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Trabajo N°1. Bioquímica II
Hematología Básica, ADN-ARN
Castillo, Yaviely;Centeno, Bárbara
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1. Introducción
Al igual que otras ciencias biomédicas, en la última década la hematología ha
presentado importantes avances, tanto en el campo de la fisiopatología y diagnóstico,
como también en las estrategias de tratamiento. Los problemas hematológicos que
afectan a los seres humanos han sido estudiados por diversos grupos de hematólogos,
a lo largo de los últimos 60 años del siglo XX, en investigaciones fundamentalmente
clínicas. La hematología se dedica al diagnóstico y tratamiento de pacientes que
presentan enfermedades sanguíneas, o cualquier tipo de cuadro clínico que puede ser
detectado mediante análisis sanguíneos [1].
Por otro lado, los ácidos nucleicos, las proteínas y los polisacáridos son
biomoléculas que en su conjunto realizan diversos procesos químicos que constituyen
la materia viva. De ahí la importancia e interés para los científicos, del estudio de sus
propiedades y funciones. Cabe mencionar que estas sustancias existen en forma de
macromoléculas, que son polímeros en los cuales cada tipo, está formado por la unión
de un número limitado de clases de unidades monoméricas. Donde en cada caso la
secuencia de unidades es específica. Existen dos tipos de acido nucleico que son: ADN
(Ácido desoxirribonucleico) y ARN (Ácido Ribonucleico) que actúan como
depositarios y transmisores de la información genética de cada célula, tejido y
organismo. Así la información contenida en el ADN puede ser copiada por partes, en
moléculas específicas de ARN denominadas ARN mensajeros (ARNm), este proceso se
denomina transcripción y la información codificada en el ARNm es luego traducida en
una secuencia específica de aminoácidos que forman una proteína. Este último
proceso se denomina traducción. El avance en el estudio de estas moléculas ha sido
vertiginoso, encontrando hoy tecnologías aplicadas con nanomateriales, polímeros,
tecnología PCR de amplificación del ADN, entre otros [2, 3]
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2. Hematología Básica
La hematología es la rama de la ciencia médica que se encarga del estudio de los
elementos de la sangre y sus precursores, así como de los trastornos estructurales y
bioquímicos de estos elementos, que puedan conducir a una enfermedad [1].
En general las enfermedades sanguíneas pueden afectar a al sistema
eritrocitario, sistema leucocitario, hemostasia o hemopatías malignas
(leucemias/linfomas, discrasias y otros) [4].
Las enfermedades de la sangre básicamente, pueden afectar elementos celulares
(eritrocitos, plaquetas y leucocitos), plasmáticos (inmunoglobulinas, factores
hemostáticos), órganos hematopoyéticos (médula ósea) y órganos linfoides (ganglios
linfáticos y bazo). Debido a las diversas funciones que los componentes sanguíneos
cumplen, sus trastornos darán lugar a una serie de manifestaciones que pueden
englobarse en diversos síndromes [1, 4].
De ésta manera para comprender ésta rama se debe conocer las definiciones
básicas relacionadas a la sangre.
2.1 Sangre y sus componentes
Básicamente la sangre está constituida por dos grupos;
- Elementos Formes: son elementos semisólidos y particulados en ésta
categoría entran las células sanguíneas; glóbulos blancos se originan en la
médula ósea mediante un complejo proceso de diferenciación y maduración
celular. En este proceso denominado hematopoyesis participan varios
factores de maduración. Y también se encuentran los derivados celulares que
son los eritrocitos (glóbulos rojos) y plaquetas [5].
- El plasma sanguíneo: un fluido traslúcido y amarillento que representa la
matriz extracelular líquida en la que están suspendidos los elementos
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formes. Este representa un medio isotónico para las células sanguíneas, las
cuales sobreviven en un medio que esté al 0,9 % de concentración.
Elementos Formes
Glóbulos Rojos
Los glóbulos rojos son células anucleadas que se forman en la médula ósea a
partir de «stem cells». Una vez en la circulación tienen como principal función
transportar oxígeno a los tejidos, tarea que desarrollan por aproximadamente 120
días, hasta que el sistema los retira de la circulación. Los glóbulos rojos tienen como
función principal y utilizando su proteína más abundante, la hemoglobina transportar
el oxígeno desde los pulmones a los tejidos
Glóbulos Blancos
Los glóbulos blancos o leucocitos incluyen linfocitos, granulocitos (neutrófilos,
eosinófilos y basófilos) y monocitos, que se forman en la médula ósea a partir de
Fig. N°1. Esquema de la Hematopoyesis para producción de los
componentes de la sangre
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células pluripotentes, en un proceso finamente regulado y con la participación de
diversas citoquinas y receptores para las mismas. Los leucocitos forman parte del
sistema inmune, el que se incluye entre los mecanismos biológicos destinados a
mantener la organización estructural y funcional de los individuos y está
genéticamente programado para la neutralización y eliminación, tanto de agentes
infecciosos, células y moléculas extrañas [1]
Plaquetas
Son pequeñas células que circulan en la sangre; participan en la formación de
coágulos sanguíneos y en la reparación de vasos sanguíneos dañados. Las plaquetas
son producidas en el proceso de formación de las células sanguíneas llamado
(trombopoyesis) en la médula ósea, por fragmentación en los bordes citoplasmáticos
de los megacariocitos. Desempeñan un papel fundamental en la hemostasia
(mecanismos para la detención de hemorragias en el organismo) y son una fuente
natural de factores de crecimiento. Estas circulan en la sangre de todos los mamíferos
y están involucradas en la hemostasia, iniciando la formación de coágulos o trombos
[6].
