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TRANSICIONES ATÍPICAS EN CINÉTICA ENZIMÁTICA

ATYPICAL TRANSITIONS IN ENZYME KINETICS

Rendón Gómez Juan Luis

Departamento de Bioquímica. Facultad de Medicina.UNAM

Correo electrónico: jrendon@bq.unam.mx

Resumen

En este trabajo se enfatiza la importancia de analizar las curvas de

progreso completas de reacciones catalizadas enzimáticamente. Se revisan

conductas cinéticas atípicas que pueden exhibir algunas enzimas durante el

desarrollo de un ensayo de actividad, así como los modelos que explican tales

comportamientos. Los fenómenos analizados incluyen la histéresis, la histéresis

oscilatoria atenuante, inestabilidad del producto de la reacción y la inhibición por

sustrato seguida de reactivación (seudohistéresis). Adicionalmente, se describe el

procedimiento in silico para simular y analizar los cursos temporales de una

reacción.

Palabras clave: cinética enzimática, histéresis, curso temporal, constante de

velocidad

Abstract

In the present work the importance to analyze the full progress curves of

enzyme catalyzed reactions is stressed. Atypical kinetic behavior displayed by

some enzymes in the course of an activity assay, as well as the models explaining

Monroy Cárdenas C, González Andrade M, Guevara Flores A, Lara Lemus R, Matuz Mares D, Molina Jijón E, Torres Durán PV. Mensaje Bioquímico, Vol. XL, 185-210, Depto de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México. Cd. Universitaria, CDMX.,MÉXICO.,(2016). (http://bioq9c1.fmedic.unam.mx/TAB)

(ISSN-0188-137X)

MENSAJE BIOQUÍMICO, VOL. XL (2016)

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such behavior are revised. The analyzed phenomena including hysteresis, damped

oscillatory hysteresis, unstability of the reaction product, and substrate inhibition

followed by reactivation (pseudohysteresis). Furthermore, the in silico procedure to

simulate and analyze the full progress curves of a reaction is described.

Keywords: enzyme kinetics, hysteresis, time progress curve, rate constant

Introducción

Para la mayor parte de las enzimas conocidas, el análisis de velocidades

iniciales ha permitido obtener una gran cantidad de información acerca de su

comportamiento, incluyendo la determinación de sus parámetros y del mecanismo

cinético utilizado por la enzima [1]. Muchos de los modelos disponibles describen

la dependencia de dicho parámetro respecto de algún factor (p.ej. concentración

de sustrato, pH, temperatura, concentración de inhibidor, etc.) que es controlado

por el investigador [1,2]. En todos los casos, la velocidad inicial representa una

medida de la capacidad de una enzima para catalizar la reacción correspondiente

bajo las condiciones experimentales dadas, y suele expresarse generalmente

como el cambio de concentración por unidad de tiempo (p.ej. mM/seg) o bien

como la cantidad de producto producido por unidad de tiempo (p.ej. µmol/seg). La

información requerida para poder realizar el cálculo correspondiente se obtiene,

generalmente, a partir de la pendiente inicial de un gráfico de absorbencia – que

representa la concentración de alguno de los sustratos o productos de la reacción

– versus tiempo. Debido a ello, es frecuente que el investigador que está llevando

a cabo la caracterización de una enzima se limite a obtener los registros de

actividad únicamente durante el tiempo necesario para obtener la velocidad inicial;

esto es particularmente cierto si se trata de un investigador no versado en cinética

enzimática. Si bien, para una gran cantidad de enzimas dicha información es

suficiente para caracterizar su conducta cinética, se conocen ejemplos que se

desvían significativamente del patrón convencional, y para los cuales no basta con

analizar el inicio de la reacción. Tales situaciones, que representan casos

inusuales o atípicos, están dadas por la propiedad de alguno de los componentes

de la reacción – en la mayor parte de los casos por la enzima – y su análisis

permite obtener información adicional que incluso puede tener implicaciones

fisiológicas. Para ello, es necesario contar con el curso temporal completo – o

curva de progreso – que muestra el avance de la reacción hasta el alcance del

estado de equilibrio. La información obtenida a partir del análisis de dichos

registros permite conocer algunas de las propiedades de la enzima en cuestión,

así como arrojar luz en el origen molecular de la conducta atípica.

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Para una enzima convencional, el tipo de curso temporal es uno en el cual

la velocidad de la reacción tiene su mayor magnitud al inicio y decrece

gradualmente conforme avanza la reacción, llegando a un valor aparente igual a

cero cuando el sistema alcanza el estado de equilibrio; en esta última condición,

se igualan las velocidades de la reacción en ambos sentidos [2,3]. El decremento

en la velocidad de la reacción es consecuencia de la disminución en la

concentración del o los sustratos y, potencialmente, del efecto inhibidor que

pudiera ejercer el o alguno de los productos de la reacción. Si se trata de

reacciones reversibles, la disminución en la velocidad también será consecuencia

del efecto de la reacción reversa. Dependiendo de la concentración inicial de

sustrato, el perfil resultante será ligeramente diferente, pero en ningún caso se

observa una velocidad mayor a aquella dada al inicio de la reacción. Aun en

presencia de factores que puedan afectar la capacidad catalítica de la enzima

(inhibidores, activadores, etc,), la pendiente inicial seguirá representando la

condición de máxima velocidad de la reacción bajo las condiciones particulares del

ensayo.

La Figura 1 muestra dos cursos temporales típicos que ilustran el progreso de la

reacción hasta el agotamiento del sustrato; ambas curvas fueron simuladas a dos

concentraciones de sustrato muy diferentes utilizando el siguiente modelo simple:

En este esquema, las “k” representan las constantes de velocidad especificas

asociadas a cada etapa. A una concentración baja de sustrato (Fig. 1a), la

velocidad de la reacción decrece como se describe líneas arriba, debido a que la

concentración del complejo productivo cae rápidamente como consecuencia del

agotamiento del sustrato; por el contrario, a una concentración de sustrato muy

elevada la velocidad decrece lentamente durante un periodo de tiempo

considerable (Fig. 1b), ya que el nivel elevado del sustrato permite que la

concentración del complejo productivo se mantenga aproximadamente constante.

