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Todo lo que quisiste saber del ribosoma shunting y que este paper no contestará
Balcazar D., Gangemi M., Gómez Acuña L.
Traducción en eucariotas
Mediante el reclutamiento cap-dependiente del complejo ternario, seguido de un escaneo lineal de la subunidad 40S.
Encuentra el primer codón AUG en el contexto de iniciación apropiado, y la subunidad 60S puede unirse comenzando la traducción.
INICIO de la TRADUCCIÓN
Durante estrés celular, este mecanismo es inhibido, y se activan mecanismos de iniciación alternativos que estimulan la traducción de una variedad de proteínas importantes para responder a este estrés.
Algunos factores a tener en cuenta
Reconoce el CAP: importante para el escaneo de la subunidad 40S
Importante para la formación del complejo ternario, posibilitando cargar el tRNA-Met sobre la subunidad 40S.
1°) en la región 5’ UTR, la presencia de cortos upstream open reading frames (uORFs), inhiben la traducción del mRNA.
Durante la traducción de un uORF, otros complejos ribosomales no pueden unirse al mRNA. Si el uAUG es reconocido eficientemente, o cuando la elongación y/o terminación se da muy lentamente, causa una fuerte inhibición de la traducción del principal ORF.
TRES MECANISMOS ALTERNATIVOS para facilitar o regular el acceso del ribosoma al codón AUG adecuado.
mRNAs ATF4 y GCN4: es un mecanismo de reiniciación regulado (saltear uORFs al verdadero codón de inicio).
… Pero, en algunos casos, permite una activación relativa cuando el complejo ternario es limitado por la fosforilación de eIF2.
TRES MECANISMOS ALTERNATIVOS…
2°) ribosomas pueden saltearse el cap y ser reclutados al mRNA por un internal ribosome entry site (IRES).
Proteasa del picornavirus (poliovirus)
TRES MECANISMOS ALTERNATIVOS…
3°) involucra la translocación del ribosoma de una región upstream shunt donor a una downstream shunt acceptor en un mRNA. Se lo conoce como ribosome shunting.
Cauliflower mosaic virus (CaMV)
TRES MECANISMOS ALTERNATIVOS…
En este trabajo se estudió la traducción del mRNA cIAP2.
La proteína anti-apoptótica cIAP2: inhibidor directo de caspasas activas (mediadores esenciales de los procesos de apoptosis) y además posee actividad de ligasa ubiquitina E3, mediando la poliubiquitinación y degradación de proteínas apoptóticas como Smac/Diablo y RIP.
cIAP2 es un oncogen, y su sobreexpresión ha sido asociada con progresión neoplásica en una variedad de cánceres.
Su expresión es altamente regulada tanto a nivel transcripcional y traduccional.
Contiene una región 5’ UTR muy larga (2.83-kb), donde hay 64 uAUGs río arriba del verdadero, mostrados en el diagrama lineal.
¿Por que empleamos este mRNA cIAP2?
Parece muy improbable que el mecanismo predominante de iniciación de traducción fuese por escaneo mediado por ribosomas.
Entonces, examinaron esta región 5’UTR por su potencial capacidad de mediar la síntesis de proteínas mediante un mecanismo alternativo.
Objetivos generales
• Determinar si la región 5´no codificante del mRNA de cIAP2 media la iniciación de la traducción vía ribosome shunting.
• Determinar si el inicio de la traducción de este mensajero es modulada durante estés celular.
Estrategia experimental general
5´UTR Fluc ORF
Distintas construcciones
35 nt poly A
Transcripción in vitro
(T4 RNA polimerasa, MpppG)
AAAAAAAAAAAAAAAAA
Traducción in vitro(Extractos no nucleares de HeLa)
Transfección transitoria de células 293T (células embrionarias humanas de riñón)
Medición de la actividad de luciferasa
Cantidades equimolares
• Determinar si la traducción de cIAP2 es cap dependiente y si es mediada por una secuencia IRES
Objetivo 1
¿Afecta el 5’UTR de cIAP2 a la traducción?
el 5’UTR del transcripto cIAP2 fue clonado inmediatamente upstream del gen reportero firefly luciferase (FLuc) (p-cIAP2-FL).
