comparaciÓn de medios de cultivo en la micropropagaciÓn de
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UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
COMPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO EN LA MICROPROPAGACIÓN DE PIÑA (Ananas comosus L.
Merr) A PARTIR DE YEMAS AXILARES E HIJOS BASALES
TRABAJO EXPERIMENTAL
Trabajo de titulación presentado como requisito para la obtención del título de
INGENIERO AGRÓNOMO
AUTOR BAQUE ANCHUNDIA LISBETH ALLISON
TUTORA PhD. ARIADNE VEGAS GARCÍA
GUAYAQUIL – ECUADOR
2019
2
UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
APROBACIÓN DEL TUTOR
3
UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÒN
4
Dedicatoria
A Dios, principalmente por darme la oportunidad de
haber culminado esta etapa profesional, pese a toda
circunstancia nunca me abandonó, sin El nada de
esto hubiese sido posible por eso y mucho más esto
se lo dedico con todo el amor del mundo.
A mis padres, por estar y ser pilar fundamental en mi
vida y toda mi carrera, mi mamá Ana por darme sus
consejos cuando más lo he necesitado; mi papá
Orlando que sin duda alguna ha sido mi mejor
ejemplo y a pesar de las dificultades y obstáculos
me demuestra que puedo contar con el siempre.
A mis padrinos Mayra y Rodolfo, quienes han puesto
su granito de arena en absolutamente todo, por su
infinito apoyo.
Mi abuelita Julia por ser parte de mi meta alcanzada
y al resto de mis familiares.
5
Agradecimiento
Mi eterno agradecimiento que nunca será suficiente
para la persona más importante en mi vida, Jesús.
Para aquellas personas que siempre estuvieron
apoyándome, ya sea con una palabra de aliento o
simplemente dándome ánimos y fuerzas para seguir
adelante y no rendirme en todo el arduo proceso.
Agradezco a mi tutor de tesis la Dra. Ariadne Vegas,
por su ayuda incondicional durante todo el trabajo,
por corregirme y guiarme hasta el último momento,
por su eterna disposición muchas gracias.
A mis compañeros Robin Vera, Angelo Toledo,
Milena Garcés, Karissa Otero y Bianca Macías por
su compañía en todo el trabajo realizado en
laboratorio.
6
Autorización de autoría intelectual
7
Índice general PORTADA ………………………………………………………………………………...1
APROBACIÓN DEL TUTOR ................................................................................. 2
APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÒN ......................................... 3
Dedicatoria .......................................................................................................... 4
Agradecimiento .................................................................................................... 5
Autorización de autoría intelectual ..................................................................... 6
Índice general ....................................................................................................... 7
Índice de tablas .................................................................................................. 12
Índice de figuras ................................................................................................ 13
Resumen ............................................................................................................. 15
Abstract .............................................................................................................. 16
1. Introducción .................................................................................................. 17
1.1 Antecedentes del problema......................................................................... 17
1.2 Planteamiento y formulación del problema ............................................... 18
1.2.1 Planteamiento del problema ................................................................ 18
1.2.2 Formulación del problema ................................................................... 19
1.3 Justificación ................................................................................................. 19
1.4 Delimitación de la investigación ................................................................. 19
1.5 Objetivo general ........................................................................................... 20
1.6 Objetivos específicos .................................................................................. 20
1.7 Hipótesis ....................................................................................................... 20
2. Marco teórico ................................................................................................. 21
2.1 Estado del arte ............................................................................................. 21
2.2 Bases teóricas .............................................................................................. 22
2.2.1 Generalidades de la piña ...................................................................... 22
8
2.2.2 Taxonomía de la piña ............................................................................ 22
2.2.3 Descripción botánica de la piña ........................................................... 23
2.2.4 Variedades de piña cultivadas en el Ecuador ..................................... 24
2.2.5 Requerimientos edafoclimatológicos del cultivo de piña .................. 25
2.2.6 Requerimientos agronómicos del cultivo de piña .............................. 26
2.2.6.1. Fertilización ....................................................................................... 26
2.2.6.2. Riego .................................................................................................. 26
2.2.6.3. Control de plagas y enfermedades .................................................. 27
2.2.6.4. Métodos de propagación .................................................................. 28
2.2.6.4.1. Propagación vegetativa ................................................................. 28
2.2.6.4.2. Propagación in vitro o micropropagación .................................... 29
2.2.6.5. Medios de cultivo para micropropagación ...................................... 31
2.2.6.5.1. Composición de medios de cultivo para células vegetales ........ 31
2.2.7 Mantenimiento de la asepsia ................................................................ 32
2.2.8 Latencia ................................................................................................. 33
2.3 Marco Legal .................................................................................................. 33
2.3.1 Constitución de la República del Ecuador (2008) ............................... 33
3. Materiales y métodos ..................................................................................... 35
3.1 Enfoque de la investigación ........................................................................ 35
3.1.1 Tipo de investigación ........................................................................... 35
3.1.2 Diseño de investigación ....................................................................... 35
3.1.2.1. Investigación experimental .............................................................. 35
3.1.2.2. Investigación descriptiva ................................................................. 35
3.1.2.3. Investigación explicativa .................................................................. 35
3.2 Metodología .................................................................................................. 35
9
3.2.1 Variables ................................................................................................ 38
3.2.1.1. Variable independiente ..................................................................... 38
3.2.1.2. Variable dependiente ........................................................................ 39
3.2.2 Tratamientos ......................................................................................... 39
3.2.3 Diseño experimental ............................................................................. 39
3.2.4 Recolección de datos ........................................................................... 39
3.2.4.1. Recursos............................................................................................ 39
3.2.4.1.1. Materiales y herramientas ............................................................. 39
3.2.4.1.2. Material experimental ..................................................................... 39
3.2.4.1.3. Recursos humanos ........................................................................ 40
3.2.4.1.4. Recursos económicos ................................................................... 40
3.2.4.2. Métodos y técnicas ........................................................................... 40
3.2.4.2.1. Método inductivo ........................................................................... 40
3.2.4.2.2. Método deductivo .......................................................................... 40
3.2.4.2.3. Método sintético ............................................................................. 40
3.2.5. Análisis estadístico .............................................................................. 40
3.2.5.1. Análisis funcional ............................................................................. 40
3.2.5.2. Andeva no paramétrica Prueba de Kruskal-Wallis ......................... 41
3.2.5.3. Hipótesis estadísticas....................................................................... 41
3.2.5.4. Delimitación experimental ................................................................ 41
3.2.5.5. Manejo del ensayo ............................................................................ 41
3.2.5.5.1. Preparación .................................................................................... 41
3.2.5.5.2. Material genético ............................................................................ 41
3.2.5.5.3. Dosificación .................................................................................... 42
3.2.5.5.4. Toma de muestra ........................................................................... 42
10
3.2.5.6. Variables a evaluarse ........................................................................ 42
3.2.5.6.1. Tratamientos .................................................................................. 42
3.2.5.6.2. Porcentaje de contaminación ........................................................ 42
3.2.5.6.3. Número de brotes sanos ............................................................... 42
3.2.5.6.4. Porcentaje de oxidación ................................................................ 42
3.3 Aspectos administrativos ............................................................................ 42
3.3.1 Recursos bibliográficos ....................................................................... 42
3.3.2 Materiales y equipos ............................................................................. 43
3.3.3 Recursos humanos ............................................................................... 43
4. Resultados ...................................................................................................... 44
4.1 Determinar el mejor método de desinfección de yemas axilares de la
corona e hijos basales ................................................................................ 44
4.1.1 Porcentaje de contaminación y oxidación .......................................... 44
4.1.1.1. Primera siembra ................................................................................ 44
4.1.1.2. Segunda siembra .............................................................................. 44
4.1.1.3. Tercera siembra ................................................................................ 45
4.1.1.4. Cuarta siembra .................................................................................. 46
