tesis de grado ingeniería química
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Tesis de grado ingeniería química
Emitida a
Universidad de los andes
Presentado por
Edison Fabián Reyes Gómez
Titulo
Examen preliminar de producción de PETasa para bio-despolimerización a escala del
Tereftalato de Polietileno (PET).
Universidad de los Andes
Departamento de ingeniería química
Asesor principal
Rocío Sierra Ramírez
Co asesor
Dinary Eloísa Duran
Tabla de contenido Resumen ........................................................................................................................................ 4
Motivación .................................................................................................................................... 4
1. Introducción .......................................................................................................................... 5
1.1. Estructura .......................................................................................................................... 6
2. Planteamiento del problema .................................................................................................. 7
2.1. General .............................................................................................................................. 7
2.2. Especifico .......................................................................................................................... 7
3. Objetivos ............................................................................................................................... 8
3.1. Generales ........................................................................................................................... 8
3.2. Específicos ........................................................................................................................ 8
4. Procedimiento ....................................................................................................................... 9
4.1. Selección y obtención del plásmido. ................................................................................. 9
4.2. Extracto de plásmido y cuantificación de pureza .............................................................. 9
4.3. Cultivo E. coli k12 ............................................................................................................. 9
4.4. Obtención de células competentes y transformación. ....................................................... 9
4.5. Inducción PETasa ............................................................................................................ 10
4.6. Separación y purificación. ............................................................................................... 10
4.7. Análisis de plásticos ........................................................................................................ 10
4.8. Caracterización de PETasa .............................................................................................. 11
4.8.1. Presencia ..................................................................................................................... 11
4.8.2. Actividad enzimática ................................................................................................... 11
5. Resultados y discusión. ....................................................................................................... 14
5.1. Selección y obtención del plásmido. ............................................................................... 14
5.2. Extracto de plásmido y cuantificación de pureza ............................................................ 14
5.3. Cultivo E. coli k12 ........................................................................................................... 15
5.4. Obtención de células competentes y transformación ...................................................... 15
5.5. Inducción PETasa. ........................................................................................................... 16
5.6. Separación y purificación ................................................................................................ 16
5.7. Análisis de desechos plásticos de PET ............................................................................ 16
5.8. Caracterización de PETasa .............................................................................................. 18
5.8.1. Validez ........................................................................................................................ 18
5.8.2. Actividad enzimática. .................................................................................................. 19
5.10 Discusiones adicionales ................................................................................................... 22
5.11 Restricciones ................................................................................................................... 23
6 Conclusiones ....................................................................................................................... 25
7 Mejoras a seguir. ................................................................................................................. 26
8 Bibliografía ......................................................................................................................... 27
9 ANEXOS ............................................................................................................................. 33
9.1 Procedimientos metodológicos ....................................................................................... 33
9.1.2 Selección de cultivo E. coli ......................................................................................... 33
9.1.3 Extracto de plásmido y cuantificación de pureza. ....................................................... 33
9.1.4 Preparado de células competentes ............................................................................... 34
9.1.5 Transformación ........................................................................................................... 35
9.1.5.1 Electroporacion ........................................................................................................... 35
9.1.5.2 Choque térmico ........................................................................................................... 36
9.1.6 Separación y purificación ............................................................................................ 36
9.1.6.1 Sonicación ................................................................................................................... 36
9.1.6.2 Columna de cromatografía .......................................................................................... 37
9.2 Resultados ....................................................................................................................... 38
9.2.2 Crecimiento E. coli k12 transformada bajo selección con Ampicilina........................ 38
9.2.3 Calorimetría diferencial de barrido (DSC) de los sustratos de desecho ...................... 38
9.2.4 Mediciones absorbancia espectrofotometría UV ........................................................ 43
9.2.5 Estadísticos ganancia de absorbancia a 205nm y 280nm en el eluato ........................ 48
9.2.6 Disminución másica en la reacción PET-PETasa ....................................................... 48
9.2.7 Calculo actividad enzimática ...................................................................................... 49
9.2.8 Comparación concentración proteica .......................................................................... 50
Resumen
El poli (tereftalato de etileno) (PET), uno de los plásticos sintéticos que se producen en
más cantidad a lo largo del planeta, se acumula a una velocidad considerable en nuestro
medio ambiente. Las propiedades y estructura de este material le confieren gran utilidad
pero también le proporcionan una resistencia notable ante la biodegradación. De no
concretarse soluciones para mitigar el daño al medio ambiente que hace este como otros
plásticos, puede llegarse a generar una reacción en cadena medio ambiental que también
conllevaría a un problema de mayores proporciones. Recientemente el aislamiento de
una bacteria hace poco descubierta capaz de crecer en este plástico, el mejoramiento de
los genes que transcriben una de sus proteínas que le dotan su capacidad de degradar el
PET y el estudio sistemático de sus tasas de degradación; permite examinar de forma
preliminar cada una de las etapas del proceso de producción de esta enzima así como la
caracterización comparada y practicable de su actividad enzimática en la reacción de
despolimerización hacia este plástico. Los resultados como el procedimiento del
presente estudio detallan un proceso de producción largo y complejo. Se resulta además
en un proceso en el que su etapa determinante de reacción enzimática tiene tasas de
degradación similares a lo reportado en la literatura, pero se calcula que todavía no tiene
las mínimas características para acceder al nivel industrial.
Motivación
La creciente problemática a nivel global acerca de la contaminación de plásticos en
nuestras ciudades y más triste en nuestros ecosistemas, hace evidente precisar
soluciones para eliminar, o mejor aún; reutilizar los desechos de este material.
1. Introducción
Los plásticos tienen una gama de propiedades deseables de estabilidad que han hecho
que se produzcan ampliamente en diversos artículos de nuestro diario vivir.
Dependemos de los plásticos tanto que la cantidad sumada de producción alrededor del
mundo en 2014 fue 108 toneladas [1]. Los dos plásticos más utilizados son el polietileno
(PE) y el poli cloruro de vinilo (PVC). El tereftalato de polietileno (PET), el material
plástico eje del presente trabajo es el quinto plástico más usado alrededor del planeta, 9
X 106 toneladas se produjeron en el mundo en 2014. Este tipo de polietileno se usa en
todos los artículos de consumo masivo que contienen símbolo de reciclaje número 1 [2].
Reciclar cualquier plástico conlleva a que se reduzca el contenido energético del
material así como parte de sus propiedades originales. Este cambio en el material debido
al proceso de reciclaje hace también que el precio de este disminuya [3]. Por ejemplo, el
PET virgen tiene un contenido energético de 85 MJ/Kg en comparación al PET
reciclado el cual tiene 55 MJ/Kg, una disminución del 35%. Por esto, el precio del PET
virgen es 2 $/Kg y el del reciclado se reduce casi a la mitad a 1.1 $/Kg [1]. Los pasos
comúnmente necesarios para reciclar el PET son la recolección del material, su
inspección, corte, lavado, separación por flotación, el secado, la fundición, la filtración,
el peletizado, empacado, el calentamiento e iluminación de planta y el transporte del
material [4]. Por cierto, los procesos de corte, lavado y separación por lavado lo está
haciendo la naturaleza hoy en día en nuestros océanos, porque el oleaje, y ciertas
condiciones ambientales como la luz solar UV fragmentan este material a tamaños
microscópicos [5] [6] [7].
La imposibilidad de lograr que los plásticos reciclados tengan al menos la misma
calidad que sus materias primas de inicio, hace que al final este termine como material
basura después que se le haga uno o más ciclos de reciclaje. América Latina, África y la
mayoría de Asia son las regiones que tienen menos índice promedio de reciclaje en el
mundo [8]. De hecho, hace poco se ha estado propagando el conocimiento que los
plásticos representan una grave amenaza de contaminación global, en especial en lo
ecosistemas marinos [9], debido a las vidas ultra largas en el medio ambiente de la
mayor parte de los plásticos [10] [11] [12]. Son hasta 103 años predichos de
desintegración en condiciones normales [13].
Esta consecuencia en nuestros ecosistemas, si se toma como base el PET; nace del
hecho que particularmente este plástico es excesivamente firme ante la
despolimerización catalítica o biológica. La estabilidad alta de este poliéster se debe a
que sus enlaces éster tienen además accesibilidad limitada. A escala industrial, se ha
reportado la posibilidad de despolimerizar el PET por medio de químicos que rompen
sus enlaces ésteres internos [14] [15]. Esto se puede hacer por acción catalítica
utilizando compuestos órgano-metálicos [15] o por otras rutas como metanólisis,
glicólisis o hidrólisis [14]. Sin embargo el camino órgano-metálico no reporta
características de escalabilidad industrial y los caminos químicos últimos son realizados
a altas temperaturas y producen desechos extra nocivos [16].
Alternativamente, debido al bajo costo esperado y a su ventaja ecológica, métodos de
biodegradación han sido apoyados para controlar la contaminación de PET [17] [18]
[19]. En el año 2016, Yoshida et al. después de aislar bacterias de un basurero Japonés
puso en evidencia el descubrimiento de un nueva bacteria llamada Ideonella sakaiensis,
con la insólita capacidad de utilizar el sustrato plástico PET como su mayor fuente de
energía para su crecimiento [20]. Desde el 2005 se han realizado varios estudios que
mencionan enzimas que tienen la habilidad de degradar el PET [21] [22] [23] [24], pero
han sido estudios que no se conectan de manera simple por el hecho de utilizar códigos
genéticos distintos y porque no generan desintegración molecular de PET por medio de
rutas metabólicas [17]. Aun así, por análisis de árbol filogenético, se predice que las
bacterias que pueden tener capacidad para degradar el PET son Thermobifida fusca,
Thermobifida alba, Saccharomonospora viridis y la Ideonella sakaiensis [25]
Yoshida demostró que la capacidad inusual de la Ideonella Sakaiensis se debe a dos
enzimas, la PETasa y la MHETasa. La primera convierte el PET a Bis(2-hidroxietil)
tereftalato (MHET), ácido Tere ftálico mono(2-hidroxietil) (BHET) y ácido tereftalico
(TPA); y la segunda convierte el MHET y el BHET a TPA y etilenglicol [20].
Específicamente sobre la PETasa, a esta se le ha hecho análisis estructurales y se
distingue su similitud con hidrolasas alfa-beta, cutinasas y lipasas [26]. Así pues,
después del proceso de despolimerización por la ruta metabólica de la Ideonella
sakaiensis, los productos en solución acuosa que quedan mayoritarios son el ácido
Tereftálico y etilenglicol, siendo el etilenglicol el mayor constituyente.
Por un lado, el etilenglicol es utilizado principalmente en formulaciones anticongelantes
(50%) y como materia prima en la manufactura de poliésteres tal como el tereftalato de
polietileno (PET) (40%) [27]. También se utiliza en nichos específicos como
anticorrosivos, en la producción de algunas vacunas y como parte de formulaciones
preservantes de muestras biológicas [27]. Ahora por parte del ácido tereftálico, este
solido blanco es un químico commodity que se utiliza principalmente como precursor de
poliésteres PET, en ropa o en botellas plásticas. Varias millones de toneladas son
producidas anualmente de este químico [28]. Ademas el ácido tereftalico puede ser
utilizado como precursor para suplir catecol, un químico más fino utilizado en
farmacéutica y cosmética [29]. Para hacer esto se sigue parte de la ruta metabólica de la
Ideonella sakaiensis haciendo uso de 2 proteínas: ácido tereftalico- 1,2 dioxigenasa y
1,2dihidroxi-2,5ciclohexadieno-1,4dicarboxilato dehidrogenasa. Se han producido hasta
20 000 toneladas de catecol al año en el mundo en los últimos años [29].
En el presente estudio se persigue el fin de examinar cada una de las etapas del proceso
de producción de la mejor modificación genética de la PETasa conocida y asequible
[30] [17], así como la caracterización comparada y practicable de su actividad
enzimática.
1.1. Estructura
Después de un breve exordio al trabajo con la enzima PETasa, se define en primer lugar
tanto el problema general como el específico, de los cuales se relacionan los objetivos a
seguir. Luego se menciona el procedimiento para solucionar el problema particular que
busca el presente estudio. Se sigue cada objetivo procedimental procurando alcanzar las
condiciones necesarias que definen el éxito de cada etapa. Siguiente se reportan los
resultados obtenidos como también las discusiones asociadas a cada uno de ellos
consideradas más relevantes. Luego se dictaminan las conclusiones del presente trabajo
y finalmente se mencionan los trabajos futuros que se consideran necesarios.
2. Planteamiento del problema
2.1. General
Los materiales plásticos que se encuentran en diversos artículos de nuestro diario vivir
son productos considerablemente persistentes en el medio ambiente porque no existe
actividad enzimática común que permita romper sus cadenas poliméricas en
constituyentes simples. Particularmente los poli ésteres que contienen una gran
proporción de componentes aromáticos, tal como el tereftalato de polietileno (PET),
hacen que sean especialmente inertes ante la remediación biológica natural. Es así que
se ha estimado hasta 1000 años de degradación de este plástico en condiciones normales
[13]. Adicionalmente los altos costos del proceso de reciclaje en comparación con su
producción desde materias vírgenes, la excesiva producción y demanda, y la
acumulación de material desecho plástico en ecosistemas terrestres y marinos; hacen de
la eliminación o reaprovechamiento de este material un problema a nivel mundial.
Este problema per se genera la oportunidad para buscar rutas que mitiguen el impacto
ambiental negativo que conlleva el uso extensivo que se le ha dado al plástico, así que
es necesario indagar y precisar soluciones para eliminar o reaprovechar el material
desecho del plástico.
