I.- TITULO:

CARACTERIZACIÓN Y EVALUACIÓN NUTRICIONAL DE DOS TIPOS DE

HARINA DE PEPA DE PACAE (Inga edulis Mart).

II.- PLANTEAMIENTO Y JUSTIFICACION DEL TEMA

2.1.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA:

2.1.2 DESCUBRIMIENTO DEL PROBLEMA:

Las semillas del pacae se utilizan como alimento animal en nuestra

amazonía, esto nos conlleva a pensar que contienen alto contenido

proteico que puede ser aprovechado satisfactoriamente previa

transformación en alimentación humana para salvaguardar los altos

índices de desnutrición de algunas zonas de nuestra región.(1)

2.1.2 HECHOS:

Los altos índices de desnutrición de algunas zonas de nuestra región

nos motiva a encontrar alternativas alimenticias de productos de la zona

que contengan un alto valor nutritivo que ayude a disminuir estos índices y

crear bienestar corporal que nos conlleve a un desarrollo como región.

2.1.3Planteamiento del problema

¿Cual de las dos variedades de pacae preponderantes en la selva central

de nuestra región nos permite obtener harinas con mayor contenido

nutricional, alto poder de digestibilidad y funcionalidad?

2.2.- JUSTIFICACIÓN

La semilla del Pacae posee propiedades nutritivas como el alto contenido

de calcio, fósforo y proteínas con alto grado de digestibilidad .Por ende

previos análisis se pueden aprovechar dichos nutrientes mediante la

elaboración de harinas que puedan ser utilizada como reforzamiento de

alimentos como papillas y mezclas tradicionales para elaboración de

productos que combatan el grado de desnutrición de nuestra región.(3)

1

III.- OBJETIVOS

3.1 General:

Evaluar las dos variedades de pacae que nos permitan obtener harinas con

mayor contenido nutricional, alto poder de digestibilidad y funcionalidad.

3.2 Específicos:

Caracterización fisicoquímica de las pepas del pacae (Humedad, ceniza,

Extracto seco, Proteína bruta, fibra bruta, extracto no nitrogenado).

Elaboración de las curvas de secado para las pepas del pacae.

Realización de pruebas fitoquímicas en las pepas deshidratadas (Saponinas,

fenoles, esteroides).

Evaluación cromatográfica para la cuantificación de aminoácidos en las

harinas.

Caracterización biológica de las proteínas en las harinas (PER, NPU).

IV.- MARCO TEORICO

4.1. El Pacae: Es un árbol pequeño de 8-3 m. de altura; fuste de 15-40 cm, muy

ramificado, casi desde la base y corteza externa lisa de color pardo grisáceo. Hojas

compuestas, alternas, paripinnadas, con estípulos decíduas y ráquis alado pardo

tometoso.. El fruto es una vaina cilíndrica indehiscente, con surcos longitudinales

múltiples, de 40-120 cm. de largo y 3,5- 3,7 cm. de diámetro, verde oscuro pardo-

tomentoso. Semillas en número de 10-20 por fruto, oblongas, negro a negro violáceo y

cubiertas por un arilo blanco, algodonoso y dulce. El arilo de la semilla de los frutos

maduros es comestible; es pulposo, suculento y dulce. Se consume directamente al

estado fresco. Se utiliza también en la preparación de refrescos, y tiene potencial en la

producción de alcohol de buena calidad. (1)

Tradicionalmente, los frutos de segunda calidad son consumidos por el ganado

vacuno, porcino, aviar y en piscicultura; la semilla contiene proteínas en cantidad

importante, que le dan potencial como ingrediente en alimentación animal. (1)

4.1.1 Variedades del Pacae: En la estrella fluvial del Marañón se conocen 22

variedades y especies de Pacae, como lo atestiguan los esposos Berlín en

etnobiología, subsistencia y nutrición en una sociedad de la selva tropical: los

2

Aguaruna, 1978. En Nuestra selva central las dos variedades mas

preponderantes son :

o Inga Grenadensis Urb

o Inga benthamiana meisn

Estas dos variedades son conocidas comúnmente como la variedad blanca

y la amarilla por el color del arilo respectivamente. (1)

4.1.2 Usos de las Pepas de Pacae: Algunas comunidades indígenas de la

Amazonía, además de consumir la fruta como alimento, utilizan las

semillas y hojas con fines medicinales: antidiarreico y antirreumático.

Las semillas de especies seleccionadas son consumidas por ciertos

grupos indígenas de Araracuara. En El Salvador se emplea la corteza

de algunas especies para la producción de taninos. En el Vaupes,

Colombia, los indígenas utilizan la goma de ciertas especies para

fijarlos colores destinados a pintar sombreros, canastas y otras

artesanías.(2)

4.1.3 Composición Fisicoquímica y Fitoquímica de Las Pepas del

Pacae: Las semillas de Inga edulis de la variedad grenadensis,

comidas como vehículos, se divulgan para contener por 100 g, 118

calorías, 63.3% humedad, 10.7 proteína de g, 0.7 grasas de g,

carbohidratos total de 24.0 g, fibra de 1.6 g, ceniza de 1.3 g. Pulpa de

Inga spp. contiene por 100 g, 60 calorías, 83.0% humedades, 1.0

proteínas de g, 0.1 grasas de g, 15.5 carbohidratos total de g, 1.2

fibras de g, 0.4 cenizas de g. Semillas secadas de Inga spp. contener

por 100 g, 339 calorías, 12.6% humedad, 18.9 proteína de g, grasa de

2.1 g, carbohidratos total de 62.9 g, fibra de 3.4 g, ceniza de 3.5 g. Las

semillas del género Inga se divulgan para contener los inhibidores de

la tripsina y los inhibidores del chymotrypsin.(3)

3

4.2 Tendencia de los Sustitutos Alimenticios con Harinas de Alto Valor

Proteico:

En la década de 1970-1980 en varios países del mundo se implementaron programas

de investigación tendientes a formular alimentos con un alto contenido de proteína de

buena calidad, utilizando principalmente proteínas vegetales. La idea era utilizar

estas formulaciones en sustitución de las proteínas de origen animal, que por su baja

disponibilidad y alto costo no estaban disponibles para las poblaciones de escasos

recursos. Para estos fines se han empleado proteínas de oleaginosas, de

Cereales y de leguminosas, que combinadas, dan origen a alimentos de alto valor

proteínico y contienen otros nutrientes que son deficitarios en la dieta de la población.