4.1.1.5. Quinta siembra .................................................................................. 47
4.1.1.5.1 Medio de cultivo liquido ................................................................. 47
4.2 Establecer el mejor medio de cultivo para obtener la iniciación de
yemas axilares ............................................................................................. 50
4.2.1 Número de brotes sanos ...................................................................... 50
4.2.2 Porcentaje de oxidación ....................................................................... 51
5. Discusión ........................................................................................................ 53
6. Conclusiones ................................................................................................. 56
11
7. Recomendaciones ......................................................................................... 57
8. Bibliografía ..................................................................................................... 58
9. Anexos ............................................................................................................ 66
12
Índice de tablas
Tabla 1. Jerarquía nomenclatural de la piña ....................................................... 23
Tabla 2. Procedimiento de siembra ..................................................................... 38
Tabla 3. Descripción de los tratamientos a utilizar .............................................. 39
Tabla 4. Experimento .......................................................................................... 41
Tabla 5. Prueba T para muestras Independientes en la primera siembra de
yemas axilares de la corona e hijos basales. ....................................... 44
Tabla 6. Prueba T para muestras Independientes (luz: desinfección cloro 3%) ... 45
Tabla 7. Prueba T para muestras Independientes (oscuridad y luz: desinfección
cloro 3%) ............................................................................................... 46
Tabla 8. Prueba T para muestras Independientes (oscuridad y luz: desinfección
cloro 4%) ............................................................................................... 46
Tabla 9. Prueba T para muestras Independientes (oscuridad y luz: desinfección
cloro 4%) ............................................................................................... 47
Tabla 10. Anava Prueba de Kruskal Wallis para coronas ..................................... 48
Tabla 11. Anava Prueba de Kruskal Wallis para hijos .......................................... 49
Tabla 12. Descripción de la contaminación en las cinco siembras realizadas ...... 50
13
Índice de figuras
Figura 1. Formula T-student ................................................................................. 40
Figura 2. Formula prueba de Kruskal-Wallis ........................................................ 41
Figura 3. Mapa de ubicación ................................................................................ 66
Figura 4. A: Recolección de piña para obtención de los explantes; B: Explantes
de piña de corona e hijos; C: Desinfección de los explantes en
detergente; D: Desinfección de los explantes en cloro 1.8% en
cámara de flujo laminar. ........................................................................ 66
Figura 5. A: Primera siembra en medios de cultivos sólidos; B: contaminación
de primera siembra. .............................................................................. 67
Figura 6. A: Segunda siembra; B: Contaminación de segunda siembra; C:
Contaminación de coronas; D: Contaminación de hijuelos. ............... 67
Figura 7. A: Tercera siembra; B: Coronas contaminadas; C: Presencia de
bacteria en coronas; D: Hijuelos contaminados. ................................... 68
Figura 8. A: Cuarta siembra; B, C, D: Presencia de bacterias en explantes de
coronas e hijos. .................................................................................. 68
Figura 9. A: Quinta siembra de explantes en medios líquidos en condiciones de
oscuridad; B, C, D: Explantes con presencia de coloración marrón en
condiciones de luz. ............................................................................... 69
Figura 10. A: Hijuelos con presencia de bacteria; B: Explante (hijo) con una leve
brotación; C: Resiembra del explante verde. ...................................... 69
Figura 11. A: Resiembra de los explantes de medios líquidos en medios
sólidos; B: Explante oxidado; C: Explante con las mismas
características desde el inicio de siembra; D: Explante que presentó
una leve brotación; E: Explante oxidado. ............................................ 70
14
Figura 12. A: Explantes sin presencia de brotes .................................................. 70
15
Resumen
En Ecuador, la producción de piña (Ananas comosus L. Merr.) ha cobrado un
importante auge en los últimos años. Las técnicas de cultivo in vitro en esta
siembra, se han utilizado con el fin de obtener mayor cantidad de plantas sanas
libres de patógenos. En este estudio se busca comparar medios de cultivo en la
micropropagación de piña var. Cayena a partir de yemas axilares de la corona e
hijuelos y se realizó en el laboratorio de Biotecnología de la Universidad Agraria
del Ecuador. Se utilizó un diseño completamente al azar, en la fase inicial
compuesto de cuatro tratamientos: MS suplementado con BAP (1.0 y 2 mg. L-1),
ANA (0.01, 0.5 y 2.0 mg. L-1) y Tiamina (5 mg. L-1). Se realizaron cinco siembras
iniciales con diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio al 1.8, 3 y 4 %
durante el proceso de desinfección. La alta contaminación por hongos y bacterias
de los ápices en las primeras dos siembras fue reducida significativamente (del 80
al 28 %) incrementando la concentración de cloro al 4 % en el proceso de
desinfección. La oxidación fenólica fue un problema en las siembras iniciales y se
pudo disminuir (del 60 al 10 %) cuando los explantes iniciados se mantuvieron en
condiciones de oscuridad. Aun cuando se incrementaron las concentraciones de
BAP y tiamina en los medios de cultivo líquidos y sólidos, ningún tratamiento tuvo
efecto para la inducción de la brotación de las yemas axilares de coronas e hijos
basales.
Palabras clave: ápices, contaminación, desinfección, latencia, oxidación.
16
Abstract
In Ecuador, pineapple production (Ananas comosus L. Merr.) has reached a
significant boom in recent years. In vitro culture techniques in this crop have been
used in order to obtain healthy plants free of pathogen. This study seeks to
compare culture media in the micropropagation of pineapple var. Cayenne from
axillary crown buds and offspring and was carried out in the Biotechnology
Laboratory of the Agricultural University of Ecuador. A completely randomized
design was used, in the initial phase composed of four treatments: MS
supplemented with BAP (1.0 and 2 mg. L-1), ANA (0.01, 0.5 and 2.0 mg. L-1) and
Tiamina (5 mg. L-1). Five initial seedlings were carried out with different
concentrations of sodium hypochlorite at 1.8, 3 and 4% during the disinfection
process. High fungal and bacterial contamination of apex in the first and second
seedlings was significantly reduced (from 80 to 28 %) by increasing the chlorine
concentration to 4 % in the disinfection process. Phenolic oxidation was a problem
in the initial seedlings and could be decreased (from 60 to 10 %) when the initiated
explants were kept in dark conditions. Although concentrations of BAP and
thiamine increased in means of cultivation liquids and solids, no treatment had
effect for the induction of the sprouting of the axillary buds of crowns and basal
offspring.
Keywords: apex, contamination, disinfection, latency, oxidation.
17
1. Introducción
1.1 Antecedentes del problema
En Ecuador, la producción de piña (Ananas comosus L. Merr) ha cobrado un
importante auge en los últimos años, debido a su demanda en los mercados
internacionales MAGAP, (2014). Razón por la cual, muchos productores se han
interesado en incursionar en este mercado; sin embargo, son varios los
problemas que deben superarse para obtener buenos rendimientos Pineda,
et.al., (2014). En primer lugar, se encuentra la alta inversión monetaria,
especialmente para evitar las plagas y enfermedades, en segundo lugar, el
largo tiempo (al menos dos años) que se requiere para la cosecha de los frutos
y la obtención de dividendos, y por último la falta de programación en las
cosechas (BANACOL, 2016a).
Aunado a lo antes citado, podemos mencionar la falta de capacitaciones
dirigidas a los productores, tanto en el manejo agronómico como en el manejo
de postcosecha con el fin de optimizar el rendimiento de este cultivo Moreira y
Uguña, (2018). Por tal motivo ha sido difícil obtener frutos con estándares
internacionales de comercialización, que en este rubro son determinados por
los grados Brix y la acidez, y se encuentran estrechamente relacionados con
una buena fertilización y manejo agronómico del cultivo (MAGAP-
AGROCALIDAD, 2016).
“Entre las alternativas disponibles para solventar los problemas del cultivo de
piña, se puede mencionar la micropropagación, la cual incrementa la
producción de plantas sanas libres de patógenos en grandes volúmenes en
corto tiempo y garantiza la estabilidad genética del cultivar a propagar” (Kessel,
2013).
18
En Ecuador, existen precedentes de estudios en biotecnología aplicada al
cultivo de Ananas, especialmente a las variedades Champaka y Hawaiana
Saucedo et.al., (2007), y el híbrido MD-2 Suárez, (2011); sin embargo, aún
queda mucho por evaluar en el ámbito de la micropropagación, y es imperativo
lograr un protocolo estandarizado de excelentes resultados para la propagación
efectiva de este fruto.
1.2 Planteamiento y formulación del problema
1.2.1 Planteamiento del problema
La piña como muchas frutas, presenta un elevado valor nutricional además de
aportar otros elementos como fibra, por lo tanto, su consumo es de vital
importancia para el buen desarrollo del cuerpo humano Alves, et al., (2006).
Razón por la cual, incrementar la producción de este cultivo representa un reto
diario.
La micropropagación de piña a partir de yemas axilares in vitro es un método
para obtener plantas vigorosas y sanas libres de cualquier patógeno, como
Phythopthora parasitica y Pectobacterium carotovora. Este fruto se propaga
comercialmente de forma asexual a partir de hijos basales, lo cual genera una alta
tasa de transmisión de enfermedades Christianson y Warnick, (1983). De ahí la
importancia de producción de vitroplantas sanas. Adicionalmente, es necesario
realizar estudios para buscar frutos que no solo suplan las necesidades de
alimentación, sino que aporten con una alta cantidad de nutrientes, que llenen de
energía al organismo y que estén al alcance económico de un alto porcentaje de
la población y mejoren la calidad de vida de las personas.
19
1.2.2 Formulación del problema
¿Mediante la micropropagación in vitro de piña (Ananas comosus L. Merr),
variedad Cayena a partir de yemas axilares de la corona e hijos basales se
logrará la producción de semilla asexual in vitro selectas y libres de
enfermedades?
1.3 Justificación
Las técnicas de cultivo in vitro en piña, se han utilizado con el fin de obtener
mayor cantidad de plantas, pese a ello, los informes que lo referencian son
escasos en el Ecuador y en dichos estudios se han utilizado otras variedades,
creando así la necesidad de profundizar en las investigaciones concernientes a
esta fruta de gran importancia tanto en la seguridad alimentaria, salud y
agricultura.
El presente trabajo de investigación se justifica por la incidencia de plagas y
enfermedades que constantemente presenta el cultivo de piña y la posible
infección de la semilla comercial (hijos basales) y con la perspectiva de obtener
plantas sanas de piña debido a los problemas fitosanitarios que presenta.
