TRANSCRIPCIÓN

Libro de Consulta:Alberts et al. 5th EdMolecular Biology of The CellCapítulo 6

La estructura del RNACadena sencillaRibosa (2’ y 3’OH)Uracilo en lugar de Timina

RNA DNA

Tipo de ARN Cantidad relativa (%) Coeficiente de sedimentación (S)

Número de nt

ARN ribosomal 80 23S16S5S

37001700120

ARN de transferecia 14 4S 75ARN mensajero 5 variable variableOtros ARNs no codificantes

1 variable variable

Tipos de moléculas de RNA en bacteria

saca

rosa

5%

20%

5S16S

23S

Dúplex Región de cadena sencilla

Tallo - asa Protuberancia

Burbujas internas

Desapareamiento, simétrica, asimétrica

Juntas

Tres tallos, cuatro tallos

El RNA puede formar estructura secundaria

Todos los apareamientos son antiparelelos5’ à 3’3’ ß 5’

Se permiten modificaciones de las bases en RNA

Más común para el RNA de transferencia (tRNA)

Dogma central

Retrotranscripción

Replicación de DNA

Reparación Recombinación

Síntesis de RNATranscripción

Síntesis de proteínaTraducción

Aminoácidos

Una de las cadenas de DNA se transcribe

RNA polimerasa

Para un gen solo se utiliza una de las cadenas como molde por la RNA pol

molde

codificante

El RNA transcrito es complementario a la secuencia de la cadena de ADN que se utilizó como molde y es idéntico a la cadena CODIFICANTE excepto por la presencia de U. Entoneces en el DNA se distinguen las dos cadenas (molde y codificante). La codificante tiene los codones para la proteína.

¿Cómo se recluta la RNA polimerasa al DNA?

¿Cómo sabe cuál es la cadena que va a transcribir?

¿Qué necesita para poder transcribir el DNA?

¿Cómo sabe la RNA polimerasa que debe terminar la transcripción?

INICIO

v Secuencia en el DNA (PROMOTOR)

v Reconocimiento del Promotor

v RNA polimerasa

PROMOTOR

PROMOTOR

molde

molde

Promotor: secuencias de DNA (en la cadena codificante) que reconoce la RNA polimerasa y proteínas asociadas a ella para iniciar la transcripción

La RNA polimerasa reconoce el promotor en la cadena superior(codificante) y transcribe de izquierda a derecha usando comomolde la cadena inferior

La RNA polimerasa reconoce el promotor en la cadena inferior(codificante) y transcribe de derecha a izquierda usando comomolde la cadena superior

5’ 3’

Operón: Varios genes regulados por un solo promotor

Caja -10 (Caja TATA): 5’- TATAAT -3’Secuencia – 35: 5’- TTGACA -3’

El Promotor (secuencia) se lee de 5’ a 3’ y determina el INICIO

Sitio +1 (Inr): sitio donde inicia la TranscripciónNo se transcribe (-) significa antes de +1 (hacia el 5’)

Hay genes ubicados en cualquiera de las dos cadenas de DNA (flechas azules y cajas amarillas del DNA), la dirección está dada por los promotores (cajas verdes del DNA) y representa la cadena codificantes para cada gen; en gris se representa la región intergénica del DNA.

therefore serves as a summary or “average” of a large number of individualnucleotide sequences.

The DNA sequences of individual bacterial promoters differ in ways thatdetermine their strength (the number of initiation events per unit time of thepromoter). Evolutionary processes have fine-tuned each to initiate as often asnecessary and have thereby created a wide spectrum of promoters. Promotersfor genes that code for abundant proteins are much stronger than those associ-ated with genes that encode rare proteins, and their nucleotide sequences areresponsible for these differences.

Like bacterial promoters, transcription terminators also have a wide rangeof sequences, with the potential to form a simple hairpin RNA structure beingthe most important common feature. Since an almost unlimited number ofnucleotide sequences have this potential, terminator sequences are even moreheterogeneous than promoter sequences.

