Tinción de la muestra

• Aumenta la resolución• Acentúa las características morfológicas

• Conserva la muestra

ColorantesHacen más visibles las estructuras internas y externas aumentando el contraste con el fondo

–2 características fundamentales :• Grupos cromóforos

–Con dobles enlaces conjugados–Dan al colorante su color

• Afinidad por los componentes celulares–Por enlaces iónicos (más comunes) , covalentes o hidrófobos

Colorantes• Ácidos:

– afinidad por las estructuras alcalina hemoglobina

– Eosina.

• Básicos: – afinidad por las estructuras ácidas ácidos nucleicos.

– Azul de metileno.

Colorantes• Neutros:

– Sales de un ácido y de una base coloreados. – Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de

otro. – Eosinato de azul de metileno.

• Indiferentes: – Insolubles en el agua y tiñen

a aquellas sustancias que tienen un poder de disolución superior al del líquido empleado para preparar la solución colorante.

– Sudán III para teñir las grasas.

Fijación– Por calor

•Preserva la morfología general pero no las estructuras internas

– Química•Protege la subestructura fina y la morfología de los microorganismos delicados de mayor tamaño

Fijación química• Aldehídicos

• Ácido ósmico• Tetróxido de osmio

• Compuestos mercúricos y crómicos,

• Alcoholes, la acetona, el dietil-pirocarbonato.

Tipos de tinción• Tinción simple

– Un solo colorante. –Colorantes básicos

• Mas usados• Tienen cargas positivas

–Ej.: Cristal violeta, fucsina básica, safranina, verde malaquita

–Colorantes ácidos • Menos usados• Tienen cargas negativas

–Ej.: Eosina, Fucsina ácida

Safranina

Tipos de tinc ión

•Tinción diferencial

– 2 ó más colorantes– Divide a las bacterias en grupos diferentes según sus propiedades de tinción:

•Tinción de Gram•Tinción ácido alcohol resistente

• Tinción de Gram

Procedimiento Técnico

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Gram positiva

Gram negativa

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-Tinc ión Ácido alcohol res is tente

– Elevado contenido en lípidos de las paredes de estas células

– Se tiñen calentando una mezcla de fucsina básica y fenol

Mycobacterium lepraeColorante de contraste: azul de metileno

-Método de Ziehl Nee ls en

• Frotis fijación x calor teñir con fucsina fenicada Calentar suavemente con el mechero hasta la emisión de vapores.

– El colorante no debe secarse ni hervir, añadir más si es necesario.

– Mantener la emisión de vapores durante 5 minutos. • Lavar con agua decolorar con alcohol ácido

Lavar con agua teñir con azul de metileno• un minuto.

• Lavar con agua escurrir dejar secar al aire microscopio

*Rojo Positivo *Azul Negativo

TINCIÓN DE KINYOUN• Ziehl-Neelsen modificado Método frío

– Extensión Desecación Fijación Dejar enfriar Coloración

• Fucsina de Kinyoun • 5-7 minutos-min., sin calentar.

– Lavar con agua/escurrir el colorante Decolorar con alcohol-HCl Lavar con agua Coloración de contraste

• Azul de metileno • 2-3 min.

– Lavar secar microscopio.

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Tinc ión de es tructuras es pec íficas

Tinción negativa– Para capsulas – Se mezclan las bacterias con tinta china o colorante de nigrosina y se extienden sobre un porta

– Las capsulas se observan sin color sobre un fondo oscuro

Cryptococcus neoformans – tinción negativa con tinta china

– Doble tinción– Las esporas se tiñen primero calentando las bacterias con verde malaquita

– Se contratiñe con safranina quedando las células vegetativas y las endosporas con colores diferentes

Bacillus cereus

Tinción de esporas (Método de Schaeffer-Fulton)

Tinc ión de flage los– Los flagelos deben ser recubiertos con suficiente colorante como para ser observados

– Se aplica mordiente (como ácido tánico y alumbre de potasio) para aumentar el grosor de los flagelos y se tiñen con pararosanilina (Método de Leifson) o fucsina básica (Método de Gray)

Vibrio cholerae O1

Tinc iones policrómicas• Tipo Romanowsky

– un colorante ácido (eosina) – Colorantes básicos (tiacinas).

• Azul de metileno y sus derivados (colorantes tipo azur).

• Diagnóstico hematológico– Wright – Giemsa

• sola o en combinación con la de May-Grünwald

TINCIÓN GIEMSA• Frotis sanguíneo • Fijación con metanol x 3 minutos Escurrir

secar al aire • Diluir en un tubo de ensayo 0,2 ml de azur-

eosina-azul de metileno según Giemsa con 2 ml de solución tampón pH 7,2.

• Cubrir el frotis con la dilución de colorante– dejándolo actuar durante 25 minutos.

• Escurrir lavar con agua del grifo. • Lavar con tampón pH 7,2 hasta eliminar los

restos del colorante. • Escurrir y secar en posición vertical

TINCIÓN GIEMSA• Eritrocitos color rosa asalmonado

• Plaquetas color violeta.

• Neutrófilos núcleo de color azul violeta, el citoplasma rosa y la granulación de un color violeta rojizo

TINCIÓN DE WRIGHT• Frotis sanguíneo muy fino secar al aire. • Verter 1 ml de eosina-azul de metileno

– por un minuto

• Lavar con solución tampón pH 7,2 escurrir y secar en posición horizontal

• Diluir 0,5 ml. de eosina-azul de metileno con 0,5 ml de solución tampón pH 7,2. Mezclar bien y cubrir la extensión. – durante 3-5 minutos

• Lavar con agua del grifo con solución tampón pH 7,2 escurrir y secar en posición vertical.

Tinción de es tructurases pec íficas

Sistemas de marcaje inmunocitoquímico

• Métodos directos – primer anticuerpo o anticuerpo primario se encuentra unido a algún tipo de marcador fluorocromo

Tinción de es tructurases pec íficas

• Métodos indirectos– El anticuerpo primario aplicado sobre las células es reconocido por un segundo anticuerpo, secundario, unido a un marcador

– El anticuerpo secundario se aplica a una concentración en exceso.

– Mas sensible

Tinción de es tructurases pec íficas

• Métodos del anticuerpo no marcado o de puente

anticuerpo primario anti-anticuerpo, secundario anticuerpo anti-peroxidasa peroxidasa.

Otras tinc iones

• Para protozoos• Para Trichomonas vaginalis• Para amibas de vida libre• Para helmintos

Conclus ión

Materiales

Técnica

Observacion