2.2. Especifico
En 2016 al aislar en un basurero Japonés la bacteria Ideonella sakaiensis creciendo en
sustratos PET y además al identificar que su capacidad peculiar de digerir plástico
corresponde a la acción de dos enzimas particulares; se abren más caminos para indagar
el uso de exclusivas enzimas como estas en la eliminación o reaprovechamiento de este
material plástico. En este caso la enzima PETasa, es transcrita originalmente desde los
genes de la I. sakaiensis y produce una acción de hidrolisis en las cadenas poliméricas
del PET que termina en la producción de componentes más simples [20]. Por tal razón,
los genes aislados de esta bacteria que traducen esta enzima han estado pasando por
modificaciones genéticas de mejora desde su descubrimiento con el objetivo de
aumentar sus rendimientos de hidrolisis [17] [18].
De esta manera, la disociación del plástico por rutas enzimáticas, se inicia partiendo del
proceso de transformación de los códigos genéticos óptimos en vectores de expresión,
para resultar en la producción y exposición enzimática ante sustratos plásticos en
condiciones aptas de reacción. De tal forma, surge la pregunta sobre la posible
escalabilidad industrial del proceso para despolimerizar el PET bajo acción primera de
la PETasa. Así entonces, existe la necesidad de seguir examinando el proceso de
despolimerización de PET con asistencia de la PETasa, con el objetivo de detallar sus
etapas involucradas con sus óptimos asociados, en especial su proceso último de
reacción enzimática [17] [31].
3. Objetivos
3.1. Generales
1. Examinar y ejecutar las etapas necesarias del proceso de obtención PETasa
poniendo en práctica óptimos reportados en literatura con un
microorganismo estudiado y asequible.
2. Suplir un sistema de reacción que ponga en contacto material desecho de
tereftalato de polietileno con PETasa.
3. Comparar en la medida de lo posible la actividad enzimática resultante en la
reacción de despolimerización PET-PETasa respecto a los reportes de
literatura disponibles en especial respecto al de Austin et al.
3.2. Específicos
1. Traer al laboratorio la mejor modificación genética posible del plásmido que
puede transcribir la PETasa.
2. Hacer varias extracciones de este plásmido.
3. Transformar genéticamente la bacteria E. coli K12 con los extractos de
plásmido hechos previamente.
4. Cultivar e inducir en medio liquido colonias individuales de bacterias
transformadas con éxito.
5. Ejecutar varias rutas de separación y purificación para aislar la PETasa.
6. Analizar la existencia de PETasa según las rutas de extraccion.
7. Seleccionar el mejor plástico de desecho hecho de PET para incorporarlo en
una posterior bio reaccion con PETasa
8. Ejecutar condiciones de bio reacción a distintas composiciones en la mezcla
de reacción.
9. Analizar el efecto de la composición en la mezcla de reacción, en la
actividad enzimática medible de la PETasa de la reacción de
despolimerización para PET.
4. Procedimiento
Para desarrollar este proyecto se siguió en orden las siguientes metodologías hasta
llegar a la reacción principal entre el sustrato de tereftalato de polietileno y la proteína
PETasa. Se procuró alcanzar en cada etapa del proceso su condición óptima según la
literatura para terminar examinando el proceso de reacción de despolimerización.
4.1. Selección y obtención del plásmido.
El plásmido PET21b(+)-IS-PETase-W159H-S238F (#112203) fue provisto por el
repositorio internacional sin ánimo de lucro de plásmidos Addgene [32]. Este plásmido
se ha escogido debido a que ha sufrido una optimización por codones para aumentar la
expresión en E. Coli k12 [30] y porque su transcripción genera la proteína IsPETasa con
una cola de poli histidina. Este material genético se le hizo un proceso tanto para
almacenaje a corto como para largo plazo [33]. En el ANEXO 9.1.1 se muestra en más
detalle lo necesario a tener en cuenta para hacer el almacenamiento correcto.
4.2. Extracto de plásmido y cuantificación de pureza
Luego de almacenar tanto para corto como para largo plazo se procedió a extraer este
plásmido PET21b(+) desde E. coli DH5α. Para hacer esto se aisló el ADN desde un
cultivo líquido fresco. La extracción y aislamiento del plásmido se hizo con ayuda de un
kit miniprep Monarch® NEB#T1010 de 50 preparaciones. Se usaron colonias
individuales desde un cultivo fresco en agar con 100 𝜇g/ml de ampicilina como
marcador de selección; para inocular medio de cultivo LB líquido. Se cultivó de 12 a 16
horas por la noche debido a que es un tiempo donde el contenido de plásmido es alto, a
37ºC y 200 RPM. El detalle de protocolo seguido para la separación y purificación del
plásmido se encuentra en el ANEXO 9.1.2.
4.3. Cultivo E. coli k12
Siguiente a la extracción del plásmido se procedió a hacer un cultivo de E. coli k12. La
transformación genética se realizó con la extracción y purificación del plásmido. La
cepa de E. coli k12 fue provista por el laboratorio de biofísica de la universidad. Se
emplearon placas con medio de cultivo indicador para corroborar como mínimo la
existencia de E. coli. El indicador utilizado fue Eosina Azul de metileno para corroborar
visualmente la existencia de E. coli. En este medio esta bacteria crece como colonias
violetas con brillo verde metálico [35].
4.4. Obtención de células competentes y transformación.
La preparación de células competentes para transformación dependió del método que se
escogió de transformación. Para transformar por electroporación se prepararon células
electro competentes y para hacerlo por choque térmico se prepararon células quimio
competentes. Las células para choque térmico se almacenaron en criogenia a -80°C
hasta su uso en la transformación. La preparación de dichas células se encuentra en el
ANEXO 9.1.3. Una vez preparadas células competentes E. Coli k12 y con la extracción
del plásmido de la IsPETase se procedió con la transformación genética. Para realizar la
transformación se siguieron los dos protocolos del ANEXO 9.1.4.
4.5. Inducción PETasa
Para la selección bacteriana se utilizó un medio LB con adición de 100 𝜇g/ml de
ampicilina, después se incubo a 37 ° C durante 16 horas. La induccion ocurre gracias a
la adición de IPTG que se realizó al inicio del proceso de crecimiento y hasta alcanzar
una concentración final de 1 mM.
4.6. Separación y purificación.
Para probar la acción de la IsPETasa se hace tomando soluciones provenientes de dos
rutas de separación y purificación. Ambos caminos iniciaron con un cultivo celular de
E. coli K12 fresco inducido para la síntesis proteica desde el crecimiento celular. En la
primera ruta se hace lisis en buffer RIPA con PMSF 1mM [36] [37] [38] y separación
de proteínas desde el interior del citoplasma de la célula por sonicación y
centrifugación. En el segundo camino se toma la mitad de la solución resultante previa y
se le hace un proceso de purificación cromatográfica con resina carga de níquel.
En el ANEXO 9.1.5 se encuentra en más detalle el proceso de sonicación y de
extracción por columna de cromatografía que permitió preparar las mezclas de reacción
de IsPETasa
4.7. Análisis de plásticos
Para probar la acción enzimática de la IsPETasa sobre un sustrato compuesto de
tereftalato polietileno se comprobó el material de desecho de PET o material con marca
de reciclaje 1 [2], en vez de materia prima virgen; con material PET de alta pureza. El
material de desecho se le hizo un análisis de calorimetría diferencial de barrido DSC
para corroborar su pureza. Este método puede proveer la temperatura de fusión
cristalina, la temperatura de transición vítrea, la temperatura de inicio de picos y el
porcentaje de cristalinidad de distintos polímeros [39]. Para determinar las propiedades
térmicas de los desechos plásticos se utilizó el termo grama originado por un equipo
previamente calibrado DSC Q 2000 con sistema de refrigeración 90 RCS y estación de
análisis de datos para el manejo, el almacenamiento y cálculos a partir de estos. Las
medidas fueron hechas a una velocidad de calentamiento de 6 K/min, con muestras que
comprendieron de 2 a 4 mg de muestra. Siempre se tiene en cuenta una cacerola de
muestra referencia. Se probaron 5 materiales desecho como muestras con 2 repeticiones
cada una: cocacola® 500mL, tostato® hidratante tropical 600mL, Canada Dry® 400mL
y Agua cristal® 600 mL.
Las propiedades térmicas que son comparables a una resina PET son una temperatura
pico endotérmica o de fusión cristalina de 248,5°C y una temperatura de inicio de este
proceso de 240,8°C [40] [41]. Adicionalmente, el PET con una cristalinidad del 100%
tiene un cambio de entalpia de fusión de 140J/g [42], así la cristalinidad es la
proporción del cambio de la entalpia de la medición y la entalpia del PET con 100% de
cristalinidad [41]. Ahora, el peso molecular promedio de las botellas de PET se tomó en
53400g/mol [43]. Este se halla por métodos de ensayo de grupos carboxilos e hidroxilos
finales y por uso de GPC. Este peso molecular promedio es necesario para calcular la
entalpia específica de fusión cristalina en la medida.
4.8. Caracterización de PETasa
La máxima caracterización posible es la cuantificación de pureza en las extracciones, la
concentración de la proteína, la afinidad de separación y purificación, y la actividad
enzimática. Por obstáculos metodológicos se evaluó exclusivamente la presencia de la
PETasa en el eluato de purificación, su concentración calculada por nanodrop® y la
actividad enzimática por medición indirecta.
4.8.1. Presencia
La concentración de la IsPETasa en la etapa de purificación con cromatografía de níquel
se puede evaluar con distintos métodos. El ensayo de Bradford [44] [45] y la
cuantificación con nanodrop [46] son métodos aconsejados por razones de accesibilidad
y sensibilidad. El ensayo utilizando el ácido bicinconinico logra también buena
resolución de concentración proteica [47] [48].El ensayo de Bradford depende del
compuesto brillante de Coomassie G250, el cual forma un complejo colorido azul
cuando se une a las proteínas y de color rojo estando en su forma libre. Este complejo
final tiene alto coeficiente de extinción molar, se forma relativamente rápido y es
estable por 1 hora [44]. El problema de este método es que se debe crear un estándar de
proteína que contenga exactamente de 0 a 20 microgramos y en este estudio de
cuantificación la concentración es lo que precisamente se quiere conocer. En otras
palabras para lograr con notable exactitud la concentración proteica por este método se
deben hacer distintas curvas analíticas para calibrar la concentración. Este ensayo va
más allá del alcance del presente trabajo.
El método que se utilizó para comprobar la existencia de proteína en el eluato
proveniente de la purificación con NI+2, fue midiendo la absorbancia que presenta el
buffer de elusión (blanco) y el eluato de proteína particularmente a 205 nm y 280 nm.
Los enlaces peptídicos tienen su pico de absorbancia a 280nm y los enlaces aromáticos
proteicos la tienen a 205 nom [49]. La diferencia de absorbancias entre el eluato ye el
blanco permitirá corroborar la presencia de la proteína en el eluato.
Ahora, el método que se utilizó para el cálculo de concentración de la proteína de
interés es por nanodrop. La medición con este dispositivo se hizo utilizando un volumen
de 1 tanto de buffer de elución como de solución con proteína eluida. El nanodrop
tiene aplicaciones pre- programadas para la cuantificación directa de proteínas
utilizando medidas de absorbancia a 280 nm y 205 nm [50].
4.8.2. Actividad enzimática
En este punto del procedimiento se llegó a uno de los objetivos principales de este
estudio. Aquí se hicieron ensayos enzimáticos con varias soluciones de esta hidrolasa
para determinar algunos atributos particulares como la actividad enzimática en unidades
enzimáticas, la actividad específica, y el número de recambio. La actividad enzimática
se refiere a las moles de sustrato convertidas en unidad de tiempo o la velocidad de
conversión por su volumen de reacción. La actividad específica es la actividad de la
enzima por miligramo de proteína total, esta característica da una medición de la pureza
de la proteína en la mezcla [51]. Por otro lado el número de recambio es definido como
el número máximo de conversiones químicas de las moléculas del sustrato por segundo
que resultan en un sitio único catalítico por una concentración de enzima particular. El
número de recambio puede saberse directamente después de la actividad específica
porque el peso molecular enzimático esta reportado en la literatura [52].
Este ensayo enzimático es indirecto y se hizo midiendo la disminución másica del
sustrato plástico por la acción de la isPETasa en solución acuosa. En este ensayo se
calcularon diferencias significativas entre la disminución másica a distintas condiciones
de solución de proteína y se compararon con lo reportado en la literatura.
La digestión con esta proteína se hizo fijando las siguientes condiciones en la reacción:
1- Volumen máximo de solución de proteína diluida de 1,5mL en tubos eppendorf
de este volumen.
2- El sustrato será el material plástico de desecho más parecido a PET puro
(obtenido en la sección de análisis de plásticos DSC previo)
3- El sustrato en cada prueba es un disco de 3mm de radio y 1 mm de ancho que
pese entre 4 y 6 mg.
4- Temperatura de reacción a 30ºC
5- Tiempo de reacción 108 horas
6- Agitación mantenida en la reacción de180 RPM
Con estas condiciones establecidas, el factor que cambio en este ensayo solamente fue
la composición de la solución que contenía la isPETasa y que estuvo en contacto con el
sustrato plástico. La Tabla 1 muestra las 5 distintas soluciones que se evaluaron, su
porcentaje en la mezcla de reacción y una leve descripción; la Tabla 2 muestra el
número de muestras que se hicieron con cada condición de solución.
