trabajo en condiciones de estereabilidad

Trabajo en condiciones de esterilidad

¿Cúando se ha de utilizar la técnica de esterilidad?

• Siempre que se trabaja con organismos vivos o con cualquier medio, tampón o contenedor que se usa para organismos vivos.

• Preparación de cultivos bacterianos para transformación• Preparación de placas para cultivos de levaduras• Filtración de suero para medios de cultivo• Apertura de un tubo que contiene bacterias liofilizadas

¿Cúando es conveniente utilizar la técnica de esterilidad?

• Siempre que no queremos que los contenidos de un área entren en otro.

• Preparación de digestiones con enzimas de restricción• Preparación de reacciones de PCR• Marcaje de células con 32P

Fuentes de contaminaciónAire

Superficie de trabajo

Agua 100 bacterias/mLProtozoos

ManipuladorCuero cabelludo 1.5 x 106/cm2

Secreción nasal 106-107/mLEstornudo 107/mLSaliva 106-108/mLManos 2x103/cm2

Sentado 100.000Sentado moviéndose 1.000.000Sentarse 2.500.000

Cinética de destrucción: condiciones que la afectan

• Concentración del agente• Tiempo de exposición• pH del medio• Temperatura• Presencia de materiales

extraños• Resistencia propia del

microorganismo• Número inicial de la

población

Técnicas de esterilización

• Agentes físicos* Calor seco* Calor húmedo* Filtración* Radiaciones

• Agentes químicos

Esterilización por calor seco

•Provoca desnaturalización de proteínas y oxidación

•Mediante flambeado, incineración o, más habitualmente en el laboratorio, horno Pasteur o Poupinell

Condiciones de esterilización por calor seco

160ºC 180 minutos170ºC 90 (metálico) – 120 minutos180ºC 30 minutos

Esterilización por calor húmedo

Determina la desnaturalización del

DNA, la generación de cortes de cadena

sencilla en el mismo, la alteración de la

integridad funcional de la membrana y la

activación de ribonucleasas que destruyen rRNAs.

Esterilización por calor húmedo•Pasteurización:

< 100ºC(65º 30’ o 72º 15’)

•Tindalización y ebullición100ºC

•Autoclavado>120ºC

(121º 20’)

Condiciones de esterilización por calor húmedo

TEMPERATURA (C°) TIEMPO DE EXPOSICION

MINIMO (minutos) 121 20

126 10

134 7

El papel de la presión en la esterilización por calor húmedo

Presión relativa por encima de la

atmosférica (bar)

Temperatura de vaporización del

agua0 99,63

0.5 111,71 * 120,23 *2 ** 133,54 **3 143,624 151,84

Comparación entre las condiciones de esterilización por calor seco y

húmedo

Calor seco Calor húmedo

150-160ºC>3h

121ºC15-30 min

160-170ºC2-3h

132ºC3-5 min

170-180ºC1-2h

140ºC1-2 min

Modificaciones químicas en los medios de cultivo durante el autoclavado

• destrucción de algunos aminoácidos• caramelización de azúcares• hidrólisis de la sacarosa• variación del pH• precipitación de sales de Mg, K, amonio, fosfato• desnaturalización de proteínas• inactivación de vitaminas

Comparación entre las condiciones de esterilización por calor seco y

húmedo

Esterilización por métodos mecanicos: filtración

Filtros de ésteres de celulosa de 0.22 μm de poro

Esterilización por radiaciones

•IonizantesUso rutinario en

laboratorios para material desechable

•UltravioletaDaños en el DNA que

afectan su capacidad de replicación

Se aplican mediante lámparas de mercurio

Esterilización, desinfección y asepsia mediante productos químicos

Esterilización

• Proceso mediante el cual se alcanza la muerte de todas las formas de vida microbianas, incluyendo bacterias y sus formas esporuladas altamente resistentes, hongos y sus esporas y virus.

• Se entiende por muerte la pérdida irreversible de la capacidad reproductiva del microorganismo.

