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DOCTORADO EN CIENCIAS Y BIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS

Uso de diferentes estrategias para mejorar la micropropagación de cocotero a partir de

explantes de plúmula y de inflorescencia inmadura

Tesis que para obtener el grado de Doctor en Ciencias

Presenta:

M.C. Antonio Andrade Torres

Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.

Mérida, Yucatán, México

2011

Mérida, Yucatán, México, a 06 de octubre de 2011

DECLARACIÓN DE PROPIEDAD:

Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación Científica de Yucatán , A.C ., y que a razón de lo anterior y en contraprestación de los servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados, dicha información, en términos de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial , le pertenece patrimonialmente a dicho Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya manifestado, reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollos tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo correspondiente a dicha información, le pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación Científica, A.C., y en el mismo tenor, reconozco que si derivaran de este trabajo productos intelectuales o desarrollos tecnológicos, en lo especial , estos se regirán en todo caso por lo dispuesto por la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial , en el tenor de lo expuesto en la presente Declaración.

CENTRO DE INVESTIGACION CIENTIFICA DE YUCA TAN A.C. POSGRADO EN CIENCIAS Y BIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS

RECONOCIMIENTO

Por medio de la presente, hago constar que el trabajo de tesis titulado

"Uso de diferentes estrategias para mejorar la micropropagación de

cocotero a partir de explantes de plúmula y de inflorescencia inmadura"

fue realizado en los laboratorios de la Unidad de Biotecnología del

Centro de Investigación Científica de Yucatán , A.C. bajo la dirección del

Dr. Carlos Mariano Oropeza Salín , dentro de la Opción Doctorado

Después de Maestría, perteneciente al Programa de Posgrado en

Ciencias y Biotecnología de Plantas de este Centro.

Atentamente,

Director Académico

Centro de Investigación Científica de Yucatán, AC.

111

Reconocimientos

El presente trabajo se desarrolló bajo la dirección del Dr. Carlos Oropeza en el laboratorio de cocotero de la Unidad de Biotecnología del Centro de Investigación Científica de Yucatán, Mérida, Yucatán.

El Comité Tutoral de este trabajo estuvo integrado por el Dr. Carlos Oropeza (CICY-UBT), Dr. Luis Sáenz (CICY-UBT), Dr. Manuel L. Robert (CICY-UBT), Dr. Luis Carlos Rodríguez (CICY-UBT) y Dr. Alfonso Azpeitia (1 N 1 FAP-Tabasco) .

Este proyecto fue parcialmente financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (proyecto número 43834-Z).

Este trabajo fue desarrollado con el apoyo de una beca para estudios de doctorado otorgada por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (número 204774).

Se contó con el apoyo de la Universidad Veracruzana a través de la Dirección General de Desarrollo Académico (DGDA) y la Dirección General de Investigaciones (DGI). La DGDA tramitó un apoyo del PROMEP para la fase de redacción de tesis (PROMEP/1 03.5/10/5675, UV-491 ).

V

Al M.C. Bartolomé Chi por el apoyo técnico y sugerencias en el cultivo de Agrobacterium tumefaciens.

Al lng . Bioq. José Germán Nic por el apoyo técnico y sugerencias respecto a la clonación de secuencias con pGEM.

A la lng. Bioq. Ana Colli por el apoyo técnico en la extracción de ADN de callo embriogénico de Cocos nucifera.

A los compañeros del laboratorio de cocotero con quienes interactué durante mi estancia: Mayra, Germán (Nic) , Carlos (Ka 'ax) , Ana, Rafael (Rafita) , Roberto, Carmen y Candy.

A todo el grupo de cocotero por todo su apoyo y por la convivencia sana y amena que siempre tuvimos.

Al Mtro. Eric Hernández Velasco por el apoyo brindado desde la administración deiiNBIOTECA durante mi estancia en CICY.

A la L.C. Norma Mendoza López, Administradora del INBIOTECA, UV, por el apoyo brindado en el proceso para concluir este proyecto durante este último año.

A la L.C . Wendy Castillo López, analista PROMEP, adscrita a la administración de la DGDA de la UV, por todo el apoyo brindado respecto al proyecto PROMEP asignado para concluir la presente tesis Doctoral.

A la Lic. Ma. Oiga Sobrino Ortiz, del Departamento de Superación Académica de la UV, Responsable de seguimiento académico a becarios PROMEP, por todo el apoyo brindado respecto al proceso para obtener la beca y posterior a ello.

vm

Dedicatorias

A mi madre, Rita Torres Hernández, a quien amo profundamente y admiro, porque sin importar las circunstancias siempre tiene una opinión inteligente, la fortaleza y determinación para seguir adelante, y siempre ha sabido transmitirnos amor.

A mi padre Bernardo Andrade Martínez, gracias por alentarme a alcanzar las metas.

A Laura Yesenia Solís Ramos, amare del/a mia vita l Gracias por el apoyo durante todo este proceso. Te amo.

A mis hermanos Ana, Cecilia, Bernardo y José Luis, a quienes amo y con quienes he compartido hermosos momentos.

A mis sobrinos Alí, Angel y Axel, quienes están iniciando su propia historia y deseo que siempre tengan la fortaleza de seguir adelante hasta cumplir sus metas.

A Lilia Hernández Hernández, Fidel Torres González y Marcos F. Torres Hernández, personas que amo y amare siempre porque me brindaron lo mejor de ellos en cada momento. Cada opinión sincera, cada sonrisa, cada consejo, cada momento de alegría los llevo conmigo siempre. Ustedes siguen aquí.

lX

CONTENIDO Página

Declaración de propiedad Reconocimiento iii Reconocimientos v Agradecimientos vii Dedicatorias ix Contenido xi Lista de figuras xv Lista de tablas xx Lista de abreviaturas xxiii

Resumen xxv Abstract xxvii

Introducción 1 Problemática del cultivo de cocotero 2 Micropropagación de cocotero 2

Antecedentes 4 Micropropagación de cocotero a partir de tejidos de 4

inflorescencia Micropropagación de cocotero a partir de plúmula 5 Aplicación de biorreactores al cultivo de cocotero 7 Transformación genética 9 Aplicación de sistemas de transformación genética 11

HIPOTESIS 15

OBJETIVO GENERAL 15

OBJETIVOS ESPECIFICOS 15

ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 16 Aplicación de Biorreactores 17 Obtención del ADNc del gen CnSERK 17 Desarrollo de un protocolo de transformación genética 17 Multiplicación de callo embriogénico obtenido a partir de ovario 18

no fertilizado y/o raquilla de inflorescencia inmadura REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 19

Capítulo 1 Micropropagación de cocotero a partir de ovario no fertilizado 25

XI

y/o raquilla de inflorescencia inmadura 1.1 INTRODUCCIÓN 25 1.1.1 Nuevos intentos a partir de tejidos florales 25 1.1.2 La posibilidad de multiplicación masiva a partir de tejidos 26

florales 1.2 MATERIALES Y METODOS 26

1.2.1 Colecta de inflorescencias, extracción de raquilla y ovario 27 no fertilizado

1.2.2 Inducción de callo embriogénico a partir de ovario no 29 fertilizado y raquilla

1.2.3 Caracterización de callo embriogénico 29 1.2.4 Multiplicación de callo embriogénico 30

1.3 RESULTADOS 30 1.3.1 Experimento 1. Inducción de callo embriogénico a partir de 30

raquilla 1.3.2 Experimento 2. Inducción de callo embriogénico a partir de 32

ovario no fertilizado 1.3.3 Experimento 3. Nueva inducción de callo embriogénico a 34

partir de ovario no fertilizado 1.3.4 Multiplicación de callo embriogénico 35

1.4 DISCUSIÓN 41 1.5 CONCLUSIÓN 43 1.6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 44

Capítulo 2 Obtencion del ADNc completo del gen CnSERK. 45 2.1 INTRODUCCIÓN 45 2.1.1 Genes SERK- relacionados con embriogénesis somática. 45 2.2 MATERIALES Y METODOS 47

2.2.1 Material vegetal 47 2.2.2 Extracción de ácidos nucleicos 47 2.2.3 Obtención del ADNc completo del gen CnSERK 47

2.3 RESULTADOS 48 2.3.1 Diseño de oligonucleótidos para amplificar el ADNc 48

Completo del Gen CnSERK 2.3.2 Extracción de ARN de callo embriogénico de cocotero 49 2.3.3 Detección del gen CnSERK en el ARN extraído de callo 50

embriogénico 2.3.4 Amplificación del ADNc completo del gen CnSERK 51 2.3.5 Secuenciación del ADNc completo del gen CnSERK 52 2.3.6 Secuencia predicha de aminoácidos para el gen 54

CnSERKAAT 2.4 DISCUSIÓN 54 2.5 CONCLUSIÓN 55

Xll

2.6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 56

Capítulo 3 Aplicación de biorreactores para desarrollo de brotes de 59 cocotero.

3.1 INTRODUCCIÓN 59 3.1.1 Aplicación de biorreactores en cocotero 59 3.1.2 Biorreactor Modular de Inmersión Temporal (BioMINT) 60

3.2 MATERIALES Y MÉTODOS 63 3.2.1 Condiciones del experimento 64 3.2.2 Tratamientos 65

3.3 RESULTADOS 65 3.4 DISCUSIÓN 70 3.5 CONCLUSIÓN 72 3.6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 73

Capítulo 4 Transient genetic transformation of embryogenic callus of 75 Cocos nucifera L.

Nota introductoria 75 Transient genetic transformation of embryogenic callus of Cocos 75

nucifera L. Abstract 75 Key words 76 Abbreviations 76

4.1 INTRODUCTION 76 4.2 MATERIALS ANO METHODS 79

4.2.1 Plant Material 79 4.2.2 Strains and plasmids 79 4.2.3 Bacteria/ culture 80 4.2.4 Transient transformation by biobalistic, vacuum infiltration 80

and co-cultivation 4.2.5 Bacteria elimination 80 4.2.6 Histochemical GUS detection and fluorescent proteins 80

visualization 4.2.7 Kanamycin for transformed plant cells selection 81 4.2.8 Transgene detection by Polymerase Chain Reaction (PCR) 81

4.3 RESUL TS ANO DISCUSSION 82 4.3.1 Evaluation of the gusA gene as reporter for coconut 82

genetic transformation 4.3.2 Eva/uation of gfp and DsRFP as reporter genes for 84

coconut genetic transformation 4.3.3 Bacteria elimination 86 4.3.4 Kanamycin for transformed plant cells selection 86

Xlll

4.3.5 Combined use of biobalistics, vacuum infiltration and co- 87 cultivation with A. tumefaciens

4.3.6 PCR analysis oftransient transformed coconut 89 embryogenic calli 4.4 ACKNOWLEDGMENTS 91 4.5 REFERENCES 91

Capítulo 5 Conclusiones y perspectivas. 97

5.1 Micropropagación de cocotero a partir de ovario no fertilizado 98 y/o raquilla de inflorescencia inmadura.

5.2 Obtención del ADNc completo del gen CnSERK. 99 5.3 Aplicación de biorreactores BioMINT. 100 5.4 Transformación genética de callo embriogénico de cocotero. 101 5.5 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 103

xiv

Lista de figuras

Figura 1 Mecanismo de reconocimiento para la infección de las células

vegetales por A. tumefaciens (tomado de Salís-Ramos et al. 201 0) . 1: proteínas del cromosoma bacteriano y receptores del hospedero que participan en la unión de la bacteria con la membrana del hospedero. 2: Señales moleculares liberadas de la herida del hospedero (compuestos fenólicos, monosacáridos y pH ácido) y censadas por virA 3: Autofosforilación de VirA y 4 : activación de VirG y de los demás genes vir, a través de la fosforilación del aspartato.

Página 10

2 Estrategia desarrollada en este trabajo para los estudios del 16 mejoramiento de la micropropagación de cocotero. Las cajas en verde indican las actividades desarrolladas en este trabajo. Las líneas punteadas indican pasos que eventualmente se pueden conectar si los resultados son exitosos. MCE = multiplicación de callo embriogénico.

1.1 Metodología para el desarrollo de un protocolo de 26 micropropagación de cocotero a partir de ovario no fertilizado y/o raquilla. En blanco las actividades desarrolladas y en verde se indica la meta.

1.2 a: representación de la disposición de las inflorescencias en 28 la planta, la cual es en espiral y de manera ascendente. b: imagen de espatas conteniendo inflorescencias desde etapa O hasta la -22, obtenidas de una palma adulta.

1.3 a: espatas con inflorescencias en etapa -1 , -2 y -3. b: imagen 28 de raquillas con flor femenina inmadura cerca de su extremo izquierdo (base) . Del centro y hacia el extremo derecho se observan múltiples flores masculinas inmaduras. Los números a la derecha de la imagen indican la etapa de desarrollo a qu.e corresponden las raquillas. e: corte transversal de flor femenina en etapa -1 que muestra la posición del ovario no fertilizado.

1.4 a: flores femeninas obtenidas de inflorescencias -3 y -4 29 colocadas en solución de hipoclorito de sodio al 30% antes de ser abiertas en campana de flujo laminar. b: flor femenina siendo disectada en el estereoscopio en campana de flujo laminar para extraer el ovario no fertilizado. e: ovario no fertilizado sembrado en medio semisólido con 2,4-D y carbón

XV

activado para inducción de callo embriogénico.

1.5 Respuestas obtenidas en el experimento de inducción de 31 callo embriogénico en raquilla tras 180 días de cultivo. Los tratamientos aplicados están indicados con la leyenda t1 a t20 (ver tabla 1.1 ). Los números sobre las barras indican el porcentaje de la respuesta correspondiente.

1.6 Cortes histológicos de explantes de raquilla que a los 90 días 31 de inducción formaron tejido tipo callo. El tejido está teñido con azul negro de naftol. La barra de referencia equivale a 5mm.

1.7 Imagen de callo tipo haustorial obtenido en cultivo de ovario 33 no fertilizado. Cada línea de la escala corresponde a 1 mm.

1.8 Algunos explantes del experimento 2 que presentaron 35 formación de callo tipo embriogénico. a= ovario no fertilizado de etapa -4 con 0.35 mM de 2,4-D. by e= ovario no fertilizado de etapa -4 con 0.55 mM de 2,4-D.

1.9 Callo embriogénico de 180 días obtenido a partir de ovario no 36 fertilizado en etapa -4, subcultivado con 0.55 mM de 2,4-D para multiplicación de callo embriogénico.

1.1 O Estructuras embriogénicas obtenidas mediante 37 multiplicación de callo embriogénico inducido en ovario no fertilizado etapa -4. Las estructuras se obtuvieron con 0.55 mM de 2,4-D.

1.11 Esquema comparativo de los tiempos requeridos para los 38 procesos morfogénicos con explante de plúmula y de ovario no fertilizado.

1.12 Porcentaje de formación de callo embriogénico en 40 explantes de raquilla y ovario. Datos generados en colaboración con ellng . José Luis Chan.

1.13 Callo y embriones generados a partir de explante de 41 raquilla y obtenidos después de 6 ciclos de multiplicación. A: Callo embriogénico con estructuras embriogénicas. B: callos con embriones somáticos globulares (parte superior) y embriones somáticos germinando (parte inferior).

XVl

1.1 Metodología propuesta para la amplificación por PCR y la secuenciación del ADNc completo del gen CnSERK. Los 48 rectángulos blancos indican las actividades desarrolladas. En verde se destacan las metas. El rectángulo punteado indica un paso que se puede desarrollar eventualmente a partir de los resultados de este trabajo.

1.2 Fotografía de gel de agarosa (1 %) con muestras de ARN 49 total extraído de callos embriogénicos de cocotero. M) carril con el marcador de 1 kb. Carril 1) 2 ¡JI de la muestra 1. Carril 2) 5 ¡JI de una dilución (1 a 1 O) de la muestra 1. Carril 3) 5 ¡JI de una dilución (1 a 10) de la muestra 2. Carril 4) 2 ¡JI de la muestra 2.

1.3 Fotografía de gel de agarosa (1 %) con las muestras de ARN 50 total tratadas con ADNasa. M= carril con el marcador de 1 kb. Carriles 1 y 2= 3 ¡JI de la dilución de las muestras 1 y 2 respectivamente. Carril 3= 3 ¡JI de la muestra 2.

1.4 Fotografía de gel de agarosa al 1% con productos de RT- 51 PCR amplificados. M= marcador de 1 kb. Carriles 1 a 3 muestras amplificadas con cebadores F2-R1 (Pérez-Núñez, 2006). Carril 1 = ARN de callo embriogénico primario de 90 días. Carril 2= 5 ¡JI ARN de callo no embriogénico. Carril 3= 5 ¡JI de ARN de callo embriogénico de 70 días. Carriles 4 a 6 amplificados con cebadores F1-R2 (Pérez-Núñez, 2006). Carril 4= 2 ¡JI de ARN de callo no embriogénico. Carril 5= ARN de callo embriogénico de 90 días. Carril 6= ARN de callo embriogénico de 70 días.

1.5 Programa de RT-PCR diseñado para la amplificación del 52 ADNc completo del gen CnSERK usando los dos juegos de cebadores diseñados en este trabajo y el ARN extraído de callo embriogénico de cocotero.

1.6 Fotografía de gel de agarosa al 1% con productos de RT- 52 PCR amplificados con los cebadores diseñados para obtener el ADNc completo del gen CnSERK. M= marcador de 1 kb. En carriles 1 y 3 muestras amplificadas con cebadores AAT F1-R 1. Carril 1 = ARN de callo embriogénico de 70 días. Carril 3= ARN de callo embriogénico de 90 días. Carril 2= amplificación a partir de ARN de callo embriogénico de 70 días con cebadores AAT F2-R2.

xvii

1. 7 Análisis clustal W de las secuencias de aminoácidos de las 55 proteínas CnSERKAAT (obtenida en este estudio) y CnSERK (Pérez-Núñez et al., 2009).

2.1 Representación del biorreactor 8ioMINT. A, los diferentes componentes: 1, vasos cilíndricos de policarbonato. 2, 61 empaques de hule para los vasos. 3, parrilla de policarbonato que se acopla con el adaptador. 4, adaptador que une los vasos y cuenta con dos válvulas para intercambio de gases. En 8 y C se representan las posiciones que adopta el biorreactor en el móctulo Sy8, gracias a lo cual se pueden alternar las fases de aireación (8) e inmersión (C) de los explantes. Figuras realizadas por Antonio Andrade-Torres, 2008.

2.2 Representación del módulo SyB. A, vista frontal : 1, 62 biorreactores BioMINT con brotes. 2, plataforma. 3, lámparas fluorescentes. 4, temporizador que controla el movimiento de la plataforma. 5, temporizador que controla el fotoperiodo. 8 , vista lateral con biorreactores BioMINT en fase de aireación. Figuras realizadas por Antonio Andrade-Torres, 2008.

2.3 Metodología para la aplicación de biorreactores BioMINT 64 para el desarrollo de brotes de cocotero. Las cajas en blanco representan las actividades a desarrollar en este trabajo. La caja en verde representa la meta perseguida. La caja en línea punteada representa acciones que eventualmente se pueden realizar con este sistema.

2.4 Promedio de longitud total del brote por tratamiento en 67 biorreactor BioMINT.

2.5 Promedio de longitud (cm) de hoja mayor por tratamiento en 67 biorreactor BioMINT.

2.6 Número promedio de hojas por brote por tratamiento en 68 biorreactor 8ioMINT.

2. 7 Proporción de brotes con raíz primaria por tratamiento en 68 biorreactor BioMINT.

2.8 Proporción de brotes con raíz secundaria en biorreactor 69 BioMINT.

XVlll

2.9 Longitud promedio en centímetros de la raíz principal a 69 través del experimento en biorreactor BioMINT.

2.1 OAspecto de los brotes. El , ejemplo de explante inicial, la 71 barra de referencia equivale a 2cm. Desde C hasta T4 brotes a los 100 días. C, brote en control (medio semisólido). T1 , brote en tratamiento de inmersión cada 1 h. T2, brote en inmersión cada 2h . T3, brote en inmersión cada 4h. T4, brote en inmersión cada 8h.

3.1 Histochemical localization of GUS activity in different coconut tissues. Upper panel shows assays in buffer solution with 83 different pH : (A) wild type embryogenic callus; (B) wild type male flowers; and (C) wild type zygotic embryos. Lower panel assays in buffer at pH 7: (D) wild type rachillae of young inflorescence; (E-F) wild type zygotic embryos, the circle in (F) indicates the plumule. Bar= 5 mm.

3.2 Green and red fluorescence in coconut embryogenic callus 85 observed through a stereoscope. Callus co-cultured with EHA101 + pBIN19cATgtp. visible (A) and with filter for green fluorescence (B) . Callus co-cultured with EHA101 + pLH60 DsRFP, visible (C) and with filter for green fluorescence (D) . Bar= 5 IJm.

3.3 Red fluorescence of coconut embryogenic callus observed 88 through a stereoscope. Visible = visible ligth. DsRed = using filters for red fluorescent protein detection. TO = wild type embryogenic callus (negative control) . T5 = embryogenic callus transformad by vacuum infiltration and co-cultivation (C58C1 + pER1 OW-35SRed). T6 = embryogenic callus transformad by biobalistics and co-cultivation (C58C1 + pER 1 OW-35SRed). T7 = embryogenic callus transformad by biobalistics, vacuum infiltration and co-cultivation (C58C1 + pER10W-35SRed). Bar= 5 mm.

3.4 Visualization of PCR products amplified by specific primers 89 for WUSCHEL and VirE2 genes. M = 1 kb ladder; + = positive control , plasmidic DNA of pER1 OW-35SRed ; 1 and 2 = DNA from embryogenic calli 60 days after transformation with treatment T7 (biobalistics, vacuum infiltration and cocultivation); 3 and 4 = DNA from embryogenic calli 60 days after transformation with treatment T6 (biobalistics and co-

XIX

cultivation) ; C = negative control, DNA from wild type embryogenic calli.

3.5 Proposed protocol for the genetic transformation of coconut 90

Tabla 1

embryogenic callus.

Lista de tablas

Resumen del desarrollo histórico de la micropropagación de cocotero.

Página 4

1.1 Porcentaje de explantes por tratamiento que presentó alguna 30 respuesta a la inducción con BAP y 2, 4-D a los 180 días de cultivo. Entre paréntesis se indica el número de tratamiento.

1.2 Número de explantes utilizados en el experimento de 32 inducción con ovario no fertilizado. Se indica el tipo de tejido y las concentraciones de 2,4-D utilizadas. En paréntesis se indica la etapa de desarrollo del tejido.

1.3 Número de explantes que respondieron formando callo tipo 33 embriogénico. En paréntesis se indica la etapa de desarrollo en que fue obtenido el explante.

1.4 Concentraciones de 2,4-D y número de explantes utilizados 34 por tratamiento en el experimento 3. Se indica en paréntesis la etapa de desarrollo en que fue tomado el explante.

1.5 Número de explantes por respuesta obtenida para cada 34 etapa de desarrollo del explante inicial.

1.6 Número de explantes que respondieron formando callo tipo 35 embriogénico de acuerdo a la concentración de 2,4-D.

1.7 Datos de la multiplicación de callo embriogénico (CE). 37

1.8 Porcentaje de callo embriogénico obtenido al multiplicar 39 diferentes líneas generadas con ovario no fertilizado y raquilla (T1-7) .

XX

2.1 Secuencia de los cebadores diseñados y utilizados para amplificar el ADNc del gen CnSERK a partir de ARN de callo 49 embriogénico de cocotero.

3.1 Resultados del experimento de brotes en biorreactor BioMINT 64 al día 1 OO. Control , medio semisólido. T1 , inmersión cada 1 h. T2, inmersión cada 2h. T3, inmersión cada 4h. T4, inmersión cada 8h. Los valores son promedios con la desviación estándar o el porcentaje cuando así se indica.

4.1 Effect of antibiotic treatment on the reiterated growth of A. tumefaciens on coconut embryogenic callus. Calli were co- 85 cultured with A. tumefaciens for 48 hours befare antibiotic treatment with timentin and/or cefotaxime for 30 days. The number of calli used per treatment was 15. The medium used was semi salid Y3 with activated charcoal. Different letters after result figures denote significant differences between treatments.

4.2The effect of different treatments on the genetic transformation 87 of coconut embryogenic callus. In all treatments with bacteria ca-culture, the strain used was C58C1 (with plasmid pER10W-35SRed). The total number of calli per treatment was 25. Red fluorescence resulting from transformation was detected as fluorescence by microscopy. Different letters after result figures denote significant differences between treatments. Observations were made 3 days after ca-culture.

XXI

AL uv GFP DsRFP dNTPs GUS PCR 2, 4-D CA NaCI nptll ADN-T rpm mg mg ¡-1 g ¡-1

iJM mM nm MS cm mm h ¡Jm

psi mi

Lista de abreviaturas

Amarillamiento Letal del Cocotero Ultra violeta Proteína Fluorescente Verde Proteína Fluorescente Roja Desoxirribonucleótidos trifosfatos ~- glucuronidasa Reacción en cadena de la polimerasa Ácido 2, 4-d icloro-fenoxiacético Carbón activado Cloruro de sodio Neomicina fosfotransferasa 11 Ácido desoxirribonucléico de transferencia Revoluciones por minuto Miligramos Miligramos por litro Gramos por litro Micromolar Milimolar Nanómetros Medio Murashige & Skoog Centímetros Milímetros Horas Micrómetros Libras por pulgada cuadrada Mililitros

XXlll

Resumen

El cocotero (Cocos nucifera L. ) es una especie de alto potencial económico, se ha demostrado que puede tener un papel importante en la producción de biodiesel y de bebidas energéticas. Sin embargo, su producción ha venido disminuyendo debido a la incidencia de plagas y enfermedades. La mejor estrategia para enfrentar estos problemas es la replantación con variedades resistentes, sin embargo, la propagación natural del cocotero, ocurre solo de manera sexual , y es muy difícil lograr la rápida propagación de los genotipos selectos para satisfacer la creciente demanda. La clonación in vitro vía embriogénesis somática es una alternativa conveniente debido a su gran potencial para la propagación masiva. En este trabajo se planteó realizar estudios que contribuyan a mejorar la micropropagación de cocotero a partir de explantes de plúmula o de tejidos de inflorescencia inmadura. Se estableció el protocolo para inducir callo embriogénico (CE) a partir de raquilla y ovario no fertilizado, y se aplicó el sistema de multiplicación de callo embriogénico de Pérez-Núñez et al. (2006) desarrollado para plúmula. Los resultados mostraron que es posible inducir la formación de callo embriogénico a partir de ambos explantes, además es posible la multiplicación del callo embriogénico y la obtención de embriones somáticos en ambos casos, y también es posible la embriogénesis somática secundaria en el caso de raquilla. En ambos casos, el comportamiento de los CEs es muy similar a lo reportado para plúmula. La secuencia de aminoácidos del gen CnSERKAA T amplificado en este estudio tiene una extensión de 629 aminoácidos similar a la reportada para CnSERK (GenBank AY791293) y ambas secuencias solo difieren en los aminoácidos 35, 308, 328, 341 , 558 y 608, pero no se afecta la funcionalidad de la proteína. Usando cualquiera de los dos juegos de cebadores diseñados en este trabajo es posible amplificar por RT-PCR el ADNc completo del gen CnSERK. La Aplicación de biorreactores BioMINT con un tratamiento de 2 minutos de inmersión cada 1 h y 2h favoreció el desarrollo de brotes de cocotero en comparación con los brotes control (medio-sólido), esto en base a un mejor desarrollo de características importantes como el incremento de número de hojas por brote, el incremento de brotes con raíz y el incremento de longitud de hojas y de raíz. El protocolo de transformación genética combinado (biobalística + infiltración + co-cultivo con Agrobacterium tumefaciens C58C1 + pER1 OW-35SRed) presentó mayor eficiencia de transformación que cualquiera de las técnicas aplicada de manera individual. Este trabajo ha contribuido a establecer las bases para la micropropagación masiva a partir de tejidos adultos y el establecimiento de un sistema de trasformación que podría tener utilidad para entender el proceso de embriogénesis somática, además de tener aplicaciones prácticas como la introducción de características agronómicas importantes.

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Abstract

The coconut palm (Cocos nucifera L.) is a species of high economic potential, has been shown to play an important role in producing biodiesel and energy drinks. However, its production has been declining because the incidence of pests and diseases. The best strategy to address these problems is replanting with resistant varieties, however, the natural propagation of the coconut tree, occurs only in a sexual way, and it is very difficult to achieve the rapid propagation of genotypes selected to meet the increasing demand. Cloning via somatic embryogenesis in vitro is a suitable alternative because of its great potential for mass propagation. In this work was to conduct studies that improve the micropropagation of coconut from plumule explants, or immature inflorescence tissue. lt was established the protocol to induce embryogenic callus (EC) from unfertilized ovary and rachilla , and applied the system of multiplication of embryogenic callus Pérez-Núñez et al. (2006) developed for plumule. The results showed that it is possible to induce the formation of embryogenic callus from both explants, it is also possible the multiplication of embryogenic callus and somatic embryos obtained in both cases, it is also possible secondary somatic embryogenesis in the case of rachilla. In both cases, the behavior of ECs is very similar to those reported for plumule. The amino acid sequence of the gene CnSERKAAT amplified in this study has an extension of 629 amino acids similar to that reported for CnSERK (GenBank AY791293) and both sequences differ only at a mino acids 35, 308, 328, 341 , 558 and 608, but does not affect the functionality of the protein. Using any of the two sets of primers designed in this work can be amplified by RT-PCR the complete cONA of the gene CnSERK. Application of BioMINT bioreactors with a treatment 2 minutes of immersion every 1 h and 2h favored the development of coconut shoots compared to control (semi-salid medium), this based on a better development of important features such as increased number of leaves per shoot, shoots with increasing root length and increased leaf and root. The combined genetic transformation protocol (biolistic + infiltration + co-cultivation with Agrobacterium tumefaciens C58C1-pER1 OW-35SRed) had higher transformation efficiency than any of the techniques applied individually. This work has helped establish the basis for mass micropropagation from adult tissues and the establishment of a system of transformation that could be useful to understand the process of somatic embryogenesis, in addition to practica! applications such as the introduction of important agronomic characteristics.

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Introducción

El cocotero (Cocos nucifera L.) es una de las plantas más representativas de las zonas costeras tropicales. La producción de cocotero en América Latina y el Caribe representa cerca del 1 O % de la producción mundial, siendo México y Brasil los países productores más destacados de la región . La nuez fresca para agua y la copra para la obtención de aceite son los principales productos, sin embargo, existe una gran variedad de usos adicionales a partir de cada uno de los componentes de la planta (Salunkhe y Desai , 1986).

En 2005 el valor de mercado en Estados Unidos de América para los productos de coco suministrados por México alcanzó los 8.7 millones de dólares, mientras que para el aceite de coco (crudo y refinado), alcanzó los 242.4 millones de dólares, sin embargo México prácticamente no participó en este rubro específico, pero es un mercado con gran potencial pues la demanda se incrementa anualmente (Conacoco, 2006). En años recientes también se ha incrementado el interés por producir y comercializar agua de coco, considerada una bebida isotónica natural. En 2009 PepsiCo lnc. adquirió Amacoco, la compañía productora de agua de coco más grande de Brasil , e inició una estrategia de crecimiento de mercado que incluye casi toda América Latina y Estados Unidos de América (EFE, 2009).