El 5’UTR de cIAP2 inició la traducción en un 25% con respecto al transcripto con 5’UTR corto y sin estructura (40-nt) en un contexto monocistrónico (p-FL).
IN VITRO
Transcripción in vitro: transcriptos m7G-capped and poly(A)-tailed.
Traducción en extractos no nucleados de células HeLa.
IN VIVO
Transfectados en células 293T.
Primero …
SI
Inserción de una estable estructura RNA hairpin (ΔG: - 60 kcal/mol) para prevenir el escaneo cap-dependiente
Reemplazo del m7G cap con un cap ApppG análogo que no puede unir al eIF4E, por lo que no hay escaneo.
Fueron traducidas en extractos de células HeLa (C) o transfectadas en
células 293T (D).
¿Hay escaneo cap-dependiente?.
Luego …
Estructura RNA hairpin inhibió la producción de FLuc by 98% (línea 2).
Cap ApppG inhibió la traducción del wild-type 5’UTR tanto en ausencia (lane 3) y presencia (lane 4) de RNA hairpin.
HAY TRADUCCIÓN CAP DEPENDIENTE
¿Hay escaneo cap-dependiente?. SI
Para testear una actividad potencial IRES de cIAP2 5’UTR.
RNA reportero dicistrónico conteniendo el HCV IRES o HCV IRES un invertido.
Tratadas con 1μM thapsigargin por 6h para inducir estrés ER, para ver si se activa este mecanismo.
¿La región 5’ UTR de cIAP2 media la traducción vía IRES?
Transfección de RNAs dicistrónicos en células 293T
No estresadas (condición normal)
No fue detectada traducción mediada por IRES en condiciones normales
No fue posible medir actividad de IRES cIAP2 inducida por estrés.
¿La región 5’ UTR de cIAP2 media la traducción vía IRES?
NO
5’UTR media la traducción via cap dependiente y no via IRES
¿Existe una explicación alternativa para es que esta región 5’UTR cIAP2 pueda traducir de una manera cap-dependiente?
Existe una conformación termodinámicamente estable, con importantes características estructurales dentro esta región, muy similares a las requeridas para el ribosome shunting de la 35S RNA de CaMV del pararetrovirus.
Ribosome shunting ocurre dentro de los 216-nucleótidos en la región 5’ UTR del mRNA HSP70 humano, estimulando su traducción durante heat shock.
Estas estructuras fueron muy bien conservadas en los transcriptos de algunos cIAP2 ortólogos.
¿Existe una explicación alternativa para es que esta región 5’UTR cIAP2 pueda traducir de una manera cap-dependiente?
• Determinar si el gen cIAP2 es traducido mediante ribosome shunting.
• Para ello, se realizaron cambios en las estructuras características del 5’UTR necesarias para este mecanismo (deleciones, mutaciones, etc), en CaMV.
• Se utilizaron construcciones con el 5’UTR modificado río arriba del gen de Fluc.
Objetivo 2
Esquema del experimento
LA TRADUCCIÓN EN UN 90 %
• Región doble cadena que forma un stem estable en 5’UTR es esencial para el ribosome shunting, facilitando la translocación del ribosoma desde el sitio donor hasta el aceptor.• Se delecionaron 55 nt de la misma.
Resultados
Resultados
LA TRADUCCIÓN EN UN 75 %
El apareamiento estable en esta región es esencialpara la eficiencia de traducción de cIAP2
Para confirmar que esta disminución en la eficiencia de la traducciónse debía a una pérdida en la estabilidad del stem, se cambiaron tres Gpor C en la base del mismo.
Resultados
LA TRADUCCIÓN EN UN 63% IN VITROY 81% IN VIVO
La traducción de un ORF corto localizado inmediatamente río arriba del stem, cumple un rol crítico facilitando la traducción de cIAP2
El Ribosome shunting en CaMV requiere la traducción de un uORF corto localizado inmediatamente río arriba del stem.Para evaluar el efecto de este uORF, se cambió el AUG del uORF2 por AUC.
A continuación se delecionaron los primeros 1230 nt del 5’UTR, reduciendosu largo original en un 44%. Hipótesis: la traducción se vería altamente reducida, ya que se removería el sitio donor de shunt completo, el uORF2 y una primera porción del stem.
