto

Están prácticamente fuera del alcancede casi todos los laboratorios de investiga-ción y son impensables, hoy en día, paralos laboratorios clínicos. Inicialmente sesomete el DNA completo a enzimas de res-tricción y luego se hace una AAN selectivade las zonas parcialmente complementa-rias o/y contiguas a la zona donde actúanlos enzimas de restricción. Es capaz dedetectar mínimos cambios en las bases delos fragmentos amplificados.

ESTUDIOS DE SENSIBILIDADSu finalidad es poder predecir, si la

cepa aislada responderá al tratamientotuberculostático convencional o bien sipresenta algún mecanismo de resistenciaque indican que una determinada droga nova a ser efectiva.

Antaño en lugares donde los índices deresistencia eran bajos, menores del 4%para la Isoniacida (INH) se desaconsejabala realización de los estudios de sensibili-dad. Una metodología inadecuada, en no



pocas ocasiones, daba lugar a que se reco-mendase el uso de drogas más tóxicas ymenos eficaces con el consiguiente perjui-cio para el paciente y para la salud pública.

El incremento de cepas resistentesregistrado a partir de los años 90, hace quelos estudios de sensibilidad sean recomen-dables hoy en día frente a todas las cepasde M. tuberculosis que se aíslan inicial-mente a cualquier paciente. Aunque cadavez la tecnología es más sencilla, el hechode que cada laboratorio, en los paísesdesarrollados, no aísle suficientes cepaspara coger la experiencia necesaria ha dehacer que se plantee su realización o laderivación del estudio, hacia centros conmás experiencia o/y mejor tecnología4.

El problema de la resistencia en latuberculosis está ligada al hecho de la ele-vada concentración bacteriana presenteen las lesiones. En la tuberculosis pulmo-nar, la mayor concentración bacteriana seda en las lesiones cavitadas que puedencontener hasta 107 ó 109 organismos, mien-tras que la concentración presente en losfocos caseosos, no suele exceder los 102 ó104. Desde 1949, era un hecho conocido,que la aparición de resistencias, se dabacon mucha más frecuencia en el tratamien-to de lesiones cavitadas25,26.

David27 en 1970, demostró la probabili-dad de distribución de mutantes resisten-tes, mediante un test de fluctuación, con elque puso en evidencia, que M. tuberculosisadquiría espontáneamente una mutaciónque le hacía resistente a isoniacida, estrep-tomicina, etambutol y rifampicina con unafrecuencia media de 3x10-8, 3x10-8, 1x10-7, y2x10-10 respectivamente. De este modo, laprobabilidad teórica de adquirir una muta-ción que confiera resistencia a dos drogases menor a 10-15. De ahí que la base del trata-miento de la tuberculosis sea el empleo devarias drogas efectivas simultáneamente.

Los criterios para definir la resistenciaa una droga en M. tuberculosis se han toma-do sobre una base empírica, teniendo encuenta que a partir de una cierta propor-ción en el número de mutantes resistentes,la droga no va a ser efectiva. En base aestudios clínicos y bacteriológicos, seacepta como proporción crítica la del 1%.Si se produce un crecimiento por encima

de esta proporción, se valora la cepa comoresistente.

Para estudiar la sensibilidad de lasmicobacterias, se emplea generalmente elmétodo de las proporciones, es decir secompara el número de colonias que crecenen un medio con droga y el número de colo-nias que crecen en el mismo medio libre dedroga. Si el número de colonias en el prime-ro no llega al 1% del segundo, la droga seconsidera efectiva. Los medios que contie-nen huevo, tipo L-J, no son adecuados parael antibiograma. En un intento por conse-guir una uniformidad en los estudios desensibilidad el CDC y el NCCLS (NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards)recomiendan la utilización del medio agarde Middlebrook 7H10 o 7H1128, 29.