Desinfección

• Proceso mediante el cual se eliminan los agentes patógenos reconocidos, pero no necesariamente todas las formas de vida microbianas. Solamente se aplica a objetos inanimados.

Antisepsia

• Proceso que, por su baja toxicidad, se utiliza para la destrucción de microorganismos presentes sobre la superficie cutáneo-mucosa. Como la desinfección, tampoco implica la destrucción de todas las formas de vida.

Desinfectantes y antisépticos

De alto nivel:

• Actúan incluso sobre esporas bacterianas y por tanto con un tiempo adecuado de exposición permiten una esterilización química

• Modifican (p.e. alquilación) de forma irreversible grupos de proteínas y ácidos nucleicos, inhibiendo actividades enzimáticas

• Son desinfectantes estrictos y no pueden utilizarse como antisépticos

• Óxido de etileno (gas)• Formaldehído 8% en alcohol 70%, al 37% p en forma de gas• Glutaraldehído al 2%• Peróxido de hidrógeno en soluciones al 10%


De mediano nivel:

• No actúan sobre esporas pero sí sobre M. tuberculosis, hongos y virus no lipídicos

• La mayoría se pueden utilizar como desinfectantes y antisépticos

• Oxidantes que actúan a nivel de proteínas y ácidos nucleicos:Compuestos clorados: hipoclorito de sodioCompuestos yodados: betadine• Compuestos que lesionan la membrana plasmáticaCompuestos fenólicosAlcoholes: etanol al 70%JabonesClorohexidina


De bajo nivel:

• No actúan sobre esporas ni sobre Micobacterium, hongos o virus no lipídicos

• Se utilizan sólo para limpieza doméstica. Están en desuso en hospitales y laboratorios

• Compuestos de amonio cuaternario: agentes catiónicos que actúan a nivel de membrana: cloruro de benzalconio

• Compuestos mercuriales: bacteriostáticos (bactericidas sólo a concentraciones muy elevadas): mercuriocromo

¿Qué normas se han de seguir para trabajar con material estéril?

1. El área de trabajo ha de estar alejado de corrientes y tráfico

2. El área de trabajo se ha de limpiar antes de utilizarla y al acabar con un antiséptico (etanol 70%). Se debe mantener limpio y sin elementos innecesarios.

3. Todas las pipetas y botellas han de ser estériles

4. Se ha de organizar el área de trabajo para minimizar los movimientos

5. Todo lo que se necesite debe tenerse preparado previamente para no tener que abandonar el área de trabajo

6. Resulta conveniente llevar guantes y cambiarlos a menudo


7. Para transferir líquidos es conveniente utilizar pipetas

8. Las botellas se deben abrir formando un ángulo aproximado de 45º y deben taparse lo antes posible evitando dejar el tapón

9. Botellas y pipetas de vidrio se han de flamear

10. Se ha de pipetear de forma suave y se deben evitar remolinos con los líquidos de las botellas

11. Para esterilizar por filtración se ha de mantener el filtro cerrado por la parte inferior hasta que esté situada la jeringuilla en la parte superior y esté listo el recipiente estéril de recogida

12. Se tirará cualquier pipeta que haya tocado una botella o superficie y no se reutilizarán pipetas.

Cabinas de seguridad de flujo laminar

Horizontal Vertical

Están diseñadas para proporcionar protección personal,ambiental y del producto (esterilización) cuando se realizan prácticas

y procedimientos adecuados.

Cabinas de seguridad de flujo laminar

Cabina de seguridad de clase ICabina ventilada para

protección personal con entrada de aire desde el

operador. El aire descargado al exterior atraviesa un filtro de partículas de elevada

eficacia para proteger el ambiente de las

descargas de agentes patógenos. Es adecuada

para trabajar con agentes de riesgo

moderado, cuando se necesita contención pero NO para la protección de

productos (esterilización).

Cabina de seguridad de clase II

Cabina ventilada para la protección del personal,

el producto y el ambiente. Dispone de

filtros de partículas de elevada eficacia a la entrada y salida. Se

utilizan con agentes que producen riesgos desde bajos a moderados,

cantidades muy pequeñas de sustancias químicas tóxicas y cantidades traza de sustancias

radiactivas.