Realizar este trabajo es fundamental para lograr producir en un tiempo corto
plantas genéticamente idénticas, uniformes fisiológicamente, de desarrollo normal
y libre de patógenos que puedan ser aclimatadas en un período de tiempo
reducido.
1.4 Delimitación de la investigación
Espacio: El trabajo investigación se lo realizó en el laboratorio de la
Universidad Agraria del Ecuador.
Tiempo: Duración 6 meses.
20
1.5 Objetivo general
Comparar medios de cultivo en la micropropagación de Ananas comosus var.
Cayena a partir de yemas axilares de la corona e hijos basales.
1.6 Objetivos específicos
Determinar el mejor método de desinfección de yemas axilares de la corona
e hijos basales.
Establecer el mejor medio de cultivo para obtener la iniciación de yemas
axilares
Identificar el mejor medio de cultivo para la multiplicación de brotes
obtenidos en la fase de iniciación.
1.7 Hipótesis
Al menos uno de los tratamientos empleados resultará eficaz para la
micropropagación de piña a partir de yemas axilares de la corona e hijos basales.
21
2. Marco teórico
2.1 Estado del arte
Según MAGAP (2014) la producción de piña en Ecuador ha venido en aumento
(3.66%) respecto al año anterior, a pesar de registrarse una disminución de
superficie cultivada. Esta tendencia se ha mantenido hasta el presente año. La
producción de este fruto presenta una serie de problemas de plagas y
enfermedades.
Carrillo y Burgos (2015) menciona que la piña es el segundo cultivo tropical de
importancia mundial después del banano, aportando más del 20% del volumen
mundial de frutos tropicales. Ecuador es uno de los países en vías de
desarrollo y con la mayor diversidad de clima tropical seco y húmedo, es muy
rico en su flora y fauna. Posee gran gama de variedades de piña, que son
apetecidas en los mercados americanos y europeos; debido a que es muy
reconocida por sus grandes propiedades nutritivas, sabor y aroma inigualable
Saucedo, et al., (2008).
Ecuador es un país privilegiado debido a que posee grandes extensiones de
tierra que cumplen con los requisitos edafoclimáticos requeridos para un cultivo
con calidad. Las zonas principales en donde se cultiva la piña son: Quevedo,
Santo Domingo de los Tsáchilas, Santa Elena, Yaguachi, Milagro, Huaquillas,
Arenillas, Pasaje, Buena Fe, Portoviejo, Chone, San Lorenzo, entre otras. Las
variedades más cultivadas son Española roja, Cabezona, Cayena Lisa,
Champaka, entre otras (Revista Lideres, 2015).
22
2.2 Bases teóricas
2.2.1 Generalidades de la piña
“Ananas comosus L. Merr es una planta exuberante conocida más que por su
belleza, por el sabor del fruto al cual se le nombra comúnmente como piña,
pinneaple (inglés), ananá o matzatli” Asohofrucol, (2018).
Según Suárez (2011) “la piña es una fruta tropical originaria del sur de Brasil y
Paraguay, de gran importancia comercial, esto se debe a la gran aceptación del
fruto por parte de los consumidores a nivel mundial”.
Exactamente no se ha logrado determinar la fecha en que la fruta fue difundida
al resto de zonas tropicales de América, pero lo que sí se sabe con certeza es
que la piña fue cultivada en Europa a finales del siglo XVII y que entre los
siglos XVIII y XIX la productividad de la piña estaba totalmente desarrollada a
lo largo del continente y al resto del mundo. (Ramos, 2000).
2.2.2 Taxonomía de la piña
Fue descrita inicialmente en 1754 por Carl Von Linneo, de unos especímenes
cultivados, bajo el nombre de Bromelia comosa. Posteriormente, en 1917, Elmer
Merrill reinterpreta este género, determina que B. comosa pertenece al taxa
Ananas. Desde entonces hasta la fecha la clasificación taxonómica de la piña es
la siguiente:
23
Tabla 1. Jerarquía nomenclatural de la piña
Clase Equisetopsida
Subclase Magnoliidae
Superorder Lilianae Takht.
Orden Poales Small
Familia Bromeliaceae Juss
Género Ananas Mill
Especie A. comosus
Tropicos (2018).
2.2.3 Descripción botánica de la piña
Según Sandoval y Torres (2011) Ananas comosus se caracteriza por presentar
las siguientes características organográficas de sus partes:
2.2.3.1. Raíz
Típicamente fasciculada, superficial se localiza entre los primeros 15 cm del
suelo.
2.2.3.2. Tallo
De apariencia acaule, el cual luego de 1 – 3 años crece en longitud,
presentándose un vástago rojizo completamente cubierto por las hojas, de
consistencia carnosa.
2.2.3.3. Hojas
Hojas simples, rígidas, en roseta basal, sésiles, lanceoladas de 30 a 100 cm
largo, estrechamente imbricadas, ligeramente cóncavas, con márgenes con
espinas de puntas cortas o enteras, según la variedad.
24
2.2.3.4. Inflorescencia
Las inflorescencias aparecen en el ápice del tallo, en forma de espiga
fusionada, la cual alberga entre 100 y 200 flores. Las flores son hermafroditas,
trímeras, sésiles, con brácteas inconspicuas, los sépalos externos apenas
asimétricos y libres, de ovario súpero.
2.2.3.5. Frutos
Es una infrutescencia o sincarpio, de forma entre cilíndrica hasta piramidal,
dependiendo de la variedad. Su centro es fibroso, se forma a partir del tallo axial
engrosado, y las paredes del ovario, la base de la bráctea y los sépalos se
transforman en una pulpa amarilla, apenas fibrosa, dulce y ácida, muy fragante.
La flor se transforma en un escudete octogonal de cubierta dura, formada por la
fusión del ápice de la bráctea y los tres sépalos, que formarán la dura piel cerúlea
y espinosa del fruto. La cavidad de la flor endurece sus paredes.
2.2.4 Variedades de piña cultivadas en el Ecuador
Entre las Ananas más cultivadas en el Ecuador encontramos:
2.2.4.1. Variedad Perolera
Es la mayormente cultivada para el consumo en fresco del Ecuador. Este cultivar posee hijos sin espinas. El fruto maduro es cilíndrico de color amarillo anaranjado y con pulpa de color amarillo cremosa, con ojos profundos, predomina una sola corona; dependiendo del manejo del cultivo pueden pesar entre 600 y más de 3000 g. (Jiménez, 2005, p.62). La pulpa es medianamente fibrosa, altamente apetecible suculenta y refrescante, con 13 a 16º Brix, por tal razón es preferida para su consumo en fresco; además es resistente al manipuleo y transporte, por lo que es la mayormente cultivada para el consumo nacional. Además, se considera resistente a Phytophthora (Moreira y Uguña, 2018, p.3). 2.2.4.2. Variedad Cayena Lisa
No posee espinas, se cultiva en menor proporción que la Perolera; el fruto es cilíndrico y alargado de color amarillo naranja con un peso promedio de 2,5 Kg, sin embargo, eso depende del manejo del cultivo, en la realidad se observan tamaños desde 500 hasta más de 3000 g. El contenido de fibra es bajo y el
25
porcentaje de jugo alto; la pulpa tiene un color amarillento a dorado y posee un alto contenido de azucares, es firme y resistente, con una buena duración postcosecha. La desventaja de este cultivar es que emite un bajo número de hijos o retoños (Consejo Nacional de Producción, 2014).
2.2.4.3. Variedad MD-2 (Golden Sweet)
Pertenece al grupo Cayena, es cultivada exclusivamente con fines de
exportación, aunque aquella fruta que no cumple con los estándares de calidad
se la comercializa para mercado local. Este híbrido se caracteriza por alcanzar
aproximadamente cinco veces más de contenido de ácido ascórbico (Vitamina
C) que las demás variedades. En el mundo se la conoce con varios nombres
comerciales, el más difundido es Golden Sweet; otros son Premium Select; Sun
Ripe; Supersweet Pineapple, entre otros (Alatorre, 2012, p.86).
2.2.5 Requerimientos edafoclimatológicos del cultivo de piña
Entre las buenas prácticas agrícolas para el cultivo de piña se recomienda las
siguientes condiciones edafoclimáticas:
2.2.5.1. Clima
“La piña se puede sembrar desde el nivel del mar hasta los 800 m de altitud,
con un rango de temperatura entre 20 y 30 ºC. Se ha registrado que a mayores
altitudes se ve afectada la acidez de la fruta” (Sandoval y Torres, 2011).
2.2.5.2. Precipitación
El óptimo de precipitación debe encontrarse entre 1200 – 2000 mm por año,
siendo los requerimientos mínimos diarios de aproximadamente 50 mm. De
presentarse una precipitación anual menor a 1200 mm, se debe pensar en la
necesidad de riego (García y Rodríguez, 2016).
2.2.5.3. Luminosidad
Este factor afecta directamente el rendimiento del cultivo, una deficiencia de luz
genera frutos opacos, un exceso de luz por su parte quema la planta. Por lo tanto,
requiere medio mensual, entre 1200 y 1500 horas de luz al año (Valverde, 2014).