La realización del antibiograma enmedios líquidos cada vez es más frecuentepor su relativa sencillez, reproducibilidady rapidez, ya que los resultados puedenobtenerse en 5-10 días, frente a 3 semanasque requieren los medios sólidos. En elmétodo radiométrico BACTEC, que equiva-le a una versión modificada del de las pro-porciones, la resistencia se determinacomparando el crecimiento que se detectaen un vial control sin droga y en otro igualque contiene la droga que se quiere testar.El vial que contiene droga se inocula conuna concentración de bacterias 100 vecessuperior a la del control sin droga. Los via-les se leen diariamente, registrándose suíndice de crecimiento. Se determina la dife-rencia entre los índices que se registran endías consecutivos. Cuando el índice de cre-cimiento en el vial control alcanza un valordeterminado, se interpretan los resultadosdel siguiente modo: si la diferencia entrelos índices de crecimiento, es menor en elvial que contiene droga que en el control,la población es sensible; si mayor, es resis-tente30. Se debe hacer constar cuál es laconcentración o concentraciones a la/sque se ha testado el fármaco. Es posibleque cepas resistentes a INH a concentra-ciones bajas y sensibles a concentracionesaltas respondan a INH y no se deba sus-pender su prescripción. Los estudios serealizan frente a los 4 tuberculostáticosprincipales: isoniacida, estreptomicina,rifampicina y etambutol. La pirazinamidasolamente es activa en medio ácido por lo



que es preciso bajar el pH del medio, conlo que muchas veces, queda comprometi-do el crecimiento bacteriano. El sistemaBACTEC ha resuelto este problema utili-zando una modificación del medio de cul-tivo para el estudio de esta droga.

Aunque con menos experiencia quecon el BACTEC radiométrico también sehan desarrollado y adaptado los antibio-gramas a otros medios líquidos como elESP, el MGIT y el MB/BacT ALERT 3D.

Los estudios de sensibilidad frente aotras drogas resultan problemáticos y noestán bien estandarizados31. La utilidad delos antibiogramas de MNT para guiar eltratamiento de las micobacteriosis no estáclara. Puede ser útil testar M. avium frentea macrólidos y M. kansasii frente a rifam-picina

Cuando el paciente, por datos epide-miológicos conocidos, es probable quealbergue una cepa de MTC resistente y labaciloscopia sea claramente positiva,puede plantearse realizar el antibiogramadirectamente de la muestra. Posterior-mente se debe confirmar el antibiogramacon la técnica estandarizada a partir delcultivo31.

Se han descrito diversos genes cuyamutación se asocia con la resistencia adrogas. Así, la resistencia a rifampicina enmás del 96% de los casos se debe a unamutación en el gen rpo. En cuanto a la iso-niacida, se han descrito diversos geneskatG, inhA, ahpC, kasA, que en su conjuntoson responsables de la resistencia a estadroga aproximadamente en un 90% de loscasos; la resistencia a etambutol en un 47-65% de los casos, se debe a una mutaciónen el gen embB y la resistencia a estrepto-micina en un 70% se debe a la mutación delgen rpsL. Se han desarrollado múltiplesmétodos moleculares para detectar laposible existencia de estos mecanismos deresistencia con el objeto de no tener queesperar los 5-10 días que puede tardar elantibiograma a partir de que la cepa esteaislada, pero todavía no son lo suficiente-mente simples como para incorporarlos ala rutina diagnóstica32.

En el Hospital de Navarra, el promediodel porcentaje de cepas resistentes a iso-niacida en 5 años (1998-2002) es del 7%,

que es un índice relativamente alto, sinembargo, la incidencia de cepas multirre-sistentes es decir, resistentes al menos aisoniacida mas rifampicina, en ese mismoperíodo de tiempo, no llegó al 2%.

CONSIDERACIONES FINALES1. La baciloscopia sigue siendo el método

más rápido y barato para diagnosticarla TB en nuestro medio.

2. El diagnóstico de certeza se establececon el aislamiento en cultivo e identifi-cación de M. tuberculosis a partir demuestras clínicas.

3. La utilización sistemática de medios decultivo líquidos ha aumentado su sen-sibilidad y rapidez. También ha hechoque se aíslen más micobacterias notuberculosas cuya significación clínicaes, en muchas ocasiones, difícil de esta-blecer.

4. Los estudios de sensibilidad deben rea-lizarse a todo primer aislamiento de Mtuberculosis en centros acreditados ycon suficiente experiencia.

5. El gran desarrollo de la tecnologíamolecular de ácidos nucleicos ha per-mitido en muchos laboratorios que ladetección e identificación de M tubercu-losis y otras micobacterias sea másrápida y precisa.

6. Las técnicas moleculares están permi-tiendo conocer mejor los factores devirulencia del microorganismo, susmecanismos de resistencia y aspectosepidemiológicos de las micobacterio-sis, que redundarán en un mejor mane-jo de la enfermedad y de los pacientes.

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