Muchas formulaciones de esta naturaleza se han desarrollado y sometido a pruebas

biológicas de calidad nutricional, utilizando animales experimentales, y finalmente el

hombre. Se consideran dos grupos: a) sustitutos de leche, y b) extensores de

alimentos de origen animal.(4)

Consideraciones Generales:

La planificación y el desarrollo de estos alimentos debe tomar en cuenta

consideraciones, de orden tecnológico-nutricional, cultural, social y económico, tales

como:

1. Materia Prima: en lo posible debe ser local, ya que al importarla, no sólo se crea

una dependencia, sino que se incrementa el costo final del producto.

2. Evaluación de Calidad: se han diseñado guías y metodologías para el control y la

garantía de calidad de las fórmulas. Estas comprenden procedimientos de orden

Tecnológico (aceptabilidad y estabilidad del producto), nutricional (calidad y

digestibilidad de la proteína y tolerancia por los niños, y efecto suplementario a la

dieta), toxicológico y sanitario.

3. Procesamiento y Comercialización: se han establecido procedimientos generales

para el sistema de producción con respecto a la disponibilidad y características de la

materia prima y la adición de suplementos y sabores. Con respecto a la

4

comercialización, se ha puesto especial atención a la forma de presentación, precio,

estabilidad, envase, distribución y propaganda. Más que un concepto, las harinas

compuestas son ya una realidad traducida en alimentos que se comercializan y se

consumen, y que pueden contribuir significativamente al mejoramiento de la

seguridad alimentaria y nutricional de la población centroamericana.(4)

4.2.1 Harinas Compuestas a base de Leguminosas y Otros:

La tecnología para la preparación de harinas precocidas de frijol consiste en someter

el grano a un proceso de cocción, deshidratación y molienda. El producto así

obtenido está listo para consumo después de cocinarse durante 10 a 15 minutos.

Este tipo de producto puede usarse en la preparación de harinas compuestas

basadas en diferentes leguminosas de grano. La combinación del frijol común

con otros frijoles como el caupí (Vigna sinensis) o el gandul (Cajanus cajan) pueden

utilizarse posiblemente reduciendo el precio del producto y creando el interés para

producir otras leguminosas en determinadas regiones. Este tipo de harina compuesta

puede ser usado como sopa de diferentes tipos y sabores, o puede combinarse con

otros alimentos en la preparación de sopas de alto valor nutritivo. (4)

5

4.3 Elaboración de harinas Precocidas:

Son aquellas en la cual el índice de solubilidad y el índice de absorción es mayor

que las harinas crudas. Se tienen dos fases que son la tecnológica y la fase

nutricional (formulación de mezclas). (5)

Materia Prima

Clasificación y Selección

Lavado

Tratamiento Térmico (89ºC)

Secado o deshidratado (50-60ºC)

Molienda

Tamizado

Harina

El tiempo de tratamiento térmico para leguminosas es de 20-25 min.Los criterios

que se deben tomar para la elaboración de una mezcla alimenticia son: (5)

Deben tener un alto valor nutricional: Proteínas de alto poder nutricional,

carbohidratos fácilmente digestibles, densidad energética adecuada (0.8-

1Kcal/g de alimento preparado)

Estar libre de factores antinutricionales (Saponinas, inhibidores de proteasas,

oligosacaridos, etc)

Preferentemente se debe usar materias primas locales

Debe corresponder a los hábitos alimenticios locales.

Debe tener una vida útil larga.

6

Debe tener un costo moderado.

4.4 El HPLC: Esta técnica se ha convertido, sin lugar a dudas, en la más popular y

versátil de las técnicas analíticas modernas en los laboratorios de hoy. Los sistemas

de HPLC se utilizan actualmente en una amplia variedad de campos. Día a día

aumentan los requerimientos de confiabilidad de los datos analíticos y de eficiencia

en el flujo de trabajo del laboratorio, para un desarrollo más rápido de nuevas drogas,

para mejorar la seguridad de los alimentos, y para cumplir con estándares más altos

en regulaciones ambientales.  Un aspecto importante en el análisis de los

aminoácidos es el hecho de que no se pueden detectar en el visible-UV. Existen

varios reactivos que reaccionan con los aminoácidos dando compuestos coloreados

o fluorescentes y que, por tanto, pueden utilizarse para análisis cualitativos o

cuantitativos. Esto es lo que se denomina derivatización de los aminoácidos. Los

métodos fluorimétricos tienen muchas ventajas respecto a la espectrofotometría

para el análisis de aminoácidos. Necesidades proteicas. Se requiere un criterio para

fijar las necesidades o exigencias en proteínas para el ser humano. Por ello se

establece una "proteína de referencia" o "patrón".(6)

A menudo es necesario identificar y cuantificar los aminoácidos individuales de una

mezcla, tanto en estudios metabólicos como en las investigaciones de la estructura de

las proteínas. El uso de la cromatografía en capa fina o de la electroforesis son

adecuados para averiguar el número y la cantidad relativa de los diferentes

aminoácidos presentes en una muestra (análisis cualitativo), aunque para los análisis

cuantitativos es necesaria la cromatografía de gases o un analizador de aminoácidos.

(6)

4.4.1 Cromatografía en capa fina. Una importante aplicación de la

cromatografía en capa fina es la de servir como guía para el desarrollo de las

condiciones óptimas para realizar separaciones por cromatografía de líquidos en

columna. Proporciona una idea rápida de los aminoácidos mayoritarios existentes

en la muestra. Las ventajas de este procedimiento son la rapidez y el bajo coste

de los ensayos experimentales. De hecho, algunos cromatografistas son de la

opinión de que los ensayos en capa fina deberían preceder siempre al uso de la

7

columna.En la cromatografía de papel se pueden aplicar grandes volúmenes de

muestra, lo que permite la elución posterior de un aminoácido en particular para

su posterior purificación y análisis, factor que tiene gran importancia en la

identificación de un constituyente desconocido de la muestra. Antes de la realizar

la cromatografía, es necesario eliminar las sustancias que interfieren, tales

cromoproteínas, carbohidratos y sales, lo que puede hacerse con una resina de

intercambio iónico. Los aminoácidos retenidos pueden eluirse a continuación

añadiendo a la columna un pequeño volumen de amoniaco y lavando después

con agua destilada. La separación de los aminoácidos se basa en que éstos se

reparten de modo diferencial entre la fase móvil y la fase estacionaria.