La producción de biodiesel puede ser otro uso del cocotero con gran importancia económica que puede ayudar a hacer rentable su cultivo. En 2006 se instaló en Filipinas una planta que anualmente procesa unos 75 millones de litros de aceite de coco para generar un producto denominado coco-biodiesel , que utilizado como aditivo al 2% en los motores a diese! permite reducir en más del 70% los niveles de emisión de contaminantes sin requerir ninguna modificación al motor que lo usa (Carlos Carpio, Coconut Philippine Authority, Filipinas 201 0) . Esta iniciativa representa una nueva alternativa que puede llegar a reproducirse en otros países productores de cocotero, incluyendo a México.

En México, la mayor superficie cultivada con cocotero se encuentra en áreas marginadas de los suelos costeros, no obstante se le considera como un cultivo de importancia económica y principalmente social , ya que alrededor de 56 mil familias dependen directamente del cultivo o de las actividades derivadas de éste. En 2004 el cultivo del cocotero cubría una superficie de 148 mil hectáreas distribuidas en siete estados de la costa del pacífico y cinco estados de la región golfo de México (Sagarpa, 2005).

De manera general se ha considerado que el cocotero es un cultivo que requiere poco cuidado, lo que ha traído como consecuencia que las plantaciones hayan quedado marginadas únicamente en las zonas costeras y sin la atención suficiente, ocasionando rendimientos hasta 40% menores (Domínguez et al., 1999). Por lo tanto la generación y aplicación de nuevas estrategias de manejo que incrementen la productividad ayudarían a hacer

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del cocotero un cultivo económicamente rentable, que además genere mayor demanda de mano de obra.

Problemática del cultivo de cocotero En el contexto mundial la producción de cocotero ha venido

disminuyendo debido principalmente a la incidencia de plagas y enfermedades, al pobre rendimiento de las plantaciones y al uso de variedades de baja producción. De acuerdo con Punchihewa (1999) uno de los principales factores del bajo rendimiento de las plantaciones es el envejecimiento de los cultivares. Por otro lado, el Amarillamiento Letal (AL) , el anillo rojo y la pudrición del cogollo son las enfermedades más importantes que afectan el cultivo (Oropeza et al., 2005). El AL es una enfermedad devastadora que además del cocotero afecta a una gran cantidad de especies de palmas. De acuerdo con Harrison et al., ( 1999) a finales del siglo pasado el AL destruyó millones de palmas en Jamaica, Florida y el sureste de México. Domínguez et al., (1999) mencionan que en México esta enfermedad eliminó más del 95% de las palmas Altas del Atlántico en la costa de Quintana Roo, Yucatán, Campeche y Tabasco.

Con respecto al manejo del AL aunque se han intentado diferentes medidas (ver McCoy et al., 1983), la más eficaz hasta el momento es la resiembra con palmas resistentes (Been, 1991 Harrison y Oropeza, 2008), pero además, la mayoría de las plantaciones de cocotero requieren resiembra debido a las pérdidas causadas por la senescencia de las palmas. En diferentes partes del mundo se han llevado a cabo estudios sobre selección de genotipos para resistencia a enfermedades u otras características de interés, y los resultados son positivos (Santos 1999; Zizumbo et al. 1999; Oropeza et al. 2005). Sin embargo, mediante la propagación natural del cocotero, la cual ocurre solo de manera sexual , será muy difícil lograr la rápida propagación de los genotipos selectos o de individuos dentro de estos genotipos para satisfacer la creciente demanda, pues se producen muy pocas semillas por palma además de que la planta tiene un ciclo de vida largo. En este sentido, la clonación in vitro vía embriogénesis somática parece ser la alternativa más conveniente de aplicar debido a su gran potencial para la propagación masiva (Oropeza et al. 2005).

Micropropagación de cocotero La micropropagación de plantas o propagación vegetativa in vitro es

una técnica que permite la multiplicación masiva de individuos elite con alta productividad y/o resistencia a enfermedades (Verdeil et al. , 1997). Por lo que se considera una alternativa viable para propagar los genotipos o individuos de cocotero que sean de interés. Durante los últimos 30 años, se ha intentado obtener un método para clonar estos individuos a partir de

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diferentes tipos de explantes. Se han usado raíces (Justin , 1978), hoja joven (Pannetier and Buffard-Morel, 1982; Buffard-Morel et al. 1988), ápice de tallo (Weerakoon, 2004), y tejidos de inflorescencia inmadura (raquilla y ovario no fertilizado) pero con poco éxito en cada caso y resultados poco reproducibles.

El uso de plúmula para la inducción de embriogénesis somática ha mostrado ser el enfoque más viable para la micropropagación de cocotero (Pérez-Núñez, 2006), y también ha servido para realizar estudios para obtener un mejor entendimiento del proceso en si en cocotero (Oropeza et al. , 2005). La plúmula se obtiene de embriones cigóticos maduros y consiste del meristemo rodeado de los primordios foliares (Hornung, 1995; Chan et al., 1998). Con este explante se desarrolló el primer protocolo reproducible aunque con baja eficiencia de producción de embriones somáticos, dando aproximadamente 4 embriones por explante de plúmula (Chan et al., 1998).

Pérez-Núñez et al. (2006) , utilizando explante de plúmula, combinaron la multiplicación de callo embriogénico con embriogénesis somática secundaria para obtener un sistema más eficiente para la regeneración de cocotero, determinando que se pueden obtener 100,000 embriones somáticos por cada explante inicial. Sin embargo, aunque este es el protocolo mejor establecido hasta el momento, todavía es susceptible de ser mejorado. Por ejemplo, incrementando la eficiencia de producción de embriones somáticos por callo embriogénico se puede reducir el número de ciclos de multiplicación del callo embriogénico requeridos y obtener un gran número de embriones en menos tiempo y a menor costo de producción. Sin embargo, se debe considerar que mientras se utilice tejido de embrión cigótico (plúmula) como punto de partida este método permite clonar al embrión y no al individuo adulto que lo produce, por lo que no estamos seguros de que las plantas así producidas cuenten con las características de interés.

A pesar de los avances obtenidos a la fecha , aún se necesita superar algunas limitantes del protocolo de micropropagación de cocotero como los reducidos rendimientos en: 1) explantes que forman callo embriogénico, 2) embriones somáticos producidos por callo embriogénico, 3) embriones somáticos que germinan, 4) brotes que llegan a planta, y 5) el no contar con un explante inicial que permita clonar individuos adultos seleccionados por su desempeño. Por lo tanto en este trabajo se realizaron estudios para abordar algunas de estas limitantes y tratar de obtener opciones para superarlas .

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Antecedentes

Micropropagación de cocotero a partir de tejidos de inflorescencia Los primeros estudios para establecer un método de

micropropagación de cocotero se realizaron con tejidos de inflorescencia inmadura puesto que el fin era obtener un método para clonar plantas adultas seleccionadas o mejoradas. Entre las principales aportaciones, se determinó la formulación del medio de cultivo que se usa actualmente para la micropropagación de cocotero y se logró regenerar un reducido número de plantas por embriogénesis somática (Tabla 1 ).

Tabla 1. Resumen del desarrollo histórico de la micropropagación de cocotero.

Uso de Explantes de Inflorescencia para Micropropagación

Eeuwens ( 1976) Eeuwens & Blake (1977) Eeuwens (1978)

Branton & Blake (1983)

Se determinaron los requerimientos minerales, orgánicos y de reguladores del crecimiento para la formación de callo en explantes de inflorescencias, hojas y meristemo apical.

Primeros resultados de embriogénesis somática.

Buffard-Morel et al. Mayor respuesta a la inducción de la embriogénesis (1992) somática mediante el establecimiento de líneas de Verdeil et al. (1994) callos homogéneos y condiciones mejor definidas.

Uso de Explantes de Plúmula para Micropropagación

Hornung (1995) Primeros resultados sobre el potencial de respuesta Oropeza et al. (1995) de los explantes de plúmula para formar callos y

embriones somáticos.

Chan et al. (1998) Desarrollo de un protocolo que permite regeneración reproducible de cocotero a partir de explantes de plúmula, se cuantifican los rendimientos por primera vez y las plántulas pueden ser establecidas exitosamente en condiciones ex vitro.

Branton y Blake (1983) lograron la inducción de callo cultivando secciones de raquilla de inflorescencia inmadura de cocotero en medio Y3 con 2,4-D (1 o-4 M). Después de tres o cuatro subcultivos con una disminución progresiva de la concentración de 2,4-D (1 o-4 M a 1 o-7 M) observaron en cortes histológicos, la aparición de áreas embriogénicas bien definidas en las capas externas del meristemo floral de cocotero y

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finalmente describieron por primera vez la formación de estructuras nodulares que desarrollaban dos zonas meristemáticas y una gran zona cotiledonar de manera similar al embrión cigótico de cocotero, sin embargo no pudieron determinar las condiciones para su posterior desarrollo hacia embriones o plantulas.

Verdeil et al. (1992) regeneraron plántulas clonales de cocotero a partir de inflorescencia inmadura, en este caso obtuvieron callo después de nueve meses de inducción y posteriormente realizaron la incubación de los tejidos incrementando la concentración del 2, 4-D en periodos desde uno a 12 meses. Se formó un callo secundario granular que se hizo embriogénico a partir del cual se generaron nódulos y embriones somáticos. Se realizó la maduración de los embriones reduciendo gradualmente la concentración de 2, 4-D y lograron obtener plántulas después de 18 a 24 meses.

Entre los inconvenientes que presenta la micropropagación a partir de inflorescencia inmadura es que en la mayoría de los casos no se obtienen resultados reproducibles. Sin embargo, a pesar de los inconsistentes resultados se logró demostrar que la embriogénesis somática tenía potencial como vía de regeneración para el cocotero, por lo que se continuó trabajando en la búsqueda de un explante que fuera más responsivo para poder establecer un protocolo de regeneración por esta vía.

Micropropagación de cocotero a partir de plúmula La plúmula, obtenida a partir de embrión cigótico de cocotero fue el

tipo de explante que demostró ser el más responsivo para formar callo embriogénico y embriones somáticos (Chan et al., 1998), a partir de este explante se logró establecer el primer protocolo reproducible y cuantificable para la micropropagación de cocotero (Tabla 1 ), aunque solo se podían obtener 4 embriones somáticos por plúmula, por lo que se han realizado diferentes estudios para incrementar su eficiencia.

Azpeitia (2003) realizó un estudio sobre inducción de embriogénesis somática en tejido de plúmula de cocotero aplicando tratamientos con 3 diferentes citocininas exógenas (BAP, Zeatina y 2iP), y una anticitocinina (8-azaadenina) . Encontró que la aplicación de citocininas no favorece la producción de callo embriogénico y que los niveles endógenos de citocinina probablemente producen una inhibición de la formación del callo. La aplicación de la anticitocinina 8-azaadenina permitió incrementar 1.24 veces la formación de callo embriogénico en las plúmulas tratadas, respecto a las no tratadas, además se pueden obtener 8.8 embriones somáticos por explante, lo que representan un incremento del 100% en relación al control.

Azpeitia et al. (2003) estudiaron el efecto del brasinoesteroide 22(S), 23(S)-homobrasinólido sobre la formación de callo inicial , formación de callo embriogénico y formación de embriones por callo embriogénico a partir de explantes de plúmula. Los explantes fueron expuestos a dos

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periodos de precultivo uno de 3 y otro de 7 días de duración , en ambos casos se probaron diferentes concentraciones (0.01 , 0.1, 1, 2 y 4 ~M) del brasinoesteroide. Los explantes respondieron favorablemente al brasinoesteroide e incrementaron la capacidad de formación de callo inicial , callo embriogénico y embriones somáticos por callo embriogénico. El tratamiento de 3 días de precultivo con brasinoesteroide a 0.01 o 0.1 ~M permite incrementar 2.8 veces la formación de embriones somáticos por callo embriogénico (1 0.8 embriones por callo embriogénico) con respecto al tratamiento control (3.8 embriones por callo embriogénico) (Azpeitia et al., 2003).

Pérez-Núñez et al. (2006) , desarrollaron un sistema que combina eventos de multiplicación de callo embriogénico con embriogénesis somática secundaria. La multiplicación de callo embriogénico permite incrementar el número de unidades obtenidas por cada explante inicial pero tiene el inconveniente de que puede llegar a generar variación no deseada y eventualmente puede disminuir la capacidad embriogénica de los tejidos por el uso repetido, sin embargo, al intercalar un evento de embriogénesis somática secundaria, ésta evita que los tejidos pierdan su capacidad embriogénica y que se presente variación, aunque la capacidad de multiplicación es menor que cuando se hace la multiplicación de callo embriogénico de forma directa. Entonces, aunque la embriogénesis somática secundaria puede considerarse como cuello de botella, en realidad da como resultado un sistema más eficiente para la regeneración de cocotero. En el sistema propuesto se real izan tres eventos de multiplicación de callo embriogénico, se intercala una primera formación de embriones somáticos, los cuales se utilizan como explantes para volver a inducir la formación de callo embriogénico y se realizan nuevamente los eventos de multiplicación para intercalar un evento de embriogénesis somática secundaria y así sucesivamente repetir "n" ciclos para generar un número de explantes deseado y en un momento determinado los embriones somáticos pueden ser germinados, obtener brotes y plántulas (Pérez-Núñez et al. 2006).

Aplicando este sistema de multiplicación se puede realizar la propagación masiva de cualquier material de cocotero, incluyendo híbridos. Sin embrago, aun es susceptible de ser perfeccionado para hacerlo más rentable y poder aplicarlo a nivel comercial , además, como se mencionó anteriormente, es necesario utilizar un explante que permita clonar individuos adultos. En este sentido, después de varios años se retomaron los estudios basados en tejidos de inflorescencia. Perera et al. (2007) reportaron la obtención de callo embriogénico a partir de ovario no fertilizado extraído de inflorescencias inmaduras de cocotero. Por análisis histológico determinaron que los callos obtenidos se originan a partir del carpelo y por citometría de flujo determinaron que los callos embriogénicos son diploides, lo que sugiere que a partir de este tejido es posible clonar

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individuos adultos de cocotero, sin embargo, para la micropropagación a partir de este explante aún se requiere realizar estudios que permitan resolver detalles del proceso para hacerlo más reproducible y eficiente.

Por lo tanto, aunque los recientes resultados con ovario no fertilizado abren la posibilidad de generar un protocolo para clonar plantas adultas, es importante continuar realizando estudios con tejido de plúmula ya que el proceso de embriogénesis a partir de este explante está muy bien caracterizado, además los avances en el conocimiento de los procesos o las mejoras al protocolo de plúmula podrán eventualmente ser aplicadas a otro tipo de explante, como puede ser el ovario no fertilizado.

En este sentido, considerando al sistema que utiliza plúmula, es importante realizar estudios para superar sus principales limitantes, como los reducidos rendimientos en : 1) explantes que forman callo embriogénico, 2) embriones somáticos producidos por callo embriogénico, 3) embriones somáticos que germinan, y 4) brotes que llegan a planta.

Aplicación de Biorreactores al cultivo de cocotero La aplicación de sistemas de inmersión temporal o biorreactores, es

un aspecto que no ha sido abordado en cocotero pero que tiene alto potencial pues, como se describe más adelante, ha mostrado buenos resultados en la micropropagación de otras especies, incrementando la eficiencia de producción de unidades de propagación en diferentes etapas del proceso, y disminuyendo la necesidad de mano de obra, por lo que se reduce el costo unitario del producto (Robert et al. , 2006).

Los sistemas de inmersión temporal intercalan periodos de aireación e inmersión del explante en el medio líquido (Preil , 2005; Robert et al., 2006), brindando condiciones más homogéneas que facilitan la disponibilidad de nutrimentos y ofrece ventajas adicionales como una mayor simplicidad en el manejo que disminuye la mano de obra y elimina el uso del gelificante (Maene y Debergh, 1985; Teisson y Alvard , 1995; Teisson et al., 1999; Robert et al., 2006). Este sistema ha sido aplicado a una gran variedad de especies y de tipos de explantes permitiendo en la mayoría de los casos incrementar las eficiencias de multiplicación de unidades de propagación, la germinación de embriones y el desarrollo de brotes según el caso (Etienne y Berthouly, 2002 ; Preil , 2005).

Se ha demostrado que para Hevea brasiliensis (Müll. Arg.) , la aplicación del sistema de inmersión temporal favorece un mejor desempeño de los callos embriogénicos comparado con el sistema tradicional del cultivo en medio semi-sólido, observándose un desarrollo sincrónico de los embriones somáticos, una reducción hasta del 50% en el número de embriones anormales y en la etapa de germinación se presenta una estimulación del desarrollo de la raíz, así como de la emergencia del epicótilo (Etienne et al., 1997).

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Escalona et al., (1999), aplicaron un sistema de inmersión temporal para mejorar la eficiencia de un protocolo de micropropagación de piña (Ananas comosus L. Merr) . Después de 42 días el cultivo en sistema de inmersión temporal incremento hasta 4 veces la tasa de multiplicación , el peso fresco y peso seco de los brotes en comparación con el cultivo en medio semi-sólido y en medio líquido. El tiempo requerido para la formación de brotes adecuados para llevar a la etapa de enraizamiento y aclimatización disminuyó considerablemente en el sistema de inmersión temporal respecto al sistema convencional de medio semi-sólido (Escalona et al. , 1999).

Un estudio posterior reportó que la aplicación del sistema de inmersión temporal en piña, reduce la tasa fotosintética de los brotes en cultivo, y en contraste incrementa su capacidad de tomar azúcares y nitrógeno del medio de cultivo, dando como resultado un incremento en el peso seco y el área foliar de los brotes, características que los hacen tener un mejor desempeño en la etapa de aclimatización (Escalona et al., 2003).

Otra ventaja reportada para los sistemas de inmersión temporal, es la posibilidad de establecer protocolos de transformación genética que utilicen la inmersión temporal para la fase de selección de transformantes. Espinosa et al. , (2002). Desarrollaron un sistema de producción de plantas de piña transgénicas aplicando el sistema de inmersión temporal para la fase de selección con antibióticos (Phosphinothricina e hygromycina), posterior a la infección con Agrobacterium tumefaciens, demostrando que el sistema de inmersión temporal produce mayor número de transformantes que el sistema con medio semi-sólido (Espinosa et al., 2002).

En un estudio con Calathea orbifolia Linden (planta ornamental) compararon la anatomía foliar en la fase in vitro , y el comportamiento fotosintético y el crecimiento ex vitro de plantas producidas en sistema de inmersión temporal y en el sistema con medio semi-sólido. Las plantas en sistema de inmersión temporal presentaron un clorénquima foliar y parénquima más grueso, también presentaron menor frecuencia estomatal y mayor presencia de ceras epicuticulares en comparación con las plantas en medio semi-sólido (Yang y Yeh, 2008). En cuanto al comportamiento ex vitro , las plantas provenientes del sistema de inmersión presentaron mayor tasa fotosintética, así como, mayor área foliar y peso seco con diferencia significativa respecto a las plantas de medio semi-sólido (Yang y Yeh, 2008).

Con base en lo anterior, en este trabajo se propuso el uso de sistemas de inmersión temporal como una alternativa para buscar incrementar el número de brotes enraizados y generar plántulas con un desarrollo más homogéneo. En este sentido, en CICY se han realizado estudios para desarrollar biorreactores económicos que puedan adaptarse a las necesidades específicas de las especies que se están estudiando, tal es el caso del biorreactor BioMINT (Robert et al. , 2006), el cual se ha utilizado

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con éxito para brotes de cedro rojo (Peña-Ramírez et al., 2010) y chile habanero (Bello-Bello et al., 2010), y en este caso se plantea su uso para la etapa de desarrollo de brotes de cocotero. Los biorreactores BioMINT presentan ciertas ventajas sobre otros biorreactores comerciales o reportados en la literatura, pues se adaptan muy bien al tamaño de los brotes de cocotero, además utilizan un módulo tipo mecedora que fue diseñado y construido a bajo costo en CICY y no se requiere adquirir sistemas adicionales para su funcionamiento como en el caso de los biorreactores tipo RITA u otros que requieren mecanismos más complejos para la renovación del medio de cultivo o la transferencia del medio a través del sistema.

Transformación genética Entre las metodologías de mejoramiento genético, la ingeniería

genética y la transformación son técnicas actuales que combinadas permiten introducir características específicas al genoma de una planta o cultivo. La ingeniería genética brinda la posibilidad de manipular, aislar de manera específica, cortar y pegar el ADN que codifica para un gen responsable de alguna característica de interés (Webb y Morris, 1992). Por su parte, la transformación genética permite mediante un medio, que puede ser biológico o físico, transferir el ADN de interés al núcleo de la célula objetivo. Eventualmente el ADN transferido se incorpora establemente en algún cromosoma y se expresa para dar lugar a la nueva característica genética. La célula transformada se debe multiplicar y diferenciar para dar lugar a una nueva planta. Este proceso involucra distintas etapas como inserción , integración, expresión y heredabilidad del nuevo ADN (Webb y Morris, 1992).

Existen al menos dos tipos de métodos para introducir el ADN en una célula objetivo, los llamados métodos de transferencia directa y los de transferencia indirecta. Se llama transferencia directa del ADN , cuando el método utilizado permite introducir el ADN al interior de la célula , atravesando la baFrera de la pared y la membrana de la célula vegetal, sin la ayuda de vectores biológicos como plásmidos, bacteriófagos o cósmidos (Webb y Morris, 1992). Entre los métodos de transferencia directa más usados para la obtención de plantas transgénicas están el bombardeo de partículas, la micro-inyección y la electroporación (Herrera-Estrella et al., 2004). En el otro extremo, la transferencia indirecta es mediada por Agrobacterium tumefaciens y sus especies relacionadas A. rhizogenes y A. vitis (Tzfira y Citovsky, 2000). Agrobacterium es el único organismo conocido capaz de transferir ADN al núcleo de una célula de diferentes reinos, es una bacteria del suelo Gram-negativa que puede transformar genéticamente células de numerosas especies de plantas dicotiledóneas, monocotiledóneas y gimnospermas, además de diversas especies de

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hongos (levaduras, ascomicetes y basidiomicetes) , así como mamíferos y células humanas (Hwang y Gelvin , 2004; Salís-Ramos et al. 2010) .

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Figura 1. Mecanismo de reconocimiento para la infección de las células vegetales por A. tumefaciens (tomado de Solís-Ramos et al. 201 0) . 1: proteínas del cromosoma bacteriano y receptores del hospedero que participan en la unión de la bacteria con la membrana del hospedero. 2: Señales moleculares liberadas de la herida del hospedero (compuestos fenólicos, monosacáridos y pH ácido) y censadas por virA 3: Autofosforilación de VirA y 4: activación de VirG y de los demás genes vir, a través de la fosforilación del aspartato.

El tipo silvestre de Agrobacterium lleva dos tipos de genes: los oncogenes y los encargados de la biosíntesis de aminoácidos derivados u opinas (Hwang y Gelvin, 2004). Agrobacterium transforma genéticamente plantas y algunos otros organismos por transporte de una cadena sencilla (cadena T) de ADN de transferencia (ADN-T) de su plásmido inductor de tumores (Ti) dentro de la célula huésped integrándola dentro de su genoma. La expresión del ADN-T una vez integrado en el hospedero, resulta en una incontrolada división celular y formación celular, que produce y secreta opinas que son utilizadas por Agrobacterium y otros diferentes

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microorganismos como el recurso de carbono y nitrógeno (Salís-Ramos et al., 2010).

Entonces el proceso de transformación de la bacteria requiere la presencia de elementos genéticos como son: (1) los genes de virulencia del cromosoma de Agrobacterium (chv) , (2) el ADN-T delimitado por el borde derecho y el borde izquierdo, (3) los genes de virulencia del plásmido Ti (genes vir) que constituyen la maquinaria de transferencia de ADN-T y (4) proteínas codificadas en el hospedero (Hwang y Gelvin, 2004; Salís-Ramos et al. , 201 O).

Para el reconocimiento del hospedero Agrobacterium se une a la pared celular en el sitio de una herida mediante proteínas codificadas en el cromosoma bacteriano (ChvA, ChvB, PscA y Attl) y receptores localizados en la superficie celular del hospedero como la proteína vitronectina, la proteína de unión a la ricadhesina y la celulosa sintasa (CSLA9) entre otras (fig . 1, inciso 1) (Solí s-Ramos et al. . 201 0) . Dichas proteínas interactúan con la proteína VirB2 de la bacteria (BT11 , BTI2, BTI3 y una GTPasa asociada a la membrana, RAB8) (Citovsky et al .. 2007).

El proceso de infección de A. tumefaciens inicia con la activación de los genes de virulencia (genes vir) en su plásmido Ti, mediante las señales moleculares liberadas en la herida del hospedero. Dentro de estas señales se incluyen clases específicas de compuestos fenólicos (e.g ., acetosiringona AS), monosacáridos y el pH ácido (fig . 1, inciso 2) . Las señales de inducción son censadas por la proteína VirA que es una proteína cinasa transmembranal y VirG es el regulador de respuesta. VirA se autofosforila en un residuo histidina y transfiere su grupo fosforil al residuo aspartato en la posición 52 de VirG (fig . 1, inciso 3) (Jin et al., 1990a). La VirG es una proteína de unión a secuencias específicas de ADN que reconoce y se une a una secuencia dodecámero de ADN llamada caja vir (Jin et al., 1990a), la cual está presente en regiones promotoras río arriba de todos los genes vir. La proteína VirG está unida a los promotores de otros genes vir a través de su dominio e-terminal y el dominio N-terminal queda libre para interactuar con otros componentes (Jin et al., 1990c). VirG activa la transcripción de esos promotores en una ruta dependiente de fosforilación (Jin et al., 1990b) (fig. 1, inciso 4) .

Hay dos modelos moleculares propuestos para explicar la integración del ADN-T en el genoma del hospedero, uno es la reparación de la molécula de la doble cadena rota (DSB) y el otro es la reparación de un hueco (gap) en la cadena sencilla (Salís-Ramos et al., 201 0) . Tzfira et al. (2003) , aportaron evidencias de que el modelo de la doble cadena rota puede ser el mecanismo más común que está operando para la integración.

Aplicación de sistemas de transformación genética La transformación genética ha mostrado ser una de las técnicas

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más exitosas para introducir una característica específica al genoma de un cultivo (Webb y Morris, 1992). La transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens permite buenos resultados para la transferencia y sobre-expresión de genes en diferentes especies de monocotiledóneas y dicotiledóneas (Herrera-Estrella et al., 2004).

Mediante transformación genética se ha logrado abatir la recalcitrancia a la morfogénesis in vitro de diferentes especies de plantas así como incrementar su resistencia a diferentes organismos patógenos (Cai et al. 2002; Shin et al. 2002; Zuo et al. 2002; Herrera-Estrella et al. 2004). Mediante la inserción y sobre-expresión de genes relacionados con el control de la morfogénesis como el gen heterólogo WUSCHEL , se logró promover la transición del estado vegetativo al embriogénico en tejido in vitro de Arabidopsis thaliana y Coffea canephora , para eventualmente observar la formación de embriones somáticos (Zuo et al. 2002; ArroyoHerrera et al. 2008). En Capsicum chinense, la expresión inducida del gen WUSCHEL disparó la formación de estructuras globulares en segmentos de tallo transformado, sugiriendo que el gen heterólogo WUSCHEL estaba involucrado en el proceso morfogénico en los tejidos (Solís-Ramos et al. 2009).

El grupo de estudios en cocotero de la Unidad de Biotecnología del CICY comenzó estudios en este sentido y actualmente se cuenta con un protocolo para la transformación genética de tejido de cocotero, sin embargo, aun es poco eficiente y todavía no se han podido regenerar plantas transformadas.

El primer estudio de transformación genética de cocotero se realizó aplicando biobalística para transformar callo embriogénico. Se obtuvo expresión temporal de los genes reporteros que codifican para las proteínas fluorescentes verde (GFP) y roja (DsRed). Este experimento demostró la utilidad de estos genes para ser usados como reporteros en los ensayos con cocotero, sin embargo la eficiencia de transformación fue muy baja y no se logró obtener la regeneración de transformantes (González-Estrada et al., 2003).

Buscando mejorar la eficiencia de transformación, Ramírez (2003) transformó mediante Agrobacterium tumefaciens callos embriogénicos de cocotero. En este caso utilizó el gen reportero GUS que codifica para la ~glucuronidasa. Se demostró que la transformación de callo embriogénico mediante A. tumefaciens es más eficiente que la transformación por biobalística, sin embargo continuó siendo baja. Además, observó que los callos embriogénicos presentan actividad endógena tipo ~-glucuronidasa , por lo que el gen GUS no se podría utilizar en callos de cocotero como gen reportero para diferenciar entre los tejidos transformados de los no transformados.

Utilizando el sistema mediado por A. tumefaciens, Becerril (2003) transformó callos embriogénicos de cocotero utilizando como reportero el

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gen que codifica para la proteína verde fluorescente (GFP), confirmando la utilidad del mismo para ser usado en cocotero.

Hasta aquí se logró establecer que en el caso de cocotero la transformación mediada por A. tumefaciens es más eficiente que la transformación por biobalística, además de que mediante Agrobacterium es posible utilizar los genes de las proteínas fluorescentes verde y roja como reporteros, sin embargo, la eficiencia de transformación continuó siendo baja y se presentó el problema de que es difícil eliminar la bacteria de los tejidos transformados, lo que afecta el posterior desarrollo de los callos embriogénicos.

En un intento por incrementar la eficiencia de transformación de cocotero se realizó otro estudio en el cual se aplicó el método de infiltración al vacío previo al ca-cultivo con A. tumefaciens (Ramírez, 2005). En este caso se utilizó el gen reportero OsRed . Los resultados mostraron mayor eficiencia de transformación respecto a todos los estudios anteriores, y se logró determinar las mejores condiciones para realizar el tratamiento de infiltración de callos embriogénicos de cocotero, lo que representa un buen avance. Sin embargo, la eficiencia de transformación siguió siendo baja en términos del número de callos expresando la proteína roja.

El principal problema encontrado hasta este momento es el número de callos embriogénicos que expresan el gen reportero y un método efectivo para eliminar la bacteria después del ca-cultivo. No obstante, es importante contar con un protocolo eficiente para la transformación genética para cocotero porque permitiría el estudio de genes de interés, podría contribuir al mejoramiento genético y a la solución de aspectos clave para la propagación de individuos élite de la especie, por ejemplo, mediante la sobre-expresión de genes relacionados a embriogénesis somática.

Con base en los reportes citados, en este trabajo se plantea realizar estudios que contribuyan a mejorar la micropropagación de cocotero ya sea a partir de explantes de plúmula o de tejidos de inflorescencia inmadura.

13 .·

HIPÓTESIS

1) Es posible que el callo embriogénico obtenido de explantes de tejidos florales se pueda multiplicar aplicando el sistema desarrollado para plúmula.

2) Es posible que la aplicación de biorreactores BioMINT ayude a mejorar el desarrollo de brotes obtenidos a partir de plúmula de cocotero.

