trabajo previo a la obtenciÓn del tÍtulo de ingeniera de...
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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA
CARRERA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS
TEMA:
DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARA LA OBTENCIÓN
DE CALLO A PARTIR DE TEJIDOS DE MORA DE CASTILLA
SIN ESPINAS (Rubus glaucus) EN UN MEDIO ESTÁNDAR DE
CULTIVO
TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO
DE INGENIERA DE ALIMENTOS
AUTORA: JESSANDRA ELIZABETH VÁSQUEZ RODRÍGUEZ
DIRECTORA: ING. NUBIA GRIJALVA
Quito-Ecuador
2014
© Universidad Tecnológica Equinoccial. 2014
Reservados todos los derechos de reproducción
DECLARACIÓN
Yo JESSANDRA ELIZABETH VÁSQUEZ RODRÍGUEZ, declaro que el
trabajo aquí descrito es de mi autoría; que no ha sido previamente
presentado para ningún grado o calificación profesional; y, que he
consultado las referencias bibliográficas que se incluyen en este documento.
La Universidad Tecnológica Equinoccial puede hacer uso de los derechos
correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de
Propiedad Intelectual, por su Reglamento y por la normativa institucional
vigente.
_________________________
JESSANDRA ELIZABETH VÁSQUEZ RODRÍGUEZ
C.I. 1716873417
CERTIFICACIÓN
Certifico que el presente trabajo que lleva por título Desarrollo de un
protocolo para la obtención de callo a partir de diferentes tejidos de
mora de castilla (Rubus glaucus) en un medio estándar de cultivo,
que, para aspirar al título de Ingeniera de Alimentos fue desarrollado por
Jessandra Elizabeth Vásquez Rodríguez, bajo mi dirección y supervisión,
en la Facultad de Ciencias de la Ingeniería; y cumple con las condiciones
requeridas por el reglamento de Trabajos de Titulación artículos 18 y 25.
___________________
Ing. Nubia Grijalva
DIRECTORA DEL TRABAJO
C.I.1717665689
DEDICATORIA
A mi madre, por ser todo en mi vida.
Ramiro, te agradezco porque por ti soy la mujer que soy ahora.
Hermana, eres mi mejor amiga….
AGRADECIMIENTO
A Dios por ser el pilar de mi vida, por caminar siempre a mi lado, por
permitirme culminar mis estudios y estar tan cerca de convertirme en una
profesional.
A mi madre, por estar siempre junto a mí dándome su amor y apoyo
incondicional, por ser la luz que guía mi vida y darme ánimos para continuar.
A mi hermana por estar siempre a mi lado en todo momento sin pensarlo dos
veces su apoyo, amor y cariño es lo más importante en mi vida.
A mis amigas Dayana Cerón y Natalia Parra, porque han sido una gran
ayuda en la realización de esta tesis, su paciencia y amor ha sido
incondicional y único, les agradezco de todo corazón por su ayuda.
A la Ing. Nubia Grijalva por todo su apoyo, paciencia y por caminar conmigo
en el desarrollo de mi trabajo. Gracias por transmitirme sus conocimientos y
ayudarme a culminar mi carrera, de todo corazón le deseo lo mejor.
vii
ÍNDICE DE CONTENIDOS
PÁGINA
RESUMEN…………………………………………………………………….…xiv
ABSTRACT…………………………………………………………………...…xv
1.INTRODUCCIÓN………………………………………………………………1
2. MARCO TEÓRICO……………………………………..……………………3
2.1. MORA DE CASTILLA……………………………………………………3
2.1.1.ASPECTOSaGENERALES…………………………………………3
2.1.2. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA………………………………………..4
2.1.3. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA………………………………….5
2.1.4.COMPOSICIÓNaQUÍMICAaYaVALORaNUTRICIONAL………..5
2.1.5. IMPORTANCIA ECONÓMICA……………………………………..7
2.1.6.PIGMENTOSaDEaLAaMORAaDEaCASTILLA………………......7
2.1.6.1.Antocianinas………………………………………………………..8
2.2.CULTIVOaINVITROaDEaPLANTAS……………………………………9
2.2.1. ESTRATEGIAS DE CULTIVO IN VITRO………………………..11
2.2.2.OBTENCIÓNADEACALLO…………………………………………12
2.2.3. USO DE BIOREGULADORES EN EL CULTIVO IN VITRO…...13
2.2.4.APLICACIONES DEL CULTIVO IN VITRO……………………....13
2.3. CULTIVO IN VITRO EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA…………..16
viii
PÁGINA
2.3.1. MOLECULAR FARMING…………………………………………..18
2.4. CULTIVO IN VITRO DE MORA DE CASTILLA………………………19
2.4.1. METABOLITOS SECUNDARIOS DE INTERÉS EN LA MORA..20
3.1METODOLOGÍA………………………………………………………….…..21
21
3.1. OBTENCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL…………………….…..….21
3.2. DESINFECCIÓN………………………………………………………...21
3.2.1.SEMILLAS……………………………………………………………21
3.2.2.RAÍCES……………………………………………………………….22
3.2.3.YEMAS APICALES, EXPLANTES DE HOJAS Y TALLOS….….22
3.3. ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS………………………………….23
4. ANÁLISIS DE RESULTADOS………………………………………………27
4.1.FORMULACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO MINIMO
PARA LA OBTENCIÓN DE CALLO…………………………………...27
4.2. EFICACIA DE LOS MÉTODOS DE DESINFECCIÓN……………...29
4.3. FASE DE ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS DE SEMILLAS
RAÍCES Y BROTES..……………………………………………………30
4.1.1.SEMILLAS…………………………………………………………….32
4.1.1.1.Pretratamientos………………………………………………….…32
4.1.2.BROTES……………………………………………………………....33
4.1.3.RAÍCES………………………………………………………………..35
4.4. OBTENCIÓN DE CALLOS A PARTIR DE EXPLANTES DE d
hojas y HOJAS Y TALLOS……………………………………………………..36
ix
PÁGINA
4.5. ANALISIS ECONÓMICO…………..…………………………………..41.
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES…………………………….45
5.1. CONCLUSIONES………………………………………………….45
5.2. RECOMENDACIONES…………………………………………...46..
BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………..47.
ANEXOS………………………………………………………………………......55
x
ÍNDICE DE TABLAS
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Tabla 1. Clasificación taxonómica de la mora de castilla (Rubus glaucus)...5
Tabla 2. Composición nutricional de la mora…………………………………...6
Tabla 3. Técnicas de cultivo in vitro de plantas………………………….…....10
Tabla 4. Técnicas de cultivo in vitro vegetal…………………………………...12
Tabla 5. Ejemplos de las aplicaciones de las técnicas de cultivo in vitro
en la industria alimentaria………………………………………….....17
Tabla 6. Avances en la industria alimentaria mediante la técnica de
cultivo in vitro……………………………………………………..……18
Tabla 7. Trabajos realizados con mora de castilla sin espinas……………...20
Tabla 8. Medios de cultivo evaluados, Medio M&S…………………………...24
Tabla 9. Condiciones de incubación de los explantes sembrados………….26
Tabla 10. Eficacia de bioreguladores en diferentes investigaciones………..27
Tabla 11. Métodos de desinfección utilizados para todos los tejidos……....29
Tabla 12. Crecimiento de semillas, raíces y brotes in vitro de mora de
castilla……………………………………………………………….....31
Tabla 13. Resultados obtenidos para la obtención de callos a parir de
hojas y tallos…………………………………………………………..37
Tabla 14. Costos fijos y depreciación de equipo y materiales empleados
para la realización de cultivo in vitro de mora de castilla sin
espinas………………………………………………………………....42
xi
PÁGINA
Tabla 15. Costos totales para la obtención de 240 placas por día para
2 trabajadores al día con 5 explantes cada uno mora de
castilla sin espina………………………….…………………………..43
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
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Figura 1. Mora de castilla en estado de madurez…………………………..…4
Figura 2 . Procedimiento básico de cultivo de célilas en suspención……...11
Figura 3. Callos obtenidos a los quince días de siembra a partir de tallos..28
Figura 4. Callos obtenidos a las tres semanas de siembra a partir
hhhhhhhhde hojas………………………………………………………………..28
Figura 5. Cultivo de semillas……………………………………………...….…33
Figura 6. Cultivo de yemas axilares a los 10 días…………………………...34
Figura 7. Cultivo de yemas axilares a los 15 días…………………………....35
Figura 8. Cultivo de raíces a los 20 días………………………..………........35
Figura 9. Formación de callo T2 con hormona en un medio estéril………..38
Figura 10. Formación de callo T3 con hormona en un medio estéril………38
Figura 11. Fenolización en explantes de hojas…………………………......399
Figura 12. Formación de callo alrededor del explante de hoja a las tres
aaaaaaaaalsemanas………………………………………..………………...…40
Figura 13. Formación de callo en explante de hoja………………………….40
xiii
ÍNDICE DE ANEXOS
PÁGINA
Anexo 1. Composición química del medio M&S……………………………..55
xiv
RESUMEN
El cultivo de callos in vitro es una técnica que se usa tanto para el
mejoramiento de especies de gran importancia económica como para la
obtención de metabolitos secundarios. Consiste en el cultivo bajo
condiciones controladas y asépticas de fragmentos de tejidos de una planta
para promoverlos a crecer en un ambiente apropiado que permita el
desarrollo de su capacidad morfogenética. La investigación tuvo la finalidad
de obtener callos a partir de semillas, hojas, raíces y tallos de mora de
castilla (Rubus glaucus) sin espinas, utilizando un medio Murashige y Sook
estándar óptimo, con tres diferentes dosificaciones de auxina 2-4D hormona
que promueve el crecimiento vegetal en tallos y hojas. Inicialmente, se
probaron diferentes protocolos de desinfección donde se trabajó con cuatro
diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio y etanol. Para la
obtención de callo se trabajó con tres diferentes medios de cultivos cada uno
con dosificaciones de 0.5 g/L, 1 g/L y 1.5 g/L de la auxina 2-4D y las placas
sembradas fueron almacenadas bajo los requerimientos necesarios del
explante. El método de desinfección más favorable fue con hipoclorito al
0.5% y etanol al 35%, posteriormente lavado con agua destilada estéril para
eliminar los excesos de las soluciones. En la fase de callogenesis en un
medio óptimo estándar con la auxina 2-4D la mejor concentración fue de 1.5
g/L con una aparición de células desdiferencidas a los 15 días de la siembra
en tallos y hojas, ocupando el 100% del área foliar en los tallos en un lapso
de 20 días. No se obtuvo crecimiento celular en semillas ya que la
dormancia de este tipo de explante posee un bajo poder germinativo y un
grado de dormancia alto. Los resultados obtenidos constituyen la base para
posteriores trabajo de investigación como la identificación de pigmentos y la
evaluación de metabolitos secundarios mediante células en suspensión de la
mora de castilla para crear colorantes naturales y fragancias.