Plasma Sanguíneo
El plasma sanguíneo es la porción líquida de la sangre en la que están inmersos
los elementos formes. Es salado y de color amarillento traslúcido y es más denso que
el agua. El volumen plasmático total se considera como de 40-50 mL/kg peso. El
plasma sanguíneo es esencialmente una solución acuosa de composición compleja
conteniendo 91% agua, y las proteínas el 8% y algunos rastros de otros materiales
(hormonas, electrolitos, etc.). Estas proteínas son: fibrógeno, globulinas, albúminas y
lipoproteínas. Otras proteínas plasmáticas importantes actúan como transportadores
hasta los tejidos de nutrientes esenciales como el cobre, el hierro, otros metales y
diversas hormonas. Los componentes del plasma se forman en el hígado (albúmina y
fibrógeno), las glándulas endocrinas (hormonas), y otros en el intestino. Además de
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vehiculizar las células de la sangre, también lleva los alimentos y las sustancias de
desecho recogidas de las células. El suero sanguíneo es la fracción fluida que queda
cuando se coagula la sangre y se consumen los factores de la coagulación [4].
2.2 Análisis y recolección de muestras de sangre
El estudio de la sangre es fundamental en la etapa de diagnóstico y control de la
evolución en las enfermedades hematológicas. Los procedimientos para los análisis de
sangre son dependientes de la calidad de las muestras la cual debe ser recolectada,
identificada, transportada y almacenada adecuadamente para no provocar hemólisis
(desintegración de los glóbulos rojos) todo lo cual contribuirá a un buen análisis de la
muestra [7].
En primer lugar una muestra de sangre lleva algunos componentes para
preservar su constitución, a continuación se mencionan estos, juntos con otros
aspectos a tomar en cuenta para el análisis y recolección de muestras [1].
Fig. N°2. Diagrama resumen de la composición de la sangre.
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Anticoagulantes
Cuando la sangre se recibe en frascos sin anticoagulantes ésta se coagula dentro
de los 5 a 10 minutos de recolectada la muestra. Luego se produce la retracción del
coágulo liberándose el suero. Cuando se requiere obtener plasma (contiene los
factores de la coagulación), estudiar algunas propiedades de la sangre total o analizar
algunos de sus componentes celulares es necesario agregar un anticoagulante. Es
importante el tipo de anticoagulante, la concentración del mismo y la relación
sangre:anticoagulante; cuando ésta es no es correcta pueden ocurrir importantes
errores. Las sales de sodio o potasio son los tipos de anticoagulantes más efectivos y
usados, puesto que no se produce hemólisis ni deformación celular. Algunos de los
anticoagulantes más usados [4]:
- EDTA (Ácido Etilendeaminotetraacético): La coagulación requiere de iones
calcio (Ca2+), por lo que su quelación inhibe el proceso, uno de los agentes
quelantes más utilizados es el EDTA, la concentración recomendada es de 1 a
5 ppm [8].
- Citrato de Sodio: Inhibe la coagulación porque precipita de los iones calcio
La concentración sugerida es de 109 mM y se debe usar en una relación 9:1;
se utiliza en las pruebas de hemostasia [8].
- Heparina: La inhibición de la coagulación la realiza aumentando
significativamente la velocidad de acción de la antitrombina III, inhibidor
natural de las serino-proteasas de la coagulación, y causa menos hemólisis
que el EDTA concentración recomendada es de 15 a 20 ppb [4].
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Recolección de Muestras
Los tubos son los elementos más usados para la recolección de muestras de
sangre. Estos pueden ser al vacío (aspiran automáticamente la sangre) o no, de
plástico o vidrio, con o sin anticoagulante. Pueden diferenciarse por el color de la tapa
del tubo, según si contienen o no anticoagulante y en el primer caso identifican el
anticoagulante; los colores usados internacionalmente son: rojo (sin anticoagulante),
lila (EDTA), celeste (citrato de sodio) [4].
Antes de la recolección de la muestra, el primer paso es una adecuada
identificación del (los) tubo(s) en que se depositará la muestra; al menos debe incluir
el nombre y apellido del paciente, examen, y fecha [4].
2.2.1 Tipos de recolección
Entre los tipos de recolección más común podemos destacar:
Fig. N°3. Estructuras químicas de anticoagulantes más utilizados en la toma
de muestras de sangre [4].
