transformacion genetica de papa

XII JORNADAS DE INVESTIGACIN Revista Investigacin Cientfica, Vol. 4, No. 2, Nueva poca. Mayo - Agosto 2008

ISSN 1870-8196

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Transformacin gentica de Solanum cardiophyllum mediada

por Agrobacterium rhizogenes

Ana Mara Reyes Contreras Leticia Almanza Snchez Jos C. Snchez Prez Miguel Alvarado Rodroguez Unidad Acadmica de Agronoma Universidad Autnoma de Zacatecas Sal Fraire Velzquez Unidad Acadmica de Biologa Experimental Universidad Autnoma de Zacatecas

Resumen

Para contribuir a al preservacin y al mejoramiento gentico de la papita de

campo, se desarroll una metodologa de micropropagacin y transformacin

gentica va Agrobacterium rhizogenes. Se utiliz el medio de cultivo Murashige-

Skoog con diversas concentraciones de la auxina AIA (0-0.4 mg/l), de la citocinina

BA (0-4.0 mg/l) y del cido giberlico AG3 (0-1.0 mg/l) y un incremento del 10% en

las sales de nitrgeno, para establecer el sistema de regeneracin in vitro; las

plntulas obtenidas se subcultivaron para establecer la tasa de multiplicacin y

evaluar el mejor balance hormonal para su micropropagacin. Para la

transformacin gentica se utiliz la cepa bacteriana A4 de Agrobacterium

rhizogenes, que contiene el plsmido silvestre pRiA4 y adems el vector binario

pESC4. Se cocultiv a concentraciones de 107, 108 y 109 bacterias/ml con

segmentos nodales de plntulas micropropagadas. Se realizaron de manera

exitosa las pruebas histolgica (GUS) y de Biologa Molecular (PCR) para comprobar

la incorporacin de transgenes. En esta ltima prueba se identificaron un

segmento de 780 pb del gen rol B del plsmido silvestre y un segmento de 517 pb

del gen nptII del vector binario.

Palabras claves: cardiophyllum, micropropagacin, Agrobacterium


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Introduccin

La transformacin gentica en plantas, es un proceso por el cual el ADN exgeno

y de inters, es introducido al ncleo de las clulas vegetales que pueden ser

parte de un explante en un cultivo morfognico o protoplasto y una vez que el

ADN es introducido mediante una serie de procedimientos, se regenera una planta

completa transformada genticamente, partiendo de dichas clulas

transformadas (van der Salm et al., 1996).

Existen varios mtodos para incorporar genes exgenos al genoma de las

clulas vegetales y uno de los ms utilizados es mediante Agrobacterium

rhizogenes (Tzfira, 2008). La tcnica requiere el desarrollo previo de una

metodologa de regeneracin in vitro de la especie vegetal que se desee

transformar genticamente (Prez et.al., 1999).

Entre las especies no cultivadas en peligro de extincin se encuentran las

papas silvestres, consideradas entre las primeras plantas utilizadas como alimento

por los antiguos pobladores de Amrica (Ugent, 1987) aunque, actualmente el uso

de implementos de labranza modernos, provocan abatimiento de las poblaciones

de estas especies arvenses (Davis y Bye, 1982), siendo las ms afectadas en el

altiplano Potosino-Zacatecano Solanum cardiophyllum y S. ehrenbergii.

Estas especies silvestres muestran cualidades que las distinguen de otras

especies de papas, tales como la resistencia a condiciones de baja humedad y

un alto valor nutrimental, pues contiene 3.2% de protena, alta riqueza en

carbohidratos y vitamina C, adems de una gran resistencia a la agresividad de

patgenos como Phytophtora infestans y Alternaria solani (Galindo, 1982). Las

especies arvenses S. brachistotricum, S. cardiophyllum Lindley subesp. Ehrenbergii

Bitter resisten el ataque a todos los virus que afectan a las variedades de S.

tuberosum, por lo que son una fuente potencial de germoplasma para programas

de fitomejoramiento de papa cultivada (Luna-Cabazos et al, 2007).


