UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA

CALIFORNIA SUR

ÁREA DE CONOCIMIENTO DE CIENCIAS DEL MAR

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA

MARINA

TESIS

ESTUDIO DEL PROCESO DE PROTEÓLISIS EN EL JUGO

GÁSTRICO DE LANGOSTA AMERICANA (Homarus

americanus), POR LA ACCIÓN DE PROTEINASAS

DIGESTIVAS.

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:

BIÓLOGO MARINO

PRESENTA

IVÁN RODRÍGUEZ SIORDIA

DIRECTOR:

Betsaida Bibo Verdugo

LA PAZ, B. C. S. AGOSTO DE 2014

Resumen

La proteólisis es un proceso de hidrólisis de proteínas llevado a cabo por medio de

enzimas llamadas proteinasas, la cual se efectúa por la ruptura de enlaces peptídicos

que unen a los aminoácidos. Este proceso puede llevarse a cabo de manera

secuencial en la que una o varias proteinasas son necesarias para que otras

proteinasas actúen. Efecto que se ha observado en el tracto digestivo de

invertebrados como platelmintos e insectos. Este trabajo demuestra un mecanismo

similar en el jugo gástrico de langosta americana, Homarus americanus. El jugo

gástrico de langosta americana es ácido, pH ~4.7, y presenta cisteíno, aspártico y

serino proteinasas. En el presente estudio se evaluó la hidrólisis de los sustratos

protéicos: albúmina sérica bovina, hemoglobina y actina del músculo de Agropecten

circularis, por acción de las proteinasas del jugo gástrico de langosta americana y se

evaluó el efecto de los inhibidores específicos: Pepstatin A, E-64 y Pefabloc,

inhibidores de proteinasas aspártico, cisteíno y serino respectivamente. La hidrólisis

se cuantificó por el porcentaje de proteína remanente en SDS-PAGE y se analizó por

densitometría de imagen. El tiempo en el que ocurre la hidrólisis máxima de cada

sustrato, dependió de la naturaleza del mismo. Las proteínas comerciales BSA y

hemoglobina se hidrolizaron entre 6 y 8 h, mientras que la hidrólisis de actina,

utilizada para analizar la hidrólisis de una proteína homóloga a las hidrolizadas en el

jugo gástrico de langosta americana en el medio natural, finalizó en 1 h. El ensayo de

inhibición señala que si se inhiben las aspártico y cisteíno proteinasas la hidrólisis no

se detiene, por otro lado, al inhibir las cisteíno la hidrólisis se detiene

considerablemente, sin embargo, al inhibir tanto aspártico y cisteíno proteinasas la

hidrólisis se detiene. Estos resultados indican que las proteinasas que

sinérgicamente están participando en el proceso de proteólisis, son las de tipo

cisteíno y aspártico, lo cual se convalida dado que ambas proteinasas presentan su

máxima actividad a pH ácido. Los resultados también sugieren que las aspártico y

cisteíno proteinasas están involucrados en un proceso secuencial en la hidrólisis de

BSA y Actina, en el que se requiere la participación inicial de las cisteíno proteinasas,

para que las de tipo aspártico puedan intervenir, es decir, las cisteíno proteinasas

constituyen un paso limitante en la hidrólisis de estos sustratos. Por otra parte, la

hidrólisis de la hemoglobina puede completarse por las aspártico y cisteíno

proteinasas de forma individual y por lo tanto, ninguna de ellas constituye un paso

limitante en el proceso.

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar quiero agradecer a mis padres, a ellos les debo todo lo que soy. Mi

madre, mi heroína, mi pilar en esta vida, por darme todas las fuerzas y las ganas de

salir adelante. Mi padre, mi ejemplo a seguir, por todos los concejos que me ha dado,

por el apoyo para llegar a cumplir todas mis metas.

Agradezco a mi directora de Tesis Betsaida Bibo, por dirigir éste trabajo, por

contagiarme su entusiasmo y ganas de trabajar, además por todos los consejos y

ánimos, pero sobre todo, por brindarme su amistad.

Agradezco al Dr. Fernando García Carreño, por abrirme las puertas del laboratorio

de BQ, por ayudarme a ampliar mi mente y formular nuevas metas, por involucrarme

en el mundo de la bioquímica y hacer que me guste, como me gusta ahora.

Agradezco a mi abuelo Pancho, mi inspiración, por inculcarme el valor de la

responsabilidad y las ganas de superarse, por enseñarme que la vida no es fácil,

pero es bonita.

Agradezco a mi familia, principalmente a mis tías: Marta, Nena y Yaya, por brindarme

todo su amor y cariño y estar apoyándome siempre.

Agradezco a la Técnico María de Los Ángeles Navarrete del Grupo de BQ por el

apoyo técnico y el entrenamiento en el manejo de técnicas, equipo y organización del

trabajo de laboratorio, además por los consejos y críticas y, no menos importante,

por todo el cariño y muestras de afecto que ha dado.

Agradezco a mi amigo Micro, porque te fuiste de esta vida, cuando apenas

empezaba, pero tu alegría y cariño permanece en cada día de mi vida.

Agradezco a Juan Ángel, porque sin ti, yo ya estuviera loco (más), por apoyarme

siempre, ayudarme a levantarme cuando me caía, ser mi sostén y mi mano derecha.

Agradezco a mis amigos: Diego, Ely, Cari, Rodrigo Edgar y Kalid por ser mi apoyo

durante todos estos años, por todo el cariño, afecto y ánimos que han dado desde

que nos conocimos, tanto en los buenos momentos como en los no tan buenos. Son

mi familia, lo sabe, ocupan un espacio importante en mi vida y en mi corazón.

Agradezco a mis amigos de Las Palma: Patricia, Josef, Evita y Michele, por ser parte

de mi vida, porque estando del otro lado del mundo, representan para mí una familia.

Gracias por ayudarme a abrir las puertas de mi mente y enseñarme a ver las cosas

desde una perspectiva más amplia. Los quiero con toda mi alma.

Agradezco a Tania, Bere y Cristi, por permanecer en mi vida a pesar de la distancia y

por ser unas verdaderas amigas.

Agradezco a todos mis compañeros de la carrera, que de mayor o menor medida,

influyeron en lo que soy ahora, principalmente a Lupita, Janna, Kenia, Zuri, Airy,

Yors, Vale, Nico, Memo. ¡GRACIAS POR TODO!

Agradezco a Erika Torres Ochoa y Sergio Flores Ramírez, por ser parte de mi

comité, por todas sus observaciones y críticas y además por ser parte importante de

mi formación académica.

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 1

2. ANTECEDENTES ....................................................................................................................... 4

2.1 Las proteinasas ..................................................................................................................... 4

2.2 Inhibidores de proteinasas .................................................................................................. 5

2.3 Hidrólisis de proteína por proteinasas digestivas en invertebrados ............................. 7

2.4 Proteinasas del sistema digestivo de crustáceos ............................................................ 8

2.5 El organismo de estudio: langosta americana (Homarus americanus) ..................... 10

2.6 Las proteinasas digestivas de langosta americana ...................................................... 10

3. JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................................... 13

4. PREGUNTA CIENTÍFICA ........................................................................................................ 14

5. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 15

5.1 Objetivo general ............................................................................................................... 15

5.2 Objetivos específicos ...................................................................................................... 15

6. HIPÓTESIS ................................................................................................................................ 16

7. MATERIAL Y MÉTODO ........................................................................................................... 17

7.1 Obtención y procesamiento de jugo gástrico de langosta americana ........................ 17

7.2 Cuantificación de concentración de proteína y actividad proteolítica total ................ 17

7.3 Identificación de proteinasas activas a pH fisiológico ................................................... 17

7.4 Extracción de Actina de Argopecten circularis. ............................................................. 19

7.5 Ensayo de hidrólisis de proteínas .................................................................................... 20

7.6 Ensayo de inhibición de proteinasas ............................................................................... 21

7.7 Análisis estadístico ............................................................................................................. 23

8. RESULTADOS .......................................................................................................................... 24

8.1 Las proteinasas del jugo gástrico de langosta americana. .......................................... 24

8.2 Proteínas del músculo de Actinopecten circularis. ........................................................ 26

8.3 Monitoreo temporal del proceso de poroteólisis ............................................................ 26

8.4 Ensayo de inhibición de proteinasas ............................................................................... 30

9. DISCUSIÓN ............................................................................................................................... 34

9.1 Identificación de proteinasas en el jugo gástrico de langosta americana. ................ 34

9.2 Monitoreo de la hidrólisis de proteína. ............................................................................ 35

9.3 Participación de las proteinasas en la hidrólisis. ........................................................... 36

10. CONCLUSIONES...................................................................................................................... 40

11. RECOMENDACIONES ............................................................................................................ 41

12. REFERENCIAS ......................................................................................................................... 42

13. LISTA DE TABLAS Y FIGURAS ............................................................................................. 48

1

1. INTRODUCCIÓN

La proteólisis es un proceso de hidrólisis llevado a cabo por las enzimas

llamadas proteinasas, la cual se efectúa por la ruptura de enlaces peptídicos que

unen a los residuos de aminoácidos de las proteínas (Kato, 1999). Las proteinasas, o

enzimas proteolíticas, son las responsables de llevar a cabo esta función. Estas

enzimas se clasifican en exoproteinasas y endoproteinasas, de acuerdo a la

localización del enlace peptídico que hidrolizan dentro de una proteína, los primeros

cortan el enlace peptídico en un amino acido no terminal y las endoproteinasas

únicamente en aminoácidos terminales. Las endoproteinasas, a su vez, se clasifican

en cuatro grupos, de acuerdo a su mecanismo de catálisis en: serino, cisteíno,

aspártico y metalo proteinasas (Rawlings y Barrett, 1993). Estas enzimas operan en

muchos procesos biológicos, tales como la digestión de proteínas provenientes del

alimento, coagulación de la sangre, síntesis de hormonas, apoptosis, entre otros

procesos celulares (Berg, et al. 2002).