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Punción Venosa: la típica punción venosa, El material a usar en la punción
venosa debe ser estéril
(jeringa desechable). El
tamaño de las agujas
dependerá de la cantidad de
sangre a recolectar y de la
edad del paciente; una
combinación de un número y
una letra indica el diámetro y longitud, así por ejemplo la más usada 21G1
indica que la aguja tiene un diámetro de 21 mm y 4 cm de longitud. Se deben
descartar las zonas que presentan hematomas, quemaduras, cicatrices y
edema. Las posibles venas a puncionar deben ser evaluadas aplicando un
torniquete por un período no superior a 1 minuto, ya que un mayor tiempo se
asocia con hemoconcentración. Antes de la punción se debe limpiar la zona
elegida con un algodón impregnado en alcohol 70%, luego se debe fijar la vena
traccionando suavemente la piel, introducir la aguja en el mismo sentido de la
vena y liberar inmediatamente el torniquete; la sangre debe ser aspirada
suavemente. Luego se retira la jeringa y con un algodón se presiona el lugar de
punción para evitar sangramiento. Antes de depositar la sangre en el tubo se
retira la aguja, la sangre se agrega lentamente por las paredes del tubo. Luego
de tapar ésta (si no es al vacío) y si la sangre fue recolectada en un tubo con
anticoagulante, se mezcla inmediatamente por inversión en forma suave, para
evitar alteraciones y daño celular [8, 4].
Punción Capilar: Cuando por diversas razones no se puede realizar la punción
venosa o la cantidad de la muestra
requerida es pequeña, se puede
obtener sangre por punción capilar. La
sangre capilar es obtenida por una
Fig. N°4. Ilustración de punción venosa directa [8]
Fig. N°5. Ilustración de punción capilar y
sitios adecuados para la punción en pie y
mano [8]
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punción con una lanceta; en adultos y niños el lugar a elección es la parte
lateral de un dedo de la mano y en recién nacidos es la parte lateral de la planta
del pie. Se debe hacer una punción fuerte y certera, se elimina la primera gota
de sangre y para tener una adecuada recolección se debe presionar muy
suavemente, evitando la salida de líquido tisular [8, 4].
2.2.2 Almacenamiento y transporte de muestras de sangre
Dentro de la primera hora de tomada la muestra de sangre los cambios en las
células sanguíneas son imperceptibles; éstos se hacen más importantes a partir de las
tres horas hasta completarse a las 8 horas, a temperatura ambiente. Las alteraciones
incluyen: leucocitos, desintegración de los glóbulos rojos, incremento del hematocrito,
y también alteración del tamaño y distribución de las plaquetas. Todas estas
alteraciones son evitables si la muestra de sangre se almacena a 4ºC [1].
Cuando una muestra de sangre va a ser transportada se deben tomar
precauciones para evitar las alteraciones descritas; aunque el transporte se realice
entre lugares cercanos se aconseja hacerlo en contenedores refrigerados [8].
Las condiciones para las pruebas de coagulación son más exigentes que para
análisis regulares de sangre [1].
2.2.3 Tinción de May Grünwald-Giemsa
Es una técnica de tinción derivada del método de Romanowsky que se utiliza
principalmente para el coloreo de muestras de frotis (extendido de sangre sobre un
portaobjeto) sanguíneos o extendidos de médula ósea. Emplea dos soluciones
colorantes [8]
La solución de May-Grünwald, que contiene el colorante ániónico eosina y el
colorante catiónico azul de metileno ambos disueltos en metanol. La solución de
Giemsa, que contiene eosina, azul de metileno y una serie de productos de la oxidación
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de este último tales como el azur A, el azur B, el violeta de metilo y el azul de metilo
[8].
Todos estos colorantes se encuentran en estado no ionizado mientras se
mantienen en solución de alcohol metílico, pero al añadir agua se ionizan y se unen
selectivamente a los constituyentes celulares precipitando como sales insolubles. Los
componentes celulares de naturaleza aniónica (ácida) se unen selectivamente a los
tintes catiónicos tiñéndose en variados tonos de azul. Estos componentes son
llamados basófilos: (ADN, mitocondrias, ribosomas y citoplasma de células ricas en
ARN). Los componentes celulares de naturaleza catiónica (básicos) se unen
selectivamente al tinte ácido eosina, tiñendose en variados tonos de naranja y rojo. A
estos elementos se los denomina acidófilos o eosinófilos. Este es el caso de la
hemoglobina, y de las proteínas contenidas en las granulaciones de los granulocitos
eosinófilos. Los componentes celulares que tienen afinidad por ambos tipos de
colorantes se denominan neutrófilos y se tiñen en variados tonos de violeta [1].
2.3 Hemograma
El hemograma es un examen hematológico fundamental. El estudio cuantitativo
y citológico de las células sanguíneas, permite avanza significativamente en la mayoría
de las enfermedades hematológicas, en que los glóbulos rojos, leucocitos y/o
Fig. N°6. Tinción May Grünwald-Giemsa
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plaquetas se ven afectados, ya sea por la falta de producción en la médula ósea o por
destrucción periférica. En la actualidad, se recomienda expresar los resultados de los
parámetros biológicos de acuerdo con el llamado sistema internacional de unidades
[1].