xv
ABSTRACT
Cultivating in vitro callus is a technique used to improve both species of great
economic importance to the production of secondary metabolites. It consists
in the cultivation under aseptic and controlled conditions of tissue fragments
of a plant to promote them to grow in an appropriate environment that allows
the development of their morphogenetic capacity. The research was intended
to obtain callus from seeds, leaves, roots and stems of blackberry (Rubus
glaucus) Boneless using a standard Murashige and Sook optimal, with three
different dosages of 2,4-D auxin hormone that promotes plant growth in
stems and leaves. Initially, different disinfection protocols where he worked
with four different concentrations of sodium hypochlorite and ethanol were
tested. For obtaining callus worked with three different culture mediums each
with dosages of 0.5 g / L, 1 g / L and 1.5 g / L of 2,4-D auxin and seeded
plates were stored under the necessary requirements explant . The method
of disinfection was more favorable with 0.5% hypochlorite and 35% ethanol,
then washed with sterile distilled water to remove excess solution. In phase
callogenesis standard optimal medium with auxin 2-4D the best
concentration was 1.5 g / L with an appearance desdiferencidas cells at 15
days after planting in stems and leaves, occupying 100% of the leaf area on
stems in a span of 20 days. Not cell growth in seed dormancy obtained as
explant such germination is low and a high degree of dormancy. The results
form the basis for further research and identification of pigments and
evaluation of secondary metabolites using suspension cells castilla mulberry
to create natural dyes and fragrances.
1. INTRODUCCIÓN
1
1. INTRODUCCIÓN
En los últimos años se ha dado mayor interés a la biotecnología vegetal con
el propósito de producir alimentos con mejor calidad y con un alto nivel
nutricional además obtener metabolitos de interés comercial (Pérez, 1998).
La propagación in vitro de plantas es una técnica muy utilizada en cultivos de
gran importancia económica y de consumo diario como la mora de castilla
(Rubus glaucus). En España en 1990 existían 28 laboratorios dedicados a la
producción comercial de este tipo de plantas, esencialmente por la rapidez
de crecimiento de tejidos, órganos, semillas, embriones (Segretín citado por
Alulema, 2013), sin embargo actualmente este número se ha incrementado
notablemente.
La obtención de callos se la realiza a partir de órganos o tejidos organizados
cultivados en un medio sólido suplementado apropiadamente ante la
presencia de auxinas exógenas (Warren, 1992).
Los callos son células desdiferenciadas que no tienen ningún orden
específico de crecimiento. Existen diferentes bioreguladores de crecimiento
que ayudan la obtención de callos partiendo de diferentes tejidos, como el
caso de las auxinas. Las auxinas son bioreguladores de crecimiento que
favorecen la división y elongación celular de todos los órganos (Díaz, 2012).
En la industria alimentaria la formación de callos es aplicada para la
producción de metabolitos secundarios de interés (pigmentos, colorantes,
fragancias), adicional a esto a partir de este tejido foliar se pueden obtener
miles de plantas comerciales a menor tiempo comparando con el método
tradicional, ya que no demandan un espacio excesivamente grande para ser
almacenados ni mucha mano de obra.
La optimización de un protocolo para el cultivo celular partiendo de
diferentes tejidos ofrece grandes expectativas para el empleo de esta
tecnología en procesos de mejoramiento genético en la mora de castilla
(Rubus glaucus), para la producción de plantas certificadas que se puedan
2
adaptar al medioambiente permitiéndoles combatir diversas plagas y
enfermedades; así mismo potenciar sus pigmentos naturales que son de
gran valor nutricional por su capacidad antioxidante.
La implementación de tecnologías para la producción de vitroplantas
considera la aplicación en forma sucesiva de un grupo de fases,
relacionadas entre sí, que tienen lugar bajo estrictas condiciones de asepsia
y rigurosos procedimientos de operaciones, y a su vez, la base de diferentes
procesos de trabajo con un carácter manual (Martín, 2010). Adicionalmente
el costo de la materia prima es considerablemente alto por estas razones
este trabajo propone potenciar los recursos y materia prima necesaria
obteniendo los mismos resultados que otros trabajos ya realizados.
Para el presente trabajo se plantearon algunos objetivos:
Objetivo General
Desarrollar un protocolo para la obtención de callo a partir de diferentes
tejidos de mora de castilla sin espinas (Rubus glaucus) en un estándar de
cultivo.
Objetivos Específicos
Estandarizar el protocolo de desinfección de diferentes tipos de
tejidos para obtener callos.
Determinar el medio estándar óptimo (formulación, dosis de la auxina
2-4D, condiciones de crecimiento) para obtener callos a partir de
diferentes tejidos.
2. MARCO TEÓRICO
3
2. MARCO TEÓRICO
2.1. MORA DE CASTILLA
2.1.1. ASPECTOS GENERALES
El género Rubus agrupa una gran cantidad de especies en el reino vegetal
que se encuentran diseminadas en casi todo el mundo excepto en las áreas
desérticas (Alulema, 2013).
En 1840 se iniciaron en Estados Unidos trabajos para obtener diferentes
variedades con mejores características y desde entonces se han generado
nuevas modificaciones de mora de castilla en las zonas templadas
(Cabezas, 2008).
Existen en la actualidad especies del género Rubus con espinas y sin
espinas con variedades de porte erecto y semierecto. La primera variedad
reportada es la Dorchester y luego la Synder, en 1851. Este producto se
encuentra distribuido a nivel mundial, aunque la producción comercial está
ubicada en las zonas templadas (Morrillo, 2011).
La mora de castilla (Rubus glaucus) es uno de los frutos de origen silvestre
más conocidos y cultivados en Ecuador, especialmente en las zonas de
clima frío y moderado, su cultivo presenta una importante demanda.
Actualmente es conocida por sus beneficios nutricionales para el ser
humano, no solo por su gran cantidad de vitaminas y minerales sino también
por su capacidad antioxidante (Martínez, 2007). Se cultiva a una altitud de 1
800 a 3 000 metros sobre el nivel del mar, en las provincias de Tungurahua,
Cotopaxi, Pichincha, Imbabura, Carchi y Bolívar, en una extensión de 5 200
hectáreas, con una producción anual entre 12 y 14 toneladas al año (Diario
Hoy, 2014).
4
2.1.2. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA
La mora de Castilla pertenece a la Familia Rosáceae, del género Rubus y
especie glaucus, también es conocida como mora andina; en América del
Norte y en Europa también es conocida como zarzamora (Delgado, 2012)
Existen varias especies de Rubus cultivadas como son: R. floridundus, R.
figantus, R. adenotrichas, R. notingensis, y la de mayor importancia en
nuestro país es R. glaucus.
