Trabajos seleccionadosXXI Congreso Argentino de Cardiologia

Identificacion in situ de apoptosis en biopsiasendomiocardicas durante episodios de rechazoagudo por medio de marcacion especifica defragmentos de ADN nuclear

R. LAGUENS, P. CABEZA MECKERT, S . PERRONE, R. FAVALORO

Departamento de Investigaci6n Clinica YCYCC, Fundaci6n Favaloro, Buenos AiresTrabajo recibido para su publicaci6n : 11 /94 Aceptado: 11 /94Direcci6n pare separates : Belgrano 1746, Buenos Aires, Argentina .

Se pesquis6 la presencia de apoptosis de nucleos individuates en biopsias endomiocardicas de 6pacientes con trasplante cardfaco por medio de la detecci6n in situ de roturas del ADN nuclear pormedio de la marcaci6n con duTP biotinilado incorporado con deoxinucleotidil transferasa y serevel6 con estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina . En ninguna de las muestras obtenidasen el momento del trasplante se observaron nucleos apopt6sicos, los que se observaron en losmiocitos, celulas endoteliales y del tejido conectivo intersticial en muestras obtenidas entre 7 y146 dfas despu6s del trasplante . La variedad y niimero de c6lulas que presentaron nucleosapopt6sicos variaron de acuerdo con el grado de rechazo, establecido de acuerdo con la gradaci6nrecomendada por la Sociedad Internacional de Trasplante de Coraz6n y Pulm6n . En todos loscasos de rechazo 3A (n = 8), en la mitad de los grados 2 (n = 8) y en algunos grado 1B (3/8) seobservaron miocitos con nucleos apopt6sicos en la vecindad o en el interior de zonas con infiltra-do inflamatorio. En los rechazos grado 0 y 1A y en las zonas con efecto "Quilty" no se observaronmiocitos con nucleos apopt6sicos . Por el contrario, las c6lulas endoteliales y conectivas intersticia-les presentaron nucleos apopt6sicos independientemente del grado de rechazo . Estos resultadosindican que durante los episodios de rechazo la apoptosis de los miocitos es uno de los mecanis-mos de dano inmunol6gico y que la investigaci6n de este fen6meno en las biopsias endomiocardicaspuede ser de utilidad para el diagn6stico del dano hfstico. Rev Arg Cardiol 1995,63 (3) :241-247 .

Palabras clave Apoptosis - Rechazo agudo - Trasplante - Biopsia endomiocArdica

El rechazo agudo del corazon alotrasplantado repre-senta el paradigma de la inmunidad mediada porcelulas, un proceso por medio del cual el dano hfsticoes producido por linfocitos sensibilizados . El meca-nismo propuesto para esa sensibilizaci6n consiste enla liberacion por celulas CD4+, activadas por elaloantfgeno, de interleukina 2, la que a su vez indu-ce la proliferacion de celulas T CD8+ citotoxicas queproducen la posdestruccion de las celulas trasplan-tadas que expresen antigens de clase I del complejomayor de histocompatibilidad. (1)

Los mecanismos de produccion de dano hfsticopor las celulas que infiltran el corazon alotrasplanta-do y las alteraciones celulares consecutivas al danoinmunologico no estan todavfa completamente di-

lucidados. Se ha propuesto que una vez que las celu-las citot6xicas se contactan con sus celulas diana li-beran el contenido de granulos lfticos en el pequenoespacio que separa ambas celulas. Como las granu-laciones de los linfocitos citotoxicos contienen unaprotefna que forma poros en la membrana plasmati-ca celular, la perforina o citolisina, y enzimas lfticas,se postula que estas sustancias danan la membranaplasmatica y producen la muerte celular por lisis os-motica. (2)

Sin embargo, la mayorfa de los datos histoqufmi-cos y morfologicos, tanto in vivo como in vitro , indi-can que tanto en el rechazo de los injertos, como enlas reacciones autoinmunes y las infecciones virales,la muerte celular inducida por mecanismos inmu-