La participación de proteinasas en distintos procesos fisiológicos, es a menudo

organizada en cascadas proteolíticas y/o su partición es orquestada de forma

secuencial. Los procesos enzimáticos que ocurren en cascada, son empleados por

los sistemas para alcanzar una respuesta rápida por efecto de una señal; como

ocurre en el proceso de coagulación de la sangre que donde se presenta una

cascada de activación de zimógenos (Krem y Di Cera, 2002). En el sistema digestivo

de mamíferos, la cascada de activación de enzimas digestiva inicia con la secreción

de éstas en el duodeno, en forma de zimógenos; las enteroquinasas, que son

secretadas en el duodeno al entrar la proteína del alimento, activan a las tripsinas,

las cuales subsecuentemente activan otras enzimas como tripsinógeno,

quimotripsinógeno, proelastasa, procarboxipeptidasa y prolipasa. A su vez, las

proteinasas digestivas actúan de manera secuencial para producir péptidos

pequeños y aminoácidos libres que pueden ser absorbidos por las células epiteliales

2

del intestino (Barboza et al. 2008). Por otro lado, en invertebrados se ha descrito que

las proteinasas actúan de manera secuencial, es decir, que las proteinasa de un tipo

catalítico actúan primero sobre el sustrato, y posteriormente, los productos de la

hidrolisis, continúan siendo hidrolizados por las mismas enzimas o por proteinasas

de otro tipo catalítico (Brunelle et al. 1999; Williamnson et al. 2004; Delcrox et al.

2006; Horn et al. 2009).

Los crustáceos, son un grupo de invertebrados que pertenecen al phylum

Arthropoda, uno de los más abundantes y diversos del reino animal. Los crustáceos

presentan variaciones estructurales y fisiológicas en el sistema digestivo, las cuales

dependen de los hábitos alimenticios, la disponibilidad de alimento, las condiciones

del hábitat y el estadio de vida (Biesiot y McDowell, 1990; García-Carreño y Haard

N.F. 1993; García-Carreño et al. 1994 y Johnston y Yellowlees 1998). En los

crustáceos, las proteinasas digestivas son de mecanismos catalíticos variados,

incluyendo serino, cisteíno, metalo y aspártico proteinasas; se ha propuesto que la

transición de cisteíno/aspártico a serino proteinasas en el proceso evolutivo ocurrió

en artrópodos y/o moluscos (Delcrox et al. 2006). Las proteinasas de los crustáceos

son secretadas por la glándula digestiva, también llamada hepatopáncreas, que es el

órgano en que ocurre la síntesis de enzimas digestivas, la absorción de los nutrientes

del alimento y almacenamiento de lípidos y glucógeno (Ceccaldi, 1977). Los

principales componentes proteinolíticos de los sistemas digestivos de las especies de

crustáceos estudiadas a la fecha son serino proteinasas (tripsinas y quimotripsinas)

(Galgani et al. 1985; Tsai et al. 1991, Muhlia-Almazán y García-Carreño, 2003).

La langosta americana, Homarus americanus, es un crustáceo bentónico del

orden Decápoda, perteneciente a la familia Nephropidae. El jugo gástrico de langosta

americana es un medio ácido de pH ~4.7. Algunas proteinasas digestivas de este

organismo han sido purificadas y caracterizadas desde el punto de vista bioquímico y

molecular. Estas proteinasas pertenecen a los tipos catalíticos aspártico (Rojo et al.,

3

2010a, 2010b) y cisteíno (Layckoc et al., 1989, 1991). Sin embargo, poco se ha

ahondado en el estudio del tipo de proteinasas activas bajo las condiciones de pH del

jugo gástrico y que probablemente estén involucradas en la proteólisis que ocurre

dentro de la cavidad gástrica de langosta americana. Tampoco se ha descartado que

las serino proteinasas, que comúnmente son abundantes en otras especies de

crustáceos decápodos, sean activas en la proteólisis. Aunque se han purificado

proteinasas del jugo gástrico de langosta americana, aún no se conoce si estas

orquestan un proceso de proteólisis ordenado, en que la participación de las

proteinasas es consecutiva, o si bien es un proceso que ocurre al azar. El objetivo de

esta tesis fue estudiar las proteinasas digestivas de la langosta americana por medio

de técnicas electroforéticas y desarrollo de zimogramas. Así también, estudiar la

hidrólisis de diversas proteínas por acción de las proteinasas del jugo gástrico e

investigar el posible papel en la proteólisis mediante el uso de inhibidores de los

principales tipos catalíticos de proteinasas, más específicamente si la participación

de alguna de ellas es determinante para el inicio de la proteólisis.

4

2. ANTECEDENTES

2.1 Las proteinasas

Las proteinasas de tipo serino (EC 3.4.21) son una clase de enzimas

proteolíticas caracterizadas por la presencia de un residuo de serina en su sitio

activo. Estas pueden ser encontradas tanto en eucariotas como procariotas y están

involucradas en procesos como la digestión, la homeostasis, la apoptosis, la

reproducción y la respuesta inmune (Porgal, 2005). Las serino proteinasas más

estudiadas son las quimotripsinas las cuales presentan residuos de Ser196-Asp102-

Hist5 en su sitio activo (Hedstrom, 2002).

Las proteinasas de tipo cisteíno (EC 3.4.22), son proteínas involucradas en

muchos procesos bioquímicos que ocurren en los organismos, cuya función principal

es la degradación de péptidos y proteínas. Las proteinasas de tipo cisteíno se dividen

en dos grupos las citosólicas que conforman las calpainas y las lisosomales que

constituyen las catepsinas (catepsina B, C, H, K, L, M, N, S, T, V y W) (Grzonka et al.

2001). La actividad enzimática de las cisteíno proteinasas está relacionada con la

presencia de una diada catalítica formada por un residuo de cisteína e histidina, los

cuales se encuentran presentan actividad en un intervalo de pH de 3.5 a 8.9 (Turk et

al. 1997). La familia de la papaína ha sido mayormente estudiada de este tipo de

proteinasas, la cual tiene como residuos catalíticos a Cys25 y His159. La actividad

enzimática de las cisteíno proteinasas está relacionada con la presencia de una

diada catalítica formada por un residuo de cisteína e histidina, los cuales se

encuentran presentan actividad en un intervalo de pH de 3.5 a 8.9 (Turk et al. 1997).

Las aspártico proteinasas (EC 3.4.23) comprenden un grupo de enzimas

homólogas que incluye a pepsina, quimiosina, renina, catepsina D. Con la excepción

de la renina, su pH óptimo es ácido y todas tienen dos residuos de ácido aspártico

5

involucrados en el mecanismo catalítico (Pear y Blundell, 1984). Las aspártico

proteinasas tienen secuencias características en la región de los dos residuos

catalíticos de ácido aspártico: Asp32-Thr-Gly-Ser en el dominio terminal N y Asp215-

Thr-Gly-Ser/Thr en el dominio terminal C, ambos tienen afinidad por aminoácidos

hidrofóbicos (Davies, 1990).

2.2 Inhibidores de proteinasas

Los inhibidores de proteinasas son compuestos que interactúan con las

proteinasas de tal manera que las inhabilitan para llevar a cabo su función catalítica.

La función fisiológica de estos inhibidores es evitar que ocurra la ruptura de los

enlaces peptídicos de las proteínas, lo que los hace importantes en la iniciación,

mantenimiento y finalización de varios procesos biológicos. Los inhibidores de

proteinasas son estructuras químicas variadas y se encuentranse encuentran

presentes en múltiples formas, así como en numerosos tejidos de plantas y animales,

incluso en microorganismos (Laskowski y Kato, 1980).

Cada inhibidor presenta en su superficie un ambiente químico ideal para que,

al contacto con un tipo determinado de enzima, pueda reconocerlo como posible

sustrato (Laskowski y Kato, 1980). El Pepstatin A, el L-trans-Epoxysuccinyl-

leucylamido(4-guanidino)butano (E-64) y el Pefabloc, son algunos inhibidores que se

emplean comunmente en la caracterización de proteinasas, los cuales inhiben a las

aspártico, cisteíno y serino proteinasas, respectivamente. Estos pueden ser

empleados para procesos de extracción y purificación, análisis de procesos

secuenciales de proteinasas y estudios bioquímicos que requieren proteínas

(Hernández-Cortez et al. 1997; Navarrete del Toro et al. 2006; Rojo et al. 2010a).

El Pepstatin A es un inhibidor reversible de enzimas ácidas como Pepsina,

HIV-, Catepsina D y Renina. Este inhibidor es insoluble en agua, sin embargo, puede

6

diluirse en Sulfóxido de Dimetilo (DMSO). Para que este inhibidor pueda llevar a

cabo su efecto, deben de estar presentes tres elementos: un grupo 3 (S)-hidroxilo en

el tercer residuo de Pepstatina, un grupo isopropilo o su equivalente en el primer

residuo y una porción de grupo dipeptil Ala-Sta en C-terminal (Richt y Sun, 1980). En

trabajos previos el inhibidor Pepstatin A ha sido empleado con el fin de identificar,

purificar y caracterizar las aspártico proteinasas crustáceos (Navarrete del toro et al.

2006; Rojo et al. 2010a).