La forma clásica de expresar el hematocrito (Hto) en porcentaje (%) ha sido
substituida por las unidades correspondientes de acuerdo con el sistema SI. Debido a
que el Hto corresponde a la relación existente entre el volumen de hematíes y el de
sangre total, su unidad resulta de un cociente entre dos unidades de volumen
idénticas (L/L), por lo que equivale a 1. De acuerdo con ello, un Hto de 45%
corresponde según el sistema SI a 0.45 L/L o simplemente 0,45 [4, 8].
La de hemoglobina es el parámetro hematológico cuya forma de expresión ha
sido más discutida. Así mientras se ha preconizado expresarlo en milimoles por litro
(mmol/L), todavía se considera aceptable hacerlo en gramos por litro (g/L). La
variación del nuevo valor con respecto al de concentración de hemoglobina expresada
en unidades clásicas (g/dL) [4].
La información cualitativa y cuantitativa que proporciona el hemograma
podemos separarla en globulos rojos y blancos.
Tabla N°1. Ejemplo de un hemograma [4]
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Glóbulos rojos
El hematocrito corresponde al volumen de glóbulos rojos expresado
porcentualmente respecto a un volumen de sangre; de esta forma provee
un valor estimativo del grado de anemia. El valor del hematocrito se
obtiene por centrifugación de sangre anticoagulada. El procedimiento es
simple y reproducible. Brevemente, a un capilar (7.5 cm x 1 mm), se
agrega sangre anticoagulada con EDTA y luego de sellar un extremo se
centrifuga (5 min. a 12.000 r.p.m). Realizado el procedimiento sepueden
distinguir tres capas: glóbulos rojos,“buffy coat” (glóbulos blancos y
plaquetas), y plasma. El porcentaje de hematíes (hematocrito), se obtiene
a partir de una tabla graduada [8, 1].
La función primordial de la hemoglobina, principal proteína de los
glóbulos rojos, es transportar el oxígeno y el dióxido de carbono hacia y
desde los tejidos, respectivamente. Su determinación ayuda a establecer
el grado de la anemia. Para determinar la concentración de la
hemoglobina en la sangre, se utiliza el método de la
cianmetahemoglobina (HiCN), recomendado por el “International
Committee for Standarization in Hematology” (ICSH). Brevemente, la
sangre es diluida con el reactivo de Drabkin (incluye ferricianuro de
potasio y cianuro de potasio). Todos los tipos de hemoglobina son
oxidadas por el ferricianuro de potasio a metahemoglobina, que en
presencia de ferricianuro de potasio forma un compuesto estable,
cianmetahemoglobina. Para determinar la concentración de las muestras
se debe interpolar en una curva de calibración previamente preparada
usando un estándar [8, 1].
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La relación entre hematocrito y hemoglobina o recuento de glóbulos
rojos permite obtener índices que ayudan a clasificar las anemias según el
tamaño y cromia de los glóbulos rojos. Las constantes más usadas son
Volumen Corpuscular Medio (VCM) y Concentración de Hemoglobina
Corpuscular Media (CHCM) [8].
Hay también otras anomalías de tipo cualitativas, como cambio en la forma o en
el color de los glóbulos y a la presencia de agentes extraños en su estructura.
Glóbulos blancos
Las alteraciones que pueden presentar los leucocitos en el hemograma son de
dos tipos, cuantitativos y cualitativos (citológicos).
El recuento normal de leucocitos fluctúa entre 5.000–10.000/μL y en
recién nacidos entre 15.000-20.000/μL.
El extendido o frotis sanguíneo, es un elemento muy importante en la
realización del hemograma. Es posible obtener información con respecto
a la morfología de las tres series sanguíneas glóbulos rojos, leucocitos, y
plaquetas. Adicionalmente, el citohematólogo experimentado puede tener
una apreciación sobre aspectos cuantitativos: índices hematológicos,
recuento de leucocitos y recuento de plaquetas [8].
3. Citometría Hemática
Se refiere a la medición de las células de la sangre (citos = células; metro =
medida). La interpretación correcta de éste análisis permite establecer diagnósticos
definitivos sobre las enfermedades sanguíneas. La evaluación correcta de los
parámetros citomorfológico de la citometría hemática completa (CHC) ofrece
información acerca de los padecimientos primarios del tejido hematopoyético, y de
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otros trastornos no hematológicos y permite ampliar la variedad de diagnósticos
diferenciales [9, 10].
Consta de 2 partes;
1.- Fórmula roja: Determina los parámetros relacionados con los eritrocitos.
2.- Fórmula blanca: Determina los parámetros relacionados con los leucocitos.
La biometria hematica completa generalmente incluye los siguientes
componentes [11]:
- Recuento de leucocitos
- Recuento diferencial leucocitario
- Conteo de glóbulos rojos (RBC o recuento de eritrocitos)
- Hematocrito (Hct) o valores normales de hemoglobina (HBG)
- El volumen corpuscular medio
- Hemoglobina corpuscular media (promedio en cantidad de la
hemoglobina en los glóbulos rojos)
- La concentración media de hemoglobina corpuscular (la
concentración media de hemoglobina en un volumen dado de sangre).
- El recuento de plaquetas:
- El volumen medio de plaquetas (MPV) es una medida que
describe el tamaño medio de las plaquetas en la sangre [4].