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nologicos se lieva a cabo por medio de la induccionde apoptosis. (3) El hecho bioquimico mas caracte-ristico de la apoptosis es la rotura de la cromatinapor la accion de endonucleasas. (4) La tecnica masfrecuentemente empleada para la deteccion deapoptosis consiste en la extraccion del ADNgenomico y la pesquisa de multiples fragmentos deADN nucleosomico en geles de agarosa . (5) Comoeste estudio requiere la destruccion de los tejidos, suaplicacion a las pequenas muestras que se obtienenen Jas biopsias endomiocardicas no es conveniente,dado que las mismas deben ser procesadas para suexamen anatomopatologico con el fin de diagnosti-car la presencia de un episodio de rechazo agudo ygraduar su intensidad para adoptar las medidas te-rapeuticas necesarias .

Recientemente se han desarrollado metodos parala deteccion in situ de roturas del ADN nuclear encortes de tejido, lo que permite el diagnostico deapoptosis en las mismas muestras que se procesanpara el estudio anatomopatologico. (6) El hecho deque por medio de estas tecnicas sea posible diagnos-ticar la presencia de apoptosis en nucleos individua-tes nos indujo a pesquisar la presencia de roturas delADN nuclear en biopsias endomiocardicas de pacien-tes con trasplante cardiaco, con el fin de indagar si laapoptosis desempena algun papel en el rechazo agu-do y determinar si su diagnostico puede representarun metodo mas sensible que los actualmente usadospara el diagnostico morfologico del dano celular .

En el presente trabajo presentamos evidencias deque en el corazon humano trasplantado existeapoptosis de algunos miocitos, celulas intersticialesy endoteliales, y de que la variedad y el numero decelulas que presentan apoptosis estan relacionadoscon la presencia histologica de un rechazo agudo .

MATERIAL Y METODO

PacientesSe estudiaron 73 biopsias realizadas a 6 pacientes

sometidos a trasplante cardiaco, durante el protoco-lo de biopsias endomiocardicas para el diagnosticode rechazo agudo . Se obtuvieron muestras en el mo-mento del trasplante y hasta 146 dias despues delmismo. Los especfmenes biopsicos se tomaron deltabique del ventrfculo derecho mediante el use deun biotomo introducido en la vena yugular derecha .

Tecnica histol6gicaLos fragmentos de tejido (6 a 8 en cada procedimien-to biopsico) se fijaron 2 horas en solucion tamponadade formaldehfdo al 4% y se incluyeron en Histowax.Se obtuvieron cortes de 4-5 gm de espesor que seadhirieron a portaobjetos recubiertos con polilisinapara incrementar la adherencia y se secaron a 37°C .

Los cortes se colorearon con hematoxilina y eosina ytricromico de Gomori. El diagnostico y graduaciondel rechazo agudo se realizaron con microscopfa deluz de acuerdo con los criterios establecidos por laSociedad Internacional de Trasplante de Corazon yPulmon. (7)

Detecci6n de apoptosisSe empleo, con algunas modificaciones, la tecnica

de Gavrieli, Sherman y Ben-Sasson, (6) basada en launion de dUTP marcada con biotina a los sitios derotura del ADN (buck end labeling) por medio de laaccion de deoxinucleotidil-transferasa terminal . Loscortes se secaron a 60°C durante una hora previo a lahidratacion, que se Ilevo a cabo con xileno, alcoholetlico y agua doblemente destilada. Se emplearonreactivos de grado analitico con el fin de reducir elriesgo de contaminantes que interfirieran con la re-accion enzimatica . Despues de la hidratacion se re-movieron las proteinas de los cortes de tejido pormedio de la incubacion durante 15 minutos a tempe-ratura ambiente con 20 µg/ml de proteinas K (SigmaChemical Co, St. Louis, Mo.) . Despues de lavar loscortes repetidas veces con agua destilada, se sumer-gieron en tampon TDT (30 mM de base Trizma[Sigma], 140 mM de cacodilato de sodio y 1 mM decloruro de cobalto) durante 15 minutos a temperatu-ra ambiente y se incubaron durante una hora en at-mosfera humeda a 37°C con 0,3 e .u/ml dedeoxinucleotidil-transferasa terminal (TDT) y de dUTP biotinilada (Gibco Co, Grand Island, N.Y.) entampon TDT. La reaccion finalizo transfiriendo loscortes a tampon TB (300 mM de cloruro de sodio y30 mM de citrato de sodio) durante 15 minutos a tern-peratura ambiente . Despues de tres lavados con aguadestilada los cortes se cubrieron con 2% de albuminabovina y se lavaron repetidamente con tampon fos-fato salino . La presencia de compuestos biotiniladosse demostro con estreptavidina-fosfatasa alcalinaempleando un equipo comercial (Biogenex) . Comocontroles se incubaron cortes alternativos con la mis-ma tecnica pero sin la incorporacion de TDT . Ade-mas se investigo apoptosis en cortes de mucosa deintestino delgado, donde las celulas del extremo delas vellosidades muestran normalmente tal fenome-no. (6)