Solución
+isPETasa
% Volumen reacción
Después de
sonicación y
separación
solidos
Purificación
columna
níquel eluato
Purificación
columna
níquel
lavado
Solución
optimizadora
1 100 0 0 0
2 0 0 100 0
3 0 33 0 66
4 0 100 0 0
5 0 0 0 100
Tabla 1. Condiciones de composición de la mezcla de reacción con PETasa
No.
Muestras
#
Solución
1 a 6 1
7 a 9 2
10 a 15 3
15 a 18 4
19 24 5
Tabla 2. Numero de muestras para evaluar el efecto de cada solución
La solución de optimización presente en la solución número 3 se compone de 500mM
Sulfato de sodio Na2SO4, 20%V/V total de glicerol, y pH 8 con buffer fosfato.
Para hacer la medición correcta de peso de las muestras de plástico antes y después de
reacción, lo cual permite medir indirectamente la actividad enzimática promedio; se
eliminó la humedad en la muestra como los residuos líquidos de solución. Siguiente al
ANEXO 9.1.6 este lineamiento se hizo con el siguiente proceso:
1. Pesado de muestras después de cortadas del material plástico residuo escogido.
2. Secado de 16 horas a 75°C (no superar el punto de transición vítrea).
3. Pesado de muestras antes de envasarlos en los eppendorfs de reacción.
4. Preparación de solución mezcla de reacción con muestra de sustrato y PETasa
diluida.
5. Incubación por 108 horas a 30°C.
6. Recolección y lavado de muestras con etanol y agua
7. Secado de 16 horas a 75°C.
8. Pesado de muestras individuales según su número de muestra
9. Calculo de masa de sustrato perdida.
5. Resultados y discusión.
5.1. Selección y obtención del plásmido.
La bacteria E. coli DH5∝ transformada con el plásmido PET21b(+)-IS-PETase-
W159H-S238F ], fue seleccionada satisfactoriamente en 6 platos de agar estéril cada
uno con 100 μg/mL de ampicilina filtrada. Los platos se renovaron a los dos meses
después de la primera selección. Siguiente a esto se preservó esta bacteria y su plásmido
a largo plazo en 3 crioviales con el respectivo protocolo recomendado de criogenia a -
80°C presente en el ANEXO 9.1.2. La bacteria en estas condiciones puede ser replicada
hasta 20 años después.
5.2. Extracto de plásmido y cuantificación de pureza
Se hicieron 6 extractos del plásmido PET21b(+)-IS-PETase-W159H-S238F con ayuda
del kit miniprep Monarch® NEB#T1010 [34] y su respectivo protocolo de extracción de
ADN resumido en el ANEXO 9.1.2. Cada extracto contuvo 30 μl de buffer elución y
concentraciones calculadas del plásmido (con asistencia del dispositivo nanodrop one®
Thermo Scientific) explicitas en la Tabla 2. El pH registrado de cada extracto se
muestra también en esta tabla.
Extracto Concentración ADN
(ng/𝛍L))
pH
1 3,75 7.1
2 13,31 7.3
3 18,64 7.3
4 28,35 6.9
5 31,28 7.1
6 12,15 7.0
Tabla 3. Concentración de ADN en los extractos de plásmido.
Se puede ver que el extracto 4 y 5 fueron los más concentrados de plásmido. Pero hay
tres observaciones acerca de las concentraciones de extracción obtenidas:
1. En el caso del plásmido PET21b(+)-IS-PETase-W159H-S238F, este tiene un
origen de replicación pUC con replicón pMB1 [53], el cual permite clasificarlo
como un plásmido de alto número de copias por célula, más de 75 [34]. El
plásmido tiene un tamaño de 6,2kbp y el origen de replicación está ubicado del
1629bp al 2217bp.
2. El nanodrop® calcula la concentración del plásmido extraído basándose en dos
proporciones de absorbancia medida, la primera es respecto a las absorbancias
de 260nm/280nm y la segunda respecto a las de 260nm/230nm [50].
3. Las especificaciones del kit miniprep utilizado aseguran para el tamaño de
plásmido en cuestión (6.2 kbp) una concentración máxima de 255 ng/μL. Según
cálculos se obtuvo un orden de magnitud menor al rendimiento máximo de
extracción en los extractos más concentrados. También que la capacidad de
adhesión de las columnas del kit son hasta 20 μL de ADN , pero por resultados
obtenidos no se utilizó más del 0,5% de capacidad de estas columnas.
Estas observaciones permiten asegurar solamente que existe en el extracto una
concentración de plásmido que aunque no es la mejor si es suficiente para las etapas
posteriores de transformación en E. coli k12.
5.3. Cultivo E. coli k12
Desde el cepario interno no pudieron recuperarse las células provenientes de 3 crio
viales que contenían la cepa E.coli k12 [54] [55]. Por esta razón muy amablemente hubo
colaboración desde los laboratorios de biofísica de la universidad. Para la transferencia
de esta cepa específica, su identificación de traspaso fue E. coli k12 mg1655. Esta cepa
tiene una taxonomía principal de E.coli K12 [56].
Al hacerse el método de verificación de E. coli con medio selectivo de eosina azul de
metileno, crecieron varias colonias violetas con poco brillo verde metálico. Se puede
concluir así que había al menos presencia de E.coli.
5.4. Obtención de células competentes y transformación
El método final realizado para hacer células competentes y así la transformación
bacteriana fue por choque térmico, aunque tiene mejores rendimientos la transformación
bacteriana por electroporación [57], especialmente para la transferencia de moléculas de
ADN relativamente grandes. Se prepararon varias alícuotas de células competentes para
electroporación, pero se presentaron problemas técnicos en las cubetas del
electroporador disponible debido a generación de arcos eléctricos internos y de esta
manera la transformación no podía hacerse. Así para la transformación bacteriana, al
final se generaron células quimiocompetentes. Se generaron 12 soluciones de células
quimiocompetentes y se almacenaron en criogenia para luego ser usadas en la
transformación. Una vez descongeladas estas soluciones no es recomendable utilizarlas
de nuevo.
Las células competentes por este método deben su competencia a la actividad de iones
en solución de CaCl, a la presencia de moléculas de glicerol en la solución que las
contiene y a condiciones de pH óptimas. Es necesario esto porque la transformación
bacteriana no ocurre en condiciones que normalmente ocurren en la naturaleza [58]. De
esta manera estos factores facilitan la toma del plásmido por parte de las células E. coli
en el punto cúspide de la transformación. Aquí es cuando las células tienen el máximo
estrés posible para forzar adquirir moléculas de ADN. Por parte de los iones estos
equilibran la carga iónica del exterior de la célula con su parte interior en el momento
que se empiezan a quebrar las paredes celulares. También el glicerol facilita la
descongelación de las células haciendo que estas no se quiebren desde -80°C.
Ahora bien, debido a que no se pudo realizar la transformación bacteriana por
electroporación se hizo este procedimiento por el método clásico de choque térmico. La
transformación fue posible en el tercer intento, gastando un total de doce cajas petri con
agar y ampicilina como marcador de selección a la concentración necesaria
(100μg/mL). En este proceso crecieron solo 5 colonias individuales repartidas en 2 cajas
Petri. El blanco fue E. coli k12 sin proceso de transformación. En el ANEXO 9.2.2 se ve
registro fotográfico de las 2 cajas Petri en las que crecieron las colonias E. coli k12
transformadas con el gen de producción de la is-PETasa (derecha) respecto al blanco
(izquierda) el cual tenía E. coli k12 sin transformar. En rojo se recalcan las colonias que
crecieron.
5.5. Inducción PETasa.
Para hacer la inducción se utilizó IPTG. Este inductor una vez se preparara su solución
madre (100mM) se tuvo la precaución de pasarse por filtro de 3μm para su
esterilización. Así, desde un cultivo previo en platos agar con antibiótico se pasó a hacer
crecer 3 cultivos líquidos de un total de 150 mL. Estos cultivos también tenían
antibiótico, pero en adición tenian IPTG 1mM para inducir la producción de proteína.
El IPTG es un imitador molecular de la alolactosa que a diferencia de esta, no es
hidrolizable por una proteína natural de muchas bacterias llamada beta-galactosidasa
[59]. Por tanto, su concentración se mantiene sin cambio durante la inducción proteica.
El IPTG aquí es un metabolito que desencadena la transcripción del operon Lac [60].
Este operon Ltac está presente en el plásmido PET21b(+)-IS-PETase-W159H-S238F
del 5132 bp al 5156 bp [53] y es el que propicia la transcripcion de la PETasa, pues el
operon se ubicada cascada arriba del gen de interes.
No existe un óptimo de producción de proteína en el proceso de inducción respecto al
tiempo en que se añade IPTG después de iniciar un cultivo fresco celular. La adición de
IPTG para inducir la producción proteica aumenta máximo 1.5% si se añade 4 horas
después de que se empieza el cultivo celular según literatura [61].
5.6. Separación y purificación
Para asimilar la complejidad y la especificidad del proceso de separación y purificación
de la PETasa se empieza por tener en cuenta que las células E.coli producen en su
mantenimiento celular alrededor de 106 proteínas [62]. La isPETasa se encuentra al
interior del citoplasma, así que la primera etapa de separación consiste en romper la
pared celular de las E.coli k12 transformadas e inducidas para liberar todo su contenido
proteico al medio. La liberación del contenido del citoplasma al medio circundante se
realiza comúnmente con el proceso de sonicación. En este proceso de quiebre de pared
celular se concentraron en 30 mL de buffer RIPA las células frescas de 90mL de cultivo
inducido. Al final de la sonicación se le debe hacer un proceso de centrifugación, de lo
cual se debe tomar el sobrenadante del buffer RIPA. Este sobrenadante es una solución
que incluye la PETasa con muchas más proteínas.
Luego se tomó la mitad del volumen del sobrenadante para purificarse con asistencia de
una columna de cromatografía cargada de iones de níquel. Este volumen de
sobrenadante pasó a ser 12 mL de solución eluato de PETasa con pH medido de 7.4.
En teoría el eluato solo debería tener presente en su solución la PETasa. Esto debe
ocurrir porque una vez pasada la columna por el buffer de lavado el cual retira
impurezas y se aplica justo antes del buffer de elución; el buffer de elución remplaza los
sitios de coordinación de los iones níquel que atrapan la terminación de 6x poli histidina
presente en la cola de la PETasa [63] [64] [42] [53] y libera de esta forma esta proteína
atrapada por la columna cromatográfica.
5.7. Análisis de desechos plásticos de PET
Este análisis arroja que el plástico de desecho de la botella Cocacola® 500mL es el mas
cercano a PET puro. Siendo así este se favoreció como sustrato ante la reacción de
despolimerización con PETasa. Las purezas calculadas en las dos repeticiones hechas
con el plástico de esta botella por el equipo DSC utilizado fueron las más altas con un
valor promedio de 87mol%. Los resultados de todos los análisis de calorimetría
diferencial de barrido hechos en las botellas plásticas se muestran en el ANEXO 9.2.3.
A los resultados de este anexo debe tomarse el peso molecular promedio del PET como
53000g/mol para calcular la pureza molar [43].
Nunca es posible alcanzar 100% de cristalinidad en condiciones de procesamiento
normales [65] [66], pero altas cristalinidades son alcanzadas en cristalización a altas
temperaturas y por enfriamiento muy lento desde fusión. Por lo general el PET que se
encuentra en el mercado tiene menos de 90% de cristalinidad [67] y es semicristalino
con fases cristalina y amorfa coexistiendo [68]. La medición de cristalinidad no fue
posible por los resultados DSC porque existió un error que se repetía en toda las
muestras y fue que existía una pendiente negativa en la medición de flujo de calor
respecto a la temperatura. Este error se debe probablemente a un problema de medición
del equipo disponible que el mismo trata de corregir tomando en cuenta está pendiente
(-534.9mW/°C).
Aun así, según la norma ASTM internacional D3418 se puede aseverar la
caracterización de la calidad del PET por medio de la temperatura extrapolada de inicio
de cristalización y la temperatura pico de fusión [69]. De esta manera, solo se
caracterizó la mejor pureza del PET respecto a estas temperaturas características porque
existió un error en la medición del calor específico de cristalización y por consiguiente
su cristalinidad. En la 0 se muestra la temperatura extrapolada de inicio de cristalización
y la temperatura pico de fusión medida en cada muestra plástica así como la diferencia
de estos valores según la literatura.
Muestra
T
extrapolada
de inicio de
cristalización
(°C)
T pico
de
fusión
(°C)
Diferencia T
extrapolada de
inicio de
cristalización
por literatura
Diferencia T
pico de
fusión por
literatura
Cocacola® 500mL
1 236,5 248,24 -1,8% -0,1%
Cocacola® 500mL
2 233,01 248,98 -3,2% 0,2%
Canada dry®
400mL 1 235,7 248,6 -2,1% 0,0%
Canada dry®
400mL 2 233,49 247,98 -3,0% -0,2%
Cristal® 600mL 1 233,27 247,28 -3,1% -0,5%
Cristal® 600mL 2 232,68 247,42 -3,4% -0,4%
Tostao® 600mL 1 233,82 247,14 -2,9% -0,5%
Tostao® 600mL 2 242,73 248,29 0,8% -0,1%
Tabla 4. Comparación de mediciones DSC de muestras desecho plásticas respecto
a la literatura.
5.8. Caracterización de PETasa
5.8.1. Validez
Las 4 soluciones analizadas fueron: la solución sobrenadante del proceso de sonicación,
el ultimo buffer de lavado después de pasar por la columna cromatografica, la solución
eluato de proteína, y el buffer de elución usado en la cromatografia de afinidad. En
primera instancia se midió el espectro de absorbancia de estas soluciones desde 200nm
a 300nm para observar picos distinguibles en 205nm y 280nm. El espectro de absorción
de cada solución analizada se muestra en el ANEXO 9.2.4. Se pueden ver varios
patrones en las cuatro gráficas. EL más notable es que existen algunas impurezas que
tienen mayor concentración que las proteínas y absorben longitudes de onda cercanas.