Generalmente se realizan por el procedimiento ascendente: introduciendo el

borde inferior de la placa cromatográfica en el eluyente que será succionado por

acción de las fuerzas capilares del recubrimiento de la superficie del la placa.La

identificación de un aminoácido se realiza comparando los valores de R f (factor

de retraso: cociente entre la distancia recorrida por el compuesto desde el origen

y la distancia recorrida por el solvente desde el origen), con otros tomados como

referencia, debiéndose utilizar al menos tres sistemas de disolventes distintos

para establecer su identidad con un cierto grado de seguridad. La naturaleza de

los aminoácidos es un factor importante a la hora de elegir un disolvente, ya que

los diferentes solventes pueden permitir una mejor resolución de los

componentes ácidos, básicos o neutros. En general, aumentando la proporción

de agua en el disolvente se incrementan todos los valores de R f e introduciendo

pequeñas cantidades de amoniaco aumentan los valores del factor de retraso de

los aminoácidos básicos. Algunos disolventes contienen compuestos nocivos, por

ejemplo el fenol, lo que restringe su uso rutinario. La composición química del

disolvente puede también limitar el rango de reactivos de localización que pueden

aplicarse satisfactoriamente. Por ejemplo, el ácido sulfanílico no puede utilizarse

con disolventes fenólicos. El poder de resolución de la cromatografía de capa fina

puede aumentarse empleando técnicas bidimensionales, o sea, utilizando dos

disolventes distintos. Se aplica una cantidad de muestra mayor que la utilizada

generalmente para la separación cromatográfica de una dimensión

(aproximadamente el triple) en una esquina del papel o placa y se hace correr en

una dimensión. Entonces el cromatograma se seca completamente al aire, se gira

un ángulo de 90º y se desarrolla con el segundo solvente. Tras un nuevo secado,

8

se sumerge en el reactivo de localización elegido. En la cromatografía de dos

dimensiones, la composición de los dos disolventes es la que determina el orden

en que debe utilizarse.(6)

Las separaciones bidimensionales permiten la resolución de un gran número de

aminoácidos presentes en una muestra, ya que los que tienen una movilidad

similar en la primera dimensión se separan en la segunda. Esto es muy útil en la

detección de los componentes que están en muy baja concentración y pueden

quedar enmascarados por otros compuestos que tengan una concentración alta

cuando se utiliza la cromatografía en una dimensión. (6)

4.5 MÉTODOS BIOLÓGICOS QUE SE UTILIZAN PARA EVALUAR LA CALIDAD DE

LA PROTEÍNA:

4.5.1 RELACION DE EFICIENCIA PROTEICA (PER).- Este método fue

desarrollado por Osborne y Col. en 1979, el introdujo por primera vez que el

crecimiento de las ratas es el reflejo de la eficiencia de la proteína

suministrada, lo cuantifico con la relación cantidad de ganancia de peso por

gramos de proteína consumida. Originalmente esta relación se realizaba a

diferentes niveles de proteína, cuanto mas alto es el nivel de una proteína, es

mas sensible a los cambios del PER, hubo necesidad de estandarizar el

porcentaje de proteína, fijar un nivel para todas las proteínas, para evitar

variaciones, se recomendó el 10% de proteínas para ratas en crecimiento.

Para comparar la calidad de varias proteínas, además de estandarizar el

porcentaje de proteínas es necesario considerar otros factores como:

Edad.-LA edad de las ratas tiene un efecto en la medida de la

calidad de las proteínas, generalmente se usan ratas destetadas de

21 a 23 días.

Raza.-Diferentes razas de ratas presentes con diferentes rangos de

peso, entre las razas que se usan tenemos alas ratas albinas raza

Holtzman (mansas), Winster (agresivas) y otras.

9

Sexo.-El sexo de la rata usada tiene un efecto en el peso, los machos

presentan mayor rapidez en el crecimiento que las hembras, se

recomienda el uso de las ratas machos.

Numero de animales.-Diez ratas para cada una de las muestras

problema y 10 para la muestra control

Periodo de Experimentación.- Es de cuatro semanas a 28 días

notándose que los valores disminuyen con el tiempo ,la primera

semana, el crecimiento es rápido y las subsiguientes es mas lento

El PER de las proteínas de algunos de los alimentos se presentan en

el cuadro siguiente:

ALIMENTO PROTEINA (%) PER

INCAPARINA 27 2-5

CORN-SOY-MILK 19 2-4

FORTESAN 23 2-6

PERUVITA 35 2-4

SOYA 40 2-3

HABAS 30 1-8

TRIGO 14 1-8

AVENA 13 2-2

GRANO DE GIRASOSL 30 2-1

GRANO DE ALGODON 53 2-3

TUBERCULO DE

PATATA

9 2-0

CASEINA (TESTIGO) --- 2-5

10

4.5.2 UTILIZACION NETA DE LA PROTEINA (NPU).- Este método fue

desarrollado por Miller y Bender (1975) mide directamente la utilización de la

proteína determinando la cantidad de nitrógeno retenido proveniente del

consumo de proteína de un alimento, es decir manifiesta en un solo índice tanto

la digestibilidad de la proteína como el valor biológico de la mezcla de

aminoácidos absorbidos por el intestino (7).

En forma práctica el nitrógeno retenido se determina por la deferencia entre el

nitrógeno corporal de un grupo de ratas alimentadas con una dieta aproteica.