RESULTADOSCon la tecnica empleada se observo una tincion

caracteristica e intensa de los nucleos de los mioci-tos, del endotelio capilar, de celulas intersticiales yde elementos de los infiltrados inflamatorios . La tin-cion estaba circunscripta a celulas aisladas o a pe-quenos grupos celulares. Los nucleos aparecian ho-mogeneos y no se observo tincion del areacromatinica .

IDENTIFICACION IN SITU DE APOPTOSIS EN BIOPSIAS ENDOMIOCARDICAS / R. Laguens y col .

En los cortes empleados como controles, que fue-ron incubados sin incorporaci6n de TDT a la reac-ci6n, no se observ6 tinci6n nuclear .

En los cortes de intestino delgado utilizados comocontrol positivo de la reacci6n se observaron nucleosapopt6sicos en el extremo distal de las vellosidades .

Correlacion de la apoptosis con el grado derechazo

En ninguna de las muestras obtenidas en el mo-mento del trasplante se observaron nucleos colorea-dos. En las biopsias obtenidas en diferentes tiemposdespues del trasplante, la presencia de nucleosapoptosicos y su distribuci6n de acuerdo con el tipocelular variaron con el grado de rechazo . En las biop-sias de grado 0 (n = 18) no se observo tinci6n de losnucleos de los miocitos . Por el contrario, en los re-chazos grado 3A (n = 8) todas las biopsias mostraronmiocitos apoptosicos . Los miocitos con nucleos co-loreados se observaron en el seno de los infiltradosinflamatorios (Figura 1) o en su vecindad . En el exa-men con el microscopio de interferencia se observoque, si bien algunos de los miocitos apopt6sicos pre-sentaban vacuolizaci6n citoplasmica y bordes carco-midos, otros aparecfan normales . En las areas bi6p-sicas libres de infiltrados inflamatorios no se obser-varon miocitos con nucleos coloreados .

En las biopsias endomiocardicas diagnosticadascomo grado de rechazo agudo 1 A y 1B (n = 30) sola-mente se observaron miocitos apopt6sicos en 3 ca-sos grado 1B . Comparados con el grado 3A, los mio-citos con nucleos apopt6sicos eran mas escasos, exis-tiendo entre 1 a 3 por cada area inflamatoria. En 4/8

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biopsias de grado 2 se observaron miocitosapopt6sicos en el seno de los infiltrados inflamato-rios con una distribuci6n semejante a la de los recha-zos 1B .

La prevalencia de apoptosis en las celulas inters-ticiales y vasculares fue diferente que en las de losmiocitos. En ninguna de las muestras obtenidas enel momento del trasplante se observaron nucleosapopt6sicos en el intersticio o en los vasos. En 7/18biopsias grado 0 se observ6 ocasionalmente tinci6nde los nucleos del endotelio capilar y de escasas ce-lulas conectivas intersticiales dispersas al azar (Fi-gura 2). Una prevalencia similar de celulas endote-liales e intersticiales apoptosicas se observ6 en lasbiopsias endomiocardicas con grado de rechazo 1A,1B y 2. Sin embargo, el numero de dichas celulas connucleos coloreados era mayor que en ]as biopsias sinevidencia de rechazo, apareciendo tanto en areas deinflamaci6n como en zonas normales. Una distribu-ci6n semejante se observ6 en las biopsias diagnosti-cadas como grado 3A, pero con una prevalencia ma-yor (8/8). Ademas, en areas fibr6ticas correspondien-tes a cicatrices de biopsias previas o de episodios derechazo anteriores se observaron pequenos capila-res y fibroblastos con nucleos intensamente colorea-dos .