La impureza que se repite en las cuatro graficas tiene su pico de absorción en 230nm.
La impureza que ocurre cerca de 210 nm es imidazol [70] proveniente de los buffer de
lavado y elución de proteína. Se puede observar también en todos los espectros
tomados, que en la región desde 230 a 290 nm hay una banda de absorción que tiene
pico entre 255nm y 260nm. Esta banda de absorción disminuye notablemente desde la
solución que proviene del sonicador. Es de esperarse esta disminución, porque significa
que la columna cromatografica dejo pasar casi un millón de proteínas presentes en el
citoplasma [62] para acomplejar las únicas que pudieran unirse a la columna, es decir la
PETasa.
Por parte de la medida de concentración hecha en el nanodrop, se tomó una gota de 1
de tres soluciones para observar tanto su espectro de absorción como para estimar
por el método del equipo la concentración de proteína [50]. En el ANEXO 9.2.4 se
muestran estos datos. La solución tomada como blanco es el buffer de elusión, y las
muestras a partir de este son la fracción de lavado, y el eluato. Así, la concentración
calculada de proteína en el eluato de PETasa fue 1,25 mg/ml.
En cuanto a las medidas de absorbancia a las longitudes de onda específicas de 205nm y
280nm [46] estas se hicieron comparando dos soluciones: el buffer de elución y el
eluato. Se hicieron dos réplicas de cada experimento con entre 6 a 9 muestras. De estos
datos se puede corroborar que la absorción del eluato en 205nm y en 280nm es
significativamente mayor que en el buffer de elución con más de 99% de confianza (ver
ANEXO 9.2.5). Si se supiese el coeficiente de extinción molar de la PETasa y se
asumiera que el extracto tiene estrictamente solo esta proteína se puede llegar a saber
directamente la concentración. Para saber la concentración de esta como otras proteínas,
el ensayo de Bradford o el de ácido bicinconinico resultan ser de gran exactitud [44]
[45] [47] [48].
De esta forma se asegura que en el eluato existe PETasa a una concentración no
conocida. Esto debe ser así porque no hay más proteínas presentes en la solución a
purificar que puedan acomplejarse con los iones Ni+2 presentes en la resina. La PETasa
que proviene del gen PET21b(+)-IS-PETase-W159H-S238F esta modificada
genéticamente para traducir en una proteína que en su terminación tiene etiqueta 6X his
[53].
Adicionalmente, se puede obtener la concentración de esta PETasa como de otras
proteínas midiendo las curvas de fusión con la temperatura de fusión de soluciones
concentradas de proteína. Por ejemplo, la temperatura de fusión asociada a la
IsPEtaseW/T
y IsPEtaseC203A/C239A
es respectivamente 46.8°C y 33.6°C [25]. Para hacer
esto se puede seguir el método de micro calorimetría diferencial de barrido de proteínas
[42] o por sistemas de PCR en tiempo real [25].
5.8.2. Actividad enzimática.
Los sustratos plásticos en cada prueba fueron discos individuales de radio promedio
3mm y espesor 1mm, los cuales fueron cortados desde una botella Cocacola 500mL.
Luego gracias al proceso de secado a 75°C y 18 horas se retiro 3% promedio de su peso
a causa de humedad. Esta disminución de peso se debe a la eliminación del agua de su
superficie debido la humedad del ambiente. Al culminar el proceso de secado y la
medición de masa inicial de cada disco sustrato de PET, se realizaron las mezclas de
reacción presentes en la 0 y se ejecutaron al mismo tiempo los ensayos de reacción
presentes en la 0. Después de 4 días y medio se sacaron de la incubadora las mezclas de
reacción, se retiraron de las mezclas los sustratos plásticos individuales, y a cada disco
sustrato debidamente rotulado se le hizo el mismo proceso de secado a 75°C y 18 horas.
En la 0 se muestran las mediciones de diferencia de masa del sustrato plástico en las 24
muestras de despolimerización teniendo el mismo proceso de secado para cada sustrato.
Se puede ver en el registro que la solución base 3 fue la única que generó efecto
medible sobre la disminución de peso de los sustratos plásticos. También que la mayor
diferencia de reducción másica se encuentra en la muestra 11.
No.
Muestra
#
Solución
base
Peso
inicial
sustrato
seco
(mg)
Peso
final
sustrato
seco
(mg)
Diferencia
(mg)
1 1 4,7 4,7 0,0
2 1 4,5 4,5 0,0
3 1 5,0 5,0 0,0
4 1 5,1 5,1 0,0
5 1 4,9 4,9 0,0
6 1 4,3 4,3 -0,1
7 2 5,0 5,0 0,0
8 2 4,0 4,0 0,0
9 2 4,7 4,6 0,0
10 3 5,1 5,0 -0,1
11 3 5,7 5,4 -0,3
12 3 4,7 4,6 -0,1
13 3 4,5 4,5 0,0
14 3 4,9 4,7 -0,2
15 3 5,0 4,9 -0,1
16 4 5,0 5,0 0,0
17 4 5,3 5,3 0,0
18 4 4,2 4,2 0,0
19 5 4,9 4,9 0,0
20 5 5,0 5,0 0,0
21 5 4,1 4,1 0,0
22 5 5,1 5,1 0,0
23 5 4,7 4,7 0,0
24 5 4,2 4,2 0,0
Tabla 5. Mediciones de diferencia másica en las muestras plásticas
Partiendo de este hecho se observa entonces actividad enzimática en una reacción de
despolimerización. Esta reacción descompone las cadenas plásticas de tereftalato de
polietileno (PET), con un peso molecular promedio de 53000g/mol [43]; en productos
que tienen pesos moleculares de menos de 300g/mol [17]. Los compuestos
constituyentes de esta reacción son Bis(2-hidroxietil) tereftalato, ácido Tere ftálico
mono(2-hidroxietil), ácido tereftalico; que en forma reducida respectivamente se
pueden llamar BHET, MHET y TPA [20].
En el estudio de la isPETasa acerca caracterización e ingeniería de esta poliesterasa
[17], publicado por Austin et al. (procedimientos de la academia nacional de ciencias
Estadounidense); se crea la mejor mutación asequible de aumento de rendimiento
enzimático de la PETasa partiendo del gen original de la bacteria Ideonella sakaiensis
responsable de transcribir esta [17]. En este estudio de caracterización parte de su
metodología dispone para su experimentación de cupones de 6mm de diámetro con
condiciones de reacciones similares. Estas pueden compararse con las utilizadas en el
presente trabajo a diferencia que esta caracterización mencionada tenía una
concentración inicial conocida de PETasa en la mezcla de reacción.
Uno de los resultados del estudio de caracterización de Austin et al., es la concentración
de los tres productos resultantes en el medio liquido de reacción después de llevar a
cabo la degradación del sustrato plástico PET con la PETasa. Las condiciones de
reacción del presente trabajo que fueron similares a las efectuadas en el estudio de
caracterización e ingeniería Estadounidense son:
1- En el estudio de Austin et al. se llevó a cabo la reacción durante 96 horas y en el
presente trabajo durante 108 horas, ambas a 30°C.
2- Se hizo la reacción al interior de tubos eppendorfs de 1,5mL.
3- Se utilizaron 500 μL de solución de PETasa, aunque en el estudio Norte
Americano la concentración inicial de PETasa era 50nM.
4- Se usó sustrato plástico en forma de cupones de 6mm de diámetro (peso
promedio entre 4mg y 6 mg).
La única condición que se varía en el presente estudio es la composición de la mezcla de
reacción, en la Tabla 1 se define la procedencia de las mezclas utilizadas respecto al
proceso de extracción y purificación. Ahora bien, puede que las condiciones no sean
óptimas para abrir el sitio activo presente en la IsPETasa y por eso no se nota registro de
actividad en la solución número 2; o que la concentración de la PETasa en esta solucion
sea lo suficientemente baja para no tener actividad medible.
Los resultados también demuestran que la actividad enzimática de la PETasa en la
solución 1 es por lo menos un orden de magnitud inferior a la que se registra en el
eluato purificado de proteína con solución optimizadora. Este hecho, tomando posibles
consideraciones de costos asociados a proceso, abre la cuestión si vale la pena tener en
cuenta el proceso de purificación para el uso de esta u otra hidrolasa con el mismo fin.
En específico, se resaltan tres patrones en los resultados obtenidos de disminución
másica:
1. La solución de PETasa que solamente tenía eluato desde la columna
cromatográfica de níquel (solución 2) no tuvo actividad medible en la
disminución másica del sustrato.
2. La solución de PETasa que era 50% eluato de la columna cromatográfica de
níquel y 50% de solución optimizadora (solución 3) fue la única que registro
actividad.
3. El resto de soluciones, es decir la 1, 2 y 5, no tuvieron registro de actividad por
lo menos medible.
En específico se midió la mayor diferencia de reducción de masa en la muestra 8. En
esta muestra aleatoriamente estaba el sustrato plástico más pesado de la serie de
experimentos, el cual registro una disminución másica máxima de 0,3 mg, o 5%. EL
promedio de disminución másica fue 0,13mg, o 2.5%. Se puede comprobar que la
disminución másica por la reacción de la solución 3 es mayor de 0 con 97,5% de
confianza, es decir que hubo actividad enzimática en el sistema de reacción PET-
PETasa. La prueba t relacionada asi como el intervalo de confianza de las mediciones
de cada solución se muestra en el ANEXO 9.2.6. Con esta prueba t se predice que el
intervalo de la reducción másica por la reacción de la solución 3, a 97,5% de confianza;
está entre -2,7mg a 0mg.
El ANEXO 9.2.7 muestra la estimación y las suposiciones para caracterizar la actividad
enzimática de la PETasa. El ponderado de actividad enzimática, actividad específica y
número de recambio se resume en la 0.
Característica
enzimática
Valor
promedio
estimado
Comentario
Actividad
enzimática
[𝜇𝑚𝑜𝑙
𝑚𝑖𝑛 ]
3 ∗ 10−4 Moles de sustrato convertidas en unidad de tiempo
Actividad
especifica
[𝜇𝑚𝑜𝑙
min 𝑚𝑔 ]
1 ∗ 10−4 Actividad de la enzima por miligramo de proteína
total
Numero de
recambio [𝑠−1] 4 ∗ 10−3 número máximo de conversiones químicas de las
moléculas del sustrato por segundo
Tabla 6. Medidas de caracterización enzimática de la PETasa en presencia de la
solución optimizadora
En el estudio de Yoshida acerca del descubrimiento de la primera enzima PETasa, la
actividad de esta enzima no fue medida debido a que se salía de los límites de detección.
Además, la cinética de Michaelis-Menten no puede ser aplicada por lo menos sin
modificaciones, debido a que en la hidrolisis enzimática de PET interviene una reacción
heterogénea de dos fases [20]. En cuanto al estudio de caracterización e ingeniería de
esta enzima hecho por Austin et al., la doble mutación S23F/W159H construida en tal
estudio y presente en los genes del plásmido que se usó en el presente trabajo; tan solo
asegura un incremento de actividad, pero no se expone ninguna medición de actividad
enzimática [17]. De hecho solo se puede ver que la actividad con esta doble mutación
debe ser mayor que la de la PETasa descubierta por primera vez. Así, las
concentraciones medidas de MHET y TPA después de 96 horas de reacción con la
PETasa traducida del plásmido modificado de doble mutación, son respectivamente
150mg/L y 60mg/L. De esta manera al tener un volumen liquido de reacción máximo de
1,5 mL en cada eppendorf de ensayo, se predice por acción de 50nM PETasa [17], una
despolimerización máxima de en total 0.315 mg de sustrato. Este valor máximo de
disminución másica del sustrato predicho en el estudio de Austin et al. tiene el mismo
orden de magnitud que el valor máximo obtenido en el presente ensayo enzimático pero
en condiciones de optimización. El valor máximo de masa despolimerizada calculado en
tal estudio es 1.3 veces mayor que el promedio alcanzado de despolimerización en el
presente trabajo.
La cuestión es que la concentración de proteína utilizada en el estudio de
caracterización e ingeniería se sabía con más precisión que la que se tiene calculada en
el presente estudio con asistencia del nanodrop, como se muestra en la comparación del
ANEXO 9.2.8. Esta comparación de composición proteica utilizada en el volumen de
reacción de ambos estudios indica una cuestión veraz y es que la concentración
calculada de PETasa por nanodrop debe ser mayor a la que fue utilizada realmente. Para
llegar a concentraciones de proteina de la magnitud que calcula el nanodrop es
cuestionable utilizar procesos de filtración en gel y diálisis [42]. También, la
concentración proteica derivada del nanodrop se estima debe ser mayor a la verdadera
porque de ser así se esperaría una disminución másica mayor. Esto debería ocurrir a
menos que pasen dos circunstancias: que haya una fracción significativa de PETasa
desnaturalizada en la solución de reacción, o que la velocidad de reacción no se vea
alterada significativamente por la concentración de proteína. En ambos casos no hay
información suficiente para confirmar estadísticamente esta cuestión. El resultado de
esta esta situación es que el cálculo de la actividad específica y el número de recambio
pueden servalores más pequeños que los calculados.