Cabina de seguridad de clase III

Cabina de seguridad de clase IIICabina totalmente

cerrada, a prueba de fugas de gas, y

mantenida a una presión inferior a la atmosférica

(1cm de columna de agua). Posee un filtro de

partículas de elevada eficacia a la entrada de gases y dos, en serie, a la salida. El acceso a su

interior se realiza mediante el uso de guantes de caucho

sujetos a la cabina.

Selección del tipo de cabina de seguridad biológica


Clase I

Agentes biológicos de los grupos :GRUPO 1: Agentes biológicos que tienen escasísimas probabilidades de

causar enfermedades en el ser humano. No producen infecciones y tienen pocas probabilidades de propagarse en la colectividad.

GRUPO 2: Agentes biológicos que pueden ser causa de enfermedadeshumanas y que podrían constituir un peligro para los trabajadores. Rara

vez producen infecciones. Es poco probable que se propaguen en la colectividad y se suele disponer de profilaxis o tratamientos efectivos.

Otros compuestos:Pueden ser usadas para aquellas operaciones que impliquen la manipulación de compuestos químicos tóxicos y/o cancerígenos

modificando el sistema de tratamiento del aire expulsado. Siempre teniendo en cuenta que muchas de las operaciones con estos compuestos

precisan ser realizadas en un ambiente estéril y que este tipo de cabinas no lo proporcionan puesto que el aire es tomado del ambiente de

trabajo y no recibe ningún tratamiento.


Clase II

Agentes biológicos pertenecientes a los grupos 1 y 2; algunos autores incluyen los agentes pertenecientes al grupo :

GRUPO 3: Agentes biológicos que pueden ser causa de enfermedades humanas graves y que representan un serio peligro para los trabajadores. Puede existir el riesgo de que se propaguen en la colectividad, pero se

suele disponer de profilaxis y tratamientos efectivos.

Otros compuestosPueden ser utilizadas para la manipulación de compuestos químicos de alta toxicidad siempre y cuando se modifique el sistema de tratamiento del aire

expulsadoDiversos autores desaconsejan su uso en operaciones con compuestos

inflamables y/o explosivos si el porcentaje de aire recirculado es elevado (70%).


Clase III

Agentes biológicos pertenecientes a los grupos 3 y 4:GRUPO 4: Agentes biológicos que son causa de enfermedades humanas graves y que constituyen un serio peligro para los trabajadores. Puede existir el riesgo de que se propague en la colectividad y no se suele

disponer de profilaxis o tratamientos efectivos.

Otros compuestosEste tipo de cabinas puede ser utilizado para la manipulación de

compuestos químicos tóxicos y/o cancerígenos, siempre y cuando se modifique el sistema de tratamiento del aire expulsado.

Uso de las campanas de flujo laminar

1. Se ha de verificar que la campana está encendida y que el aire está circulando

2. Se ha de evitar bloquear el flujo de aire colocando material

3. Antes de su uso se ha de limpiar con etanol 70%

4. Es conveniente minimizar los movimientos dentro y fuera de la campana


5. No se debe utilizar la llama

6. Si tienen dispositivos de luz UV, se ha de comprobar que están apagados antes de empezar a trabajar

7. Al acabar de trabajar se ha de sacar todo el material utilizado y se ha de limpiar la campana

8. Es fundamental el mantenimiento con cambios regulares de filtrol y prefiltros así como descontaminaciones con formaldehído

Clasificado y selección del método de

esterilización

Materiales Calor húmedo

Calor seco

EtO Flash

Material textil(gasas, ropa, vendas etc.)

R No N N

Material plástico R - 1 –8

No 0 – 3 N

Material de goma R N 0 – 3 N

Instrumental de acero inox.