El resultado de la prevalencia de celulasapoptosicas de acuerdo con el grado de rechazo estasintetizado en la Tabla 1 .

Apoptosis y efecto "Quilty"En ]as 63 biopsias estudiadas, 8 presentaron efec-

to "guilty" B . En ellas se observaron escasas celulas

Fig . 1 . Rechazo grado 3A mostrando losnucleos coloreados de los miocitos apopto-sicos (flechas gruesas) y de celulas inflama-torias (flechas delgadas) . Aumento original250 X .

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sinuosidades de las membranas miociticas, desorga-nizacion de las miofibrillas, vacuolizacion celular ocambios en la afinidad tintorial de las celulas afecta-das. (9) Estas alteraciones deben estar en el contextode infiltrados inflamatorios . El microscopio electro-nico, que puede dar una evidencia mejor de la ne-crosis celular, no es un metodo practico para el diag-nostico del rechazo agudo, por el tamano pequenode las muestras a examinar y el tiempo relativamen-te largo que demanda la tecnica, en una situacion querequiere prontitud en el diagnostico histopatologicopara el monitoreo del tratamiento del rechazo. Porotra parte, en algunos estudios no ha sido posibleencontrar una evidencia ultraestructural clara denecrosis miocitica, sugiriendo que el dano celularpuede ser reversible . (10)

Dado que el rechazo agudo es un proceso inmunemediado por celulas, el estudio y diagnostico de losmecanismos de muerte celular que ocurren duranteel desarrollo del dano tisular y la busqueda de evi-dencias inmunologicas de muerte mediada por ce-lulas podrian ser iitiles para un diagnostico correctode los episodios de rechazo . Se han propuesto dosmecanismos como responsables de la muerte celularen las lesions de origen inmunologico, llamadasnecrosis, o muerte accidental, y apoptosis, o muerteprogramada . Se sostiene que la necrosis es la conse-cuencia de la liberacion por el linfocito citotoxico degranulaciones lfticas que contienen una protefnaformadora de poros, perforina o citolisina, yenterasas, las que danan las membranas celulares yprovocan la muerte de las celulas diana por lisis os-motica. (11) El hallazgo de esos mismos productosen los linfocitos cultivados de biopsias endomiocar-dicas del momento del rechazo (12) y en las celulasinflamatorias presentes en las mismas biopsias (13)

Tabla 1Prevalencia de micleos apopt6sicos en biopsias

endomioc5rdicas

inflamatorias e intersticiales apoptosicas sin tincionde los nucleos de los miocitos subyacentes, con laexcepcion de un caso correspondiente a un efecto"Quilty" B en un rechazo grado 3A, en el que se ob-servaron miocitos apoptosicos en un area de infiltra-do mononuclear penetrante (Figura 3) .

DISCUSIONLa biopsia endomiocardica (BEM) es actualmente

el metodo mas confiable para diagnosticar el recha-zo agudo del trasplante alogenico del corazon hu-man. (8) La extension y calidad del infiltrado infla-matorio y la presencia de muerte o degeneracionmiocitica con considerados los pilares para el diag-nostico del rechazo agudo en el trasplante de cora-zon human. Si bien la evaluacion de la calidad yextension del infiltrado inflamatorio normalmente nopresenta dificultades, la injuria miocitica no es siem-pre evidente a nivel del microscopio de luz. Cuandono existe una ruptura de la integridad celular, o unamarcada hipereosinofilia, el diagnostico de la injuriamiocitica esta basado en alteraciones imprecisas,como la centralizacion de las miofibrillas con

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Fig. 2 . Imagen con bajo aumento de unabiopsia endomiocardica sin signos his-tolbgicos de rechazo. Solamente los nu-cleos de algunas celulas intersticiales yendoteliales aparecen coloreados. Au-mento original 100 X.