Sin embargo, existen casos en los cuales las curvas de progreso de una reacción

catalizada por enzima se desvían significativamente respecto de los patrones

mostrados en la Fig. 1.

La presente revisión tiene como objetivo presentar y describir los patrones

atípicos más frecuentemente encontrados en ensayos enzimáticos

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convencionales, incluyendo la discusión de su origen. No se analizan aquellos

fenómenos que ocurren en la fase pre-estacionaria de cursos temporales

convencionales – cuya duración ocurre en la escala de milisegundos o

microsegundos – ya que su detección requiere equipo especializado no disponible

en muchos laboratorios; sin embargo, se describe el método “in silico” más

utilizado en el análisis de los cursos temporales completos, que puede ser

aplicado también a dichos fenómenos muy rápidos.

Figura 1. Cursos temporales convencionales de una reacción catalizada por enzima. Las curvas fueron generadas con el programa Dynafit utilizando el modelo mostrado en el esquema 1. Los valores utilizados para las constantes de velocidad fueron los siguientes: k1 = 25 µM -1 s -1; k-1 = 180 s-1; k2 = 90 s-1; k-2 = 20 s-1; k3 = 260 s-1; k-3 = 1 µM -1 s -1. El panel “a” muestra el curso temporal simulado a una concentración baja de sustrato (5 µM), mientras que el panel “b” se obtuvo con una concentración alta de sustrato (1 mM). En ambos casos, la concentración de enzima fuè de 10 nM. Los insertos muestran la variación en la velocidad de reacción a lo largo del tiempo de reacción.

Caso 1. Histéresis.

El concepto de histéresis en cinética enzimática fue introducido en 1970 [4]

para hacer referencia a enzimas que responden lentamente a un cambio en la

concentración de un ligando, que puede ser alguno de los sustratos de la reacción.

De entonces a la fecha se han descrito una gran cantidad de enzimas que

presentan conducta histerética, de tal manera que constituyen el grupo más

grande con cinéticas atípicas [5,6]. Las enzimas con cinética histerética se

caracterizan por exhibir un tiempo de retraso en el transcurso de un ensayo

enzimático; durante dicho periodo la velocidad de la reacción varía gradualmente

desde un valor inicial hasta alcanzar la velocidad de estado estacionario.

Dependiendo de la relación entre ambas velocidades, se reconocen dos patrones

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de respuesta: a) enzimas que presentan un curso temporal caracterizado porque

la velocidad inicial es menor en comparación con la velocidad del estado

estacionario; b) enzimas que exhiben un curso temporal donde la velocidad inicial

es mayor en relación con la velocidad del estado estacionario. En el primer caso,

el tiempo de retraso es denominado “lag” en inglés, mientras que para el segundo

caso se habla de un “burst” de actividad [6,7] (es importante señalar en este punto

que la traducción literal de las palabras “lag” y “burst” sería de “retraso” y

“explosión”, respectivamente; sin embargo, la utilización de la palabra “retraso”

como traducción de “lag” puede generar confusión, ya que ambos tipos de

conducta histerética presentan un tiempo de retraso. Debido a lo especializado del

tema, y a que prácticamente no existen textos de cinética enzimática en español,

no hay una traducción oficial de dichos términos, por lo que en la presente revisión

se seguirán manejando en inglés).

En la Fig. 2 se muestran cursos temporales simulados que representan los dos

patrones descritos; a partir de dichos trazos es posible evaluar los siguientes

parámetros:

Figura 2. Curvas de progreso de la reacción características de enzimas histeréticas. Las curvas fueron generadas con el programa DYNAFIT utilizando el modelo mostrado en la Figura 3. Los valores utilizados para las constantes de velocidad en la simulación de la transición tipo “burst” y tipo “lag” fueron las indicadas en las leyendas de las Figuras 4 y 5, respectivamente. Las concentraciones de sustrato utilizadas fueron de 45 µM para la transición tipo “burst” (o) y de 70 µM para la transición tipo “lag” (●). Las flechas extrapoladas al eje de las ordenadas representan el exceso o el déficit en concentración de producto debido al retraso en el alcance del estado estacionario.

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a) la velocidad inicial (vi), que representa la actividad de la forma de la enzima

presente al inicio de la reacción. Como en cualquier ensayo enzimático

convencional, esta velocidad se obtiene a partir de la pendiente inicial de la curva

de progreso. Cuando la forma predominante de la enzima antes de la conversión

es inactiva o poco activa, la velocidad inicial será igual a cero o apenas detectable,

respectivamente, y corresponde a la fracción de la población de enzima en la

forma activa.

b) la velocidad de estado estacionario (vss), que corresponde a la actividad dada

por el estado final de la enzima inducido por el ligando; dicha velocidad se evalúa

a partir de la pendiente de la porción lineal del trazo. Dependiendo de la

concentración del ligando correspondiente, así como de la magnitud de las

constantes de velocidad involucradas en la etapa lenta, la velocidad de estado

estacionario será la resultante de la fracción de la población de enzima en cada

uno de los estados.

c) la constante de velocidad (k) asociada con la transición lenta. Este parámetro

puede evaluarse directamente a partir de la curva de progreso de la reacción; para

ello, es necesario obtener en primer lugar el tiempo de retraso (), que está

representado por el punto donde intersectan las pendientes correspondientes a las

velocidades inicial y de estado estacionario. Una vez conocido, y sabiendo que la

constante de velocidad es el recíproco del tiempo de retraso, su obtención es

directa. El valor de la constante de velocidad es función de la concentración del

ligando que induce la histéresis, así como de las constantes de velocidad de todas

las reacciones involucradas en el modelo, por lo que la función matemática que la

define dependerá de la complejidad del modelo [4]. Para la gran mayoría de las

enzimas histeréticas descritas, la magnitud del tiempo de retraso se encuentra en

la escala de segundos a minutos [6].