We have discussed bacterial promoters and terminators in some detail toillustrate an important point regarding the analysis of genome sequences.Although we know a great deal about bacterial promoters and terminators andcan construct consensus sequences that summarize their most salient features,their variation in nucleotide sequence makes it difficult to definitively locatethem simply by analysis of the nucleotide sequence of a genome. It is even moredifficult to locate analogous sequences in eucaryotic genomes, due in part to theexcess DNA carried in them. Often, we need additional information, some of itfrom direct experimentation, to locate and accurately interpret the short DNAsignals contained in genomes.

Since DNA is double-stranded, two different RNA molecules could in princi-ple be transcribed from any gene, using each of the two DNA strands as a tem-plate. However, a gene typically has only a single promoter, and because the pro-moter’s nucleotide sequence is asymmetric (see Figure 6–12), the polymerase canbind in only one orientation. The polymerase synthesizes RNA in the 5¢-to-3¢direction, and it can therefore only transcribe one strand per gene (Figure 6–13).Genome sequences reveal that the DNA strand used as the template for RNA syn-thesis varies from gene to gene depending on the location and orientation of thepromoter (Figure 6–14).

Having considered transcription in bacteria, we now turn to the situation ineucaryotes, where the synthesis of RNA molecules is a much more elaborateaffair.

Transcription Initiation in Eucaryotes Requires Many Proteins

In contrast to bacteria, which contain a single type of RNA polymerase, eucary-otic nuclei have three: RNA polymerase I, RNA polymerase II, and RNA poly-merase III. The three polymerases are structurally similar to one another (and tothe bacterial enzyme) and share some common subunits, but they transcribedifferent types of genes (Table 6–2). RNA polymerases I and III transcribe thegenes encoding transfer RNA, ribosomal RNA, and various small RNAs. RNApolymerase II transcribes most genes, including all those that encode proteins,and our subsequent discussion therefore focuses on this enzyme.

Although eucaryotic RNA polymerase II has many structural similarities tobacterial RNA polymerase (Figure 6–15), there are several important differencesin the way in which the bacterial and eucaryotic enzymes function, two of whichconcern us immediately.

FROM DNA TO RNA 339

Figure 6–13 The importance of RNApolymerase orientation. The DNA strandserving as template must be traversed in a3¢-to-5¢ direction. Thus, the direction ofRNA polymerase movement determineswhich of the two DNA strands is to serveas a template for the synthesis of RNA, asshown in (A) and (B). Polymerase directionis, in turn, determined by the orientationof the promoter sequence, the site atwhich the RNA polymerase beginstranscription.

C C C C C C C C C C C C C C C C C C

G G G G G G G G G G G G G G G G G G

G G G G G G G

3¢5¢

5¢3¢

5¢3¢

DNA double helix

RNA

an RNA polymerase that moves from rightto left makes RNA by using the top strandas a template

C C C C C C C C C C C C C C C C C C

G G G G G G G G G G G G G G G G G G

3¢5¢

5¢3¢

C C C C C C C

3¢5¢

an RNA polymerase that moves from leftto right makes RNA by using the bottomstrand as a template

(A)

(B)

Figure 6–14 Directions of transcriptionalong a short portion of a bacterialchromosome. Some genes are transcribedusing one DNA strand as a template, whileothers are transcribed using the otherDNA strand. The direction of transcriptionis determined by the promoter at thebeginning of each gene (greenarrowheads). This diagram showsapproximately 0.2% (9000 base pairs) ofthe E. coli chromosome. The genestranscribed from left to right use thebottom DNA strand as the template; thosetranscribed from right to left use the topstrand as the template.5000 nucleotide pairs

3¢

5¢gene ggene fgene cgene b

gene a gene d gene e

RNA transcripts

5¢

3¢

DNA of E. coli chromosome

5’3’

La cadena codificante es la superior

5’3’

La cadena codificante es la inferior

El PROMOTOR determina la orientación

Una vez que reconoce el promotor:•La RNA pol debe abrir la burbuja de transcripción (helicasa, gasto de ATP) •Comenzar la polimerización de NTPs en sentido 5’à3’ (NO necesita cebador)•Debe escapar del Promotor

