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Tiempo
Seña
lCROMATOGRAFÍA
La cromatografía es un conjunto de técnicas que
permiten la separación de compuestos
estrechamente relacionados.
Método de análisis para separar,
identificar y cuantificar
CROMATOGRAFÍA
selectividad
Método separativo por excelencia
Origen A principios del siglo XX, el botánico ruso
Tswett separó pigmentos vegetales
pasando soluciones de estos pigmentos
por una columna de vidrio empaquetada
con CaCO3.
Las especies separadas (clorofilas,
carotenos y xantofilas) aparecían como
bandas de colores (verde, anaranjado y
amarillo, respectivamente) lo que dio
origen al nombre del método
khroma, khromatos = color
graphos = escrito, grabado
Geles de
poliacrilamida
y agarosa.
Nace HPLC
1968: se comercializa el
primer HPLC como un
"Analizador de ácido
nucleico."
1969: 1er simposio
internacional sobre
HPLC.
Se obtienen partículas
peliculares de porosidad
controlada.
Columnas
monolíticas Cromatografía
líquida-ultra
alta presión
(UHPLC).
Gran avance
instrumental.
Miniaturización
Cromatografía en
papel, de
partición en fase
inversa. Primeros
geles de
dextranos.
Cromatografía de
gases.
CG-masa
Martin y Synge
realizan trabajos de
cromatografía de
reparto
1952: Martin y
Synge ganan
Premio Nobel de
Química por sus
trabajos en
cromatografía de
reparto.
Archer
Martin
Richard
Synge
Tswett
1903
1900 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000
Breve historia
HPLC-
espectrometría
de masas
Cromatografía actual
Fase móvil (líquida o gaseosa): contiene los
componentes a separar y fluye a través de la fase
estacionaria
Fase estacionaria (líquida o sólida): a través
de la cual fluye la fase móvil y donde quedan
momentáneamente retenidos los componentes
de la muestra
Un sistema cromatográfico consta de dos
fases
Método físico de separación en el cual los
componentes a ser separados se
distribuyen entre 2 fases, una de las
cuales es fija (fase estacionaria) y la otra
se mueve en una determinada dirección
(fase móvil).
Definición de la IUPAC
Cromatografía
La distribución entre fases está
determinada por la diferente afinidad de
cada analito hacia dichas fases. La
separación se produce por las distintas
velocidades de migración de los
analitos, determinadas por el tiempo que
permanecen en cada fase
Definición de la IUPAC
Cromatografía
• líquida convencional y fase ligada (reparto)
• sólida (adsorción)
• resina intercambiadora (intercambio iónico)
• gel poroso (tamizado)
• afinidad (reacción específica)
Líquida (cromatografía
líquida)
Gaseosa (cromatografía
gaseosa)
Fluido supercrítico (cromatografía de fluidos
supercríticos)
Clasificación
FM FE e interacción
• líquida convencional y fase ligada (reparto G-L)
• sólida (adsorción)
Fluido calentado a T superior a la
crítica. Tiene algunas propiedades
de gas y algunas de líquido. La FE
puede ser líquida o sólida
Según disposición física de la FE y dirección de elución
Planar
Papel
Capa fina
radial descendente
ascendente
ascendente
Clasificación
Columna
descendente
Según disposición física de la FE y dirección de elución
Clasificación
Desarrollo por elución (el más frecuente)
La muestra se introduce en el extremo superior de
una columna y al pasar la FM los componentes se
separan en zonas, por distintas afinidades entre
analitos y fases.
Desarrollos cromatográficos
Desarrollo por desplazamiento: La FM es más afín
a la FE que los analitos y los desplaza.
El analito menos retenido se recupera en forma pura,
seguido por una mezcla, y seguido del otro analito en
forma pura. Es una técnica preparativa.
Análisis frontal: Aplicación continua de la muestra en
el origen. El analito menos retenido fluye, y el más
retenido se acumula cerca del origen. Al alcanzarse la
capacidad máxima del adsorbente, el analito más
adsorbido empieza a desplazarse. Las primeras
fracciones contienen el material menos adsorbido y
luego aparece una mezcla de ambos componentes. Es
una técnica preparativa.
Desarrollos cromatográficos
La cromatografía de elución es un
procedimiento en el cual la FM pasa en forma
continua a través del lecho cromatográfico
(FE) y la muestra se introduce en una
siembra.
Cromatografía de elución
Análisis cualitativo y
cuantitativo
B Detector
B A
t0
B A
B A
Muestra
Cromatografía en columna: elución
A + B
t2 t1 t4 t3
FM FM FM FM
Objetivo de la cromatografía
resolver los componentes de una muestra
Cromatograma con
picos no resueltos
Mejora por aumento
en la separación de
bandas
Mejora por
disminución del ancho
de bandas
Teorías del proceso cromatográfico
Teoría de los platos: concepto de N y H (similitud
con columna de destilación fraccionada). Explica la
forma gaussiana de las bandas pero no su
ensanchamiento durante el proceso cromatográfico.