Adicionalmente a los parámetros anteriores, en las curvas de progreso de

una enzima con cinética histerética es posible definir la amplitud de la transición.

Esta se obtiene por extrapolación de la línea que define la velocidad de estado

estacionario hasta su intersección en el eje de concentración de producto (Fig. 2).

En el caso de una cinética con un “burst” de actividad, la amplitud representa el

“exceso” de producto generado al pasar desde el estado inicial – más activo - al

estado estacionario, mientras que para una enzima con un “lag” en el curso

temporal, la amplitud se interpreta como el déficit de producto no generado como

consecuencia de un estado de la enzima inicialmente menos activo (nótese que

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para una cinética con un “lag”, la extrapolación de la pendiente del estado

estacionario al eje de las ordenadas se da en valores negativos de concentración).

Si bien en la Figura 2 se muestran los perfiles de ambos tipos de conducta

histerética utilizando la formación de producto conforme progresa la reacción, la

forma de los gráficos no cambia si se representa el consumo de alguno de los

sustratos; simplemente las curvas comenzarían a una concentración diferente de

cero y las pendientes serían negativas a lo largo del curso temporal.

Los parámetros que definen el perfil de la curva de progreso, utilizando la

formación de producto para monitorear la reacción, se encuentran relacionados a

través de la ecuación:

Donde el término [P] representa la concentración del producto de la reacción a

diferentes tiempos. Esta ecuación es aplicable a cinéticas que presentan un “lag”;

para enzimas que muestran un “burst” de actividad, la diferencia de velocidades

debe substituirse por el término: (Vi – Vss), ya que en este caso la velocidad inicial

es mayor que la velocidad en el estado estacionario. Si se supone que una vez

alcanzado este último, la velocidad ya no cambia con el progreso de la reacción (lo

que solamente ocurre a concentraciones altas del o de los sustratos), entonces a

tiempo infinito la ecuación anterior se simplifica a:

Donde el término [P]ss representa la concentración de producto generado en el

estado estacionario.

Si bien los parámetros señalados pueden obtenerse gráficamente mediante

la combinación de las ecuaciones 1 y 2 y su transformación logarítmica, existen

actualmente diversos programas de computadora que permiten realizar el ajuste

de la ecuación anterior – por regresión no lineal – a los datos contenidos en una

curva de progreso [8-10]. Si la ecuación (1) se deriva con respecto al tiempo, se

obtiene una función que define la variación de la velocidad de reacción conforme

avanza esta última:

Donde v representa la velocidad instantánea – es decir, la pendiente – a lo largo

de la reacción. Es importante aclarar que la aplicabilidad de esta ecuación está

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restringida al inicio de la curva donde ocurre la transición lenta y hasta el punto

donde la velocidad se hace constante; es decir, la ecuación se basa en que la

concentración del sustrato permanece constante durante el periodo de tiempo

analizado. Esta última condición puede lograrse, como se mencionó

anteriormente, si el ensayo de actividad se lleva a cabo utilizando una

concentración elevada de sustrato.

En la Figura 3 se muestran cursos temporales simulados que representan

los dos patrones descritos de conducta histerética; los cursos fueron simulados a

diferentes concentraciones de sustrato para ilustrar el efecto de dicha variable,

tanto sobre el perfil del curso temporal, como sobre las variaciones de velocidad

durante el transcurso de la reacción. Si se compara la dependencia de la

velocidad respecto del tiempo de reacción de una cinética histerética con aquella

de un curso temporal convencional (Fig. 1), se enfatiza aún más la diferencia entre

ambos tipos de conducta. Es importante señalar que si se desea obtener la

ecuación de velocidad para una enzima que exhibe conducta histerética es posible

utilizar, ya sea las velocidades iniciales (vi), o bien las velocidades en el estado

estacionario (vss). Dependiendo del modelo y de la velocidad de la transición, la

forma final de dichas ecuaciones puede ser ligeramente diferente [6].

Figura 3. Modelo general de conducta histerètica. En este esquema, las letras “E” y “F” representan dos conformaciones alternas de la enzima. Las reacciones horizontales corresponden a transiciones conformacionales reversibles. Las flechas dobladas indican la transformación de sustrato en producto y su liberación. El modelo asume que ambos complejos binarios son activos, aunque con diferente constante catalítica (k 6 > k 5 ).

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Modelo general de la conducta histerética

Para explicar la cinética de enzimas histeréticas, el modelo utilizado se

muestra en la Figura 4, que considera una enzima monomérica con un solo sitio

activo. Los postulados del modelo son los siguientes:

i) La enzima existe en dos estados distintos en ausencia de cualquier ligando.

Dichos estados se encuentran en equilibrio y la velocidad de la transición entre

ellos debe ser muy lenta; es decir, la magnitud de las constantes de velocidad

correspondientes es pequeña en comparación con la constante de velocidad que

limita la conversión del sustrato en producto. Cabe señalar que también es posible

que el estado inicial de la enzima este representado por una forma única y que la

unión del ligando correspondiente le permita acceder a un nuevo estado.

ii) Las propiedades físicas y cinéticas de ambos estados son diferentes. Este

atributo del modelo es fundamental, ya que de ello depende la posibilidad de

observar la histéresis durante un ensayo enzimático. En el modelo mostrado, si se

supone que la forma de la enzima marcada como “F” tiene mayor afinidad por el

sustrato y es catalíticamente más activa en comparación con la forma “E”,

entonces la adición del ligando inducirá la aparición de una transición tipo “lag”;

por el contrario, si el estado “F” es menos activo, el desplazamiento del equilibrio a

su favor debido a la presencia del ligando dará lugar a una transición tipo “burst”.

iii) En ausencia de ligando, la población de la enzima se encuentra

mayoritariamente en uno de los dos estados, que puede ser el que posea mayor o

menor actividad catalítica; sin embargo, solamente será posible observar la

transición en el curso de un ensayo enzimático si el sustrato – o el ligando capaz

de modificar el equilibrio – se une a aquel estado de la enzima cuya población es

una minoría inicialmente.