3) Es posible que al combinar las técnicas de biobal ística, con la infiltración y ca-cultivo con Agrobacterium tumefaciens se incremente la eficiencia de transformación del callo embriogénico de cocotero.

OBJETIVO GENERAL

Realizar estudios que contribuyan a mejorar la micropropagación de cocotero a partir de explantes de plúmula y de explantes que permitan clonar individuos elite de cocotero, como el ovario no fertilizado y la raquilla de inflorescencia inmadura.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1) Explorar si es posible la multiplicación de callo embriogénico obtenido a partir de ovario no fertilizado y/o raquilla de inflorescencia inmadura.

2) Aislar de callo embriogénico de cocotero el ADNc completo del gen CnSERK y secuenciarlo.

3) Aplicar el uso de biorreactores BioMINT para mejorar el desarrollo de brotes de cocotero.

4) Establecer un método para la transformación genética de callo embriogénico de cocotero aplicando bombardeo sin ADN como pretratamiento, seguido por infiltración de los explantes en presencia de Agrobacterium tumefaciens y el posterior ca-cultivo.

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ESTRATEGIA EXPERIMENTAL Plúmula

Callo IEmbríogéní co 1(CEj

C.aUo con E mbríone·s

Somáticos (ES I

Ca liD con lES <germinando

Brotes

Aislammiento del cONA de CnSERJ<

• • • • • •

Ovaño 100 f erti lizado v r.aq~ il la

• • • • • • • • • • • 1 1 •••••••••• •••••••••••••••••••••••

Desarrollo de Br~s en

Bíorreact.c:wes BioMINT

• •

~----P-I.a_n_u_s ____ ~r-·•••••••••••J Figura 2. Estrategia desarrollada en este trabajo para los estudios del mejoramiento de la micropropagación de cocotero. Las cajas en verde indican las actividades desarrolladas en este trabajo. Las líneas punteadas indican pasos que eventualmente se pueden conectar si los resultados son exitosos. MCE = multipl icación de callo embriogén ico.

El protocolo de micropropagación de cocotero desarrollado por el CICY se considera eficiente y se determinó que puede producir 100,000 embriones somáticos a partir de cada explante inicial (plúmula) (PérezNúñez et al., 2006). Sin embargo, es susceptible de ser mejorado en diferentes aspectos para poder hacerlo más rentable y poder usarlo a escala comercia l. La presente estrategia experimental para mejorar el protocolo de micropropagación de cocotero incluye el mejoramiento de

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aspectos prácticos del protocolo y la realización de estudios orientados a obtener un mejor entendimiento de los procesos involucrados en la respuesta del explante al cultivo in vitro.

Aplicación de Biorreactores Uno de los aspectos prácticos a resolver es la eficiencia en términos

del número de unidades obtenidas en diferentes etapas del proceso, por ejemplo, el número de unidades de callo embriogénico, o de embriones somáticos que germinan y llegan a planta. En este sentido, la aplicación de sistemas de inmersión temporal es una de las mejores opciones puesto que en otros cultivos se ha observado que incrementan la eficiencia del proceso de germinación de embriones somáticos y el desarrollo de los brotes en comparación con los sistemas en medio semisólido por lo que en consecuencia se reduce notablemente el tiempo requerido para esta etapa (Etienne y Berthouly, 2002).

Entonces se propone realizar ensayos con material obtenido a partir de plúmula de cocotero y aplicar el uso de biorreactores para mejorar el desarrollo de los brotes de cocotero hasta llegar a planta (Figura 1 ).

Obtención del ADNc del gen CnSERK Otro enfoque para mejorar la eficiencia de la micropropagación por

embriogénesis somática, es realizar estudios orientados a resolver aspectos específicos y obtener un mejor entendimiento del proceso. En este sentido, el estudio de genes relacionados con la inducción de embriogénesis somática en tejido de cocotero in vitro , puede aportar información para incrementar la eficiencia del proceso. Estudios previos han demostrado que al insertar mediante transformación genética genes relacionados con el control de la embriogénesis somática se puede obtener una mejor respuesta de los tejidos transformados al sobre-expresar los transgenes, por lo tanto, el aislamiento del ADNc completo del gen CnSERK (Figura 1) es un paso que en un futuro permitirá realizar estudios durante el desarrollo de callo embriogénico y nos dará una mejor comprensión del papel que desempeña este gen durante el proceso de embriogénesis somática. Eventualmente este conocimiento puede incrementar la eficiencia del protocolo de micropropagación de cocotero, por ejemplo mediante la sobre-expresión inducida de éste gen o de otros aplicando técnicas de transformación genética.

Desarrollo de un protocolo de transformación genética El protocolo para transformación genética de tejido de cocotero que

ha desarrollado el grupo de estudios en cocotero del CICY aún es poco eficiente. No obstante, es indispensable contar con un protocolo eficiente de transformación genética (Figura 1) para el estudio de genes de interés con miras a mejorar el proceso de micropropagación por embriogénesis

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somática, además de que este protocolo podría contribuir al mejoramiento genético y posiblemente a incrementar la respuesta in vitro de los tejidos mediante la sobre-expresión de genes relacionados a la embriogénesis somática en tejidos poco responsivos como son los tejidos de inflorescencia inmadura.

Multiplicación de callo embriogénico obtenido a partir de ovario no fertilizado y/o raquilla de inflorescencia inmadura

Otro de los aspectos prácticos o con aplicación más inmediata, es el hecho de que el actual protocolo de micropropagación de cocotero al usar tejido embrionario (plúmula) como explante inicial , genera clonas genéticamente diferentes a la planta madre, y las plántulas obtenidas pueden no expresar las características agronómicas deseadas, por ejemplo alto rendimiento productivo. Es entonces necesario desarrollar un protocolo que permita clonar palmas adultas seleccionadas por características de interés.

El ovario no fertilizado y la raquilla de inflorescencia inmadura ya fueron usados como explante para intentar la micropropagación de cocotero, pero no se tuvieron buenos resultados. Sin embargo, considerando el estado de conocimiento sobre el cultivo in vitro a partir de plúmula de cocotero (Chan et al. , 1998; Sáenz et al., 2006; Pérez-Núñez et al; 2006), y el reciente reporte de Perera et al., (2007), se planteó hacer estudios para integrar un método combinado en el que se realice la inducción de callo embriogénico a partir de ovario no fertilizado, u otro tejido de inflorescencia inmadura, y entonces determinar las condiciones para su multiplicación de acueroo al proceso reportado por Pérez-Núñez et al. , (2006) (Figura 1 ), lo cual permitirá incrementar el número de embriones somáticos obtenidos por explante inicial y eventualmente la regeneración de plántulas que serán clonas de la planta donadora.

En términos generales la estrategia experimental aquí planteada (Figura 1) cubre aspectos importantes que pueden tener repercusión en el manejo del cocotero, buscando desarrollar un protocolo que permita obtener de manera más eficiente embriones somáticos y su conversión a planta, así como sentar las bases para que eventualmente se puedan clonar individuos adultos en los cuales se haya probado que presentan características de interés como productividad o resistencia a enfermedades.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Arroyo-Herrera, A , A Ku, R. Canche, F. Quiróz-Figueroa, V.M. Loyola, L.C. Rodríguez, C. Burgueff, V.M. Suárez and E. Castaño. 2008. Expression of WUSCHEL in Coffea canephora causes ectopic morphogenesis and increases somatic embryogenesis. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 94: 171-180.

Azpeitia, A 2003. Estudio de diferentes estrategias para promover la embriogénesis somática en cocotero a partir de explantes de plúmula. Tesis de Doctorado. Centro de Investigación Científica de Yucatán, Yucatán, México. 130p.

Azpeitia , A , J.L. Chan, L. Sáenz and C. Oropeza. 2003. Effect of 22(S), 23 (S)-homobrassinolide on somatic embryogenesis in plumule explants of Cocos nucifera L. , cultured in vitro. J. Hort. Sci. Biotech. 78: 591-596.

Been , B.O. 1991. Observations on field resistance to lethal yellowing in coconut varieties and hybrids in Jamaica. Oléagineux, 36:9-11 .

Becerril , K.M. 2003. Transformación de callos embriogénicos de cocotero (Cocos nucifera L.) con el gen de la proteína verde fluorescente mediante Agrobacterium tumefaciens. Tesis profesional. Ingeniero Bioquímico. Mérida, Yucatán, México.

Bello-Bello J.J., Canto-Fiick A , Balam-Uc E. , Gómez-Uc E., Robert M.L. , lglesias-Andreu L.G., and Santana-Buzzy N. 2010. lmprovement of In Vitro Proliferation and Elongation of Habanero Pepper Shoots (Capsicum chinense Jacq.) by Temporary lmmersion. Hortscience 45(7) : 1093-1098.

Branton, R. L. , and J. Blake. 1983. Development of organized structures in callus derived from explants of (Cocos nucifera L.). Ann. Bot. 52:673-678.

Buffard-Morel, J., J.L. Verdeil and C. Pannetier. 1988. Vegetative propagation of coconut palm through somatic embryogenesis, obtention of plantlets from leaf explant. In: Durand, G., L. Bobichon and J. Florent (eds) Proceedings of the 8th international biotechnology symposium. París, p 117.

Buffard-Morel , J. , Verdeil , J.-L. , and Pannetier, C. 1992. Embryogene"se somatique du cocotier (Cocos nucifera L.) a· partir d'explants foliares: e·tude histologique. Can. J. Bot. 70:735-741 .

Cai, W ., Rong-Xiang, F., Feng-Li, Z., Jiu-Chun, Z., Xiaoying , CH., Gui-ling, W., K-Qiang, M., Hong-Sheng, S., Xu , W., and Yue-Ren L. 2002. Virus-resistant Chili pepper produced by Agrobacterium speciesmediated . transformation . In Khachatourians, G., Mc.Hughen, Scorza, R. , Nip, W.K., Hui, Y.H. Transgenic plants and Crops. Marcel Dekker, lnc. N.Y. 563-577.

Carpio C. 201 O. Comentario personal. Coconut Philippine Authority.

19

Filipinas. Chan , J. L. , L. Sáenz, C. Talavera, R. Hornung, M. Robert, and C. Oropeza.

1998. Regeneration of coconut (Cocos nucifera L.) from plumule explants through somatic embryogenesis. Plant Cell Rep. 17:515-521 .

CONACOCO. 2006. Estudio de la Demanda Nacional de Pulpa, Fibra y Agua para la Compactación de la Oferta Regional del Cocotero. Consejo Nacional del Coco A.C. 116p.

Citovsky V., Kozlovsky s.v.., Lacroix B., Altsman A , Dafny-Yelin M., Vyas S., Tovkach A , and Tzfira T. 2007. Biological systems of host cell involved in Agrobacterium infection . Cellular Microbiology. 9 (1 ): 9-20.

Domínguez, E. , J. López, R. Castillo y P. Ruíz. 1999. El Cocotero (Cocos nucifera L.) Manual para la Producción en México. INIFAP. Tabasco, México. 132p.

EFE. 2009. PepsiCo adquirirá Amacoco, la compañía de agua de coco más grande de Brasil. http://www.revistaplus.com.py/noticias-vermas.php?id=4324. Accesado 3 de octubre de 2009.

Eeuwens, C.J. 1976. Mineral requirements for growth and callus initiation of tissue explants excised from mature coconut palms (Cocos nucifera) and cultured in vitro. Physiol. Plant. 36: 23-28.

Eeuwens, C.J. 1978. Effects of organic nutrients and hormones on growth and development of tissue explants from coconut (Cocos nucifera) and Date (Phoenix dactylifera) Palms Cultured in vitro. Physiologia Plantarum. 42 (2) : 173-178.

Eeuwens, C.J. and J. Blake. 1977. Culture of coconut and date palm tissue with a view to vegetative propagation. Acta Hortic. 78: 277-286.

Escalona, M. , J.C. Lorenzo, B. González, M. Daquinta, J.L. González, Y. Desjardins and C.G. Borroto. 1999. Pineapple (Ananas comosus L. Merr) micropropagation in temporary immersion systems. Plant Cell Reports. 18: 743-748.

Escalona, M. , G. Samson, C. Borroto, and Y. Desjardins. 2003. Physiology of effects of temporary immersion bioreactors on micropropagated pineapple plantlets. In Vitro Cell. Dev. Bioi.-Piant. 39:651-656.

Espinosa, P., J.C. Lorenzo, A Iglesias, L. Yabor, E. Menéndez, J. Borroto, L. Hernández and A.D. Arencibia. 2002. Production of pineapple transgenic plants assisted by temporary immersion bioreactors. Plant Cell Rep. 21:136-140.

Etienne, H. and M. Berthouly. 2002. Temporary immersion systems in plant micropropagation. Plant Cell , Tissue and Organ Culture 69: 215-231 .

Etienne H., Lartaud M. , Michaux-Ferriere N., Carron M.P., Berthouly M. and Teisson C. 1997. lmprovement of somatic embryogenesis in Hevea brasi/iensis (Müll. Arg .) using the temporary immersion technique. In

20

Vitro Cell. Dev. Bioi.-Piant. 33: 81-87. González-Estrada, T.A. , Souza-Perera, R. , Steinbiss, H., Jach, G.,

Schmelzer, E., Rohde, W., Oropeza, C. (2003). Coconut (Cocos nucifera L.) embryogenic calli transformation by particle gun with green fluorescent protein and red fluorescent protein. XI Congreso Nacional de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas. Acapulco, Gro. México.

Harrison N.A, Cordova 1. , Richardson P., and DiBonito R. 1999. Detection and diagnosis of lethal yellowing. In : Oropeza, C. , J.-L. Verdeil , R. Ashburner, R. Cardeña and J.M. Santamaría (Eds) . Current Advances in Coconut Biotechnology. Kluwer Academic Publishers. The Netherlands. Pp: 183-196.

Harrison N.A , Oropeza, C. , 2008. Coconut lethal yellowing . In: Harrison, N.A , Govind P.R. , Marcene C. (eds) . Characterization, Diagnosis and Management of Phytoplasmas. Studium Press LLC, Texas, USA, pp. 219-248.

Herrera-Estrella, L. , Simpson, J ., and Martínez-Trujillo , M. 2004. Transgenic Plants. An historical perspective. In: Peña, L. Transgenic Plants. Methods and Protocols. Humana Press. 286. Pp. 3-31 .

Hornung, R. 1995. Micropropagation of Cocos nucifera L. from plumule tissue excised from mature zygotic embryos. Plant. Res. Devel. 2: 38-41 .

Hwang, H.H., and S.B. Gelvin. 2004. Plant proteins that interact with VirB2, the Agrobacterium tumefaciens pilin protein , mediate plant transformation. The Plant Cell. 16: 3148-3167.

Jin S. , Roitsch T. , Ankenbauer R.G., Gordon M.P., and Nester E.W. 1990a. The VirA protein of Agrobacterium tumefaciens is autophosphorylated and is essential for vir gene regulation . Journal of Bacteriology. 172 (2) : 525-530 .

Jin S, Roitsch T, Christie P.J., and Nester E.W. 1990b. The regulatory VirG protein specifically binds to a cis-acting regulatory sequence involved in transcriptional activation of Agrobacterium tumefaciens virulence genes. Journal of Bacteriology. 172 (2) : 531-537.

Jin S, Prusti R.K, Roitsch T, Ankenbauer R.G and Nester E.W. 1990c. Phosphorylation of the VirG protein of Agrobacterium tumefaciens by the autophosphorylated VirA protein: essential role in biological activity of VirG. Journal of Bacteriology. 172 (9) : 4945-4950.

Justin, S.H.F.W. 1978. Vegetative propagation of coconuts. Report East Mailing Research Station . 1977. pp 75-176.

Maene L. , and Debergh P. 1985. Liquid medium additions to established tissue cultures to improve elongation and rooting in vivo. Plant Cell , Tiss. Org. Cult. 5: 23-33

McCoy, R.E. , Howard F.W., Tsai J.H., Donselman H.M., Thomas D.L. , Basham H.G., Atilano R.A. , Eskafi F.M. , Britt L. and Collins M.E. 1983. Lethal yellowing of palms. University of Florida Agricultura!

21

Experiment Stations Bulletin 834. Gainesville, Florida, USA. 1 OOp. Oropeza C., Alpízar L. , Islas 1. , Escamilla A. , and Santamaría J. 1995.

Physiology and biochemistry of lethal yellowing affected palms. In: Oropeza C., Howard F.W. and Ashburner G.R. (Eds) . Lethal Yellowing, Research and Practica! Aspects. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. pp 65-77.

Oropeza C. Rillo E. Hocher V. & Verdeil J-L. 2005. Coconut micropropagation, pp. 334-348 . In: Batugal P. Rao R.V. & Oliver J. (eds) , Coconut Genetic Resources, lnternational Plant Genetic Resources lnstitute-Regional Office for Asia , the Pacific and Oceania (IPGRI-APO), Serdang , Selangor.

Pannetier, C., and J. Buffard-Morel. 1982. Premiers r'esultats concernant la production d'embryons somatiques 'a partir de tissus foliaires de cocotier, Cocos nucifera L. Oleagineux. 37:349-354.

Peña-Ramírez Y.J., Juárez-Gómez J., Gómez-López L. , Jerónimo-Pérez J.L. , García-Sheseña 1. , González-Rodríguez J.A. and Robert M.L. 201 O. Multiple adventitious shoot formation in Spanish Red Cedar (Cedrela odorata L.) cultured in vitro using juvenile and mature tissues: an improved micropropagation protocol for a highly valuable tropical tree species. In Vitro Cell. Dev. Bioi.-Piant 46 (2) :149-160.

Perera P.I.P. Hocher V. Verdeil J-L. Doulbeau S. Yakandawala D.M.D. & Weerakoon L.K. 2007. Unfertilized ovary: a novel explant for coconut (Cocos nucifera L.) somatic embryogenesis. Plant Cell Rep. 26: 21-28.

Pérez-Núñez, M.T. 2006. Embriogénesis somática en cocotero: estudios sobre aspectos del desarrollo y mejoramiento de la eficiencia. Tesis de Doctorado. CICY. Mérida, Yucatán. 95p.

Pérez-Núñez, M.T., J.L. Chan, L. Sáenz, T. González, J.L. Verdeil , and C. Oropeza. 2006. lmproved Somatic Embryogenesis from Cocos nucifera (L.) Plumule Explants. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 42:37-43.

Preil W. 2005. General introduction: a personal reflection on the use of liquid media for in vitro culture. In: Hvoslef-Eide A.K. and Preil W. (Eds) . Liquid Culture Systems for in vitro Plant Propagation. Springer. Berlin. Pp 1-18.

Punchihewa, P.G. 1999. Current status of the coconut industry. In: Oropeza, C., J.L. Verdeil , R. Ashburner, R. Cardeña and J.M. Santamaría (Eds) . Current advances in coconut biotechnology. Kluwer Academic Publishers Netherlands. Pp. 3-17.

Ramírez, J. E. 2003. Actividad enzimática tipo ~-Giucuronidasa endógena en tejidos de cocotero (Cocos nucifera L.). Tesis Profesional. Ingeniero Bioquímico. Instituto Tecnológico de Mérida. 66p.

Ramírez, J.E. 2005. Estudios preliminares de transformación genética de cocotero (Cocos nucifera L.) cv. Alto del Atántico mediante

22

Agrobacterium tumefaciens. Tesis Maestría en Ciencias y Biotecnología de Plantas. CICY. Mérida, Yucatán. 70p.

Robert, M.L. , J.L. Herrera-Herrera, G. Herrera-Herrera and M.A. HerreraAiamillo. 2006. Chapter 11 . A new temporary inmersion bioreactor system for micropropagation. In: Loyola-Vargas, V.M. and F. Vázquez-Fiota (ed). Methods in Molecular Biology. Vol. 318. Plant Cell Culture Protocols. Human Press lnc. New Jersey. 121 -129.

Saenz, L. , A Azpeitia , B. Chuc-Armendariz, J.L. Chan, J.-L.Verdeil, V. Hocher, and C. Oropeza. 2006. Morphological and histological changes during somatic embryo formation from coconut plumule explants. In Vitre Cell. Dev. Bioi.-Piant42 (1):19-25.

Sagarpa. 2005. Plan rector sistema producto nacional palma de coco. Sagarpa-Tec Monterrey-INCA Rural. México D.F. 54p.

Salunkhe D.K. and B.B. Desai. 1986. Coconut. In : Postharvest Biotechnology of Oilseeds. Vol. 2. CRC Press Crit. Rev. Boca Raton, Florida.

Santos, G.A. 1999. Potencial use of clonal propagation in coconut improvement programs. In: Oropeza C., F.W. Howard and G.R. Ashburner (Eds) . Lethal Yellowing Research and Practica! Aspects. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. Pp 419-430.

Shin R. , Park J., An J.M. and Paek K.H. 2002. Ectopic expression of Tsi1 in transgenic hot pepper plants enhaces host resistance to viral , bacteria! , and oomycete pahogens. The American Phytopathological Society. MPMI. 15 (10) : 983-989.

Solís-Ramos L.Y. González-Estrada T. Nahuath-Dzib S. Zapata-Rodríguez L.C. and Castaño E. 2009. Overexpression of WUSCHEL in Capsicum chinense causes ectopic morphogenesis. Plant Cell Tiss. Org . Cult. 96: 279-287.

Solís-Ramos L.Y. , González-Estrada T. , Rodríguez-Zapata L.C., KuGonzález A , andE. Castaño de la Serna. 2010. Chapter 3: lnfection mechanism of Agrobacterium tumefaciens. In: Kumar A (Ed). Plant Genetic Transformation and Molecular Markers. Pointer Pub. India. Pp. 47-65.

Teisson C., Alvard D., Lartaud M., Etienne H., Berthouly M. , Escalona M. and Lorenzo J.C. 1999. Temporary immersion for plant tissue culture. In: Plant Biotechnology and In vitro Biology in the 21 51

Century, Proceedings of the IXth lnternational Congress of Plant Tissue and Cell Culture, Section H: Novel micropropagation methods. Jerusalem. pp 629-632.

Teisson C., and Alvard D. 1995. A new concept of plant in vitro cultivation liquid medium: temporary immersion. In: Terzi M., et al. (eds) . Current lssues in Plant Molecular and Cellular Biology. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. pp 105-110.

23

Tzfira , T. and Citovsky, V. 2000. From host recognition to T-ONA integration: the function of bacteria! and plant genes in the Agrobacterium-plant cell interaction. Molecular Plant Pathology. 1(4): 202-212.

Tzfira, T. , Frankmen 1. , Vaidya M. , and Citovsky V. 2003. Site-specific integration of Agrobacterium T-ONA via double-stranded intermediates. Plant Physiol. 133: 1011-1023.

Verdeil J.-L. , Huet C, Grosdemanges F, Rival A, and Buffard-Morel J. 1992. Embryogenése somatique du cocotier (Cocos nucifera L) : obtention de plusieurs clones de vitroplants. Oleagineux 47: 465-469.

Verdeil , J.-L. , C. Huet, F. Grosdemange and J. Buffard-Morel. 1994. Plant regeneration from cultured immature inflorescence of coconut (Cocos nucifera L.): evidence for somatic embryogenesis. Plant Cell Rep. 13:218-221.

Verdeil J.-L. , Rillo E., Hornung R. , Sangare A. , Jacobsen H.J. , Oropeza C., Hocher V., and Hamon S. 1997. Report on the progress of the current STD3 project on coconut propagation through somatic embryogenesis. lnternational Symposium on Coconut Biotechnology. CICY. Merida, Yucatan, Mexico. Pp 1-5.

Webb K.J., and Morris P. 1992. Methodologies of plant transformation . In: Gatehouse, A.M.R. , Hilder, V.A. , and Boulter, D. (Eds) . Plant Genetic Manipulation for Crop Protection. CAB lnternational. Wallinford , UK. Pp. 7-43.

Weerakoon, L.K. 2004. Coconut tissue and embryo culture in Sri Lanka: current developments and future challenges. In : Peiris T.S.G., and C.S. Ranasinghe (eds) . Proceedings of the international conference of the Coconut Research lnstitute of Sri Lanka-Part 1 (Review papers and guest presentations). CRI , Lunuwila, Sri Lanka. Pp: 41-61 .

Yang S.-H . and D.-M . Yeh. 2008. In vitre leaf anatomy, ex vitre photosynthetic behaviors and growth of Calathea orbifolia (Linden) Kennedy plants obtained from semi-salid medium and temporary immersion systems. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 93: 201-207.

Zizumbo, D., Fernández, M., Torres, H., Cardeña, R. 1999. Lethal Yellowing resistance germplasm from Mexico. In: Oropeza, C., Verdeil , J-L. Ashburner, G.R. Cardeña, R. and Santamaria J.M. (Eds) . Current Advances in Coconut Biotechnology. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, The Netherlands, pp. 131-144.

Zuo J., Q . Niu, G. Frugis, N. Chua, 2002. The WUSCHEL gene prometes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis. The Plant Journal 30 (3): 349-359.

24

Capítulo 1

Micropropagación de cocotero a partir de ovario no fertilizado y/o raquilla de inflorescencia inmadura.

1.1 INTRODUCCIÓN En los últimos años el grupo de investigación sobre cocotero del

CICY ha desarrollado estudios con diferentes enfoques para hacer más eficiente el sistema de micropropagación basado en plúmula. Pérez-Núñez (2006) reportó importantes avances respecto al mejoramiento de la eficiencia de la embriogénesis somática en este sistema, integrando una estrategia que permite obtener unos 100,000 embriones somáticos mediante multiplicación de callo embriogénico y embriogénesis somática secundaria. Con este enfoque se pueden multiplicar en gran cantidad individuos obtenidos a partir de padres seleccionados lo cual es equivalente a lo que se hace actualmente en la producción tradicional de híbridos, solo que en el manejo tradicional se obtendría un individuo a partir de cada embrión cigótico, mientras que aplicando el sistema de multiplicación que se tiene establecido se podrían tener miles de individuos, los cuales podrían llevarse a campo para ser evaluados en su desempeño. Si esta técnica se combinara por ejemplo con la aplicación de marcadores moleculares, para una detección temprana de características como resistencia a patógenos o productividad, se podrían detectar materiales de interés para ser multiplicados in vitro mediante el sistema actualmente establecido. El principal inconveniente que se podría considerar es que este sistema puede no ser tan útil si se pensara en la propagación de híbridos, puesto que el tejido de plúmula es obtenido del embrión inmaduro y no permite clonar individuos adultos.

1.1.1 Nuevos intentos a partir de tejidos florales Recientemente y después de varios años se retomaron los estudios

basados en tejidos de inflorescencia. Perera et al. (2007) reportaron la obtención de callo embriogénico a partir de ovario no fertilizado extraído de inflorescencias inmaduras de cocotero. Por análisis histológico determinaron que los callos obtenidos se originan a partir del carpelo y por citometría de flujo determinaron que los callos embriogénicos son diploides, lo que sugiere que a partir de este tejido es posible clonar individuos adultos de cocotero, sin embargo, para la micropropagación a partir de este explante aún se requiere realizar estudios que permitan resolver detalles del proceso para hacerlo más reproducible y eficiente.

Por lo tanto, los recientes resultados con ovario no fertilizado abren la posibilidad de generar un protocolo para clonar plantas adultas. En este sentido, considerando al sistema que utiliza plúmula como el sistema

25

modelo para cocotero, es importante realizar estud ios para superar las principales limitantes que presenta, por ejemplo aumentar el porcentaje de germinación de los embriones somáticos y mejorar el desarrollo a planta.

1.1.2 Posibilidad de multiplicación masiva a partir de tejidos florales Dado que el protocolo a partir de plúmula no permite clonar

individuos adultos con características probadas, sería muy importante desarrollar un protocolo basado en el uso de un explante que permita lograr esto, pero usando el enfoque de producción masiva para plúmula reportado por Pérez-Núñez et al. (2006). Por lo que en este capítulo se presenta un estudio para definir cond iciones para la multiplicación de callo embriogénico obtenido de explantes de tejidos de inflorescencia inmadura, de acuerdo a lo reportado para explantes de plúmula por Pérez-Núñez et al. , (2006).

1.2 MATERIALES Y METODOS

Se realizaron experimentos para establecer un protocolo de micropropagación de cocotero a partir de ovario no fertilizado y/o raquilla de inflorescencia inmadura.

1 Corecta de inflo-rescencias en etapa -3 a -8 1

" Exb-accíón de raqui lla y ovario no fertínzado

• lnducci.ón de •callo embriogénico [2,4-!0J

Eva.IUacíón por apariencia e histología 1

• 1 Selección del callo embriogénico 1

+ Multiplicación de callo embriogénico

en medio semisólido

Figura 1.1. Metodología para el desarrollo de un protocolo de micropropagación de cocotero a partir de ovario no fertilizado y/o raqu illa. En blanco las actividades desarrolladas y en verde se ind ica la meta.

En cada experimento se desarrollaron las actividades ind icadas en la figura 1.1 las cuales se expl icarán a continuación.

26

1.2.1 Colecta de inflorescencias, extracción de raquilla y ovario no fertilizado

Se realizó la colecta de material en plantas de cocotero de la variedad enano malayo verde. Para seleccionar la inflorescencia se siguió el criterio citado por Perera et al., (2007) donde se considera a la inflorescencia más desarrollada y que recién expuso sus flores a polinización como la inflorescencia O (cero) , la inflorescencia que le sigue y que expondrá sus flores en aproximadamente 30 días se considera como inflorescencia -1 , y así sucesivamente hasta las inflorescencias que están en desarrollo en el centro de crecimiento de la palma, tal como se ilustra en la figura 1.2.

En nuestro caso se seleccionaron preferentemente las inflorescencias de etapas -3 a -8, para evitar que la colecta causara daño a la planta donadora. Se colectaron inflorescencias en una planta localizada en el jardín de CICY, cuatro plantas de un predio de Hunucmá, Yucatán, y dos más de la plantación establecida en San Crisanto, Yucatán. Las inflorescencias fueron mantenidas dentro de sus espatas (Figura 1.2 y 1.3) y en condiciones de refrigeración (6 oc) durante su transporte. Ya en el laboratorio las espatas se lavaron con agua y jabón para posteriormente aplicarles baños de 1 O minutos con hipoclorito de sodio al 30% (Figura 1.4a).

En la campana de flujo laminar se dieron enjuagues al material con agua esterilizada y se liberaron las inflorescencias contenidas en cada espata para realizar la extracción de raquillas y flores femeninas de las diferentes inflorescencias colectadas (Figura 1.3) , colocando los tejidos en una solución antioxidante. La escisión de los ovarios se realizó en campana de flujo laminar con ayuda de un estereoscopio (Figura 1.4b), separando los sépalos y pétalos para dejar libre el ovario. En cuanto a las raquillas, estas son segmentadas mediante cortes transversales de aproximadamente 1 mm de grosor descartando las secciones del extremo superior e inferior, por lo que solo se llevan a cultivo los segmentos obtenidos en la parte central de la raquilla.

.·

27

Figura 1.2. a: representación de la disposición de las inflorescencias en la planta, la cual es en espiral y de manera ascendente. b: imagen de espatas conteniendo inflorescencias desde etapa O hasta la -22, obtenidas de una palma adulta.