Se calcula usando la siguiente formula:

Los factores condicionales son:

11

PER = Ganancia en peso/proteína consumida

N corporal ratas dieta de ensayo –N corporal ratas dieta aproteica UNP = ___________________________________________________________ X 100 Nitrógeno Ingerido

Raza.-Se puede determinar el NPU en razas diferentes de ratas blancas,

dando resultados similares. (7)

Sexo.-No hay significativa diferencia entre ambos sexos, se puede emplear en

la experimentación ratas machos, hembras y ambos sexos, los valores del NPU

no serán alterados. (7)

Número de animales.-16 ratas en edad de destete ,8 ratas para ser

alimentados con la muestras de ensayo (4 para cada una),cuatro ratas para

será alimentados con la dieta aproteica y cuatro para ser alimentado con

caseína que sirven como grupo control. (7)

Periodo de experimentación.-Es de 10 días después de este tiempo los

animales son sacrificados y el nitrógeno de las caracasa es analizado. (7)

Antes de empezar a experimentación se dará a los animales una dieta de

estock o de acostumbramiento con la finalidad de que todos empiecen el

ensayo en las mismas condiciones en cuanto a alteraciones fisiológicas de

adaptación enzimáticaDebemos de distinguir los siguientes términos:

a. NPU “Calculado” .-.Se denomina cuando se obtiene a partir

de los valores determinados de la digestibilidad y del valor biológico.

b. NPU “operativo” (NPU op ).- Se refiere a la utilización de una proteína

en las condiciones en que realmente se consume, obteniéndose

experimentalmente a cualquier concentración proteica. (7)

c. NPU”estandarizado” (NPU est ).- Es una expresión pura de la calidad

de una proteína, que se obtiene experimentalmente a una

concentración proteica igual o inferior necesaria para la manutención

de su peso (7)

4.5.3 Digestibilidad de las Proteínas. La digestibilidad de las proteínas resulta

particularmente importante teniendo en cuenta que se trata de un principio nutritivo

eminentemente de comportamiento plástico .Junto con el llamado valor biológico,

12

NPU “calculado”=V.B X D/100

determina la utilización neta proteica (NPU).Por razones de técnica de laboratorio,

cuando se trabaja con proteínas se prefiere hacerlo en términos de nitrógeno,

elemento mas fácil de cuantificar y multiplicado por distintos factores (el mas común

6.25) se puede matemáticamente transformar en proteína. Las proteínas de los

alimentos principales tienen 15% de nitrógeno, lo que explica el uso de ese factor y

camia si los contenidos son mayores o menores; por ejemplo 5.97 para proteínas de

algunos vegetales,6.38 si provienen de la leche, etc (8)

La digestibilidad de una proteína teniendo en cuenta lo dicho en el párrafo

precedente, es la proporción de nitrógeno alimentario absorbido y se expresa por

la formula:

Donde: A = nitrógeno absorbido.

I = nitrógeno ingerido

F = nitrógeno fecal

Fk = nitrógeno endógeno segregado por el intestino

Por lo tanto el Valor biológico de las proteínas es la proporción de nitrógeno

absorbido, que es retenido por el organismo, para mantener la integridad de los

tejidos y permitir si fuese necesario el desarrollo y crecimiento si coincide con

esa etapa de la vida. (8)

V.- FORMULACION DELA HIPOTESIS

5.1.- HIPÓTESIS GENERAL

La harina elaborada a partir de la variedad grenadensis Urb. posee una

alta calidad proteica y elevado poder de digestibilidad y funcionalidad.

c

13

A/I = (I-(F-Fk))/I = Verdadera digestibilidad

5.2.1 VARIABLES INDEPENDIENTES

Semillas de pacae.

5.2.2 VARIABLES DEPENDIENTES

Proteína bruta

Cantidad de de aminoácidos esenciales

Eficiencia proteica (PER)

Utilización neta de proteína (NPU)

VI.- EXPLICACION DEL METODO DE TRABAJO

6.1.-Lugar de ejecución

La parte primera del proyecto de caracterización fisicoquímica y Fitoquímica se

realizará en los laboratorios de la facultad de Ingeniería en Industrias

Alimentarias de la Universidad Nacional del Centro del Perú.

La etapa final de análisis cromatográfico (HPLC) y caracterización biológica

(PER, NPU) se llevara a cabo en los laboratorios de la facultad de de Industrias

Alimentarias de la Universidad Nacional Agraria La Molina.

6.2.- Materia prima e insumos

Para el desarrollo de la investigación se tomaran muestras aleatorias de dos

variedades de Pace (Inga Grenadensis Urb e Inga benthamiana meisn) de la

finca Carpa pata, ubicada en el distrito de Mazamari, del departamento de

Junín (Perú). Estos serán obtenidos de manera aleatoria, de acuerdo a la

norma ISO 874 (muestreo de frutas y vegetales frescos). De esta muestra

global por su estado fitosanitario y madurez, se seleccionaran los frutos

destinados a los análisis.

6.3.- Equipos y materiales

6.3.1.- Equipos de laboratorio

Equipo de extracción soxhlet de 250 mL

Condensadores rectos

Campana de extracción

14

Equipo de filtración al vacío de 250 mL

Nevera no frost marca HACEB N/f12 10 modelo 53 N12-2 LF

Balanza triple brazo marca OHAUS serie 700-800 (precisión 0.1 g),

con capacidad para 2610 g

Horno de secado FISHER SCIENTIFIC ISOTEMP OVEN 737 G

Equipo de destilación semiautomático para determinación de nitrógeno

marca BUCHI modelo K314

Balanza analítica PRECISA XT 220 A (0.0001g precisión) .

Cromatógrafo.

Jaulas de metal con bebederos especiales

6.3.2.- Materiales

Recipientes de aluminio y acero inoxidable

Cucharas

Cajas de petri de 20 g de capacidad

Crisoles de porcelana de 15 mL

Balones de fondo plano de 100 mL

Erlenmeyers de 250 mL

Micro bureta de 10 mL

Tubos de ensayo de 5 mL de capacidad (1 cm de diámetro X 7 cm de

longitud)

Mortero

Papel filtro whathman Nº 604

Embudo de separación de 100 mL

Embudo de caña de 9cm. de diámetro

6.3.3.- Reactivos

Metanol

Agua Destilada

Eter de petróleo

Anhídrido acético

Solvente: n-butanol/Hac/H2O en proporción 12:3:5.

Acetónica de ninhidrina al 0.25%.

Ad-libitium-agua

15

6.4.- Métodos de Análisis:

6.4.1 Determinación de las características físicas del la semilla

Se valoraran organolépticamente, el color, olor, forma, textura, así como el peso

promedio, que se determinó por pesaje de las muestras en la balanza. Tabla 2

Tabla 2

CaracterísticasVariedad 1 Variedad 2

Forma    

Peso promedio    

Color    

Textura    

6.4.2 Caracterización Química de las semillas

A la materia prima se le realizarán todos los análisis en un diseño al azar, con

dos repeticiones. Los métodos a emplear se presentan en la tabla 3.