La última observación respecta a la ventaja que provee el uso de la solución de
optimización. Esta solución con la demás condiciones de optimización utilizadas
asegura una actividad enzimática superior a la de las condiciones normales en 6 veces
su valor. La mezcla de reacción a temperatura de 30°C, con pH de 8, en 20% glicerol
V/V y con 500mM de sulfato de sodio aumentaría respectivamente 1.2, 1.2, 1.8 y 2.4
veces la actividad enzimática [71]. Esta optimización en la composición de la mezcla de
reacción utilizada fue la condición que permitió medir una diferencia másica en el
sustrato.
5.10 Discusiones adicionales
No se verificó que la secuenciación del plásmido comprado correspondiera al
gen pedido. Se confió en el repositorio de plásmidos sin ánimo de lucro
Addgene [33] y no se incluyó la comprobación del repositorio pedido, la cual se
puede hacer por secuenciación genética [30].
Cuando se está usando una enzima en una reacción bioquímica, también puede
ocurrir una reacción de transcripción inversa. Nunca se está utilizando
totalmente en la solución una sola enzima [72]. Pero el hecho que se haga
extracción con columna de ion níquel +2 [63] [64] reduce la cantidad de
proteínas presentes en el medio y deja las que puedan acomplejarse por sus
etiquetas en la cola (tag), provistas de las modificaciones genéticas anteriores
[30] [17].
Además de esto, la eficiencia de la reacción bioquímica depende de los cambios
que se presenten en la conformación de la proteína ante los mejores estados.
Estos mejores estados son un rango de posibilidades que depende sensiblemente
de la temperatura, el pH, la concentración de iones, la tensión mecánica de la
mezcla de reacción, e inclusive el microambiente de la solución [72] [31]. Estos
estados de conformación impactan por consiguiente la actividad y la eficiencia
de la enzima.
En la mezcla de reacción que proviene del sobrenadante de la sonicación existen
más de un millón de proteínas [62]. La especificidad de separación es muy alta
para aislar la PETasa del resto de proteínas presentes en los medios de reacción
y además existe la posibilidad que las proteasas en el medio disminuyan la
concentración de PETasa.
Para seguir con mayor exactitud y precisión el progreso de reacción se deben
tener en cuenta métodos de HPLC, microscopia SEM y electroforesis en gel para
resultar en mejor precisión y exactitud en la actividad enzimática de la PETasa
[31] [17]. Para hacer lo mismo respecto a la concentración de proteína se debe
preparar método de Bradford [44] [45] o de ácido bicinconinico [47] [48].
La optimización de la solución se revela sin detergentes [71], así que en la
solución RIPA, previa al proceso de sonicación de paredes celulares; se debe
tener una concentración preferiblemente mínima de detergente [42] [36].
Para muchas aplicaciones relevantes industriales la frecuencia de recambio o
número de recambio oscila entre el rango de 10−2𝑠−1 a 102𝑠−1 [73]. Los
resultados de actividad medidos, aun teniendo un error de estimación que hacen
calcular una concentración de PETasa mayor a la real; muestran que el número
de recambio es menor en un orden de magnitud que el habitual industrialmente.
Aunque se evidencia la posibilidad de bio despolimerizar un plástico muy
estable ante el ataque microbiano u orgánico falta mejorar la genética
involucrada así como el proceso de extracción para requerimientos industriales.
Las imágenes bajo microscopia SEM de la acción de la PETasa en sustratos
plásticos provistas por la literatura muestran que la enzima se debe hundir en el
sustrato [17]. Es necesario que en el proceso de reacción preferiblemente haya
buena agitación en la mezcla para que la enzima no se inhiba a si misma por la
cristalización de sus productos en la solución acuosa aledaña a la superficie de
sustrato. Estos productos debido a la alta concentración en su superficie pueden
precipitarse dependiendo de su constante de solubilidad.
El código genético que se utilice en la bacteria que produzca la PETasa, como
también en otra proteína con el mismo fin de despolimerización; es un factor
determinante de la actividad enzimática de la PETasa en las mezclas de reacción
de despolimerización del PET [19] [31]. Por ejemplo, haciendo una
modificación genética para producir extracelularmente esta proteína se
simplificarían pasos de extracción y purificación proteica [18].
5.11 Restricciones
Económicas: En el momento los que hacen estas investigaciones de
biotecnología en el mundo no aparentan tener restricciones económicas para la
investigación pero es de resaltar que se necesitan equipos específicos para
trabajar biología molecular. El resultado a perseguir con estas debe ser la
escalabilidad, la eficiencia y eficacia del proceso de despolimeracion, y
productos de valor. Lo más equitativo posible es que se invierta en el reciclaje
una cantidad proporcional al de producción.
Ambientales: El objetivo es mitigar el daño ambiental, pero a toda cosa no se
debería probar directamente en el mar cepas modificadas para las condiciones
marítimas como se puede pensar. El proceso debe estar en condiciones
controladas.
Sociales: Entre más conciencia halla en la gente para suplir las partes primeras
del proceso de reciclaje, como lo son la recolección y selección; cualquier
proceso de reciclaje industrial se facilitaría. Debe incentivarse crear trabajo para
recolectar, inspeccionar y separar a mano los distintos plásticos, inclusive
trabajo que debe hacerse en ríos, la desembocadura de estos al mar y en mar
abierto.
Políticas: Una vez haya un factible aval de viabilidad y análisis completo de
reducción de impacto ambiental se debe construir por el bien de todos, plantas
de mitigación y reaprovechamiento de basuras plásticas. Se debe procurar unir
las grandes empresas de producción y transformación de estos materiales con las
empresas de reciclaje, para que en conjunto con la sociedad exista
continuamente este proceso.
Éticas: Primero la vida, no se debe añadir al mar directamente por probar porque
puede alterarse el equilibrio de ecosistemas marinos. Se debe continuar con estas
investigaciones biotecnológicas hasta alcanzar condiciones óptimas que
promuevan la escalabilidad del proceso. Además, debemos todas las personas
tomar conciencia de hacer parte del proceso de reciclaje de nuestros desechos.
Salud y seguridad: Todo el proceso debe hacerse en una planta-laboratorio que
este bajo el control necesario para privilegiar la seguridad biológica y de
químicos potencialmente peligrosos, y para proteger la salud de sus operarios y
todos sus agentes relacionados.
Manufacturabilidad y sustentabilidad: Iniciando desde cero, la
manufacturabilidad es compleja, pero una vez teniendo los mejores genes y las
respectivas bacterias transformadas para expresión se reduce el proceso de
producción de proteína.
El potencial de ser sustentable puede mejorarse si se reaprovecha la PEtasa de
las soluciones finales de reacción por medio de su lavado y elusión en columnas
cromatografías. Debe procurarse en la investigación y desarrollo la optimización
total del proceso debido a que los sistemas biológicos son muy sensibles a
cambios en sus soluciones liquidas.
6 Conclusiones
En este trabajo se comprobó el éxito de todos los pasos necesarios para
obtener la producción de PETasa así como el efecto de esta enzima en la
reacción de despolimerización de PET. Primero se seleccionaron con
antibiótico las células transformadas suministradas por el proveedor,
segundo se extrajo el plásmido que expresa PETasa y se calculó su pureza
media, tercero se transformó e indujo E. coli k12 para su transcripción de
PETasa, cuarto se extrajo y purificó la PETasa, quinto se analizaron diversos
desechos plásticos por DSC para corroborar su pureza y decidir cuál sustrato
plástico utilizar, sexto se evaluó la existencia de PETasa en el eluato
cromatográfico por medio de absorción UV a 205nm y 280nm, y por último
se medió indirectamente de actividad de esta enzima en varias reacciones
con el sustrato plástico escogido.
El desecho plástico analizado por DSC al cual se le calculó la mayor pureza
de PET fue la botella de 500mL de Cocacola®.
En la reacción enzimática, la solución eluato de proteína por columna
cromatografía en adición con la solución optimizadora, fue la única solución
que tuvo efecto significativo medible en la reducción de peso del sustrato
plástico.
En el presente trabajo la actividad de la PETasa expresada por el gen
PET21b(+)-IS-PETase-W159H-S238F en el vector E. coli k12, e incluyendo
la solución optimizadora de actividad, tiene una tasa de despolimerización
cercana reportes en la literatura. Bajo condiciones de reacción similares la
tasa de despolimerización promedio fue 130% menor a la medida reportada
en el estudio de caracterización e ingeniería de esta hidrolasa hecha por
Austin et al.
El número de recambio calculado de la PETasa en presencia de la solución
optimizadora permite asegurar por ahora que esta proteína está apenas en el
límite inferior que en promedio acepta uso industrial.
Debe perseguirse el mejoramiento continuo de las genéticas asociadas a las
hidrolasas capaces de despolimerizar cadenas plásticas presentes en artículos
de uso común.
7 Mejoras a seguir.
Seguir incentivando la búsqueda de los mejores códigos genéticos que
puedan transcribir a proteínas hidrolasas de PET que tengan frecuencias de
recambio a escala industrial.
Caracterizar industrialmente la reacción de despolimerización de PETasa u
otras hidrolasas con el cuidado de la completa estandarización de las
soluciones asociadas a su puesta en marcha, en especial las que contienen
estas proteinas.
Saber en qué sección volumétrica del eluato de la purificación cromatografía
se encuentra la mayor concentración de proteína por medio de evaluación
con electroforesis en gel.
Optimizar la etapa de expresión e inducción de proteína de acuerdo a la
composición del medio líquido de cultivo, el tiempo de inducción y el
tiempo de crecimiento.
Optimizar el rendimiento de la reacción heterogénea teniendo como factores
las composiciones de las distintas soluciones buffer de entrada al proceso
previo a esta reacción y el recipiente de reacción.
Unir la MHETasa al proceso de reacción de despolimerización, como pasa
en la ruta metabólica de la Ideonella sakaiensis; para al final de la
degradación tener TPA y etilenglicol, así como las proteínas necesarias para
obtener catecol.
8 Bibliografía
[1] H. S. a. D. C. Michael Ashby, Materials engineering, science, processing and
design, Amsterdam, Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, San
Diego, Tokio: Elsevier, 2014.
[2] wikipedia the free encyclopedia, «Recycling symbol,» wikipedia, 3 octubre 2019.
[En línea]. Available: https://en.wikipedia.org/wiki/Recycling_symbol. [Último
acceso: 5 nov 2019].
[3] Ashby & Jones, Engineering Materials, Pergamon Press, 1995.
[4] M. F. A. a. D. R. H. Jones, Engineering Materials 2, Oxford: Elsevier, 2006.
[5] National Ocean Service, «what are microplastics?,» National oceanic and
atmospheric administration, 15 11 19. [En línea]. Available:
https://oceanservice.noaa.gov/facts/microplastics.html. [Último acceso: 20 11 19].
[6] K. N. F. H. K. K. M. G. C. Z. E. P. F. G. &. G. P. C. Ioakeimidis, «The degradation
potential of PET bottles in the marine environment: An ATR-FTIR based
approach,» Sci Resp, vol. 6, nº 23501, 2016.
[7] P. P. M. M. H.K.Karapanagioti, «Characteristics of microplastics on two beaches
affected by different land uses in Salamina Island in Saronikos Gulf, east
Mediterranean,» Elsevier, vol. 149, nº 110531, 2019.
[8] BBC, «Los 10 países que más y menos basura generan en América Latina (y cómo
se sitúan a nivel mundial),» BBC, 9 10 2018. [En línea]. Available:
https://www.bbc.com/mundo/noticias-45755145. [Último acceso: 20 11 19].
[9] G. MR, «Plastics in the marine environment,» de Plastics and the envinronment,
New York, Wiley, 2003, pp. 379-402.
[10
]
c. A, «Plastic debris in the open ocean,» Proc Natl Acad Sci USA, vol. 111, pp.
10239-10244, 2014.
[11
]
L. K. L., «Plastic accumulation in the North Atlantic subtropical,» gyre science, vol.
329, pp. 1185-1188, 2010.
[12
]
J. J. R, «Marine Pollution.,» Science, vol. 347, pp. 768-771, 2015.
[13
]
M. R. &. A. A. L. Gregory, Plastics in the marine environment, New Yersey: Wiley
& Sons, 2003.
[14
]
S. T. Paszun D, «chemical recycling of poly(ethylene terephthalate),» Ind Eng
Chem Res, vol. 36, pp. 1373-1383, 1997.
[15
]
F. K. e. al, «Organocatalytic depolymerization of poly (ethylene terephthalate),» J
Poly Sci A, vol. 49, pp. 1273-1281, 2011.
[16
]
L. C. Z. Q. S. L. W. K. a. Y. L. Xin Huang, «Tat-independent secretion of
polyethylene terephthalate hydrolase PETase in Bacillus subtilis 168 mediated by
its native signal peptide,» Journal of agricultural and food chemistry, vol. 66, nº 50,
pp. 13217-13227, 2018.
[17
]
M. D. A. B. S. D. N. A. R. F. L. K. R. L. S. B. C. P. G. D. R. D. K. E. O. V. M. A.
W. W. E. M. Harry P. Austin, «Characterization and engineering of a plastic-
degrading aromatic polyesterase,» Procedings of the National academy of sciences,
vol. 115, 2019.
[18
]
b. S. K. a. b. H. F. S. a. b. H.-Y. S. a. b. S. J. a. b. K.-J. K. a. Hogyun Seo a,
«Production of extracellular PETase from Ideonella sakaiensis using sec-dependent
signal peptides in E. coli,» Biochemical and Biophysical Research
Communications, vol. 508, pp. 250-255, 2019.
[19
]
T. O. J. S. R. M. M. B. Ren Wei, «Engineered bacterial polyester hydrolases
efficiently degrade polyethylene terephthalate due to relieved product inhibition,»
biotechnology and bioengineering, vol. 113, nº 8, pp. 1658-1665, 2016.