Teoría cinética: La columna opera en situación de
no-equilibrio. Nuevo concepto de N y H
La teoría del proceso cromatográfico debe
explicar las variables que influyen en la velocidad
de migración de los analitos y en el
ensanchamiento de las bandas
SE
ÑA
L D
ET
EC
TO
R
t R
TIEMPO
t´ R
Cromatograma
compuesto
no retenido
por FE
analito
t M
CE
CM
Cromatografía de
reparto
Cromatografía de adsorción
Isotermas de reparto y adsorción
CM
mda/mte
masa adsorbida/masa adsorbente
Factor de separación
(factor de selectividad)
Factor de retención
(factor de capacidad)
a = kB
kA
k = nE
nM
Constante de reparto K =
CE
CM
Constantes termodinámicas
Mide la distribución del
analito entre FE y FM
Describe la velocidad de
migración del analito en
la columna
Mide la selectividad de
la columna de un
analito respecto a otro
Relación entre las constantes termodinámicas y
el tiempo de retención
velocidad lineal del soluto v = L/tR
velocidad lineal de la FM u = L/tM
velocidad relativa del analito dentro de la columna
v/u = L/tR
L/tM
La velocidad relativa también se puede definir a
partir de la fracción molar del soluto en la FM
v/u = nM
nM + nE
= 1
1 + nE/nM
v/u = tM/tR
= 1 + k
1
Igualando los segundos miembros de ambas
expresiones
tM
tR 1 + k
1 = tR = tM (1 + k)
tR = tM (1 + K VE/VM)
tR - tM
tM k =
v/u = tM/tR = 1 + k
1 v/u
velocidad relativa
Relación entre las constantes termodinámicas y
el tiempo de retención
Mejorar la separación
de bandas por
modificación de los tR
Recordando…
Modificar constantes
termodinámicas
Un recurso para resolver bandas superpuestas
Modificar FM, FE y/o temperatura
se
ña
l d
ete
cto
r
tiempo
t
t
W= 4t
punto
de
inflexión
Ancho de banda
Parámetros relacionados con el ancho de banda
N y H
N = 16 (tR/W)2
N = L/H
Eficiencia
recordando que: W = 4t t = W/4
N = 16 (tR / W)2
Demostración
H = s2 /L
s L
t tR =
s t
L tR
= 2 2
2 2
s t
L tR
= H t
L tR
= 2
2
H W
L 16 tR
=
2
2
L tR
H W
= 16 2
N
N = 16 (tR / W)2
Ecuaciones relacionadas con la eficiencia
H = A + B/m + Cm
Relacionan la altura de plato teórico con los
procesos dispersivos que ocurren dentro de la
columna (A, B y C) y la velocidad de la fase móvil
difusión en
remolino difusión
longitudinal
Ecuación de van Deemter
H = A + B/m + CEm + CMm
Otra ecuación
resistencia a la
transferencia de
masa
2
1
2
Difusión en remolino
A = 2 dp
3
3
1
constante de
empaque
diámetro
medio de
partículas
B = 2 DM
Dir
ec
ció
n d
e F
M
Difusión longitudinal
factor de obstrucción
coeficiente difusión del
analito en FM
c
c - dc
concentración
Mide la velocidad a la cual una sustancia se mueve
azarosamente de una región de alta concentración a
una de menor concentración. Es la constante de proporcionalidad que relaciona el
flujo J (medido en mol/m2.s) con el gradiente de
concentración (1ra ley de Fick)
Coeficiente de difusión (D)
J = -D dc
dx x + dx
x J
concentración
SOLUTO SOLVENTE D (m2/s)
Glicina Agua 1.1x10-9
Metanol Agua 1.6 x10-9
Albúmina Agua 0.059 x10-9
H+ Agua 9.3 x10-9
OH- Agua 5.3 x10-9
Na+ Agua 1.3 x10-9
Cl- Agua 2.0 x10-9
I2 Hexano 4 x10-9
N2 CCl4 3.4 x10-9
CS2 (g) Aire 1.0 x10-5
O2 (g) Aire 1.8 x10-5
Coeficientes de difusión (D) a 298 K
FM FE
dirección
de
elución
t1
Resistencia a la transferencia de masa
Desde y hacia la FE: CE
t2
FM FE
FE líquida
FE sólida
E 2
2 f E D k) (1
qkd C
+ =
2 d
E k) (1
k 2t C
+ =
Resistencia a la transferencia de masa
Dentro de la FM: CM
soporte soporte
M
2 c
2 p
M D
) d , , f(d C
m =
Resistencia a la transferencia de masa
H = A + B/m + CEm + CMm
H mínimo
m óptimo
A
CE
CM B
Cromatografía gaseosa
2 4 6 8 10 m (cm/s)
H (mm)
6
CE
mezclado convectivo
CM B
H (mm)
0.8
1 2 3 4 m (cm/s)
Cromatografía líquida
Disminuir el ancho de
bandas
Recordando…
Modificar variables
cinéticas y optimizar m
Otro recurso para resolver bandas superpuestas
Modificar variables que ↓H
(incluyendo el m)
Tiempo
Señ
al d
el d
etec
tor
0
1
tr
WA WB
Resolución
2 t r (W A + W
B ) R =
k B R =
1+ k B
a-1
a 4
N
1 t
t 2
B A
3 t
B A
Distribución de A y B dentro de la columna
Distancia de migración (L)
Co
nce
ntr
ació
n (
CE)
A medida que las bandas se separan, se ensanchan
¿es exitosa la separación?
El ensanchamiento de cada banda se produce a
una velocidad menor que su desplazamiento → se
logran separaciones exitosas
velocidad lineal del soluto v = L/tR
1/vA = tR(A)/L
1/vB = tR(B)/L 1/vA – 1/vB = tR(A) – tR(B)
L
tR
L =
tR = L(1/vA – 1/vB) La separación crece con la longitud de la columna
¿es exitosa la separación?
H = s2 /L s = HL
La dispersión crece con la raíz cuadrada de la longitud de la
columna
Optimización de la columna
aumentar la separación
entre bandas (tR)
Modificar variables
termodinámicas (K, k
y a) modificando FM,
FE y temperatura
disminuir el ancho de
bandas
Modificar variables
que permiten ↓H y
↑N (ecuación tipo
van Deemter)