R 0 – 2 0 – 4 0 –7

Instrumental cromado y niquelado

N R 0 – 5 N

Material de vidrio R R 0 – 6 0 –7

Talco N R N N

Vaselina / aceites N R N N

Instrumental óptico R – 8 N 0 – 8 N

Prótesis / marcapasos / implantes

R – 8 N 0 – 8 N

Contenidos acuosos R N N N

Cepillos para cirugía R N 0 – 9 N

R = recomendado 1: solo si resiste la temperatura del calor húmedo2: solo cuando no se dispone de autoclave a vapor3: solo se deteriora con la acción del calor húmedo4: solo para instrumental muy delicado de microcirugía5: solo cuando no se dispone de estufas6: solo cuando este tipo de materiales pertenece a un conjunto que debe esterilizarse con EtO7: solo en casos de urgencia y bajo normas8: solo cuando lo recomienda el fabricante9: solo cuando contienen plástico o son de este material

Material Condiciones

Ropa No comprimida. En los equipos de ropa se colocará arriba lo que se usa primero. Armar con doblado quirúrgico, no sobrecargar. Tamaño máximo 30 x 30 x 50 – peso máximo 5 Kg

Tubuladuras: de plástico termosensible

Tamaños mayores a 45 cm: disponer en forma de espiral

Tubuladuras de goma Tamaños mayores a 45 cm: disponer en forma de espiral, pero humedecer previamente su lumen con agua destilada recientemente esterilizada (no humedecer para óxido de etileno)

Jeringas de vidrio Separados camisa y émbolo (para calor húmedo y EtO) Optativo: ensamblada, si se esteriliza con calor seco, pero cuidar los tiempos de calentamiento del material

Talco En pequeños sobres de 1 ó 2 gramos, en capa fina

Vaselina En potes de vidrio con tapa hermética, cantidad máxima: 30 grs

Aceites En frascos de vidrio neutro con tapa hermética, cantidad máxima 30 grs

Tubo de ensayo Cuando se esteriliza con calor húmedo: con tapón de gasa y capuchón de papel u otro tapón que permita la penetración del vapor. Si se utiliza algodón recubrir con gasa Cuando se usa calor seco: con una tapa hermética y resistente al calor

Gasas Para cirugía: el plegado debe realizarse manteniendo los bordes hacia adentro, sin dejar hilachas ni pelusas. Diseñar las medidas necesarias. Confeccionarlas con gasa hidrófila según F. A. 6ta. Edición

Apósitos Confeccionarlos con gasa y algodón hidrófilos, según F. A. 6ta. Edición. Sin dejar pelusas ni hilachas

Contenidos acuosos Cargar sólo el 70% de la capacidad del envase. Con tapa hermética y capuchón de papel

Caja con instrumental 1. POR CALOR SECO: no sobrecargar. Ordenar internamente por tiempos quirúrgicos. El tamaño de la caja no debe exceder 10 x 10 x 30, y el peso no mayor a 8 Kg. Cuidar los tiempos de precalentamiento 2. POR CALOR HUMEDO: pinzas e instrumental abiertos o cerrados en el primer punto de la cremallera.

Clasificadoy

selección del

método de

esterilización

Envoltorio Calor húmedo Calor seco

EtO Flas

Bolsas (pouche) doble faz – papel grado médico / poliester / polipropileno

R N R -

Cajas o envases metálicos con tapa hermética

N R N -

Cajas organizadoras metálicas con filtro R N R R

Cajas organizadoras plásticas con filtro R – 1 N R R - 1

Film de polietileno grado médico N N R-

Frascos y tubos con tapón de gasa y/o papel

R N N -

Muselina: 140 hebras/pulg. ó 55 hilos/cm2 R N N -

Papel grado médico R R R -

Poliamida N R N -

Clasificado y selección del método de esterilización

¿Cómo se puede detectar contaminación?

* MACROSCÓPICAMENTE

TurbidezCambio de colorOlor

* MICROSCÓPICAMENTELevaduras Objetivo 10XBacterias Objetivo 40X

* SIEMBRA DE UNA PARTE DEL CULTIVO EN PLACAS CON MEDIO RICO

trabajo en condiciones de estereabilidad

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