Otro inhibidor utilizado es el E-64, se ha utilizado como un potente inhibidor

irreversible para muchas cisteíno proteinasas, tales como la papaína, ficina,

actinidina, la catepsina B y L (Matsumoto et al. 1999). El E-64 reacciona con el sitio

activo de la enzima mediante la formación de un enlace tioéter con el grupo

sulfhidrilo del residuo catalítico de la sisteína, sin embargo, se ha observado que no

reacciona con las proteinasas de otras clases (Handa et al. 1978; Matsumoto et al.

1989). Anteriormente este inhibidor ha sido utilizado para inhibir la actividad de

cisteíno proteinasas en decápodos, con el fin de identificar aislar y caracterizar a este

tipo de proteinasas (Laycock et al 1989; Teschke y Saborowski, 2005; Navarrete del

Toro et al. 2006).

Finalmente el inhibidor 4-[2-aminoethyl]benzenesulfonyl fluoride (Pefabloc) es

un inhibidor irreversible específico de serino proteinasas, cuya mayor cualidad es su

solubilidad en soluciones acuosas y la ausencia de toxicidad. Es frecuentemente

utilizado en sustitución del PMSF, ya que tiene características de inhibición similares.

Éste inhibidor reaccionando rápidamente con el residuo de serina de la proteinasa,

formando así una enzima acilada estable, lo que resulta en una disminución de la

actividad enzimática (Mintz, 1993).

7

2.3 Hidrólisis de proteína por proteinasas digestivas en invertebrados

El estudio del proceso de proteólisis del alimento en invertebrados se ha

centrado principalmente en nemátodos parasitarios e insectos. En varios de estos

organismos la hidrólisis de proteína es llevada a cabo por proteinasas del mismo tipo

catalítico, mientras que en otras especies, el proceso es llevado a cabo por

proteinasas de tipos catalíticos diversos. Sin embargo, se ha observado que existen

otros mecanismos por los cuales la proteólisis se lleva a cabo, la cual involucra un

proceso secuencial (Williamnson et al.2004; Delcroix, et al. 2006; Brunelle et al.

1999; Horn et al. 2009).

Williamnson et al. (2004) describió un proceso secuencial de hidrólisis de

hemoglobina por las proteinasas de un anquilostoma (Ancylostoma caninum), un

parásito exclusivo de mamíferos. En este proceso la aspártico proteinasa, tipo

catepsina D (Ac-APR-1) y una cisteíno proteinasa tipo catepsina B (CP-2) inician el

proceso de hidrólisis, posteriormente la metalo proteinasa MEP-1 participa en la

hidrólisis.

Delcroix, et al. (2006) estudiaron la proteólisis en el parásito Schitosoma

mansoni, vector de la enfermedad Esquitosomeasis. Para la hidrólisis de albúmina se

observaron que las cisteíno proteinasas, catepsina B1 y L1, presentes en el sistema

digestivo de este organismo, son necesarias para el inicio del proceso,

posteriormente se les une la catepsina D y la parte final de la hidrólisis la llevan a

cabo la catepsina B1 y C y una metalo aminoproteinasa. Por otro lado, en la

degradación de hemoglobina, la aspártico proteinasa catepsina D es iniciadora del

proceso, posteriormente se le unen las catepsinas B1 y L1 y la parte final de la

hidrólisis ocurre como se describió en el caso de la albúmina.

8

En insectos se ha estudiado el proceso de proteólisis por las proteinasas

digestivas (Boldbaatar, 2006; Ahn y Zhu-Salzman, 2009). Sin embargo, existen

pocos estudios que señalen la presencia de un proceso secuencial de proteólisis.

Brunelle et al. (1999) identificaron el papel de la catepsina D en la digestión de

proteína del escarabajo de la papa de Colorado (Leptinotarsa decemlineata) en la

hidrólisis de diferentes proteínas, siendo esta proteinasa indispensable para iniciar el

proceso, posteriormente la quimotripsina y las catepsinas B y H participan en la

hidrólisis y finalmente las carboxilo y amino proteinasas producen los péptidos y

aminoácidos son absorbidos. Horn et al. (2009) describió un proceso secuencial en la

hidrólisis de hemoglobina, llevada a cabo por las proteinasas de la garrapata común

europea (Ixodes ricinus), en donde la catepsina D soportada por la catepsina L y

legúmina son las encargadas de iniciar la hidrólisis, la cual es continuada por la

catepsina C y B.

2.4 Proteinasas del sistema digestivo de crustáceos

Se han llevado a cabo diversos estudios para conocer la fisiología de la

digestión de proteína en decápodos, principalmente en las especies de importancia

económica de la industria acuicultora. (Lee et al. 1984; Teschke y Saborowski, 2005,

García-Carreño y Haard et al.1993). En las especies estudiadas a la fecha, las

proteinasas del tipo serino , tales como, tripsinas y quimotripsinas, se reconocen

como las más abundantes y se les considera como las responsables de la digestión

de la proteína del alimento, estas enzimas proteolíticas presentan su máxima

actividad a pH 8 (Galgani et al. 1985; Souza-Buarque et al. 2009) Tsai, et al. 1991

estudiaron y diferenciaron las quimotripsinas de tres peneidos (Penaeus monodon,

Penaeus japonicus y Penaeus penicillatus), encontrando similitudes y diferencias en

este tipo de proteinasas. Las tres especies presentaron carboxiloproteinasas A y B,

quimotripsinas y tripsinas, cada una de ellas representadas por varias isoenzimas,

con las quimotripsinas como una de las endoproteinasas digestivas más abundantes.

Hernández-Cortés et al. 1997, en un estudio de purificación y caracterización de

9

quimotripsinas del camarón Penaeus vannamei, identificaron la máxima actividad a

pHs alcalinos y su gran tolerancia a cambios de temperatura.

Se han revisado una serie de estudios en relación a la caracterización de las

enzimas digestivas presentes en el sistema digestivo de distintas especies de

langostas queladas y espinosas. En los estudios realizados, Celis-Guerrero et al.

(2004), caracterizaron las enzimas presentes en jugo gástrico, hepatopáncreas y

contendido intestinal de la langosta Panulirus interruptus, encontrando que las serino

proteinasas son las enzimas más activas, entre estas encontraron tripsinas y

quimotripsinas. Perera et al. (2008) determinaron la presencia de serino y

metaloproteinasas en un estudio de caracterización de proteinasas del jugo gástrico

de Panulirus argus.

Otros estudios han mostrado la participación de la cisteíno proteinasas en

conjunto con proteinasas de tipo serino, en el proceso de hidrólisis de proteína

(Laycock et al. 1989; Teschke y Saborowski, 2005; Vijayaraghavan et al. 2011). Un

ensayo de inhibición de proteinasas en dos especies de la familia Crangonidae

(Crangon crangon y Crangon allmani), señalaron la presencia de cisteíno

proteinasas, cuya inhibición produce una disminución del 70% en el proceso,

mientras que la inhibición de serino petidasas únicamente un 30% (Teschke y

Saborowski, 2005).

Existen pocos estudios donde se le atribuya un papel en la hidrólisis de

proteína a las proteinasas de tipo aspártico en crustáceos Glass y Stark (1994)

sugieren la presencia de proteinasas tipo-pepsina en el jugo gástrico de Homarus

gamarus; estas enzimas fueron posteriormente abordadas por Navarrete del toro et

al. (2006), en un estudio donde compararon las proteinasas de distintos decápodos,

10

bajo diferentes tratamientos de inhibición y pH, demostró la presencia de proteinasas

de tipo aspártico a pH ácido en varias especies de decápodos.

2.5 El organismo de estudio: langosta americana (Homarus americanus)

La langosta americana se distribuye en el Atlántico Norte desde Cape Hatteras

en Carolina del Norte, hasta Labrador y Newfoundland en Canadá; habita en fondos

rocosos cubiertos de algas a no más de 50 metros de profundidad, a una

temperatura que oscila entre los 4 y 26°C (Factor, 1995). Esta especie es

considerada un organismo omnívoro generalista-oportunista, es decir, que pueden

alimentarse de una gran diversidad de organismos, tales como crustáceos,

pelecípodos, gasterópodos, equinodermos, gusanos marinos, macroalgas e incluso

cadáveres; la elección del alimento se relaciona con la abundancia del mismo

(García y Kensler, 1980; Elner y Campbell, 1987). La langosta americana es de gran

importancia económica y ecológica, debido a su valor en la industria de alimentos y a

su importancia trófica en el Atlántico Norte (Brusca y Brusca, 2005; Factor, 1995).

2.6 Las proteinasas digestivas de langosta americana

Existen algunos estudios de caracterización y evaluación de proteinasas

digestivas de langosta americana. Brockerhoff et al. (1970), estudiaron las enzimas

digestivas del jugo gástrico de langosta americana y encontraron la presencia de

lipasas, proteinasas como tripsina y quimotripsina, carboxiloproteinasas A,

desoxiribunocleasas, ribunocleasas, fosfatasas y quitobiasas. En este estudio

también se midió el pH del jugo gástrico, señalando que es un medio ácido (pH ~4.7)

y se encuentra por debajo del pH encontrado regularmente en otros crustáceos

decápodos (que varía usualmente por encima de pH 5) (Ceccaldi, 1997). El pH del

jugo gástrico de langosta fue monitoreado en diversas especies por Navarrete y

11

colaboradores en 2006, donde se encontró que en especies del género Homarus es

más ácido que en especies como Panulirus interruptus, Cáncer pagurus, Calinectes

arcuatos y Calinectes belicosus. En un estudio de inhibición de la actividad

proteolítica del jugo gástrico de langosta americana, se encontró que el 80% de la

actividad es suprimida por efecto del E-64 (Layckoc et al. 1989).

