Tráfico de proteínas, biosíntesis de ergosterol e impacto físico de membrana recombinante en secreción de proteínas en Pichia PastorisKristin Baumann, Núria Adelantado, Christine Lang, Diethard Mattanovich y Pau Ferrer

Carlos Alfonso MaresMarina De la Paz CervantesAnahí Esquivias SiqueirosDaniel Márquez Sánchez

Mexicali, B.C., mayo de 2012

Palabras clave

Pichia pastoris: Es una levadura muy utilizada actualmente como sistema de expresión para la producción de proteínas recombinantes (Viader et al).

Proteínas recombinantes: Son proteínas producidas mediante la tecnología del ADN recombinante, la cual ha permitido conocer y separar los genes codificantes para las proteínas de interés, que posteriormente son transferidos a diferentes hospederos u organismos diferentes a los nativos. (Valdez-Cruz et al).

Palabras clave• Fab: Fragmentos de unión a anticuerpos (Flanagan et al 2004).• Ergosterol: Esterol que se halla en los tejidos fúngicos y se

puede transformar en vitamina D2 bajo la influencia de rayos ultravioleta.

Antecedentes• La combinación de progresos rápidos e inesperados en la

secuencia de genomas a lo largo de la última década y plataformas analíticas “ómicas” han proveído una invaluable fuente de información en la fisiología de las levaduras.

Antecedentes• Sauer y colaboradores informaron la primera serie de estudios

de fisiología de células genómicas de P. pastoris recombinante bajo condiciones de estrés.

• Gasser et al seleccionaron un rango de genes regulados significativos y probaron sus homólogos de S. cerevisiae para la co-expresión en cepas de P. pastoris recombinante.

• Dragosits y colaboradores recientemente reportaron los primeros estudios “ómicos” específicos de P. pastoris investigando el efecto de la temperatura y la osmolaridad en la transcriptoma, proteoma y flujo metabólico en cepas recombinantes secretoras de un fragmento de anticuerpo Fab.

AntecedentesEn un estudio análogo, se reportó recientemente la transcriptoma, proteoma y fluoxoma de una cepa recombinante de P Pastoris expresando un fragmento de anticuerpo Fab debajo de tres condiciones de disponibilidad de oxígeno. Se observó un efecto benéfico en condiciones de hipoxia en la productividad específica en cultivos de quimiostato así como en las fermentaciones de lotes alimentados

Resultados

IDENTIFICACIÓN Y CLONACIÓN DE GENES DIANA POTENCIALES PARA EL MEJORAMIENTO DE CEPAS

- Se comparó el perfil de mRNA de una cepa recombinante a la de una cepa de control no-expresiva bajo condiciones de oxigenación diferentes.-Esta “cepa de referencia” recombinante secretó el fragmento del anticuerpo Fab 3H6 como un modelo de complejo de proteína recombinante y mostró un incremento en la capacidad de secreción bajo condiciones de crecimiento con hipoxia.

Identificación y clonación de genes diana potenciales para el mejoramiento de cepas.- Ocho genes potencialmente interesantes fueron considerados para

análisis futuros en el impacto de sobre expresión en secreción de proteínas recombinantes.

- Doce clones individuales de cada cepa co-expresante fueron verificados para la integración del gen de interés por PCR. Algunos de los clones carecían del inserto, reduciendo así el número de transformantes para estudios de detección adicionales en placas de cultivo de 24 pocillos a ocho clones por diana de construcción genética.

Identificación y clonación de genes diana potenciales para el mejoramiento de cepas.

ResultadosEL EFECTO DE GENES DIANA CO-EXPRESADOS SOBRE LA SECRECIÓN DE FAB RECOMBINANTE EN PICHIA PASTORIS DE 24 POCILLOS Y CULTIVOS DE MATRAZ DE AGITACIÓN

- Series de 8 clones verificados sobre expresaron uno de los genes diana que se utilizaron primero en una pequeña escala de imagen en placas de 24 pocillos en experimentos duplicados con posiciones al azar de los clones en la placa de 24 pocillos.- Los títulos de los productos y biomasa fueron medidos por ELISA y cuantificación de peso de células mojadas, respectivamente.

El efecto de genes diana co-expresados sobre la secreción de Fab recombinante en Pichia pastoris de 24 pocillos y cultivos de matraz de agitación

- Los resultados de esos experimentos preliminares de detección son mostrados en la Figura 1.

La capacidad de secreción de Fab de un reducido set de clones de ERO1 y WSC4 (#2, 3, 9, 11 y #3, 5, 9, 10, respectivamente) fue verificado más afondo extendiendo el número de réplicas biológicas a 2 y haciendo cultivos a mayor escala, esto es, usando matraces de agitación desconcertados.

El efecto de genes diana co-expresados sobre la secreción de Fab recombinante en Pichia pastoris de 24 pocillos y cultivos de matraz de agitación

Resultados IDENTIFICACIÓN Y MANIPULACIÓN DE RUTAS METABÓLICAS DIANA POTENCIALES PARA MODIFICACIÓN DE CEPAS.

- El análisis transcriptómico permitió la identificación de otras rutas metabólicas con notables alteraciones en condiciones de hipoxia y, por lo tanto, interfieren potencialmente o de manera relacionada a la secreción de proteínas. - Se enfocaron en el las rutas de síntesis de ergosterol y esfingolípidos, que son procesos aeróbicos que requieren de oxígeno molecular.