Las técnicas para realizar éstas mediciones van desde técnicas instrumentales
como espectrofotometría, utilizando de colorímetros, entre otras. A continuación se
describen algunas técnicas relacionadas.
3.1 Determinación de Hematocrito
Puede determinarse por métodos manuales o métodos automáticos. Los
métodos manuales consisten en la centrifugación de la muestra de sangre y los
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métodos automáticos pueden basarse en el cálculo de estos a partir de valores de
VCM, o el análisis de la sombra que produce la población eritrocitaria, al reflejarse en
un campo oscuro [8].
3.2 Determinación de Leucocitos
La sangre anticoagulada se deposita en un
líquido que permite evidenciar los leucocitos,
manteniéndolos visibles. La cámara de Neubauer es
una cámara de contaje adaptada a un microscopio de
campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un
porta-objeto con una depresión en el centro, en el
fondo de la cual, con la ayuda de una punta diamante,
se ha marcado una cuadricula [8, 11].
4. ADN y ARN
Los ácidos nucleicos son los componentes más fundamentales de la célula viva.
Parece probable que la vida en sí empezara su evolución con los ácidos nucleicos,
puesto que éstas son las únicas sustancias biológicas que poseen la propiedad de
autoduplicación. Hoy en día, los ácidos nucleicos actúan como depositarios y
transmisores de la información genética de cada célula, tejido y organismo. Existen
dos tipos de ácido nucleico el ARN (ácido ribonucleico) y el ADN (ácido
desoxirribonucleico). Cabe mencionar que estas estructuras son tan importantes que
“Los planos para la construcción de un organismo están codificados en su ácido
Fig. N°7. Identificación de áreas para el conteo
de eritrocitos y leucocitos.
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nucleico” [2, p. 95] en moléculas de gran tamaño como la que se muestra en la Fig. N°
8.
Gran parte del desarrollo físico de un organismo a lo largo de su vida está
programado en estas moléculas. Las proteínas que elaboran sus células y las funciones
que realizarán están todas registradas en esta “cinta” molecular [2]. Por ello el estudio
de sus propiedades, de su estructura, entre otras características, ha sido de gran
interés para la ciencia, a continuación brevemente se hará un recuento de la
investigación evolutiva de estas estructuras ADN y ARN hasta la actualidad.
Desde finales de los años 50 y la década de los 60, los investigadores en busca
del origen de la vida admiten cada vez más la naturaleza específica y compleja de la
vida unicelular y de las biomacromoléculas de las que dependen esos sistemas.
Además, estos investigadores han caracterizado esta complejidad y especificidad en
términos de información. Haciendo referencia al ADN, ARN y a las proteínas como
portadores o depósitos de “información”. Infiriendo que la vida se origino de la
información contenida en estas biomacromoléculas [12].
Durante gran parte del siglo XX, ya los investigadores conocían la composición
química del ADN, sabían que además de fosfatos, el ADN se componía de cuatro bases
nucleotídicas diferentes, llamadas adenina (A), timina (T), guanina (G) y citosina (C), y
que el ARN difería con respecto al ADN en que la T estaba reemplazada por (U)
uracilo, en la Fig. N°9, se muestra las estructuras de las unidades monoméricas del
ADN Y ARN. En 1909, el químico P. A. Levene propuso que las cuatro bases
Fig.N°8. ADN de un solo cromosoma humano [18]
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nucleotídicas siempre se daban en cantidades iguales dentro de la molécula de ADN.
Él formuló lo que llamó la “hipótesis tetranucleotídica”, luego está más tarde resultó
incorrecta [12].
Como consecuencia esta concepción comenzó a cambiar a mediados de los años
40 por varias razones. En primer lugar, los famosos experimentos de Oswald Avery
fueron cruciales ya que apuntaron al ADN como material genético, debido a que los
estudios sobre cepas virulentas y no virulentas de Pneumococcos identificaron el ADN
como un factor clave a la hora de explicar las diferencias hereditarias entre distintas
estirpes bacterianas. En segundo lugar, Erwin Chargaff, de la Universidad de
Columbia, a finales de los años 40 puso en duda la “hipótesis tetranucleotídica”.
Chargaff demostró, en contradicción con los primeros trabajos de Levene, que las
frecuencias de nucleótidos difieren realmente entre especies, incluso cuando a
menudo dichas frecuencias se mantienen constantes dentro de las mismas especies o
dentro de los mismos órganos o tejidos de un único organismo [2, 12]
Y por último mediante estos experimentos se había llegado a la conclusión de
que el ADN era una sustancia genética, surgiendo así nuevas preguntas, ¿Cómo podría
transmitir esa información a la célula?, Esta respuesta fue encontrada tras el
Fig.N°9. Estructuras químicas [2]
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descubrimiento de la estructura tridimensional del ADN por Watson y Crick en 1953.