La mora es una antofita, dicotiledónea que pertenece al orden rosales, con
más de 20 especies silvestres reportadas en Ecuador. Es un arbusto
perenne de crecimiento desordenado, rastrero, cuyas hojas son de
tonalidades verdosas con número de foliolos variables, generalmente
lanceolados y con envés pubescente (Salvador, 2002).
Su fruto es esférico, su tamaño varía entre 2 a 4 cm de longitud, con un
diámetro promedio de 20 mm. Posee un color verde cuando se están
formando, cuando está ya maduro como se puede ver en la Figura 1 el color
varía entre púrpura claro y oscuro (Antia y Torres, 1998).
La planta comienza a fructificar a los 8 meses después del trasplante
dependiendo del manejo y cuidado de la plantación; presenta un período de
10 o más años de producción.
Figura 1. Coloración de la mora de castilla en estado de madurez
(Montalvo, 2011; Ramírez, 2012)
5
2.1.4. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA
Según Morrillo (2011), la clasificación taxonómica de la mora de castilla
(Rubus glacus) se observa en la Tabla 1.
Tabla 1. Clasificación taxonómica de la mora de castilla (Rubus glacus)
(Morillo, 2011)
2.1.3. COMPOSICIÓN QUÍMICA Y VALOR NUTRICIONAL
Las moras son frutas con un bajo valor calórico por su escaso aporte de
carbohidratos. Sin embargo son muy ricas en antioxidantes, especialmente
en vitamina C, aportan fibra, potasio, hierro y calcio y diversos ácidos
orgánicos (Tamayo et al., 2001).
Reino Plantae
División Antofita
Clase Dicotiledónea
Subclase Arquiclamidea
Orden Rosales
Familia Rosaceae
Género Rubus
Especie glaucus
Nombre científico Rubus glaucus.
Nombre común “Mora”
6
Se caracterizan por su contenido de pigmentos naturales tales como las
antocianinas que son sustancias con acción antioxidante, le dan el color a la
mora y junto con el ácido oxálico y el ácido málico son responsables de su
sabor (Herrera, 2008).
El valor nutricional del jugo de mora en 100 gramos de porción se indica en
la Tabla 2, según un estudiado realizado por Salvador (2011).
Tabla 2. Composición nutricional de la mora
(Salvador, 2011)
Energía 57kcal
Fibra dietética 5.30 gramos
Proteínas 1.2 gramos
Grasas 0.6 gramos
Carbohidratos 13.2 gramos
Cenizas 0.6 gramos
Calcio 34 miligramos
Magnesio 20 miligramos
Potasio 196 miligramos
Fósforo 36 miligramos
Hierro 2 miligramos
Vitamina C 18 miligramos
Vitamina B6 0.06 miligramos
Ácido fólico 34 miligramos
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2.1.5. IMPORTANCIA ECONÓMICA
La mora es un fruto silvestre de gran apogeo a nivel mundial no solo por su
valor nutricional sino también porque su costo es accesible. En Ecuador
representa una rama de empleo para pequeñas y medianas industrias ya
que cultivan esta baya y lo venden al por mayor y menor, son también
destinadas a la exportación, proporcionando un ingreso al país (Alulema,
2013).
En los últimos años, el consumo de este fruto tanto fresco como congelado y
procesado se ha incrementado, tanto en el mercado nacional como en el
internacional. En el mercado internacional la mora se comercializa como
fruta de mesa y como materia prima, en Ecuador la producción es destinada
al consumo doméstico como la elaboración de jugos y menos al
procesamiento industrial (Salvador, 2002).
La principal época para la venta de mora en el Ecuador es durante la
primera semana del mes de Noviembre, se planifica realizar las podas por
sectores para que estén en plena producción una semana antes de la
celebración del día de los difuntos; en esta época el precio incrementa y
posteriormente el valor empieza a decaer (Tamayo, et al, 2001).
Esta fruta es altamente perecible debido a su fragilidad y también a la
influencia de factores extrínsecos en la postcosecha, lo cual produce un
deterioro temprano y una vida útil muy corta, dándole menor valor porque
pierde características organolépticas y no lo hace apto para el consumidor
(Martínez y Beltrán, 2007).
2.1.6. PIGMENTOS DE LA MORA DE CASTILLA
Las frutas con colores fuertes, como las moras, contienen abundantes
antocianinas las cuales son pigmentos naturales aceptados como colorantes
alimentarios; por lo tanto, pueden ser utilizadas como materia prima en la
fabricación industrial de un colorante natural. Las antocianinas representan
8
un factor importante en la industria alimentaria, debido a las restricciones
sanitarias hacia el uso de colorantes sintéticos (Marcano, 1991).
La obtención de un colorante a partir de estos compuestos presentes en los
frutos maduros de la mora de Castilla (Rubus glaucus) mejoraría las
características físicas como el color de muchos productos; además de
poseer propiedades antioxidantes (Nagem, 2000).
2.1.6.1. Antocianinas
Las antocianinas son pigmentos que generalmente se encuentran en las
flores y en las hojas de otoño, su color puede ir desde el rojo hasta el azul.
Las antocianinas que se encuentran en las flores han servido como objetos
de experimentos para varios estudios realizados, estos han sido señalados
como marcadores genéticos, razón por la cual se los ha manipulado
genéticamente para obtener nuevas variedades de petunias y camelias
(Pavlov, 1970).
De todas las antocianidinas que actualmente se conocen (aproximadamente
20), las más importantes son la pelargonidina, delfinidina, cianidina,
petunidina, peonidina y malvidina, nombres que derivan de la fuente vegetal
de donde se aislaron por primera vez; la combinación de éstas con los
diferentes azúcares genera aproximadamente 150 antocianinas (Ortiz; Reza;
Chew, 2011). Generalmente se encuentran en la cáscara o piel pero también
se pueden localizar en la parte carnosa, como en las fresas y ciruelas.
En el caso de la mora, se extraen las antocianinas violetas, estos pigmentos
tienen la característica de defender al organismo de los carcinógenos, pero
además estimulan al cerebro y se constituyen como un factor protector
contra el cáncer de colon (Santacruz, 2011).
Según un estudio realizado por Carrión (2009), México los beneficios de las
antocianinas son:
Inhiben el colesterol
Previenen el envejecimiento
9
Estimulan al tracto urinario
Mejoran la memoria
Evitan afecciones cardíacas
Regulan la presión arterial
Refuerzan las paredes venosas
Combaten las várices
2.2. CULTIVO IN VITRO DE PLANTAS
Según Mrogiski y Flaschland (2012) el cultivo in vitro de plantas se define
como “el conjunto de técnicas que permiten el cultivo de las células y tejidos
vegetales en condiciones axénicas y el aprovechamiento de su totipotencia,
así como de su aptitud para la variación y capacidad de modificación
genética”.
Existen varias técnicas con las que se cultivan plantas bajo condiciones
estériles en un laboratorio que permiten el cultivo mediante la utilización de
medios artificiales controlados y libres de microorganismos para asegurar la
calidad del producto final, las mismas que se observan en la Tabla 3, el
método de propagación debe ser seleccionado tomando en cuenta la
materia prima con la que se va a trabajar y de las demandas de la planta
(Mrogiski, y Flaschland, 2012).
10
Tabla 3. Técnicas de cultivo in vitro de plantas
Nombre de la técnica Explante Resultado
Obtención de plantas con
sanidad controlada
Meristemas Plantas libres de virus
Micropropagación Ápices terminales Meristemas
Obtención de híbridos
interespecificos
Embrión cigótico, ovarios u
óvulos fecundados
Híbridos derivados
Obtención de plantas de
semillas con embriones
rudimentarios
Semillas Yerba mate o tipos de
duraznos
Obtención de plantas
haploides
Anteras, microesporas
aisladas y óvulos
Establecimiento de cultivo de
células en suspensión
Explantes extraídos de
semillas germinadas
Obtención de metabolitos
secundarios
(Mrogiski, Flaschland y Sansberro, 2012)
El cultivo de células y tejidos vegetales ha reemplazado en algunos casos el
cruzamiento tradicional ya que ahorra tiempo y ofrece mejores resultados.
Las células vegetales son colocadas en un medio basal con determinados
reguladores de crecimiento, vitaminas, aminoácidos y un azúcar (Lee, 2000).
El procedimiento básico para obtener un cultivo de células vegetales se
detalla en la Figura 2.
11
Figura 2. Procedimiento básico del cultivo de células en suspensión
(Alulema, 2013)
2.2.1. ESTRATEGIAS DE CULTIVO IN VITRO
El término cultivo de tejidos vegetales involucra a diferentes técnicas de
cultivo como se observa en la Tabla 4 de material vegetal diverso,
incluyendo a los protoplastos (células desprovistas de su pared celular),
células, tejidos, órganos y plantas completas. Mediante éstas y otras
técnicas de cultivo, es posible obtener plantas libres de microorganismos en
un medio nutritivo aséptico y estéril en condiciones ambientales controladas
(Segretín, 2003).