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Figura 4. Efecto de la concentración de sustrato sobre una transición histerética tipo “burst”. El panel “a” muestra los cursos temporales a tres concentraciones de sustrato, y el panel “b” la dependencia de la velocidad de reacción correspondiente respecto del tiempo. Las curvas fueron generadas con el programa DYNAFIT utilizando el modelo mostrado en la Figura 3. L os valores de las constantes de velocidad fueron las siguientes: k1 = 0.145 s -1; k-1 = 0.0015 s-1; k2 = 20 µM -1 s-1; k-2 = 350 s-1; k3 = 80 µM -1 s-1; k-3 = 90 s -1; k4 = 0.4 s-

1; k-4 = 0.008 s-1; k5 = 250 s-1; k6 = 15 s -1; la concentración de la forma inicial de la enzima (E) fue de 30 nM. Los números al lado de cada curva indican la concentración correspondiente de sustrato en la escala micromolar.

Origen molecular de la cinética histerética

Si bien el modelo descrito en la sección anterior permite analizar y obtener

los parámetros cinéticos básicos de una enzima histerética, no proporciona

ninguna información acerca del fenómeno subyacente a dicha conducta. Sin

embargo, los resultados obtenidos a partir del estudio experimental de una gran

cantidad de enzimas que exhiben cinética histerética, han permitido dilucidar las

causas más frecuentes, que pueden resumirse en los siguientes puntos:

i) Un cambio conformacional lento debido a la unión de un determinado ligando –

que puede ser el sustrato, el producto, algún cofactor, etc. –a uno de los

conformeros inicialmente presentes. Generalmente la unión del ligando ocurre en

condiciones de equilibrio rápido, de modo que la transición observada en el

ensayo enzimático será resultado del desplazamiento del equilibrio en favor de

aquel estado de la enzima que posea más afinidad por el ligando involucrado en la

transición. Tales transiciones conformacionales pueden ser detectados siguiendo

los cambios en la fluorescencia intrínseca de la proteína [11]. Entre las enzimas

cuya conducta histerética se debe a cambios conformacionales lentos se

encuentran la piruvato carboxilasa [12], la fructosa 1,6-bis fosfatasa [13], la

ribulosa 1,5-bis fosfato carboxilasa [14] y la metano mono oxigenasa [15].

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ii) Cambio en el estado de agregación de la enzima por unión del ligando

correspondiente a uno solo de los oligomeros. En este caso, la transición

observada será el resultado de una disociación o de una agregación de la enzima;

como consecuencia de ello, los tiempos de retraso evaluados experimentalmente

se verán fuertemente influidos por la concentración de proteína en el ensayo (es

importante señalar que una disociación puede manifestarse cinéticamente como

una transición lenta, con un perfil del curso temporal tipo “lag” o “burst” debido a

una diferencia de actividad entre oligomeros de diferente masa molecular; ello

ocurre cuando la enzima en cuestión es almacenada a una concentración mucho

mayor en comparación con la utilizada en un ensayo de actividad). Al igual que en

el caso de los cambios de conformación, la unión del ligando ocurre en

condiciones de equilibrio rápido. Si la transición es lo suficientemente lenta – en la

escala de minutos – es posible analizar la conversión de un oligomero a otro

durante la transición mediante el uso combinado de entrecruzadores covalentes y

electroforesis desnaturalizante [16]. El grupo de enzimas que exhiben este tipo de

transición incluye a la fosfofructocinasa [17], la CTP sintetasa [18], la glutamina

fosforribosilpirofosfato amidotransferasa [19], la glucógeno fosforilasa [20] y la

hexocinasa [21].

iii) Desplazamiento de un ligando fuertemente unido por otro ligando. En este

modelo de conducta histerética, un compuesto inhibidor con una constante de

disociación pequeña – alrededor de 10 -7 M o menor – es desplazado de la enzima

cuando es añadido otro ligando, típicamente el sustrato; como consecuencia de

ello, el curso temporal de la reacción muestra un aumento gradual de la velocidad.

La glutamato deshidrogenasa de hígado de bovino exhibe este tipo de conducta

cuando se utiliza GTP como inhibidor [4]. En el caso de una enzima oligomérica

que posee más de un sitio para el ligando fuertemente unido, la ecuación que

describe la dependencia de la velocidad de reacción con el tiempo toma una forma

complicada.

Adicionalmente a lo anterior, también es posible observar una transición

histerética debido a cambios repentinos en el pH o la temperatura. Dicho

fenómeno puede darse cuando la enzima en cuestión es almacenada a cierta

temperatura y pH y el ensayo se realiza en condiciones diferentes [22]. El evento

molecular subyacente puede implicar cambios conformacionales o en el estado de

agregación de la enzima.

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Por otra parte, aunque se mencionó anteriormente que la unión del ligando

responsable de la transición histerética ocurre en condiciones de equilibrio rápido,

esta última no es un pre-requisito del fenómeno. Existe la posibilidad de que las

constantes de velocidad involucradas en la unión y disociación del ligando

correspondiente sean de la misma magnitud que aquellas de la transición lenta de

la enzima. En este caso, el fenómeno histerético – que se observa en los curvas

de progreso de la reacción – va acompañado de cooperatividad cinética, que se

pone de manifiesto al analizar la dependencia de la velocidad inicial respecto de la

concentración del ligando [6]. Dependiendo de la enzima, se puede obtener

cooperatividad positiva o negativa asociada con transiciones tipo “burst” o “lag”

[23].