[20
]
K. H. T. T. I. T. H. Y. Y. M. K. T. K. M. K. K. O. Shosuke Yoshida, «A bacterium
that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate),» Sciencemag, vol. 351,
nº 6278, pp. 1196-1199, 2016.
[21
]
Y. E. K. B. Zheng Y, «A review of plastic waste biodegradation,» Crit Rev
Biotechnol, vol. 25, pp. 243-250, 2005.
[22
]
T. O. J. S. R. M. M. B. J. T. W. Z. Ren Wei, «Engineered Bacterial Polyester
Hydrolases,» biotechnology and bioengineering, vol. 113, nº 8, pp. 1658-1665,
2016.
[23
]
S. H. P. J. D. K. D. W. D. Müller R. J, «Enzymatic degradation of PET: rapid
hydrolyse using a dydolase from T. Fus.ca,» Macromol rapid commun, vol. 26, pp.
1400-1405, 2005.
[24
]
H. A. E. e. al, «Enzymatic surface hydrolysis of PET: effect of structural diversity
on kinetic properties of cutinases from Thermobifida,» macromolecules, vol. 44, pp.
849-857, 2011.
[25
]
I. J. C. H. S. H. F. S. H.-Y. S. T. J. S. S. Y. C. S. Y. L. &. K.-J. K. Seongjoon Joo,
«Structural insight into molecular mechanism of poly (ethylene terephthalate)
degradation,» nature communications, vol. 9, nº 382, pp. 1-12, 2018.
[26
]
e. a. Han X, «structural insight into catalytic mechanism of PEt hydrolase,» Nat
Commun, vol. 8, p. 2106, 2017.
[27
]
S. Rebsdat y D. Mayer, «Ethylene Glycol,» de Ullmann's Encyclopedia of
Industrial Chemistry, Weinheim, Wiley-VCH.
[28
]
R. J. Sheehan, «Terephthalic Acid, Dimethyl Terephthalate, and Isophthalic Acid,»
de Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Illinois, united states , Wiley
& sons, 2006.
[29
]
H. e. a. Fiegel, «Phenol Derivatives,» de Ullmann's Encyclopedia of Industrial
Chemistr, Weinheim, Wiley-VCH, 2005.
[30
]
Addgene, «pET21b(+)-Is-PETase-W159H-S238F,» [En línea]. Available:
https://www.addgene.org/112203/. [Último acceso: 1 9 2019].
[31
]
M. Y. B. L. M. D. B. H. S. C. X. Z. Yuan Ma, «Enhanced Poly(ethylene
terephthalate) Hydrolase Activity by Protein Engineering,» Research Synthetic
Biology, vol. 888, nº 4, pp. 888-893, 2018.
[32
]
A. was a gift from Gregg Beckham & Christopher Johnson, Artist, pET-21b(+)-Is-
PETase-W185A (Addgene plasmid # 112204 ; http://n2t.net/addgene:112204 ;
RRID:Addgene_112204). [Art].
[33
]
Addgene, «Addgene the nonprofit plasmid repository,» [En línea]. Available:
http://www.addgene.org/recipient-instructions/myplasmid/. [Último acceso: 1 7
2019].
[34
]
Biolabs New england, «Monarch® Plasmid DNA Miniprep Kit Protocol (NEB
#T1010,» 2019. [En línea]. Available:
https://international.neb.com/protocols/2015/11/20/monarch-plasmid-dna-miniprep-
kit-protocol-t1010. [Último acceso: 1 8 2019].
[35
]
L. Y. C. R. I. D. V. A. E. S. E. Diliana Celeste Pérez-Reytor, «Verificación rápida
de la pureza microbiológica de bancos de Escherichia coli K12,» Biotecnologia
aplicada de bancos de Escherichia coli K12, vol. 20, nº 4, 2003.
[36
]
PROVOST & WALLET RESEARCH, «Whole Cell Lysate Preparation using RIPA
Buffer – for membrane and soluble proteins,» UNIVERSITY OF SAN DIEGO,
1998. [En línea]. Available:
http://home.sandiego.edu/~josephprovost/RIPA%20Buffer%20Lysis%20Protocol.p
df. [Último acceso: 2 octubre 2019].
[37
]
proteintech, «LYSATE PREPARATION: WHY IS RIPA BUFFER BEST FOR
WESTERN BLOT?,» protein tech gropu, 31 octubre 2016. [En línea]. Available:
https://www.ptglab.com/news/blog/lysate-preparation-why-is-ripa-buffer-best-for-
western-blot/. [Último acceso: 1 sept 2019].
[38
]
G. james, «Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in
buffers,» Analytical Biochemistry, vol. 86, nº 2, p. 574, 1978.
[39
]
M. A. G. a. H. H. R. MOHAMMAD N. SIDDIQUI, «Identification of different type
of polymers in plastics waste,» Journal of Environmental Science and Health, vol.
PartA, nº 43, pp. 1303-1310, 2008.
[40
]
E. R. a. S. A. H. Darrel Iler, «An Introduction to Polymer Processing, Morphology,
and Property Relationships through Thermal Analysis of Plastic PET Bottles,»
Journal of chemical education, vol. 83, nº 3, pp. 439-442, 2006.
[41
]
H. C. a. P. Cebe*, «Vitrification and Devitrification of Rigid Amorphous Fraction
of PET during Quasi-Isothermal Cooling and Heating,» Macromolecules, vol. 42,
nº 1, pp. 288-29, 2009.
[42
]
M. D. A. B. S. D. N. A. R. F. L. K. R. L. S. Harry P. Austin, «supporting
information for characterization and engineering of a plastic- degrading aromatic
polyesterase,» PNAS, 2017.
[43
]
K. R. K. A. B. a. A. J. D. Shady Farah, «molecular weight determination of
polyethylene terephthalate,» Poly(Ethylene Terephthalate) Based Blends,
Composites and Nanocomposites, 2015.
[44
]
B. J. O. a. J. Markwell, «Assays for Determination of Protein cocentration,»
Current Protocols in Protein Science, vol. 48, nº 1, pp. 3.4.1-3.4.29, 2007.
[45
]
M. M. Bradford, «A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding,» Analytical
Biochemistry,, vol. 72, nº 1-2, pp. 248-254, 1976.
[46
]
N. J. &. C. G. M. Anthis, «Sequence-specific determination of protein and peptide
concentrations by absorbance at 205 nm.,» Protein Science, vol. 22, nº 6, pp. 851-
858, 2013.
[47
]
S. P.K. y e. al., «Measurement of protein using bicinchoninic acid". Anal.
Biochem,» Anal. Biochem, vol. 150, nº 1, pp. 76-85, 1985.
[48
]
O. B. &. M. f. t. d. o. p. concentration, «Assays for the determination of protein
concentration,» de Current protocols in protein science, 2007, pp. 14-17.
[49
]
N. a. C. G. Anthis, «Sequencespecific specific determination of protein and peptide
conentrations by absorbance at 205 nm.,» Protein Science, vol. 22, pp. 851-858,
2013.
[50
]
thermo scientific, «espectrofotometros micro-UV/Vis nanodrop one guia del
usuario,» julio 2016. [En línea]. Available: https://assets.thermofisher.com/TFS-
Assets/CAD/manuals/3091-NanoDrop-One-User-Guide-v1.3-sw-SPANISH.pdf.
[Último acceso: 1 9 2019].
[51
]
Nomenclature committee of the international union of biochemistry, «units of
enzyme activity,» Eur. J. Biochem, vol. 97, nº 2, pp. 319-320, 1979.
[52
]
S. Schnell, M. Chappell, N. Evans y M. Roussel, «The mechanism
distinguishability problem in biochemical kinetics: The single-enzyme, single-
substrate reaction as a case study,» Comptes Rendus Biologies, vol. 329, nº 1, pp.
51-61, 2006.
[53
]
addgene the nonprofit plasmid repository, « Sequence Analyzer: pET21b(+)-Is-
PETase-W159H-S238F Sequencing Result,» addgene, [En línea]. Available:
https://www.addgene.org/browse/sequence/215852/. [Último acceso: 1 junio 2019].
[54
]
D. V. T. Rada, Interviewee, inviabilidad E.Coli k12 desde cepario interno.
[Entrevista]. 6 9 2019.
[55
]
E. F. R. Gomez, Interviewee, inviabilidad E.coli k12 desde cepario interno.
[Entrevista]. 6 9 2019.
[56
]
Uniprot, «Proteomes - Escherichia coli (strain K12),» 24 11 2019. [En línea].
Available: https://www.uniprot.org/proteomes/UP000000625. [Último acceso: 19
11 2019].
[57
]
D. C. Chang, Electroporation and Electrofusion, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.
KGaA, 2006.
[58 B. F. Donahue RA, «Large-volume transformation with high-throughput efficiency
] chemically competent cells,» Focus, vol. 20, nº 2, pp. 54-56, 1998.
[59
]
B. K. (. Marbach A, «lac operon induction in Escherichia coli: Systematic
comparison of IPTG and TMG induction and influence of the transacetylase LacA,»
journal of biotechnology, vol. 157, nº 1, pp. 8-82, 2012.
[60
]
K. S. S. S. Hansen LH, «The effect of the lacY gene on the induction of IPTG
inducible promoters, studied in Escherichia coli and Pseudomonas fluorescens,»
Curr. microbiol., vol. 36, nº 6, p. 341, 1998.
[61
]
C. A. G. O. A. Luz Yurany Moreno, «Expresión y purificación de las proteínas
estructurales VP5* y VP8* de rotavirus en bacterias E. coli BL21(DE3),» Rev.
Coulumb. Biotecnol, vol. 15, nº 1, pp. 82-87, 2013.
[62
]
U. Alon, an introduction to systems biology design principles o biological circuits,
Chapman and Hall/CRC, 2019.
[63
]
Labome, «purificacion de proteinas,» Labome the world of laboratories, 17 11
2012. [En línea]. Available: http://www.labome.es/method/Protein-
Purification.html. [Último acceso: 1 noviembre 2019].
[64
]
BIO-RAD LABORATORIES INC, «Instruction manual,» de Profinity TM IMAC
resins, USA}, BIO RAD, 2000, p. 52.
[65
]
M. L. Miller, the structure of polymers, Ney york : Reinhold , 1966.
[66
]
A. Y. H. E. Bilal DEMİREL, «Crystallization Behavior of PET Materials,» BAÜ
Fen Bil. Enst. Dergisi Cil, vol. 13, nº 1, pp. 26-35, 2011.
[67
]
P. a. A. T. Munk, Introduction to macromolecular science, New York: John Wiley
& Sons, 2002.
[68
]
R. F. Boyer, «Glassy transitions in semi crystaline polymers,» Journal Polymer
Science, 1975.
[69
]
ASTM, «standard test method for transition temperatures and enthalpies of fusion
and crystallization of polymers by differential scanning calorimetry (D3418),»
ASTM international, USA, 2015.
[70
]
«imidazole,» spectra base, [En línea]. Available:
https://spectrabase.com/spectrum/D1BN0wakHHj. [Último acceso: 20 11 2019].
[71
]
C. S. S. Z. R. W. C.-C. Y. Congcong Liu, «Structural and funcional characterization
of polyethylene,» Biochemical and biophysical research communication, vol. 508,
p. 289 294, 2019.
[72
]
N. Anthony, «What does ‘residual activity of an enzyme’ refer to?,» Quora, 17 may
2017. [En línea]. Available: https://www.quora.com/What-does-
%E2%80%98residual-activity-of-an-enzyme%E2%80%99-refer-to. [Último
acceso: 11 9 2019].
[73
]
H. J, Industrial Catalysis: A Practical Approach. Weinheim, Weinheim, Germany:
Wiley VCH, 2006.
[74
]
Addgene, «Streaking and Isolating Bacteria on an LB Agar Plate,» 28 2 2017. [En
línea]. Available: http://www.addgene.org/protocols/streak-plate/. [Último acceso:
1019 7 1].
[75
]
Addgene, «Inoculating a Liquid Bacterial Culture,» [En línea]. Available:
http://www.addgene.org/protocols/inoculate-bacterial-culture/. [Último acceso: 1 7
2019].
[76
]
Addgene, «Creating Bacterial Glycerol Stocks for Long-term Storage of Plasmids,»
[En línea]. Available: http://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/.
[Último acceso: 1 7 2019].
[77
]
cold spring harbor protocols, «Ampicilin stock solution (100 mg/mL),» [En línea].
[78
]
eppendorf, «E. coli k12 transformation protocl,» [En línea]. Available:
https://www.eppendorf.com/product-
media/doc/en/045157_Protocol/Eppendorf_Cell-Technology_Protocol_Escherichia-
coli-K12_Protocol-No-4308-915514-Escherichia-coli-K12.pdf. [Último acceso: 1 9
2019].
[79
]
Open wet ware, «Preparing chemically competent cells,» [En línea]. Available:
https://openwetware.org/wiki/Preparing_chemically_competent_cells. [Último
acceso: 3 9 2019].
[80
]
Addgene, «Bacterial Transformation,» 3 11 2017. [En línea]. Available:
https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/. [Último acceso: 3 9
2019].
[81
]
Uniprot, «UniProtKB - A0A0K8P6T7 (PETH_IDESA),» UnitprotKB, 13 11 2019.
[En línea]. Available: https://www.uniprot.org/uniprot/A0A0K8P6T7. [Último
acceso: 20 11 2019].