Resultados
LA TRADUCCIÓN EN UN 60-65%
Se observa una disminución menor a la esperada.Es posible que la mutante haya utilizado un camino alternativo menos eficiente de shunting.Todavía quedan 27 AUG y varias estructuras stem menores, que inhibirían el scanning común.Trabajos anteriores demostraron que estas dos características son necesarias y suficientes para mantener bajos niveles de traducción constitutiva.
Se quiere investigar el comportamiento del ribosoma al enfrentar el stem. El mismo puede seguir traduciendo a lo largo de la estructura tridimensional, o bien saltarla para reubicarse río abajo de ésta.• Se hibridó un primer de DNA específico contra una región definida del 5’UTR, cercana a los dominios 3 y 4.• Se trató con RNasa H con fines de degradar esta corta región de RNA complementaria y generar un RNA no contiguo.
Resultados
El tratamiento con RNasa no afectó la eficiencia de traducción, demostrando que el ribosoma se translocaría al RNA contiguo para continuar con el proceso de traducción, en lugar de scanear el stem. DATA NOT SHOWN.
El uORF2 en el 5’UTR facilita la traducción.A continuación se quiso analizar el efecto de uORF1.• Se agregó una base para crear un corrimiento del marco de lectura que aumentara el largo de uORF1 de 19 a 37 codones.• La traducción en esta mutante provocaría un bypass del uORF2 y el sitiodonor de shunting, terminando 17 pares de bases río abajo del uORF2.
Resultados
LA TRADUCCIÓN IN VIVO EN SÓLO UN 25%.
Hipótesis: • La mayoría de los ribosomas bypasseó al ORF1 para comenzar la traducciónrío abajo del ORF2.• La traducción de un ORF1 elongado permite el shunting en algún punto ríoabajo del ORF2, indicando que, ni el producto del ORF1 ni su largo, afectarían la traducción de ORF2Conclusión: dado el pobre contexto de iniciación en el que se encuentra ORF1y que al parecer ORFs más cortos favorecen el shunting, la primer hipótesis resulta más probable.
El 5’UTR de cIAP2 comprende dos exones.• El primero tiene 109 bases y contiene el start de uORF1.• El segundo tiene 3507 bases, incluye los sitios donor y aceptor y los primerosnucleótidos de uORF2.• Para estudiar el efecto de esta región sobre la eficiencia traduccional, se delecionóel exón 1.
Resultados
LA TRADUCCIÓN EN UN 20%
Si bien la presencia de uORF1 inhibiría en teoría latraducción de uORF2, parece existir algo en el exón 1que facilita este proceso.
Una estructura adicional de 2,48 kb que incluye 62 AUG y el dominio 3, queda por fuera del stem y probablemente sea bypasseada por los ribosomas.• Para analizar el rol de esta estructura en el shunting, se delecionó completamente,adicionando un hairpin estable que bloquee el scanning convencional, por encima del stem.
Resultados
LA TRADUCCIÓN EN UN 90%
No solo el stem es necesario para el shunting,sino que la secuencia adicional de 2,48 kb , jugaríaun rol imprescindible.
El dominio 3 es una estructura conservada del 5’UTR de cIAP2 dentro de los mamíferos.• Se delecionó el dominio 3 completo para analizar su importancia.• Además, se delecionaron dos dominios no conservados, “4+5”.
Resultados
• La deleción del dominio 3 produjo una inhibición de la traducción del 80%• La deleción de los dominios “4+5” no produjo alteraciones en la eficienciatraduccional.
Por último, se examinó si la localización del codón de inicio de cIAP2 eracrítica para mantener la eficiencia traduccional.• Las construcciones mutantes tenían el AUG de cIAP2 seis codones río arriba del AUG de FLuc.• La deleción del codón de inicio de cIAP2 provocaría que el ribosoma comenzarala traducción 18 nt río abajo.Resultados
No se observaron diferencias significativas en la eficiencia de traducción entre la mutante y el control.• Esto sugeriría que la posición del codón de inicio de cIAP2 no es relevante y que, luego del aterrizaje, el ribosoma podría scannear el RNA en busca del siguiente AUG en buen contexto de inicio.