Grado de rechazo Miocitos Intersticio y endotelio

Dia del trasplante 0/6 0/6Grado 0 0/18 7/18Grado 1A 0/11 7/11Grado 1B 0/22 9/22Grado 2 4/8 5/8Grado 3A 8/8 8/8

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sugiere que este mecanismo de muerte celular act isen los episodios de rechazo .

El segundo mecanismo de muerte inmunologica,apoptosis, se reconoce a nivel morfologico por me-dio de la microscopia electronica de transmision . Suscaracteristicas mas importantes consisten en lacondensacion de la cromatina nuclear, lacondensacion de la matriz citoplasmica y de losorganoides y la aparicion de expansiones pediculadasde la membrana plasmatica, un proceso llamadozeiosis . (14,15) Con el microscopio de luz la apoptosisno puede diagnosticarse con precision . A pesar deque la presencia de nucleos con la cromatina conden-sada y de homogenizacion citoplasmica con reduc-cion del tamano celular puede ser considerada su-gestiva de apoptosis, otras condiciones patologicastales como la hipoxia pueden producir alteracionessimilares de los miocitos . Como el fenomeno bioquf-mico mas caracteristico de la apoptosis es el clivajede la cromatina por la activacion de endonucleasas,la pesquisa de fragmentos de DNA es un metodoconfiable para su diagnostico . La tecnica empleadaen el presente trabajo, marcando in situ las roturasde DNA nuclear en biopsias procesadas para estu-dios histopatologicos rutinarios, permite la identifi-cacion individual de celulas apoptosicas . Ademas,dado que la rotura de la cromatina es un proceso di-namico y prolongado, estas tecnicas permiten la iden-tificacion de celulas en proceso de apoptosis, peroque todavia no muestran evidencias morfologicas dedano .

Nuestros resultados muestran que la presencia decelulas apoptosicas en el corazon esta asociada conel trasplante . En ninguna de las muestras obtenidasde los corazones dadores en el momento del trasplan-te, asi como tampoco en las biopsias endomiocardi-cas de pacientes con diferentes afecciones cardiacas(cardiomiopatia dilatada, cardiomiopatia hipertrofi-ca, fibrosis subendocardica y amiloidosis), hemosencontrado nucleos apoptosicos. En las biopsias decorazones trasplantados se encontraron nucleosapoptosicos tanto en los miocitos como en las celu-las endoteliales e intersticiales . La presencia de mio-citos apoptosicos fue coincidente con la evidenciahistologica de rechazo. En ninguna de las biopsiasdiagnosticadas como grados 0 y 1A se hallaron mio-citos apoptosicos. Por el contrario, en los casos diag-nosticados como rechazos grado 113, 2 y 3A se en-contraron miocitos apoptosicos pero con una preva-lencia diferente de acuerdo con el grado de rechazo .Mientras todos los casos 3A mostraron miocitosapoptosicos, los mismos estaban presentes solamen-te en unos pocos casos de rechazo 1B y en la mitadde los grado 2. Esta observacion sugiere que en algu-nos casos diagnosticados como grado 113 por la au-sencia de necrosis miocitica en las tecnicas histologi-

Fig . 3. Efecto "Quilty" B mostrando una tincibn intensa de losnucleos del infiltrado inflamatorio y de algunos miocitossubendocardicos . Aumento original 100 X .

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cas de rutina, existe dano inmunologico de los mio-citos. Por el contrario, algunos de los casos diagnos-ticados grado 2 sobre la base del dano miocftico, apa-rentemente no muestran evidencia de apoptosis. Deacuerdo con lo esperado, el efecto "Quilty" no estu-vo relacionado con apoptosis miocitica. El hecho deque el unico caso de efecto "Quilty" positivo hayacoincidido con un episodio de rechazo grado 3A hacesuponer que se trataba de un rechazo subendocardi-co mas que un autentico efecto "Quilty" . Sin embar-go, dado que algunas veces existen dificultades paradistinguir el efecto "Quilty" del rechazo, la investi-gacion de apoptosis podrfa ser de utilidad para rea-lizar el diagnostico diferencial .