-1

-2

Figura 1.3. a: espatas con inflorescencias en etapa -1 , -2 y -3. b: imagen de raquillas con flor femenina inmadura cerca de su extremo izquierdo (base) . Del centro y hacia el extremo derecho se observan múltiples flores masculinas inmaduras. Los números a la derecha de la imagen indican la etapa de desarrollo a que corresponden las raquillas. e: corte transversal de flor femenina en etapa -1 que muestra la posición del ovario no fertilizado.

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Figura 1.4. a: flores femeninas obtenidas de inflorescencias -3 y -4 colocadas en solución de hipoclorito de sodio al 30% antes de ser abiertas en campana de flujo laminar. b: flor femenina siendo disectada en el estereoscopio en campana de flujo laminar para extraer el ovario no fertilizado. e: ovario no fertilizado sembrado en medio semisólido con 2,4-D y carbón activado para inducción de callo embriogénico.

1.2.2 Inducción de callo embriogénico a partir de ovario no fertilizado y raquilla

La inducción de callo embriogénico se realizó en frascos de cultivo con 1 O mi de medio semisólido (Figura 1.4c) ya sea a partir de los ovarios no fertilizados extraídos o de los segmentos de raquilla de las inflorescencias. Se utilizó el medio de inducción que se aplica para plúmula de cocotero (Y3, Pérez-Núñez et al., 2006), con carbón activado (0 .25%), pH 5.75, con 5% de sacarosa, y 0.3% (w/v) de gelrite. En el caso del ovario no fertilizado los tratamientos fueron diferentes concentraciones de 2,4-D, mientras que para el caso de los segmentos de raquilla se aplicaron diferentes concentraciones de 2,4-D/BAP. Para ambos tipos de explante los frascos se mantienen en oscuridad a 28°C por 3 meses sin subcultivar. Una vez obtenido callo, éste es subcultivado en medio para inducir su multiplicación.

1.2.3 Caracterización de callo embriogénico

Para caracterizar el callo obtenido se tomaron muestras y se analizaron tanto por su apariencia externa como por cortes histológicos, de este modo se seleccionó el callo considerado embriogénico para subcultivarlo en medio semisólido e inducir su multiplicación . Los cortes histológicos se realizaron con ácido periódico Schiff (APS) + Azul-Negro de naftol incluyendo los tejidos en parafina.

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1.2.4 Multiplicación de callo embriogénico

Una vez obtenido callo embriogénico, se procede de acuerdo al protocolo de Pérez-Núñez (2006), renovando el medio de cultivo para intentar la multiplicación del callo de manera similar a lo que se realiza con el tejido obtenido a partir de plúmula. Eventualmente, cuando se cuente con un protocolo adecuado para producción de callo embriogénico a partir de alguno de los explantes ensayados se pueden tener condiciones para realizar ensayos en biorreactor para multiplicación de callo embriogénico.

'

1.3 RESULTADOS

1.3.1 Experimento 1. Inducción de callo embriogénico a partir de raquilla

Se realizó el experimento para la inducción de callo embriogénico a partir de segmentos de raquilla de inflorescencias en etapa -6 y -7, colocando los explantes en frascos de cultivo con 1 O mi de medio Y3 adicionado con las concentraciones de 2,4-D y BAP indicadas en la tabla 1.1, dando un total de 20 tratamientos ensayados y 195 explantes usados.

Tabla 1.1. Porcentaje de explantes por tratamiento que presentó alguna respuesta a la inducción con BAP y 2, 4-D a los 180 días de cultivo . Entre paréntesis se indica el número de tratamiento.

2,4-D [mM]

BAP [mM] o 0.01 0.05 0.2 0.4

o o (t20 o (t19) 50 (t18) o (t17) o (t16)

0.005 o (t15) o (t14) o (t13) o (t12) 33 (t11)

0.02 O (t1 O) 50 (t9) 33 (tB) 25 (t7) 25 (t6)

0.04 o (t5} o (t4} 42 {t3} 16 {t2} 20 {t1}

En ' la figura 1.5 se presentan las respuestas obtenidas en este experimento. A diferencia de los experimentos con ovario no fertilizado que se explicarán más adelante, los explantes de raquilla presentaron poca mortalidad , solo 18 explantes (9.2% del total) en 5 tratamientos se necrosaron y murieron al final del periodo de inducción (Figura 1.5) . No obstante, la mayor parte de los explantes (141 = 72.3%), simplemente presentaron un incremento drástico en su tamaño y algunos desarrollaron los meristemos florales pero no formaron callo de ningún tipo. Solamente 36

30

explantes (18.4 % del total} distribuidos en 9 tratamientos presentaron la formación de callo, pero con apariencia diferente al callo tipo embriogénico que se obtiene a partir de plúmula o de ovario no fertilizado.

115

100 100 100 100 100 100 100 100

95 00

83,4

75 75 75 75 51 51 51

512 55 ro ro 50

42.8

35 33 33 !5.8

1~ 25 25

1 1 21)

J 1 1 15 11 o o o o o o o o o -5 , .. .J. .()> ~ ~ ..y " -3> ./!> "<:)

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• %deCallo • %de mortalidad • "lo sin callo

Figura 1.5. Respuestas obtenidas en el experimento de inducción de callo embriogénico en raquilla tras 180 días de cultivo. Los tratamientos aplicados están indicados con la leyenda t1 a t20 (ver tabla 1.1 ). Los números sobre las barras indican el porcentaje de la respuesta correspondiente.

Figura 1.6. Cortes histológicos de explantes de raquilla que a los 90 días de inducción formaron tejido tipo callo. El tejido está teñido con azul negro de naftol. La barra de referencia equivale a 5mm.

31

Los explantes que presentaron la formación de tejido tipo callo, fueron clasificados en grupos de acuerdo a sus características morfológicas y se hicieron cortes histológicos a una muestra de cada grupo obtenido. En la figura 1.6 se presentan algunos de los cortes histológicos realizados y se observa que en ningún caso hay evidencia de que sea tejido con capacidad embriogénica. Sin embargo, los explantes fueron sub-cultivados en medio nuevo para darles seguimiento y observar su desarrollo.

1.3.2 Experimento 2. Inducción de callo embriogénico a partir de ovario no fertilizado

Se realizó un primer experimento con material colectado en una planta localizada en el CICY, se probaron las inflorescencias correspondientes a las etapas -2 y -3 (Figura 1.2 a y b) , a partir de las cuales se hizo la extracción de flor femenina y se colocaron en cultivo los siguientes tejidos en las concentraciones de 2, 4-D indicadas en la tabla 1.2.

Tabla 1.2. Número de explantes utilizados en el experimento de inducción con ovario no fertilizado. Se indica el tipo de tejido y las concentraciones de 2,4-D utilizadas. En paréntesis se indica la etapa de desarrollo del tejido.

Tejido Domo del ovario

Sépalos óvulos Suma

0.3 5 (-3) 3 (-3) 4 (-2)

12

2,4-D [mM] 0.45 0.6 5 ( -3) 5 ( -3) 3 (-3) 3 (-3) 4 (-2) 3 (-2)

12 11

Suma 15 9

11 35

Después de 60 días de inducción se comenzó a revisar en el microscopio estereoscópico todos los explantes que formaron callo para seleccionar aquellos que presentaron características parecidas al callo embriogénico que se obtiene en los cultivos a partir de plúmula, a este callo se le denominó callo tipo embriogénico.

32

Tabla 1.3. Número de explantes que respondieron formando callo tipo embriogénico. En paréntesis se indica la etapa de desarrollo en que fue obtenido el explante:.:... --------:---=--=--e:-=--------

Tejido Domo del ovario

Sépalos óvulos

0.3 o o o

0.6 o o o

En la tabla 1.3 se observa que los explantes cultivados en el tratamiento con la mayor concentración de 2,4-D (0.6 mM) aplicada, no presentaron una respuesta favorable y al final de los 90 días de incubación se obtuvo 100% de mortalidad independientemente de la etapa de desarrollo a que pertenecía el tejido (-2 o -3) . En general en las otras 2 concentraciones de 2,4-D probadas solo se obtuvo un incremento en el tamaño del explante, y no se formó callo embriogénico. Los tejidos extraídos de la inflorescencia -3 fueron los únicos que respondieron formando callo, mientras que los de la inflorescencia -2 se necrosaron y murieron antes de concluir el periodo de evaluación de 90 días (Tabla 1.3) . Solamente en el tratamiento con 0.45 mM de 2,4-D se observó la aparición de callo tipo embriogénico en un único explante de tejido en etapa -3 (Tabla 1.3). Se realizó la renovación del medio (0.45 mM de 2,4-D) al explante que presentó callo tipo embriogénico pero no se logró mantener con el mismo aspecto y al final se obtuvo callo de tipo haustorial (Figura 1. 7) .

Figura 1.7. Imagen de callo tipo haustorial obtenido en cultivo de ovario no fertilizado. Cada línea de la escala corresponde a 1 mm.

33

1.3.3 Experimento 3. Nueva inducción de callo embriogénico a partir de ovario no fertilizado

Con base en los resultados del experimento 2 se planteó un experimento con material colectado en cuatro plantas en la localidad de Hunucmá, Yucatán. Se colectaron las inflorescencias más jóvenes correspondientes a las etapas -3 y -4, se extrajo la flor femenina y se obtuvieron los explantes para cultivarlos en las concentraciones de 2, 4-D indicadas en la tabla 1.4.

Tabla 1.4. Concentraciones de 2,4-D y número de explantes utilizados por tratamiento en el experimento 3. Se indica en paréntesis desarrollo en que fue tomado el explante.

Tejido Ovario (-3) Ovario (-4)

Suma

0.35 21 15 36

0.4 22 17 39

2,4-D [mM] 0.45 0.5 21 19 18 16 39 35

0.55 20 17 37

la etapa de

Suma 103 83 186

En la tabla 1.5 de la siguiente página, se observa que poco más de la mitad de los explantes usados en el experimento (96 = 51 .6 %) se necrosaron y murieron independientemente del tratamiento en que fueron cultivados o de la etapa de desarrollo en que fueron colectados (-3 y -4) . Sin embargo, se observó que los explantes de la etapa -3 tuvieron mayor frecuencia de mortalidad (62) respecto a los de la etapa -4 (34) . De los explantes que sobrevivieron , la mayoría (81 = 43.5 % del total) solo presentaron un incremento de tamaño o la formación de callo tipo haustorial. Después de 90 días de inducción únicamente 9 explantes (4.8 % del total) presentaron la formación de callo tipo embriogénico, 8 de estos explantes eran de la etapa -4 y 1 de la etapa -3 (tabla 1.5) .

Tabla 1.5. Número de explantes por respuesta obtenida para cada etapa de desarrollo del explante inicial.

Respuesta Explante muerto

Crecimiento de tejido Callo tipo embriogénico

Total

Etapa del Explante -3 -4 62 34 40 41 1 8

103 83

34

Total 96 81 9

186

En la tabla 1.6 se presenta el número de explantes que formó callo tipo embriogénico en relación a la concentración de 2,4-D utilizada. El tejido de etapa -4 con la concentración 0.55 mM de 2,4-D presentó el mayor número de explantes con formación de callo tipo embriogénico (3) , esta concentración es muy cercana a la que se usa para inducir la misma respuesta en plúmula (0.6 mM de 2,4-D) (Pérez-Núñez et al., 2006) .

Tabla 1.6. Número de explantes que respondieron formando callo tipo embriogénico de acuerdo a la concentración de 2,4-D.

2,4-D [mM] Tejido 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55

Ovario (-3) Ovario (-4)

o 2

1 2

o o

o 1

o 3

En la figura 1.8 se muestran imágenes de explantes que presentaron formación de callo tipo embriogénico después de 90 días de inducción. Todos los explantes se subcultivaron en medio semisólido para mantener el callo embriogénico y proceder a su multiplicación .

Figura 1.8. Algunos explantes del experimento 2 que presentaron formación de callo tipo embriogénico. a= ovario no fertilizado de etapa -4 con 0.35 mM de 2,4-D. by e= ovario no fertilizado de etapa -4 con 0.55 mM de 2,4-D.

1.3.4 Multiplicación de callo embriogénico

Una vez obtenido callo tipo embriogénico se procedió a multiplicarlo aplicando el sistema de Pérez-Núñez et al., (2006). En la figura 1.9 se presentan imágenes del desarrollo del callo tipo embriogénico tras 90 días de haber sido subcultivado en medio Y3 con 0.55 mM de 2,4-D. A partir de

35

estas estructuras se obtuvieron los explantes para iniciar la multiplicación del callo tipo embriogénico.

En la figura 1.1 O se observan las estructuras embriogénicas obtenidas tras la multiplicación de callo embriogénico, estas estructuras ya presentan una morfología muy similar a la que presentan las estructuras embriogénicas que se obtienen en los cultivos de plúmula.

Figura 1.9. Callo embriogénico de 180 días obtenido a partir de ovario no fertilizado en etapa -4 , subcultivado con 0.55 mM de 2,4-D para multiplicación de callo embriogénico.

36

Figura 1.1 O. Estructuras embriogénicas obtenidas mediante multiplicación de callo embriogénico inducido en ovario no fertilizado etapa -4. Las estructuras se obtuvieron con 0.55 mM de 2,4-D.

Tabla 1.7. Datos de la multiplicación de callo embriogénico (CE). Ciclo Tipo de explante No. de No. de

Inducción 1 2 3

Ovario Estructuras Embriogénicas Estructuras Embriogénicas

Estructuras Embriogénicas

explantes CEs 34 2 (6 %) 14 5(35%) 31 6(19%)

18 3 (16 %)

La tabla 1. 7 presenta los resultados de multiplicación de callo embriogénico. El explante inicial fue el ovario no fertilizado en el cual se indujo la formación de callo con 2,4-D y se obtuvo un 6 % de formación de callo. A partir del primer evento de multiplicación se utilizaron como explantes las estructuras con apariencia de callo embriogénico o estructuras embriogénicas. En el evento 3 se lograron obtener las estructuras embriogénicas mostradas en la figura 1.1 O, las cuales son claramente

37

similares a las que se obtienen en el cultivo de plúmula (Fig. 1.11 ). Es importante mencionar que los tiempos requeridos para obtener

las repuestas de los explantes fueron muy superiores a los reportados para plúmula (Chan et al., 1998; Pérez-Núñez et al., 2006). En el caso de la inducción inicial de callo a partir de raquil la se necesitan 6 meses y en ovario se necesitaron de 3 a 5 meses por lo que se realizó un sub-cultivo a los 3 meses, mientras que para plúmula el proceso hasta callo embriogénico toma 3 meses (Chan et al., 1998 - Figura 1.11 ).

Después del tercer evento de multipl icación del callo embriogén ico de raqu illa y ovario no fertilizado, la morfología del callo embriogénico comenzó a ser muy similar al obten ido mediante plúmula y el tiempo requerido para la formación de las estructuras se redujo notoriamente, de ta l manera que fue muy similar a lo que se observa en plúmula. Las estructuras embriogénicas generadas en los cultivos a partir de ovario o raqu illa, que morfológicamente fueron similares a las que se obtienen en plúmula, presentaron los mejores porcentajes de multiplicación en todos los ensayos real izados.

Tíemp" acumulado Ovario no fertmzado

t

1m 3-5m

t

3m 6-7m

t

5m 10m

8m ?m

12m ?m

Figura 1.11 . Esquema comparativo de los tiempos requeridos para los procesos morfogénicos con explante de plúmula y de ovario no fertilizado.

38

En la tabla 1.8, se muestran los porcentajes de formación de callo embriogénico al multiplicar diferentes líneas embriogénicas generadas por inducción de explantes de ovario no fertilizado y de raquilla . En este punto ya el comportamiento del material es prácticamente como el observado para plúmula, con porcentajes superiores a los obtenidos en los primeros ciclos de multiplicación y también muy elevado comparado con lo reportado por Perera et al. , (2007) y Verdeil et al., (1994) para estos mismos explantes, puesto que ellos reportan resultados globales del experimento pero no dividen los porcentajes por líneas embriogénicas.

Al continuar multiplicando los callos obtenidos en raquilla y a los de ovario no fertilizado se obtuvieron los resultados de la figura 1.12. Es importante mencionar que en el caso de los callos embriogénicos de ovario no fertilizado, éstos fueron perdiendo la capacidad de multiplicación, mientras que en los de raquilla la capacidad embriogénica se mantuvo y fue posible obtener mucho más unidades en cada nuevo ciclo (Figs. 1.12, 1.13).

Tabla 1.8. Porcentaje de callo embriogénico obtenido al multiplicar diferentes líneas generadas con ovario no fertilizado y raguilla (T1-7) .

Línea

6 15 19 20 23

31A 32-B 34

34-B 34-F 34-H

37 T1-7

No. de Explantes iniciales

40 59 14 4

31 21 9 9

49 20 33 18 36

39

%de Callo Embriogénico

47.4 66.4 35.7 o

19.3 23.8 22.2 77.7 47.3 40.0 39.4 27.7 40.1

% formación de callo embriogénico

100 Raquilla Ovario no fertilizado

80

50

40

20

o CMCE -1 CMCE -2 CMCE -3

CMCE = Ciclo de Mui!Jpltcación de Collo Embriogénico

SEC = Callo embfiogenlco formado por embriones somáticos

SEC-ECM = MulJpltcaCJón de cano Embnogémco formado por embnones somáticos

Figura 1.12. Porcentaje de formación de callo embriogénico en explantes de raquilla y ovario. Datos generados en colaboración con ellng . José Luis Chan.

En la figura 1.12 se observan resultados muy importantes. El primero es que se puede ver que por primera vez en ambos tipos de explantes ha sido posible realizar la multiplicación de callo embriogénico. Otro aspecto importante es que se observa una tendencia de incremento en la capacidad de multiplicación para el caso de los cultivos de raqu illa, mientras que en el caso de ovario no fertilizado parece que la tendencia es inversa, es decir, está disminuyendo su capacidad de multiplicación conforme avanzan los ciclos. Finalmente, un resultado sumamente relevante es que se puede observar como para el caso de los cultivos de raquilla ha sido posible realizar eventos de embriogénesis somática secundaria, es decir, obtener embriones somáticos globulares (Fig. 1.13 8), los cuales se utilizan como explante y generan nuevo callo embriogénico que después se puede multiplicar. Entonces, a partir de los pocos explantes de raquilla que formaron callos que parecían embriogénicos se generaron callos embriogénicos que se pudieron multiplicar y que también generaron embriones somáticos que germinaron como se muestra en la figura 1.13.

Es importante mencionar que en el caso de los callos embriogénicos de ovario no fertilizado, debido a que parecen ir perdiendo la capacidad de multiplicación, es necesario ensayar la embriogénesis somática secundaria como alternativa para renovar esta capacidad (PérezNúñez et al., 2006).

40

Figura 1.13. Callo y embriones generados a partir de explante de raquilla y obtenidos después de 6 ciclos de multiplicación. A: Callo embriogénico con estructuras embriogénicas. B: callos con embriones somáticos globulares (parte superior) y embriones somáticos germinando (parte inferior) .

1.4 DISCUSIÓN .. La selección de explantes es un punto crítico que define la

posibilidad de obtener una respuesta adecuada tras la inducción in vitro. En el caso de la raquilla, los mejores resultados se presentaron con los explantes de inflorescencia en etapa -7, que son los explantes más jóvenes que se utilizaron en este trabajo y en los cuales aún no se aprecia la diferenciación de estructuras florales. Sin embargo, la colecta de inflorescencias de esta etapa es muy difícil debido a que en las palmas adultas solo es posible observar inflorescencias hasta la etapa -3 o -4, porque a partir de la inflorescencia -5 se encuentran protegidas en el interior de la zona de crecimiento de la palma, y el tratar de extraerlas aumenta el riesgo de causar daño a la palma y afectar su desarrollo, o favorecer la contaminación por algún patógeno potencial (hongo o bacteria) e incluso provocarle la muerte.

En el caso del ovario no fertil izado, los mejores resultados se obtienen con explantes de inflorescencia en etapa -4, tal como fue reportado previamente por Perera et al., (2007} , aunque ellos reportan haber utilizado inflorescencias mucho más jóvenes (-5 y -6) del cultivar alto de Sri Lanka, en nuestro caso, solamente se probaron las etapas -3 y -4 debido a que en

41

la variedad Enano Malayo Verde que usamos para los experimentos si se toman inflorescencias de etapa -5 en adelante no es posible identificar flores femeninas en la base de las estructuras, pues aún no están formadas, y solamente a partir de la etapa -4 se pueden obtener los explantes requeridos. En este caso, la colecta de las inflorescencias en etapas -3 o -4 no es tan problemática como para el caso de la raquilla (-7) y es posible obtenerlas sin causar mayor daño a la planta donante. En general , esta tendencia de obtener mejores respuestas en tejidos más jóvenes ha sido documentada para diferentes especies de monocotiledóneas (G+owacka et al., 2010).

Las respuestas obtenidas tras la inducción inicial con cualquiera de los dos explantes fueron considerablemente bajas si se comparan con los resultados de plúmula. Sin embargo, en la inducción a partir de raquilla con BAP y 2,4-D la formación de callo inicial fue entre 16 % y 50 %, mientras que Verdeil et al., (1994) reportaron entre 16% y 30% de callo inicial tras 8 meses de cultivo utilizando solo el 2,4-D como inductor. En el caso de ovario no fertilizado se obtuvo un 6 % de formación de callo, lo cual es mucho menor al 30% previamente reportado para Perera et al., (2007) para el mismo tipo de explante o al 57 % reportado para plúmula (Chan et al. , 1998).

Los tiempos requeridos para obtener las repuestas de los explantes fueron muy superiores a los 90 días requeridos para plúmula (Chan et al., 1998; Pérez-Núñez et al., 2006). Sin embargo, en los cultivos de raquilla el tiempo requerido para la obtención de callo fue menor a los 8 meses que reportan Verdeil et al., (1994) para este explante, quienes evaluaron respuestas de inducción con diferentes concentraciones de 2,4-D en explantes de raquilla obtenidos de 3 diferentes genotipos y en 4 diferentes estados de madurez del explante. Estos mismos autores, observaron que los mejores resultados de inducción se obtuvieron cuando aplicaron concentraciones de 0.45 y 0.55 mM de 2,4-D, mientras que en este experimento los mejores resultados se obtuvieron combinando 0.40 mM de 2,4-D con 0.04 mM de BAP.

El comportamiento de los explantes de raquilla durante la inducción fue similar a lo descrito por Verdeil et al., (1994), donde los explantes que generaron callo tipo embriogénico respondieron formando masas de células de distintos tonos de color café, mientras que los explantes que no presentaron esta respuesta comenzaron a formar estructuras tipo flor, tipo hoja y algunos otros se necrosaron y murieron. Al igual que en el trabajo de Verdeil et al., (1994), se observó que la mayoría de los explantes con las concentraciones más bajas de 2,4-D no presentaron la respuesta de formar callo tipo embriogénico.

En el caso de la inducción inicial de callo a partir de ovario no fertilizado se necesitó un periodo de 3 a 5 meses con la aplicación de 0.55 mM de 2,4-D para observar la respuesta en el explante, por lo que se

42

.,

realizó un sub-cultivo a los 3 meses, mientras que Perera et al., (2007) reportaron la obtención de callo en máximo 3 meses con una concentración menor de 2,4-D (0.1 mM), por otro lado, el proceso en plúmula hasta callo embriogénico toma 3 meses con una aplicación de 0.6 mM de 2,4-D (Chan et al., 1998). En cuanto a la morfología de los callos obtenidos fue muy similar a la que presentan los callos de plúmula y a lo reportado para este mismo explante, observándose como masas traslúcidas de estructuras globulares que tienden a blanquearse (Chan et al., 1998; Pérez-Núñez et al. , 2006; Perera et al., 2007). También se observó el posterior desarrollo de unidades meristemáticas en la periferia de las estructuras, las cuales dieron origen a los embriones somáticos, tal como se ha descrito para plúmula (Sáenz et al., 2006).

1.5 CONCLUSIÓN

Se obtuvo callo embriogénico a partir del cultivo de raquilla etapa -7 en medio Y3 con 0.04 mM de BAP + 0.4 mM de 2,4-D y a partir de ovario no fertilizado de etapa -4 en medio Y3 con 0.55 mM de 2,4-D. También se demostró que es posible obtener embriones somáticos a partir de estos callos embriogénicos aplicando las condiciones que se usan para plúmula y en el caso de raquilla se demostró que los embriones somáticos germinan.

Se demostró que es posible realizar la multiplicación de callo embriogénico obtenido a partir de raquilla y de ovario no fertilizado, además a partir del tercer evento de multiplicación se obtuvieron estructuras embriogénicas similares a las que se obtienen a partir de plúmula. Con excepción de la etapa de inducción se observó que los tiempos requeridos para los procesos morfogénicos en los ciclos de multiplicación a partir de raquilla y ovario no fertilizado pueden ser muy similares a los reportados para plúmula.

43

1.6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Chan, J. L. , L. Sáenz, C. Talavera, R. Hornung, M. Robert, and C. Oropeza. 1998. Regeneration of coconut (Cocos nucifera L.) from plumule explants through somatic embryogenesis. Plant Cell Rep. 17:515-521 .

Gfowacka K., Jezowski S., and Z. Kaczmarek. 2010. The effects of genotype, inflorescence developmental stage and induction medium on callus induction and plant regeneration in two Miscanthus species. Plant Cell , Tiss. Org . Cult. 102 (1 ): 79-86.

Perera P.I.P. Hocher V. Verdeil J-L. Doulbeau S. Yakandawala D.M.D. and Weerakoon L.K. 2007. Unfertil ized ovary: a novel explant for coconut (Cocos nucifera L.) somatic embryogenesis. Plant Cell Rep. 26: 21-28.

Pérez-Núñez, M.T. 2006. Embriogénesis somática en cocotero: estudios sobre aspectos del desarrollo y mejoramiento de la eficiencia. Tesis de Doctorado. CICY. Mérida, Yucatán . 95p.

Pérez-Núñez, M.T. , J.L. Chan , L. Sáenz, T. González, J.L. Verdeil , and C. Oropeza. 2006. lmproved Somatic Embryogenesis from Cocos nucifera (L.) Plumule Explants. In Vitre Cell. Dev. Biol. Plant. 42:37-43.

Saenz, L. , A. Azpeitia, B. Chuc-Armendariz, J.L. Chan, J.-L.Verdeil , V. Hocher, and C. Oropeza. 2006. Morphological and histological changes during somatic embryo formation from coconut plumule explants. In Vitre Cell. Dev. Bioi.-Piant 42 (1 ): 19-25.

Verdeil, J.L. , C. Huet, F. Grosdemange and J. Buffard-Morel. 1994. Plant regeneration from cultured immature inflorescence of coconut (Cocos nucifera L. ): evidence for somatic embryogenesis. Plant Cell Rep. 13:218-221 .

44

Capítulo 2

Obtención del ADNc completo del gen CnSERK.

2.1 INTRODUCCIÓN La embriogénesis somática ha sido aplicada para el cultivo in vitro

de cocotero (Chan et al., 1998) y el proceso ha sido caracterizado por morfología e histología (Sáenz et al., 2006), también se ha demostrado que la aplicación de la multiplicación de callo embriogénico combinada con eventos de embriogénesis somática secundaria permite obtener un mayor número de embriones somáticos por explante inicial (Pérez-Núñez et al., 2006) y se considera que este sistema tiene un gran potencial para la micropropagación de material elite. Sin embargo, los tejidos que permiten la clonación de individuos adultos son poco responsivos al cultivo in vitro, por lo que los estudios de genes relacionados con la embriogénesis somática son muy importantes para mejorar la eficiencia de la respuesta, por ejemplo mediante la transformación genética de los tejidos y la sobre-expresión de genes que controlen o disparen la respuesta embriogénica.

La existencia del gen SERK en el genoma de cocotero fue reportada por Pérez-Núñez et al., (2009) , y se ha demostrado en otras especies que su sobre-expresión induce una mayor respuesta embriogénica por lo que es un candidato ideal para incluirlo en la construcción de un vector para transformación genética de tejido de cocotero y analizar su expresión en el tejido transformado. Sin embargo, aún es necesario obtener la amplificación del ADNc completo mediante RT-PCR, incluirlo en un vector de clonación, secuenciarlo y posteriormente incluirlo en un vector para transformación con Agrobacterium. En este capítulo se presenta lo referente a la obtención del ADNc completo del gen CnSERK.

2.1.1 Genes SERK - relacionados con embriogénesis somática. La embriogénesis somática se define como un proceso en el cual se

desarrolla una estructura bipolar (embrión somático) a partir de células no cigóticas, esta estructura es similar a un embrión cigótico, no tiene conexión vascular con el tejido del cual se origina, puede germinar y convertirse en plántula (Von Arnold et al., 2002).

Diferentes factores genéticos y fisiológicos activan el proceso de embriogénesis somática en diferentes tipos de células somáticas vegetales cultivadas in vitro. Sin embargo, aun no se conocen bien las bases moleculares y bioquímicas de la embriogénesis somática vegetal. Los estudios moleculares y genéticos realizados a la fecha han derivado en la identificación y caracterización de diferentes genes relacionados con la regulación de este proceso.

Entre los genes relacionados con la embriogénesis somática, se ha detectado en las etapas tempranas del proceso a los genes ~omatic

45

~mbryogenesis Beceptor !Sinases (SERKs), los cuales forman un subgrupo en las 1_eucine-B.ich B_epeat-B.eceptor-1.ike _tsinases (LRR-RLKs) que comprende la subfamilia más grande de RLKs en plantas y además están relacionados con pr.ocesos clqve de¡ desarrollo. vegetal (S harma et al. , 2008). : ~ .

El primer gen SERK fue identificado ·'en células competentes de zanahoria (Daucus carota) en cultivo in vitro , este gen codifica para un receptor transmemb'ranal'1ipo cinasa con repetidos ricos -en leucina (LRR). DcSERK se ha considerado como un marcador de células competentes para formar embriones en cultivo (Schmidt et al., 1997). Durante la embriogénesis cigótica la expresión del gen DcSERK se encontró en embriones cigóticos globulares y no en embriones en etapa tardía (Hecht et al. , 2001 ). Por lo que se considera que la expresión de este gen es un marcador de adquisición de competencia embriogénica.

Posteriormente se identificó en cultivos embriogénicos de Arabidopsis thaliana un ortólogo funcional de DcSERK (AtSERK1) y se identificaron adicionalmente cuatro SERKs putativos en Arabidopsis (Hecht et al. 2001 ). Se estableció q'ue AtSERK1 y AtSERK2 tienen un papel en el control de la esporogénesis (Aibrecht et ·al. 2005; Colcombet et al. 2005). Baudino et al. (2001) aislaron ZmSERK1 and ZmSERK2 en maíz (Zea mays L.) y encontraron que· sus patrones de expresión son similares a los que presenta DcSERK durante la embriogénesis somática, por lo que concluyen que estos genes tienen influencia sobre la inducción de la embriogénesis en maíz. De la misma manera, se ha visto que la expresión de los genes SERK aislados de Arabidopsis pueden inducir la embriogénesis somática en líneas de A. thaliana transformada (Hecht et al., 2001) así como en otras especies como alfalfa y algunas monocotiledóneas (Somleva et al., 2000; Nolan et al. , 2003).