[82
]
Ministerio de trabajo y asuntos sociales España, instituto nacional de seguridad e
higiene en el trabajo, «NTP 585: Prevención del riesgo biológico en el laboratorio:
trabajo con,» 2001. [En línea]. Available:
https://www.insst.es/documents/94886/327064/ntp_585.pdf/8b622baa-4fbe-43f4-
a796-bc15d2ce0282?version=1.0. [Último acceso: 1 8 2019].
9 ANEXOS
9.1 Procedimientos metodológicos
9.1.2 Selección de plásmido
El almacenamiento de la bacteria que contiene en su interior el plásmido de interés del
presente estudio se debe hacer a corto y largo plazo
Almacenamiento corto plazo:
Addgene envía por barco este plásmido transformado en E. colí DH5∝ y puesta en un
pinchazo cultivado en Agar LB, similar a un Agar común puesto en plato. Este cultivo
debe ser almacenado a 4°C una vez es recibido por el laboratorio. La garantía de vida
del cultivo es al menos dos semanas desde su recepción si es almacenado de esta forma.
Almacenamiento largo plazo:
Así dentro de las 2 primeras semanas de recibido el plásmido se debe crear una reserva
de glicerol que se guarde a -80ºC. Para crear la reserva de glicerol se sigue el protocolo
siguiente sugerido por el proveedor:
1. Desde el pinchazo de bacteria se raya en platos agar con marcador de selección y
aislar en colonias individuales [74]. Usar colonias individuales desde el plato
agar rayado para inocular un cultivo líquido que sirva en la purificación de
ADN, minimiza la posibilidad de tener una mezcla de plásmidos.
2. Inocular durante la noche un cultivo líquido. Al usar un cultivo líquido fresco se
asegura que crezca suficiente bacteria para extraer y purificar favorablemente el
ADN, además para crear las reservas de glicerol [75]. Los plásmidos
normalmente llevan uno o más genes de resistencia a antibiótico. De esta forma
se puede fácilmente aislar bacterias que contengan plásmido de las que no lo
contienen por selección artificial. El antibiótico para el plásmido utilizado en
este trabajo es ampicilina y la concentración por medio de cultivo es 100μg/mL. 3. Crear un reserva en glicerol y almacenar a -80°C [76]. La adición de glicerol
estabiliza la bacteria congelada, previene el daño de las membranas celulares y
mantiene la célula viva.
Además, para hacer esto bien es necesario crear una solución reserva de ampicilina para
suplir todas las etapas siguientes que tengan medios de selección. Se debe disolver 1
gramo de ampicilina de sodio en 10 mL. Para hacer el proceso estéril, se requiere filtrar
esta solución en un filtro 0,22 μm esterilizado prelavado con 50 mL de agua
desionizada. Luego de que la solución este filtrada se guarda a -20ºC y así puede llegar
a durar hasta un año [77].
9.1.3 Extracto de plásmido y cuantificación de pureza.
Para hacer la separación y la purificación se debe asegurar centrifugación a 13000RPM,
homogenizado del buffer de lisis, y temperatura de 4ºC para el buffer de neutralización
(este tiene RNasa A). En la extracción se utilizó el kit miniprep Monarch® NEB#T1010
y se siguió el protocolo que este aconceja:
1. Concentrar 1,5 ml de cultivo bacteriano (sin exceder 15 unidades OD) por
centrifugación durante 30 segundos. Se desecha luego el sobrenadante. Los
cultivos no deben crecer demasiado (12-16 horas es lo ideal).
2. Resuspender el sedimento en 200 μl de buffer de resuspensión (B1 es rosa).
Luego se pone en vortex para garantizar que las células se resuspendan por
completo. No debe haber grumos visibles.
3. Lisar las células mediante la adición de 200 μl de buffer lisis (B2 es azul/verde).
Invertir el tubo de inmediato suavemente 5 a 6 veces hasta que el color cambie a
rosa oscuro y la solución sea clara y viscosa. No utilizar el vortex e incubar por
un minuto. Se debe tener cuidado de no manipular la muestra de manera brusca
y arriesgarse a cortar el ADN cromosómico, que se purificará conjuntamente
como contaminante. También evitar incubar más de un minuto para evitar la
desnaturalización irreversible del plásmido.
4. Neutralizar el lisado agregando 400 μl de buffer de neutralización de plásmido
(B3 es amarillo). Luego invertir suavemente el tubo hasta que el color sea
uniformemente amarillo y se forme un precipitado. No utilizar el vortex e
incubar por 2 minutos. Tener cuidado de no cortar el ADN cromosómico
mediante agitación vorticial o agitación vigorosa. Invertir firmemente el tubo
promueve una buena mezcla, importante para la neutralización total.
5. Aclarar el lisado girando durante 5 minutos a 16,000 x g. El manejo cuidadoso
del tubo asegurará que no se transfieran escombros. Los tiempos de centrifugado
más largos darán como resultado una pastilla más compacta que reducirá el
riesgo de obstrucción de la columna.
6. Transferir cuidadosamente el sobrenadante a la columna de centrifugación y
centrifugar durante 1 minuto. Desechar el flujo continuo.
7. Volver a insertar la columna en el tubo de recolección y agregar 200 μl de buffer
de lavado de plásmido 1. El buffer de lavado de plásmido número 1 elimina el
ARN, las proteínas y la endotoxina. Centrifugar durante 1 minuto. El tubo de
recolección está diseñado para contener 800 μl de líquido de flujo continuo y
aun así permitir que la punta de la columna esté segura por encima de la parte
superior del líquido. Vacíar el tubo siempre que sea necesario para garantizar
que la punta de la columna y el flujo no entren en contacto.
8. Añadir 400 μl de buffer de lavado de plásmido número 2 y centrifugar durante 1
minuto.
9. Transferir la columna a un tubo limpio de punta de 1,5 ml. Se debe tener
cuidado para asegurarse de que la punta de la columna no entre en contacto con
el flujo. Si existe duda alguna, volver a girar la columna durante 1 minuto antes
de insertarla en el tubo limpio de la microcentrífuga.
10. Agregar 30 μl de buffer de elución de ADN al centro de la matriz. Esperar 1
minuto y luego hacer girar durante 1 minuto para eluir el ADN. El agua libre de
nucleasas (pH 7–8.5) también se puede usar para eluir el ADN. El rendimiento
aumenta ligeramente si se usa un volumen mayor de buffer de elución de ADN,
pero el ADN estará menos concentrado como resultado de la dilución
9.1.4 Preparado de células competentes
Para tener células electro competentes se siguen 4 pasos [78]:
1. Inocular 500mL de medio LB con 2,5 mL de un cultivo fresco de E. coli K12.
Luego poner a crecer con agitación a 37°C hasta alcanzar un OD 600 de 0,5 a 0,6.
2. Se enfrían luego las células en hielo por 15 minutos y se transfieren a un frasco de
centrifuga pre enfriado. Se cultiva por centrifugación (a 20 minutos, 5,000 x g, 2-
4 °C). Luego se resuspende la masa sólida en 5ml de agua helada y se mantienen las
células frías durante todo el procedimiento.
3. Lavar dos veces con el volumen de cultivo original de agua helada. Centrifugar
como la centrifugación previa. Luego resuspender la fase solida con agitación
moderada.
4. Colocar una alícuota de células de 120 μL (micropipeta) en tubos pre enfriados de
centrifuga. Se congelan las células para su uso posterior, se agrega 40μL de glicerol
al 10% enfriado con hielo, luego se mezcla y centrifuga a 10 minutos, 5,000x g y 2-
4°C. Resuspender las células en glicerol al 10% enfriado con hielo hasta una
concentración final de aproximadamente 2 X 1011 células/mL. Agregar una alícuota
de 120 μL en tubos pre enfriados de centrifuga. Congelar rápidamente en hielo seco
y almacenar a -80°C.
Ahora, para tener células quimio-competentes con nivel promedio de competencia se
siguen los pasos siguientes [79]:
1. Preparar 20 mL de solución de tris 0.1 M y ajustar su pH a 7 con ayuda de HCl.
2. Preparar 60 mL de solución CaCl2 0,1M, glicerol 10% (v/v) y Tris-HCl 1mM;
almacenar a 4ºC y usar siempre frio.
3. Aislar una colonia individual (E. coli K12) y encubar en medio LB en 3 tubos
falcon.
4. Se incuba a 37ºC toda la noche a 250RPM.
5. Al día siguiente se diluyen 200 μL de cultivo en 800 μL de medio LB estéril, se
mide la absorbancia OD 540 de la solución.
6. Diluir el cultivo para obtener 50mL de densidad óptica de 0.2.
7. Incubar a 37 °C, 250 RPM hasta que la densidad óptica sea de 0.4
(aproximadamente 45 minutos).
8. Alicuotar el cultivo resultado a 3 falcon.
9. Incubar los falcon 10 minutos a 0ºC.
10. Centrifugar a 2000RPM, 6 minutos y a 4ºC. Desechar el sobrenadante.
11. Resuspender en 10 mL de la solución fría y estéril de CaCl2.
12. Centrifugar ahora a 1800RPM, 6 minutos y a 4ºC. Desechar el sobrenadante.
13. Resuspender nuevamente en 10 mL de solución fría y estéril de CaCl2.
14. Cultivar por 30 minutos a 0ºC
15. Centrifugar ahora a 1800RPM, 6 minutos y a 4ºC. Desechar el sobrenadante.
16. Resuspender en 2 mL de solución fría y estéril de CaCl2.
17. Transferir a tubos eppendorf de a 100 μL hasta servir toda la solución anterior y
congelar inmediatamente en hielo seco.
18. Almacenar a -80ºC el conjunto de tubos eppendorf.
9.1.5 Transformación
9.1.5.1 Electroporacion
Al tener células electro-competentes se puede hacer el proceso de transferencia de ADN
desde el medio al interior de la bacteria por electroporación en 5 pasos [78]:
1. Adicionar 1 μL de DNA (10 pg en agua) a tubos que contienen 40 μL de células
electrocompetentes. Homogenizar por agitación suave con pipeta varias veces.
2. Transferir la mezcla a una taza pre enfriada de electroporación. Limpiar la humedad e
insertarla en el dispositivo electroporador.
3. La electroporación ocurre en promedio a 1.700 V con una constante de tiempo de 5
ms y en modo procariotas “O”.
4. Inmediatamente adicionar 1mL de medio SOC y transferir a un tubo de cultivo estéril
con ayuda de una pipeta Pasteur. Inocular 30 a 60 minutos con agitación moderada a
37°C .
5. Colocar en platos con medio LB que contenga el químico de selección apropiado.
9.1.5.2 Choque térmico
Al tener células quimio-competentes se puede hacer el proceso de transferencia de ADN
desde el medio al interior de la bacteria por un método de choques térmicos. Son 9
pasos [80]:
1. Sacar las células competentes de -80 ° C y descongelar en hielo
(aproximadamente 20-30 minutos).
2. Retirar las placas de agar (que contienen el antibiótico apropiado) del
almacenamiento a 4 ° C y dejar en calentamiento a temperatura ambiente (con
precalentamiento a 37ºC es mejor).
3. Mezclar 3 μl de ADN (generalmente 10 pg - 100 ng) en 30 μL de células
competentes en una microcentrífuga o tubo halcón. Mezclar suavemente también
moviendo el fondo del tubo con el dedo varias veces.
4. Incubar la mezcla competente de células y ADN en hielo durante 30 minutos.
5. Aplicar un choque térmico a cada tubo de transformación colocando el fondo de
1/2 a 2/3 del tubo en un baño de agua a 42 ° C durante 45 segundos
6. Volver a colocar los tubos en hielo durante 2 minutos.
7. Agregar 300 μl de medio SOC (sin antibiótico) a las bacterias e incubar con
agitación a 37 ° C durante 45 minutos. Este paso de crecimiento las bacterias
tienen tiempo para generar proteínas de resistencia a los antibióticos codificadas
en el esqueleto del plásmido, así pueden crecer una vez plaqueadas en agar con
antibiótico [80]. Este paso no es crítico para la resistencia a la ampicilina, pero
es mucho más importante para otras resistencias a los antibióticos.
8. Colocar y esparcir máximo 50 μL en placa parte del volumen de transformación
en una placa de agar LB de 10 cm que contenga el antibiótico apropiado. Si la
placa de agar no seca adecuadamente antes que empiece la división celular, las
bacterias se difunden a través del líquido y no crecen en colonias [80].
9. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche. Hacer control positivo para
asegurar que el procedimiento de transformación esté funcionando.
9.1.6 Separación y purificación
9.1.6.1 Sonicación
Con el cultivo fresco, las paredes celulares en su interior se quebrantan por sonicación
con un sonicador de punta. Este proceso requiere sumergir la punta del sonicador 1cm
en la fase liquida durante 40 minutos con muestras de máximo 20 mL. Los escombros
celulares luego se retiran y se guarda el sobrenadante a 4°C. Hasta acá llega la primera
ruta de separación. Así, la segunda ruta de separación añade una etapa de purificación
con cromatografía de afinidad de níquel que permite separar todas las proteínas
presentes en el medio con una etiqueta de poli histidina [63] [64]. La secuenciación de
la PETasa producida permite ver que la cadena termina en un marcador 6XHis [53].
El buffer RIPA a utilizar se modifica por razones de disponibilidad de reactivos. Para
hacer este buffer se utilizó una solución 50mM Tris-HCl con pH 7,5, 150mM cloruro
sodio, 1mM EDTA, 0.1% SDS y PMSF 1mM. Para Lisar las células con el buffer RIPA
se sigue el siguiente protocolo:
1. Remover el medio viejo de cultivo y resuspender las células con 3 mL de medio
PBS frio.