Subunidades de la RNA polimerasa bacteriana

Centro catalítico

Especificidad promotor

ω

Subunidad Gen Número Funciónα RpoA 2 Iniciación de la cadena, anclaje de otras

subunidades y proteínas reguladorasβ RpoB 1 Iniciación y elongación de la cadena, formación de

enlace fosfodiesterβ' RpoC 1 Unión al DNAω RpoH 1 Proteína reguladoraσ RpoD 1 Reconoce el Promotor

Holoenzima

El factor Sigma garantiza la unión estable de la RNA pol en el Promotor

Gen Masa (kDa) Uso Secuencia -35 Separación Secuencia -10RpoD 70 General TTGACAT 16-18 nt TATAATRpoH 32 Choque térmico CCCTTGAA 13-15 nt CCCGATNTRpoN 54 Nitrógeno CTGGNA 6 nt TTGCAfliA 28 Flagelar CTAAA 15 nt GCCGATAA

Los genes que se expresan bajocondicionesparticulares, tienenpromotoresdiferentes y utilizanotros factores sigma (diferentes al general, sigma 70)

Sub-etapas en el INICIO de la Transcripción bacteriana

Factor sigma

Complejo cerrado

Complejo abierto (12 nt)

Escape del promotor

Síntesis de 8-10 nt de RNA abortiva hasta…

…Liberación de Sigma

Reconocimiento del promotor

El INICIO se ha completado sólo cuando se separa sigma y permite el escape del promotor

NTP Canal secundarioHíbridoRNA-DNA

Canal desalida delRNA

β'

β

⍵

Sitio activo⍺-NTD

⍺-CTD

Mg2+

3’

5’

3’

3’

5’ 5’

Nature Reviews Microbiology 9, 319-329

Dirección de la transcripción

Burbuja de transcripción competente para ELONGACIÓN

5’ 3’

Reacción que cataliza la RNA polimerasa

(NMP)n + NTP (NMP)n+1 + PPiDNA

Mg2+

RNA polimerasa

- NO requiere cebador- utiliza Mg2+ como cofactor- utiliza NTPs (ATP, GTP, CTP, UTP) como sustrato- La cadena de ARN crece SIEMPRE en sentido 5’ ® 3’

ELONGACIÓN

Terminación

5’

5’

La secuencia programada para terminar debe ser transcrita a RNA

La secuencia terminadora de la transcripción aparece en el RNA transcrito

Terminador intrínseco Terminador Rho-dependiente

La proteína Rho reconoce en el RNA transcrito secuencias específicas rut, avanzando hacia la RNA pol y desenrollando el dúplex RNA : DNA en el sitio de síntesis

El terminador intrínseco presenta secuencia rica en CG en el RNA transcrito formando un tallo-asa que pausa a la RNA pol y se libera el RNA recién sintetizado

Inhibidores de la Transcripción bacteriana

Las rifampicinas son antibióticos producidos por Streptomycesmediterranei, con buena actividad contra bacterias Gram-positivas y contra Mycobacterium tuberculosis.

Su mecanismo de acción estriba en la inhibición del inicio de la transcripción, uniéndose de modo no covalente a la subunidad ß de la RNA polimerasa bacteriana.

Resumen de la Transcripción bacteriana

v Para iniciar la transcripción se requiere una secuencia llamada Promotor, está hacia la región 5’ de un gen, contiene caja -10 (TATA) y -35 reconocidas por la subunidad Sigma de la RNA pol

v Para elongar el transcrito la RNA pol debe escapar del promotor liberándose de Sigma

v El promotor NO de transcribe. El nucleótido +1 marca el inicio del transcrito que será idéntico a la cadena Codificante del DNA, excepto por U en lugar de T

v Para elongar la RNA pol requiere NTPs (ATP, GTP, CTP, UTP), magnesio y su Molde de DNA. No se requiere cebador inicial.

v La transcripción ocurre en dirección 5’ à 3’. Hay una pequeña porción de dúplex RNA-DNA en el sitio de elongación

v Para terminar la transcripción deben reconocerse secuencias en el RNA transcrito que promoverán de alguna manera la separación del dúplex RNA-DNA y liberación del RNA recién sintetizado