En el estudio de Navarrete et al. (2006), se destaca que a diferencia de otras

especies de crustáceos decápodos, en langosta Europea (Homarus gamarus) la

proteólisis a pH ácido es mayor que la encontrada a pH alcalino; lo que sustenta que

el proceso proteólisis ocurre principalmente a pH ácido. Del análisis de inhibición, el

Pepstatin A y el E-64 son los inhibidores que tienen mayor efecto en la actividad a pH

3, lo que sugiere que además de las cisteíno proteinasas reportadas por Layckoc et

al. (1989), las aspártico proteinasas también tienen participación activa en la

proteólisis, dado que en este caso el pH del ensayo es más próximo al pH fisiológico

del jugo gástrico de la langosta.

A la fecha se han purificado y caracterizado las proteinasas digestivas de los

tipos catalíticos aspártico y cisteíno a partir del jugo gástrico de langosta americana

(Homarus americanus) (Laycock et al. 1989 y 1991; Rojo et al 2010a y 2010b). La

cisteíno proteinasa purificada por Layckoc et al (1989) es una enzima de 28 kDa de

peso molecular, con un pH óptimo de pH 4.5. Esta proteinasa fue purificada por

afinidad al sustrato y por cromatografía de intercambio iónico; en todos los

experimentos utilizaron DTT para activar a las cisteíno proteinasas y amortiguador de

acetato de sodio 100mM a pH 4.7, para nivelar el pH. Años después, se investigó la

secuencia de esta enzima y se determinó que es una catepsina L, la cual presenta 3

izoenzimas: LCP1, LCP2 Y LCP3 (Laycock et al. 1991). Rojo et al. (2010a y 2010b)

mediante técnicas de biología molecular investigaron la naturaleza de las aspártico

proteinasas de langosta americana y europea (Homarus gamarus) y se identificaron

dos isoenzimas, la catepsina D1 (~32 kDa) y catepsina D2 (~45 kDa), los transcritos

12

de la catepsina D1 se encontraron únicamente en el tejido de la glándula digestiva,

mientras que los de la catepsina D2 se encontró en todos los tejidos analizados. Esto

sugiere que la catepsina D1 es una proteinasa digestiva. La secuencia traducida del

RNAm de la catepsina D1 coincide con secuencias obtenidas por análisis de

espectrometría de masas de la aspártico proteinasa purficada del jugo gástrico de

langosta americana y europea. La catepsina D1 del jugo gástrico de langosta tiene

su máxima actividad a pH ácido (pH ~4.7), además presenta una gran especificidad

al sustrato a bajas temperaturas (Rojo et al. 2013).

13

3. JUSTIFICACIÓN

Las proteinasas del sistema digestivo de langosta americana (Homarus

americanus) han sido estudiadas por diferentes autores (Laycock et al. 1989;

Laycock et al. 1990; Navarrete del Toro et al. 2006; Rojo et al. 2010a, 2010b). Se han

identificado cisteíno y aspártico proteinasas activas en el jugo gástrico a pH ácido, a

las cuales se les atribuye que participan en la hidrólisis de proteína, sin embargo, se

desconoce si las proteinasas del tipo serino, participan en el proceso. De igual

manera se desconoce el tipo de proteinasas activas al pH fisiológico del jugo gástrico

de langosta y que por lo tanto son potenciales a participar en el proceso de hidrólisis

de proteína del alimento.

La caracterización de la actividad proteolítica llevada a cabo por las enzimas

digestivas de langosta americana constituye una parte importante en el estudio de la

fisiología digestiva de este organismo, además provee información complementaria

para el estudio de sus necesidades alimenticias y nutricionales (Holthuis, 1991). La

langosta americana es una especie de gran importancia económica, ya que

representa uno de los recursos de mayor valor monetario en algunos sitios en los

que se distribuye (Nicosia y Lavalli, 1999), dado esto, el conocimiento de la biología y

ecología de la especie en función es de gran importancia para su manejo y

conservación, así como para asegurar una explotación sustentable del mismo (Ward,

2000).

Por otro lado, debido las sus propiedades físicas, químicas y catalíticas de las

enzimas proteolíticas, pueden ser utilizadas para hidrolizar proteínas con propósitos

industriales. Por lo que el estudio de estas proteinasas podría contribuir a dar

información acerca del potencial como herramienta biotecnológica en las industrias,

alimentaria, farmacéutica y cosmética (Rasmussen y Morrissey, 2007).

14

4. PREGUNTA CIENTÍFICA

¿Las proteinasas del jugo gástrico que intervienen en la proteólisis, están

involucradas en un proceso secuencial o su participación en el proceso ocurre

meramente al azar? Si el proceso es llevado a cabo de manera secuencial, ¿cuál es

el papel que desempeña cada tipo de proteinasa?

15

5. OBJETIVOS

5.1 Objetivo general

• Describir el proceso de la proteólisis in vitro, que efectúan las proteinasas en

el jugo gástrico de langosta americana (Homarus americanus), a pH

fisiológico.

5.2 Objetivos específicos

• Identificar la composición de proteinasas presentes en el jugo gástrico de H.

americanus

• Describir el proceso de proteólisis en el jugo gástrico de H. americanus, a pH

fisiológico, utilizando extractos de proteína soluble de músculo de organismos

marinos y proteínas comerciales.

• Identificar el papel de las proteinasas en el proceso de proteólisis ocurrido en

el jugo gástrico de H. americanus, a pH fisiológico.

16

6. HIPÓTESIS

Si en otros sistemas digestivos de invertebrados, que basan la proteólisis en

aspártico y cisteíno proteinasas, la hidrólisis es un proceso secuencial que es

iniciado por alguna de ellas, permitiendo así la participación del resto, entonces las

proteinasas del jugo gástrico de langosta americana están involucradas en un

mecanismo similar.

17

7. MATERIAL Y MÉTODO

7.1 Obtención y procesamiento de jugo gástrico de langosta americana

Los ejemplares adultos de langosta americana fueron comprados en un

mercado local de la ciudad de San Francisco, California, EU. El jugo gástrico de

éstos se extrajo de los especímenes vivos y en ayuno, expuestos a condiciones

controladas de salinidad, temperatura y suministro de alimento; por succión,

utilizando una jeringa equipada con tu tubo de diámetro pequeño que se insertó por

la cavidad oral hasta la cavidad gástrica. Inmediatamente después del muestreo se

determinó el pH de las muestras y se transfirieron a tubos de 1.5 mL, los cuales

fueron centrifugados por 10 min a 10 000 g a 4 °C, con el fin de separar los sólidos.

El sobrenadante fue liofilizado y posteriormente almacenado a -20 °C. El extracto se

resuspendió en agua destilada a una concentración de 20 mg/mL, esta preparación

se empleó en los análisis posteriores.

7.2 Cuantificación de concentración de proteína y actividad proteolítica total

La concentración de proteína del jugo gástrico se cuantificó por el método de

Bradford (1976) utilizando BSA como proteína estándar. La actividad proteolítica total

se cuantificó empleando el método reportado por Díaz-López, et al. (1998), con la

modificación de que se empleó amortiguador de acetato de sodio 100mM a pH 4.7.

7.3 Identificación de proteinasas activas a pH fisiológico

Para determinar los tipos de proteinasas que se encuentran activas en el jugo

gástrico de langosta americana se evaluó la actividad enzimática mediante la técnica

de zimograma en geles de acrilamida 12% al pH fisiológico del jugo gástrico (pH 4.7)

18

y a pH alcalino (pH 8.0). Antes de la electroforesis se mezclaron 5 L de jugo

gástrico con 5 L de los inhibidores 1 mM Pefabloc, 1 mM E-64 y 1 mM Pepstatin A,

se incluyó un control que contenía DMSO, el solvente del Pepstatin A. El jugo

gástrico se incubó con los inhibidores durante una hora a temperatura ambiente.

Para contrastar los resultados, se repitió el ensayo ahora incubando con jugo

gástrico previamente tratado con ditrioteitol (DTT) 1.25 mM, con la finalidad de

observar el efecto de este sobre las proteinasas en los zimogramas, posterior al

tratamiento con DTT se siguió la misma metodología que se indica para las muestras

no tratadas con este agente.

Después de la incubación, la reacción fue frenada por la incorporación de

amortiguador de muestra 4X para SDS-PAGE. Las proteínas del jugo gástrico se

separaron en SDS-PAGE 12%. Para la evaluación de los zimogramas a pH ácido,

después de la electroforesis el gel se sometió a tres baños de 10 minutos con

amortiguador de acetato de sodio (100Mm, pH 4.7), con la finalidad de ajustar el pH

del gel. Inmediatamente después, los geles se incubaron a 4°C por 30 min con el

sustrato hemoglobina al 0.25% disuelta en amortiguador de acetato de sodio

(100mM, pH 4.7) y posteriormente a temperatura ambiente por 90 min. Para evaluar

la actividad a pH alcalino (pH 8), se empleó el procedimiento anterior, omitiendo los

baños de ajuste de pH, dado que éste ya presenta un pH alcalino tras la

electroforesis, además se utilizó caseína al 3% como sustrato, disuelta en

amortiguador Tris (50mM a pH 8.0). Finalizado el tiempo de incubación los geles

lavados y teñidos con la solución de Coomassie (0.05% azul de Coomassie R, 40%

Metanol, 7% ácido acético). Bandas claras en un fondo azul indica la presencia de

actividad proteolítica. El efecto de los inhibidores se medirá por comparación de la

intensidad de banda comparando los tratamientos con el control.