Selección del explante
Pretratamiento de limpieza al explante
Desinfección al explante
Preparación de medio de cultivo M&S
Esterilización de la superficie de trabajo
Seccionar el explante
Vertir el medio M&S enriquecido en placas
petri
Sembrar el explante en el medio sólido o
semisólido
Almacenamiento bajo condiciones de luz y
humedad controladas
Germinación
Obtención de callo
Transferencia del callo a un medio con
fitohormonas Cultivo en suspensión
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Tabla 4. Técnicas de cultivo in vitro vegetal
TÉCNICA EXPLANTE APLICACIÓN
Micropropagación Células, tejidos,
órganos, semillas y
embriones
Producción masiva de especies
hortícolas, aromáticas, medicinales,
frutícolas, ornamentales y forestales
Cultivo de meristemas Meristema apical Plantas libres de virus, multiplicación
vegetal y multiplicar especies de
plantas con reproducción lenta
Cultivo de células Callo Embriones somáticos y metabolitos
secundarios
(Sagretín, 2003)
2.2.2. OBTENCIÓN DE CALLO
El callo es una masa de tejido indiferenciado que crece sin ningún tipo de
orden que surge de la proliferación de células del parénquima. Los callos no
tienen patrones de crecimiento que se puedan predecir, tienen como
característica principal su crecimiento irregular, teniendo el potencial para
desarrollar raíces normales, brotes y embriones que forman plántulas
(Lallana citado por Alulema, 2013).
Usualmente es el resultado de alguna herida que sufrió el explante, esto
puede ser en el tallo, hojas y raíz que ha sido sembrado en un medio de
cultivo específico inducido por un balance hormonal entre diferentes
hormonas de crecimiento como son auxinas como por ejemplo la 2-4D y
citoquininas. Son llevados en placas petri con el medio artificial a un cuarto
oscuro con condiciones de temperatura, humedad y luz controladas (Ortega;
Konerva; Ruiz, 2010).
Posteriormente se puede llevar el callo obtenido a un medio sólido o líquido
para la obtención de células en suspensión, mediante una agitación
constante por un tiempo determinado.
13
2.2.3. USO DE BIOREGULADORES EN EL CULTIVO IN VITRO
Las hormonas vegetales son compuestos orgánicos de bajo peso molecular
que coordinan el crecimiento y desarrollo de las plantas. Según Díaz (2009),
la clasificación es la siguiente:
Auxinas, son hormonas que estimulan el crecimiento de la plantas,
especialmente el tallo e inhiben el desarrollo lateral de las ramas. Las
hormonas que pertenecen a este grupo son: AIA, ANA, AIB, 2.4-D,
2.4.5-T.
Citoquininas, son hormonas promueven la división y la diferenciación
celular. Las más comunes son: Zeatinas, Kinetina y BAP.
Giberelinas, son hormonas que estimulan el crecimiento de la planta,
actuando sinérgicamente con las auxinas. Dentro de este grupo se
encuentran las. GA1, GA3, GA4, GA7 y GA9.
Ácido Abscísico, son hormonas que tienen función antagónica a
otras hormonas, como por ejemplo, es inhibidora del crecimiento de la
plántula y de la germinación de las semillas. Estimula la senescencia
de las hojas.
Etileno, es una hormona que estimula el crecimiento trasverso en las
células de la planta; estimula la maduración de los frutos, el
envejecimiento de las flores e inhibe el crecimiento de las semillas
(Saavedra, 2008).
2.2.4. APLICACIONES DEL CULTIVO IN VITRO
El cultivo in vitro incluye un conjunto de técnicas de gran utilidad en la
mejora vegetal, es por esto su gran importancia en la industria para poder
producir compuestos naturales de alta calidad y a bajos costos.
14
El cultivo de tejidos presenta aspectos y aplicaciones prácticas muy variadas
entre las que se destaca la producción de metabolitos secundarios de
plantas (Kreis, 2007).
Además de las rutas del metabolismo primario, similares en todos los
organismos vivos, los vegetales tienen otras vías metabólicas que llevan a la
formación de compuestos característicos de un grupo taxonómico y cuya
función no guarda relación con los procesos vitales de la célula que los
biosintetiza. Estas rutas constituyen el metabolismo secundario el cual
puede definirse como la biosíntesis, transformación y degradación de
compuestos endógenos mediante proteínas de especialización (Piñol y
Palazón, 1993).
Las técnicas de micropropagación y mejoramiento de plantas han permitido
desarrollar procesos de producción de compuestos utilizando células
vegetales en diferentes tipos de bioreactores secundarios, para incrementar
el contenido de metabolitos (Sánchez & Arias, 2002).
Algunas células vegetales producen metabolitos secundarios importantes en
las interacciones de la planta con el medio ambiente o que están
relacionadas con la parte reproductiva de la planta. Muchos de estos
productos secundarios tienen uso en la industria farmacéutica, alimenticia,
entre otras, ya que tiene aplicaciones como esencias, colorantes, aditivos
alimenticios, insecticidas y productos farmacéuticos (Llorente, 2002).
Actualmente se considera que existen alrededor de 20000 metabolitos
secundarios que son producidos por las plantas y cada año se agregan 1600
nuevas sustancias (Salisbury y Ross, 1994).
Muchos de los metabolitos secundarios se han intentado sintetizar
químicamente, sin éxito, por lo que se hace necesario obtenerlos
directamente de las plantas (Kieran et al., 1997).
Según Wink (1999) se considera tres grandes grupos de metabolitos
secundarios: terpenos, fenoles y alcaloides.
15
Terpenos, son sustancias químicas que se encuentran en los aceites
esenciales, resinas y otras sustancias aromáticas de muchas plantas,
por ejemplo en los pinos y muchos tipos de cítricos (Heldt, 1997).
Fenoles, los fenoles constituyen un grupo de productos naturales
muy importantes. Se encuentran, entre otros, en los taninos usados
en el curtido de pieles, refinación de vinos, producción de resinas
fenólicas y epóxicas, entre otros (Vitores citado por Sánchez, 2002).
Alcaloides, son compuestos secundarios que poseen nitrógeno en su
estructura formando parte de un anillo heterocíclico. Se forman por
rutas metabólicas a partir de aminoácidos. Por lo general en una
planta se encuentran varios alcaloides (Wink, 1999).
El uso del cultivo de células vegetales en suspensión para producir una
enorme variedad de compuestos de alto valor terapéutico o industrial realza
su utilidad en la formación de los metabolitos (Chawla, 2002). Las plantas
presentan rutas metabólicas comunes en las que se producen compuestos
que son necesarios para su crecimiento y desarrollo. Estos compuestos son
conocidos como metabolitos primarios; in vitro estos fitoquímicos aparecen
en una fase temprana de la cinética de crecimiento de la biomasa (Wink,
1999).
Los metabolitos secundarios pueden eventualmente producirse; por lo
general aparecen en una fase tardía de la cinética de crecimiento celular,
terminando la fase exponencial o durante la fase estacionaria (Davies,
1995).
El cultivo de células vegetales presenta una gran alternativa para la
producción de dichas sustancias, sin embargo la baja producción de estos
biocompuestos es una de las principales limitaciones del cultivo celular,
debido a que los metabolitos secundarios son producidos para proteger la
planta de insectos, herbívoros y patógenos, o para sobrevivir a otros tipos de
estrés biótico o abiótico (Zhao et al., 2005).
16
Existen diversas técnicas para la producción de metabolitos secundarios in
vitro estas incluyen tratamientos con diversos elicitores, vias de señalización
(Yukimune et al., 1996; Zhao et al., 2005; Zhang et al., 2004).
Elicitación, es la activación o incremento de los metabolitos
secundarios utilizando un agente llamado elecitor. Los elicitores son
aquellos factores bióticos como microorganismos o abióticos como
sustancias químicas y agentes ambientales, que producen el estrés
en la planta o en el cultivo celular para inducir la biosíntesis de
metabolitos secundarios (Pérez, 2008).
Vías de señalización, la del jasmonato ha sido observada como la
ruta transductora de señales elicitoras para la producción de
metabolitos secundarios en diversas especies vegetales (Farmer et
al., 2003).
2.3. CULTIVO IN VITRO EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA
Muchos de los compuestos químicos que son utilizados por el hombre en su
vida diaria provienen de plantas, tanto silvestres como cultivadas. Entre
estos compuestos se encuentran a los utilizados en cosméticos, medicina y
en alimentos (Morones et al., 2002).