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Objetivos

Desarrollar una metodologa para transformar genticamente la papa de campo

Solanum cardiophyllum va Agrobacterium rhizogenes. Para lograr lo anterior, los

objetivos particulares planteados son los siguientes:

Determinar un balance de reguladores del crecimiento vegetal para establecer, inducir brotacin mltiple y enraizar in vitro la papa de campo.

Desarrollar una metodologa para transferir genes exgenos al genoma de la papa de campo a travs de Agrobacterium rhizogenes.

Realizar pruebas histoqumicas y de Biologa Molecular para comprobar la transformacin gentica.

Materiales y mtodos

La investigacin se realiz entre marzo de 2006 y abril de 2008 en el laboratorio de

Cultivo de Tejidos en la Unidad Acadmica de Agronoma y en el Departamento

de Biologa Molecular de Plantas de la Unidad Acadmica de Biologa

Experimental, ambos pertenecientes a la Universidad Autnoma de Zacatecas.

Se utilizaron papitas de monte provenientes del municipio de Pinos, Zac, haciendo

una seleccin previa de las que se encontraron en mejor estado fsico, de color

claro y superficie regular.

Se emple la bacteriana A4 de A. rhizogenes, la cual es del tipo agropina. Esta

bacteria contiene el plsmido silvestre pRiA4 y el vector binario pESC4.

Los tubrculos se lavaron en agua corriente con detergente y cepillo de fibras

suaves. Se secaron, posteriormente se les dio un bao en una solucin de Nitrasan-

D al 2% y con 300 mg/l de AG3 durante una hora y se secaron al medio ambiente.

Luego se colocaron en frascos cerrados y se mantuvieron a 4C hasta que se


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observ la aparicin de yemas en los tubrculos, aproximadamente a las dos

semanas.

Los tubrculos se colocaron en una solucin de Nitrasan-D al 1%, en agitacin

continua durante 1 h, luego se enjuagaron con agua destilada estril.

Posteriormente se repiti el mismo procedimiento pero en una solucin de

kanamicina al 0.2 %. Durante este proceso, cada 5 min se dio un pulso de 1 min

de vaco.

Se aislaron las yemas y a continuacin se lavaron con detergente y agua

corriente, utilizando un cepillo de cerdas suaves. Posteriormente se llevaron a

condiciones de asepsia, bajo campana de flujo laminar, para esterilizar

externamente las yemas en una solucin de alcohol etlico al 70% durante un

minuto, enjuagndolas tres veces con agua destilada estril, a continuacin se

colocaron en una solucin acuosa de hipoclorito de sodio comercial al 10% (V/V)

durante 30 minutos, y finalmente se enjuagaron 4 veces con agua destilada estril.

Se eliminaron las partes daadas por los agentes desinfectantes, obtenindose

yemas de aproximadamente 4 mm, las que se inocularon en frascos tipo gerber

con el medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) sin reguladores del

crecimiento vegetal, con 30 g/l de sacarosa y gelificado con 7.5 gr/l de Agar, los

que previamente se esterilizaron en autoclave a 121C durante 15 min. Se coloc

un explante por frasco con 30 ml de medio de cultivo. A las seis semanas, las

yemas que tuvieron una respuesta favorable se subcultivaron en el medio MS

suplementado con las combinaciones de BA y AIB a concentraciones de 0-4 mg/l

y 0-0.4 mg/l respectivamente, con el fin de inducir brotacin mltiple en los

explantes.

Con el propsito de obtener brotes ms vigorosos para llevar a cabo el

enraizamiento de plntulas y el proceso de transformacin gentica, se sembraron

segmentos nodales de los multiplicados en el paso anterior, en el medio de cultivo

MS, suplementado con diversas concentraciones de 0 y 100 mg/l de glutamina, y

de 0 y 1 mg/l de AG3 y 10% ms de las sales de nitrgeno del medio MS. A las seis

semanas se realiz la evaluacin.