19

7.4 Extracción de Actina de Argopecten circularis.

Se realizó la extracción de proteína de músculo aductor de almeja (Argopecten

circularis), utilizando la metodología propuesta por Rodrigáñes, et al. (2011), con la

finalidad de emplearlo como sustrato en los experimentos posteriores a la par de

proteínas comerciales seleccionadas. A. circularis presenta una estrecha relación

evolutiva con los organismos de los cuales se alimenta esta langosta (Elner y

Campbell, 1987).

Los especímenes de A. circularis fueron adquiridos en un mercado local y

trasportados al laboratorio. El músculo aductor se disectó y se cortó en trozos de

aproximadamente un gramo, se añadió amortiguador (0.1M Tris-HCl, 0.25 sucrosa,

1Mm EDTA) a razón de 3:1. La extracción de proteína soluble se realizó por

maceración en un mortero y posteriormente se centrifugó a 10 000g por 10 min a 4

°C en tubos de plástico de 2mL. Después de la centrifugación, se recuperó el

sobrenadante y la proteína soluble se extraída se concentró por ultrafiltración en

membrana Amicon de 10 000 kDa de peso molecular de corte a 4 000 g por una hora

a 4 °C. Se cuantificó proteína del extracto de proteína soluble del extracto y se ajustó

la concentración a 6 mg/mL. El extracto de proteína soluble del músculo de A

circularis se almacenó a -20 ° C hasta su uso.

Se utilizó SDS-PAGE 8% para identificar la composición y masa molecular de

proteína en el músculo de A. circularis (Yamada et al. 2000). Se identificó a actina,

una proteína representativa de músculo, tanto de vertebrados como de

invertebrados, la que fue utilizada como sustrato.

20

7.5 Ensayo de hidrólisis de proteínas

Para investigar el proceso de proteólisis por las proteinasas digestivas de

langosta americana, se hicieron ensayos con tres sustratos: albúmina sérica bovina,

hemoglobina y extracto de proteína soluble del músculo de A. circularis. Un primer

ensayo de actividad con cada sustrato se realizó para obtener una aproximación al

tiempo en que se agota el sustrato en la reacción, para luego hacer reacciones en las

que se incluyeron inhibidores de aspártico, cisteíno y serino proteinasas.

Todas las reacciones se llevaron a cabo en tubos de plástico de 0.5 mL y a

temperatura ambiente. Para investigar el tiempo en que el sustrato se ha agotado en

la reacción, se incubó jugo gástrico (0.15 U/mL de actividad proteolítica a pH ácido)

con 1.25 mM DTT por 10 minutos. Las mezclas de reacción consistieron en: 20 L de

jugo gástrico tratado con DTT, 20 L de DMSO (que se emplearía en los siguientes

ensayos debido a que es el solvente de uno de los inhibidores empleados), 20 L de

amortiguador de acetato de sodio (350 mM, pH 4.7) y 40 L de agua destilada, las

reacciones se iniciaron con la adición de sustrato, todos los sustratos se emplearon a

una concentración de 6 mg/mL.

Las mezclas fueron incubadas por 1200 min, durante los cuales se llevaron a

cabo muestreos a los 0, 15, 60, 240 y 1200 min después de haber comenzado la

incubación, en cada uno de ellos se extrajeron 15 L de la muestra y se les adicionó

5 L de amortiguador de muestra 4X para DTT-SDS-PAGE (Laemmli, 1970). Se

colocaron los tubos en baño de agua hirviendo por 10 minutos para detener la

reacción. Posteriormente se refrigeraron hasta condensar y se centrifugaron a 10 000

g por 5 min a temperatura ambiente, para obtener el líquido condensado en las

paredes del tubo. Los productos de la hidrólisis en la mezcla de reacción de BSA y

de Actina se separaron por SDS-PAGE 12% y los productos de hidrólisis de

21

hemoglobina por SDS-PAGE 15%. Los geles se tiñeron para revelar proteína con

solución de Coomassie.

Los geles se documentaron en un equipo de análisis de imagen (GEL-DOCTM

IMAGE; Bio-Rad). Para el análisis se identificó la banda que corresponde a la

proteína comercial y a la actina en el extracto de proteína soluble del músculo de A.

circularis. Se comparó la cantidad de proteína remanente en cada tratamiento con la

resolución de la proteína utilizada como sustrato, mediante la técnica de

densitometría de imagen, utilizando el software (ImageLab 4.0.1). Con este

experimento se determinó el tiempo en que ocurre la hidrólisis completa del sustrato.

Luego se repitió el mismo experimento realizando los muestreos en el periodo de

tiempo identificado, con la finalidad de tener una aproximación más exacta a este.

7.6 Ensayo de inhibición de proteinasas

Con el objetivo de estudiar de qué manera están actuando las proteinasas del

jugo gástrico de langosta americana en la hidrólisis de los diferentes sustratos y de

esta manera poder identificar la presencia de proceso sucesivo en la hidrólisis, se

llevó a cabo un ensayo de inhibición, utilizando los inhibidores específicos de

proteinasas Pepstatin A (100 M), E-64 (100 M) y Pefabloc (100 M), los cuales

tienen la función de inhibir a las proteinasas de tipo aspártico, cisteíno y serino

respectivamente.

De igual manera que en el ensayo de hidrólisis de proteína, todas las

reacciones se llevaron a cabo en tubos de 0.5 mL a temperatura ambiente. Se inició

el ensayo con la activación de las cisteíno proteinasas del jugo gástrico (0.15 U/mL

de actividad proteolítica a pH ácido) incorporando 1.25 Mm de DTT al extracto y

dejando incubar por 10 min. Posteriormente se incorporaron los inhibidores, el

22

amortiguador de acetato de sodio (350 mM, pH 4.7) y el DMSO, como se muestra en

la tabla I y se dejaron en incubación por 30 min, finalmente se adicionaron 20 L de

sustrato (BSA, Hemoglobina y extracto de proteína soluble del musculo de A.

circularis) y se incubaron hasta el tiempo de hidrólisis máxima de cada uno,

identificado en el experimento anterior. Al finalizarla incubación se extrajeron 15 L

de cada una de las muestras y se les adicionó 5 L de amortiguador de muestra 4X

para DTT-SDS-PAGE. Se colocaron los tubos en baño de agua hirviendo por 10

minutos para detener la reacción. Posteriormente se refrigeraron hasta condensar y

se centrifugaron a 10 000 g por 5 min a temperatura ambiente, para obtener el

líquido condensado en las paredes del tubo. Los productos de la hidrólisis en la

mezcla de reacción de BSA y de Actina se separaron por SDS-PAGE 12% y los

productos de hidrólisis de hemoglobina por SDS-PAGE 15%. Los geles se tiñeron

para revelar proteína con solución de Coomassie. Este experimento se llevó a cabo

por triplicado para cada una de los sustratos experimentales.

Tabla I Protocolo de reacciones del ensayo de inhibición. Se muestran los componentes y el

volumen (μL) de cada uno de ellos, empleado para llevar a cabo cada tratamiento.

Tubo Muestra JG+ DTT

(L)

Buffer

(L)

DMSO

(L)

Pepstatin A

(L)

E-64

(L)

Pefabloc

(L)

H20

(L)

1 Control 10 10 10 - - - 20

2 Sustrato (s) - 10 - 10 10 10 10

3 Enzima (E) 10 10 - 10 10 10 20

4 Peps A 10 10 - 10 - - 20

5 E-64 10 10 10 - 10 - 10

6 Pefabloc 10 10 10 - - 10 10

7 Peps A+E-64 10 10 - 10 10 - 10

8 Peps A+Pefa 10 10 - 10 - 10 10

9 E-64+Pefa 10 10 10 - 10 10 -

10 PepsA+E-64+Pefa 10 10 - 10 10 10 -

Los geles se documentaron en el equipo de análisis de imagen (GEL-DOCTM

IMAGE; Bio-Rad). Para el análisis se identificó la banda que corresponde a la

proteína empleada como sustrato y comparó la cantidad de proteína remanente en

cada tratamiento por densitometría de imagen, usando el software (ImageLab 4.0.1).

23

7.7 Análisis estadístico

Para cada tratamiento de sustratos, se probó normalidad y homocedasticidad

de varianzas y se realizaron análisis estadísticos en el software STATISTICA 7, para

determinar diferencias entre cada tratamiento de inhibidores. Mediante un análisis de

varianza de una vía (ANOVA) se determinó la presencia de diferencias significativas

(p≤0.05) entre cada tratamiento de cada uno de los sustratos y posteriormente se

utilizó la prueba de diferencia de medias Tukey (Zar, 1984) para determinar grupos

sin diferencias significativas.

24

8. RESULTADOS

8.1 Las proteinasas del jugo gástrico de langosta americana.

La actividad de las proteinasas del jugo gástrico de langosta americana se

identificó mediante un análisis del efecto de diferentes inhibidores, utilizando como

base las bandas en los zimogramas realizados. Se observó que a pH 8.0 hay nueve

bandas de actividad, de las cuales seis de ellas no son visibles en los carriles donde

se colocaron las muestras con E-64 (Figura 1-C), lo cual indica que pertenecen a la

clase cisteíno (18.5, 37, 42, 48, 54 y 60 kDa), otras dos bandas disminuyen

su actividad en las muestras que contenían Pefabloc, por lo que se puede considerar

una proteinasa de la clase serino (Figura 1-D); la banda restante pertenece a la clase

aspártico (37 kDa) dado que se vio reducida su actividad en las muestras que

fueron incubadas con Pepstatin A como se observa en la figura 1-A.