En el caso de la industria alimentaria, la técnica de cultivo in vitro ha
permitido tener una gama muy amplia de productos alimenticios fortificados
utilizando diferentes técnicas que se observan en la Tabla 5, generando así
nuevos sabores (Morcillo y Cortez, 2013).
17
Tabla 5. Ejemplos de las aplicaciones de las técnicas de cultivo in vitro en la
industria alimentaria
TÉCNICA RESULTADOS USO
Micropropagación Propagación clonal rápida
Semillas sintéticas
Floricultura, fruticultura
Desarrollo de embriones
Inhibidores de proteasas Resistencia a insectos Maíz, soja transgénica
Protección mediada por
ARN.
Resistencia a virus Maíz, eucalipto
Clonación de genes Alteración de color Flores y sus frutos
(Morcillo y Cortez, 2013)
El uso del cultivo de tejidos ha permitido el desarrollo de nuevos productos
de alta calidad garantizando la sanidad y ofreciendo al consumidor las
características organolépticas y nutricionales que demanda. Existen grandes
avances en esta área como se detalla en la Tabla 6.
El empleo de esta técnica también va dirigido a la producción de colorantes y
saborizantes naturales utilizando explantes de plantas ya que recientes
estudios han demostrado que el uso de colorantes sintéticos en los
alimentos pueden resultar dañinos para la salud debido a su grado de
toxicidad, como por ejemplo el color rojo (Kowerk, 1990).
18
Tabla 6. Avances en la industria alimentaria mediante la técnica de cultivo
ain vitro
AUTOR RESULTADO
Empresa CALGENE (2002) Aceites ricos en Acido esteárico
Tobar (2012) Alteración de los hidratos de carbono en
papa para aumentar el contenido de
almidón
Potrykus y Beyer (2000) Arroz con la producción de beta-carotenos
Food Future (2014) Carne in vitro
2.3.1. MOLECULAR FARMING
El molecular farming es la producción de proteínas de alto valor agregado en
las plantas. El disco de la hoja es sumergida en una suspensión bacteriana,
donde la bacteria Trojan horse infecta los bordes de la hoja y en este
proceso integra los genes que codifican para la proteína de interés en el
genoma vegetal.
En la producción en campo, luego de la cosecha el tejido que acumula la
proteína puede ser consumido directamente o se puede extraer la proteína
para un uso posterior.
A partir de esta técnica se han obtenido los siguientes resultados en la
industria alimentaria:
Alimentos para animales.
Enzimas industriales.
Riesgos sanitarios reducidos de contaminación por patógenos.
El costo de la proteína son 10 veces más baratas que por otros
métodos.
19
2.5. CULTIVO IN VITRO DE MORA DE CASTILLA
Actualmente la forma de cultivo in vitro es la más recomendable por sus
aplicaciones fitosanitarias, además tiene la finalidad de proporcionar gran
cantidad del fruto con buena calidad genética y bajo condiciones
controladas.
Ya que en el Ecuador existe un alto interés en la producción frutales, entre
ellos la mora de castilla, es necesario desarrollar técnicas in vitro y de campo
mejoradas y actualizadas que permitan profundizar el conocimiento de su
fisiología básica y obtener altos rendimientos del cultivo y así poder suplir la
demanda interna y externa que tiene el país (Contreras; Muñoz; Reyes,
2010).
Para la realización del cultivo vegetal de la mora de castilla, es importante la
selección del explante con el que se va a trabajar tomando en cuenta que se
desea conseguir y el tiempo, por lo general se utiliza ápices meristemáticos
como explantes primarios para iniciar el proceso de micropropagación. Sus
células en división permiten un rápido crecimiento, siempre y cuando se
encuentren en un medio de cultivo apropiado, además permite obtener
plántulas libres de contaminación endógena para la fase de multiplicación
(Katil y García, 2012).
El balance hormonal en el medio de cultivo es fundamental para el
crecimiento de la mora de castilla, según Alulema (2013); Díaz (2012), Katil y
García (2012) el mejor balance hormonal se da utilizando
citoquininas/giberelina.
Se han realizados varios trabajos en el país con respecto al cultivo in vitro de
mora de castilla sin espinas, algunos se detallan en la Tabla 7.
20
Tabla 7. Trabajos realizados con mora de castilla sin espinas
2.2.4.1. Metabolitos secundarios de interés en la mora
Dentro del gran grupo de los fenoles se encuentra el grupo de los
flavonoides que son pigmentos no nitrogenados que como se mencionó
anteriormente se encuentran en la mora de castilla especialmente el
kaempferol.
El kaempferol es una de los flavonoides más importantes en la naturaleza y
de igual manera posee un alto contenido de antioxidantes. En estudios
recientes, fue extraído de hojas de Gynkgo biloba y su uso fue eficaz para
inhibir la proliferación celular en cáncer de páncreas e inducir la apoptosis de
las células cancerígenas (Zhang et al., 2008).
No existen todavía trabajos realizados donde se pueda obtener este tipo de
flavonoide utilizando la técnica del cultivo in vitro (Duke, 1997).
REFERENCIAS NOMBRE DEL TRABAJO
Katil y García (2012) Establecimiento y multiplicación in vitro de
mora de castilla sin espinas mediante
ápices meristemáticos
Alulema (2013) Establecimiento de un protocolo para la
obtención de proembriones a partir de
callos desarrollados de tejido foliar de
vitroplantas de mora de castilla sin espinas
Paucar (2011) Organogénesis directa in vitro a partir de
explante de mora de castilla
Cárdenas (2013) Evaluación agronómica y fenología de dos
clones de mora de castilla sin espinas para
determinar su potencial comercial
3. METODOLOGÍA
21
3. METODOLOGÍA
3.1. OBTENCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL
Se trabajó con hojas, tallos, yemas apicales y semillas que fueron extraídas
de frutos y plantas de la mora de castilla proveniente del INIAP de la granja
experimental Tumbaco.
Las plantas fueron criadas en invernadero, bajo condiciones controladas. Se
seleccionaron las plantas en mejores condiciones, con mayor número de
yemas apicales y con sus hojas en un estado favorable.
3.2. DESINFECCIÓN
La desinfección, siembra y cultivo de hojas, tallos, yemas apicales y semillas
se realizó asépticamente en los laboratorios de Microbiología y de Suelos de
la Universidad Tecnológica Equinoccial.
3.2.1. SEMILLAS
Para disminuir la contaminación y la dormancia en las semillas inicialmente
se realizó un pretratamiento de escaldado en agua a 85 oC por 30 segundos,
posteriormente en agua a 10 oC por 30 segundos y luego se las colocó en
agua a temperatura ambiente durante 8 horas.
Luego las semillas fueron colocadas sobre papeles absorbentes y expuestos
al sol durante 30 minutos hasta asegurar que estén completamente secas.
Las semillas secas fueron colocadas en un envase de vidrio estéril con tapa
y fueron almacenadas a una temperatura de 5 oC durante 24 horas. Una vez
culminado este procedimiento se realizó un escaldado de las semillas en un
22
recipiente metálico cerrado y forrado con una lija para realizar un escaldado
por 1 minuto.
La siembra se realizó bajo condiciones de esterilidad en una cámara de flujo
laminar marca TELSTAR, la cual fue desinfectada previamente con alcohol
comercial y con una solución de Cloro al 5% para obtener un área
completamente estéril. El material vegetal fue expuesto a un tratamiento de
Hipoclorito de Sodio al 0.5% por 2 minutos, después fue lavado con agua
destilada estéril para retirar el exceso de la solución preparada,
posteriormente se sometió a las semillas con un segundo tratamiento de
etanol al 35% por 2 minutos, de igual manera se retiró el exceso de etanol
con lavados de agua destilada estéril y se las puso a secar sobre papel bond
estéril.
3.2.2. RAÍCES
El día anterior a la siembra las raíces fueron retiradas de la planta y lavadas
con agua potable y jabón líquido antibacterial para retirar el exceso de tierra
y otros elementos, se secó el exceso de agua. Se colocó en una funda
pequeña de plástico y se almacenó a una temperatura de 5 oC durante toda
la noche. Transcurrido este tiempo, se realizó un lavado de raíces con jabón
líquido antibacterial y agua potable durante 20 minutos para asegurar que
toda la tierra sea retirada de las raíces y quitar el exceso de jabón.
En la cámara de flujo laminar se realizó la desinfección de las raíces con
soluciones de Hipoclorito de Sodio al 0.5% y Etanol al 35% con lavados de
agua destilada estéril.
3.2.3. YEMAS APICALES, EXPLANTES DE HOJAS Y TALLOS
El material vegetal seleccionado fue almacenado a una temperatura de 5 oC
durante 9 horas. Se realizó un lavado con agua potable y detergente hasta
eliminar restos de tierra.