2. Enjuagar, retirar y volver añadir 3mL de medio PBS.
3. Adicionar 1.5 mL de PBS y mezclar suavemente las células en tubos de
microcentrifuga.
4. Centrifugar a 2500 x g a 4°C y por 5 minutos. Decantar el sobrenadante y
mantener las células en pellet.
5. Añadir 0.25 mL de buffer RIPA y resuspender las células.
6. Lisar las células por sonicación en un baño de hielo con 40 ciclos de 20
segundos de sonicación, 40 segundos de descanso y 36% de amplitud.
7. Mezclar suavemente durante 15 minutos en baño de hielo.
8. Centrifugar a 14,000 rpm por 15 minutos y guardar el sobrenadante a 4°C
9.1.6.2 Columna de cromatografía
Por parte de la cromatografía de Níquel se utiliza la resina IMAC en condiciones no
denaturantes [64]. Para utilizar la resina se deben añaidr las soluciones que se muestran
en la 0 en su orden descendente. Esto se debe hacer para obtener en el momento de
purificación la resina de mejor calidad. La cantidad de resina utilizada para el propósito
de purificación es suficiente con un lecho de 1cm y 3 mL de volumen. Se debe procurar
no dejar burbujas de aire en la resina, que su empaque se ubique encima de una columna
con filtro de sílice y que el flujo de cualquier solución no supere en la resina 600cm/hr.
Solución Descripción Volumen solución: Volumen
Resina
Regeneración 10mM fosfato de sodio,
1M NaCl, 0.2M EDTA, pH 7.4
1:6
Limpieza 1. strip: 50mM fosfato de
sodio, 0.3 M NaCl, 0.1M
EDTA pH 7.5
2. wash: 2M NaCl
3. wash: 70% v/v etanol
1. 1:6
2. 1:6
3. 1:6
Saneamiento 1% ácido acético, 0.12M ácido
fosfórico, pH1.5
1:6
Carga Ni+2 1. 50mM acetato de sodio, 0.3M
NaCl, pH 4
2. 0.3M NiSO4
1. 1:6
2. 1:6
Tabla 7. Pre tratamiento y carga de columna cromatográfica.
Una vez se ha hecho esto para al final cargar correctamente la resina con iones níquel se
puede dar paso a la purificación de la PETasa. Los buffers que se requieren en orden
para obtener esto se muestran en la 0.
Buffer Descripción Volumen buffer: Volumen
Resina
Unión 50mM fosfato de sodio, 300mM
NaCL, 5mM imidazol, pH 8
1:5
Lavado 50mM fosfato de sodio, 300mM
NaCL, 10mM imidazol, pH 8
1:10
Elusión 50mM fosfato de sodio, 300mM 1:5
NaCL, 250mM imidazol, pH 8
Tabla 8. Buffers requeridos para la purificación de proteína.
Ahora, para purificar la muestra que contiene la proteína en primera instancia se une
imidazol baja concentración a la resina con el buffer de unión, luego así se añade la
solución que tiene en su interior la proteína de interés (PETasa). Después se lava la
resina con el buffer de lavado para retirar demás cosas que no interesen. Y por último se
eluye la proteína usando imidazol a alta concentración con el buffer de elusión. De esta
manera la proteína purificada queda inmersa en el buffer de elusión.
Llegar a la máxima purificación de proteina sale de los alcances de este proyecto pero
se hace con una filtración en gel en una columna superdex 75HR [42]. Para
cristalografía, la proteína se puede llegar a concentrar hasta 10 mg/mL y dializarse entre
10mM de Tris, ph 7,5, 100nM de NaCl. La PETasa puede cristalizarse a 10mg/mL por
difusión de vapor [42].
9.2 Resultados
9.2.2 Crecimiento E. coli k12 transformada bajo selección con Ampicilina.
Ilustración 1. Colonias E. coli k12 transformadas con éxito, a la izquierda control
el positivo.
9.2.3 Calorimetría diferencial de barrido (DSC) de los sustratos de desecho
Cocacola 500mL 1:
Gráfica 1. Cocacola 500mL 1
Gráfica 2. Cocacola 500mL 2
Gráfica 3. Canada dry 400mL 1
Gráfica 4. Canada dry 400mL 2
Gráfica 5. Cristal 600mL 1
Gráfica 6. Cristal 600mL 1
Gráfica 7. Tostao 600mL 1
Gráfica 8. Tostao 600mL 2
9.2.4 Mediciones absorbancia espectrofotometría UV
Gráfica 9. Mezcla de proteínas después del proceso de sonicación y centrifugación.
Gráfica 10. Fracción ultima de lavado recogida desde la columna cromatográfica
Ab
sorb
anci
a
Longitud de onda (nm)
Despues de sonicación
abso
rban
cia
Longitud de onda (nm)
Fraccion ultima de buffer de lavado
Gráfica 11. Solución buffer de elución
Gráfica 12. Extracto de PETasa (eluato)
La siguiente gráfica y concentración de proteína calculada en 3 muestras: eluato
(negro), blanco buffer elusión (rojo) y fracción de lavado ultima (verde). La
concentración de proteina se calcula en 1,26 mg/ml.
Ab
sorb
anci
a
Longitud de onda (nm)
Blanco: buffer de elucion
absr
ob
anci
a
longitud de onda (nm)
Eluato de proteina
Gráfica 13. Concentraciones calculadas por nanodrop.
A continuación se muestran los datos obtenidos de absorbancia a 205nm y 280nm del
eluato de proteína tomando como blanco el buffer de elución.
Informe Medida
Simple
Tiempo Colección:08/11/2019
17:51:49
Versión
Software:3.00(182)
Instrumento :Cary 50
Leer Abs nm Solución Absorbancia
Cero (3,4727)
205,0 buffer 3,4727
Cero (3,4712)
205,0 buffer 3,4712
Cero (3,4847)
205,0 buffer 3,4847
1 0,0740 205,0 eluato 0,074
2 0,0624 205,0 eluato 0,0624
3 0,0358 205,0 eluato 0,0358
4 0,0299 205,0 eluato 0,0299
5 0,0356 205,0 eluato 0,0356
6 0,0750 205,0 eluato 0,075
Promedio absorbancia buffer 3,4762
Varianza absorbancia buffer 0,0000
Promedio de ganancia en
absorbancia eluato 0,0521
Varianza ganancia en absorbancia 0,0004
Tabla 9. Primera toma de datos de absorbancia a 205nm.
Informe Medida Simple
Tiempo Colección:08/11/2019
17:56:23
Versión
Software:3.00(182)
Instrumento :Cary 50
Leer Abs nm Solución Absorbancia
Cero (3,4874) 205,0 buffer 3,4874
Cero (3,4731) 205,0 buffer 3,4731
Cero (3,4819) 205,0 buffer 3,4819
Cero (3,4806) 205,0 buffer 3,4806
Cero (3,4505) 205,0 buffer 3,4505
Cero (3,4809) 205,0 buffer 3,4809
1 0,0237 205,0 eluato 0,0237
2 0,0947 205,0 eluato 0,0947
3 0,0301 205,0 eluato 0,0301
4 0,0635 205,0 eluato 0,0635
5 0,0372 205,0 eluato 0,0372
6 0,0360 205,0 eluato 0,036
Promedio absorbancia buffer 3,4757
Varianza absorbancia buffer 0,0001
Promedio de ganancia en absorbancia
eluato 0,0475
Varianza ganancia en absorbancia 0,0006
Tabla 10. Segunda toma de datos de absorbancia a
205nm
Primera toma de datos de absorbancia a 280nm
Informe Medida
Simple
Tiempo Colección:08/11/2019
18:01:56
Versión
Software:3.00(182)
Instrumento :Cary
50 Solución Absorbancia
Cero (0,9383)
280,0 buffer 0,9383
Cero (0,9387)
280,0 buffer 0,9387
Cero (0,9386)
280,0 buffer 0,9386
Cero (0,9385)
280,0 buffer 0,9385
Cero (0,9387)
280,0 buffer 0,9387
Cero (0,9384)
280,0 buffer 0,9384
1 2,8871 280,0 eluato 2,8871
2 2,9814 280,0 eluato 2,9814
3 3,4692 280,0 eluato 3,4692
4 2,8665 280,0 eluato 2,8665
5 2,9845 280,0 eluato 2,9845
6 2,8928 280,0 eluato 2,8928
Promedio absorbancia buffer 0,9386
Varianza absorbancia buffer 0,0000
Promedio de ganancia en
absorbancia eluato 3,0136
Varianza ganancia en absorbancia 0,0436
Tabla 11. Primera toma de datos de absorbancia a 280nm.
Informe Medida Simple
Tiempo Colección:08/11/2019 18:03:46
Versión Software:3.00(182)
Instrumento :Cary
50 Solución Absorbancia
Cero (0,9385)
280,0 buffer 0,9385
Cero (0,9385)
280,0 buffer 0,9385
Cero (0,9379)
280,0 buffer 0,9379
Cero (0,9385)
280,0 buffer 0,9385
Cero (0,9382)
280,0 buffer 0,9382
Cero (0,9380) buffer 0,938
280,0
Cero (0,9382)
280,0 buffer 0,9382
Cero (0,9383)
280,0 buffer 0,9383
Cero (0,9385)
280,0 buffer 0,9385
1 2,8283 280,0 eluato 2,8283
2 2,9211 280,0 eluato 2,9211
3 2,8782 280,0 eluato 2,8782
4 3,0091 280,0 eluato 3,0091
5 2,9850 280,0 eluato 2,985
6 2,9833 280,0 eluato 2,9833
7 2,7991 280,0 eluato 2,7991
8 2,9876 280,0 eluato 2,9876
9 2,7625 280,0 eluato 2,7625
Promedio absorbancia buffer 0,9383
Varianza absorbancia buffer 0,0000
Promedio de ganancia en
absorbancia eluato 2,9060
Varianza ganancia en
absorbancia 0,0076
Tabla 12. Segunda toma de datos de absorbancia a 280nm.
9.2.5 Estadísticos ganancia de absorbancia a 205nm y 280nm en el eluato
Tabla 13. Prueba t de la medición de las ganancias de absorbancia del eluato a 205nm y
280nm.
9.2.6 Disminución másica en la reacción PET-PETasa
Prueba t de la medición de disminución másica por despolimerización con la solución
ensayo 3 de reacción.
Tabla 14. Prueba T de la medición de disminución másica por despolimerización con la
solución ensayo 3 de reacción.
Gráfica 14. Intervalos de confianza de la disminución másica en cada solución de
reacción de PETasa.
9.2.7 Calculo actividad enzimática
La actividad enzimática calculada en unidades enzimáticas a partir de la disminución
másica promedio (mg), el tiempo de reacción (h), el peso molecular promedio del PET y
el volumen de solución es:
𝑢𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎𝑡𝑖𝑐𝑎𝑠 [𝜇𝑚𝑜𝑙
𝑚𝑖𝑛 ] =
0,00013𝑔 ∗𝑚𝑜𝑙
53000𝑔
108ℎ ∗60𝑚𝑖𝑛
ℎ∗ 0,0015𝐿
= 3 ∗10−10𝑚𝑜𝑙
𝑚𝑖𝑛
→ 3 ∗10−4𝜇𝑚𝑜𝑙
𝑚𝑖𝑛
Si se toma en cuenta la concentración calculada por el dispositivo nanodrop, aunque sea
muy alta de una purificación; se puede estimar la actividad específica y el número de
recambio. La actividad enzimática toma en cuenta la concentración proteica y
nuevamente el volumen de solución:
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎 =𝑢𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎𝑡𝑖𝑐𝑎𝑠
1,26𝑚𝑔𝑚𝑙
∗ 1,5𝑚𝑙= 1 ∗
10−10𝑚𝑜𝑙
𝑚𝑖𝑛 𝑚𝑔→ 1 ∗
10−4𝜇𝑚𝑜𝑙
𝑚𝑖𝑛 𝑚𝑔
Para el número de recambio es necesario saber el peso molecular promedio de la
PETasa. Se reporta que la PETasa pesa 30 247 Da [81], es necesario el número de
Avogadro y ciertos factores de conversión:
𝑃𝑀𝑝𝑒𝑡𝑎𝑠𝑎 [𝑚𝑔
𝜇𝑚𝑜𝑙] =
30247𝐷𝑎
𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎∗
1,6605 ∗ 10−24𝑔
𝐷𝑎∗
6,022 ∗ 1023𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑠
𝑚𝑜𝑙
=30246𝑔
𝑚𝑜𝑙→
30 246 000𝑚𝑔
𝑚𝑜𝑙∗
𝑚𝑜𝑙
106𝜇𝑚𝑜𝑙=
30, 246𝑚𝑔
𝜇𝑚𝑜𝑙
De esta manera el número de recambio se calcula en:
𝑁𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑐𝑎𝑚𝑏𝑖𝑜 [𝑠−1] = 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎 ∗30, 246𝑚𝑔
𝜇𝑚𝑜𝑙=
4 ∗ 10−3
𝑠
9.2.8 Comparación concentración proteica
Masa de PETasa puesta en volúmenes de reacción (1,5mL) del estudio de
caracterización e ingeniería [17]:
50 ∗ 10−9𝑚𝑜𝑙
𝐿∗ 0.0015𝐿 ∗ 30246000
𝑚𝑔
𝑚𝑜𝑙= 2 ∗ 10−3𝑚𝑔
Masa de PETasa puesta en volúmenes de reacción (1,5mL) del presente estudio de
caracterización
1,26𝑚𝑔
𝑚𝑙∗ 1,5𝑚𝑙 = 1.9𝑚𝑔