TABLA 3. Métodos analíticos para caracterización de las semillas del Pacae

(Inga edulis mart)

DETERMINACION METODO

Humedad Desecación a 100- 105 ºC en estufa a presión

constante hasta peso constante

Ceniza Calcinación a 550 ºC, por 4 horas

Extracto etéreo Soxhlet, por 4 horas

Proteína bruta Kjeldahl

Fibra bruta Método Weende

Extracto no nitrogenado

(NNP)

Por diferencia

16

En la tabla 4 se mostrarán los resultados del análisis químico y caracterización

de los componentes nutricionales principales de la semilla del fruto del pacae

(Inga edulis mart) .Debido a que la mitad del contenido de la semilla es agua,

es de vital importancia realizar un proceso de secado para evitar el deterioro del

material por ataque de microorganismos e incrementar la vida útil del producto.

Como se puede observar este proceso además concentra los macro nutrientes

y su interés nutricional.

TABLA 4. Análisis Químicos realizados a las semillas secas del pacae

(g/100g)

Determinación

Contenido base Humedad Contenido base seca

  variedad 1 variedad 2 variedad 1 variedad 2

Humedad        

Ceniza        

Proteína*        

Fibra        

Grasa        

ENN (Extracto no

nitrogenado)        

*factor utilizado 5.7

6.4.4 Pruebas Cualitativas fitoquímicas

Las pruebas se realizaran por triplicado a la materia prima.

6.4.4.1 Preparación de la muestra: Se tomaran 10g de semilla deshidratada,

se maceraran en un mortero y se añadirán 30 mL de éter de petróleo y

30 mL de una mezcla de 9:1 de metanol-agua; la mezcla se dejara por

17

espacio de 15 minutos, se filtrara y posteriormente se separaran la

fase acuosa de la fase etérea, en un embudo de separación.

6.4.4.2 Saponinas: Se tomara 1 ml de la fracción de metanol- agua del

proceso anterior y se añadirán 9 ml de agua. Se filtrara y se

transvasara 1 ml del filtrado a un tubo de ensayo, se agitó

vigorosamente por 30 segundos y se dejó en reposo durante 15

minutos. La presencia de saponinas, se establecerá de acuerdo a la

espuma sobrenadante y su altura en la muestra.

Los resultados, se interpretaran según los siguientes parámetros:

TABLA 5. Nivel del contenido de saponinas

Altura (mm) Contenido de saponinas

5-9 Bajo

10-14 Moderado

Mayor a 15 Alto

Menor a 5 Prueba negativa

6.4.4.3 Fenoles: A cinco tubos de ensayo de 5 mL, se adicionaran a cada

uno, tres (3) gotas de la fracción metanólica-agua, posteriormente se

añadió, tres (3) gotas de agua destilada con lo que se logró un color

amarillo. Uno de los tubos se dejará como testigo y a los restantes se

ira adicionando respectivamente una, dos, tres, cuatro, gotas de

cloruro férrico (5%)

La caracterización de fenoles se hace de acuerdo a la coloración así:

Ninguna reacción (no cambia de color) = no hay presencia de

fenoles o taninos.

Cambio en el color azul oscuro = fenoles o taninos pirogálicos

(hidrosolubles).

18

Cambio de color a verde oscuro = fenoles o taninos de tipo

catecol (flavonoides o taninos concentrados).

6.4.4.4 Esteroides (prueba de Lieberman-Buchard): Se colocará 1 mL de la

fracción no polar (capa de éter de petróleo) en un crisol; se evaporará

casi

hasta

sequedad y se adicionaran tres (3) gotas de cloroformo. Luego se

secaran en campana de extracción y se adicionaran dos (2) gotas de

anhídrido acético seguido por una gota de ácido sulfúrico concentrado.

Los cambios de color indican:

Azul o verde = esteroides

Rojo, rosado o violeta = triterpenos

Amarillo pálido = esteroides o triterpenos saturados

En la tabla 6 se presentaran los resultados de las pruebas realizadas Para las dos

muestras de pepas de pacae.

TABLA 6. Resultados de pruebas fitoquímicas

Si se presentaran pruebas positivas para esteroides y fenoles, se realizaran

estudios fitoquímicos posteriores para las pruebas positivas, que permitirán

corroborar, la presencia de este tipo de sustancias cuantitativamente, que

pueden ser un factor de interferencia en la asimilación de nutrientes.

Prueba Resultado muestra 1 Resultado muestra 2

Saponinas

Esteroides

Fenoles

19

6.4.5 ANÁLISIS DEL CONTENIDO DE AMINOÁCIDOS POR HPLC EN LAS

DOS HARINAS

A continuación, se incluye un protocolo típico del análisis de aminoácidos en

harinas:

- Dejar a reflujo las muestras con HCl 6N durante 24 horas.

-Evaporar a sequedad en evaporador rotatorio.

- Añadir agua y evaporar a sequedad.

- Realizar el examen cromatográfico de las soluciones problemas al 10% de

las muestras tratadas en solución acuosa de isopropanol a 10%.

- El sistema solvente: n-butanol/Hac/H2O en proporción 12:3:5.

- Soporte papel Whatman nº1.

- Longitud del papel 50 cm.

- Método cromatográfico descendente.

- Duración: 12 horas.

- Solución reveladora: solución acetónica de ninhidrina al 0.25%.

- Condiciones de revelado: 20 min a 105ºC.

- Comparación frente a muestras puras de clorhidratos de aminoácidos.

6.4.6 METODOS BIOLÓGICOS PARA LA EVALUACION DE LA CALIDAD

PROTEICA DE LAS HARINAS

6.4.6.1 RELACIÓN DE EFICIENCIA PROTEICA (PER)

Se cogeran 30 ratas ,20 de ellas para ser alimentadas con

nuestras harinas en estudio(10 en cada tipo) y las otras 10

restantes con las raciones que contienen caseína.

Se pesaran cada rata y se colocaran en una jaula independiente

y se anotaran inmediatamente en las hojas de registro. El peso

promedio de los 3 grupos de ratas de menos 5 gramos.

20

Administrar a cada rata del grupo del problema 10 gramos de la

dieta con las harinas en estudio, en los primeros

días ,sucesivamente 15 gramos,20 gramos, etc.

Administrar a cada rata del grupo control,10 gramos de la

dieta preparada con caseína los primeros días, sucesivamente

15 gramos,20 gramos.

Administrar Ad-libitium agua en unos bebedores preparados de

frascos con tubos de vidrio y tapón de jebe.

Alimentar a las ratas por un periodo de 4 semanas.