A diferencia de los miocitos, que mostraronapoptosis solamente en los rechazos 113, 2 y 3A, laapoptosis de las celulas endoteliales capilares y co-nectivas intersticiales estuvo presente en la mitad delos rechazos grados 0 y 1A, ademas de observarse enla mitad de los rechazos 1B y 2 y en todos los recha-zos grado 3A . Si se tiene en cuenta que no se encon-tro apoptosis de esas celulas en las biopsias endo-miocardicas obtenidas en el momento del trasplan-te, parece razonable suponer que este fenomeno estavinculado con el trasplante. Sin embargo, el hechode que la apoptosis de las celulas endoteliales y co-nectivas fuese observada en las muestras sin eviden-cia histologica de rechazo induce a suponer que estefenomeno no esta vinculado con el rechazo mediadopor celulas . Con los estudios realizados en el presen-

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to trabajo no es posible establecer si la apoptosis delas celulas endoteliales y conectivas es la consecuen-cia de la inmunidad humoral o de las drogas em-pleadas para la induccion de inmunosupresion . Essabido que los corticosteroides inducen la apoptosisde los linfocitos (17) y la ciclosporina A la previene .(18) Segin nuestro conocimiento, no existen estudiosacerca de la accion de esas drogas sobre las celulascardiacas .

La informacion disponible indica que en el cora-zon trasplantado operan dos mecanismos de muertecelular, apoptosis y lisis osmotica, al parecer mascomplementarios que antagonicos en la citotoxicidadmediada por celulas . Uno, dependiente de una sepalde contacto transmembrana plasmatica, y el otro dela exocitosis de material toxico por linfocitosefectores. (18) La observacion de que los linfocitosCD4+ y CD8+ poseen mecanismos de citotoxicidaddependiente e independiente de las granulacionesapoya esta opinion .

A pesar de que el nl mero relativamente pequenode casos del presente trabajo impide obtener conclu-siones definitivas, es nuestra opinion que la investi-gacion de la presencia de apoptosis en los miocitospuede ser un medio litil para el diagnostico de danocelular y para establecer variedades dentro de los gra-dos bajos de rechazo, permitiendo de esta manera laadopcion de medidas terapeuticas .

Dentro de la misma linea de razonamiento, la in-vestigacion de apoptosis por tecnicas in situ podriaser un medio eficaz para el diagnostico anatomopa-tologico de miocarditis en la que el dano miocitico esel requisito exigido para diferenciar entre una mio-carditis establecida y una fronteriza (borderline) . (20)

SUMMARY

APOPTOSIS: "IN SITU" IDENTIFICATION BYNUCLEI DNA FRAGMENTS-SPECIFICTAGGING, IN ENDOMYOCARDIAL BIOPSYESDURING EPISODES OF ACUTE REJECTION

The presence of apoptosis in individual nuclei ofendomyocardial biopsies from 6 patients withallogeneic heart transplant was demonstrated bymeans of the detection in situ of nuclear DNAbreaks. Biotinylated dUTP incorporated withdeoxynucleotidyl transferase and revealed withalkaline phosphatase-labeled streptavidin wasemployed. None of the samples at the moment oftransplant presented apoptotic nuclei, which wereobserved in the myocytes, endothelial and connec-tive tissue interstitial cells of the biopsies, obtainedbetween 7 and 146 days after transplant . The kindand number of cells with apoptotic nuclei wasdifferent according to the rejection grade (Grading

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of the ISHLT) . All the rejection grade 3A (n = 8),half of the rejection grade 2 (n = 8) and some of therejection grade 1B (3/8) biopsies showed myocyteswith apoptotic nuclei within or in the neighborhoodof the inflammatory infiltrates zones . In therejection grades 0 and 1A, and in "Quilty" effectareas, no myocytes with apoptotic nuclei wereobserved. On the contrary, in the endothelial andconnective tissue cells, apoptotic nuclei wereobserved in all the rejection grades . These resultsindicate that during the acute rejection episodesmyocyte apoptosis is one of the mechanisms ofimmunological damage and that its recognition mayrepresent a useful tool for the demonstration ofmyocyte damage in endomyocardial biopsies .

Key words Apoptosis - Acute rejection - Transplant -Endomyocardial biopsy

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