El modelo propuesto por Watson y Crick concebía “una estructura de doble hélice
para explicar la forma de cruz de Malta de los patrones obtenidos por los estudios del
ADN realizados por Franklin, Wilkins y Bragg a comienzos de los años 50 mediante
cristalografía de rayos X” en la Fig. N°10 , se muestra una fotografía de difracción de
rayos X producido por fibras de ADN húmedas [2, 12]
De acuerdo con el modelo de Watson y Crick, ahora bien conocido, las dos
hebras de la hélice estaban hechas de moléculas de azúcar y fosfato unidas por enlaces
fosfodiéster. Las bases nucleotídicas estaban unidas horizontalmente a los azúcares en
cada una de las hebras de la hélice y a una base complementaria de la otra hebra para
formar un “peldaño” interno en una “escalera” torsionada. Por razones geométricas,
su modelo requería el apareamiento (a lo largo de la hélice) de adenina con timina y
de citosina con guanina [12]
Estos descubrimientos pronto demostraron que las secuencias de ADN no solo
eran muy complejas sino también altamente específicas en lo relativo a sus
requerimientos biológico-funcionales. El descubrimiento de la complejidad y la
especificidad de las proteínas habían llevado a los investigadores a sospechar un
papel funcional específico para el ADN. La estructura del ADN descubierta por Watson
y Crick sugería un medio por el que la información o la especificidad podían
codificarse a lo largo de la espiral del esqueleto de azúcar-fosfato. Su modelo sugería
que las variaciones en la secuencia de bases nucleotídicas pudieran encontrar
Fig.N°10. Pruebas sobre la esctructura del ADN [2]
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expresión en la secuencia de aminoácidos que forman las proteínas. La hipótesis de
secuencia sugería que las bases nucleotídicas en el ADN funcionaban como letras de
un alfabeto o caracteres en una máquina de codificar. Del mismo modo como las letras
de un alfabeto en un lenguaje escrito pueden realizar la función de comunicación
dependiendo de su secuencia, igualmente podrían las bases nucleotídicas del ADN
originar la producción de una molécula funcional de proteína dependiendo de su
preciso ordenamiento secuencial [2, 12]
Por otro lado los ácidos nucleicos mencionados anteriormente ADN y ADN están
involucrados en la síntesis de proteínas o “expresión génica” la cual consistía en
primer lugar en la copia de largas cadenas de bases nucleotídicas durante un proceso
conocido como transcripción. Es decir, para que la información contenida en el ADN
pueda ser utilizada por las células debe transcribirse a una molécula de ARN, donde la
molécula de ARN se copia fielmente a partir de la molécula de ADN. La copia
resultante, un “transcrito”, fabrica una hebra sencilla de “ARN mensajero” que ahora
contenía una secuencia de bases de ARN que refleja con precisión la secuencia de
bases de la hebra original de ADN. El transcrito es entonces transportado hasta un
orgánulo complejo denominado ribosoma. En el ribosoma, el transcrito es “traducido”
con ayuda de moléculas adaptadoras altamente específicas (llamadas ARN-
transferentes) y de enzimas específicas (llamadas aminoacil ARNt sintetasas) para
producir una cadena de aminoácidos en crecimiento [12]
Se puede inferir de lo antes mencionado que un gen está compuesto, por una
secuencia lineal de nucleótidos en el ADN, dicha secuencia determina el orden de los
aminoácidos en las proteínas. Sin embargo el ADN no proporciona directamente de
inmediato la información para el ordenamiento de los aminoácidos y su
polimerización, sino que lo hace a través de otras moléculas, los ARN.
Como se ha mencionado anteriormente, la ciencia ha seguido una investigación
constante acerca de estas biomoléculas como son el ADN, ARN y las proteínas, por
nombrar algunas de las tecnologías que se están utilizando actualmente, se
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encuentran: seguimiento óptico de nanopartículas de sílice modificado
orgánicamente, como vehículos de ADN: Un enfoque no viral de la nanomedicina para
la entrega de genes [13]. Estudio de Nanoparticulas bioconjugadas para la protección
del ADN de escisión, la ingeniería genética ha traído consigo nuevos retos y
oportunidades para la medicina y la investigación biomédica. Sin embargo, la
ingeniería genética la tecnología está limitada en las manipulaciones de ADN porque
sus hebras se escinden en entornos celulares. Aunque se han tomado algunas medidas
para proteger el ADN de la escisión, tales como la adición de inhibidores en soluciones
de ADN y este atrapado en liposomas, estos métodos pueden dificultar aún más la
manipulación de ADN, por ello los nanomateriales con propiedades únicas como gran
superficie de área, estructura de poros, efecto encajado, y el efecto del tamaño; han
sido utilizados con eficacia en bioanálisis y la administración de fármacos. Es por lo
tanto que utilizando estos se espera puedan proteger a las secuencias de ADN
incrustados debido a sus grandes estructuras de superficie y poros [14], la Fig. N°11,
muestra una micrografía correspondiente a las nanoparticulas utilizadas en este
estudio.