26
2.2.5.4. Viento
La piña es susceptible a períodos largos de viento, disminuyendo su talla hasta
un 25%. Cuando se acompaña de lluvias abundantes los hongos penetran por las
heridas o roturas causadas por el frotamiento entre las hojas (Morales, 2005).
2.2.5.5. Suelo
Es recomendable suelos con alto contenido de materia orgánica con buen
drenaje, el pH entre 5 a 6. En el caso de suelos arcillosos, se debe hacer énfasis
en un buen drenaje, ya que estos tienden a retener mayor cantidad de agua,
situación que propicia el desarrollo de enfermedades fungosas (BANACOL,
2016b).
2.2.6 Requerimientos agronómicos del cultivo de piña
2.2.6.1. Fertilización
Según Asohofrucol (2018) el nitrógeno y potasio son los elementos más
importantes dentro del cultivo de piña influyen sustancialmente en la calidad del
fruto. Deben establecerse planes anuales de riego con estos componentes,
especialmente en el primer año, donde se recomienda adicionar fosforo para
contribuir a un buen desarrollo radicular.
2.2.6.2. Riego
Según Agrocalidad (2016) la piña a pesar de ser una monocotiledónea con
metabolismo CAM, altamente adaptada a la sequía, requiere de al menos 15 a 35
mm de riego por semana, el cual puede proporcionarse a la planta bien sea por
goteo o aspersión.
27
2.2.6.3. Control de plagas y enfermedades
Según Agrocalidad (2016) entre las plagas y enfermedades más comunes que
atacan los cultivos de piña podemos mencionar las siguientes:
Cochinilla arenosa: Dysmicoccus brevipes (Cochinilla rosada),
Dysmicoccus neobrevipes (Cochinilla gris). Daño: Esta plaga ataca
cualquier parte de la planta durante todo el ciclo del cultivo. Las hembras
maduras y ninfas chupan savia de los tallos y raíces, secretando toxinas
que provocan el retardo del crecimiento y el desecamiento de la planta.
Sinfilidos: Hanseniella spp, Scutigerella spp, Symphylella spp. Daño: Se
alimentan de las secciones más jóvenes de las raíces, afectando la
absorción de elementos nutritivos de la planta.
Caracoles: Opeas pumilum, Cecilioides aperta. Daño: se alimentan de los
ápices, provocando síntomas de enanismo, des-uniformidad en la
plantación (parches).
Picudo: Metamasius dimidiatipennis. Daño: Plaga esporádica en cultivos
poco tratados.
Nemátodos: (Meloidogyne, Rotylenchulus, Helicotylenchus,
Pratylenchus y Criconemoides). Daños: Depende del modo de
alimentación, se ejercerá un daño determinado en la planta
Barredor del fruto: (Strymon basilide). Daño: Las larvas de esta mariposa
penetran en los frutos, creando cavidades que lo destruyen internamente.
Gusano soldado: (Elaphria nucicolora). Daño: Las larvas raspan y comen
superficialmente la cáscara de la fruta.
Según BANACOL (2016a) las enfermedades más comunes de la piña son:
28
Pudrición del cogollo: (Phytophthora parasitica). Daño: Históricamente
este hongo ha atacado los cultivos alrededor del mundo.
Pudrición del fruto: (Phytophthora cinnamomi). Daño: En follaje presencia
de clorosis, en frutos aparición de tejido blando, necrótico, momificado.
Fusarium: (Fusarium sp.). Daño: deshidratación foliar, acucharamiento del
follaje y emisión de espinas, frutos pequeños y momificación.
Hoja de tamal o Pudrición bacterial del fruto: (Pectobacterium carotovora).
Daño: Se considera la segunda enfermedad más importante de este cultivo.
Pudrición acuosa o fruta bofa: (Thelaviopsis paradoxa). Daño: Afecta el
material de siembra, tallo, hojas y frutos.
2.2.6.4. Métodos de propagación
Según Uriza (2011) “la multiplicación de la piña se puede dar por medio de
semillas (las cuales deben ser previamente desinfectadas), la propagación
vegetativa y propagación in vitro.”
2.2.6.4.1. Propagación vegetativa
Según indica Medina, et.al., (2014) y Vázquez, et.al., (2015) esta es una
técnica de reproducción de las plantas por vía asexual, para ello se utiliza
tejidos vegetales que conservan la potencialidad de multiplicación y
diferenciación celular para generar nuevos tallos y raíces a partir de diferentes
órganos de la planta. En la piña la propagación vegetativa se puede dar de
diferentes partes de la planta, entre los más comunes encontramos:
Hijos basales: nacen de la base de la planta, son los más vigorosos; emiten
raíces que penetran el suelo, teniendo generalmente hojas más largas.
29
Brote del tallo: es el que se desarrolla en las axilas de las hojas. Es
vigoroso, resistente y asegura la segunda cosecha
Hijo intermedio: es el brote que nace entre el brote de tallo y el brote del
pedúnculo del fruto, llamado bulbillo.
Bulbillo: es el hijo que se desarrolla a partir de una yema axilar del
pedúnculo. Debe recolectarse en el momento de la cosecha del fruto porque
si se deja para después, su desarrollo se interrumpe al desecarse el
pedúnculo y luego cae al suelo.
Corona: es el penacho de hojas ubicado en la parte superior de la fruta.
Para ser utilizada en la propagación, es preciso que la base de la misma
esté seca, para evitar su pudrición.
2.2.6.4.2. Propagación in vitro o micropropagación
Es una técnica que consiste en aislar una porción de la planta, a la cual se le
llamará explante o propágulo, a este se le proporcionará artificialmente las
condiciones físicas y químicas que requiera, para que las células expresen su
potencial intrínseco; los principios en los que se fundamenta la técnica son el
de totipotencialidad y regulación hormonal Rojas, et.al., (2014).
Como indica Olmos, et.al., (2010), la micropropagación puede llevarse a cabo a
través de tres vías de regeneración, a saber: brotación de yemas axilares
preexistentes, producción de yemas de novo y embriogénesis somática.
Partiendo de este material vegetal, para completar esta técnica es necesario
cumplir cinco etapas fundamentales, que son:
30
Preparatoria o fase 0: Selección de las plantas madres que sean sanas,
vigorosas y fuera de estrés, es decir libres de deficiencias o enfermedades
por hongos o virus para poder obtener inóculos de buena calidad.
Establecimiento o iniciación del cultivo: Consiste en el acondicionamiento
del explante para garantizar su supervivencia en condiciones de laboratorio.
Es la fase más importante desde el punto de vista aséptico, pues se debe
evitar al máximo problemas de contaminación y de oxidación que pueden
causar la muerte del explante.
Multiplicación de vástagos o embriones: Concluida la fase de
establecimiento del cultivo, es momento de pasar el brote a un nuevo medio
de cultivo, con adición de algunas fitohormonas o reguladores de
crecimiento cuyo balance generalmente favorece a las citocininas,
necesarias en el proceso de organogénesis. A medida que el explante
comienza a crecer y multiplicarse es subdividido y cada nuevo explante es
cultivado individualmente en un nuevo medio de cultivo, una vez
multiplicado y desarrollado, nuevamente es subdividido y a esta parte se le
llama subcultivo; el número de subdivisiones depende de la especie, pero
en general no se puede exagerar este proceso porque puede haber efectos
negativos en las vitroplántulas.
Enraizamiento: como su nombre lo indica en esta etapa se produce la
formación de raíces adventicias, lo cual puede llevarse a cabo tanto in vitro
como ex vitro. En el primer caso suelen emplearse reguladores de
crecimiento y sustratos apropiados, en el segundo caso, suelen emplearse
previamente esterilizados tierra, abono, arena mezclado en diferentes
proporciones.
31
Aclimatación de las plántulas: consiste en un acondicionamiento de las
plántulas entre el laboratorio y las condiciones medioambientales de su
nuevo entorno en un sustrato estéril.
2.2.6.5. Medios de cultivo para micropropagación
Los medios de cultivos empleados comúnmente en la micropropagación de
células vegetales, se pueden sintetizar de la siguiente manera:
2.2.6.5.1. Composición de medios de cultivo para células vegetales
Según Argenbio (2018) la composición de medios de cultivo para células
vegetales se detalla a continuación.
Agua destilada: Representa el 95% del medio nutritivo.
Fuente de carbono: Generalmente se utiliza sacarosa. La fuente de carbono
es necesaria porque los explantes no son totalmente autotróficos y la
fotosíntesis in vitro no aporta las necesidades de las células
Compuestos inorgánicos: Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) y
Microelementos (Fe, Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I), en una proporción
que depende del medio o base elegido.
Vitaminas: Mioinositol, vitamina B1 (tiamina), ácido nicotínico (niacina),
vitamina B6 (piridoxina), pantotenato de calcio, ácido fólico, vitamina B2
(riboflavina), vitamina C (ácido ascórbico), vitamina H (biotina), ácido para-
aminobenzoico y vitamina E (tocoferol)
Hormonas reguladoras de crecimiento: Auxinas, estas promueven la
elongación celular, la formación de callos y de raíces adventicias; inhiben la
formación de brotes axilares y adventicios y, a veces, la embriogénesis en
suspensiones celulares. Ejemplos: IAA (ácido indol acético), NAA (ácido
32
naftalenoacético), IBA (ácidoindolbutírico), 2,4 D (2,4- diclorofenoxiacético).