Artefactos que podrían generar cursos temporales tipo histéresis

Aunque en principio la observación de un “lag” o de un “burst” (Figura 5)

durante el curso de un ensayo enzimático puede considerarse como evidencia de

que se está frente a una enzima con cinética histerética, existen diversas

situaciones que pueden dar lugar a un curso temporal similar. Las causas más

comunes son:

Figura 5. Efecto de la concentración de sustrato sobre una transición histerética tipo “lag”. El panel “a” muestra los cursos temporales a tres concentraciones de sustrato, y el panel “b” la dependencia de la velocidad de reacción correspondiente respecto del tiempo. Las curvas fueron generadas con el programa DYNAFIT utilizando el modelo mostrado en la Figura 3. Los valores de las constantes de velocidad fueron las siguientes: k1 = 0.0015 s -

1; k-1 = 0.15 s-1; k2 = 60 µM -1 s-1; k-2 = 120 s-1; k3 = 1 µM -1 s-1; k-3 = 40 s -1; k4 = 0.04 s-1; k-4 = 0.008 s-1; k5 = 80 s-1; k6 = 0.5 s -1; la concentración de la forma inicial de la enzima (F) fue de 30 nM. Los números al lado de cada curva indican la concentración correspondiente de sustrato en la escala micromolar.

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i) Cuando se realizan ensayos de actividad en los cuales se requiere de una

enzima auxiliar, es frecuente observar una transición con un tiempo de retraso tipo

“lag” si la concentración de la enzima auxiliar no es suficiente (p. ej. la utilización

de la lactato deshidrogenasa para determinar la actividad de la piruvato cinasa).

En este caso, aumentar la concentración de esta última bastará para eliminar la

transición [24]; si esto no ocurre, entonces puede considerarse que realmente se

trata de una enzima con propiedades histeréticas. De ser el caso, existe un

método para analizar la cinética de una enzima histerética que requiere de

enzimas auxiliares [25].

ii) Existen inhibidores que se caracterizan por unirse lentamente a la enzima, por

lo que la formación del complejo enzima-inhibidor ocurre lentamente y es posible

observarla en el transcurso de un ensayo enzimático. En estas situaciones, el

curso temporal mostrará una transición tipo “burst” [26].

iii) La inactivación de la enzima en el transcurso de la reacción puede generar un

“burst” de actividad. En este caso es necesario llevar a cabo experimentos

adicionales para descartar esta posibilidad, lo que implica preincubar la enzima

por tiempos variables bajo las condiciones del ensayo y determinar si la velocidad

inicial disminuye con el tiempo de incubación; de ser así, se trata de un fenómeno

de inactivación.

Importancia fisiológica de la conducta histerética

En su artículo original de 1970, Carl Frieden describió una serie de

situaciones en las cuales la presencia de una enzima con propiedades histeréticas

podría tener implicaciones fisiológicas importantes [4]. El aspecto central es que la

respuesta lenta de una enzima frente a un cambio repentino en la concentración

de un ligando – particularmente si se trata de una enzima que exhibe una

transición tipo “lag” – servirá para evitar cambios rápidos en la concentración de

un cierto metabolito. Un ejemplo que podría ilustrar la importancia de una enzima

con cinética histerética está representado por la enzima bifuncional aspartato

cinasa-homoserina deshidrogenasa, que forma parte de la vía metabólica

involucrada en la síntesis de treonina y lisina [27].

Caso 2. Histeresis oscilatoria atenuante.

Un caso particularmente interesante de cinética atípica está representado

por la butiril colinesterasa humana, una esterasa relacionada con la

acetilcolinesterasa [28]. La enzima es una proteina monomérica y actúa sobre un

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amplio espectro de compuestos que contienen un enlace ester, entre los que se

incluyen la aspirina, la cocaína, la succinilcolina, etc. Las curvas de progreso de la

reacción, obtenidas en presencia del sustrato acetato de N-metil indoxil, revelaron

que la enzima exhibe una fase de retraso típica de una transición tipo “lag” [29],

caracterizadas por que la velocidad inicial es igual a cero (Fig. 6a). Con base en

dicha información, se concluyó que el estado inicial de la enzima es inactivo. La

conducta histerética puede explicarse mediante una simplificación del esquema de

reacción mostrado en la Figura 3, suponiendo que el estado inicial de la enzima es

incapaz de unir el acetato de N-metil indoxil. Por consiguiente, los cursos

temporales son el resultado de una transición conformacional desde un estado

totalmente inactivo hasta un estado que puede unir y catalizar la hidrólisis del

sustrato. Sin embargo, la conducta cinética más interesante de la

butirilcolinesterasa se observó en presencia de benzil-colina [30]; utilizando como

sustrato a este compuesto, las curvas de progreso de la enzima exhiben una serie

de oscilaciones en la señal del registro que se atenúan gradualmente conforme

progresa la reacción (Figura 6b). Aunado a lo anterior, la frecuencia y la amplitud

de las oscilaciones disminuyeron al incrementar la concentración del sustrato.

Dicha conducta fué denominada histéresis oscilatoria atenuada [30,31].

Figura 6. Cursos temporales experimentales de la butiril-colinesterasa. El panel “a” representa el perfil obtenido utilizando como sustrato el ester acetato de N-metil indoxilo (1 mM); la reacción fué monitoreada siguiendo la aparición de producto a 430 nm. El panel “b” corresponde a los perfiles obtenidos con un derivado alquilado de la benzil colina a las concentraciones indicadas en la Figura; en este caso, las reacciones fueron seguidas monitoreando la desaparición de sustrato a 240 nm. Ambos experimentos fueron realizados a pH 7 y 25OC. (Los gràficos fueron tomados de la referencia 31).