Registrar el peso de cada rata semanalmente ,el consumo y

desperdicio de alimentos diariamente y anotar en la ficha de

control correspondientemente.

Calculamos el PER

Esto para cada animal y se calcula un promedio para cada

grupo de proteína. Los resultados se muestran como:

PER del alimento control (Caseína)

PER del alimento en estudio (Muestras)

El PER de los alimentos en estudio se compara con

respecto al PER de la caseína, según:

Comparación= (PER Alimento/PER Caseína) X 100

Según la FAO un PER para considerarse alto, es decir de

alta calidad proteica debe ser mayor o igual a 80% respecto al

PER de la caseína.

6.4.6.2 UTILIZACIÓN NETA DE LA PROTEÍNA:

21

PER = Ganancia en peso promedio/proteína consumida promedio

Pesar 12 ratas de 21 a 23 días de edad de ambos sexos para ser

alimentados con las harinas y cuatro con la dieta aproteica.

Colocar a cada rata en una jaula y suministrar una dieta de

acostumbramiento

Administrar Ad-libitium agua en unos bebedores preparados de frascos con

tubos de vidrio y tapón de jebe.

A partir del quinto día suministrar a 8 ratas la dieta preparada con el

alimento (4 para cada tipo de harina) y a 4 ratas la dieta que no tiene

proteína, previamente pesado, durante un periodo de 10 días

Después sacrificar a los animales ,abrir el cráneo ,la cavidad toráxica y los

residuos del tubo digestivo

Pesar el cuerpo de los animales, secar la carcaza a 105 ºC por 48 h.

Pesar el animal seco y moler con todo el pelo, homogenizar y luego sacar

una alícuota para determinar proteína

Determinaremos entonces la proteína con el método kjetdahl.

Sacar promedio de nitrógeno de la carcasa de los 8 animales

alimentados(Cp) con la dieta de las harinas y el promedio de las cuatro

ratas alimentadas con la dieta que no contiene proteínas(Co).

NPU = Cp-Co x 100

I

I = Nitrógeno ingerido

Con la formula de NPU hallar NPU1 Y NPU2.

6.5.- Metodología Experimental:

6.5.1.- Descripción del diagrama de flujo:

22

Se seleccionaran las materias primas de las dos variedades de pacae para

obtener sus respectivas semillas y analizar las humedades, cenizas, extracto

seco, proteína bruta, extracto no nitrogenado. Se tendrá en cuenta la

variedad de pacae y el estado de madurez de dicha leguminosa.

Se procederá a secar dichas semillas previo un tratamiento térmico de 89 ºC,

cuando estas estén completamente secas se realizaran las pruebas

cuantitativas fitoquímicas de saponinas, fenoles y esteroides.

Después de esta etapa se elaboraran harinas de dichas variedades de pepas

para luego analizarlas cromatograficamente (HPLC) y determinar su

composición de aminoácidos.

Como paso final caracterizaremos biológicamente estas harinas para ver su

valor biológico y compararlas.

Materia Prima

Clasificación y Selección

Lavado

Tratamiento Térmico (89ºC)

Secado o deshidratado (50-60ºC)

Molienda

Tamizado

23

Harina

6.5.2 Esquema Experimental :

Se elaboro el siguiente diagrama experimental de elaboración de harinas de pepa de

pacae (Inga edulis mart) para su respectiva evaluación y caracterización proteica

nutricional.

24

6.5.2.- Diseños experimentales:

6.5.2.1 Diseño experimental para la caracterización fisicoquímica de las

pepas de las dos variedades con tres repeticiones:

Base Seca Base húmeda

 

Muestra 1

 

Muestra 2

 

Muestra 1

 

Muestra 2

 

Nº de

Rep H C PB F G ENN H C PB F G ENN H C PB F G ENN H C PB F G ENN

1                                                

2                                                

3                                                

Donde

H= Humedad

C= Ceniza

25

PB=Proteína Bruta

G=Material graso

ENN=Extracto no nitrogenado

6.5.2.2 Diseño experimental para la caracterización fitoquímica de las

pepas secas de pacae con tres repeticiones:

  VARIEDAD 1 VARIEDAD 2

Nº repet. Saponinas Fenoles Esteroides Saponinas Fenoles Esteroides

1            

2            

3            

6.5.2.3 Diseño experimental para el PER de las Harinas obtenidas:

PARA CASEINA (PATRON)

Nº de ratas Peso inicial 1º Semana 2º Semana 3º Semana 4 Semana Consumo de

Caseína

GP

(Ganancia

en Peso)

CP

(Consumo

de

Proteína)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Para Harina 1

Nº de ratas Peso inicial 1º Semana 2º Semana 3º Semana 4 Semana Consumo de GP CP

26

alimento (Ganancia

en Peso)

(Consumo

de

Proteína)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Para Harina 2

Nº de ratas Peso inicial 1º Semana 2º Semana 3º Semana 4 Semana Consumo de

alimento

GP

(Ganancia

en Peso)

CP

(Consumo

de

Proteína)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

6.5.2.4 Diseño experimental para el NPU:

PARAMETROS HARINA1

(PROTEINA)

HARINA

2(PROTEINA)

DIETA

APROTEICA

Número de animales

27

Contenido de nitrógeno

promedio (g) de la carcasa

(Nitrógeno corporal).

Contenido de nitrógeno

(g) de las dietas

(Nitrógeno ingerido).

NPU

6.5.2.5 Cuadro de comparación

Muestras NPU PER

Harina de variedad 1

Harina de variedad 2

28

VII.- CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Tiempo Estimado : 11 Meses