Citocininas: Estas promueven la división celular, regulan el crecimiento y el
desarrollo de los tejidos vegetales. Ejemplos: cinetina, 2iP (2-
isopentiladenina), BAP (benzilaminopurina), zeatina. Otros compuestos.
Ejemplos: giberelinas y ácido abcísico.
Mezclas de compuestos poco definidos: Extracto de levadura, extractos
vegetales, hidrolizados de caseína, peptona y triptona. La tendencia actual
en investigación es la de sustituirlos por medios de composición definida.
Materiales inertes: Utilizados como soporte. Ejemplos: agar, agarosa, otros
polisacáridos (Gelrite, Phytagel), lana de vidrio, papel de filtro, arena,
esponjas de poliestireno.
Sin embargo, uno de los medios más utilizados es el de Murashige & Skoog
(M&S), este es una mezcla compleja de sales complementadas con vitaminas, a
la cual se agrega sacarosa y agar.
2.2.7 Mantenimiento de la asepsia
Como es conocido generalmente, las técnicas de cultivo in vitro necesitan
conservar un control estricto de la asepsia para mantener el adecuado
desarrollo y producción de plántulas y, las técnicas de cultivo en medios
líquidos como el Sistema de Inmersión Temporal no son la excepción (Zamora
y Juárez 2008). Es así que, en este tipo de sistemas, la probabilidad de
contaminación se puede desplegar más rápidamente y dispersar con mayor
facilidad en el medio líquido y puede acarrear perdidas hasta del 100% del
cultivo (Senamhi, 2009). Por ello, el material vegetal a ser inoculado en el
Sistema de Inmersión Temporal debe estar sometido previamente a subcultivos
33
que permitan asegurar su asepsia en fin de controlar el crecimiento indeseado
de microorganismos patógenos (Albarracín, 2012).
2.2.8 Latencia
Para el cultivo in vitro de piña, se debe de cumplir con una fase inicial de
rompimiento de la latencia de las yemas, lo cual puede lograrse con la adicion
de reguladores de crecimiento al medio de cultivo (Saucedo, 2008). En el caso
de yemas provenientes de hijos basales de piña, se puede lograr romper la
latencia en aproximadamente 40%, adicionando 1 mg.L-1
de ácido
naftalenacético, 0.001 mg.L-1 de benzilaminopurina y 0.0001 mg.L-1 de ácido
giberélico, al medio MS-62, semisolidificado con 4 g.L-1 de agar. Las
condiciones de cultivo son: fotoperiodo de 16 horas/luz, con una intensidad
entre 3000 y 4000 lux y temperatura promedio de 26°C Tapia, et.al., (2005).
2.3 Marco Legal
2.3.1 Constitución de la República del Ecuador (2008)
Como fundamento legal se considera lo establecido en la Constitución de la República del Ecuador 2008 – Derechos del Buen Vivir. Donde uno de los objetivos del plan nacional del Buen Vivir es garantizar los derechos de la naturaleza y promover un ambiente sano y sustentable. Sección primera: Agua y alimentación y sección segunda: Ambiente sano. Art. 13.- Las personas y colectividades tienen derecho al acceso seguro y permanente a alimentos sanos, suficientes y nutritivos; preferentemente producidos a nivel local y en correspondencia con sus diversas identidades y tradiciones culturales. El Estado ecuatoriano promoverá la soberanía alimentaria. Art. 14.- Se reconoce el derecho de la población a vivir en un ambiente sano y ecológicamente equilibrado, que garantice la sostenibilidad y el Buen Vivir, Sumak Kawsay. Se declara de interés público la preservación del ambiente, la conservación de los ecosistemas, la biodiversidad y la integridad del patrimonio genético del país, la prevención del daño ambiental y la recuperación de los espacios naturales degradados (Ley Organica de Biodiversidad, Semillas y Fomento de la Agricultura Sostenible, 2017).
34
Art. 21.- Los parámetros de calidad de piña dependen del mercado, los mismos que, si bien varían, tienen condiciones generales: - Cantidad de sólidos solubles o grados brix mínimo de 12° hasta 14° y aumenta un grado cada tres días. - Translucidez de 0,8-1. – Porosidad 1, en una escala de 1-4. - Las condiciones de luminosidad son importantes para el color de la fruta. Art 23.- Dentro de los parámetros de empaque, se debe contar con especificaciones documentadas de lo siguiente como mínimo: grados Brix, traslucidez, color, tamaño, forma, variedad, peso con o sin corona, y temperatura de almacenamiento. Estos datos deben ser obtenidos de los requerimientos del cliente, el mercado o especificaciones internas de la empresa. Art. 73.- EI Estado aplicará medidas de precaución y restricción para las actividades que puedan conducir a la extinción de especies, la destrucción de ecosistemas o la alteración permanente de los ciclos naturales. Se prohíbe la introducción de organismos y material orgánico e inorgánico que puedan alterar de manera definitiva el patrimonio genético nacional. Art. 400.- El Estado ejercerá la soberanía sobre la biodiversidad, cuya administración y gestión se realizará con responsabilidad intergeneracional. Se declara de interés público la conservación de la biodiversidad y todos sus componentes, en particular la biodiversidad agrícola y silvestre y el patrimonio genético del país. Art. 406.- El Estado regulará la conservación, manejo y uso sustentable, recuperación, y limitaciones de dominio de los ecosistemas frágiles y amenazados; entre otros, los páramos, humedales, bosques nublados, bosques tropicales secos y húmedos y manglares, ecosistemas marinos y marinos-costeros (Constitucion del Ecuador 2015).
35
3. Materiales y métodos
3.1 Enfoque de la investigación
Se detalla el tipo, nivel de conocimiento y diseño de investigación.
3.1.1 Tipo de investigación
La presente investigación es de carácter inductivo con características
aplicadas y por el movimiento de las variables de concepción experimental,
mediante la recolección de datos que permitió probar la hipótesis mediante el
análisis estadístico.
3.1.2 Diseño de investigación
3.1.2.1. Investigación experimental
Este tipo de investigación permitió manipular las variables y medir su efecto
sobre las variables dependientes.
3.1.2.2. Investigación descriptiva
Permitió recolectar los datos sobre la base de la hipótesis, exponiendo y
resumiendo la información para analizar minuciosamente los resultados a fin de
extraer generalizaciones significativas que contribuyeron en la relación que
existen entre dos o más variables.
3.1.2.3. Investigación explicativa
Permitió explicar el porqué de un fenómeno o hecho determinado.
3.2 Metodología
Para la iniciación de las siembras se implementó el siguiente procedimiento: a
las coronas e hijuelos basales se les eliminó totalmente las hojas para exponer las
yemas.
Al material vegetal (piña) se procedió a quitarle las hojas tanto de la corona
como de los hijos basales, quedando pequeñas porciones para extraer las yemas.
36
Una vez eliminada las hojas a los brotes se lavaron con detergente líquido
transferidos a una solución diluida al 1.8 y 4 % i.a. de cloro comercial por 20 min,
para después lavarlos con agua del grifo eliminando todo el jabón, luego lavados
tres veces en agua destilada estéril en una cabina de flujo laminar (Daquinta
et.al., 1995; Dolgov et.al., 1998), y así se obtuvo los explantes primarios: yemas
de la corona e hijuelos (Fitchet-Purnell, 1993).
El proceso de siembra se llevó a cabo en la cámara de flujo laminar, donde se
desinfectaron todas las superficies de contacto y el material utilizado para la
siembra utilizando un aspersor que contenía isopropanol al 70%.
Primera siembra
La desinfección con cloro se hizo en la cámara de flujo laminar, una vez lista
los brotes se colocaron cloro al 1.8% por 10min y luego se los lavaron tres veces
con agua destilada estéril.
Para el proceso de siembra se colocaron explantes con yemas en servilletas
esterilizadas para que se sequen 10 minutos aproximadamente. Luego se
procedió a realizar pequeños cortes de los hijos basales para sembrarlos en los
medios de cultivos.
Así mismo con la corona se hizo pequeños cortes de 0.5 cm de y se los colocó
en los medios de cultivos MS BAP (0.5mg.L-1). Fueron en total 10 ápices de
corona y 10 de Hijos. Los explantes implantados se colocaron en condiciones de
luz (8 h luz/16 h de oscuridad.
Segunda siembra
En la segunda siembra se lavó los brotes y se dejaron por 30 minutos en cloro
al 3%, para después ponerlos a secar en servilletas esterilizadas. Se sembraron
37
en 20 frascos de vidrio, (10) ápices de corona y (10) ápices de hijos, y se
colocaron en condiciones de luz.