23
Dentro de la cámara de flujo laminar previamente desinfectada y esterilizada
se extrajo Microestacas de 1 cm de longitud con una y dos yemas axilares,
explantes de hojas y tallos de 1 cm de longitud para realizar con mayor
facilidad la desinfección. A continuación se colocó 2 gotas de Tween 80 en
la solución de Hipoclorito de Sodio al 0.5% y se lavó con abundante agua
destilada estéril, dejando que repose por 2 minutos.
Por último el material fue expuesto a la solución de Etanol al 35% y lavado
posteriormente con agua destilada estéril.
3.3. ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS
Se preparó un medio de cultivo M&S (Murashige y Skoog, 1962) con
macronutrientes, micronutrientes y sales de hierro, fue suplementado con
azúcar y Agar. Se utilizaron diferentes concentraciones de los compuestos
ya mencionados y de la hormona 2-4D, como se puede observar en la Tabla
8.
24
Tabla 8. Medios de Cultivos evaluados, Medio Murashige y Skoog
El pH fue llevado entre 5-6 utilizando Hidróxido de Sodio 1N antes de ser
autoclavado el medio de cultivo. Se trabajó con diferentes concentraciones
de agar para obtener medios sólidos y semisólidos. Se dispensó en frascos
esterilizados y placas petri para semillas, explantes, yemas axilares y tallos,
para las raíces se colocó en tubos de ensayo de 20 ml.
Una vez desinfectadas las raíces, fueron secadas en hojas de papel bond
esterilizadas, se cortó fragmentos de 1.5 cm de longitud y se las plantó en
tubos de ensayos con medio Murashige y Skoog sólido T0, T1, T2 y T3.
Las yemas axilares fueron de igual manera secadas y se realizó un pequeño
corte en la parte inferior de la microestaca, se las colocó de forma vertical en
placas petri en medio M&S T0.
Para la obtención de callos se utilizó explantes de hojas y tallos. Después
del tratamiento de desinfección se seleccionó las hojas en mejores
condiciones y las más verdes, se las seccionó en pequeños cuadrados de 2
cm de longitud, retirando los bordes al igual que la parte interna de la hoja
para obtener una buena calidad de explantes.
Tratamiento
Murashige
y Skoog
(1L)
Agar
(g)
Azúcar
(g)
2-4D
(g)
Macronutriente
(ml)
Micronutriente
(ml)
Sales
de
Hierro
(ml)
T0 10 0 20
T1 10 0.5 20
T2 8 1 20
T3 10 1.5 20
25
A los tallos se les retiró la membrana superior de la corteza y se les cortó en
la parte inferior para colocar la zona de cicatrización en contacto con el
medio de cultivo y así la absorción de nutrientes sea más eficiente.
Los explantes y los tallos fueron colocados en placas petri con un medio
Murashige y Skoog T1, T2, T3 y almacenados en condiciones de oscuridad a
temperatura ambiente.
Como último procedimiento para potenciar las características de la auxina
(2-4D), se diluyó en agua destilada estéril y fue dispensada en los diferentes
tratamientos T1, T2 y T3 previamente autoclavados y se sembró de igual
manera explantes y tallos.
Todas las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente de acuerdo a
sus requerimientos como se expresa en la Tabla 9.
Cada cinco días se observaba que no exista ninguna contaminación
endógena en el medio o en los explantes además se detectaba si había la
presencia de callo en los alrededores del material vegetal cultivado.
26
Tabla 9. Condiciones de incubación de los explantes sembrados
Tratamiento
Murashige y Skoog
Explante Horas Luz Horas oscuridad
T0
Sin hormona
Semillas 16 8
Raíces 16 8
Yemas axilares 16 8
T1
O.5 g/L
Semillas 16 8
Raíces 16 8
Hojas 0 24
Tallos 0 24
T2
1 g/L
Semillas 16 8
Raíces 16 8
Hojas 0 24
Tallos 0 24
T3
1.5 g/L
Semillas 16 8
Raíces 16 8
Hojas 0 24
Tallos 0 24
Es importante recalcar que durante el período de luz a lo largo del día, la
temperatura en el interior de los frascos y placas de cultivo es de 1-2 °C
superior a la de la cámara, debido al efecto invernadero (Marín, 1993).
La humedad se mantiene alrededor del 70% en las condiciones en las que
se realizan habitualmente los cultivos, aunque varía con la temperatura de la
cámara y el tipo de cierre de las placas y frascos.
4. ANÁLISIS DE RESULTADOS
27
4. ANÁLISIS DE RESULTADOS
4.1. FORMULACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO MÍNIMO
lalalPARA LA OBTENCIÓN DE CALLO
En este trabajo de investigación se buscó la obtención de callos a partir de
diferentes tejidos de mora de castilla (Rubus glacus) y optimizar al máximo
los materiales y reactivos necesarios, basándose en los trabajos realizados
por Alulema (2013) y Paucar (2011), donde también se utilizó diferentes
concentraciones de hormona 2-4D pero con la adición de otros
bioreguladores y sustancias orgánicas.
Para la obtención de callos en mora de castilla se ha trabajado con diversos
bioreguladores, dependiendo de los objetivos que se desea alcanzar, como
se indican en la Tabla 10.
Tabla 10. Eficacia de bioreguladores en diferentes investigaciones
Bioregulador Explante Trabajo de investigación
Auxina 2-4D Hojas y tallos Espinoza et al,.2010
AIA Tallos y raíces Pérez et al,.2012
BAP y AIA Hojas Alulema, 2013
AIA, BAP, TDZ, ANA IBA Hojas Paucar, 2011
Auxina 2-4D Hojas, tallos, raíces y yemas
axilares
Vásquez, 2014
Adicionalmente al uso de hormonas en los trabajos mencionados se utilizó
Macro y micro nutriente, agar, azúcar o sacarosa, al igual que se añadió
28
vitaminas y compuestos orgánicos para estimular el crecimiento vegetal los
cuales no fueron introducidos en este proyecto.
En la presente investigación se obtuvo callos partiendo de tallos a los quince
días como lo muestra la Figura 3 y en el caso de las hojas se manifestó un
crecimiento de callo a los quince días y a los veinte días como lo muestra la
Figura 4, obteniendo resultados similares a los encontrados por Alulema
(2013) y Paucar (2011).
Figura 3. Callos obtenidos a los quince días de siembra a partir de tallos
Figura 4. Callos obtenidos a las tres semanas de siembra a partir de hojas
29
4.1. EFICACIA DE LOS MÉTODOS DE DESINFECCIÓN
El protocolo de desinfección se basó en un inicio en el método propuesto por
Akita, Hina y Nishi (2000), sin embargo los resultados no fueron favorables
ya que se presentó contaminación de un 63% de los explantes sembrados y
también se produjo daño físico del explante (cambio de coloración, textura).
Para todos los explantes se utilizó tres diferentes métodos de desinfección
como se detalla en la Tabla 11 y se realizó lavados con agua destilada
estéril para cada tratamiento de desinfección como lo propone Paucar (2011)
para retirar todo exceso.
Se utilizó hipoclorito de sodio al 0.5% y etanol al 35%, como lo propone
Pérez et al., (2012) dentro de la cámara de flujo laminar se sumergió al
material en una solución de cloro al 0,5% con 3 ml de tween 80.
Tabla 11. Métodos de desinfección utilizados para todos los tejidos
Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Ensayo 4
Método de
desinfección
% NaClO %
Etanol
%
NaClO
%
Etanol
%
NaClO
%
Etanol
%
NaClO
%
Eta
nol
Concentración 10 45 5 45 1 35 0.5 35
Resultados Se afectó la
coloración de los
explantes.
63% de
contaminación
Cambios ligeros
en la morfología.
70% de asepsia
Cambios físicos
ligeros en los
explantes
(textura y
cambio de color)
72% de asepsia
Ningún daño
físico al
explante.
90% de
asepsia
Referencia Akita, Hina y Nishi
(2000)
Alulema (2013) Espinoza et al.,
(2010)
Espinoza
et al., 2010
30
Como se observa en la Tabla 11, utilizando el ensayo 4 donde se empleó
NaClO al 0,5% y Etanol al 35%, los explantes no mostraron ninguna lesión y
el nivel de contaminación del 10%. Estos resultados fueron similares a los
que presentaron Espinoza et al., (2010) y Alulema (2013).
Alulema (2013), indicó que el empleo de explantes de plantas cultivadas
dentro del laboratorio en condiciones semicontrolada, permite lograr grandes
cantidades de explantes libres de contaminación, durante el establecimiento
in vitro.
4.3. FASE DE ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS DE SEMILLAS,
lalalaRAÍCES Y BROTES
Se utilizaron diferentes explantes y tratamientos para cada ensayo, para la
evaluación de los resultados se asignó el valor de 1 cuando se observó
crecimiento, caso contrario cero (0) como indica la Tabla 12.