Otros SERK putativos han sido identificados en otras especies de plantas incluyendo Medicago truncatula (Nolan et al. 2003), Helianthus annuus (Thomas f?t al. 2004), Oryza sativa (Hu et al. 2005), Theobroma cacao (Santos et al. 2005), Citrus unshui (Shimada et al. 2005), y Solanum tuberosum (Sharma et al., 2008) lo que sugiere la ubicuidad de una pequeña familia de SERK en todas las especies de plantas, además de la conservación funcional de un papel específico en la embriogénesis.

Además mediante transformación genética se ha determinado que la sobre-expresión de SERK induce la embriogénesis somática y la formación de embriones somáticos en el tejido transformado (Hecht et al., 2001 ), por lo que este gen es de gran interés para usarse en el mejoramiento de la respuesta· embriogénica en cocotero tanto para el sistema basado en plúmula como para la inducción de respuesta embriogénica en explantes no responsivos o poco responsivos.

Pérez-Núñez (2006) identificó en tejido de cocotero (Cocos nucifera L.) in vitro , un ortólogo del gen SERK (CnSERK) y se reportó su expresión

46

diferencial en células embriogénicamente competentes (Pérez-Núñez et al., 2009). La expresión de SERK se ha observado desde la etapa de células competentes hasta la etapa globular de los embriones somáticos y su detección es menor en etapas no embriogénicas de los cultivos (Schmidt et al., 1997; Somleva et al., 2000; Hecht et al. , 2001). Este mismo patrón de expresión fue observado para CnSERK (Pérez-Núñez et al., 2009). Además el pico de expresión de este gen parece coincidir con un incremento en actividad de cinasa en cultivos de plúmula que fue determinado en un trabajo previo (Islas-Flores et al. , 2000) y ambos eventos se observan inmediatamente después de un pico de acumulación de 2,4-D determinado por Sáenz et al. (2005) , todos estos eventos son previos a la formación de callo embriogén ico en los cultivos de plúmula.

Sin embargo, el ADNc del gen CnSERK no había sido aislado completo en cocotero, pues en los trabajos previos solamente se obtuvieron diferentes fragmentos que sirvieron de base para inferir la secuencia, por lo que es importante lograr aislar el ADNc completo del gen CnSERK, secuenciarlo para corroborar su identidad y poder usarlo en ensayos de transformación genética como una forma de incrementar la respuesta embriogénica.

2.2 MATERIALES Y MÉTODOS

2.2.1 Material vegetal.

Para los experimentos de este capítulo se emplearon tej idos obtenidos por cultivo in vitro de plúmula de Cocos nucifera L. , de la variedad enano malayo verde (EMV) de 90 días de cultivo.

2.2.2 Extracción de ARN.

Se realizó la extracción de ARN total con el reactivo Trizo! (lnvitrogen) de acuerdo a las recomendaciones del proveedor. Se anal izó la calidad del ARN aislado mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. Se determinó la concentración de cada muestra mediante espectrofotometría a longitud de onda de 260 nm. También se analizaron las muestras a 280 y 230 nm para determinar la posible contaminación por proteínas o carbohidratos respectivamente.

2.2.3 Obtención del ADNc completo del gen CnSERK

Se diseñaron oligonucleótidos específicos tomando como base la secuencia reportada para el gen (Pérez-Núñez et al., 2006; 2009) y se trató

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de obtener su amplificación a partir de ARN extraído de callos embriogénicos de cocotero de 90 días, los productos de PCR se clonaron en el vector pGEM T-Easy y fueron secuenciados (Figura 2.1 ).

Diseño de oligos ·(Forward- Reversel en base a la s e cue ncia rep ortada d e l gen CnSERK

E.xtracci-ón de ARN de callo. e mbriog énic o de· c o cotero

Amplificación del cONA Completo por RT-PCR 11890 pb)

+ Clonación de productos en pGEM T-Easy

+ Secuenciación y análisis de secuenci:a

~- -- ------- - ----- 1 1 Inserción en ve ctor bin a rio 1

Figura 2.1. Metodología propuesta para la amplificación por PCR y la secuenciación del ADNc completo del gen CnSERK. Los rectángulos blancos indican las actividades desarrolladas. En verde se destacan las metas. El rectángulo punteado indica un paso que se puede desarrollar eventualmente a partir de los resultados de este trabajo.

2.3 RESULTADOS

2.3.1 Diseño de oligonucleótidos para amplificar el ADNc completo del gen CnSERK

Para realizar los experimentos y amplificar el ADNc completo del gen CnSERK se diseñaron dos juegos de oligonucleótidos o cebadores a partir de la secuencia reportada por Pérez-Núñez et al. (2006). Los cebadores diseñados se presentan en la Tabla 2.1.

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Tabla 2.1. Secuencia de los cebadores diseñados y utilizados para amplificar el ADNc del gen CnSERK a partir de ARN de callo embriogénico de cocotero.

Cebador SERK AATF1 Forward SERK AATR1 Reverse SERK AATF2 Forward SERK AATR2 Reverse

Secuencia atggcggtcctggagcggg

tcatctggggccagataattcga atggcggtcctggagcgggat

tcatctggggccagataattcgac

2.3.2 Extracción de ARN de callo embriogénico de cocotero

Se realizó la extracción de ARN total a partir de callo embriogénico primario de cocotero, se obtuvieron 2 muestras y a cada muestra se le hizo una dilución 1 a 1 O y se corrieron en un gel de agarosa al 1% (Figura 2.2). Posteriormente estas muestras fueron tratadas con ADNasa y se corrieron en un gel de agarosa al 1% (Figura 2.3).

M 1 2 3 4

Figura 2.2. Fotografía de gel de agarosa (1 %) con muestras de ARN total extraído de callos embriogénicos de cocotero. M) marcador de 1 kb. Carril 1) 2 !JI de la muestra 1. Carril 2) 5 !JI de una dilución (1 a 1 O) de la muestra 1. Carril 3) 5 IJI de una dilución (1 a 10) de la muestra 2. Carril4) 2 !JI de la muestra 2.

49

11 1 7 3

Figura 2.3. Fotografía de gel de agarosa (1%) con las muestras de ARN total tratadas con ADNasa. M= marcador de 1 kb. Carriles 1 y 2= 3 ~1 de la dilución de las muestras 1 y 2 respectivamente. Carril 3= 3 ~1 de la muestra 2.

2.3.3 Detección del gen CnSERK en el ARN extraído de callo embriogénico

Con el ARN extraído se realizó una reacción de RT-PCR aplicando combinaciones de los cebadores diseñados y probados por Pérez-Núñez (2006). Los resultados de la amplificación se muestran en la figura 2.4, se demostró que era posible amplificar el gen CnSERK en las muestras de ARN extraídas de callo embriogénico de cocotero, pues se obtuvieron los fragmentos de los tamaños esperados para cada combinación de cebadores, que fueron 595 pb para la combinación F2-R1 y 674 pb para la combinación F1-R2.

50

Figura 2.4. Fotografía de gel de agarosa al 1% con productos de RT -PCR amplificados. M= marcador de 1 kb. Carriles 1 a 3 muestras amplificadas con cebadores F2-R1 (Pérez-Núñez, 2006). Carril 1= ARN de callo embriogénico primario de 90 días. Carril 2= 5 !JI ARN de callo no embriogénico (Control negativo). Carril 3= 5 !JI de ARN de callo embriogénico de 70 días. Carriles 4 a 6 amplificados con cebadores F1-R2 (Pérez-Núñez, 2006). Carril 4= 2 IJI de ARN de callo no embriogénico. Carril 5= ARN de callo embriogénico de 90 días. Carril 6= ARN de callo embriogénico de 70 días.

2.3.4 Amplificación del ADNc completo del gen CnSERK

Después de comprobar que a partir de las muestras de ARN se podía amplificar el gen CnSERK, se procedió a diseñar el programa de RT-PCR para realizar los ensayos de amplificación del ADNc completo de CnSERK usando los cebadores diseñados en este trabajo (Figura 2.5) . Se realizó la reacción de RT-PCR con el programa diseñado para las combinaciones de cebadores AAT F1-R1 y AAT F2-R2.

En la figura 2.6 se presentan los resultados de la reacción de PCR desarrollada con los cebadores diseñados para amplificar el ADNc completo de CnSERK. Se obtuvo la amplificación de un fragmento del tamaño esperado (1890 pb), lo que sugiere que con ambos juegos de cebadores diseñados se puede obtener la amplificación del ADNc completo del gen CnSERK a partir de ARN extraído de callo embriogénico de cocotero.

51

Figura 2.5. Programa de RT-PCR diseñado para la amplificación del ADNc completo del gen CnSERK usando los dos juegos de cebadores diseñados en este trabajo y el ARN extraído de callo embriogénico de cocotero .

., 1 2 3

----F1 F2 F1

Figura 2.6. Fotografía de gel de agarosa al 1% con productos de RT-PCR amplificados com los cebadores diseñados para obtener el ADNc completo del gen CnSERK. M= marcador de 1 kb. Carriles 1 y 3 muestras amplificadas con cebadores AA T F1-R1 . Carril1= ARN de callo embriogénico de 70 días. Carril3= ARN de callo embriogénico de 90 días. Carril 2= amplificación a partir de ARN de callo embriogénico de 70 días con cebadores AAT F2-R2.

2.3.5 Secuenciación del ADNc completo del gen CnSERK

Los productos amplificados por PCR fueron purificados, se insertaron en el vector de clonación pGEM y se enviaron a secuenciar por

52

duplicado. Los resultados de la secuenciación se presentan a continuación . Al nivel de aminoácidos CnSERKAA T presentó 99% de similitud con la secuencia de CnSERK reportada por Pérez-Núñez et al., (2009).

Secuencia del ADNc completo de CnSERKAA T ATGGCGGTCCTGGAGCGGGATGTCATGGTGCCATGGTTTCTGTGGTTG ATTCTGGTCTTCCACCCCCTGGCTAGGGTTCTTGCTAACTCGGAAGGT GATGCATTGCACAGTTTGAGGACCAACCTAATTGATCCAAGTAATGTGC TGCAGAGCTGGGATCCGACTCTGGTCAATCCATGCACATGGTTCCATG TTACTTGTAATAATGACAATAGTGTCATTAGAGTTGATCTTGGAAATGCA CAGTTATCTGGTACATTGGTCCCTCAGCTTGGTCTTCTGAAAAACTTGC AATATTTGGAACTTTACAGTAACAATATAAGTGGCACGATTCCTAGTGAC CTTGGAAATTTGACAAATTTGGTGAGCTTGGATCTGTACTTAAACAGTTT CACTGGTGGAATTCCTGACACACTGGGAAAGCTAACAAAACTGCGTTTC CTCCGGCTTAACAACAATAGCCTGTCGGGTTCAATTCCTCAATCTTTAA CCAATATTACTGCACTCCAAGTTTTGGATTTGTCAAACAACAACTTATCA GGAGAAGTTCCATCAACTGGATCCTTTTCGCTATTCACTCCCATCAGTT TTGCTAACAATCCTCAATTATGTGGTCCGGGAACAACAAAGGCTTGTCC TGGTGCTCCTCCATTATCTCCACCACCTCCATTTATTTCTCCAGCACCA CCCTCGTCTCAAGGAAGTAGTGCCTCTAGCACTGGAGCAATTGCTGGT GGAGTTGCTGCAGGTGCTGCTCTGCTATTTGCTGCACCTGCTATTGGA TTTGCATGGTGGCGCCGTCGTAAGCCGCAAGAACATTTCTTTGATGTG CCTGCTGAAGAGGATCCAGAAGTTCATTTGGGCCAGCTTAAACGGTTTT CTCTGCGAGAACTGCAAGTTGCTACGGATAATTTTAGCACCAGGAACAT TTTGGGCAGAGGTGGTTTTGGCAAGGTCTATAAAGGACGTCTTGCAGA TGGTCAATTAGTGGCAGTCAAGAGGCTAAAAGAAGAGCGCACATCAGG AGGCGAGCTTCAATTTCAGACAGAAGTTGAGATGATTAGCATGGCTGT GCATCGAAATTTGCTTCGACTTCGTGGGTTTTGCATGACACCCACCGAA CGATTGCTTGTATATCCCTATATGGCTAATGGAAGTGTGGCATCATGCT TAAGAGAGCGGCCACCATCGGAACCTCCACTTGATTGGACAACTCGGC GAAGGATTGCATTGGGATCTGCAAGGGGGCTGTCGTATTTGCATGATC ATTGCGATCCAAAAATTATTCATCGTGATGTCAAAGCTGCAAATATTTTA TTGGATGAAGAGTTTGAGGCAGTTGTTGGAGACTTTGGCTTGGCCAAA CTCATGGACTACAAGGATACCCATGTAACAACTGCTGTTCGTGGAACAA TTGGACATATTGCTCCAGAATACCTGTCTACCGGAAAGTCCTCAGAGAA GACTGATGTTTTTGGATATGGAATCATGCTTTTGGAACTTATTACAGGC CAGAGGGCATTCGACCTTGCCAGGCTTGCAAATGATGATGATGTCATG TTGCTGGACTGGGTAAAAGGACTGCTGAAAGAGAAAAAGCTGGACATG TTGGTCGACCCGGATCTCCAGGATGACTATGTGGAGGCTGAGGTGGA GTCGCTTATCCAAGTAGCTCTGCTATGTACCCAGGGCTCCCCAATGGA GCGGCCCAAGATGTCAGAGGTGGTGAGGATGCTCGAAGGTGATGGCC TTGCTGAGAGATGGGAGGAATGGCAGAAGGTTGAAGTTGTACGTTTAG

53

ATGTAGAGATGGCTCCACCCAACAGCAACAATGAATGGATCATAGACTC TACTGACAACCTTCATGCAGTCGAATTATCTGGCCCCAGATGA

2.3.6 Secuencia predicha de aminoácidos para el gen CnSERKAA T

Secuencia predicha de aminoácidos para la proteína codificada por el ADNc del gen CnSERKAA T. Esta secuencia fue obtenida con el programa CLC Sequence Viewer 6.

MAVLERDVMVPWFLWLILVFHPLARVLANSEGDALHSLRTNLIDPSNVLQS WDPTLVNPCTWFHVTCNNDNSVIRVDLGNAQLSGTLVPQLGLLKNLQYLE L YSNNISGTIPSDLGNLTNLVSLDLYLNSFTGGIPDTLGKLTKLRFLRLNNNS LSGSIPQSLTNITALQVLDLSNNNLSGEVPSTGSFSLFTPISFANNPQLCGP GTTKACPGAPPLSPPPPFISPAPPSSQGSSASSTGAIAGGVAAGAALLFAA PAIGFAWWRRRKPQEHFFDVPAEEDPEVHLGQLKRFSLRELQVATDNFST RNILGRGGFGKVYKGRLADGQLVAVKRLKEERTSGGELQFQTEVEMISMA VHRNLLRLRGFCMTPTERLLVYPYMANGSVASCLRERPPSEPPLDWTTRR RIALGSARG LSYLH DHCDPKII H RDVKAAN 1 LLDEEFEA WGDFGLAKLM DY KDTHVTTAVRGTIGHIAPEYLSTGKSSEKTDVFGYGIMLLELITGQRAFDLA RLANDDDVMLLDWVKGLLKEKKLDM L VDPDLQDDYVEAEVESLIQVALLCT QGSPMERPKMSEWRMLEGDGLAERWEEWQKVEWRLDVEMAPPNSNN EWIIDSTDNLHAVELSGPR.

2.4 DISCUSIÓN

La secuencia de aminoácidos de SERKAA T tiene una extensión de 629 aminoácidos similar a la reportada por Pérez-Núñez et al., (2009) para CnSERK (GenBank AY791293) . El análisis BLAST de la secuencia de SERKAAT mostró alineación con más de 50 accesiones correspondientes a genes SERK reportados para diferentes especies vegetales, incluyendo monocotiledóneas, dicotiledóneas, coníferas, y musgos.

Al comparar la secuencia de aminoácidos obtenida para CnSERKAA T en este trabajo con la reportada para CnSERK por PérezNúñez et al (2009) se observó que son similares con excepción de los aminoácidos 35, 308, 328, 341 , 558 y 608, los cuales difieren , pero no afectan la funcionalidad de la proteína (Figura 2.7) .

El análisis de la proteína CnSERKAA T putativa mostró que contiene los dominios característicos reportados para otras proteínas SERK, y que presenta la misma estructura reportada para CnSERK (Pérez-Núñez et al 2009). Los dominios encontrados incluyen cinco dominios Repetidos Ricos

54

en Leucina (LRR), así como un dominio Pro-rich conteniendo el motivo SerPro-Pro (SPP), que es la principal característica que distingue a las proteínas SERK de otras proteínas LRR-RLK (Hecht et al. 2001 ), también incluye el dominio transmembranal.

CnSERKAAT MA V LERD VMV PWFLWL 1 LV FHPLAR VL ANSEGDA HSLRTNL 1 DPSN V LOS 51 CnSERKPN MAV LERD VMV PWFLWL 1 LV FHPLAR VL ANSEGDA HS L RTN L I DPS NVL QS 51

CnSERKMT WDPT L VNPCTWFH V TCNNDNS V 1 RV D L GNAQL SGT LV PO L G L L KNLO Y L E L 102 C" SCRKPN WDP TLVNPCTWFHVTCNNDN SV I RV DLGNAOLSGTL V PQLGLLKNLO YL EL W2

CnSERK AAT Y SNN 1 SGT 1 PSD LGN L T N L V S LO L V LNSFTGG 1 PDT LGK L T K L RF LR LNNN 153 CnSERKPN Y SNN 1 SGT 1 PSDLGN L TNL V SLDL Y LNSFTGG I PDTLGKL TKLRFLRLNNN t 53

CnSERKAAT SLSG S 1 PQSL TN 1 TA LO V LDLSNNNLSGE V PSTGSFSLFTP 1 S FAN N PQLC 204 CnSERK PN S LSGS 1 POSL T N 1 TA LO V LDLSNNNLSGE V PSTGSFSL F TP 1 SFAN N POLC 204

CnSERKAAT GPG T TKACPGAPPLSPPPPF 1 SPAP P S SQG S SASSTGA 1 AGG V AAGAA l lf 255 CnSERKPN GPGTTKACPGAPPLSPPPPF 1 SPAPPSSOGSSASSTGA 1 AGG V AAGAA L LF 255

CnSERKAAT AAPA 1 GFAWJIIRRRK POEH F FD VPAEEDPE V H LGOL KRFSLRE LOV ATDN FS 306 CnSERK PN AAPA 1 GFAWJIIRRRKPOEHF FD V PAEEDPE V HLGOLKRFS L RE LOV A TON F S 306

CnSERKAAT T N 1 L GRGGFGK VY KGR L ADG L V A V KR L KEERT GGE LOFOTE V EM 1 SMA 357 CnSERK PN T N 1 L GRGGFGK VV KGRLADG l VA V KRLK E ERT GGE LOFOTEV EM 1 SMA 357

CnSERK M T V HRN L LRLRGFCMTPTER L l VY P YMANGS V ASC l RERPPSEPP LOWTTRRR 408 CnSERK PN V HRN L LR lRGFCMTPT ER L L VV P VMANGSV ASC L RERPPSEPP LDWTTRRR 408

CnSERKMl 1 A L GS ARGL SY LHDHCDPK 1 1 HRD V KAAN 1 LL DEEFEA VV GDFGLAKLMD Y 459 CnSERK PN 1 AtG S ARGl SY LHDHCDPK 1 1 HRDV KAAN 1 L l DEEFEA VV GDFGLAKLMD Y 459

CnSERKAAT K DT HVTTAV RG T 1 GH 1 APEYLSTGK SS EKTD V FG YG 1 MLLEL 1 TGORAFD L 510 CnSERK PN K DTH VT TAV RGT 1 GH 1 APE Y LSTGKS S EKTD V FG YG 1 ML L E l 1 TGORA F D L ~10

CnSERKAAT ARl AN DDDVML lDWV KG L LKEKKLDML VOPDLOOD YV EAE V E S L 1 O V l LC 561 CnSERKPN AR L ANDDD VMLLDWV KG L LKEKKLDM LVDPDLODD YV EAE V E S LIO V L LC ~1

CnSERKAAT TOGS PMERPKMSE VVRM L EGDGlAERWEEWOK V E VVRLDV EMAPPN CnSERKPN TOG S PMERPKMSE VVRM L EGDGLAERWEEWOK V E VV RLDV EMAPPN

CnSERKAAT 1 1 DSTDNlHA VELSGPR 629 CnSERKPN 1 1 D S TDNlHA V E LSGP R 629

Figura 2.7. Análisis clustal W de las secuencias de aminoácidos de las proteínas CnSERKAAT (obtenida en este estudio) y CnSERK (Pérez-Núñez et al., 2009).

2.5 CONCLUSIÓN

Usando cualquiera de los dos juegos de cebadores diseñados en este trabajo es posible amplificar por RT-PCR una banda del tamaño esperado (1890pb). Los resultados de la secuenciación y los análisis ClustaiW y BLAST confirman que se amplificó el ADNc del gen CnSERK. El ADNc que se tiene en el vector de clonación puede ser usado para incorporar en un plásmido binario para transformación genética mediada por A. tumefaciens.

55


Albrecht C, Russinova E, Hecht V, Baaijens E, de Vries S. 2005. The Arabidopsis thaliana somatic embryogenesis receptor-like kinases 1 and 2 control male sporogenesis. Plant Cell 17:3337-3349.

Baudino S, Hansen S, Brettschneider R, Hecht VRG, Dresselhaus T, Lorz H, Dumas C, Rogowsky PM.2001 . Molecular characterization of two novel maize LRR receptor-like kinases, which belong to the SERK gene family. Planta 213:1-10.

Chan, J. L. , L. Sáenz, C. Talavera, R. Hornung, M. Robert, and C. Oropeza. 1998. Regeneration of coconut (Cocos nucifera L.) from plumule explants through somatic embryogenesis. Plant Cell Rep. 17:515-521.

Colcombet J, Boisson-Dernier A, Ros-Palau R, Vera CE, Schroeder JI. 2005. Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinases1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation. Plant Cell17:3350-3361.

Hecht, V., J.P. Vielle-Calzada, M.V. Hartog, E.D. Schmidth, K. Boutilier, U. Grossniklaus and S.C. de Vries. 2001 . The Arabidopsis SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR KINASE 1 gene is expressed in developing ovules and embryos and enhances embryogenic competence in culture. Plant Physiol. 127: 803-816.

Hu H, Xiong L, Yang Y. 2005. Rice SERK1 gene positively regulates somatic embryogenesis of cultured cell and host defense response against fungal infection. Planta 222 :107-117.

Islas-Flores 1, Chan JL, Oropeza C and Hernández-Sotomayor M.T. 2000. Occurrence of phosphorylated proteins and kinase activity in coconut tissues cultured in vitro in a medium that induces somatic embryogenesis. Plant Physiol Biochem 38: 825-836.

Nolan KE, lrwanto RR, Rose RJ . 2003. Auxin up-regulates MtSERK1 expression in both Medicago truncatula root-forming and embryogenic cultures. Plant Physiol 133:218-230.

Pérez-Núñez, M.T. , J.L. Chan, L. Sáenz, T. González, J.L. Verdeil , and C. Oropeza. 2006. lmproved Somatic Embryogenesis from Cocos nucifera (L.) Plumule Explants. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 42:37-43.

Pérez-Núñez, M.T., R. Souza, L. Sáenz, J.L. Chan , J.J. Zúñiga and C. Oropeza. 2009. Detection of a SERK-Iike gene in coconut and analysis of its expression during the formation of embryogenic callus and somatic embryos. Plant Cell Rep. 28: 11-19.

Sáenz, L. , R. Souza, J.L. Chan, A Azpeitia and C. Oropeza. 2005. 14C-2 ,4-dichlorophenoxyacetic acid uptake and formation of embryogenic calli in coconut plumular explants cultured on activated charcoal-free media. Rev. Fitotec. Mex. 28 (2) : 151-159.

56

Saenz, L. , A. Azpeitia, B. Chuc-Armendariz, J.L. Chan, J.-L.Verdeil , V. Hocher, and C. Oropeza. 2006. Morphological and histological changes during somatic embryo formation from coconut plumule explants. In Vitro Cell. Dev. Bioi.-Piant 42 (1 ): 19-25.

Santos MD, Romano E, Yotoko KSC, Tinaco MLP, Dias BBA, Aragao FJL. 2005. Characterization of the cacao somatic embryogenesis receptor-like kinase (SERK) gene expressed during somatic embryogenesis. Plant Sci 168:723-729.

Schmidt EDL, Guzzo F, Toonen MAJ, de Vries SC (1997) A leucine rich repeat containing receptor-like kinase marks somatic plant cells competent to form embryos. Development 124:2049-2062.

Sharma, S.K., S. Millam, l. Hein and G.J. Bryan . 2008. Cloning and molecular characterization of a patato SERK gene transcriptionally induced during initiation of somatic embryogenesis. Planta. 228: 319-330.

Shimada T, Hirabayashi T, Endo T, Fujii H, Kita M, Omura M. 2005. lsolation and characterization of the somatic embryogenesis receptor-like kinase gene homologue (CitSERK1) from Citrus unshui Marc. Sci Hortic 103:233-238.

Somleva MN, Schmidt EDL, de Vries SC. 2000. Embryogenic cells in Dactylis glomerata L. (Poaceae) explants by cell tracking and by SERK expression. Plant Cell Rep 19:718-726.

Thomas C, Meyer D, Himber C, Steinmetz A (2004) Spatial expression of a sunXower SERK gene during induction of somatic embryogenesis and shoot organogenesis. Plant Physiol Biochem 42:35-42.

Von Arnold , S.; Sabala, 1. ; Bozhkov, P.; Dyachok, J.; Filonova, L. 2002. Developmental pathways of somatic embryogenesis. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 69:233-249.

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Capítulo 3

Aplicación de biorreactores para desarrollo de brotes de cocotero.

3.1 INTRODUCCIÓN El protocolo de micropropagación de cocotero basado en plúmula

tiene una limitante en la eficiencia de la germinación de los embriones somáticos producidos y en el posterior desarrollo de los brotes. Como se discute en los antecedentes, la aplicación de biorreactores ha sido muy efectiva para incrementar la eficiencia en el desarrollo de brotes de diferentes especies de plantas. Aunado a esto, esta etapa se realiza actualmente utilizando medio semisólido (Chan et al., 1998), lo cual puede ser uno de los principales factores limitantes de la eficiencia, ya que en los medios semisólidos las condiciones de cultivo y la exposición a los componentes del medio no son homogéneas para todas las células o tejidos (Robert et al., 2006). Considerando lo anterior la aplicación de biorreactores puede dar una solución adecuada para esta etapa del protocolo de micropropagación de cocotero, tal como ha dado buenos resultados en otras especies de plantas micropropagadas (ver sección de antecedentes) .

En este trabajo se realizó la aplicación de biorreactores BioMINT buscando incrementar el número de brotes con raíz, y mejorar el desarrollo de los brotes en cuanto al número de hojas por brote y el tamaño de hoja. Además, como se discutió en los antecedentes, la aplicación de los biorreactores puede ser útil para reducir el tiempo requerido para estos procesos.

3.1.1 Aplicación de biorreactores en cocotero La aplicación de sistemas de inmersión temporal o biorreactores, es

un aspecto que no ha sido abordado en cocotero pero que tiene alto potencial pues ha mostrado buenos resultados en la micropropagación de otras especies, incrementando la eficiencia de producción de unidades de propagación en diferentes etapas del proceso, y disminuyendo la necesidad de mano de obra, por lo que se reduce el costo unitario del producto (Robert et al., 2006).

Los sistemas de inmersión temporal intercalan periodos de aireación e inmersión del explante en el medio líquido (Preil , 2005; Robert et al., 2006) y de acuerdo con su operación, estos sistemas pueden ser agrupados en 4 categorías: 1) maqui nas tipo mecedoras, 2) inmersión completa del material vegetal y renovación del medio nutritivo; 3) inmersión parcial con mecanismo de renovación del líquido nutritivo; 4) inmersión completa dirigida por transferencia neumática del medio líquido sin renovación del medio (Etienne y Berthouly, 2002).

El cultivo en biorreactor brinda condiciones más homogéneas que facilitan la disponibilidad de nutrimentos y ofrece ventajas adicionales como

59

una mayor simplicidad en el manejo que disminuye la mano de obra y elimina el uso del gelificante (Maene y Debergh, 1985; Teisson et al. , 1995; Robert et al. , 2006). Este sistema ha sido aplicado a una gran variedad de especies y de tipos de explantes permitiendo en la mayoría de los casos incrementar las eficiencias de multiplicación de unidades de propagación, la germinación de embriones y el desarrollo de brotes según el caso (Etienne y Berthouly, 2002; Preil, 2005). Los sistemas de inmersión temporal, permiten evitar la vitrificación del explante e incrementar la capacidad del explante para adaptarse a condiciones ex vitro (Etienne y Berthouly, 2002; Preil, 2005).

En el CICY se han realizado estudios para desarrollar biorreactores económicos que puedan adaptarse a las necesidades específicas de las especies que se están estudiando, tal es el caso del biorreactor BioMINT, el cual se ha utilizado con éxito para diferentes especies de plantas, y en este caso se plantea su uso para la etapa de desarrollo de brotes. Estos biorreactores presentan ciertas ventajas sobre otros biorreactores comerciales o reportados en la literatura, por ejemplo, se adaptan muy bien al tamaño de los brotes de cocotero, además estos biorreactores utilizan un módulo tipo mecedora que es diseñado a bajo costo en el CICY y no se requiere adquirir sistemas adicionales para el funcionamiento del sistema como en el caso de los biorreactores tipo RITA u otros que requieren mecanismos más complejos para la renovación del medio de cultivo o la transferencia del medio a través del sistema. Además los biorreactores RITA no se adaptan al tipo de brote en cuestión , ya que los brotes de cocotero son muy grandes para ser introducidos en ese tipo de biorreactor. A continuación se describen los biorreactores BioMINT.

3.1.2 Biorreactor Modular de Inmersión Temporal (BioMINT) Un BioMINT consiste de dos vasos cilíndricos de policarbonato, uno

translucido y el otro opaco, que se acoplan por medio de un adaptador. El vaso translúcido es para los tejidos o plantas y el opaco para el medio de cultivo líquido. En el adaptador se encuentra acoplada una parrilla que evita que los tejidos o plantas entren al vaso oscuro pero permite el libre flujo del medio de cultivo líquido por gravedad al cambiar de posición (Figura 3.1 ). Para evitar filtraciones en la unión de los dos vasos se colocan empaques de hule (Robert et al., 2006).

60

A /~\ ()

~'\

Figura 3.1 . Representación del biorreactor 8ioMI NT. A, los diferentes componentes: 1, vasos cilíndricos de policarbonato. 2, empaques de hule para los vasos. 3, parrilla de policarbonato que se acopla con el adaptador. 4, adaptador que une los vasos y cuenta con dos válvulas para intercambio de gases. En 8 y C se representan las posiciones que adopta el biorreactor en el módulo Sy8, gracias a lo cual se pueden alternar las fases de aireación (8) e inmersión (C) de los explantes. Figuras realizadas por Antonio Andrade-Torres, 2008.