Tercera siembra
En esta siembra se procedió a hacer la desinfección de los explantes con cloro
al 3 %. Se sembraron las yemas axilares de coronas (12) e hijos (18) en medios
de cultivo BAP 1 mg y se realizaron cortes de 1 cm aproximadamente para cada
frasco de medio de cultivo. Una vez finalizada la siembra se procedió a dejar los
explantes iniciados en condiciones de oscuridad.
Cuarta siembra
En esta siembra se procedió a hacer la desinfección de los explantes con
cloro al 4 %. Se implantaron yemas axilares de corona (8) y yemas de hijuelos (8)
en medios de cultivo Ms suplementados con BAP (1mg.L-1). Se colocaron una
semana en oscuridad y luego se pasaron a las condiciones de luz.
Quinta siembra
En esta siembra se procedió a hacer la desinfección de los explantes con cloro
al 4 %. Se implantaron yemas axilares puentes de Heller, en tubos de ensayos
contentivos de cuatro medios de cultivo MS líquidos suplementados con
diferentes concentraciones de ANA y BAP en tubos de ensayo, con 20
repeticiones por tratamiento haciendo un total de 80 unidades:
T1: MS BAP (1 mg.L-1); ANA (0,5mg.L-1)
T2: MS BAP (1mg.L-1); ANA (0,01mg.L-1)
T3: MS BAP(1mg.L-1); ANA (2mg.L-1)
T4: MS BAP (2mg.L-1); ANA (0,5mg.L-1)
Los explantes sembrados se dejaron una semana en la oscuridad.
38
Después de 3 semanas se realizó una resiembra de los ápices de piña no
contaminados en medios de cultivo sólidos MS con dosis de BAP (0,5 mg.L-1),
ANA (5mg.L-1), tiamina (5mg.L-1)
Tabla 2. Procedimiento de siembra
Nº Siembra
de Iniciación
[ ] de cloro
Consistencia
de los medios
Composición del
MS (Reguladores
de crecimiento)
Fotoperiodo
Siembra 1 Cloro 1.8 % Sólido BAP (0,5 mg.L-1) Luz (1)
Siembra 2 Cloro 3 % Sólido BAP (0,5 mg.L-1) Luz
Siembra 3 Cloro 3 % Sólido
BAP (1 mg.L-1)
Luz
Siembra 4 Cloro 4 % Sólido
BAP (1mg.L-1)
Oscuridad(2)
Siembra 5
Cloro 4 %
Líquido
BAP (1 mg.L-1) +
ANA (0.5 mg.L-1)
BAP (1 mg.L-1
) +
ANA (0.01 mg.L-1)
BAP (1 mg.L-1)
+ANA (2 mg.L-1)
BAP (2 mg.L-1)+
ANA( 0.5 mg.L-1)
Oscuridad
Baque, 2019
(1): Condiciones de luz: 8 h luz/ 16 h oscuridad
(2): Condiciones de oscuridad. Se colocaron en la oscuridad por una semana.
3.2.1 Variables
3.2.1.1. Variable independiente
Medios de cultivo complementados con BAP, ANA y Tiamina para la iniciación
de yemas de corona e hijos basales.
39
3.2.1.2. Variable dependiente
Número de brotes sanos, porcentaje de contaminación, porcentaje de
oxidación.
3.2.2 Tratamientos
Tabla 3. Descripción de los tratamientos a utilizar
Baque, 2019
3.2.3 Diseño experimental
Para llevar a cabo esta investigación se utilizó un diseño completamente al
azar (DCA) con análisis de varianza no paramétrica. Así mismo, se realizó la
prueba de Kruskal-Wallis, en la fase inicial compuesto de 4 tratamientos con 20
repeticiones, que dan un total de 80 unidades experimentales a evaluar, en este
caso cada unidad experimental estuvo constituida por un envase (por ejemplo, de
compota o similar).
3.2.4 Recolección de datos
3.2.4.1. Recursos
3.2.4.1.1. Materiales y herramientas
Agua, cinta, papel aluminio, libreta de apuntes, cámara fotográfica e insumos.
3.2.4.1.2. Material experimental
Medios de cultivo, coronas e hijuelos basales de A. comosus.
No. Tratamiento Descripción
Iniciación
T1
T2
T3
T4
MS + MS + BAP 1mg.L-1 + ANA 0,5mg.L-1 + tiamina-HCl 4mg.L-1
MS + BAP 1mg.L-1 + ANA 0,01mg.L-1 + tiamina-HCl 4mg.L-
1
MS + BAP 1mg.L-1 + ANA 2 mg.L-1 + tiamina-HCl 4mg.L-1
MS + BAP 2mg.L-1 + ANA 0,5mg.L-1 + tiamina-HCl 4mg.L-1
40
3.2.4.1.3. Recursos humanos
Tesista, tutor.
3.2.4.1.4. Recursos económicos
El presente trabajo de investigación es financiado por recursos propios del
Tesista y la Universidad Agraria del Ecuador.
3.2.4.2. Métodos y técnicas
3.2.4.2.1. Método inductivo
Este método permitió observar los resultados obtenidos con la finalidad de
cumplir los objetivos e hipótesis planteadas.
3.2.4.2.2. Método deductivo
Permitió observar casos particulares de la investigación a través de principios,
teorías y leyes.
3.2.4.2.3. Método sintético
Permitió establecer y relacionar los resultados para construir la discusión,
conclusiones relacionadas bajo la perspectiva de totalidad de la investigación.
3.2.5. Análisis estadístico
3.2.5.1. Análisis funcional
Con los resultados por obtener en cada unidad experimental en función de las
variables a medir se realizó un análisis de varianza (ANDEVA) y prueba de T-
student que es una distribución de la probabilidad, que surge para estimar la
media de una población, aplicando software estadístico INFOSTAT.
La fórmula de la prueba de T-student se detalla a continuación:
Figura 1. Formula T-student
41
3.2.5.2. Andeva no paramétrica Prueba de Kruskal-Wallis
Figura 2. Formula prueba de Kruskal-Wallis
Baque, 2019
3.2.5.3. Hipótesis estadísticas
Ho: No habrá diferencia entre los tratamientos aplicados en la
micropropagación de piña (Ananas comosus L. Merr.)
Ha: Habrá diferencias entre los tratamientos aplicados en la micropropagación
de piña (Ananas comosus L. Merr.)
3.2.5.4. Delimitación experimental
Tabla 4. Experimento
Variable Descripción
Iniciación
Tipo de Siembra In vitro
Número de tratamientos 4
Número de Repeticiones 20
Número de unidades experimentales 80
Baque, 2019
3.2.5.5. Manejo del ensayo
3.2.5.5.1. Preparación
Se realizó en forma manual, con diversos medios de cultivo y explantes de A.
comosus.
3.2.5.5.2. Material genético
A. comosus var. Cayena
42
3.2.5.5.3. Dosificación
Se realizó diferentes tratamientos para poder demostrar cuál es el más idóneo
para el desarrollo del material genético.
3.2.5.5.4. Toma de muestra
La muestra se debió tomar de la parte central de los cuadros.
3.2.5.6. Variables a evaluarse
3.2.5.6.1. Tratamientos
Se realizó 4 tratamientos para determinar cuál fue el mejor medio de cultivo, y
variaron de acuerdo a las siembras.
3.2.5.6.2. Porcentaje de contaminación
Se evaluó y contabilizó en el proceso de iniciación de la micropropagación de
las yemas de A. comosus por siete días.
3.2.5.6.3. Número de brotes sanos
La extracción y siembra de las yemas se realizó en la cámara de flujo laminar
después de haber sido desinfectadas. Las yemas aisladas se cultivarón en el
medio de cultivo semisólido, se incubaron inicialmente en condiciones de
oscuridad por 7 días y luego en condiciones de fotoperíodo con luz blanca, hasta
obtener brotes de 1 cm de longitud aproximadamente.
3.2.5.6.4. Porcentaje de oxidación
Se evaluó y contabilizó las yemas de A. comosus que se encuentran
oxidadas.
3.3 Aspectos administrativos
3.3.1 Recursos bibliográficos
Los recursos de consulta que se utilizó son:
Biblioteca de la Universidad Agraria del Ecuador.
43
Tesis de grados de varias universidades
Informes técnicos
Revistas agrícolas
Boletines de instituciones de investigación
Páginas Web
3.3.2 Materiales y equipos
Los materiales que se utilizaron para recopilar la información de carácter
experimental son:
Hojas
Bolígrafos
Instrumentos de laboratorio
Cámara fotográfica
CPU, impresora
Mapa de Ubicación
3.3.3 Recursos humanos
El recurso más importante para levantar esta investigación es el talento
humano, tales como:
Estudiante Tesista
Catedrático de la Universidad Agraria del Ecuador
44
4. Resultados
4.1 Determinar el mejor método de desinfección de yemas axilares de la
corona e hijos basales
4.1.1 Porcentaje de contaminación y oxidación
4.1.1.1. Primera siembra
A los siete días de la siembra se registró la contaminación, presentándose 80
% de contaminación en los ápices de corona y 90 % de contaminación en los
ápices de hijuelos por hongos y bacterias procedentes del explante.
Cabe recalcar que los ápices que no se contaminaron se oxidaron y por ende no
se obtuvieron brotes.