Por otro lado, en el zimograma a pH 4.7 incubado con DTT se identifican seis

bandas de actividad, todas ellas observadas en el zimograma a pH 8.0, sin embargo,

presentan una mayor intensidad (Figura 1-A,B), lo que hace que la cisteíno petidasa

de 37kDa no se pueda identificar. Las muestras que contenían Pefabloc como

inhibidor no vieron afectada su actividad, lo cual señala que las serino proteinasas no

están activas a pH 4.7 (Figura 1-A,C).

25

Figura 1 Zimograma que muestra el efecto de diferentes inhibidores específicos de proteinasas

sobre la actividad proteolítica del jugo gástrico de langosta americana, sin la presencia de DTT,

A) zimograma a pH 4.7 con Hemoglobina como sustrato; B) zimograma de actividad a pH 8.0

con caseína como sustrato y con DTT, C zimograma a pH 4.7 con Hemoglobina como sustrato;

D) zimograma de actividad a pH 8.0 con caseína como sustrato Las flechas señalan los sitios

donde la actividad disminuyó. Mw = Marcador de peso molecular. C = Actividad proteinolítica

del jugo gástrico. P = Efecto de pesptatin A sobre el jugo gástrico. E = efecto del E-64 sobre el

jugo gástrico. F = efecto del Pefabloc sobre el jugo gástrico.

26

8.2 Proteínas del músculo de Actinopecten circularis.

Por medio de electroforesis se identificó las proteínas presentes en el músculo

de Argopecten circularis, Miosina (220 kDa), Paramiosina (111 kDa) y Actina (42

kDa) (Figura 2). Dado la abundancia de la Actina, bajo las condiciones

experimentales de este trabajo, se tomó como proteína referente en el resto de los

experimentos.

Figura 2 SDS-PAGE de las principales proteínas presentes en el músculo de A. circularis. LMH

y HMW son marcadores de peso molecular, alto y bajo respectivamente.

8.3 Monitoreo temporal del proceso de poroteólisis

Mediante un análisis de intensidad de banda por densitometría, se realizó un

monitoreo de los productos de hidrólisis de los sustratos a diferentes tiempos de

reacción por las proteinasas del jugo gástrico de langosta americana, para evaluar el

tiempo en que el sustrato se agota en la reacción.

27

La hidrólisis del BSA (66.0-kDa), ocurre de manera exponencial durante los 90

min posteriores al inicio de reacción, hidrolizando aproximadamente el 80% de la

proteína, después de este tiempo, la hidrólisis ocurre más lentamente, siguiendo un

patrón lineal, hasta aproximadamente hasta los 360 min después de la exposición

con el jugo gástrico, después de este tiempo la hidrólisis se detiene, observándose

una pequeña fracción de proteína remanente (Figura 3).

Figura 3. Hidrólisis de BSA por acción de las proteinasas presentes en el jugo gástrico de H.

americanus, a pH 4.7. A) SDS-PAGE de la hidrólisis de BSA como sustrato a diferentes tiempos

de muestreo (0, 15, 60, 240, 1200 min). Mw = marcador de peso molecular; E = enzima pura; S =

sustrato. B) Representación gráfica de la hidrólisis BSA, determinada por los cambios en la

densidad óptica. Los resultados se encuentran expresados como la cantidad remanente de

proteína detectada en SDS-PAGE, después de incubar por 360 min.

28

En el caso de la hemoglobina (14.4-kDa), la degradación ocurre rápidamente

durante los primeros 15 minutos, luego disminuye la cantidad de proteína cerca del

50%. Posterior a esto, el potencial de hidrólisis ocurre de una manera más lenta, en

donde se presentó patrón lineal, hasta degradarse completamente pasados 480 min

desde el inicio de la reacción (Figura 4).

Figura 4. Hidrólisis de Hemoglobina por acción de las proteinasas presentes en el jugo gástrico

de H. americanus, a pH 4.7. A) SDS-PAGE de la hidrólisis de Hemoglobina como sustrato a

diferentes tiempos de muestreo (0, 15, 60, 240, 480, 600, 1200 min). Mw = marcador de peso

molecular; E = enzima pura; S = sustrato. B) Representación gráfica de la hidrólisis de

hemoglobina, determinada por los cambios en la densidad óptica. Los resultados se

encuentran expresados como la cantidad residual de proteína detectada en SDS-PAGE,

después de incubar por 480 min.

A

29

El efecto de la hidrólisis de la actina (42 kDa) ocurre de una manera similar a

la hidrólisis del BSA y la hemoglobina, es decir, se presenta un decremento

exponencial durante el inicio de la reacción, hasta disminuir a aproximadamente un

80% de la cantidad de proteína original durante los primeros 15 min; además

presenta un decremento lineal que se prolonga hasta los primeros 60 min de la

reacción, posterior a este tiempo, la degradación de proteína ha ocurrido casi en su

totalidad (Figura 5).

Figura 5. Hidrólisis de Actina de A. circularis por acción de las proteinasas presentes en el jugo

gástrico de H. americanus, a pH 4.7. A) SDS-PAGE de la hidrólisis de Actina de extracto

muscular de A. circularis, a diferentes tiempos de muestreo (0, 15, 60, 240, 360, 1200 min). Mw =

marcador de peso molecular; E = enzima pura; S = sustrato. B) Representación gráfica de la

hidrólisis Actina, determinada por los cambios en la densidad óptica. Los resultados se

encuentran expresados como la cantidad residual de proteína detectada en SDS-PAGE,

después de incubar por 240 min.

30

8.4 Ensayo de inhibición de proteinasas

La hidrólisis de BSA, en las muestras que fueron incubadas con los inhibidores

Pepstatin A, E-64 y Pefabloc por separado, muestra variaciones significativas en la

cantidad de proteína remanente. Las muestras incubadas con Pepstatin A y Pefabloc

presentan una cantidad de proteína cercana al 0%, lo que indica que la hidrólisis se

llevó a cabo en su totalidad, en cambio las muestras incubadas con E-64 muestran

cerca del 60% de proteína remanente, lo cual señala que la hidrólisis de proteína se

llevó a cabo parcialmente. Por otro lado, el resultado cambia al incubar las muestras

con mezclas de los distintos inhibidores. Las muestras incubadas con Pepstatin A y

E-64, al igual que las incubadas con los tres inhibidores presentaron valores

estadísticamente iguales a la cantidad de proteína pura utilizada como sustrato, lo

que indica que la hidrólisis se detuvo. Sin embargo, no ocurre lo mismo al incubar las

muestras con Pepstatin A y Pefabloc, ya que la hidrólisis no se detiene. Al incubar E-

64 y Pefabloc, se presenta el mismo efecto que incubar únicamente con E-64. Como

se muestra en la figura 6-B y corroborado con el análisis de varianza y la prueba

Tukey (P < 0.05) los tratamientos que contenían Pepstatin A+E-64 y Pepstatin A y la

combinación de los tres inhibidores son significativamente iguales al control negativo;

de igual manera, las muestras que contenían E-64 y E-64+Pefabloc son

estadísticamente iguales entre sí; así mismo, las muestras que contenían Pepstatin

A, Pefabloc y la combinación de ambos son significativamente iguales (Figura 6).

31

Figura 6 Representación gráfica (A) de la hidrólisis de BSA por acción de las proteinasas

presentes en el jugo gástrico de H. americanus, en ausencia o presencia de inhibidores

específicos. La imagen muestra la cantidad de proteína remanente, observada en SDS-PAGE

(B), después del tiempo de hidrólisis máxima (360 min), comparada con la cantidad de proteína

del sustrato puro (S). Cada barra representa la media de las tres réplicas. Barras con la misma

letra señalan que no existen diferencia significativas (P < 0.05). (MW = Marcador de peso

molecular; C = control; JG = jugo gástrico; P = Pepstatin A; E = E-64; F = Pefabloc).

La hidrólisis de hemoglobina, en las muestras que fueron incubadas con

Pepstatin A, E-64, Pepstatin A + Pefabloc y E-64 + Pefabloc mostraron muy poca

variación en el grado de hidrólisis, mostrándose valores que van desde el 15% al

30% de cantidad de proteína remanente, lo cual, en base a análisis estadísticos, los

hace iguales (P < 0.05). Por otro lado, en las muestras incubadas con los inhibidores

Pepstatin A + E-64 y con la mezcla de los tres inhibidores, se observa una cantidad

de proteína remanente que va del 85% al 90% respectivamente, lo cual, junto con el

control, los hace estadísticamente iguales (Figura 7).

32

Figura 7 Representación gráfica (A) de la hidrólisis de BSA por acción de las proteinasas

presentes en el jugo gástrico de H. americanus, en ausencia o presencia de inhibidores

específicos. La imagen muestra la cantidad de proteína remanente, observada en SDS-PAGE

(B), después del tiempo de hidrólisis máxima (480 min), comparada con la cantidad de proteína

del sustrato puro (S). Cada barra representa la media de las tres réplicas. Barras con la misma

letra señalan que no existen diferencia significativas (P < 0.05). (MW = Marcador de peso

molecular; C = control; JG = juago gástrico; P = Pepstatin A; E = E-64; F = Pefabloc).