Los biorreactores 8ioMINT utilizan un módulo denominado Sy8 que es del tipo mecedora (Figura 3.2) , el cual consta de plataformas que pueden ser independientes o estar sincronizadas y son controladas por un temporizador en el cual se establece el tiempo de inmersión y de aireación (Figura 3.2) . La plataforma en posición horizontal proporciona la inmersión del explante, mientras que la plataforma en un ángulo de 60° proporciona el periodo de aireación (Figura 3.1 8 y C) . Las lámparas fluorescentes localizadas sobre cada plataforma le proveen de una fuente de luz artificial (Figura 3.2) (Robert et al., 2006).

61

A B

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1

~2 1

t 1 J

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o o Figura 3.2. Representación del módulo SyB. A, vista frontal : 1, biorreactores BioMINT con brotes. 2, plataforma. 3, lámparas fluorescentes. 4, temporizador que controla el movimiento de la plataforma. 5, temporizador que controla el fotoperiodo. B, vista lateral con biorreactores BioMINT en fase de aireación. Figuras realizadas por Antonio AndradeTorres, 2008.

Bello-Bello et al. (201 O) aplicaron los biorreactores BioMINT en diferentes etapas de un protocolo de regeneración de Capsicum chinense Jacq. , encontrando que con este sistema se incrementa la tasa de multiplicación de brotes respecto a lo obtenido en medio semisólido, mientras que el enraizamiento y desarrollo de brotes aislados se realiza con mayor eficiencia y en menor tiempo que en medio semisólido. Los mejores resultados los obtuvo manteniendo los explantes en 2 minutos de inmersión

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con intervalos de 8 horas de aireación. Peña-Ramírez et al. (201 O) también aplicaron el biorreactor

BioMINT para brotes de cedro rojo con resultados favorables sobre el enraizamiento y desarrollo de los brotes aplicando 5 minutos de inmersión con 8 horas de aireación, usando una formulación de medio de cultivo WP, con ácido giberélico (GA3) a 8.66 IJM y sacarosa a 30 g L-1.

Otros experimentos han demostrado que este sistema tienen efectos positivos en la proliferación, enraizamiento y desarrollo de brotes de agave (Robert et al., 2006). También existen numerosos reportes sobre la aplicación exitosa de biorreactores para reducir los tiempos que requiere el proceso, además de disminuir costos y la mano de obra (Etienne y Berthouly, 2002; Robert et al., 2006).

Por lo anterior se considera que este sistema tiene alto potencial para hacer más eficiente el desarrollo de brotes de cocotero obtenidos a partir de plúmula.

3.2 MATERIALES Y MÉTODOS

Los experimentos consistieron en colocar brotes de cocotero de entre 2 y 3 cm de longitud , sin raíz, en biorreactores BioMINT aplicando el mismo tiempo de inmersión en todos los tratamientos (2 minutos) pero con diferentes frecuencias de inmersión (Figura 3.3) . Se realizó una evaluación fenotípica para determinar el efecto de los tratamientos en el desarrollo de los brotes. Estos estudios permitieron determinar condiciones de cultivo para incrementar el número de plántulas de cocotero para llevar a la etapa de aclimatación y finalmente a campo. También es posible que estas condiciones sirvan de base en el futuro para aplicar a brotes obtenidos a partir de otro tipo de explante diferente a plúmula, por ejemplo tejido de ovario no fertilizado o raquilla (Figura 3.3).

63

Brotes de cocotero (plúmula)

Diferentes frecuencias de inmersión en BioMINT

Evaluación fenotípica

···························~ • • : Brotes (explante alternativo) : • • ~············~········ · ·· · ' • • . .

•••••• ••

Incrementar numero de brotes con raíz y número de hojas por brote

Incrementar número de plántulas

Figura 3.3. Metodología para la aplicación de biorreactores BioMINT para el desarrollo de brotes de cocotero. Las cajas en blanco representan las actividades a desarrollar en este trabajo. La caja en verde representa la meta perseguida. La caja en línea punteada representa acciones que eventualmente se pueden realizar con este sistema.

3.2.1 Condiciones del experimento

Como primer paso, se estableció un ensayo prel iminar para determinar la factibil idad de usar los biorreactores con brotes de cocotero. Se colocaron brotes de cocotero utilizando medio de cultivo Y3 líquido con carbón activado. En base a los resultados de este primer ensayo, se determinaron las condiciones a utilizar para los experimentos. Todos los brotes utilizados en los experimentos fueron producidos por embriogénesis somática a partir de plúmula de cocotero variedad enano malayo verde cultivada en medio semi-sól ido (Chan et al. , 1998).

Se desarrolló el experimento aplicando biorreactores BioMINT para el desarrollo de brotes de cocotero, los biorreactores con brotes se colocaron en un módulo SyB de cuatro plataformas, programando independientemente cada plataforma para dar 4 frecuencias de inmersión. El módulo SyB con los biorreactores se mantuvo en el cuarto de cultivo a una temperatura ambiental de 26 oc ± 1 °C, fotoperiodo de 16 hr mediante lámparas fluorescentes (25 ¡Jmol/m2 s \ La inmersión se aplicó en posición horizontal y la aireación mediante un ángulo de inclinación de los

64

biorreactores de 60°. En el experimento se utilizaron como testigo brotes cultivados en medio semisólido, mantenidos en los estantes normales del cuarto de cultivo.

3.2.2 Tratamientos Se estableció un experimento de 4 meses colocando en cada

plataforma dos biorreactores BioMINT. Cada biorreactor BioMINT se preparó con 200 mi de medio líquido Y3 con carbón activado, y 1 O brotes de entre 2 y 3 cm de longitud. Se realizó la renovación de medio cada 60 días.

Se aplicaron los siguientes tratamientos: T1) 2 minutos de inmersión 1 1 hr de aireación T2) 2 minutos de inmersión 1 2 hr de aireación T3) 2 minutos de inmersión 14 hr de aireación T4) 2 minutos de inmersión 18 hr de aireación

Grupo control : se colocaron frascos gerber con medio Y3 semisólido con carbón activado conteniendo 20 brotes en total.

3.3 RESULTADOS

Al inicio del experimento todos los tratamientos tenían un promedio de tamaño de brote de 2.8 cm (Fig . 3.4) , la longitud de la hoja mayor era entre 1.8 y 2.3 cm (Fig . 3.5) , y el número promedio de hojas por brote era de 3.6 (Fig . 3.6) . La proporción de brotes con raíz por tratamiento variaba de 0.3 para el T3 a 0.8 para el T2 (Fig . 3.7) mientras que, con excepción del tratamiento control ninguno de los brotes presentaba raíces secundarias (Fig . 3.8) . La máxima longitud promedio de raíz principal era de 0.6 cm y se presentó en el tratamiento control y el T2 (Fig . 3.9) .

Para el día 60 en todos los tratamientos los brotes ya tenían en promedio más de 4 hojas, la longitud promedio de hoja para todos los tratamientos era mayor a 3 cm y se estimó un incremento de entre 20.9 y 48.5 % en el tamaño de las hojas. Los tratamientos T1 y T2 (BioMINT con inmersión cada 1 h y 2h respectivamente) , presentaron mayor promedio de longitud de hoja y porcentaje de crecimiento de hoja con respecto al control y a los tratamientos con 4h y 8h. El porcentaje de brotes con raíz fue variable entre tratamientos, con un rango de 40 a 80 %, la longitud promedio de raíz varió de 0.28 a 1.19 cm y el porcentaje de crecimiento de raíz varió entre 16.6 y 64.7 %. Los tratamientos T1 y T2 presentaron mayor porcentaje de brotes con raíz y mayor longitud de raíz. El tratamiento T1 presentó el mayor valor de porcentaje de incremento de longitud de raíz.

En el día 100 el promedio de hojas por brote era de 4.3 para el T3 y de 5.1 para T2 (Tabla 3.1 ), la longitud promedio de hoja varió de los 2.13 cm a los 5.23 cm y el incremento en el tamaño de la hoja varía de 20.9 a 48.5

65

% (Tabla 3.1 ). Los tratamientos T1 y T2 (BioMINT con inmersión cada 1 h y 2h respectivamente) , presentaron los mayores valores de porcentaje de incremento de hojas por brote, los mayores valores de longitud promedio de hoja, y los mayores valores de porcentaje de incremento de longitud de hoja (Tabla 3.1 ).

Tabla 3.1 . Resultados del experimento de brotes en biorreactor BioMI NT al día 1 OO. Control , medio semisólido. T1 , inmersión cada 1 h. T2, inmersión cada 2h . T3, inmersión cada 4h. T4, inmersión cada 8h . Los valores son promedios con la desviación estándar o el porcentaje cuando así se indica.

% Mortalidad 15 o 20 NHB: número de hojas por brote. %1HB: porcentaje de incremento de hojas por brote. LH : Longitud de hoja mayor. %1LH: porcentaje de incremento de longitud de hoja. %BR: porcentaje de brotes con raíz principal. %BRS: porcentaje de brotes con raíz secundaria. %1BRS: porcentaje de incremento de brotes con raíz secundaria. LR: longitud de raíz principal. %1LR: porcentaje de incremento de longitud de raíz principal.

El porcentaje de brotes con raíz por tratamiento se presentó en valores de 30 a 90 %, la longitud promedio de raíz varía de 0.35 a 1.39 cm y el porcentaje de incremento de longitud de raíz varía de 16.6 a 64.7 % (Tabla 3.2) . En los tratamientos T1 y T2 se presentaron los mayores valores en cuanto al porcentaje de brotes con raíz, y la longitud promedio de raíz (Tabla 3.1 ). El tratamiento T1 presentó el mayor valor de porcentaje de incremento de longitud de raíz y solamente se presentó mortalidad de brotes en el control y en el tratamiento T4 (Tabla 3.1).

66

12

10 9.6

I i ~ 1! o ...

t 5.43

60 lOO 210

T~poen días

- •Centro! -- l h --- 2n - 41'1 - ah

Figura 3.4. Promedio de longitud total del brote por tratamiento en biorreactor BioMINT.

0 +---------------~--------------~--------------~------------~ o 60 100 210

Tiempo en cias

Figura 3.5. Promedio de longitud (cm) de hoja mayor por tratamiento en biorreactor BioMINT.

67

5 JI e .. ~ .{4 o X . " ~ !a z_

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..... .......... t 3.35

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0~------------~--------------~--------------~------------~ o 60 100 210

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- -Control .......,_ l h -..- 2h - 4h - Bh

Figura 3.6. Número promedio de hojas por brote por tratamiento en biorreactor BioMINT.

1.2

.. j 0.8 .. 8 ! 0.6

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-- -+ o.55- ---- -~ o.ss

OA

0.2

o 60 100 210 Tie-mpo endQs

- -CDntrol _._ lh _.,._ 2h - 4h _._ Bh

Figura 3.7. Proporción de brotes con raíz primaria por tratamiento en biorreactor BioMINT.

68

0 .8

0 .7

0.6

4 i 0 .5

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1 .. 0 .2

0 .1

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- - Contr~ _._ th ............... 2h -w-4h - 8h

Figura 3.8. Proporción de brotes con raíz secundaria en biorreactor BioMINT.

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1.84

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[email protected] •n dás

....... - Control ~ 1h --....... 2h - 4h - ah

Figura 3.9. Longitud promedio en centímetros de la raíz principal a través del experimento en biorreactor BioMINT.

69

Al día 210 el promedio de longitud de brote ya presentaba una diferencia marcada, siendo de 9.6 cm en el T1 y de 5.4 cm para el control y los T3 y T4 (Fig. 3.4) . La longitud de la hoja mayor también presentaba diferencia significativa siendo para los T1 y T2 de más de ?cm mientras que en los demás tratamientos y el control era menor a 4cm (Fig. 3.5). El número promedio de hojas por brote era mayor a 5 para el T2 y cercano a 5 para el T1 , mientras que para el T3 y el control era menor a 4 (Fig . 3.6) . La proporción de brotes con raíz principal no presentó incremento a lo largo del experimento para los T3, T4 y control, mientras que si se observó un incremento en los T1 y T2, siendo el T1 el que registró el incremento mayor (Fig. 3. 7) . El T1 presentó el mayor incremento de brotes con raíces secundarias, seguido por el T2, el control presentó el valor intermedio con diferencia significativa respecto al T1 y los T3 y T4 presentaron el menor número de brotes con raíces secundarias (Fig . 3.8). La máxima longitud promedio de raíz principal era de 0.6cm y se presentó en el tratamiento control y el T2 (Fig. 3.9).

3.4 DISCUSIÓN

Se observó que por su longitud de hoja los tratamientos T1 y T2 presentan el 70% de los brotes en el rango de tamaño intermedio y máximo, y en el caso de T1 se concentra más del 50% de sus brotes en el grupo de mayor tamaño, mientras que los demás tratamientos presentan valores en el rango menor e intermedio principalmente. En cuanto a la longitud de la raíz, el control y los tratamientos T1 y T2 presentan el 90% de sus brotes con raíz en el rango intermedio, y el 10% de sus brotes están en el rango de mayor tamaño de raíz, es también importante considerar que el número de brotes con raíz es menor en el control que en los tratamientos T1 y T2.

El T2 es el que presenta el mayor incremento de hojas por brote, seguido del T1 . En cuanto al incremento de longitud de hoja los tratamientos T1 y T2 presentaron mayores valores respecto a los demás tratamientos y el control. El mayor incremento en longitud de raíz se presentó en el T1 .

En la figura 3.1 O se observa una comparación de los brotes en los diferentes tratamientos al día 100 cuando ya se presentaban diferencias morfométricas entre tratamientos. Se aprecia que los brotes del T1 y T2 ya mostraban mejores atributos morfométricos como son la longitud total de brote, la longitud de hoja mayor y la aparición de raíces secundarias. Aunque no existen reportes previos para cocotero, estos resultados contrastan con lo reportado por Bello-Bello et al. (201 0) , quienes observaron que los brotes de chile habanero necesitan periodos de 2 minutos de inmersión pero con 8 horas de aireación para obtener los mejores resultados en cuanto a elongación de brote, incluso reporta multiplicación de

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brotes con estas condiciones. Por su parte Peña-Ramírez et al. (201 O) también reportan que para eedrela odorata los mejores resultados de elongación de brotes en BioMINT se obtienen aplicando tiempos de aireación largos (5 min de inmersión con 8 horas de aireación) en un periodo de sólo 30 días y alcanzan una longitud >5 cm, mientras que el cocotero requiere periodos de 2 min de inmersión con tiempos de aireación cortos y cultivo en BioMINT mayor a 100 días para obtener los mejores resultados en elongación de brote, de hoja mayor y aparición de raíces secundarias. No obstante estos tiempos de cultivo son menores a lo reportado para cocotero en medio semisólido que puede ser de 6 a 9 meses {e han et al., 1998) por lo que se puede considerar que la aplicación del sistema BioMINT a cocotero presenta resultados prometedores para mejorar el actual sistema de micropropagación de cocotero en su etapa final in vitro y generar una mayor cantidad de brotes con características adecuadas para aclimatar y crecer en invernadero.

Figura 3.10. Aspecto de los brotes. El , ejemplo de explante inicial , la barra de referencia equivale a 2 cm. Desde e hasta T4 brotes a los 100 días. e, brote en control (medio semisólido). T1 , brote en tratamiento de inmersión cada 1 h. T2, brote en inmersión cada 2h. T3, brote en inmersión cada 4h. T4, brote en inmersión cada 8h.

71

3.5 CONCLUSIÓN

La aplicación de biorreactores BioMINT con un tratamiento de 2 minutos de inmersión cada 1 h o 2h favoreció el desarrollo de brotes en comparación con los brotes control (medio sólido) , esto en base a un mejor desarrollo de características importantes como el incremento de número de hojas por brote, el incremento de brotes con raíz y el incremento de longitud de hojas y de raíz.

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Bello-Bello J.J., Canto-Fiick A , Balam-Uc E., Gómez-Uc E., Robert M.L. , lglesias-Andreu L.G. , and Santana-Buzzy N. 201 O. lmprovement of In Vitro Proliferation and Elongation of Habanero Pepper Shoots (Capsicum chinense Jacq.) by Temporary lmmersion. Hortscience 45(7) : 1093-1098.

Chan, J. L. , L. Sáenz, C. Talavera, R. Hornung, M. Robert, and C. Oropeza. 1998. Regeneration of coconut (Cocos nucifera L.) from plumule explants through somatic embryogenesis. Plant Cell Rep. 17:515-521 .

Etienne, H. and M. Berthouly. 2002. Temporary immersion systems in plant micropropagation. Plant Cell , Tissue and Organ Culture 69: 215-231.

Maene L. , and Debergh P. 1985. Liquid medium additions to established tissue cultures to improve elongation and rooting in vivo. Plant Cell , Tiss. Org. Cult. 5: 23-33.

Peña-Ramírez, Y.J. , J. Juárez-Gómez, L. Gómez-López, J.L. JerónimoPérez, l. García-Sheseña, J.A. González-Rodríguez and M.L. Robert. 201 O. Multiple adventitious shoot formation in Spanish Red Cedar (Cedrela odorata L.) cultured in vitro using juvenile and mature tissues: an improved micropropagation protocol for a highly valuable tropical tree species. In Vitro Cell. & Dev. Biol. - Plant. 46 (2) : 149-160.

Preil W. 2005. General introduction: a personal reflection on the use of liquid media for in vitro culture. In : Hvoslef-Eide A.K. and Preil W. (Eds) . Liquid Culture Systems for in vitro Plant Propagation . Springer. Berlin. Pp 1-18.

Robert, M.l. , J.L. Herrera-Herrera, G. Herrera-Herrera and M.A. HerreraAiamillo. 2006. Chapter 11. A new temporary inmersion bioreactor system for micropropagation. In: Loyola-Vargas, V.M. and F. Vázquez-Fiota (ed). Methods in Molecular Biology. Vol. 318. Plant Cell Culture Protocols. Human Press lnc. New Jersey. 121-129.

Teisson C., and Alvard D. 1995. A new concept of plant in vitro cultivation liquid medium: temporary immersion. In: Terzi M. , et al (eds) . Current lssues in Plant Molecular and Cellular Biology. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. pp 105-11 O.

73

Capítulo 4

Transient genetic transformation of embryogenic callus of Cocos nucifera L.

Nota introductoria Este capítulo se publicó como artículo científico en la revista Biología. 66 (5) : 790-800. Springer. ISSN: 0006-3088. 001 : 1 0.2478/s11756-011-01 04-4.

Las siguientes secciones del trabajo incluido en este artículo fueron realizadas en colaboración con los coautores mencionados a continuación: E. Ramírez-Benítez, evaluación de los genes reporteros gusA y DsRFP, determinación del tiempo de infiltración de callos embriogénicos. K. Becerril, evaluación del gen reportero gfp y ensayos con antibióticos para eliminar Agrobacterium. El resto de las secciones fue realizado experimentalmente en forma exclusiva por Antonio Andrade-Torres autor de la presente tesis.

A continuación se incluye el artículo publicado.

Transient genetic transformation of embryogenic callus of Cocos nucifera L.

Antonio Andrade-Torres1·

2, Carlos Oropeza1

, Luis Sáenz\ Tomás González-Estrada3

, José Efraín Ramírez-Benítez3, Karen Becerril3

, José Luis Chan 1, and Luis Carlos Rodríguez-Zapata 1.

1Unidad de Biotecnología, Centro de Investigación Científica de Yucatán, Calle 43, No. 130, Col. Chuburná de Hidalgo, C.P. 97200, Mérida, Yucatán, México.E-mail: [email protected] 2Present address: Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada (INBIOTECA), Universidad Veracruzana, Xalapa, Veracruz, México. 3Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas, Centro de Investigación Científica de Yucatán, Calle 43, No. 130, Col. Chuburná de Hidalgo. C.P. 97200, Mérida, Yucatán, México.

Abstract: Coconut palm (Cocos nucifera) is a plant species recalcitrant to in vitro morphogenesis and no protocols for the genetic transformation of coconut tissues have been published. The present study aimed to develop a protocol for genetic transformation of this palm species; evaluating reporter genes, transformation methods, and conditions for the use of antibiotics to select transformed plant cells. The gene gusA was first used for Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of coconut embryogenic calli. However, endogenous GUS-Iike activity was found in calli not co-cultured with bacteria. Then essays for Agrobacterium-mediated transformation were developed using green and red fluorescent genes. Both genes are suitables as reporter genes for coconut transformation. In arder to

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establish a protocol for coconut genetic transformation, an approach was used that combined biobalistics to generate micro-wounds in explants, vacuum infiltration and ca-culture with Agrobacterium tumefaciens (C58C1+ pER 1 OW-35SRed containing the embryogenesis related gene WUSCHEL) . Calli treated with the combined protocol showed red fluorescence with greater intensity and greater area than calli treated with either biobalistics or infiltration, followed by bacteria ca-culture. PCR amplification of DNA extracts from transformed embryogenic callus produced a band with the expected size using WUSCHEL primers (862 bp). No band was obtained using the VirE2 primers. This is the first report of transient genetic transformation of C. nucifera and it is the first step toward a protocol that will be useful for the study of the role of genes of interest and for practica! applications, such as the improvement of coconut micropropagation via somatic embryogenesis.

Keywords: GUS-Iike activity, Agrobacterium, biobalistic, vacuum infi ltration, fluorescent proteins

Abbreviations: AC: Activated charcoal; DsRFP: Red fluorescent protein; GFP: Green fluorescent protein ; GUS: ~-glucuron idase ; MS: Murashige and Skoog medium; PCR: Polymerase chain reaction ; SDS: Sodium dodecyl sulfate; YEP: Yeast extrae! peptone medium; Y3: Eeuwens medium.

4.1 INTRODUCTION

Coconut (Cocos nucifera L.) cultivation is affected by several phytosanitary problems, and lethal yellowing disease (L Y) has been the most devastating, killing millions of coconuts in the Americas (Harrison and Oropeza, 2008). So far, the most effective way to deal with L Y is using resistant germplasm, but its identification is a very lengthy process that takes years. In Mexico, L Y resistant coconut ecotypes were identified in a ten year field evaluation (Zizumbo et al. , 2008). For large scale replanting purposes, this germplasm requires to be propagated in a massive fashion and in a period of time as short as possible. Something that if done through seed propagation would take decades, therefore an alternative could be micropropagation. Coconut is recalcitrant to in vitro morphogenesis (Oropeza et al. 2005). Nevertheless, we recently reported a reproducible regeneration system for plumule explants based on the multiplication of embryogenic callus and secondary somatic embryogenesis, with which , several thousand somatic embryos can be obtained per initial explant (Pérez-Núñez et al. 2006). However, efficiency is still low in terms of the number of explants producing embryogenic callus and the number of somatic embryos generated per embryogenic callus. These limitations are translated into more embryogenic callus multiplication cycles and labor to obtain greater yields. Therefore, it is important to improve the in vitro embryogenic capacity of coconut tissues and to strengthen coconut defenses against diseases such as L Y.

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Genetic transformation has proven to be an alternative to abate recalcitrance to in vitro morphogenesis and to increase resistance to pathogenic microorganisms (Cai et al. 2002; Shin et al. 2002; Zuo et al. 2002; Herrera-Estrella et al. 2004). This has been achieved by insertion and over-expression of genes related to the control of morphogenesis, such as the heterologous gene WUSCHEL in Arabidopsis thaliana and Coffea canephora cultures that promoted the transition from vegetative to embryogenic state, and eventually led to somatic embryo formation (Zuo et al. 2002; Arroyo-Herrera et al. 2008). In Capsicum chinense, the induced expression of WUSCHEL in segments of transformed stems began to form globular structures, suggesting that heterologous WUSCHEL was active and involved in the process of morphogenesis (Salís-Ramos et al. 2009). lt has been demonstrated in Arabidopsis, that over-expression of a SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-Iike KINASE (SERK) gene (AtSERK1) increases the embryogenic competence of callus derived from transformed seedlings 3 to 4-fold when compared with the wild-type callus (Hecht et al. 2001 ). 1 n addition to their basic role in somatic embryogenesis, OsSERK1 and OsBISERK1 are reported to partially mediate defense signa! transduction leading to disease resistance in rice (Hu et al. 2005; Song et al. 2008). Recently, Santos et al. (2008) reported that lettuce plants with elimination of LsSERK expression via RNA silencing had a reduced ability to form somatic embryos, and simultaneously became more susceptible to the pathogenic fungus Sclerotinia sclerotiorum, results that are consistant with an involvement of SERK in somatic embryogenesis and plant defence.

Regarding to transformation and resistance to diseases, some success has been obtained for different plant species. lt has been reported Capsicum annuun transformation with genes from the coat protein of the cucumber mosaic virus (CMV-CP) (Yu-Xian et al. 1996; Shin et al. 2002a; Zhu et al. 1996; Cai et al. 2002, 2003), or the coat protein of tomato mosaic virus (TMV-CP) (Cai et al. 2003), or Tsi1 gene (tobacco stress-induced gene 1) (Shin et al. 2002b), which showed resistan ce to either cucumber mosaic virus (CMV), pepper mild mottle virus (PMMV), bacteria! (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria) or fungal pathogens (oomycete, Phytophtora capsic1) , representing improvements for these susceptible cultivars. A similar transgenic approach has been employed to control Panama wilt and Sigatoka disease in banana cultivars. Chakrabarti et al. (2003) reported that the transgenic banana expressing a synthetic substitution analogue of magainin , a protein from skin secretions of Xenopus laevis, was more resistant to both F. oxysporum f. sp. cubense and M. musicola. Similar resistance to the fungal pathogen has been reported in transgenic banana expressing chitinase and /3-1 , 3-glucanase (Sreeramanan et al. 2006). Results of a recent study showed that the banana plants that expressed a human lysozyme gene under the control of 35S promoter were also resistant to Panama wilt disease under field conditions (Pei et al. 2005). The degree

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of resistance correlated positively with transgene expression, with the two most resistant transgenic lines, showing the highest gene expression (Pua 2007).

In our laboratory we have started studies on genes related to somatic embryogenesis in coconut. Pérez-Núñez et al. (2009) determined the presence of an ortholog of the SERK gene in the coconut genome. Analysis of its expression showed that it could be detected in embryogenic tissues before embryo development could be observed. In contrast, no expression was detected in non-embryogenic tissues, suggesting that CnSERK expression is associated with induction of somatic embryogenesis and that it could be a potential marker of cells competent to form somatic embryos in coconut in vitre cultures, as it is the case for other species (Schmidt et al. 1997; Somleva et al. 2000; Hecht et al. 2001 ). MonteroCortés et al. (201 O) isolated from coconut a cyclin-dependent kinase ( CDKA) gene; which might be linked to the cellular control. Expression of the CnCDKA gene steadily increased during embryogenic callus formation phase when embryogenic competence was attained . Analysis of CnCDKA expression at different somatic embryo formation stages showed that expression decreased progressively, being the lowest when somatic embryos were germinating. These genes are candidates for future experiments of transformation in coconut tissues.

There are several protocols for genetic transformation of different monocot species, such as agave (Fiores-Benítez et al. 2007), wheat (Uzé et al. 1999; Wan and Layton 2006), corn (Valdez-Ortiz et al. 2007), rice (Li et al. 1993; Lucca et al. 2001 ), and oat (Gasparis et al. 2008). In the particular case of palm species, genetic transformation has been reported only for oil palm (Eiaeis guineensis Jacq.). Parveez and Christou (1998) reported the regeneration of plants from oil palm embryogenic callus transformed by biobalistics. Abdullah et al. (2005) developed a method for genetic transformation using immature zygotic embryos of oil palm , and through analysis of GUS expression, they identified 97.4% of transformation frequency by biolistics and 64.4% through Agrobacterium tumefaciens ceculture. No studies have been reported on defense mechanisms or related genes for coconut.

In the case of transformation of coconut, there are no reports in the literature. Therefore, the present study aimed to develop a protocol for genetic transformation of this palm species; evaluating reporter genes, transformation methods, and conditions for the use of antibiotics to select transformed plant cells. A protocol that combines biobalistics to generate micro-wounds in explants, vacuum infiltration and ce-culture with A. tumefaciens was developed, and its application for the transient genetic transformation of coconut embryogenic callus is reported here.

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4.2 MATERIALS ANO METHODS

4. 2. 1 Plant Material Our workgroup have an in vitro stablished and characterized collection of different tissues and plants of Cocos nucifera L. cv. Green Malayan Dwarf, then this material as well as plants from our field collection were used for the different experiments: male flowers from immature inflorescences (stage -2 and -4; Perera et al. 2007); embryogenic calli obtained from coconut plumules according to Pérez-Núñez et al. (2006) ; zygotic embryos (excised from coconut fruits of 10-12 months old according to Chan et al. (1998) ; roots and leaves taken from plantlets obtained through somatic embryogenesis (according to Chan et al. 1998). As reference tissues for positive GUS activity, were used alfalfa seedlings (Medicago sativa L.) obtained by in vitro seed germination on MS medium (Murashige and Skoog 1962) and transformed with the binary plasmid pTG9701 , according to González-Estrada (2000) . Wild type alfalfa seedlings germinated in MS medium were used as reference for negative GUS activity. In subsequent experiments (using fluorescent proteins as reporter genes, experiments for Agrobaterium elimination and experiments for kanamycin as selective agent}, we used embryogenic calli obtained from plumular explants, according to Pérez-Núñez et al. (2006).

4.2.2 Strains and plasmids The EHA 101 , EHA 105 and C58C1 strains of Agrobacterium tumefaciens were utilized for genetic transformation. For experiments on GUS-Iike activity was used the binary plasmid pTG9701 containing the gene gusA from E. coli, which encodes GUS under control of the GH3 auxin inducible promoter of soybean (Giycine max L.), with a NOS terminator. For experiments with fluorescent proteins, the plasmids u sed were pBI N 19cATgrp and pLH60-DsRFP. Plasmid pBIN 19cATgrp contains the gene encoding green fluorescent protein (GFP), as a reporter with the CaMV35S promoter. The pLH60-DsRFP plasmid contains two T-DNA's, one of which contains the gene DsRFP, gene encoding the red fluorescent protein (DsRFP) under the control of the ubiquitin prometer of maize (pUb1), and a NOS terminator; while the another T-DNA contains the gene hpt (hygromycin phosphotransferase) controlled by the 35S promoter and the NOS terminator. For experiments on the combined protocol for transformation, the C58C1 strain of A. tumefaciens with the pER1 OW-35SRed plasmid or the disarmed C58C1 strain was used. The pER10W-35SRed plasmid contains in T-DNA the DsRFP reporter gene under the constitutive 35S promoter, the selection gene npt/1 (neomycin phosphotransferase 11} , also under the control of 35S promoter, and the embryogenesis related gene WUSCHEL from A. thaliana (Zuo et al. 2002; Canche-Moo et al. 2006; Salís-Ramos et al. 2009).

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4.2.3 Bacteria/ culture Bacteria! inoculum was grown, according to Solís-Ramos et al. (2009) , with 100 mg L-1 ampicillin (pBIN19cATgtp) . 100 mg L-1 rifampicin + 100 mg L-1

spectinomycin (pLH60-RFP), or 100 mg L-1 spectinomycin (pER 1 OW-35SRed).