Otras investigaciones utilizan dendrímeros que forman complejos con el ADN en
la utilización de vectores no virales en la liberación de material genético. Los
dendrímeros son polímeros que presentan estructuras con dimensiones
Fig.N°11. Imagen TEM de las nanopartículas de sílice modificada
con amino (45 ± 4) nm [14]
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nanométricas, baja polidispersión y una alta densidad funcional en la superficie con
un pequeño volumen molecular. La Fig. N°12 muestra un esquema del mecanismo de
acción del complejo dendrímero-plásmido ADN el cual se inicia con una interacción
entre el complejo y la membrana celular
seguida de una endocitosis dependiente de
energía. El ADN o el complejo debe salir de la
cavidad endosómica-lisosómica, sin que se
produzca la degradación ácida o enzimática,
y alcanzar el núcleo en donde se produce la
transcripción sobre el mRNA y éste en el
citosol codifica la proteína terapéutica [15, 16]
4.1 Tecnología (PCR) para generar copias de secuencias de ADN
Las técnicas de biología molecular actuales están basadas en la manipulación y
detección de gran número de moléculas y los pasos para realizar proyectos consisten
en la amplificación de secuencias de ADN [17].
Tradicionalmente, la amplificación del ADN se ha realizado in vivo, mediante un
proceso conocido de forma genérica como clonación. Ésta abarca la manipulación,
replicación del ADN y la transformación de células con dicho ADN, hasta alcanzar un
número suficiente que permita su estudio por las técnicas clásicas [17].
Sin embargo estos estudios presentan como desventaja que con llevan procesos
muy laboriosos. Actualmente se ha empleado como tecnología la amplificación de ADN
mediante nuevos métodos de secuenciación como lo es la llamada Reacción en Cadena
de la Polimerasa (PCR; del inglés, “Polymerase Chain Reaction”). Se puede considerar
la PCR como una clonación in vitro, ya que se puede amplificar en un tubo de ensayo
Fig.N°12. Representación esquemática
de la internalización celular de
plásmidos asociados a dendrímeros y
transcripción de la proteína terapéutica.
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una secuencia de DNA determinada muchas veces y además en un tiempo mínimo de
horas o incluso minutos. La PCR puede sustituir a la clonación in vivo clásica en
muchos casos, siendo en otros un aliado esencial para simplificar el proceso e
incrementar la probabilidad de éxito [17, 18].
Abarcando un poco de historia en 1985, el químico Kary Mullis desarrolló la
técnica PCR permitiendo la amplificación exponencial de una molécula de ADN,
generando millones de copias de un fragmento. Esto se lleva a cabo con
oligonucleótidos que contienen un grupo extremo 3´ libre, que es complementario con
la cadena molde de ADN. Los “oligos” funcionan como punto de inicio para la adición
de nucleótidos y para copiar la cadena molde en el PCR. Una vez que el
oligonucleótido se une a su blanco, la polimerasa de ADN puede seguir extendiendo la
hebra complementaria. En una reacción típica de PCR se usan dos oligonucleótidos
que flanquean la región de ADN que se desea amplificar. El número de copias del
fragmento de ADN que se encuentra entre los dos oligonucleotidos se amplifica con
varios ciclos de reacción. Cada ciclo de una reacción de PCR consta de tres pasos,
como se muestra en la Fig. N°13. Estos tres pasos de desnaturalización, hibridación y
polimerización se repiten “n” veces, duplicándose en cada ciclo el número de cadenas
delimitadas por los oligos [18].
Fig.N°13. Ciclo de reacción de PCR [18].
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4.1.1 Pasos del método de secuenciación PCR
- Desnaturalización: “El templado es el fragmento de ADN que se desea
amplificar, junto con la región que reconocen los oligonucleótidos. Para que
el oligonucleótido se pueda unir, es necesario que el templado sea de cadena
sencilla” (9 pág. 23). Es decir, este paso es para separar las cadenas de ADN,
esto se consigue incrementando la temperatura, con una incubación breve
del tubo de reacción a 94 ºC [17].
- Hibridación o apareamiento de los oligos al DNA molde. Para ello se baja la
temperatura de reacción, de forma que pequeñas secuencias de ADN se unan
a sus secuencias complementarias [17, 18].
- Extensión de la cadena de ADN: Se consigue elevando la temperatura de
reacción normalmente a 72°C, la cual es óptima para la polimerasa de DNA.
En este paso, la polimerasa extiende la cadena complementaria del templado.
La síntesis de la cadena complementaria tiene como punto de inicio el
complejo oligonucleótido/templado. El tiempo de incubación de este paso
depende del tamaño del segmento que se desea amplificar. El resultado son
dos hélices completas Watson & Crick en la región delimitada por los oligos.
Por lo cual se puede inferir que se duplica el número inicial de moléculas de
ADN [17, 18].
Actualmente esta técnica tiene gran importancia en biología molecular para
amplificar secuencias de ADN que luego son fácilmente clonadas y/o secuenciadas.
Asimismo, tiene otras múltiples y muy interesantes aplicaciones. Por ejemplo, para
generar mutaciones aleatorias o dirigidas; identificar genes expresados de forma
diferencial; rastrear rápida y eficientemente bibliotecas génicas; construcción de
bibliotecas sustractivas de cDNA (“subtractive cDNA libraries”); secuenciar mediante
secuenciación cíclica; entre otras [17].
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5. Conclusiones
La Hematología es una rama esencial para el desarrollo en el diagnóstico de
enfermedades y anomalías relacionadas con la sangre, el fluido más importante,
después del agua, en nuestro cuerpo; por tanto su estudio conlleva a una mejor
comprensión de todos los parámetros y variables relacionados con la sangre.