Para explicar la conducta mencionada, se propuso un modelo en el cual la

enzima libre existe como una mezcla en equilibrio de dos estados

conformacionales; ambos estados pueden unir el sustrato, pero solo uno de ellos

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es capaz de llevar a cabo la hidrólisis de la benzil-colina. Sin embargo, el aspecto

más importante del modelo – que explica las oscilaciones observadas en los

cursos temporales – es que la benzil-colina, el sustrato de la reacción, oscila a su

vez entre dos formas, de las cuales sólo una sirve como sustrato [30,31]. Las

constantes de velocidad asociadas con las transiciones conformacionales de la

enzima, así como aquella constante de velocidad para la conversión del sustrato

del estado “inactivo” al estado “activo”, son las responsables de la conducta

mencionada. Tales constantes son de primer orden y su magnitud es menor a 0.15

s-1 en todos los casos. El significado fisiológico del fenómeno descrito – si lo hay-

no ha sido dilucidado. A la fecha, la butiril colinesterasa es la única enzima

reportada en la literatura que presenta este tipo de conducta cinética.

Caso 3. Inestabilidad del Producto o de un intermediario de la Reacción

Se conocen ejemplos de reacciones en las cuales el producto de la

reacción es inestable, de modo que en el transcurso de un ensayo enzimático

deriva en un compuesto cuyas propiedades son distintas respecto de aquel a partir

del cual se produce [32]; si dicho compuesto es utilizado para monitorear la

reacción, los cursos temporales presentarán un perfil atípico. En la Figura 7a se

muestran curvas de progreso simuladas para una reacción con la característica

mencionada; las curvas fueron elaboradas con base en el siguiente modelo.

Donde R2 representa la especie en la cual se convierte el producto P (el modelo

simple mostrado supone que la reacción es irreversible). A diferencia de las

enzimas con histéresis, los cursos temporales para este tipo de conducta

muestran un máximo cuya posición depende de la concentración de sustrato;

cuando la reacción alcanza dicho punto la velocidad es igual a cero, después de lo

cual se hace negativa (Figura 7b). Un ejemplo bien estudiado de reacción que

sigue el comportamiento descrito es aquel de la oxidación de la dopamina a la

ortoquinona correspondiente catalizada por la tirosinasa [33]; en este caso, el

producto de la reacción evoluciona espontáneamente a o-dopaminacromo por

ciclización de la molécula. Es importante mencionar que los cursos temporales

descritos no se observan si la reacción en cuestión se monitorea siguiendo el

consumo de sustrato; en este caso, las curvas de progreso muestran un perfil

idéntico al de una cinética histerética con un tiempo de retraso tipo “burst”.

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200

Aunque conceptualmente simple, el modelo del esquema 2 puede generar

cursos temporales complejos que incluyen máximos y mínimos en el perfil de la

reacción. Por ejemplo, si se incluye la situación en la cual el complejo enzima-

sustrato también es inestable [34]. Ambas condiciones pueden presentarse

simultáneamente o de manera independiente. Adicionalmente, si la reacción es

reversible, las curvas de progreso no regresan a una concentración cero del

producto.

Figura 7. Cursos temporales exhibidos por una reacción en la cual el producto es inestable. Las curvas fueron generadas con el programa DYNAFIT utilizando el modelo mostrado en el esquema 2 del texto. Los valores de las constantes de velocidad empleados en la simulación fueron los siguientes: k1 = 5 µM -1 s -1; k-1 = 250 s-1; k2 = 25 s-

1; k3 = 0.01 s-1. La concentración de enzima fue de 80 nM. Los números asociados a cada trazo representan la concentración de sustrato empleada en la simulación correspondiente.

Caso 4. Inhibiciòn por sustrato seguida de reactivación (seudohisteresis)

Un último ejemplo de curso temporal atípico está representado por la

enzima tiorredoxina-glutatión reductasa (TGR), una isoforma de la tiorredoxina

reductasa de alto peso molecular [35]. Ambas enzimas pertenecen al grupo de las

disulfuro reductasas y utilizan NADPH como agente reductor; sin embargo, a

diferencia de la tiorredoxina reductasa convencional, la TGR es capaz de catalizar

diversas reacciones – además de la reducción de la tiorredoxina – entre las que

sobresale su capacidad para reducir al disulfuro del glutatión (GSSG) y participar

en intercambios tiol-disulfuro [35]. Si bien la enzima está presente en mamíferos

[35,36], su función es particularmente importante en los gusanos planos parásitos

(Platelmintos) que incluye formas bien conocidas como las duelas (p.ej. Fasciola

hepatica y Schistosoma mansoni) y los cestodos (p.ej. Taenia solium y

Rendón Gómez JL

201

Echinococcus granulosus). En estos organismos la TGR es la única enzima

involucrada en la reducción del GSSG y de la tiorredoxina oxidada, ya que

carecen de tiorredoxina reductasa y glutatión reductasa [37].

La TGR ha sido purificada y caracterizada a partir de distintos parásitos, y

su rasgo más característico – además de su naturaleza multifuncional – es el de

mostrar inhibición por el sustrato GSSG [38-41]. Dicha inhibición se observa

únicamente cuando los ensayos enzimáticos se realizan a concentraciones

moderadas o altas del disulfuro; sin embargo, si a la reacción se le permite

proceder hasta el agotamiento de alguno de los sustratos, el perfil de los cursos

temporales depende de la concentración de ambos sustratos (NADPH y GSSG),

así como de la concentración de enzima. A concentraciones bajas de GSSG, la

TGR exhibe curvas de progreso convencionales, en las cuales la velocidad es

máxima al inicio de la reacción y disminuye gradualmente (Figura 8a).

Figura 8. Cursos temporales experimentales de la tiorredoxina-glutatión reductasa. Los gráficos representan el consumo de uno de los sustratos de la enzima (NADPH). Panel “a”: perfil obtenido a concentraciones bajas de ambos sustratos (14.2 µM de NADPH y 35 µM de GSSG); panel “b”: curva de progreso atípica observada en un ensayo enzimático a concentraciones moderadas de GSSG (13.2 µM NADPH y 120 µM de GSSG); panel “c”: perfil seudohisterético obtenido a concentraciones elevadas de GSSG (45.8 µM de NADPH y 500 µM de GSSG). Los ensayos de actividad fueron realizados a pH 7.8 y 25OC. En todos los casos la concentración de enzima fué de 11 nM.