La hidrolisis de la Actina extraída de Argopecten circularis, presenta gran

semejanza con la hidrólisis de BSA, en relación a la manera en que los inhibidores

actúan sobre las proteinasas, ya que el resultado al utilizar Pepstatin A y Pefabloc

por separado y en una mezcla de ambos, no producen ningún efecto sobre la

hidrólisis, consumiéndose casi el 100% de la proteína. Al incubar con E-64 de

manera individual y en combinación con Pefabloc, los efectos sobre la hidrólisis son

muy similares, observándose cantidades de proteína remanente de 27%. Los efectos

al incubar las reacciones con Pesptatina A y E-64 en conjunto, muestran los mismos

resultados que se observan con BSA y Hemoglobina, ya que frenan casi en su

totalidad la hidrólisis, de igual manera ocurre al incubar con la mezcla de los tres

33

inhibidores. Los análisis estadísticos muestran resultados muy similares al ensayo

realizado con BSA (Figura 8).

Figura 8. Representación gráfica (A) de la hidrólisis de BSA por acción de las proteinasas

presentes en el jugo gástrico de H. americanus, en ausencia o presencia de inhibidores

específicos. La imagen muestra la cantidad de proteína remanente, observada en SDS-PAGE

(B), después del tiempo de hidrólisis máxima (240 min), comparada con la cantidad de proteína

del sustrato puro (S). Cada barra representa la media de las tres réplicas. Barras con la misma

letra señalan que no existen diferencia significativas (P < 0.05). (MW = Marcador de peso

molecular; C = control; JG = jugo gástrico; P = Pepstatin A; E = E-64; F = Pefabloc).

34

9. DISCUSIÓN

9.1 Identificación de proteinasas en el jugo gástrico de langosta americana.

Las serino proteinasas tripsina y quimotripsina, son los componentes

proteinolíticos más comunes en el tracto digestivo de crustáceos decápodos

estudiados a la fecha (Tsai et al. 1991; Celis-Guerrero et al. 2004; Navarrete del Toro

et al. 2011). Dado el mecanismo de catálisis de estas proteinasas, su pH óptimo es

alcalino (pH ~8.0). Brockerhoff et al. (1970) determinó la presencia de serino

proteinasas en Homarus americanus a pH alcalino; sin embargo, Rojo et al. (2010a)

señalan que no presentan actividad al pH fisiológico de la langosta, lo cual concuerda

con los resultados obtenidos en este estudio. Las serino proteinasas se encontraron

activas en los zimogrmas a pH alcalino pero no así al pH fisiológico de la langosta, lo

cual sugiere que estas no participan en el proceso de hidrólisis de proteína al pH

fisiológico.

En el presente trabajo se destaca la presencia de una aspártico proteinasa,

que corresponde a la catepsina D1 purificada y caracterizada por Rojo et al. (2010a;

2010b; 2013). Sin embargo, la actividad más conspicua identificada en los

zimogramas corresponde a cisteíno proteinasas, tipo catalítico del que se

identificaron múltiples bandas de actividad. De las cisteíno proteinasas identificadas

en el presente trabajo, al menos una de ellas corresponde a una Catepsina L

(Laycock et al. 1991).

Por otro lado, es evidente la presencia de una proteinasa de tipo aspártico y

varias del tipo cisteíno activas tanto a pH fisiológico como a pH alcalino; sin embargo,

a pH alcalino observa disminuida su actividad, ya que, tanto las aspártico como

cisteíno proteinasas se caracterizan por tener un pH óptimo y estabilidad a pH ácido

35

y son inestables a pH alcalino (Mihalyi, 1978; Whitaker, 1994). De las proteinasas

que se encontraron activas en los zimogramas, a pH ácido y alcalino, se puede

identificar la catepsina L reportada por Laycock et al. (1991) y la catepsina D1

reportada por Rojo et al. (2010a,b). La actividad mostrada por las cisteíno

proteinasas a pH 8.0, a pesar de saber que su actividad es muy baja a este pH

(Whitaker, 1994) se debe posiblemente a la presencia de ditioterietol (DTT) en las

muestras, ya que este compuesto protege a las cisteíno proteinasas del contacto con

el oxígeno, manteniendo un ambiente reductor (-SH) y de esta manera pueden

mantener su actividad (Price, 1991).

9.2 Monitoreo de la hidrólisis de proteína.

El objetivo del presente estudio fue conocer el mecanismo de hidrólisis de

proteína por acción de las proteinasas del jugo gástrico de H. americanus, y así

observar el comportamiento de la hidrólisis de tres distintas proteínas a través del

tiempo. Dos de los sustratos empleados son proteínas comerciales (BSA y

Hemoglobina), mientras que la actina, se extrajo del músculo abductor de la almeja

catarina (A. circularis) con el fin de representar de una manera más cercana, el

proceso de proteólisis en el jugo gástrico, en condiciones naturales (Figura 5).

El presente estudio muestra que BSA, Hemoglobina y Actina, son proteínas

que son hidrolizadas por las enzimas del jugo gástrico, sin embargo, la eficiencia de

las proteinasas para llevar a cabo la hidrólisis, depende del sustrato. En todos los

experimentos se empleó la misma cantidad de unidades de actividad proteolítica

total, sin embargo, el tiempo en que se registró el agotamiento del sustrato varió.

Mientras que la hidrólisis de la Actina es muy eficiente (~60 min) (Figura 5), la

hidrólisis del BSA y la hemoglobina se lleva a cabo muy lentamente (~360 min y ~

480 min, figura 3 y 4 respectivamente). La variación en la duración y la manera en

que se lleva a cabo la hidrólisis de las proteínas depende principalmente de la

36

solubilidad, la complejidad estructural y la composición de aminoácidos de las

proteínas (Rodrigañez, et al. 2011).

9.3 Participación de las proteinasas en la hidrólisis.

Los resultados obtenidos del ensayo de inhibición, apuntan a que las serino

proteinasas no representan un papel importante en la hidrólisis de proteína, ya que a

este tipo de proteínas están generalmente inactivas, de tal manera que al incluir

inhibidores de serino proteinasas, la hidrólisis de los sustratos proteicos puede

continuar (Rawlings y Salvesen, 2003). Esto sugiere que las proteinasas

involucradas en esta función son las de tipo cisteíno y aspártico.

Los resultados arrojados en los ensayos de inhibición específica de

proteinasas señalan que al inhibir las proteinasas de tipo cisteíno, la hidrólisis de

proteína se detiene un 65% en el caso del BSA y un 50% en el caso de la actina, sin

embargo, al inhibir las proteinasas de tipo aspártico la hidrólisis no se detiene, ya que

la hidrólisis se lleva a cabo en su totalidad (Figura 6 y 8 respectivamente). Al inhibir

tanto aspártico como cisteíno proteinasas, la hidrólisis se detiene casi en su totalidad,

observando una cantidad de proteína remanente muy similar a la de la proteína pura

utilizada como sustrato. Este mismo fenómeno ocurre al inhibir los tres tipos de

proteinasas, y dado que las serino proteinasas no están participando, se sugiere que

la hidrólisis de la proteína por parte de las cisteíno proteinasas es necesaria para que

las de tipo aspártico puedan participar en la hidrólisis del sustrato. Este fenómeno

apunta a un posible proceso secuencial de proteólisis, en donde, una vez que las

cisteíno proteinasas hayan hidrolizado a la proteína, las aspártico proteinasas en

sinergismo con las cisteíno van a hidrolizar los péptidos restantes hasta degradarlos

a aminoácidos o péptidos más pequeños (Figura 9). Un proceso secuencial en el

proceso de proteólisis ha sido identificado en el tracto digestivo de vertebrados

(Lenaric et al. 1991) donde la catepsina D se encarga de fragmentar a la proteína y

37

de esta manera las cisteíno en sinergia con la catepsina D, actúan rompiendo los

enlaces peptídicos de los fragmentos más pequeños. De igual manera, dentro del

grupo de los artrópodos se ha observado un mecanismo similar. Se ha demostrado

que en el proceso de degradación del alimento del escarabajo de la papa de

Colorado (Leptinotarsa decemlineata), la catepsina D inicia la hidrólisis de la

proteína, rompiendo los enlaces peptídicos de esta, produciendo fragmentos, las

cisteíno participar en la hidrólisis de proteína (Brunelle et al. 1991), de igual manera

se ha identificado este mismo proceso en el sistema digestivo del escarabajo de la

semilla de frijol (Callosobruchus maculatus) (Ahn y Zhu-Salzman, 2009).

La catepsina D y la catepsina L son las únicas proteinasas que han sido

identificadas en el jugo gástrico de langosta americana a pH ácido (Laycock, et al.

1998; Rojo et al. 2010a, 2010b). Se sabe que la catepsina D tiene afinidad por lo

aminoácidos hidrofóbicos (leucina y fenilalanina principalmente) (Sun, et al. 2013), de

igual manera la catepsina L muestra afinidad por este mismo tipo de aminoácidos

(Rawlings y Barrett, 1993). Al poseer afinidad por el mismo tipo de aminoácidos, se

sugiere que otros factores, independientes a la composición de aminoácidos, están

siendo determinantes para que se efectúe la proteólisis.

De manera general, las proteínas en su estructura terciaria, presentan la

mayor parte de sus aminoácidos hidrofóbicos orientados hacia el interior de la

molécula (Bajaj y Blundell, 1984), lo que haría imposible la participación tanto de la

catepsina D como de la catepsina L en la proteólisis. Sin embargo, la catepsina L de

langosta americana podría presentar características únicas de especificidad,

reconociendo además residuos hidrofílicos, tal como se ha reportado para catepsinas

L de otros invertebrados (Horn et al. 2009). Esto facilitaría a la catepsina L participar

inicialmente en la hidrólisis y, posteriormente, permitir a la catepsina D participar en

el proceso. Otro posible escenario, que sustenta la participación de las cisteíno

proteinasas en el inicio de la hidrólisis de proteína, dada la presencia de varias

38

bandas de actividad observadas en los zimogramas a pH ácido, sugiere que el jugo

gástrico de langosta americana podría presentar otros tipos de cisteíno proteinasas,

que están participando en la hidrólisis, por ejemplo catepsina B, la cual ha sido

identificada recientemente en otros sistemas de decápodos (Aoki et al. 2004;

Stephens et al. 2012). La catepsina B tiene afinidad por aminoácidos hidrófobicos

grandes y además tiene la particularidad de reconocer residuos básicos,

principalmente arginina (Hasnain et al. 1993), los cuales, al ser hidrofílicos, suelen

encontrarse en la periferia de las proteínas (Berg et al. 2002). Facilitando así, que las

proteinasas puedan hidrolizar el sustrato.