Aplicando la t-student con el valor p =0.0342 es < a α=0.05 a los datos
obtenidos se evidencia que existen diferencias significativas en el porcentaje de
contaminación entre las siembras de coronas e hijos de piña (Tabla 5).
Tabla 5. Prueba T para muestras Independientes en la primera siembra de
yemas axilares de la corona e hijos basales.
Variable: Arcoseno_porc - Clasific: Material - Prueba: Bilateral
Grupo 1 Grupo 2
Corona Hijos
n 2 2
Media 81.50 91.00
Media (1)- Media (2) -9.50
LI(95) -17.26
LS(95) -1.74
pHomVar 0.7487
T -5.27
p-valor 0.0342
Baque, 2019
4.1.1.2. Segunda siembra
Al incrementar la concentración de cloro al 3% (i.a) se obtuvo 20 % de
contaminación en las siembras de ápices de coronas y 10 % en los hijuelos, tanto
45
bacteriana como fúngica. Las yemas axilares tanto de coronas e hijos presentaron
oxidación de una coloración marrón.
Según los datos obtenidos aplicando la t-student con el valor p =0.0817 es > a
α=0.05 por lo que no existen diferencias significativas en el porcentaje de
contaminación entre las siembras de coronas e hijos de piña (Tabla 6).
Tabla 6. Prueba T para muestras Independientes (luz: desinfección cloro 3%)
Variable: Arcoseno_porc - Clasific: Material - Prueba: Bilateral
Grupo 1 Grupo 2
Corona Hijos
n 2 2
Media 22.50 12.00
Media (1)- Media (2) 10.50
LI(95) -3.28
LS(95) 24.28
pHomVar 0.8591
T 3.28
p-valor 0.0817
Baque, 2019
4.1.1.3. Tercera siembra
Utilizando el mismo procedimiento de desinfección a la siembra anterior se
presentó un 25 % de contaminación en coronas y 50 % en hijuelos.
Según los datos obtenidos mediante la t-student con el valor p =0.0126 es < a
α=0.05 por lo que si existen diferencias significativas en el porcentaje de
contaminación entre las siembras de coronas e hijos de piña (Tabla 7).
46
Tabla 7. Prueba T para muestras Independientes (oscuridad y luz:
desinfección cloro 3%)
Variable: Arcoseno_porc - Clasific: Material - Prueba: Bilateral
Grupo 1 Grupo 2
Corona Hijos
n 2 2
Media 27.00 52.00
Media (1)- Media (2) -25.00
LI(95) -37.17
LS(95) -12.83
pHomVar <0.9999
T -8.84
p-valor 0.0126
Baque, 2019
4.1.1.4. Cuarta siembra
Debido a que se incrementó al 4 % la concentración de cloro no hubo
contaminación en coronas, y presentó un 37.5 % de contaminación en los
hijuelos.
Según los datos obtenidos mediante la t-student con el valor p =0.0165 es < a
α=0.05 por lo que si existen diferencias significativas en el porcentaje de
contaminación entre las siembras de coronas e hijos de piña (Tabla 8).
Tabla 8. Prueba T para muestras Independientes (oscuridad y luz:
desinfección cloro 4%)
Variable: Arcoseno_porc - Clasific: Material - Prueba: Bilateral
Grupo 1 Grupo 2
Corona Hijos
n 2 2
Media 0.00 38.50
Media (1)- Media (2) -38.50
LI(95) -51.21
LS(95) -25.79
pHomVar <0.0001
T -38.50
p-valor 0.0165
Baque, 2019
47
4.1.1.5. Quinta siembra
4.1.1.5.1 Medio de cultivo liquido
Después de una semana de la siembra en condiciones de oscuridad, algunos
ápices presentaron una coloración marrón, pero no hubo mayor contaminación
(24.50%) como en las anteriores siembras. Como estaban en oscuridad se
procedió a pasarlos a condiciones de luz. Pasada dos semanas, uno de los
explantes sembrados presentó una leve coloración verde.
Según los datos obtenidos mediante la t-student con el valor p =0.8612 es > a
α=0.05 no existen diferencias significativas en el porcentaje de contaminación
entre las siembras de coronas e hijos de piña (Tabla 9).
Tabla 9. Prueba T para muestras Independientes (oscuridad y luz:
desinfección cloro 4%)
Variable: Arcseno_porc - Clasific: Material - Prueba: Bilateral
Grupo 1 Grupo 2
Corona Hijos
n 4 4
Media 22.00 24.50
Media (1)- Media (2) -2.50
LI(95) -36.01
LS(95) 31.01
pHomVar 0.8112
T -0.18
p-valor 0.8612
Baque, 2019
En la tabla 10 se observan todos los promedios de los porcentaje de
contaminación en las coronas de la piña obtenidos al evaluar cada siembra con
diferentes concentraciones de cloro en la desinfección. Según el análisis de
varianza no paramétrico no se obtuvo diferencias significativas entre las siembra.
Se muestra que en las últimas siembras cuatro y cinco con la desinfección al 4%
48
de cloro (0%; 18.38%) se obtuvieron los menores porcentajes de contaminación
en las coronas.
Tabla 10. Anava Prueba de Kruskal Wallis para coronas
Variable %
cloro
Siembra N Medias D.E. Medianas H p
% contaminación
corona
1.8 1 1 80.00 0.00 80.00 4.00 >0.9999
% contaminación
corona
3 2 1 20.00 0.00 20.00
% contaminación
corona
3 3 1 25.00 0.00 25.00
% contaminación
corona
4 4 1 0.00 0.00 0.00
% contaminación
corona
4 5 1 18.38 0.00 18.38
Baque, 2019
En la tabla 11 se observan todos los promedios obtenidos al evaluar el número
de siembra con las diferentes formas de desinfección en relación al porcentaje de
contaminación existente en los hijos de la piña. En el análisis de varianza no
paramétrico no se obtuvo diferencias significativas con respecto a la
contaminación entre las siembras. En la segunda siembra con desinfección al 3 %
de cloro se obtuvo menor contaminación que en la tercera, cuarta y quinta
siembra, debido al tiempo en que se procedió a sembrar el material vegetal.
49
Tabla 11. Anava Prueba de Kruskal Wallis para hijos
Variable %
cloro
Siembra N Medias D.E. Medianas H p
% contaminación
hijos
1.8 1 1 90.00 0.00 90.00 4.00 >0.9999
% contaminación
hijos
3 2 1 10.00 0.00 10.00
% contaminación
hijos
3 3 1 50.00 0.00 50.00
% contaminación
hijos
4 4 1 37.50 0.00 37.50
% contaminación
hijos
4 5 1 28.59 0.00 28.59
Baque, 2019
En general, en la primera siembra se observó que todos los ápices se
contaminaron, pero al incrementar la concentración del cloro disminuyó la
contaminación y las yemas, tanto de corona como de hijos, conservaron las
mismas características en las que se sembró, lo que significa que no
respondieron a los medios de cultivo. Esto nos demuestra que si se realiza el
proceso de desinfección con las concentraciones de productos y el tiempo
adecuado se puede evitar presencia de contaminación de los explantes de piña.
Considerando las cinco siembras existió un leve incremento en la contaminación
en los ápices de los hijos (34.48%) con respecto al de las coronas (24.81%),
observándose la presencia de bacterias y hongos (tabla 12).
50
Tabla 12. Descripción de la contaminación en las cinco siembras realizadas
Número
siembra
% Contaminación
coronas
% Contaminación
hijos
Organismos
presentes
%
Brotación
1 80 90 Bacterias y
hongos
No
2 20 10 Bacterias y
hongos
No
3 25 50 Bacterias y
hongos
No
4 0 37.5 Bacterias y
hongos
No
5 28 0 Bacterias y
hongos
No
0 12.5 Bacterias y
hongos
No
33 33 Bacterias y
hongos
No
12.5 42.85 Bacterias y
hongos
No
Promedio
general
24.81 34.48
Baque, 2019
4.2 Establecer el mejor medio de cultivo para obtener la iniciación de
yemas axilares
4.2.1 Número de brotes sanos
Los ápices que no presentaron contaminación y poca oxidación de las
siembras se procedió a quitarles una ligera capa de tejido externo para
resembrarlos en un nuevo medio de cultivo MS suplementado con 0,5mg.L-1BAP,
5mg.L-1ANA, 5mg.L-1 tiamina (sólido) con la finalidad de romper latencia y
disminuir la oxidación. Se evidenció que al remover el tejido oxidado los ápices
presentaban un color crema y no estaban oxidados internamente. Trascurridos 30
días no se observó la brotación de los ápices, los cuales terminaron contaminados
por bacterias y hongos y terminaron oxidándose.
51
4.2.2 Porcentaje de oxidación
En las cinco siembras realizadas se pudo observar que las yemas se oxidaban
con el pasar de los días. En las primeras siembras se observó que la oxidación
fue alta, entre 25 y 60 % para las yemas de coronas, y entre 54 y 80 % para las
yemas de los hijos. Sin embargo al colocar las yemas de la corona en condiciones
de oscuridad disminuyó la oxidación entre 0 y 25 %, y de los hijos basales entre 0
y 30 % (tabla 13). En todos los casos las yemas conservaron las mismas
características en las que se sembró, hasta que progresivamente se
contaminaron con bacterias y hongos.