4.2.4 Transient transformation by bioba/istic, vacuum infiltration and cocultivation Genetic transformation of coconut tissues was tested using an approach that combined biobalistics to generate micro-wounds in explants, with subsequent vacuum infiltration and/or ce-culture with A. tumefaciens (C58C1+ pER10W-35SRed). Bombardment of embryogenic calli was carried out using 1 ¡Jm diameter gold particles (without DNA) at a distance of 6 cm with a pressure of 900 psi. The coconut embryogenic calli were placed in the middle of a petri dish forming a circle of 1.5 cm in diameter over the semi solid Y3 medium phase 1 (Pérez-Núñez et al. 2006). After biobalistic treatment, the embryogenic calli were submerged in YEP medium or bacteria! suspension with A. tumefaciens strain C58C1 + pER10W-35SRed (Table 1). Corresponding treatments were placed in a chamber for vacuum infiltration at 40 psi for 20 m in (Table 1 ). Finally, without removing excess of bacteria the embryogenic calli were co-cultured in semi solid Y3 medium phase 1, in darkness at 28°C for 48 h. The conditions for bombardment and vacuum infiltration were determined by previous experiments in our working group (data not shown). Experiments were repeated 5 times with 5 explants per treatment each time.

4.2.5 Bacteria elimination After co-cultivation , all the embryogenic calli were washed for 5 min with a solution of 0.9% NaCI and subsequently with sterile distilled water three times to remove bacteria residue. Then, depending of the treatment they were immersed for 20 min under constant agitation in a solution with different antibiotic treatment solutions containing timemtin , cefotaxime or a mixture of both (Table 1) to eliminate the bacteria from the cultures. Explants in control group were washed only with NaCI 0.9% but antibiotic solution was not applied. All the explants were placed in semi solid Y3 medium phase 1

with antibiotics (300 mg L-1 Timentin + 300 mg L-1 Cefotaxime). Treatments were incubated in the dark at 27 ± 2°C.

4.2. 6 Histochemica/ GUS detection and f/uorescent proteins visualization The histochemical staining for GUS detection tests was performed according to Jefferson (1987), using 50 mg of fresh tissue for dipping in 1 ml of phosphate buffer solution at pH 6, 7, 7.5, or 8, incubating for 8 h at 3rC in darkness. After staining, samples were washed in phosphate buffer at corresponding pH and subsequently in 70% ethanol to remove chlorophyll

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and other pigments from the tissue. Explants were kept in 70% ethanol and the presence and intensity of GUS staining rate was evaluated. Two treatments were used to investigate the effect of methanol on GUS-Iike enzyme activity: (1) immersion of tissue in a solution of 20% methanol prior to staining, and (2) addition of methanol to the staining buffer (concentration: 20%); in both treatments phosphate buffer was used at pH 7.

The fluorescence of green or red fluorescent proteins was detected with a fluorescent stereoscopic microscope Leica MZFLIII with an excitation wavelength of 525/50 nm and filters 470/40 nm (green fluorescent protein) and 543/30 nm and 620/60 (red fluorescent protein) .

4.2. 7 Kanamycin for transformed plant cel/s selection The experiment was established with non-transformed embryogenic calli exposed to different doses of kanamycin in two medium formulations (Table 3) : (1) kanamycin in semisolid Y3 medium phase 1 with activated charcoal according to Pérez-Núñez et al. (2006) , and (2) kanamycin in semisolid Y3 medium phase 1 without activated charcoal , according to Sáenz et al. (2005). A control of embryogenic calli cultured without kanamycin (Table 3) was used for each of the medium formulations mentioned above. Ten embryogenic calli were used per treatment. The treatments were incubated at 27 ± 2oc in darkness for 90 days. The culture medium was renewed every 15 days to prevent the antibiotic to lose its effect. The response of the explants was evaluated every 5 days.

4.2.8 Transgene detection by Polymerase Chain Reaction (PCR) Genomic DNA was isolated from coconut embryogenic calli co-cultured with bacteria and assayed by PCR to test both the presence of the gene of interest, as well as the presence of A. tumefaciens in the tissue. For DNA isolation, samples were macerated with 200 IJL extraction buffer (200 mM Tris-HCI, pH 7.5, 250 mM NaCI, 25 mM EDTA, 0.5% SOS). The extracts were washed with 100 IJL of phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24: 1 ). The DNA was precipitated with ethanol and resuspended in 20 IJL distilled nuclease-free water. The extraction of DNA from pER10W-35SRed and C58C1 were carried out acording to the manual for plasmid purification (Wizard PLUS, PROMEGA).

PCR amplification of the gene WUSCHEL sequence was performed using the primer pair 5'tatggagccgccacaacag3' (WusF: forward) and 5'atcacagccttctccttctt3' (WusR: reverse), and a fragment of 862 bp was obtained. For gfp gene amplification the primer pair 5'cgatagccatgggtaaaggagaag3' and 5' tccagaggatccttatttgtatagttc3' was used, and a fragment of 714 bp was obtained. For amplification of DsRFP gene the primer pair 5'ggagatatccatggggtcttccaag3' and 5' cagccggatccgctaaaggaacag3' was used, and a fragment of 714 bp was obtained. The volume of the reaction mixture was 25 IJL, containing : 0.2 mM

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dNTPs, 0.02 mM MgCI2, 0.5 ¡.JM of each primer, 2 ¡.JL of sample DNA and 0.04 U ¡.JL-1 of Taq polymerase (lnvitrogen, USA). PCR conditions were: 95°C for 2 min , 30 cycles: 94°C for 1 min, 58°C for 40 s and 72°C for 1 min, 1 O m in at 72°C. For the VirE2 gene amplification the primer pair 5'acatatggagccgccacag3' and 5'atcacagccttctccttctt3' was used, and a fragment of 895 bp was obtained. The conditions were 94°C for 30 s, 30 cycles of 94°C for 1 min, 55°C 1 min and 72°C for 1 min , 10 min at 72°C. The amplified fragments were separated in 1% (w/v) agarose gels.

4.3 RESUL TS ANO DISCUSSION

4. 3. 1 Evaluation of the gusA gene as reporter for coconut genetic transformation lt is a common practice in transformation protocols that in the same DNA construct containing the gene of interest for insertion, to include a gene that encodes for an easily detectable protein which expression would indicate successful uptake of the gene of interest. A gene frecuently used for this is gusA encoding r1-glucuronidase and the corresponding development of blue staining (Parveez and Christou 1998; Ramli and Abdullah 2003; Abdullah et al. 2005; Sal ís-Ramos et al. 201 0).

Then, in arder to develop a coconut transformation protocol , we started A. tumefaciens mediated transformation of coconut embryogenic cal li, testing gusA as a reporter gene. However, after a preliminary experiment, blue staining was found in histochemical preparations of embryogenic calli not exposed to bacteria, presumably due to endogenous GUS activity; and no difference in staining intensity was found between these call i and calli co-cultured with bacteria (see Fig. 4.1 ). Since alfalfa tissues do not present endogenous GUS-Iike activity (Micallef et al. 1995; González 2000), we used wild type alfalfa tissues as well as alfalfa tissues transformed with the gusA gene, as a reference for histochemical stain ing. After staining , the leaf and petiole vascular bundles of transgenic alfa lfa stained blue at all pH values tested , and the most intense color was obtained at pH 7 (not showed). These results showed that the transformation protocol and histochemical procedure was properly done, and the gusA gene inserted in the plasmid was functional.

In different species optimal endogenous GUS-Iike activity has been reported between pH 4 and pH 6 (Hodal et al. 1992), whereas it is histochemically undetectable at pH 7.0 or higher (Aiwen et al. 1992; Hodal et al. 1992; Sudan et al. 2006; Sol í s-Ramos et al. 201 0). In contrast, the pH of E. coli-derived GUS has optimum activity at pH 7.0 (Jefferson 1987). Therefore, assaying at th is pH for transformation associated GUS activity, could be a means to discriminate the E. coli-derived GUS from endogenous GUS-Iike activity (Sudan et al. 2006). On the other hand, Kosugi et al. (1990) proposed that the use of methanol in GUS buffer eliminated endogenous

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GUS-Iike activity, while having no effect or even enhancing the activity of the introduced gusA gene. Then, before testing an alternative reporter gene, we evaluated the effect of pH and methanol treatment to discriminate between endogenous GUS-Iike activity and that resulting from transformation in embryogenic callus, and two other alternative tissue sources: male flowers and zygotic embryos.

pH6 pH7 pH7.5 pH8

A

B

F o

Figure 4.1. Histochemical localization of GUS activity in different coconut tissues. Upper panel shows assays in buffer solution with different pH : (A) wild type embryogenic callus; (B) wild type male flowers; and (C) wild type zygotic embryos. Lower panel assays in buffer at pH 7: (D) wild type rachillae of young inflorescence; (E-F) wild type zygotic embryos, the circle in (F) indicates the plum u le. Bar= 5 mm.

Endogenous GUS-Iike activity assayed at different pH values (6, 7, 7.5 and 8) showed that the wild type embryogenic calli developed blue staining at all pH values tested (Fig. 4.1A), and no difference could be observed when compared with the blue staining generated in calli cocultured with bacteria (not shown). This endogenous GUS-Iike activity was also found in other wild type coconut tissues: male flowers (anthers Fig. 4.1 B

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and 4.1 D), zygotic embryos (Fig . 4.1 C), as well as in cotyledonary tissues and plumule (Fig 4.1 F). So, GUS-Iike activity is already present in the most important explant source tissues for coconut micropropagation. Regarding methanol, two treatments were assayed . Firstly, the immersion of wild type coconunt tissues in 20% methanol did not affect the endogenous GUS-Iike activity in anthers or embryogenic calli , and only slightly decreased it in zygotic embryos. Secondly, the addition of methanol to the staining solution did not decrease the intensity of the endogenous GUS-Iike activity in any of the wild type tissues tested . Therefore, these results showed that endogenous GUS-Iike activity was present in other wild type coconut tissues besides embryogenic callus; but in contrast to previous reports with other species, neither changing pH nor methanol treatment helped to decrease endogenous GUS-Iike activity in coconut tissues, particularly at pH 7, at which E. coli-derived GUS has its optimum activity. Therefore, gusA was not considered convenient as a reporter gene for the development of a genetic transformation protocol of coconut tissues, and other genes had to be tested for this purpose.

4.3.2 Evaluation of gfp and DsRFP as reporter genes for coconut genetic transformation Since, gfp and DsRFP genes encoding for green and red fluorescent proteins, respectively, have also been useful as reporter genes in transformation protocols of different plant species (e.g. soybean , Ponappa et al. 1999; wheat, Jordan 2000; oat, Kaeppler et al. 2000; barley, Carlson et al. 2001 ; oil palm, Ramli & Abdullah 2003) , we tested A. tumefaciensmediated transformation of coconut embryogenic calli using the strains C58C1 , EHA 101 and EHA 105 and plasmids encoding the green and red fluorescent proteins.

After co-culturing with bacteria , groups of cells in embryogenic calli transformed with the plasmid pBI N 19cATgtp (Fig . 4.2A) were able to emit green fluorescence (Fig . 4.28) , and also groups of cells in embryogenic calli transformed with the plasmid pLH60-RFP (Fig. 4.2C) were able to emit red fluorescence (Fig. 4.20). Then , coconut cells in treated embryogenic calli were able to express transiently both reporter genes.

Abundance of the fluorescence (either green or red) in the transformed calli was not quantified, but it was noticed that it varied depending on the A. tumefaciens strain used . lt was lower when the C58C1 strain was used than with EHA 105 and EHA 101 strains (not showed). This difference might be related to differences in the potential of virulence of each strain as it has been reported in other cases (Hellens et al. 2000). However, in most of the embryogenic calli co-cultured with strains EHA 101 and EHA 105, recurren ce of bacteria! growth after 30 days of antibiotics treatment was common. These calli were subjected to a more aggressive treatment to prevent recurrence of bacteria! growth , but this resulted in necrosis and the

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bacteria was still able to grow on the surface of the callus. So, EHA 101 and EHA 1 05 strains were not u sed in subsecuent experiments. Therefore, these results showed which bacteria strain was more suitable, and also that both fluorescent genes are suitables as reporter genes for the transformation of coconut.

Figure 4.2. Green and red fluorescence in coconut embryogenic callus observed through a stereoscope. Callus co-cultured with EHA101 + pBIN19cATgfp. visible (A) and with filler for green fluorescence (B). Callus co-cultured with EHA101 + pLH60 DsRFP, visible (C) and with filler for green fluorescence (D). Bar= 5 ~m .

Table 4.1. Effect of antibiotic treatment on the reiterated growth of A. tumefaciens on coconut embryogenic callus. Calli were co-cultured with A. tumefaciens for 48 hours before antibiotic treatment with timentin and/or cefotaxime for 30 days. The number of call i used per treatment was 15. The medium used was semi sol id Y3 with activated charcoal. Different letters after result figures denote significan! differences between treatments.

Treatment Timentin Cefotaxime Calli without bacteria re-(mg L-1) (mg L-1

) growth after treatment 1 o o o a 2 200 o 5 b 3 o 200 6 be 4 200 200 10 cd 5 500 o 8 bcd 6 o 500 7 bcd 7 500 500 15 e 8 1000 o 11 de 9 o 1000 10 cd 10 1000 1000 15 e

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4. 3. 3 Bacteria elimination After bacteria co-cultivation, embryogenic calli were washed with different antibiotic treatment solutions containing timentin , cefotaxime or a mixture of both (Table 4.1) to eliminate the bacteria from the cultures. The most effective treatments were those with the combination of antibiotics, particularly those with the highest concentrations 500 or 1000 mg L-1,

although the same result was obtained with either of them: 100% calli free of bacteria after treatment (Table 4.1 ). Thus, the mixture at 500 mg L-1 for each antibiotic was adopted as the standard treatment for the elimination of bacteria from the embryogenic calli after ca-culture .

4.3.4 Kanamycin for transformed plant cel/s selection The plasmid used encodes resistance to the antibiotic kanamycin , one of the most-used selective agents. Therefore, embryogenic calli cells that are transformed have to be able to live in a medium containing a lethal concentration of this antibiotic. So, it is important to determine the concentration at which wild type embryogenic calli are affected by the antibiotic. Then, embryogenic calli was cultured on semi-salid Y3 media containing different kanamicin concentrations (0 , 60, 90, 180, 300, 600, 900 and 1200 mg L-1

) . After 90 days, none of the embryogenic calli tested showed symptoms of being affected by any of the antibiotic concentrations tested (Table 4.3). This was surprising because for other species lethal concentrations reported are below 200 mg L-1

. For example, Arabidopsis or tobacco plants can be selected using concentrations around 100-200 mg L-1, while other more insensitive or tolerant species, such as Catharanthus roseus, require concentrations as high as 8 g L-1 to be able to separate the transformed and non-transformed cells or tissues (Lorence and Verpoorte 2004). The medium used for the current study was prepared with the usual formulation for coconut embryogenic callus culture as reported by PérezNúñez et al. (2006). Since this medium cointains activated charcoal (AC) and this material has adsortion capacity (Sáenz et al. 201 0) , it was eliminated from the formulation considering the possibility that it might have been adsorbing the antibiotic and reducing its concentration in the medium. AC-free medium has already been tested for embryogenic calli growth, and although not optimal , this medium allowed the calli survival (Sáenz et al. 2005). Then, using AC-free medium, after 30 days, all the calli cultured with kanamycin concentrations from 300 mg L-1 to 1200 mg L-1 were affected by the antibiotic, becoming necrotic, but not those cultured with lower concentrations (Table 4.3) . Then , the mínimum effective kanamycin concentration was 300 mg L-1, still higher compared with concentrations reported for other species. For example, the transformation protocol for Agave salmiana includes 50 mg L-1 of kanamycin (Fiores-Benítez et al. 2007), 100 mg L-1 for Coffea canephora and Capsicum chinense (CancheMoo et al. 2006; Salís-Ramos et al. 2009), and 150 mg L-1 for Nicotiana

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tobaccum and Nicotiana benthamiana (Clemente 2006). Thus coconut is apparently more tolerant to the effect of kanamycin than the species mentioned above. Somehow contrasting , in the case of another palm species E. guineensis, the mínimum concentration needed was above 200 mg L-1 kanamycin (Abdullah et al. 2005). Based on the present results, we decided that a concentration of 400 mg L-1 kanamycin in semisolid Y3 medium without AC was adequate for selection of the coconut transformed ce lis.

4.3.5 Combined use of biobalistics, vacuum infiltration and co-cultivation with A. tumefaciens Previous reports indicated that the efficiency of Agrobacterium-mediated transformation could be increased with different approaches. One is the use of vacuum infiltration befare co-culturing of the explants with the bacteria (Charity et al. 2002; Acereto-Escoffié et al. 2005); another one is causing micro-wounds (ej. biobalistics particles) to the explants prior to ca-culture with bacteria (Xue et al. 2006; Valdez-Ortiz et al. 2007). Based on these reports, we tested the combined use of biobalistics for causing microwounds, vacuum infiltration and bacteria co-cultivation in an experiment with different treatments (Table 4.2). The plasmid used was pER10w-35SRed.

Table 4.2. The effect of different treatments on the genetic transformation of coconut embryogenic callus. In all treatments with bacteria ce-culture, the strain used was C58C1 (with plasmid pER1 OW-35SRed). The total number of call i per treatment was 25. Red fluorescence resulting from transformation was detected as fluorescence by microscopy. Different letters after result figures denote sign ifican! differences between treatments. Observations were made 3 days after ce-culture.

Co- % of Spots per

Treatment Biolistics Vacuum culture transformed transformed

infiltration with calli callus bacteria

TO No No No O±Oa 0.0 ±O a T1 Y es No No O±Oa 0.0 ±O a T2 No Y es No O±Oa 0.0 ±O a T3 Y es Y es No O±Oa 0.0 ±O a T4 No No Y es 32± 10.9b 2.5 ± 0.9 b T5 No Y es Y es 68 ± 22.5 e 4.0 ± 1.2 be T6 Y es No Y es 100 ±o d 5.0 ± 1.3 e T7 Y es Y es Y es 100 ±o d 9.0 ± 2.0 d

87

TO T5

Visible

DsRed

T6

~~ - .... .. -

T7

Figure 4.3. Red fluorescence of coconut embryogenic callus observed through a stereoscope. Visible = visible ligth. DsRed = using filters for red fluorescent protein detection. TO = wild type embryogenic callus (negative control). T5 = embryogenic callus transformed by vacuum infiltration and co-cultivation (C58C1 + pER10W-35SRed). T6 = embryogenic callus transformed by biobalistics and co-cultivation (C58C1 + pER10W-35SRed). T7 = embryogen ic callus transformed by biobalistics, vacuum infiltration and co-cultivation (C58C1 + pER10W-35SRed). Bar= 5 mm.

The embryogenic calli in treatments that did not include ca-culture with bacteria TO, T1 , T2 and T3 did not show red fluorescence (Table 4.2, Fig. 4.3 showing TO) . In contrast, the embryogenic calli in all other treatments where bacteria co-cultivation was included (T5, T6 and T7) showed fluorescence (Table 4.2, Fig. 4.3). This was quantitated as follows: When embryogenic calli was co-cultivated with A. tumefaciens without biobalistics or vacuum infiltration, 32% showed red fluorescence and 2.5 spots per callus (treatment T4, Table 4.2). When vacuum infiltration was used with ca-culture with bacteria , an increase was observed with 68% of calli showing red fluorescence and 4 spots per callus (treatment T5, Table 4.2), as in other reports using similarly conditions of transformation for Pinus radiata cotyledons (Charity et al. 2002); immature onion embryos (Eady et al. 2000), embryogenic calli and inflorescences of rice (Datta et al. 2000; Dong et al. 2001 ). Further improvement was obtained when biobalistics was included. With biobalistics combined with co-cultivation , 100% of calli showed red fluorescence and 5 spots per callus (treatment T6, Table 4.2) ; and when combined with vacuum infiltration and co-cultivation with bacteria the percentage of calli showing red fluorescence was al so 1 00% but the number of spots per callus increased to 9 and the size of the spots also increased (treatment T7, Table 4.2). Micro-wounds caused by biobalistics probably favor the interaction of the bacteria with calli cells. Such a combined effect has also been reported in maize and soybean (Xue et al. 2006; Valdez-Ortiz et al. 2007).

88

4. 3. 6 PCR analysis of transient transformed coconut embryogenic ca/li PCR assay for the amplification of a partial sequence of DsRed gen using primer pair DsRedF/DsRedR was carried on DNA extracts from sorne calli without ca-culture (treatments TO-T3) or with ca-culture (treatments T 4-T7) with A. tumefaciens. No amplification was obtained with treatments that did not include bacteria ca-culture, whereas positive amplification was obtained with treatments that included bacteria ca-culture and also when plasmid DNA was used as a template. The size of the band obtained was 714 bp, as expected. Also, when PCR was carried out for the amplification of a partial sequence of WUSCHEL gene (included in the plasmid used) with primer pair WusFN.JusR, no amplification was obtained with calli DNA from treatments (TO-T3) that did not include bacteria ca-culture, whereas positive amplification was obtained with treatments (T4-T7) that included bacteria caculture, and also when plasmid DNA was used as a template (Fig. 4.4) . The size of the band obtained was 862 bp, as expected (Fig. 4.4) . Finally, when PCR assay for the amplification of a partial sequence of VirE2 gene using primer pair VirE2FNirE2R was carried out, no amplification was obtained with calli DNA from any of the treatments, including those with bacteria caculture, but a clear band was amplified when using plasmid DNA (Fig . 4.4) . Therefore, the positive PCR amplifciation of partial sequences of DsRed and WUSCHEL using DNA from coconut calli co-cultured with A. tumefaciens, and the negative amplification of VirE2 from these DNA samples, supports that transient transformation did occur in the treated calli .

Wuschel

VirE2 Figure 4.4. Visualization of PCR products amplified by specific primers for WUSCHEL and VirE2 genes. M= 1kb ladder; + = positive control, plasmidic DNA of pER10W-35SRed; 1 and 2 = DNA from embryogenic calli 60 days after transformation with treatment T7 (biobalistics, vacuum infiltration and co-cultivation); 3 and 4 = DNA from embryogenic calli 60 days after transformation with treatment T6 (biobalistics and co-cultivation) ; C = negative control , DNA from wild type embryogen ic calli.

Considering all the results presented above a protocol for the transformation of coconut was integrated as shown in Fig. 4.5. lt includes the treatment of coconut embryogenic calli with : bombardment with gold particles without DNA to produce micro-wounds, and vacuum infiltration with A. tumefaciens using OsRed as reporter gene. Then A. tumefaciens is eliminated with washings with timentin + cefotaxime. And finally selective propagation of transformed cells in calli is carried out with kanamycin.

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Cumulative Steps

Treatment solutions and time media

Semisolid Y3 medium 1 with

O days Place plumule explants on médium to activated charcoal (AC)

start embryogenic callus format ion without subculture (Pérez-Núñez et al. 2006) ..

90 days 1

Embryogenic calli formed 1 ..

Bombardment of embryogenic calli with Petri dish with semisolid Y3 1¡.Jm gold particles without DNA to medium 1 with AC (Pérez-

produce micro-wounds Núñez et al. 2006) .. Vacuum infiltration for 20 min of

YEP medium with 100 mg L-

embryogenic calli with Agrobacterium 1 spectinomycine with

bacteria previously tumefaciens (strain C58C1 1 pER1 OW)

activated for 4 days .. Ca-culture of embryogenic calli with A.

Petri dish with semisolid Y3 91 days medium phase 1 with AC

tumefaciens for 48 h in darkness (Pérez-Núñez et al. 2006) ..

Elimination of A. tumefaciens with 500 Washings with antibiotic mg L-1 timentin + 500 mg L"1 cefotaxime solution

.. Semisolid Y3 medium

93 days Selective propagation of transformed without AC, subculturing

cells in calli with 400 mg L-1 kanamycin every 20 days (Sáenz et al. 2005)

F1gure 4.5. Proposed protocol for the gene!ic transformaban of coconut embryogen1c callus.

This is the first report of transient genetic transformation of coconut and it is the first step toward a protocol that will be useful for the study of the role of genes of interest and for practica! applications for the improvement of coconut micropropagation via somatic embryogenesis. For instance, an ortholog of the SERK gene in the coconut genome CnSERK isolated in our laborartory, is used within a construct for the transformation of coconut calli , we would expect that embryogenic capacity of the callus be increased as reported for similar experiences with other species (Hecht et al. 2001 ), and will also help us to learn about the role of CnSERK. Also the construct pER 1 Ow-35SRed u sed in the present study contains the heterologous gene WUSCHEL from A. thaliana (Zuo et al. 2002), a gene that is known to be involved in control of embryogenesis (Zuo et al. 2002 ; Arroyo-Herrera et al.

90

2008) . In this construct the gene WUSCHEL is under an estradiol inducible prometer (Zuo et al. 2002) . Therefore we would expect that treatment with estradiol will lead to overexpression of WUSCHEL in transformed coconut embryogenic calli , promoting somatic embryo formation as reported for Capsicum chinense cultures (Solis-Ramos et al. 2009) . This test will be carried out as a follow up of the present study, as an approach to increase the efficiency of somatic embryo formation in embryogenic calli in arder to improve the micropropagation of coconut (Pérez-Núñez et al. 2006).

4.4 ACKNOWLEDGMENTS

This research was partially funded by Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT, México, Grant No. 43834-Z). A. Andrade-Torres thanks to CONACYT for Ph.D. scholarship (204774), and Universidad Veracruzana through Dirección General de Desarrollo Académico (DGDA}, PROMEP (UV-491 ) and Dirección General de Investigaciones (DGI) for support during Ph.D. studies. Thanks to Bartolomé Chi Manzanero for helping with Agrobacterium techniques. lván Cordova for help on PCR technique. María Narváez for help with logistics.

4.5 REFERENCES Abdullah R. Zainal A. Heng W.Y. Li L.Ch. Beng Y.Ch. Phing L.M. Sirajuddin

S.A. Ping W.Y.S. Joseph J.L. & Jusoh S.A. 2005. lmmature embryo: A useful tool for oil palm (Eiaeis guineensis Jacq.) genetic transformation studies. Electron J Biotechnol. 8(1 ): 24-34.

Acereto-Escoffié P.O.M. Chi-Manzanero B.H. Echeverría-Echeverría S. Grijalva R. James Kay A. González-Estrada T. Castaño E. & Rodríguez-Zapata L.C. 2005. Agrobacterium-mediated transformation of Musa acuminata cv. "Grand Nain" scalps by vacuum infiltration. Sci. Horti. 105: 359-371 .

Alwen A. Moreno R. M. B. Vicente O. & Herbele-Bors E. 1992. Plant endogenous r.!.-glucuronidase activity: how to avoid interference with the use of E. co/i r.!.-glucuronidase as a reporter gene in transgenic plants. Transgen Res. 1: 63-70.

Arroyo-Herrera A. Ku-González A. Canche-Moo R. Quiróz-Figueroa F.R. Loyola Vargas V. Rodríguez Zapata L.C. Burgeff D'Hondt C. Suárez-Solís V.M. & Castaño E. 2008. Expression of WUSCHEL in Coffea canephora causes ectopic morphogenesis and increases somatic embryogenesis. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 94: 171-180.

Blake J. 1990. Coconut (Cocos nucifera L.): micropropagation, pp. 538-554. In: Bajaj Y.P.S. (ed) , Biotechnology in agriculture and forestry legumes and oilseed crops 1, vol 1 O, Springer, Berlin.

Canche-Moo R.L.R. Ku-Gonzalez A. Burgeff C. Loyola-Vargas V.M. Rodríguez-Zapata L.C. & Castaño E. 2006. Genetic transformation of Coffea canephora by vacuum infiltration. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84: 373-377.

91

Carlson A.R. Letarte J. Chen J. Kasha K.J . 2001 . Visual screening of microspore-derived transgenic barley (Hordeum vulgare L.) with green-fluorescent protein. Plant Cell Rep. 20: 331-337.

Chan J.L. Sáenz L. Talavera C. Hornung R. Robert M. & Oropeza C. 1998. Regeneration of coconut (Cocos nucifera L.) from plum u le explants through somatic embryogenesis. Plant Cell Rep. 17: 515-521 .

Charity J.A. Holland L. Donaldson S.S. Grace L. & Walter C. 2002. Agrobacterium-mediated transformation of Pinus radiata organogenic tissue using vacuum-infiltration . Plant Cell Tiss. Org. Cult. 70: 51-60.

Christensen AH . Quail P.H. 1996. Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screen-able marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Res. 5: 213-218.

Clemente T. 2006. Nicotiana (Nicotiana tobaccum, Nicotiana benthamiana) , pp 143-154. In: Wang K. (ed), Methods in Molecular Biology, vol. 343: Agrobacterium Protocols, 2/e, volume 1, Humana Press lnc., Totowa, New Jersey.

Datta K. Koukolikova-Nicola Z. Baisakh N. Oliva N. & Datta S.K. 2000. Agrobacterium-mediated engineering for sheath blight resistance of indica rice cultivars from different ecosystems. Theor. Appl. Genet. 100: 832-839.

Dong J. Kharb P. Teng W. & Hall T.C. 2001 . Characterization of rice transformed via an Agrobacterium-mediated inflorescence approach. Mol. Breed. 7: 187-194.

Eady C.C. Weld R.J . & Lister C.E. 2000. Agrobacterium tumefaciensmediated transformation and transgenic-plant regeneration of onion (AI/ium cepa L.) . Plant Cell Rep. 19: 376-381.

Ebert A & Taylor H.F. 1990. Assessment of the changes of 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid concentrations in plant tissue culture media in the presence of activated charcoal. Plant Cell Tiss. Org . Cult. 20: 165-172.

Ebert A Taylor F. & Blake J. 1993. Changes of 6-benzylaminopurine and 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid concentrations in plant tissue culture media in the presence of activated charcoal. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 33: 157-162.

Flores-Benítez S. Jiménez-Bremont J.F. Rosales-Mendoza S. ArgüelloAstorga G.R. Castillo-Collazo R. & Alpuche-Solís AG. 2007. Genetic transformation of Agave salmiana by Agrobacterium tumefaciens and particle bombardment. Plant Cell Tiss. Org . Cult. 91 : 215-224.

Gasparis S. Bregier C. Orczyk W. Nadolska-Orczyk A 2008. Agrobacteriummediated transformation of oat (Avena sativa L.) cultivars via immature embryo and leaf explants. Plant Cell Rep. 27: 1721-1729.

González-Estrada T.A. 2000. lnheritance and activity of the early auxin-

92

responsive GH3 prometer and somatic embryogenesis in alfalfa (Medicago sativa L.) , 191p. Ph .D. Thesis. University of Guelph, Guelph, Ontario, Ganada.

Hansch R. Koprek T. Mendel R.R. & Schulze J. 1995. An improved protocol for eliminating endogenous ~-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105: 63-69.

Harrison N.A. & Oropeza C. 2008. Coconut lethal yellowing , pp. 219-248. In: Harrison N.A. Rao G.P. & Marcone C. (Eds), Characterization, Diagnosis and Management of Phytoplasmas, Studium Press LLC, Houston, USA.