Obtener herramientas para la interpretación de los hemogramas es otra parte
fundamental de los estudios en hematología, así como las técnicas analíticas
necesarias para el análisis cuantitativo y cualitativo de las diferentes células que
componente la sangre, todo esto mediante la citometria hemática, o biometría
hemática completa
Otra parte importante de nuestro funcionamiento como seres humanos, a parte
de los fluidos sanguinos, son las proteínas, las funciones de éstas en nuestro
organismo son de suma importancia y vienen dictadas por las secuencias de
aminoácidos, y estas a su vez dependen de la secuencia de bases de ADN, ya que las
secuencias de las regiones codificantes del ADN poseen un alto grado de especificidad.
El ADN se copia a ARN en un proceso que se llama "transcripción", se puede
inferir que transcribe un texto, es decir lee y lo copia, pero no se copia a otra molécula
de ADN sino a una molécula de ARN. Estas moléculas, luego, van a ser "leídas" por un
ribosoma, en un proceso llamado "traducción".
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6. Bibliografía
[1] J. San Miguel y F. Sanchez-Guijo, Hematologia: Manual Basico Razonado,
Barcelona: Elsevier, 2009.
[2] C. Mathews, K. Holde y A. K, Bioquímica, España: Pearson, 2008.
[3] J. A. Méndez Aranguren y colaboradores, «Los microsatélites (STR´s), marcadores
moleculares de ADN por excelencia para programas de conservación: una
revisión,» vol. 13, nº 1, pp. 30-42, 2005.
[4] J. Palomo, J. Pereira y J. Palma, Hematologia: Fisiopatologia y Diagnostico, Talca:
Editorial Universidad de Talca, 2009.
[5] R. Tallitsch, M. Frederic y T. Michael, Human anatomy, San Francisco:
Pearson/Benjamin Cummings, 2006.
[6] J. Pereira, «Estructura, producción, cinética y función de las plaquetas,» de
Fisiología de la sangre, Universitaria, 1993.
[7] J. Henry, Clinical diagnosis and managementby laboratory methods, Philadelphia:
WB Saunders, 1996.
[8] E. Anne, Clinical Hematology principles, procedures, correlations, Ed. Lippincott
Williams & Wilkins, 1998.
[9] R. Argüelles, «Capitulo 2: Citometria Hematica,» de Fundamentos de Hematologia,
Barcelona, Editorial Medica Panamericana, 2009, pp. 13-32.
[10] R. Monrroy y Y. Ortiz, «Semiología de la citometria hematica,» Revista de la
Facultad de Medicina de la UNAM , vol. 53, nº 4, pp. 36-43, 2010.
[11] R. Argüelles, Fundamentos de Hematologia, Barcelona: Editorial Medica
Panamericana, 2009.
[12] S. C. Meyer, «El ADN y el Origen de la Vida: Información, Especificidad y
Explicación».
[13] R. Indrajit y colaboradores, «Optical tracking of organically modified silica
nanoparticles as DNA carriers: A nonviral, nanomedicine approach for gene
delivery,» vol. 102, nº 2, pp. 279-284, 2005.
[14] H. Xiao-xiao y colaboradores, «Bioconjugated Nanoparticles for DNA Protection
from Cleavage,» vol. 125, nº 24, 2003.
[15] V. Jato y J. Luis, «NANOTECNOLOGÍA FARMACÉUTICA: UNA GALÉNICA
EMERGENTE,» 2006.
[16] S. L. Pal y colaboradores, «Nanoparticle: An overview of preparation and
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Hematología Básica, ADN-ARN
Castillo, Yaviely;Centeno, Bárbara
26
characterization,» vol. 1, nº 6, pp. 228-234, 2011.
[17] G. D. Pérez, «Amplificación de DNA mediante PCR (Reacción en Cadena de la
Polimerasa)».
[18] R. Campion De Necochea, «Métodfos Fisicoquímicos en Biología: Secuenciación
de Ácidos Nucleicos,» 2004.
Contenido
1. Introducción ........................................................................................................................................ 1
2. Hematología Básica .......................................................................................................................... 2
2.1 Sangre y sus componentes ..................................................................................................... 2
2.2 Análisis y recolección de muestras de sangre ................................................................ 5
2.2.1 Tipos de recolección ........................................................................................................ 7
2.2.2 Almacenamiento y transporte de muestras de sangre ...................................... 9
2.2.3 Tinción de May Grünwald-Giemsa ............................................................................. 9
2.3 Hemograma .............................................................................................................................. 10
3. Citometría Hemática .................................................................................................................... 13
3.1 Determinación de Hematocrito ........................................................................................ 14
3.2 Determinación de Leucocitos ............................................................................................ 15
4. ADN y ARN ........................................................................................................................................ 15
4.1 Tecnología (PCR) para generar copias de secuencias de ADN ............................ 21
4.1.1 Pasos del método de secuenciación PCR .............................................................. 23
5. Conclusiones .................................................................................................................................... 24
6. Bibliografía........................................................................................................................................ 25