TRABAJO PRACTICO N 2

CONTRACCION MUSCULAR

• EL MUSCULO COMO EL TEJIDO DE

MAYOR CONSUMO ENERGETICO

DEL ORGANISMO

• ESTUDIO DEL SISTEMA DE

CONTRACCION DE LAS FIBRAS

MUSCULARES

OBJETIVO PRINCIPAL • Examinar la estructura de la fibra muscular y estudiar el requerimiento

químico necesario para la contracción muscular, en términos de fuentes de

ENERGIA ORGANICA e IONES INORGANICOS

MICROANATOMIA DELMUSCULO ESTRIADO

MIOFIBRILLA

FILAMENTOS GRUESOS DE MIOSINA FILAMENTOS FINOS DE ACTINA

MIOFILAMENTOS

RELACION ENTRE FILAMENTOS

FINOS Y GRUESOS

UNIDAD FUNCIONAL: EL SARCOMERO

CICLO DE CONTRACCION MUSCULAR

Ciclo de contracción animado

DISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGIA

1) DISECCION DE MUSCULO ESTRIADO (ESQUELETICO): MUSCULO FLEXOR PSOAS MAYOR DE

CONEJO.

PREPARACIONES PREVIAS AL TP

2) INCUBACION EN 50% (V/V) DE GLICEROL / H2O A 0ºC DURANTE 24 HORAS.

3) EL MUSCULO SE TRANSFIERE A UNA SOLUCION (5 mM EDTA; 5 mM EGTA; 1 mM DTT) CON

AGENTES QUELANTES DE LOS IONES CALCIO Y MAGNESIO, OVERNIGHT, REALIZANDO DURANTE ESE LAPSO

VARIOS LAVADOS Y REEMPLAZO DE LA SOLUCION PARA ELIMINAR LOS IONES.

4) HOMOGENEIZACION DEL TEJIDO Y OBTENCION DE PEQUEÑOS FRAGMENTOS DE FIBRAS MUSCULARES.

DESARROLLO DEL TP

5) CADA GRUPO DE ALUMNOS RECIBIRA UN TUBO EPPENDORF CON TEJIDO MUSCULAR

DISGREGADO.

6) MONTAJE DE TEJIDO Y OBSERVACION AL MICROSCOPIO DE LA ESTRUCTURA MUSCULAR.

IDENTIFICACION DE LA UNIDAD FUNCIONAL, EL SARCOMERO. ESQUEMA Y DESCRIPCION DE LOS

COMPONENTES, OBSERVANDO DESDE EL OBJETIVO 10X HASTA 100X (ACEITE DE INMERSION)

7) ESTIMACION DEL LARGO DE UN SARCOMERO (en m)

EN 5 MIOFIBRILLAS DISTINTAS MEDIR UN CONJUNTO DE 5 SARCOMEROS

CONSECUTIVOS (OBJETIVO 100X). LAS MEDICIONES SE REALIZARAN EN

MICROSCOPIOS CON CAMARA CLARA MEDIANTE EL USO DE TRES REGLETAS

PREVIAMENTE CALIBRADAS.

2 m

4 m

8 m

10) PARA LAS SOLUCIONES III a VI ANALIZAR EL PROCESO DE CONTRACCION Y DETERMINAR

SI SE MODIFICA EL LARGO DE UN SARCOMERO (en m), ESTIMADO PREVIAMENTE EN EL TEJIDO CONTROL.

MEDIR NUEVAMENTE 5 SARCOMEROS CONSECUTIVOS EN AL MENOS 3 MIOFIBRILLAS DIFERENTES

UTILIZANDO LAS REGLETAS. ESQUEMATIZAR CADA CASO Y COMPARAR CON EL CONTROL.

MEDIR LOS SARCOMEROS EN OBJETIVO 100X

8) ROTULAR TODOS LOS PORTAOBJETOS. COLOCAR EN UN PORTAOBJETO UNA GOTA DE HOMOGENATO Y AGREGAR A UN COSTADO UNA O DOS GOTAS DE LA SOLUCION A TESTEAR (VER TABLA). UTILIZAR DIFERENTES PIPETAS PASTEUR PARA EL HOMOGENATO Y PARA CADA SOLUCION. MONTAR EL CUBREOBJETO, VERIFICAR QUE LA SOLUCION BAÑA EL TEJIDO, OBSERVAR EN OBJETIVO 40X

EFECTO DE DIFERENTES SOLUCIONES DE PERFUSIONEFECTO DE DIFERENTES SOLUCIONES DE PERFUSION

SnPHo

9) PARA LAS SOLUCIONES I y II, OBSERVAR EN OBJETIVO 40X Y DETERMINAR QUE OCURRE

CON LA ESTRUCTURA DEL SARCOMERO DESCRIPTA INICIALMENTE (VER FIGURA 2 EN LA GUIA) .

NO HAY QUE MEDIR LOS SARCOMEROS

INCORPORAR TODOS LOS DATOS A LA TABLA DE RESULTADOS

Longitud promedio del sarcómero

Grupos Control Sol III Sol IV Sol V Sol VI

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Media ± DS

Solución de perfusión Componentes Efecto de la Solución / grado de contracción

I

II

III

IV

V

VI

INFORME a) Calcular el largo medio de un sarcómero en estado relajado (control) y esquematizar. b) Determinar, en base a lo observado, cual es el efecto de las soluciones I y II sobre la estructura del sarcómero. Esquematizar los efectos de ambas soluciones, comparando con esquemas de miofibrillas control, en estado relajado. Indicar, de ser posible, que tipo de filamento (fino o grueso) es afectado por cada solución.c) Analizar el efecto de cada una de las soluciones III a VI sobre la contracción de las miofibrillas. Determinar el largo promedio de un sarcómero para cada solución de perfusión, indicando el efecto más probable de cada una de ellas sobre la contracción de la miofibrilla. Puede clasificar el grado de contracción muscular como: ninguno, leve, moderado o fuerte, siempre comparando con el estado relajado del portaobjeto control, que se tomará como referencia. Analizar estadísticamente los datos de todo el turno. Graficar los datos obtenidos (largo del sarcómero en función de las soluciones utilizadas). A partir de este análisis, proponga la composición más probable de cada una de las soluciones de

perfusión III a VI (en este punto recuerde el objetivo del práctico)

Contracción Muscular en Psoas Mayor de Conejo