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Para el cocultivo (papita-bacteria) se seleccionaron brotes de

aproximadamente 4 cm de longitud. La bacteria se sembr en el medio YMA

(slido), se cultiv durante 48 h a 28C, para multiplicarla. Luego sta sembr en el

medio YMB (lquido), el que se mantuvo en agitacin a 120 rpm, a una

temperatura de 28C durante 48-56 h. hasta que alcanz una concentracin igual

o ligeramente mayor de 1x109 bacterias/ml. La concentracin se determin a partir

de la absorbancia del cultivo bacteriano a una longitud de onda de 620 nm en un

espectrofotmetro (Jofre-Garfias et al, 1997). Se realizaron diluciones para obtener

concentraciones de 1x108 y 1x107 bacterias/ml. Los brotes se colocaron durante 5

minutos en el medio lquido bacteriano con las tres diferentes concentraciones,

realizando tres perforaciones con una aguja de jeringa a cada explante. A las 72

h se enjuagaron los explantes en agua destilada estril, se secaron en papel filtro

estril y, se colocaron en el medio de cultivo MS suplementado con 300, 500 y

1,000 mg/l del antibitico cefotaxima, para eliminar las bacterianas. En este medio

los explantes permanecieron durante 72 h, posteriormente stos se transfirieron al

medio de cultivo MS sin antibiticos y sin reguladores del crecimiento, donde

permanecieron 4 semanas a una temperatura de 24C y un fotoperiodo de 16 h

de luz por 8 de oscuridad.

La transformacin gentica de las plntulas inoculadas, se determin

mediante tres formas:

Fenotipo.- Se compar el fenotipo de los explantes inoculados con A. rhizogenes y

los explantes usados como control negativo

Prueba de GUS (Prueba histoqumica). El vector binario transfiere la regin GUS

(gen uid A), que es un gen reportero, que sintetiza la enzima -Glucoronidasa, por

lo que se tom una muestra de races axnicas de cada una de las plntulas. Se

pusieron en contacto con el reactivo X-Gluc, el cual contiene el sustrato de la

mencionada enzima. Se incubaron segmentos de las races adventicias a 37C

durante 48 h de cada una de las plntulas.


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Anlisis molecular

Se realiz la extraccin del ADN de las races pilosas obtenidas en el cocultivo,

empleando el mtodo llamado CTAB (Doyle and Doyle, 1987).

Para realizar esta prueba se adicion a cada muestra de ADN a amplificar:

Agua desionizada estril 15.75 l

Buffer TAE 2.50 l

Desoxinucletido 2.00 l

Primers up 1.25 l para rolB y 1.25 l para nptII

Primers low 1.25 l para rolB y 1.25 l para nptII

Templado ADN 1.00 l

Taq ADN polimerasa 2.50 l

Para la amplificacin se programaron 30 ciclos bajo las siguientes condiciones:

Desnaturalizacin del templado a 94 C 1 minuto Alineamiento de primers a 55 C por 2 minutos Extensin de la cadena a 72C por 3 minutos

Los productos de la amplificacin se analizaron en un gel de agarosa al 1.2%

cargando de 5-10 l del producto de PCR.

Resultados

Regeneracin in vitro

El tratamiento previo a la desinfeccin superficial permiti realizar una esterilizacin

ms eficiente. Durante la etapa de establecimiento hubo una respuesta del

15.6%, solamente el 1 % se contamin con bacterias, y el resto no tuvo respuesta.

Las plntulas generadas en la etapa de establecimiento, se segmentaron para

aislar los entrenudos, desechando la parte basal y apical. Las yemas se transfirieron

a los medios de cultivo con diversas concentraciones de BA y AIB. Luego de seis


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semanas los explantes presentaron un crecimiento de aproximadamente de 5 cm,

con diversas cantidades de brotes adventicios. El mejor resultado que se obtuvo,

estadsticamente, fue en el medio de cultivo suplementado con 4 mg/l de BA y 0.4

mg/l de AIB, el cual gener un promedio de 4.7 brotes por explante. En el

tratamiento control no hubo la aparicin de brotes adventicios; en los tratamientos

que tuvieron AIB sin la citocinina se generaron callos en la parte basal, sin brotes

adventicios. En el resto de los tratamientos se generaron brotes pero en menores

cantidades que el primer tratamiento sealado. Por lo que en lo sucesivo este

tratamiento fue el que se us para la micropropagacin de la papita de campo,

obtenindose resultados similares en los siguientes subcultivos.