31
Tabla 12. Crecimiento de semillas, raíces y brotes in vitro de mora de castilla
Tratamiento
Murashige y
Sook
Explante #
replicas
Longitud
promedio
(cm)
Valoración Observaciones
T0
Sin
hormona
Semillas 145 0 El 10% se
contaminó
Raíces 40 _ 0 El 90% se
contaminó
T0
Sin
hormona
Yemas
axilares
55 1.5 1 Sin contaminación
Crecimiento de
pequeños brotes
T1
O.5 g/L
Semillas 95
0
Sin contaminación
Raíces 40 1 1 El 85% se
contaminó
T2
1 g/L
Semillas 95 _
0 Sin contaminación
Raíces 40 1 1 El 80% se
contaminó
T3
1.5 g/L
Semillas 95 _ 0 Sin contaminación
Raíces 40 1.5 1 80% contaminado
Para la siembra de yemas axilares no se utilizó ninguna dosificación de la
hormona 2-4D para estimular el crecimiento de brotes como lo propone
Montés y Rodríguez (2000), pese a ello se pudo evidenciar luego de 15 días
de siembra un crecimiento vegetal, al igual que los autores exponen.
32
4.1.1. SEMILLAS
4.1.1.1. Pretratamientos
Para trabajar con semillas fue necesario implementar un método que ayude
a eliminar la dormancia de las mismas, según Cunha (2005) el fenómeno de
la dormancia es común, principalmente en semillas de diferentes
procedencias incluido las de la mora de castilla que no germinan debido a
los mecanismos internos de naturaleza física o fisiológica que bloquean la
germinación.
Entre las técnicas y tratamientos más empleadas pueden citarse los
siguientes: pre-refrigeración, distintas combinaciones de temperaturas,
solución de nitrato de potasio al 0.2 %, ácido giberélico, pre-lavado y pre-
secado, ácido sulfúrico, entre otros (Farias et al., 1996); (Hernández, 2010).
No obstante en la presente investigación se utilizaron dos diferentes
tratamientos de escarificación con una combinación de temperaturas como
propone Merola y Díaz (2012). La escarificación se inició con ácido sulfúrico
al 70% por 10 minutos pero todas las semillas se lesionaron demasiado y
perdieron su viabilidad como sucedió en el ensayo presentado por Merola y
Diaz (2012).
En el segundo método se recurrió a la escarificación mediante un método
físico, se inició con un cambio fuerte de temperatura, sin embargo los
resultados no fueron los deseados a diferencia de los obtenidos por Nisa y
Qadir (1969), donde la dormancia de las semillas presentó un favorable
crecimiento y desarrollo después del tratamiento.
Las semillas utilizadas fueron extraídas directamente del fruto, pero las
semillas tienen un bajo poder germinativo y un grado de dormancia alto, lo
que no permite obtener resultados favorables de crecimiento celular o
vegetal. Según Muñoz (2010) las plántulas que logran emerger y crecer lo
hacen en forma muy lenta. Adicionalmente según Pérez (2012) la mora de
castilla se reproduce mediante la raíz primaria conjuntamente con un acodo.
33
Sin embargo el protocolo del ensayo 4 descrito anteriormente en la Tabla 11
fue seleccionado para las semillas y presentó respuestas favorables ya que
no se visualizó ningún tipo de contaminación endógena como lo muestra la
Figura 5.
Figura 5. Cultivo de semillas
4.1.2. BROTES
La utilización de brotes como explantes, al estar formadas por células
organizadas, permitió el establecimiento de cultivos con contaminación
reducida, alrededor del 90% de las placas sembradas con yemas axilares
estuvieron libres de cualquier tipo de contaminación endógena como lo
muestra la Figura 6. El uso de explantes desarrollados permite proponer un
protocolo de desinfección más sencillo.
34
Figura 6. Cultivo de yemas axilares a los 10 días
Alrededor del 40% de los explantes sembrados continuaron con su color
verde durante 15 días, posteriormente cambiaron su color a un tono pardo,
esto posiblemente se deba a que no se utilizó ningún tipo de regulador que
ayude a la estimulación de la clorofila a través de la diferenciación de
cloroplastos y en consecuencia la capacidad fotosintética (Davies, 1995).
El crecimiento vegetal se pudo observar a los quince días, como lo muestra
la Figura 7, igualando el tiempo que reporta Paucar (2011), sin embargo en
los ensayos realizados por Alulema (2013) y Paucar (2011) implica la
adición de vitaminas y dos tipos de bioreguladores para la obtención de
brotes.
Figura 7. Cultivo de yemas axilares a los 15 días
35
4.1.3. RAÍCES
Las raíces que fueron empleadas presentaron un alto grado de
contaminación (Figura 8) debido a que están en constante interacción con la
tierra, donde la contaminación por plagas y otros factores es mayor. Por esta
razón se trabajó con un protocolo de desinfección más agresivo planteado
por Espinoza et al., (2010) con hipoclorito de sodio al 1% y etanol al 35%,
pero se produjo daño al explante reduciendo su viabilidad y el grado de
contaminación fue el mismo.
Figura 8. Cultivo de raíces a los 20 días
Las raíces tuvieron un crecimiento a los 20 días, pero fue limitado. Según
Pérez (2012) para el crecimiento de la mora de castilla se necesita emplear
la raíz primaria conjuntamente con un acodo. En un medio sólido, donde la
absorción de los nutrientes es más difícil el desarrollo es restringido,
adicionalmente los medios no fueron enriquecidos con giberelinas las cuales
son hormonas que principalmente favorecen al crecimiento de la raíz (Díaz,
2010).
Espinoza et al., (2009) obtuvo raíces partiendo de tallos y hojas a diferentes
concentraciones de la auxina 2-4D y los resultados fueron visibles a los 15
días, sin embargo no se dio un crecimiento directamente usando a la raíz
como explante.
36
4.3. OBTENCIÓN DE CALLOS A PARTIR DE EXPLANTES DE
lalalHOJAS Y TALLOS
Mediante la técnica de cultivo de tejidos in vitro se puede lograr la obtención
de tejido calloso.
Los cultivos de callos son a menudo de crecimiento lento y heterogéneo,
debido fundamentalmente a la disponibilidad vectorial de los nutrientes. Son
masas celulares cuya morfología raramente provee características que
permitan la selección de líneas de interés (Warren, 1992). Según Matos
(2007) la formación del callo depende del tipo de regulador del crecimiento y
su concentración en el medio depende del genotipo y del contenido
endógeno de hormonas del explante, siendo necesario aportar, según el
caso, sólo auxinas, sólo citoquininas o ambas, en este caso se utilizó solo
una auxina para la obtención de callo partiendo de hojas y tallos.
Los resultados obtenidos a lo largo de las siembras en diferentes
tratamientos con hormona 2-4D se detallan en la Tabla 13.
37
Tabla 13. Resultados obtenidos para la obtención de callos a partir de hojas
y tallos
Tratamiento
Murashige y
Skoog
Explante # de replicas % de
resultados
positivos
Observaciones
generales
T0
Sin hormona
Tallos 15 0% Contaminación a las 2
semanas
T1
0.5 g/L
Hojas
55 0% Existió contaminación de
mohos en las hojas y
tallos a los 10 días
Proceso de fenolización
en las hojas Tallos 12 0%
T2
1 g/L
Hojas
45 0% Crecimiento de 2 callos
en 2 diferentes tallos
Sin contaminación
Proceso de fenolización
en las hojas
Tallos 35 10%
T3
1.5 g/L
Hojas 45 25% Sin contaminación
Tallos 35 30%
Los explantes crecidos en el medio basal que contenía una dosificación de 1
g/L de hormona 2-4D formaron callos de color verde oscuro y crema. Los
primeros síntomas de la presencia de células desdiferenciadas con estas
mismas características, utilizando el tratamiento T2 con 1 g/L de hormona,
se dio a los 36 días de la siembra superando el tiempo de crecimiento
propuesto por Pérez (2012), no obstante utilizando un T3 con 1.5 g/L de
hormona, se produjeron callos a los 15 días como lo muestra la Figura 9 y 10
igualando el tiempo sugerido por Alulema (2013) y Pérez (2012).
38
Figura 9. Formación de callo T2 con hormona en un medio estéril
Figura 10. Formación de callo T3 con hormona en un medio estéril
La formación de los callos en los explantes de tallos se inició en la zona en
que se hicieron los cortes, es decir, a partir del tejido de cicatrización, se
establecieron en la parte que tenían contacto con el medio.
Según propone Pérez e Iglesias (2009) la hormona 2-4D ha resultado
efectiva para la inducción de callos en diferentes tipos de explantes. Las
experiencias descritas por Pérez e Iglesias (2009), señalan que la mora de
castilla puede incluirse en el grupo de plantas que requieren un medio de
39
inducción de callo sencillo regulado con una hormona de crecimiento como
la que se utilizó.