• Determinar si ocurre modulación de la traducción mediada por la región 5´ no codificante de cIAP2 en situaciones de estrés celular.
• Determinar regulación a nivel traduccional de la expresión del gen endógeno cIAP2 en situaciones de estrés.
Evidencias: en situaciones de estrés, la traducción convencional mediada por escaneo dependiente de cap es inhibida; se activan mecanismos alternativos de iniciación de la traducción de proteínas implicadas en la respuesta celular al estrés.
Objetivo 3
Para inducir estrés celular utilizan drogas que causan distintos efectos:
• Etoposida: inhibe la actividad de la enzima topoisomerasa II, lo cual lleva al daño del DNA y a la activación de p53. La activación de p53 causa la desfosforilación de 4E-BPI que ahora puede secuestrar al factor de inicio de la traducción eIF4E, inhibiendo la traducción general.
¿El shunting es modulado por estrés?
Para inducir estrés celular utilizan drogas que causan distintos efectos:
• Thapsigargin: inhibe la actividad de la familia de bombas Ca2+ ATPasas del retículo endoplasmático. Induce la respuesta de proteínas no plegadas por el aumento de Ca2+ citoplasmático. Esta respuesta lleva a la fosforilación de la subunidad α del factor de iniciación eIF2, inhibiendo la traducción general.
¿El shunting es modulado por estrés?
Para inducir estrés celular utilizan drogas que causan distintos efectos:
• NaArs (arsenito de sodio): citotóxico y carcinogénico. Aumenta el estrés oxidativo e inhibe la reparación del DNA; a altas concentraciones puede llevar a la fosforilación de eIF2α. A bajas concentraciones puede, sin embargo, aumentar el metabolismo celular.
• H2O2: aumenta el estrés oxidativo llevando al aumento de Ca2+ citoplasmático, lo cual induce la rápida fosforilación de eIF2α.
¿El shunting es modulado por estrés?
Co- transfectan con estos mRNAs capeados y poliadenilados células MCF-7 (carcinoma mamario) y 293T, que luego fueron tratadas con las drogas que inducen estrés. Miden eficiencia de la traducción.
mRNA reportero que contiene un 5´UTR corto. Permite ver inicio de la traducción por escaneo convencional.
mRNA reportero que contiene la región 5´ UTR cIAP2
¿El shunting es modulado por estrés?
NaArs Etoposida
Ambas drogas estimulan la transcripión mediada por cIAP2 5`UTR, con poco cambio en la traducción por escaneo convencional, que no resulta inhibida.
Este tipo celular es más sensible al tratamiento con etoposida, que en este caso inhibe la traducción general. Sin embargo, la traducción de p-cIAP2-FL disminuye más lentamente que la de p-FL
Modulación de la traducción por estrés mediada por cIAP2 5´UTR
No todas los agentes que inducen estrés llevan al aumento de la traducción mediada por cIAP2 5´UTR
Modulación de la traducción por estrés mediada por cIAP2 5´UTR
Thapsigargin H2O2En estos casos, al aumentar la concentración de las drogas, disminuye la traducción mediada por cIAP2 5´UTR, mientras que, en la mayoría de los casos, la traducción general se mantiene constante
Modulación de la traducción por estrés mediada por cIAP2 5´UTR
Control de estabilidad de los mensajeros transfectados
Modulación de la traducción por estrés mediada por cIAP2 5´UTR
Nuevas construcciones:
• ΔDom3: deleción del dominio 3, mostrado como esencial para el shunting (¿unirá alguna proteína que modula la eficiencia de la traducción durante situaciones de estrés?)
• ΔDom 4+5: deleción de los dominios 4 y 5, poco conservados y no esenciales para el shunting.
Luego de transfectadas con los mensajeros, tratan a las células con etoposida.
Modulación de la traducción por estrés mediada por cIAP2 5´UTR
Modulación de la traducción por estrés mediada por cIAP2 5´UTR
• Con etoposide aumenta la traducción mediada por cIAP2 5´UTR wild-type.
• Sin etoposide, la deleción del dominio 3 disminuye la eficiencia de traducción, según lo ya visto. Sin embargo, con etoposida, esta deleción no impide que se induzca la traducción.