Figura 9 Diagrama de la degradación de BSA y Hemoglobina por acción de las péptidas del

jugo gástrico de H. americanus. La proteína ingerida que llega al jugo gástrica es fragmentada

por acción de las cisteíno proteinasas, lo cual expone los sitios catalíticos para que las

aspártico proteinasas puedan actuar; ambas enzimas degradan los fragmentos a péptidos para

que, posteriormente, puedan ser absorbidos por el epitelio.

39

Por otro lado la manera en que actúan de las proteinasas en la proteólisis, va

a estar determinada por la naturaleza del sustrato (Sun et al. 2013). Al incubar la

Hemoglobina con las enzimas del jugo gástrico, se observa que tanto las proteinasas

de tipo cisteíno como las de tipo aspártico pueden llevar a cabo la hidrólisis de

proteína, ya que independientemente de la inhibición de alguna de ellas, la

hemoglobina es hidrolizada, esto señala que ambas proteinasas participan en la

proteólisis, posiblemente de manera sinérgica y, por lo tanto, no existe un paso

limitante para que se lleve a cabo la hidrólisis. Un estudio donde llevaron a cabo

reacciones de inhibición de cisteíno y aspártico proteinasas de Plasmodium

falciparum, vector de la malaria, para hidrolizar hemoglobina, demostró la

inespecificidad de ambas proteinasas al sustrato, de igual manera demostraron la

necesidad de ambos tipos para llevar a cabo la hidrólisis de hemoglobina (Semenov

et al. 1989). Algo similar ha sido observado en las enzimas proteolíticas de tipo

aspártico CmCatD y cisteíno CmCPS del escarabajo de la semilla del frijol

(Callosobruchus maculatus), de igual manera actúan en conjunto, sin embargo,

cuando las aspártico proteinasa está ausente, la cisteíno aumenta su actividad (Ahn

y Zhu-Salzman, 2009); en estos trabajos la catepsina D siempre es más eficiente,

que otros tipos de proteinasas en hidrolizar a la hemoglobina. Por otro lado, se ha

sugerido que la catepsina D, apoyada en menor medida por la catepsina L, están

involucradas en el primer paso del proceso de hidrólisis de hemoglobina y

posteriormente el resto de las proteinasas continúan con la hidrólisis (Horn et al.

2009). Dado que estas dos proteinasas, son las únicas que se han identificado bajo

las condiciones de estudio, se podría sugerir que éstas den inicio a la hidrólisis,

permitiendo a los demás tipos de proteinasas, aún no identificados, participar en la

hidrólisis.

40

10. CONCLUSIONES

En el jugo gástrico de Homarus americanus se presentan proteinasas de tipo

aspártico, cisteíno activas a pH fisiológico (pH 4.7) y con poca actividad a pH

alcalino, por el contrario, se encuentran serino proteinasas activas a pH alcalino y

ausentes de actividad a pH ácido.

La Albúmina sérica bovina, la hemoglobina y la actina, son proteínas que son

hidrolizadas por las proteinasas del jugo gástrico.

El proceso de hidrólisis de las proteínas va a depender del sustrato sobre el que

actúan las proteinasas.

El proceso de proteólisis del jugo gástrico de Homarus americanus sobre algunas

proteínas se lleva a cabo de forma secuencial, ya que la intervención de la

proteinasas de tipo cisteíno, en la hidrólisis de algunas proteínas, representan un

paso limitante para que las proteinasas de tipo aspártico puedan involucrarse en

el proceso.

41

11. RECOMENDACIONES

Se recomienda llevar a cabo investigaciones posteriores, con el fin de

identificar los tipos de cisteíno proteinasas, aún desconocidas, observadas en los

zimogramas a pH fisiológico y llevar a cabo estudios utilizando inhibidores de cada

una de ellas para, de esta manera, describir con más detalle el procesos de hidrólisis

de proteína en el jugo gástrico de langosta americana.

42

12. REFERENCIAS

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48

13. LISTA DE TABLAS Y FIGURAS

Tabla II. Protocolo de reacciones del ensayo de inhibición. Se muestran los

componentes y el volumen (μL) de cada uno de ellos, empleado para llevar a cabo

cada tratamiento.

Figura 9. Zimograma que muestra el efecto de diferentes inhibidores específicos de

proteinasas sobre la actividad proteolítica del jugo gástrico de langosta americana,

sin la presencia de DTT, A) zimograma a pH 4.7 con Hemoglobina como sustrato; B)

zimograma de actividad a pH 8.0 con caseína como sustrato y con DTT, C

zimograma a pH 4.7 con Hemoglobina como sustrato; D) zimograma de actividad a

pH 8.0 con caseína como sustrato Las flechas señalan los sitios donde la actividad

disminuyó. Mw = Marcador de peso molecular. C = Actividad proteinolítica del jugo

gástrico. P = Efecto de pesptatin A sobre el jugo gástrico. E = efecto del E-64 sobre

el jugo gástrico. F = efecto del Pefabloc sobre el jugo gástrico.

Figura 10. SDS-PAGE de las principales proteínas presentes en el músculo de A.

circularis. LMH y HMW son marcadores de peso molecular, alto y bajo

respectivamente.

Figura 11. Hidrólisis de BSA por acción de las proteinasas presentes en el jugo

gástrico de H. americanus, a pH 4.7. A) SDS-PAGE de la hidrólisis de BSA como

sustrato a diferentes tiempos de muestreo (0, 15, 60, 240, 1200 min). Mw = marcador

de peso molecular; E = enzima pura; S = sustrato. B) Representación gráfica de la

hidrólisis BSA, determinada por los cambios en la densidad óptica. Los resultados se

encuentran expresados como la cantidad remanente de proteína detectada en SDS-

PAGE, después de incubar por 360 min.

Figura 12. Hidrólisis de Hemoglobina por acción de las proteinasas presentes en el

jugo gástrico de H. americanus, a pH 4.7. A) SDS-PAGE de la hidrólisis de

Hemoglobina como sustrato a diferentes tiempos de muestreo (0, 15, 60, 240, 480,

600, 1200 min). Mw = marcador de peso molecular; E = enzima pura; S = sustrato. B)

Representación gráfica de la hidrólisis de hemoglobina, determinada por los cambios

49

en la densidad óptica. Los resultados se encuentran expresados como la cantidad

residual de proteína detectada en SDS-PAGE, después de incubar por 480 min.

Figura 13. Hidrólisis de Actina de A. circularis por acción de las proteinasas

presentes en el jugo gástrico de H. americanus, a pH 4.7. A) SDS-PAGE de la

hidrólisis de Actina de extracto muscular de A. circularis, a diferentes tiempos de

muestreo (0, 15, 60, 240, 360, 1200 min). Mw = marcador de peso molecular; E =

enzima pura; S = sustrato. B) Representación gráfica de la hidrólisis Actina,

determinada por los cambios en la densidad óptica. Los resultados se encuentran

expresados como la cantidad residual de proteína detectada en SDS-PAGE, después

de incubar por 240 min.

Figura 14 Representación gráfica (A) de la hidrólisis de BSA por acción de las

proteinasas presentes en el jugo gástrico de H. americanus, en ausencia o presencia

de inhibidores específicos. La imagen muestra la cantidad de proteína remanente,

observada en SDS-PAGE (B), después del tiempo de hidrólisis máxima (360 min),

comparada con la cantidad de proteína del sustrato puro (S). Cada barra representa

la media de las tres réplicas. Barras con la misma letra señalan que no existen

diferencia significativas (P < 0.05). (MW = Marcador de peso molecular; C = control;

JG = jugo gástrico; P = Pepstatin A; E = E-64; F = Pefabloc).

Figura 15 Representación gráfica (A) de la hidrólisis de BSA por acción de las

proteinasas presentes en el jugo gástrico de H. americanus, en ausencia o presencia

de inhibidores específicos. La imagen muestra la cantidad de proteína remanente,

observada en SDS-PAGE (B), después del tiempo de hidrólisis máxima (480 min),

comparada con la cantidad de proteína del sustrato puro (S). Cada barra representa

la media de las tres réplicas. Barras con la misma letra señalan que no existen

diferencia significativas (P < 0.05). (MW = Marcador de peso molecular; C = control;

JG = juago gástrico; P = Pepstatin A; E = E-64; F = Pefabloc).

Figura 16. Representación gráfica (A) de la hidrólisis de BSA por acción de las

proteinasas presentes en el jugo gástrico de H. americanus, en ausencia o presencia

de inhibidores específicos. La imagen muestra la cantidad de proteína remanente,

50

observada en SDS-PAGE (B), después del tiempo de hidrólisis máxima (240 min),

comparada con la cantidad de proteína del sustrato puro (S). Cada barra representa

la media de las tres réplicas. Barras con la misma letra señalan que no existen

diferencia significativas (P < 0.05). (MW = Marcador de peso molecular; C = control;

JG = jugo gástrico; P = Pepstatin A; E = E-64; F = Pefabloc).