La auxina 2-4D es una potente auxina que se usa en el cultivo in vitro para la
formación de callos y la inducción de embriones somáticos (Rivero et al.,
2008). Se ha utilizado como regulador del crecimiento para este primer
propósito en diversas especies de plantas, con buenos resultados (Silva,
2006; Medero, 2006; Paneque, 2006) en el cultivo de cacao, de yuca y de
boniato.
Los explantes de hojas presentaron un proceso de fenolización cambiando
su color verde a color café oscuro como se puede ver en la Figura 11, esto
se debió a los cortes realizados durante la preparación del explante para la
siembra y a que la concentración de fitohormonas no era la adecuada. Los
compuestos oxidados son altamente fitotóxicos lo que produce la muerte del
explante (Muralanda, 2001).
Figura 11. Fenolización en explantes de hojas
La aparición de callos se obtuvo con la dosis de la auxina 2-4D más alta y
utilizando el tratamiento T3 como recomienda Alulema (2013), la formación
de las células diferenciadas se las pudo ver a los quince días en las
nervaduras de la hoja donde se le realizó un pequeño corte como se observa
en la Figura 12 y a las tres semanas en los alrededores de la hoja como lo
expone la Figura 13.
40
Figura 12. Formación de callos a los alrededores en hojas a las tres
semanas
Figura 13. Formación de callo en explantes de hoja
Alulema (2013) señala que obtuvo callos partiendo de hojas de plantas
cultivadas in vitro para disminuir el grado de contaminación, obteniendo
resultados a los quince días de la siembra.
González, Morejón y Portilla (2007) plantearon que las diferencias en la
respuesta al cultivo in vitro, al emplear diferentes tipos de explantes, pueden
deberse a variaciones en el contenido endógeno de las hormonas y a sus
características anatómicas.
El uso de bioreguladores representa uno de los costos más alto de los
materiales para la investigación del cultivo in vitro, lo que no permite que sea
41
tan viable continuar con otros temas de interés y poder obtener productos
derivados como fragancias, colorantes y plantas de invernadero.
La potenciación de las hormonas de crecimiento que se utilicen para la
siembra es vital para la parte económica, se debe definir el tipo de hormona
que se necesita según los requerimientos y material vegetal que vaya a ser
sembrado, ya que el empleo de más sustancias orgánicas implica mayor
gasto económico.
4.4. ANÁLISIS ECONÓMICO
La práctica de cultivo in vitro demanda el uso de diversas sustancias
orgánicas para la estimulación del crecimiento vegetal haciendo que los
resultados se den en un tiempo mínimo y con un alto rendimiento, sin
embargo se puede obtener los mismos efectos como se muestra en este
trabajo sin que sea necesaria la utilización de varias hormonas y de
vitaminas, reduciendo los costos para la obtención de callo.
En la Tabla 14 se determinan los costos fijos y la depreciación de los
equipos y materiales para la obtención de callo a partir del cultivo in vitro de
explantes (tallo y hoja) de mora de castilla sin espinas con un bioregulador
(2.4-D) en un medio básico de cultivo Murashige y Skoog.
42
Tabla 14. Costos fijos y depreciación de equipos y materiales empleados
lalalalapara la realización de cultivo in vitro de mora de castilla sin espinas
Descripción Cantidad Costo unitario
(USD)
Depreciación
(USD)
Planta de mora de castilla sin
espinas
8 2.25 -
Alcohol potable 1 galón 5.50 -
Hipoclorito de sodio 1 galón 7.60 -
Agar Agar Biomark 500 gramos 115 -
Medio de cultivo M&S 10 litros 78 -
Acido 2,4 Diclorofenoxiacetico 500 gramos 114 -
Pinzas Anatómicas 20cm 1 unidad 22 0.36
Cámara de flujo laminar 1 unidad 4896.33 81.60
Autoclave 1 unidad 2354.15 39.2
Placas petri desechables 10 unidades 4.10 -
Mano de obra 2 personas 340 -
Agua destilada 1 litro 2.25 -
43
En la Tabla 15 se exponen los costos totales necesarios para obtener 120
placas petri al día por trabajador cada una con medio Murashige y Skoog y
con 5 explantes, suponiendo que en cada placa se utiliza alrededor de 18 a
20 ml de medio de cultivo.
Tabla 15. Costos totales para la obtención de 240 placas petri por día para 2
trabajadores al día con 5 explantes cada una de mora de castilla sin espinas
Descripción Cantidad Costo total
(USD)
Planta de mora de castilla sin
espinas
20 50
Alcohol potable 1 litro 2.75
Hipoclorito de sodio 1 litro 3.80
Agar Agar Biomark 1100 gramos 253
Medio de cultivo M&S 90 litros 450
Acido 2.4 Diclorofenoxiacetico 20 gramos 4.56
Mango de Bisturí 2 7.80
Pinzas Anatómicas 15 cm 2 36
Pinzas Anatómicas 20 cm 2 44
Cernidora de 20 cm 4 9.2
Placas petri desechables 240 196.8
Mano de obra 2 34
Agua destilada 240 litros 540
Electricidad 80 horas 20
TOTAL $ 1651.91
44
El costo directo más alto implica la mano de obra ya que se está
contratando dos trabajadores para la realización de los cultivos, sin embargo
es importante mencionar que no se tiene suplementos como vitaminas u otro
tipo de bioregulador para complementar el medio de cultivo.
Al costo total obtenido de la Tabla 15 se debe restar la depreciación de los
equipos y materiales, dado esto el costo real total sería de $1651 diarios
para realizar un cultivo de mora de castilla sin espinas, para 240 placas petri
con medio M&S cada una con 5 explantes.
Los costos expresados exponen la vialidad del cultivo in vitro de la mora de
castilla utilizando un solo bioregulador de crecimiento, tomando en cuenta un
margen de contaminación o no crecimiento del 10%, se puede obtener
alrededor de 1000 explantes positivos al día por dos trabajadores, los cuales
pueden ser destinados para diversas investigaciones o llevar a la adaptación
de plantas de invernadero.
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
45
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1. CONCLUSIONES
El uso de hipoclorito de sodio al 0.5% y etanol al 35% para la
desinfección demostró ser el método más adecuado para todos los
tejidos utilizados (semillas, hojas, tallos y microestacas) ya que no
presentó ningún daño físico y la contaminación fue de un 10% en total
superando los otros ensayos utilizados.
En siembra de semillas no se presentó ningún tipo de crecimiento debido
a que tienen un bajo poder germinativo y un grado de dormancia alto. Sin
embargo la utilización de tallos pequeños para la siembra permitió
obtener la formación de callos más rápida y con mejor rendimiento.
El cultivo in vitro de tejidos de mora de castilla sin espina en un medio
semisólido presentó una mayor contaminación que la siembra en un
medio sólido.
En medios de cultivo con dosificaciones de 1.5 g/L de la auxina 2-4D se
observó crecimiento de callo a los quince días en hojas y tallos.
El empleo de concentraciones de la auxina 2.4-D en el medio de cultivo,
iguales o mayores a 1 g/L, propició la formación de callos en explantes
de hojas y tallos en el cultivo de la mora de castilla sin espinas, y se
obtuvieron callos de 0.5 cm y 1 cm de longitud a medida que se
incrementó la concentración de la hormona. La concentración más alta
de la hormona de crecimiento utilizada fue de 1.5 g/L con la cual se pudo
obtener callos en las nervaduras y en los alrededores de las hojas.
46
Desde el punto de vista económico, el uso de la auxina 2-4D para la
obtención de callos a partir de diferentes tejidos presenta la mejor
opción en costo beneficio, ya que maximizando las características del
regulador de crecimiento se puede obtener callos sin la necesidad de
otros tipos de bioreguladores u hormonas, lo que potencia las
posteriores investigaciones.
5.2. RECOMENDACIONES
Realizar un estudio para mora de castilla sin espinas, combinando las
dosificaciones de 2-4D determinadas en este estudio, con otros
bioreguladores de crecimiento, ya que se han reportado trabajos con
resultados beneficiosos en el crecimiento de raíces y callos en otras
frutas al combinar estos tratamientos.
Estudiar más detalladamente el efecto de la dormancia de las semillas de
la mora de castilla sin espinas, ya que este efecto juega un papel
fundamental si se requiere obtener plantas cultivadas in vitro.
Realizar un estudio de cultivo celular para la obtención de metabolitos
secundarios y la identificación de pigmentos.
Realizar ensayos a mayor escala definiendo cortes y tamaños de los
diferentes explantes utilizados en el presente estudio.
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ANEXOS
55
ANEXO 1
COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL MEDIO M&S