• La deleción de los dominios 4 y 5 no produce cambios en la eficiencia de la traducción con o sin etoposida.
Modulación de la traducción por estrés mediada por cIAP2 5´UTR
¿Qué pasa con la expresión de la proteína endógena?
Hasta ahora sólo miran qué pasa con mensajeros aportados de forma exógena.
Ahora van a mirar qué pasa con la expresión de la proteína cIAP2 endógena.
Tratan células 293T con etoposida, thapsigargin y NaArs; hacen un inmunoblotting.
• De acuerdo a lo visto antas, etoposida y NaArs aumentan la expresión de la proteína.
Tumor necrosis factor α: usado como control positivo. Se sabe que aumenta el nivel de cIAP2 por activación transcripcional
• De acuerdo a lo visto antes, thapsigargin reduce la expresión de la proteína.
Modulación de la traducción por estrés de cIAP2 endógena
En el experimento anterior sólo miran nivel de proteína, de modo que no se puede discriminar la regulación a nivel traduccional de la regulación a nivel transcripcional.
Evidencias: en situaciones de estrés se remueven por splicing estructuras secundarias complejas de regiones 5´UTR, lo que aumenta la eficiencia de traducción mediada por escaneo convencional. Además se ha registrado un transcripto de cIAP2 que contiene un 5´UTR de sólo 223 nt.
Para descartar que esto este sucediendo en el siguiente experimento realizan Northern blotting y RT-PCR. Analizan cuatro tipos celulares: 293T, HeLa (carcinoma cervical), Jurkart (células T) y MCF-7.
Modulación de la traducción por estrés de cIAP2 endógena
Northern: la sonda reconoce la región C- terminal
RT-PCR: los primers amplifican la región 5´UTR
• En todos los tipos celulares se observa un único mRNA de cIAP2 de 5,5 a 6 Kb.
• Con los agentes que inducen estrés celular no se observan cambios en cuanto al tamaño y cantidad de mensajero.
Modulación de la traducción por estrés de cIAP2 endógena
CONCLUSIONES
• El extremo 5’UTR de cIAP2 regula su traducción por un mecanismo de ribosome shunting y no mediante un elemento IRES.
• Este es el primer ejemplo de un transcripto de mamífero, ya sea eucariótico o viral, que se traduce exclusivamente por este método.
• La eficiencia del shunting en el 5’UTR de cIAP2 requiere de estructuras características: un CAP; un uORF de tres codones en el sitio donor de shunt; una estructura tridimensional estable de RNA doble cadena río abajo del uORF.
• Se cree que el dominio 3 involucra el reclutamiento de proteínas de unión a RNA o componentes de la maquinaria traduccional, pero queda por ser comprobado.
• La inducción de la traducción por estrés no depende los dominios 3, 4 o 5. El dominio 3 parece facilitar sólo la traducción constitutiva.
• La ventaja del shunting es que permite a la célula modular rápidamente la expresión de cIAP2 en condiciones de stress.
• Es probable que el shunting de cIAP2 sea preferentemente inhibido por condiciones de stress que induzcan la fosforilación del factor de inicio de la traducción eIF2α, impidiendo que se reinicie el complejo ternario e inhibiendo la traducción.
• La etoposida inhibe la traducción por un mecanismo que promueve el secuestro de eIF4E. Sin embargo este mecanismo no logra explicar la inducción de la traducción de cIAP2 en su totalidad, ya que luego de tratar las células durante 6 hs se recupera el scanning convencional. Es probable que la etoposida induzca la activación o expresión de factores activadores de shunting.
• Mirando lo que ocurre con un reportero se concluye que agentes que inducen estrés aumentan la traducción mediada por cIAP2 5´UTR. Esto no se ve con todas las drogas.
• Situaciones de estrés inducen la expresión de la proteína cIAP2 endógena por aumento de la traducción, no por aumento de la transcripción o cambios en el patrón de splicing.
• El próximo paso para investigar la modulación del shunting de cIAP2 en stresssería la búsqueda de proteínas que se unan al 5’UTR en presencia y ausenciade stress celular.
Muchas gracIAPs!