Identificación y manipulación de rutas metabólicas diana potenciales para modificación de cepas.

- Un esquema de la vía de síntesis de ergosterol se ilustra en la Figura 3.

- Un segundo enfoque, fue la adición de detergentes al medio de cultivo. Estos componentes, en particular el Tween 80, son típicamente suministrados a medios de cultivo anaeróbicos de S. cerevisiae para hacer crecer sustancias.

Identificación y manipulación de rutas metabólicas diana potenciales para modificación de cepas.

Resultados EL EFECTO PARCIAL DE LA INHIBICIÓN DE LA RUTA DEL ERGOSTEROL EN EL TRATAMIENTO DE SECRECIÓN DE PROTEÍNA HETERÓLOGO CON FLUCONAZOL.

- La cepa expresiva de Fab 2F5 de P. pastoris fue cultivada en placas de 24 pocillos en presencia de 0~100µg/ml de fluconazol.

El efecto parcial de la inhibición de la ruta del ergosterol en el tratamiento de secreción de proteína heterólogo con fluconazol.

- Como se muestra en la figura 4B, el fluconazol en concentraciones arriba de 0.6µg/ml tenía un efecto benéfico en la secreción de Fab (aprox. 1.4 incremento de pliegue), mientras concentraciones más altas llevaban a un efecto negativo.

Resultados

ANÁLISIS DE ESTEROL DESPUÉS DEL TRATAMIENTO CON FLUCONAZOL

ESTEROL

µg Sterol/mg DCW

Cultivo control Cultivo tratado con Fluconazol

Desconocida 1 0 0.5

Desconocida 2 0 0.47

Squalen 0 0

Zymosterol 0.17 0

Ergosterol 9.81 6.77

Fecosterol 0.21 0

Episterol 0.23 0

Esteroles totales 10.42 7.74

ResultadosEFECTOS DE ALTERACIONES POTENCIALES EN LA FLUIDEZ DE LA MEMBRANA POR EL TRATAMIENTO CON SURFACTANTES NO IÓNICOS.

- Un análisis más detallado del efecto del Tween 80 y otros dos surfactantes no iónicos relacionados (Tween 20 y Triton X-100) fueron llevadas a cabo en cultivos de matraces de agitación para la cepa expresiva P. pastoris X-33, de Fab 2F5.

Discusión- En este estudio, un microarreglo de DNA basado en la extracción de datos de experimentos que mostraron un incremento en la productividad de una proteína foránea compleja en P. pastoris ha llevado a la identificación de nuevos genes diana o rutas para el mejoramiento de producción de proteínas heterólogas.- La proteína disulfuro isomerasa (PDI) asistente recicladora de Ero1p, una proteína residente de membrana y componente clave para la maquinaria de plegamiento oxidativo, también ha sido reportada como un factor ayudante para la producción de albúmina de suero en K. lactis y el fragmento de anticuerpo humano Fab 2F5 en P. pastoris.

DiscusiónAunque el modelo de proteína en este estudio era idéntico al utilizado por Gasser y colaboradores, el diseño del experimento difiere en tres puntos esenciales: 1. La cepa era deficiente de proteasa SMD1168 (mutante de pep4).2. La expresión de vector llevaba el gen ERO1 estaba basada en

selección de histidina, 3 veces más grande e integrado en un locus diferente (HIS4).

3. El gen ERO1 era derivado del genoma de ADN de S. cerevisiae, mientras que en este estudio, el gen del huésped específico P. Pastoris era amplificado y sobre expresado.

Bibliografía• Baumann, Kristin; Adelantado, Núria; Lang, Christine; Mattanovich, Diethard; Ferrer,

Pau. 2011. “Protein trafficking, ergosterol biosynthesis and membrane physics impact recombinant protein secretion in Pichia pastoris”. Microbial Cell Factories.

• Córdoba, Henry; Algecira, Néstor; Poutou, Raúl; Barrera, Luis. 2003. “Pichia Pastoris, una alternativa para la producción de glucoproteínas humanas de uso terapéutico. Estrategias de fermentación”. Revista Colombiana de Biotecnología. Año/Volumen V, número 002.

• Viader-Salvadó, José; Guerrero-Olazarán, Martha. “Biotecnología de proteínas recombinantes con Pichia Pastoris”. Instituto de Biotecnología, Facultad de Ciencias Biológicas, UANL.

• Valdez-Cruz, Norma; Ramírez, Octavio; Trujillo-Roldán, Mauricio. “Proteínas recombinantes terapéuticas, una esperanza contra enfermedades crónicas”. Instituto de Biotecnología de la Universidad Autónoma de México.

• Flanagan, RJ; Jones, AL. 2004. “Fab antibody fragments: some applications in clinical toxicology”. Medical Toxicology Unit.

• http://hypatia.morelos.gob.mx/index.php?option=com_content&task=view&id=555&Itemid=490

• Rupp, Bernhard. http://dwb4.unl.edu/Chem/CHEM869K/CHEM869KLinks/www.ccp14.ac.uk/ccp/web-mirrors/llnlrupp/fab/fab_tutl.htm