1mes 2mes 3mes 4mes 5mes 6mes 7mes 8mes 9mes 10mes 11mes 12mes

Recolección de

la materia

prima

X

Selección

clasificación y

pelado

X

Análisis

fisicoquímico

de las pepas

X X

Secado y

deshidratado X

29

Análisis

Fitoquímico X

Molienda y

tamizado X

Análisis

Cromatográfico

de la harina

X

PER de la

Harina X X

NPU de la

Harina X X

Impresión,

Encuadernación

y empastado

X

Otros X

VIII.- PRESUPUESTO

ASIGNACION DE GASTO

IMPORTE EN S/.CODIGO DENOMINACION

05 GASTOS CORRIENTES 2 500,00

05.03 BIENES Y SERVICIOS 2 500,00

05.03.20 VIATICOS Y FLETES 200,00

05.03.20.01 Viáticos 200,00

05.03.30 BIENES DE CONSUMO 500,00

05.03.30.01 Jaulas y Bebederos 350,00

05.03.30.02 Material Biológico (Ratas) 150,00

05.03.32 PASAJES Y GASTOS DE TRANSPORTE 150,00

05.03.32.01 Pasajes 150,00

05.03.33 SERVICIO DE CONSULTORIA 100,00

05.03.33.01 Asesoria 100,00

30

05.03.39 OTROS SERVICIOS DE TERCEROS 850,00

05.03.39.01 Impresión, Encuadernación y empastado 400,00

05.03.39.02 Refrigerio 100,00

05.03.39.03 Fotocopiados 350,00

05.03.46 INSUMOS DE LABORATORIO 150,00

05.03.46.01 Reactivos 150,00

05.03.49 MATERIALES DE ESCRITORIO 100,00

05.03.49.01 Materiales de Escritorio Diversos 100,00

05.03.52 ALQUILER DE BIENES MUEBLES 450,00

05.03.52 Alquiler de Equipos de Laboratorio (Corridas de

HPLC)

450,00

TOTAL 2 500,00

IX.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

1. BRACK, E.W. Experiencias tradicionales y posibilidades de desarrollo en Selva

Central In: (Pérez, C.O. de.). Actas del Curso Taller sobre Agroforestería Tropical,

San Ramón. INADE, Lima. 1984.

2. Portal Agrario [base de datos en línea] .Perú: Recursos naturales [fecha de

acceso 1 de septiembre de 2006]. Disponible en:

http://www.minag.gob.pe/rrnn_guaba.html.

3. Duque de James A. Manual de las cosechas de energía; 1983 [en línea] [fecha

de acceso 15 de septiembre de 2006]. Disponible en:

http://www.minag.gob.pe/rrnn_guaba.html.

4. Dr. Luís G. Elías. Notas técnicas del Instituyo de Nutrición de Centro América

(INCAP).Editorial Panam. Panamá; 2000.

31

5. Msc. Clara espinoza Silva. Manual de Tecnología de Cereales y

Leguminosas UNCP. Huancayo; 2002.

6. Monografias.com [en línea]. Análisis del contenido de Aminoácidos en Alimentos

Con Fines Nutricionales; 2006. [fecha de acceso 30 de octubre del 2006].URL

disponible: ttp://www.monografias.com/trabajos7/amin/amin.html.

7. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) [en línea]. BrooKhaven

national Laboratory [fecha de acceso 5 de octubre del 2006].URL disponible en:

www.pharm.uky.edu/ASRG/HPLC/hplcmytry.html

8. .Jc.Cheftel-Jl CUQ-D. Larrent. Proteínas Alimentarias. Editorial Acribia España;

1989.

9. Rolando Salinas. Alimentos y Nutrición. Bromatología aplicada a la salud.

Editorial el ateneo. Buenos aires-Argentina; 1988.

ANEXOS

32

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DEL ALTO RENDIMIENTO (HPLC): UNA GUÍA DE

LOS USUARIOS

El HPLC es un método de análisis popular porque es fácil aprender y utilizar y no es

limitado por la volatilidad o la estabilidad del compuesto de la muestra. La sección de

la historia ilustra la evolución del HPLC a partir de los años 70 a los años 90. El

HPLC moderno tiene muchos usos incluyendo la separación, la identificación, la

purificación, y la cuantificación de varios compuestos. Es importante para ésos que

usan HPLC para entender la teoría de la operación para recibir el análisis óptimo de

sus compuestos. Para ésas interesadas al comprar o usar un HPLC hemos incluido

una lista de fabricantes, guía de localización de averías, asistencia técnica, y una

bibliografía a la ayuda reduce tu investigación personal y tiempo el referirse. Una vez

que hayas terminado la teoría de la operación, te calificarán tomar un concurso

)/rápido para probar tu comprensión de los sistemas del HPLC. (5)

33

Historia del HPLC :

Antes de los años 70, pocos métodos cromatográficos confiables eran disponibles en

el comercio al científico del laboratorio. Durante los años 70, la mayoría de las

separaciones químicas fueron realizadas usando una variedad de técnicas

incluyendo la cromatografía de la abrir-columna, la cromatografía de papel, y la

cromatografía de capa delgada. Sin embargo, estas técnicas cromatográficas eran

inadecuadas para la cuantificación de compuestos y de la resolución entre los

compuestos similares. Durante este tiempo, ejercer presión sobre la cromatografía

líquida comenzó a ser utilizado disminuir tiempo del flowthrough, así reduciendo

tiempos de la purificación de los compuestos que son aislados con chromatogaphy

de la columna. Sin embargo, los índices de corriente eran inconsistant, y la cuestión

de si era mejor tener caudal constante o presión constante fue discutida. (Quím.

analítica vol. 62, no 19, 1 Oct de 1990). (5)

34

La cromatografía líquida de alta presión fue desarrollada en los mediados de los años

setenta y mejorada rápidamente con el desarrollo de los materiales de embalaje de la

columna y la conveniencia adicional de detectores en línea. En los últimos años 70,

los nuevos métodos incluyendo la cromatografía líquida de la fase reversa

permitieron la separación mejorada entre los compuestos muy similares. Por los años

80 el HPLC era de uso general para la separación de compuestos químicos. Las

nuevas técnicas mejoraron la separación, la identificación, la purificación y la

cuantificación lejos sobre las técnicas anteriores. Las computadoras y la

automatización agregaron a la conveniencia del HPLC. Mejoras en el tipo de

columnas y reproductibilidad fueron llevadas a cabo así mientras que los términos

tales como microcolumna, columnas de la afinidad, y HPLC rápido comenzaron al

immerge. La última década ha considerado una empresa extensa en el desarrollo de

las microcolumnas, y otra especializó columnas. Las dimensiones de la columna

típica del HPLC son: XXX milímetro en longitud con un diámetro interno entre 3-5

milímetros. El diámetro generalmente de microcolumnas, o las columnas capilares,

se extiende a partir del µm el 3 al µm 200. El HPLC rápido utiliza una columna que

sea más corta que la columna típica, con una longitud de cerca de 3 milímetros

desea, y él se embala con partículas más pequeñas. (5)

Actualmente, uno tiene la opción de considerar tipos excesivos del x# de columnas

para la separación de compuestos, tan bien como una variedad de detectores

interconectar con el HPLC para conseguir el análisis óptimo del compuesto.