Hecht V. Vielle-Calzada J.P. Hartog M.V. Schmidt E.D.L. Boutilier K. Grossniklaus U. & de Vries S.C. 2001 . The Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinase 1 gene is expressed in developing ovules and embryos and enhances embryogenic competence in culture. Plant Physiol. 127: 803-816.

Hellens R. Mullineaux P. & Klee H. 2000. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in Plant Science. 5(10): 446-451.

Hodal L. Bochardt A. Neilson J. E. Mattson O. & Okkels F.T. 1992. Detection , expression and specific eliminaton of endogenous ~-glucuronidase activity in transgenic and non-transgenic plants. Plant Sci. 87: 115-122.

Hornung R. 1995. Micropropagation of Cocos nucifera L from plumular tissue excised from mature zygotic embryos. Plant Rech. Dev. 2: 38-41 .

Hu H. Xiong L. & Yang Y. 2005. Rice SERK1 gene positively regulates somatic embryogenesis of cultured cell and host defense response against fungal infection. Planta. 222: 107-117.

Jefferson R.A. 1987. Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405.

Jordan M.C. 2000. Green fluorescent protein as a visual marker for wheat transformation. Plant Cell Rep. 19: 1069-1075.

Kaeppler H.F. Menan G.K. Skadsen R.W. Nuutila A.M. & Carlson A.R. 2000. Transgenic oat plants via visual selection of cells expressing green fluorescent protein. Plant Cell Rep. 19: 661-666.

Kosugi S. Ohashi Y. Nakajima K. & Arai Y. 1990. An improved assay for ~glucuronidase in transformed cells: methanol almost completely suppresses a putative endogenous ~-glucuronidase activity. Plant Sci. 70: 133-140.

McEiroy D. & Brettell R. 1994. Foreign expression in transgenic cereals. Trends Biotechnol. 12: 62-68.

Micallef M.C. Austin S. & Bingham E.T. 1995. lmprovement of transgenic alfalfa by backcrossing. In Vitro Cell . Dev. Bioi.-Piant. 31 : 187-192.

Muhitch M.J. 1998. Characterization of pedicel ~-glucuronidase activity in developing maize (Zea mays) kernels. Physiol. Plant. 104: 423-430.

93

Li L. Rongda Q. de Kochko A. Fauquet C. & Beachy R. N. 1993. An improved rice transformation system using the biolistic method. Plant Cell Rep. 12: 250-255.

Li Z. Upadhyaya N.M. Meena S. Gibbs A.J . & Waterhouse P.M. 1997. Comparison of promoters and selectable marker genes of use in Indica rice transformation. Mol. Breed. 3: 1-14.

Lucca P. Ye X. & Potrykus l. 2001 . Effective selection and regeneration of transgenic rice plants with mannose as selective agent. Mol. Breed. 7: 43-49.

Montero-Cortés M. Rodríguez-Paredes F. Burgeff C. Pérez-Nuñez M.T. Cordova l. Oropeza C. Verdeil J-L. & Sáenz L. 201 O. Characterisation of a cyclin-dependent kinase (CDKA) gene expressed during somatic embryogenesis of coconut palm. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 102(2): 251-258.

Murashige T. & Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.

Oropeza C. Rillo E. Hocher V. & Verdeil J-L. 2005. Coconut micropropagation, pp. 334-348. In: Batugal P. Rao R.V. & Oliver J. (eds), Coconut Genetic Resources, lnternational Plant Genetic Resources lnstitute-Regional Office for Asia, the Pacific and Oceania (IPGRI-APO), Serdang , Selangor.

Parveez G.K.A. & Christou P. 1998. Biolistic mediated DNA delivery and isolation of transgenic oil palm (Eiaeis guineensis Jacq.) embryogenic callus cultures. J. Oil Palm Res. 10(2): 29-38.


Perera P. l. P. Yakandawala D.M.D. Hocher V. Verdeil J-L. & Weerakoon L. K. 2009. Effect of growth regulators on microspore embryogenesis in coconut anthers. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 96: 171-180.

Pérez-Núñez M.T. Chan J.L. Sáenz L. González T. Verdeil J-L. & Oropeza C. 2006. lmproved somatic embryogenesis from Cocos nucifera (L.) plumule explants. In Vitro Cell Dev. Bioi.-Piant. 42: 37-43.

Pérez-Núñez M.T. Souza R. Sáenz L. Chan J.L. González T. Zúñiga J.J. & Oropeza C. 2009. Detection of a SERK-Iike gene in coconut in vitro cultures and analysis of its expression during the formation of embryogenic callus and somatic embryos. Plant Cell Rep. 28: 11-19.

Ponappa T. Brzozowski A.E. & Finer J.J. 1999. Transient expression and stable transformation of soybean using the jellyfish green fluorescent protein. Plant Cell Rep. 19: 6-12.

Ramli Z. & Abdullah S.N.A. 2003. Development of a transient prometer assay system for oil palm. J. Oll Palm Res. 15(2): 62-69.

94

Richards H.A. Rudas V.A. Sun H. McDaniel J.K. Tomaszewski Z. & Conger B.V. 2001 . Construction of a GFP-BAR plasmid and its use for switchgrass transformation. Plant Cell Rep. 20: 48-54.

Sáenz L. Chan J.L. Souza R. Hornung R. Rillo E. Verdeil J-L. & Oropeza C. 1999. Somatic embryogenesis and regeneration in coconut from plumular explants, pp. 309-319. In : Oropeza C. Verdeil J-L. Ashburner G.R. Cardeña R. & Santamaría J. (eds) , Current Advances in Coconut Biotechnology, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.

Sáenz L. Souza R. Chan J.L. Azpeitia A. & Oropeza C. 2005. 14C-2,4-D Dichlorophenoxyacetic acid uptake and formation of embryogenic calli in coconut plumular explants cultured on activated charcoal-free media. Rev. Fitotec. Mex. 28(2): 151-159.

Sáenz L. Herrera-Herrera G. Uicab-Ballote F. Chan J.L. & Oropeza C. 201 O. lnfluence of form of activated charcoal on embryogenic callus formation in coconut (Cocos nucifera) . Plant Cell Tiss. Org. Cult. 100(3): 301-308.

Santos M.O. Romano E. Vieira L.S. Baldoni A.B. & Aragao F.J.L. 2008. Suppression of SERK gene expression affects fungus tolerance and somatic embryogenesis in transgenic lettuce. Plant Biol. 11 (1 ): 83-89.

Schmidt E.D.L. Guzzo F. Toonen M.A.J. & de Vries S.C. 1997. A leucinerich repeat containing receptor-like kinase marks somatic plant cells competent to form embryos. Development. 124: 2049-2062 .

Solís-Ramos L.Y. González-Estrada T. Nahuath-Dzib S. Zapata-Rodríguez L.C. & Castaño E. 2009. Overexpression of WUSCHEL in Capsicum chinense causes ectopic morphogenesis. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 96: 279-287.

Solís-Ramos L.Y. González-Estrada T. Andrade-Torres A. GodoyHernández G. & Castaño E. 2010. Endogenous GUS-Iike activity in Capsicum chinense Jacq. Electron. J. Biotechnol. 13(3): 1-7.

Somleva M.N. Schmidt E.D.L. & de Vries S.C. 2000. Embryogenic cells in Dactylis glomerata L. (Poaceae) explants identified by cell tracking and by SERK expression. Plant Cell Rep. 19(1): 718-726.

Song D. Li G. Song F. & Zheng Z. 2008. Molecular characterization and expression analysis of OsBISERK1 , a gene encoding a leucine-rich repeat receptor-like kinase, during disease resistance responses in rice. Mol. Biol. Rep. 35(2): 275-283.

Sudan C. Prakash S. Jain P.B.S. & Bhalla-Sarin N. 2006. Ubiquitous presence of r..-glucuronidase (GUS) in plants and its regulation in sorne model plants. Planta. 224: 853-864.

Uzé M. Potrykus l. & Sautter C. 1999. Single-stranded DNA in the genetic transformation of wheat (Triticum aestivum L.) : transformation frequency and integration pattern. Theor. Appl. Genet. 99: 487-495.

95

Valdez-Ortiz A Medina-Godoy S. Valverde M.E. & Paredes-López O. 2007. A transgenic tropical maize line generated by the direct transformation of the embryo-scutellum by A. tumefaciens. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 91 : 201-214.

Verdeil J-L. & Buffard-Morel J. 1995. Somatic embryogenesis in coconut (Cocos nucifera L.} , pp. 299-317. In: Bajaj Y.P.S. (ed) , Biotechnology in agriculture and forestry somatic embryogenesis and synthetic seed 1, vol 30. Springer, Berlín.

Wan Y. & Layton J. 2006. 20 Wheat (Triticum aestivum L.} , pp. 245-253. In: Wang K. (ed) , Agrobacterium Protocols, 2nd Ed ., Volume 1, Methods in molecular biology 343, Humana Press lnc., New Jersey.

Wenzler H. Mignery G. Fisher L. & Park W. 1989. Sucrose-regulated expression of a chimeric patato tuber gene in leaves of transgenic tobacco plants. Plant Mol. Biol. 13: 347-354.

Wilkinson J.E. Twell D. & Lindsey K. 1994. Methanol does not specifically inhibit endogenous ~-glucuronidase (GUS) activity. Plant Sci. 97: 61-7.

Wozniak Ch.A. & Owens L.D. 1994. Native ~-glucuronidase activity in sugarbeet (Beta vu/garis) . Physiol. Plant. 90(4): 763-771 .

Xue R.G. Xie H.F. & Zhang B. 2006. A multi-needle-assisted transformation of soybean cotyledonary node cells. Biotechnol. Lett. 28:1551-1557.

Zizumbo D. Colunga-García Marín P. Fernández-Barrera M. TorresHernández N. & Oropeza C. 2008. Mortality of Mexican coconut germplasm due to lethal yellowing. Plant Genetic Resources Newsletter, FAO-Bioversity. 156: 23-33.

Zuo J. Niu Q . Frugis G. & Chua N. 2002. The WUSCHEL gene prometes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis. Plant J. 30(3): 349-359.

Zupan J.R. & Zambryski P. 1995. Transfer of T-ONA from Agrobacterium to the plant cell. Plant Physiol. 107: 1041-1047.

96

Capítulo 5

Conclusiones y perspectivas.

El cocotero es una especie de alto potencial económico debido a que cada uno de los componentes de la planta presenta una gran variedad de usos. Recientemente se ha demostrado que además puede tener un papel importante tanto en la producción de biodiesel como en el campo de las bebidas energéticas, lo cual le da un valor mayor a la producción de cocotero. Sin embargo, tanto en el contexto nacional como mundial la producción de cocotero ha venido disminuyendo debido principalmente a la incidencia de plagas y enfermedades, al pobre rendimiento de las plantaciones y al uso de variedades de baja producción. Entre las plagas y enfermedades el Amarillamiento Letal (AL) , el anillo rojo y la pudrición del cogollo son las enfermedades más importantes que afectan el cultivo y en la actualidad se considera que una estrategia para enfrentar estos problemas es la replantación con variedades resistentes, lo que además eliminaría el problema de los individuos senescentes. En diferentes partes del mundo se han llevado a cabo estudios sobre selección de genotipos para resistencia a enfermedades u otras características de interés, y los resultados son positivos (Santos 1999; Zizumbo et al. , 1999; Oropeza et al., 2005). Sin embargo, mediante la propagación natural del cocotero, la cual ocurre solo de manera sexual, será muy difícil lograr la rápida propagación de los genotipos selectos o de individuos dentro de estos genotipos para satisfacer la creciente demanda, pues se producen muy pocas semillas por palma además de que la planta tiene un ciclo de vida largo. En este sentido, la clonación in vitro via embriogénesis somática parece ser la alternativa más conveniente de aplicar debido a su gran potencial para la propagación masiva (Oropeza et al., 2005).

A la fecha, después de más de 30 años de estudios y trabajos sobre cultivo in vitro de cocotero, los resultados han sido poco exitosos y aún se reconoce a esta especie como recalcitrante al cultivo in vitro. Aunque se habían utilizado diversos explantes obtenidos de diferentes partes de la palma (Justin , 1978; Pannetier and Buffard-Morel , 1982; Gupta et al., 1984; Raju et al. , 1984) los resultados han sido muy similares en todos los casos y el protocolo que hasta el momento ha probado tener la mejor eficiencia en la regeneración de plantas de cocotero mediante embriogénesis somática a partir de explantes de plúmula es el reportado por Chan et al., (1998) , que recientemente fue mejorado por Pérez-Núñez et al., (2006). Sin embargo, a pesar de que este protocolo es reproducible, aún se requiere mejorar la eficiencia, tanto para la producción de embriones somáticos como para la conversión a plantas, además de que es necesario contar con un protocolo reproducible que permita clonar plantas adultas.

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5.1 MICROPROPAGACIÓN DE COCOTERO A PARTIR DE OVARIO NO FERTILIZADO Y/0 RAQUILLA DE INFLORESCENCIA INMADURA.

Como estrategia para establecer un protocolo para micropropagación de plantas adultas de cocotero, en este trabajo se tomaron como base los trabajos de Pérez-Núñez (2006) , Pérez-Núñez et al. (2006) y Perera et al. (2007) y se buscó primero establecer un protocolo para inducir callo embriogénico a partir de explantes de inflorescencia inmadura, específicamente raquilla y ovario no fertilizado, y una vez obtenido el callo se buscó aplicar el sistema de multiplicación de callo embriogénico que Pérez-Núñez et al., (2006) desarrollaron para explante de plúmula de cocotero. Los resultados obtenidos en este trabajo mostraron que es posible inducir la formación de callo embriogénico a partir de ambos explantes, además es posible realizar la multiplicación del callo embriogénico y la obtención de embriones somáticos en ambos casos, y también es posible la embriogénesis somática secundaria en el caso de raquilla. En ambos casos, a excepción de la etapa de inducción el comportamiento de los callos embriogénicos es muy similar a lo reportado para explante de plúmula, por lo que se considera que existe un gran potencial para continuar trabajando con estos explantes y eventualmente integrar un protocolo eficiente que permita clonar palmas adultas.

Entre las actividades pendientes se encuentra el estudio de la adquisición de competencia embriogénica en los callos en la etapa de inducción, lo cual es crucial entender para poder reducir el tiempo en que se obtiene callo embriogénico o incrementar la eficiencia de producción de callo embriogénico. Al parecer el callo embriogénico de raquilla no pierde su capacidad embriogénica al avanzar los ciclos de multiplicación, mientras que el callo de ovario no fertilizado presenta una disminución, por lo que otro aspecto relevante es determinar si el callo embriogénico desarrollado a partir de ovario no fertilizado pierde su capacidad embriogénica y si la embriogénesis somática secundaria sería suficiente para evitar este problema o si existen requerimientos específicos para este explante que deben ser estudiados. La importancia de estudiar el ovario no fertilizado es debido a que este tipo de explante es más fácil de obtener en campo por la etapa de desarrollo que se requiere para colectarlo, mientras que el explante de raquilla es muy difícil de colectar sin dañar la planta donante, además el ovario no fertilizado da una mejor respuesta inicial a la inducción que la raquilla, por lo que estudiar los requerimientos ya en líneas establecidas in vitro podría ser más factible para este explante.

También es importante realizar los análisis morfológicos e histológicos para demostrar el origen del callo embriogénico en cada explante, así como de los embriones generados en el callo y determinar si es similar a lo que se conoce para plúmula de cocotero, lo cual daría información muy valiosa para incrementar la formación de embriones

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somáticos. Si se determina que con estos explantes se tienen las mismas características de crecimiento a partir de regiones periféricas de los tejidos y que el origen de los embriones somáticos secundarios es unicelular, tal como sucede en plúmula, automáticamente estos explantes serían candidatos para realizar estudios de transformación genética, pues se ha demostrado en otras especies que estas características son favorables para el desarrollo de protocolos de transformación (Po lito et al., 1989; Martinelli et al., 2001 ).

5.2 OBTENCIÓN DEL ADNC COMPLETO DEL GEN CNSERK

El gen SOMA TIC EMBRIOGÉNESIS RECEPTOR LIKE-KINASE (SER K) ha sido reportado como marcador de embriogénesis en plantas, tanto dicotiledóneas como monocotiledóneas. En el presente trabajo se consideró obtener mediante RT-PCR el ADNc completo del gen CnSERK, el cual fue reportado por Pérez-Núñez et al. , (2009) como marcador de embriogénesis en tejidos de cocotero cultivados in vitro. Para este propósito se detectó y aisló en callo embriogénico de cocotero obtenido a partir de plúmula aplicando la estrategia de cebadores específicos diseñados a partir de la secuencia reportada por Pérez-Núñez (2006). El trabajo consistió en amplificar mediante RT-PCR el ADNc completo del gen CnSERK. El estudio de este gen es de gran relevancia para incrementar la eficiencia de producción de embriones somáticos en callo embriogénico de cocotero, puesto que se ha demostrado en otras especies que su sobre-expresión en tejidos cultivados in vitro induce una mayor respuesta embriogénica, lo que lo convierte en un candidato ideal para incluirlo en la construcción de un vector para transformación genética de tejido de cocotero y analizar su expresión en el tejido transformado.

Los resultados de este trabajo indicaron que la secuencia de aminoácidos del gen CnSERKAA T amplificado en este estudio tiene una extensión de 629 aminoácidos similar a la reportada por Pérez-Núñez et al., (2009) para CnSERK (GenBank AY791293) y mostró alineación con más de 50 accesiones correspondientes a genes SERK reportados para diferentes especies vegetales, incluyendo monocotiledóneas, dicotiledóneas, coníferas, y musgos. Al comparar la secuencia de aminoácidos obtenida para CnSERKAA T en este trabajo con la reportada para CnSERK por Pérez-Núñez et al., (2009) se observó que son similares con excepción de los aminoácidos 35, 308, 328, 341 , 558 y 608, los cuales difieren, pero no afectan la funcionalidad de la proteína. El análisis de la proteína CnSERKAA T putativa mostró que contiene los dominios característicos reportados para otras proteínas SERK, y que presenta la misma estructura reportada para CnSERK (Pérez-Núñez et al., 2009). Entonces, usando cualquiera de los dos juegos de cebadores diseñados en este trabajo es

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posible amplificar por RT-PCR el ADNc completo del gen CnSERK. El ADNc que se tiene en el vector de clonación puede ser usado para incorporarlo en un plásmido binario para transformación genética mediada por A. tumefaciens. La actividad pendiente sería utilizar este gen en estudios de transformación genética de explantes o callo embriogénico de cocotero para estudiar los efectos que tiene la inducción de la expresión controlada del gen SERK en el tejido in vitro.

5.3 APLICACIÓN DE BIORREACTORES BIOMINT

El actual protocolo de micropropagación de cocotero basado en plúmula tiene una limitante en la eficiencia de la germinación de los embriones somáticos producidos y en el posterior desarrollo de los brotes. Estas etapa se realizan actualmente utilizando medio semisólido (Chan et al., 1998), lo cual puede ser uno de los principales factores limitantes de la eficiencia, ya que en los medios semisólidos las condiciones de cultivo y la exposición a los componentes del medio no son homogéneas para todas las células o tejidos (Robert et al., 2006). La aplicación de biorreactores ha sido muy efectiva para incrementar la eficiencia en el desarrollo de brotes de diferentes especies de plantas, por lo que en este trabajo se aplicó el uso de sistemas de inmersión temporal (biorreactores BioMINT) como una alternativa para incrementar el número de brotes enraizados y generar plántulas con un desarrollo más homogéneo. Los resultados obtenidos mostraron que la aplicación de biorreactores BioMINT con un tratamiento de 2 minutos de inmersión cada 1 h o cada 2h favoreció el desarrollo de brotes de cocotero en comparación con los brotes control (medio sólido) , esto en base a un mejor desarrollo de características importantes como el incremento de número de hojas por brote, el incremento de brotes con raíz y el incremento de longitud de hojas y de raíz. Para otras especies los mejores resultados de elongación de brotes en BioMINT se obtienen aplicando tiempos de aireación largos (5 min de inmersión con 8 horas de aireación) en periodos de sólo 30 días de cultivo en biorreactor y alcanzan una longitud de brote mayor a 5 cm, sin embargo, en cocotero se requieren periodos de 2 min de inmersión con tiempos de aireación cortos y el cultivo en BioMINT debe ser mayor a 100 días para obtener los mejores resultados en elongación de brote, de hoja mayor y aparición de raíces secundarias. No obstante que parece un proceso lento, estos tiempos de cultivo son menores a lo reportado para cocotero en medio semisólido que puede ser de 180 a 270 días (Chan et al., 1998) por lo que se puede considerar que la aplicación del sistema BioMINT a cocotero presenta resultados prometedores para mejorar el actual sistema de micropropagación de cocotero en su etapa final in vitro y generar una mayor cantidad de brotes con características adecuadas para aclimatar y crecer en invernadero.

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Además estos resultados pueden ser aplicables a brotes obtenidos a partir de algún explante alternativo a plúmula, tal como puede ser ovario no fertilizado o raquilla. Entre las actividades pendientes en este sentido estaría el real izar estudios fisiológicos detallados del comportamiento de los brotes durante el cultivo en biorreactor y realizar estudios para determinar los tiempos de inmersión y aireación más adecuados para obtener mayor eficiencia en la respuesta de los brotes en este sistema.

5.4 TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE CALLO EMBRIOGÉNICO DE COCOTERO.

La transformación genética ha mostrado ser una de las técnicas más exitosas para introducir una característica específica al genoma de un cultivo (Webb y Morris, 1992). Mediante transformación genética se ha logrado abatir la recalcitrancia a la morfogénesis in vitro de diferentes especies de plantas así como incrementar su resistencia a diferentes organismos patógenos (Cai et al., 2002; Shin et al., 2002; Zuo et al., 2002; Herrera-Estrella et al., 2004). Mediante la inserción y sobre-expresión de genes relacionados con el control de la morfogénesis como el gen heterólogo WUSCHEL , se logró promover la transición del estado vegetativo al embriogénico en tejido in vitro de Arabidopsis thaliana y Coffea canephora , para eventualmente observar la formación de embriones somáticos (Zuo et al. , 2002; Arroyo-Herrera et al., 2008). En Capsicum chinense, la expresión inducida del gen WUSCHEL disparó la formación de estructuras globulares en segmentos de tallo transformado, sugiriendo que el gen heterólogo WUSCHEL estaba activo y envuelto en el proceso morfogénico en los tejidos (Salís-Ramos et al. , 2009).

Aprovechando los avances obtenidos en este tema por el grupo de estudios en cocotero de la Unidad de Biotecnología del CICY se planteó la realización de ensayos para obtener un protocolo para la transformación genética de callo embriogénico de cocotero que sirva de base para la realización de experimentos y estudios para comprender mejor el proceso de embriogénesis somática en la especie y la expresión de genes específicos durante el proceso. Debido a que los estudios previos habían tenido baja eficiencia de transformación y a que la especie presenta problemas de fenol ización y lento crecimiento in vitro se desarrolló una estrategia para desarrollar un protocolo combinando diferentes técnicas de transformación previamente empleadas con el fin de incrementar la eficiencia de transformación del tejido de cocotero. Los resultados obtenidos utilizando la cepa de Agrobacterium tumefaciens C58C 1 + pER 1 OW-35SRed (contiene el gen WUSCHEL relacionado con embriogénesis somática) , mostraron que el protocolo combinado (biobalística + infiltración + cacultivo) presenta mayor eficiencia de transformación que cualquiera de las

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técnicas aplicada de manera individual. Los callos embriogénicos transformados mediante este protocolo combinado presentaron mayor fluorescencia con mayor intensidad y en áreas del callo mayores que los callos transformados solamente por infiltración o por ca-cultivo. La amplificación por PCR a partir de ADN extraído de callos transformados con este método produce una banda del tamaño esperado cuando se aplican los cebadores específicos para el gen heterólogo WUSCHEL (862 pb) mientras que si se usan los cebadores para el gen VirE2 , que permiten identificar la presencia de la bacteria en tejido, no se obtiene amplificación de banda. Este trabajo constituyó el primer reporte de un sistema combinado que permite la transformación transitoria de callos embriogénicos de cocotero y se considera un paso importante para el establecimiento de un sistema de transformación que tendrá utilidad para el estudio del papel de diferentes genes durante el proceso de embriogénesis somática de cocotero, además de que tiene aplicaciones prácticas como son la introducción de características de interés al cultivo como puede ser la resistencia a patógenos. Entre las actividades pendientes está el estudio del comportamiento in vitro de los callos transformados y el estudio del efecto de la inducción de la expresión de genes relacionados con la embriogénesis somática. También es necesario determinar una mejor estrategia para inducir la expresión de los genes introducidos, pues los promotores inducibles utilizados en este trabajo no han dado los mejores resultados, debido a que el cocotero presenta requerimientos de cultivo in vitro específicas que son muy distintas a las que se aplican a otras especies que se han transformado. Es muy importante continuar desarrollando experimentos de transformación y buscar determinar las mejores condiciones para poder multiplicar el callo embriogénico transformado y obtener embriones somáticos, así como evaluar después de ciclos de multiplicación el comportamiento o la heredabilidad de los genes introducidos, para determinar la posibilidad de obtener líneas embriogénicas que mantengan el gen o genes introducidos con este método.

En conjunto, todos estos resultados muestran que estamos muy cerca de poder inducir la embriogénesis a partir de explantes alternativos a la plúmula, y de hacer mucho más eficiente el sistema de micropropagación de cocotero, con lo cual se estará dando un gran paso para resolver aspectos importantes para el mejoramiento y manejo de la especie.

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Arroyo-Herrera, A. , A. Ku , R. Canche, F. Quiróz-Figueroa, V.M. Loyola, L.C. Rodríguez, C. Burgueff, V.M. Suárez and E. Castaño. 2008. Expression of WUSCHEL in Coffea canephora causes ectopic morphogenesis and increases somatic embryogenesis. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 94: 171-180.

Cai , W., Rong-Xiang, F., Feng-Li, Z., Jiu-Chun, Z. , Xiaoying , CH ., Gui-ling, W., K-Qiang , M., Hong-Sheng, S. , Xu , W. , and Yue-Ren L. 2002. Virus-resistant Chili pepper produced by Agrobacterium speciesmediated transformation. In Khachatourians, G., Mc.Hughen, Scorza, R. , Nip, W.K., Hui, Y.H. Transgenic plants and Crops. Maree! Dekker, lnc. N.Y. 563-577.

Gupta P.K., Kendurka S.V. , Kulkarni V.M., Shirgurkar M.V., Mascarenhas A. F. 1984. Somatic embryogenesis and plants from zygotic embryos of coconut (Cocos nucifera L. ) in vitro. Plant Cell Rep 3: 222-225.

Herrera-Estrella, L. , Simpson, J. , and Martínez-Trujillo, M. 2004. Transgenic Plants. An historical perspective. In: Peña, L. Transgenic Plants. Methods and Protocols. Humana Press. Pp. 286: 3-31 .

Justin, S.H.F.W. 1978. Vegetative propagation of coconuts. Report East Mailing Research Station . 1977. pp 75-176.

Martinelli L. , Candioli E., Costa D., Poletti D., and Rascio N. 2001 . Morphogenic competence of Vitis rupestris S. secondary somatic embryos with a long culture history. Plant Cell Rep. 20 (4) : 279-284.

Oropeza C. Rillo E. Hocher V. & Verdeil J-L. 2005. Coconut micropropagation , pp. 334-348. In: Batugal P. Rao R.V. & Oliver J. (eds) , Coconut Genetic Resources, lnternational Plant Genetic Resources lnstitute-Regional Office for Asia, the Pacific and Oceania (IPGRI-APO), Serdang, Selangor.

Pannetier, C., and J. Buffard-Morel. 1982. Premiers r'esultats concernant la production d'embryons somatiques ·a partir de tissus foliaires de cocotier, Cocos nucifera L. Oleagineux. 37:349-354.


Pérez-Núñez, M.T. 2006. Embriogénesis somática en cocotero: estudios sobre aspectos del desarrollo y mejoramiento de la eficiencia. Tesis de Doctorado. CICY. Mérida, Yucatán. 95p.

Pérez-Núñez, M.T. , J.L. Chan, L. Sáenz, T. González, J.L. Verdeil , and C. Oropeza. 2006. lmproved Somatic Embryogenesis from Cocos nucifera (L.) Plumule Explants. In Vitre Cell. Dev. Biol. Plant. 42:37-43.

Pérez-Núñez M.T. Souza R. Sáenz L. Chan J.L. González T. Zúñiga J.J. &

103

Oropeza C. 2009. Detection of a SERK-Iike gene in coconut in vitro cultures and analysis of its expression during the formation of embryogenic callus and somatic embryos. Plant Cell Rep. 28: 11-19.

Polito V.S., McGranahan G. , Pinney K. , and Leslie Ch. 1989. Origin of somatic embryos from repetitively embryogenic cultures of walnut (Jug/ans regia L.) : lmplications for Agrobacterium-mediated transformation . Plan Cell Rep. 8(4) : 219-221 .

Raju C.R. , Prakash Kumar P., Chandramohan M., and lyer R.D. 1984. Coconut plantlets from leaf tissue cultures. Journal of Plantation Crops 12:75-81 .

Robert, M.L. , J.L. Herrera-Herrera, G. Herrera-Herrera and M.A. HerreraAiamillo. 2006. Chapter 11 . A new temporary inmersion bioreactor system for micropropagation. In: Loyola-Vargas, V.M. and F. Vázquez-Fiota (ed). Methods in Molecular Biology. Vol. 318. Plant Cell Culture Protocols. Human Press lnc. New Jersey. 121-129.

Santos, G.A. 1999. Potencial use of clonal propagation in coconut improvement programs. In: Oropeza C., F.W. Howard and G.R. Ashburner (Eds) . Lethal Yellowing Research and Practica! Aspects. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. Pp 419-430.

Shin R. , Park J., An J.M. and Paek K.H. 2002. Ectopic expression of Tsi1 in transgenic hot pepper plants enhaces host resistance to viral , bacteria! , and oomycete pahogens. The American Phytopathological Society. MPMI. 15 (1 0) : 983-989.

Solís-Ramos L.Y. González-Estrada T. Nahuath-Dzib S. Zapata-Rodríguez L.C. and Castaño E. 2009. Overexpression of WUSCHEL in Capsicum chinense causes ectopic morphogenesis. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 96: 279-287.

Webb K.J ., and Morris P. 1992. Methodologies of plant transformation . In: Gatehouse, A.M .R. , Hilder, V.A. , and Boulter, D. (Eds). Plant Genetic Manipulation for Crop Protection. CAB lnternational. Wallinford , UK. Pp. 7-43.

Zizumbo, D., Fernández, M., Torres, H., Cardeña, R. 1999. Lethal Yellowing resistance germplasm from Mexico. In: Oropeza, C., Verdeil , J-L. Ashburner, G.R. Cardeña, R. and Santamaria J.M. (Eds). Current Advances in Coconut Biotechnology. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, The Netherlands, pp. 131-144.

Zuo J., Q. Niu , G. Frugis and N. Chua, 2002. The WUSCHEL gene promotes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis. The Plant Journal 30 (3): 349-359.

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