Al incrementar la concentración de GSSG, es posible observar cursos

temporales inusuales con un “burst” inicial seguido de un “lag” (Figura 8b) y la

amplitud relativa de ambos depende de la concentración de NADPH y GSSG.

Finalmente, a concentraciones elevadas de ambos sustratos, las curvas de

progreso semejan un perfil característico de una enzima histerética, con una

transición tipo “lag” en la cual la velocidad de la reacción se incrementa

gradualmente hasta alcanzar una pendiente constante (Figura 8c) que, en

principio, podría suponerse que representa el estado estacionario de la reacción.

MENSAJE BIOQUÍMICO, VOL. XL (2016)

202

Tal comportamiento revela que la inhibición producida por el GSSG es transitoria.

Cabe señalar que, a diferencia de una transición histerética típica, el tiempo

involucrado en alcanzar el aparente estado estacionario de la reacción puede

extenderse hasta casi una hora. Adicionalmente a lo anterior, la inclusión de algún

compuesto reductor en la mezcla de reacción (DTT, GSH o cisteína) evita las

curvas de progreso atípicas. El fenómeno mencionado fué descrito originalmente

en nuestro laboratorio en la TGR del cestodo Taenia crassiceps [38], y fué

reportado posteriormente en la enzima de otros parásitos [39-41]. Hemos

desarrollado un modelo que explica todas las respuestas de la enzima observadas

bajo diferentes condiciones. El aspecto fundamental del modelo consiste en la

existencia de un segundo sitio para el sustrato inhibidor (GSSG), el cual se

comporta como un ligando de unión lenta y lleva a la enzima a una forma casi

completamente inactiva, que implica la formación de un intermediario covalente.

Sin embargo, como consecuencia de la actividad residual en la enzima inhibida, la

concentración de GSH – que es uno de los productos de la reacción – aumenta

gradualmente, lo que permite reactivar al intermediario producido por el GSSG.

Por consiguiente, se genera una competencia entre el GSSG y el GSH por llevar a

la enzima hacia formas inactivas y activas, dando lugar a los cursos temporales

tipo histéresis.

APENDICE

Análisis de cursos temporales

El estudio de una reacción catalizada enzimáticamente mediante el análisis

de una curva de progreso se remonta a comienzos de la década de los 70’ del

siglo pasado [42-43], cuando la capacidad de los procesadores utilizados en las

computadoras permitió llevar a cabo la integración del conjunto de ecuaciones

diferenciales simultáneas que describen la variación en el tiempo de cada uno de

los participantes de la reacción. De entonces a la fecha se han desarrollado

diversos programas que permiten llevar a cabo dicho análisis [8-10], y son

accesibles para ser utilizados en las computadoras actualmente disponibles.

En esta sección se describe el procedimiento a seguir para llevar a cabo el

análisis cinético de un curso temporal, lo que requiere la construcción de un

modelo teórico plausible y su comparación y ajuste con los datos experimentales.

El análisis se enfoca en reacciones catalizadas por enzimas, aunque puede ser

aplicado, con pequeñas modificaciones, a otros sistemas (p. ej., una curva de

progreso que represente la desnaturalización de una proteína). Para ilustrar la

Rendón Gómez JL

203

secuencia de etapas, se utilizan datos que representan la inhibición competitiva de

una enzima

El primer requisito para llevar a cabo el análisis, es la obtención de un

registro completo y detallado que represente la variación en el tiempo de la

concentración de alguno de los sustratos o productos involucrados; generalmente

dicho registro está representado por un gráfico de absorbencia o fluorescencia en

función del tiempo, que muestra la desaparición del sustrato o la aparición del

producto. Una vez obtenido el registro correspondiente, se procede a tratar de

reproducir in silico el curso temporal partiendo de un modelo detallado que incluya

todas las variables controladas por el investigador (concentración de la enzima y el

o los sustratos, presencia de cofactores o inhibidores, etc). Para ello es

indispensable colectar la mayor cantidad posible de información acerca de la

enzima, lo que implica conocer si la reacción catalizada es o no reversible, su

mecanismo cinético, la posible inhibición por alguno de los sustratos o productos

de la reacción, así como la posibilidad de que alguna de las reacciones

elementales sea irreversible. Asimismo, es necesario conocer de manera precisa

la concentración de todos los participantes de la reacción utilizada en los ensayos

enzimáticos. El modelo debe describir todas las reacciones elementales de que

pueda constar el sistema, así como asignar valores a las constantes de velocidad

asociadas con cada una de dichas reacciones. La validez del modelo es probada

comparando el curso temporal teórico con el experimental.

Para ilustrar lo anterior, supongamos que se dispone de un conjunto de

cursos temporales obtenidos a diferentes concentraciones de un inhibidor y se

desea encontrar el tipo de inhibición ejercido sobre una enzima particular; ello

requiere plantear un modelo independiente para cada tipo de inhibición, simular el

curso temporal correspondiente para cada concentración del inhibidor y

compararlos con los cursos experimentales. El esquema mostrado representa el

caso de un modelo simple de inhibición competitiva reversible:

MENSAJE BIOQUÍMICO, VOL. XL (2016)

204

Puesto que lo que se pretende es obtener un gráfico que muestre la

variación en el tiempo de la concentración del sustrato o el producto de la

reacción, la construcción del curso temporal requiere plantear una ecuación

diferencial ordinaria para cada una de las especies participantes. La variación en

la concentración de cada una de las especies mostradas conforme progresa la

reacción es dada por el balance entre su velocidad de formación y su velocidad de

desaparición; por ejemplo, el complejo ES se forma a partir de la enzima y el

sustrato libres así como a partir del complejo EP, mientras que su concentración

disminuye por su transformación en este último y por su disociación en enzima y

sustrato. Lo anterior queda expresado en la siguiente ecuación:

Siguiendo el mismo razonamiento, las ecuaciones diferenciales para el resto de

las especies participantes son:

Para construir los cursos temporales teóricos, es necesario asignar valores

a todas y cada una de las constantes de velocidad involucradas en el modelo. Es

quizá esta la etapa más crítica del proceso, ya que el perfil del curso temporal

dependerá tanto del modelo elegido como de la magnitud de las constantes de

velocidad de todas y cada una de las reacciones parciales. Puesto que en muchos

casos se desconoce el valor real de dichas constantes, es común iniciar un

proceso de ajuste de cursos temporales asignando un valor unitario a todas las

constantes de velocidad, permitiendo que el programa de computadora busque los

valores que explican mejor el perfil correspondiente. Alternativamente, si se desea

construir la curva de progreso comenzando con constantes de velocidad diferentes

de la unidad, es necesario utilizar valores que sean consistentes con los datos ya

reportados en la literatura. En el caso de reacciones de segundo orden

correspondientes a la unión de un ligando con una proteína, el límite superior no

debe exceder el valor conocido para la unión, en solución liquida, entre un ligando

de bajo peso molecular y una macromolécula; dicho límite es del orden de 1 x 10 9

M -1 s -1 [44] (si esta constante se expresa en la escala micromolar, su valor

correcto es igual a 1 x 10 3 µM -1 s -1). Respecto de la magnitud de las constantes

de velocidad de primer orden correspondientes a la disociación de una molécula

Rendón Gómez JL

205

pequeña, su límite superior para reacciones en solución líquida se ubica alrededor

de 3 x 10 9 s-1 [45]; si la reacción involucra cambios conformacionales lentos de

proteínas, los valores utilizados se ubican en el intervalo de 0.01s-1 a 0.001s -1 [2].

Para asignar valores a la constante de velocidad asociada con la unión de

alguno de los sustratos a la enzima, puede utilizarse como una primera

aproximación la pendiente inicial del gráfico de velocidad inicial versus

concentración del sustrato correspondiente, que está dada por el cociente entre el

número de recambio y la constante de Michaelis-Menten correspondiente (kcat/Km);

el valor obtenido representa un límite inferior de dicha constante de velocidad [2].

Cabe señalar que para algunos mecanismos – por ejemplo, secuenciales

ordenados – es posible estimar el valor de algunas constantes de velocidad a

partir de los parámetros cinéticos [1]; en este caso, las constantes calculadas

pueden incorporarse al modelo y mantenerse como valores fijos, lo que disminuye

significativamente la incertidumbre en la estimación de las constantes

desconocidas al llevar a cabo el ajuste de curvas de progreso. Alternativamente, la

disponibilidad de datos experimentales en la literatura acerca de la magnitud de

dicha constante de velocidad para un determinado ligando de interés puede dar un

estimado realista acerca del intervalo de valores de dicha constante. Por ejemplo,

para la unión del NADH a deshidrogenasas, el valor conocido es del orden de 107

M-1 s-1 [46,47].

Figura 9. Discriminación de modelos mediante el análisis de cursos temporales. Las curvas de progreso representan datos generados in silico correspondientes a un modelo de inhibición competitiva que fueron analizadas utilizando el programa DYNAFIT con los modelos de inhibición competitiva (C), no competitiva (NC) y acompetitiva (AC). Los símbolos corresponden a los datos experimentales, control (●), y en presencia de inhibidor 500 µM (o) o 2000 µM (▼), mientras que las líneas continuas representan el ajuste obtenido con el modelo competitivo. La tabla del inserto muestra los resultados del

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206

análisis estadístico de la discriminación. SS, suma de cuadrados; MS, promedio de la suma de cuadrados; SD, desviación estándar.

Una vez establecidos los valores hipotéticos de todas las constantes de

velocidad involucradas en cada uno de los modelos alternativos, el siguiente paso

consiste en ajustar estos últimos a los datos experimentales. El programa de

computadora busca, mediante un procedimiento iterativo, los valores numéricos de

las constantes de velocidad que mejor expliquen los resultados experimentales y

despliega entonces un curso temporal teórico que es contrastado con el

experimental. La bondad del ajuste puede evaluarse mediante la estadística que

acompaña a los resultados proporcionados por el programa. Siguiendo con el

ejemplo utilizado, en la Figura 9 se muestran los resultados obtenidos con un

compuesto del cual se desea conocer el tipo de inhibición ejercido. Con base en la

comparación de los valores de los parámetros estadísticos, es claro que el modelo

que mejor explica los datos experimentales es el de inhibición competitiva.

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Semblanza del Dr. Juan Luis Rendón Gómez

El autor es Biologo por la Facultad de Ciencias de la UNAM, estudió la maestría en ciencias en la Facultad de Medicina y el doctorado en investigación biomédica básica en el Instituto de Fisiología Celular, ambas de la UNAM. Es profesor titular de tiempo completo en el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la UNAM desde 1990, donde ha participado de manera ininterrumpida en la docencia de pregrado

y de posgrado. En el área de la investigación, su interés se ha centrado en la Fisicoquímica de Proteínas y la Enzimología. Ha publicado 34 artículos en revistas de circulación internacional, de los cuales 11 son de autor de correspondencia. Es autor de 10 publicaciones nacionales y 2 capítulos de libro. Dichos artículos han sido citados màs de 200 veces en la literatura internacional. Pertenece a la Sociedad Mexicana de Bioquímica como socio numerario. Fué miembro del SNI de 1987 a 2003. Ha sido tutor de estudiantes de licenciatura, maestría y doctorado y ha participado como miembro de comités tutorales y en jurados de examen de licenciatura, maestría y doctorado.

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