Esperamos que esta revisión proporcione una referencia que todos los niveles de los

usuarios del HPLC puedan encontrar respuestas rápidas a sus problemas del HPLC.

Aunque el HPLC se considera extensamente ser una técnica principalmente para la

investigación biotechnological, biomédica, y bioquímica así como para la industria

farmacéutica, estos campos corrently abarcan el solamente cerca de 50% de

usuarios del HPLC. (Quím. analítica vol. 62, no 19, 1 Oct de 1990). El HPLC es

utilizado actualmente por una variedad de campos incluyendo los cosméticos, la

energía, el alimento, y las industrias ambientales. (5)

35

Tendencias del futuro:

El HPLC continuará siendo una de las técnicas más importantes de la separación del

laboratorio para los propósitos analíticos y preparatorios. La biotecnología y las

ciencias de vida es donde estará un procedimiento el HPLC crucial. Las compañías

de la biotecnología utilizarán HPLC para continuar probando al gobierno que sus

productos son no tóxicos, puros, y activos. Las columnas rápidas y del microbore

serán importantes en el analítico y masa-escalan los usos preparatorios para los

biologicals y los productos heterologously expresados del gene. Las técnicas de la

afinidad y del immunoaffinity serán utilizadas más con frecuencia para la producción

de productos farmacéuticos biotechnological debido a la necesidad del

ultrapurification para quitar todo el material indeseado de la célula huesped. El HPLC

continuará siendo el apoyo principal en la purificación y la separación de proteínas,

de peptides, y de nucleotides. Columnas analíticas más pequeñas serán necesarias

traz el genoma humano. La necesidad de columnas chiral de la separación de una

capacidad más exacta y más alta será necesitada por las compañías farmacéuticas

para optimizar eficacia en la masa-producción de compuestos enantiomeric “activos”.

La especialización en métodos de la detección y de la identificación aumentará de

importancia. Esto implicaría la supervisión de agentes contaminadores ambientales,

usando el embalaje especial del chelate para detectar los contaminantes del metal en

el agua, desarrollando separaciones rápidas para supervisar métodos rápidos de la

fermentación, y el convertirse en la identificación de virus y de bacterias. HPLC-MS

será importante en medicina forense y tableros que gobiernan atléticos. El uso de

HPLC-MS permitirá que los ciertos análisis y evidencia estén parados para arriba

ante el tribunal. El HPLC solamente o conjuntamente con otros métodos puede

supervisar para las drogas en atletas. La silicona era la resina/la ayuda de los años

80; posiblemente, las resinas orgánicas tomarán vuelo en años para venir puesto que

son unreactive, ellas funcionan en una amplia gama de pH, reproductibilidad son

favorables, pueden ser stereoselective, y pueden ser utilizadas con SEC (Knox,

1989). La cromatografía de Polytyptic aumentará de renombre al igual que los lasers

debido a su selectividad y sensibilidad crecientes. Los detectores de la dispersión

ligera pueden manar substituyen los detectores de RI en el futuro. Los detectores

múltiples por sistema son un possiblity y la optimización originada en ordenador de

36

las condiciones del HPLC aumentará y guardará paso con el movimiento del

conocimiento de informática.(5)

Usos para el HPLC: (5)

El HPLC preparatorio refiere al proceso del aislamiento y a la purificación de

compuestos. Importante es el grado de pureza del solute y del rendimiento de

procesamiento, que es la cantidad de compuesto producida por tiempo de la unidad.

Esto diferencia de HPLC analítico, donde está obtener el foco la información sobre el

compuesto de la muestra. La información que puede ser obtenida incluye la

identificación, la cuantificación, y la resolución de un compuesto.

Las separaciones químicas se pueden lograr usando HPLC utilizando el hecho de

que ciertos compuestos tienen diversas tarifas de la migración dadas una columna

particular y una fase móvil. Así, el chromatographer puede separar compuestos (más

en separaciones chiral) de uno a que usa HPLC; el grado o el grado de la separación

es determinado sobre todo por la opción de la fase inmóvil y de la fase móvil.

La purificación refiere al proceso de separar o de extraer el compuesto de la blanco

de otro (relacionado posiblemente estructural) los compuestos o los contaminantes.

Cada uno compuesto debe tener un pico característico bajo ciertas condiciones

cromatográficas. Dependiendo de qué necesidades de ser separado y cómo de cerca

está relacionado las muestras ser, el chromatographer puede elegir las condiciones,

tales como la fase móvil apropiada, para permitir que la separación adecuada para

recoger o para extraer el compuesto deseado mientras que se enjuaga a partir de la

fase inmóvil. La migración de los compuestos y los contaminantes a través de la

columna necesitan diferenciar bastante para poder ser recogido o extraer el

compuesto deseado puro sin incurrir en ningún otro compuesto indeseado.

La identificación de compuestos de HPLC es una parte crucial de cualquier

análisis del HPLC. Para identificar el compuesto de HPLC un detector debe primero

ser seleccionado. Una vez que el detector se seleccione y se fije a los ajustes

óptimos de la detección, un análisis de la separación debe ser desarrollado. Los

parámetros de este análisis deben ser tales que un pico limpio de la muestra sabida

37

está observado de la cromatografía. El pico que identifica debe tener un rato

razonable de la retención y se debe separar bien de picos extraños en los niveles de

la detección que el análisis será realizado. Para alterar la época de la retención de un

compuesto, varios parámetros pueden ser manipulados. El primer es la opción de la

columna, otra es la opción de la fase móvil, y pasada es la opción en caudal. Todos

estos asuntos se repasan detalladamente en este documento.

Identificar un compuesto de HPLC es lograda investigando la literatura y por ensayo y

error. Una muestra de un compuesto sabido se debe utilizar para asegurar la

identificación del compuesto desconocido. La identificación de compuestos puede ser

asegurada combinando dos o más métodos de detección.

La cuantificación de compuestos de HPLC es el proceso de determinar la

concentración desconocida de un compuesto en una solución sabida. Implica el

inyectar de una serie de concentraciones sabidas de la solución compuesta estándar

sobre el HPLC para la detección. La cromatografía de estas concentraciones sabidas

dará una serie de picos que correlacionen a la concentración del compuesto

inyectada. (5)

38