Tabla 13. Porcentaje de oxidación de coronas e hijos
Número de siembra % oxidación corona % oxidación hijos Fotoperiodo
1 60 80 Luz (1)
2 40 54 Luz
3 25 60 Luz
4 15 35 Oscuridad (2)
5 (Tratamiento 1) 10 0 Oscuridad
(Tratamiento 2) 0 15 Oscuridad
(Tratamiento 3) 25 25 Oscuridad
(Tratamiento 4) 10 30 Oscuridad
Promedio general 23.13 37.38
Baque, 2019
(1): Condiciones de luz: 16 h luz/ 8 h oscuridad
(2): Condiciones de oscuridad. Se colocaron en la oscuridad por una semana.
En general, la oxidación en las cinco siembras fue mayor en los explantes de
los hijos, con un porcentaje general de 37.38% mientras que en las coronas fue
de 23.13%.
52
Se acepta la hipótesis nula porque ningún tratamiento resulto efectivo para la
brotación de los ápices de corona e hijos de piña (Ananas comosus L. Merr).
53
5. Discusión
El propósito del estudio fue comparar medios de cultivo en la
micropropagación de piña (Ananas comosus L.) variedad Cayena lisa partir de
yemas axilares de coronas e hijos basales.
En la primera y segunda siembra hubo problemas graves de contaminación y
solo sobrevivió el 20 % de los explantes. Esta situación se solventó aumentando
la concentración de cloro en el proceso de desinfección. Entre la tercera y cuarta
siembra no existió diferencia ya que se presentó un 38 % de contaminación, y en
la quinta siembra disminuyó al 20 %. Por lo tanto, en esta investigacion se pudo
observar que en las primeras siembras utilizando en el proceso de desinfección
cloro 1.8 % durante 10 min. el porcentaje de contaminación fue alto en los
explantes tanto coronas como hijos. Sin embargo, Leiva y Amaya (2016) en su
estudio señalan que el tratamiento de desinfección y esterilización del material
vegetativo T3 que consistió en alcohol al 70% durante 1 min., seguido de
hipoclorito de sodio al 1.6 % durante 15 min. proporcionó los mejores resultados
para poder sembrar asépticamente las yemas en el medio de cultivo. Por el otro
lado, Vallecillos, et.al. (1996) utilizando una desinfección con hipoclorito de sodio
al 0.5 % en la variedad Hawaiana, tuvieron un alto porcentaje de contaminación
por microorganismos que alcanzó el 70 %, comparable con los porcentajes
obtenidos en esta tesis, en la primera y segunda siembra. Los porcentajes de
contaminación registrados en las últimas siembras al aumentar al 3 y 4 % el
hipoclorito de sodio están en concordancia con lo expuesto por Llanos (2015),
usando similares condiciones (cloro 4% durante 30 min.), donde se obtuvo poca
presencia de contaminación de los explantes tanto coronas como hijos de la piña
en la propagación in vitro, demostrando que con mayor concentración de
54
desinfectante mejoró el proceso de desinfección. No obstante Llanos (2015)
señala en su estudio que el tratamiento más adecuado para la introducción y
desinfección de yemas de la corona var. MD2 es el tratamiento 5 que consistió en
1.3 % de lejía por 10‟ para la primera desinfección, seguido por 0.8 % de lejía por
10‟ para la segunda desinfección, el cual se caracteriza por tener porcentajes de
lejía bajos y tiempos intermedios de exposición a estas concentraciones. Esto
asegura la limpieza y además daña en menor grado a las células de las yemas,
permitiendo así su proliferación y multiplicación.
En esta tesis se utilizaron dos tipos de explantes (corona e hijos) con
diferentes medios de cultivos y se pudo observar que hubo una concordancia con
Mathews y Rao (1988) y Litz y Jaiswal (1991) debido a que se presentó poca
oxidacion en los apices de las coronas (entre 0 y 25 %) y en los ápices de hijos
(entre 0 y 30 %) en las últimas siembras, las cuales permanecieron por siete dias
en condiciones de oscuridad. Litz y Jaiswal (1991) explican que en los cultivos in
vitro de la papaya y la piña, la oxidacion es muy poca o nula ya que estas no
producen fenoles u otras sustancias que se oxiden, lo cual contrasta con los
resultados de esta investigaciòn, ademàs que ellos obtuvieron mayor oxidacion
en las yemas axilares de coronas.
A pesar que la concentración de BAP fue incrementándose al igual que la
concentración de tiamina en los medios de cultivo, ningún tratamiento resultó
factible para la inducción de la brotación de las yemas axilares que no se
contaminaron ni oxidaron. Garita y Gómez (2000) afirman en su estudio que los
tratamientos de desinfección con concentraciones de NAOCl mayores al 2 %
permitieron obtener un alto porcentaje de explantes limpios, pero produjeron una
inhibición total del crecimiento de las yemas. Resultados similares fueron
55
descritos por Aghion y Beauchesne (1960). Los tratamientos de desinfección
implican un compromiso entre explantes libres de contaminación y explantes que
conserven la capacidad de crecer y desarrollarse in vitro. En este trabajo los
ápices soportaron concentraciones de NAOCl de hasta 4%, sin embargo la falta
de respuesta en las yemas pudo haber sido consecuencia del proceso de
desinfección, aunado a la contaminación y oxidación posterior de estos explantes.
Por lo anteriormente expuesto en la presente investigación se acepta la
hipótesis nula porque ningún tratamiento resultó efectivo para la
micropropagación de piña a partir de yemas axilares de la corona e hijos basales.
56
6. Conclusiones
La alta contaminación por hongos y bacterias de los ápices axilares
provenientes de coronas e hijos de piña de la variedad Cayena lisa en las
primeras dos siembras fue reducida significativamente, incrementando la
concentración de cloro al 4 % en el proceso de desinfección en las ultimas
siembras la contaminación aumentó posiblemente al tiempo en que fue sembrado
el material vegetal en los medios de cultivo.
La oxidación fenólica constituye otro de los problemas graves en la
micropropagación de piña a nivel mundial en laboratorio, sin embargo se puede
disminuir cuando los explantes iniciados se mantienen en condiciones de
oscuridad por siete días.
Aun cuando se incrementaron las concentraciones de BAP y tiamina en los
medios de cultivo líquidos y sólidos ningún tratamiento tuvo efecto para la
inducción de la brotación de las yemas axilares de coronas e hijos basales.
Se aprueba la hipótesis nula, puesto que para Ananas comosus var. Cayena
lisa no se pudieron obtener brotes a partir del cultivo in vitro posiblemente debido
a la contaminación, oxidación y falta de inducción de los mismos.
57
7. Recomendaciones
Continuar con las investigaciones utilizando otros explantes de piña. Se han
utilizado bases de hojas para obtener brotes de piña con buenos resultados. De
esta manera se podrá seguir con las etapas como son multiplicación,
enraizamiento y aclimatación.
Evaluar otros reguladores de crecimiento, dosis e interacciones entre
citocininas y auxinas en los medios de cultivo de establecimiento para obtener la
inducción de yemas y la subsecuente producción de vitroplantas.
Realizar nuevos procesos de desinfección de explantes para evitar la
presencia de microorganismos patógenos que no permiten la germinación de
vitroplantas.
58
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66
9. Anexos
Figura 3. Mapa de ubicación
Baque 2019
Figura 4. A: Recolección de piña para obtención de los explantes; B: Explantes de
piña de corona e hijos; C: Desinfección de los explantes en
detergente; D: Desinfección de los explantes en cloro 1.8% en
cámara de flujo laminar.
Baque 2019
A B
C D
67
Figura 5. A: Primera siembra en medios de cultivos sólidos; B: contaminación de
primera siembra.
Baque 2019
Figura 6. A: Segunda siembra; B: Contaminación de segunda siembra; C:
Contaminación de coronas; D: Contaminación de hijuelos.
Baque 2019
A B
A B
D C
68
Figura 7. A: Tercera siembra; B: Coronas contaminadas; C: Presencia de bacteria
en coronas; D: Hijuelos contaminados.
Baque 2019
Figura 8. A: Cuarta siembra; B, C, D: Presencia de bacterias en explantes de
coronas e hijos.
Baque 2019
A
C D
B
A B
D C
69
Figura 9. A: Quinta siembra de explantes en medios líquidos en condiciones de
oscuridad; B, C, D: Explantes con presencia de coloración marrón en
condiciones de luz.
Baque 2019
Figura 10. A: Hijuelos con presencia de bacteria; B: Explante (hijo) con una leve
brotación; C: Resiembra del explante verde.
Baque 2019
A B
C D
A B C
70
Figura 11. A: Resiembra de los explantes de medios líquidos en medios sólidos;
B: Explante oxidado; C: Explante con las mismas características
desde el inicio de siembra; D: Explante que presentó una leve
brotación; E: Explante oxidado.
Baque 2019
Figura 12. A: Explantes sin presencia de brotes
Baque 2019
A B C
D E
A