Se obtuvieron brotes ms vigorosos luego de tres subcultivos, en el medio

suplementado con 3 mg/l de BA con 100 mg/l de glutamina. Los tratamiento con

AG3 produjeron explantes muy elongados y sin vigor. El uso de un 10% ms de

sales de nitrgeno tampoco indujo brotes ms vigorosos. Los medios de cultivo sin

reguladores del crecimiento vegetal (control), 1 mg/l de AIB sin BA y 2 mg/l AIB

tambin sin BA, generaron sistemas radiculares abundantes y en los tres casos de

una manera similar. En el resto de los tratamientos se produjeron races en menor

cantidad y ms pequeas, excepto en el tratamiento con 3 mg/l sin BA, donde se

gener un callo en la parte basal de los explantes.

Se determin la capacidad de aclimatacin de 100 plntulas vigorosas con

un sistema radicular desarrollado, de aproximadamente 8 cm de largo. Se logr

concluir la etapa de aclimatacin de manera favorable, en 83 plantas, luego de

dos semanas.

Inoculacin de explantes y produccin de races pilosas

Las concentraciones bacterianas 108 y 109 bacterias/ml indujeron la generacin de

races pilosas abundantes en un 95% de los expantes, mientras que las races

pilosas generadas usando el cultivo bacteriano de 107, fueron escasas y

pequeas. En el tratamiento 109 bacterias/ml se apreciaron races ms largas y


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ms abundantes. La eliminacin de bacterias de los explantes se logr en su

totalidad en los medios de cultivo que se prepararon con 1,000 mg/l del

antibitico cefotaxima, mientras que en las concentraciones menores, la bacteria

se apreci a las cuatro semanas despus de que los explantes se subcultivaron en

medios sin antibitico.

Prueba histoqumica

Se analizaron 38 muestras, de las cuales 35 resultaron positivas a la prueba de GUS.

Todas las races que fueron analizadas se mantuvieron en incubacin bajo luz

continua, siendo esta condicin importante ya que el promotor Cab del vector

binario pESC4 que controla al gen uidA, es inducible por luz.

Las 3 muestras negativas a la prueba de GUS pero que presentaron un alto

contenido de races pilosas, puede indicar que no fue transferido el gen reportero

uid A que sintetiza la enzima -Glucoronidasa, sin embargo, es posible que el gen

rol B del plsmido de RiA4 fue incorporado al genoma del tejido de la papa de

campo.

Las races tomadas de plntulas axnicas no inoculadas con la bacteria no

mostraron actividad de GUS.

Prueba molecular mediante PCR

Al finalizar el proceso de amplificacin del gen de inters, los productos obtenidos

se analizaron en un gel de agarosa al 1.2% cargando de 5-10 l del producto de

PCR.

En la primera cavidad del gel se coloc 1 l del marcador de peso molecular

conocido de 200, 400, 600, 800, 1000, 2000. 4000 pB. En la segunda y quinta

cavidades, se coloc 1 l del amplificado de la PCR. En la sexta se coloc el

mismo volumen, pero de ADN genmico de la muestra biolgica no sometida a

PCR. El tercer y cuarto pozos no se utilizaron.


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Posteriormente de corrido el gel, se fotografi y se pudieron observar las bandas

correspondientes al marcador de peso molecular, as como la presencia de las

bandas correspondientes a los segmentos de los genes rol B y nptII de 780 y 517

pB respectivamente. La presencia de estas bandas, junto con las pruebas

anteriores, son evidencias irrefutables de la incorporacin de transgenes a las

clulas de la papita de campo por parte de Agrobacterium rhizogenes.

Conclusiones

1. Se estableci un sistema eficiente de regeneracin in vitro de la papita de

campo.

2. Se demostr que Solanum cardiophyllum es susceptible de ser transformada

genticamente por medio de Agrobacterium rhizogenes.


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