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Tesis Doctoral
Papel fundamental de cFLIP en el control de la
apoptosis en células epiteliales de mama
Rosario Yerbes Cadenas
Enero, 2010 Centro Anadaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa
(CABIMER).
Editor: Editorial de la Universidad de GranadaAutor: Rosario Yerbes CadenasD.L.: GR 1472-2010ISBN: 978-84-693-0699-4
Dr. Abelardo López Rivas, Profesor de Investigación del
Consejo Superior de Investigaciones Científicas y miembro del Centro
Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER),
CERTIFICA:
Que el trabajo titulado “Papel fundamental de cFLIP en el
control de la apoptosis en células epiteliales de mama” presentado
por Doña Rosario Yerbes Cadenas, para optar al Grado de Doctor por
la Universidad de Granada, ha sido realizado bajo su supervisión en
el Centro Andaluz de Biología Molecular Y Medicina Regenerativa y
reúne, a su juicio, originalidad y contenidos suficientes para que sea
defendido ante el tribunal correspondiente.
Y, para que conste a los efectos oportunos, expido y firmo el
presente certificado en Sevilla a de 200
Fdo: Dr. Abelardo López Rivas
ÍNDICE
I. Abreviaturas………………………………………. 1
II. Resumen………………………………………….. 4
III. Introducción……………………………………... 7
1. Mecanismos de muerte celular……………………... 8
2. Apoptosis………………………………………… 12
3. Mediadores de la apoptosis. Caspasas………………. 15
3.1 Características y organización estructural …………. 15
3.2 Clasificación ……………………………………. 16
3.3 Activación……………………………………… 19
3.3.1 Activación de caspasas iniciadoras…………… 19
3.3.2 Activación de caspasas ejecutoras……………. 20
3.4 Inhibición de las caspasas. IAPs…………………… 21
3.5 Otros mecanismos de regulación………………….. 24
4. Rutas de apoptosis………………………………… 26
4.1 Ruta Intrínseca o mitocondrial…………………… 26
4.4.1 Papel de la mitocondria en la apoptosis……….. 26
4.1.2 Familia de proteínas de Bcl-2…………………. 28
4.2 Ruta extrínseca o de receptores de muerte…………. 33
4.2.1 Señalización mediada por TNFR1/TNF………… 36
4.2.2 Señalización mediada por Fas/FasL……………. 39
5. Señalización mediada por el ligando de muerte TRAIL…. 42
5.1 TRAIL y sus receptores……………………………. 42
5.2 Señalización apoptótica mediada por TRAIL…………. 44
5.3 Señalización no apoptótica mediada por TRAIL………. 47
5.4 TRAIL y cáncer……………………………………. 47
6. FLIP………………………………………………….. 51
6.1. Estructura molecular de FLIP………………………. 51
6.2. Regulación de la expresión de cFLIP…………………. 53
6.2.1 Regulación de la síntesis de cFLIP…………………. 53
6.2.2 Regulación de la degradación de cFLIP………….. 55
6.3 Funciones de cFLIP……………………………….. 57
6.3.1 Inhibición de la apoptosis ……………………… 57
6.3.2. Proliferación celulas. Activación de las células T…. 59
6.3.3. Adhesión y migración celular………………….. 61
6.3.4. Fenotipo del ratón deficiente para cFLIP………… 61
6.3.5 Regulación de la autofagia ……………………. 62
6.3.6. cFLIP y cáncer……………………………….. 62
7. Desarrollo morfogenético del epitelio glandurar de mama... 64
IV. Objetivos………………………………………….. 70
V. Materiales y Métodos………………………… 72
VI. Resultados………………………………………….. 96 1. Sensibilización de células de cáncer de mama a la apoptosis
inducida por TRAIL. Papel de cFLIP………………………… 96 1.1 Doxorrubicina y SAHA sensibilizan a células de cáncer
de mama a la apoptosis inducida por TRAIL……………… 96 1.2 cFLIP juega un papel fundamental en la resistencia de
células de cáncer de mama a la acción de TRAIL……………. 108 1.3 Implicación de la mitocondria en la apoptosis inducida
por la sensibilización de células de cáncer de mama a TRAIL….. 112
2. Papel de cFLIP en la supervivencia celular…………………….. 115
2.1 La disminución de cFLIP por RNA de interferencia induce
apoptosis en células de cáncer de mama……………………. 115
2.2 La bajada de expresión de cFLIP por siRNA induce apoptosis en
células epiteliales no transformadas de mama MCF-10A . … 118 2.3 La apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP
por siRNA requiere del receptor de TRAIL, TRAILR2…… 120 2.4 La apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP
es independiente de ligando…………………………….. 122 2.5 Los componentes del DISC de TRAIL, FADD y Caspasa-8
participan en la apoptosis inducida por la bajada de expresión
de cFLIP……………………………………………… 124 2.6 La muerte inducida por la bajada de expresión de cFLIP
siFLIP requiere la ruta mitocondrial de apoptosis…………. 126
2.7 cFLIP regula la morfogénesis de células epiteliales de mama .. 130
3. Regulación de la expresión de cFLIP…………………………… 140
3.1 Regulación de la degradación de cFLIP……………………… 140
3.2 Regulación de la síntesis de cFLIP………………………….. 144 VII. Discusión…………………………………………….. 150
VIII. Conclusiones……………………………………….. 165
IX. Bibliografía…………………………………………… 167
X. Anexo…………………………………………………… 191
I. ABREVIATURAS
Abreviaturas
1
ABREVIATURAS.
3D : Tridimensional
ADN: Ácido desoxirribonucléico
AIF: Factor inductor de apoptosis (Apoptotic Inducing Factor)
APAF-1: Factor 1 activado por proteasas apoptóticas (Apoptotic Protease-
Activating Factor-1)
APS: Persulfato de amonio (Amonium Persulfate)
ARN: Ácido ribonucleico
ARNm: Ácido ribonucleico mensajero
ATP: Adenosina 5´-trifosfato
BH: Dominio de homología de las proteínas de la familia de Bcl-2 (Bcl-2
Homology)
BIR: Repetición IAP del baculovirus (Baculoviral IAP repeat)
BSA Seroalbúmina bovina
CARD: Dominio reclutador de caspasas (caspase reruitment domain)
CHX: Cicloheximida
CRD: dominio rico en cisterna, de la región extracelular de receptores de la
familia de TNF (cystein rich domain)
DAPI: Diaminofenilindol (4´,6-diamidino-2-phenylindole)
DcR: Receptor señuelo (decoy deceptor)
DD: Dominio de muerte (death domain)
DED: Dominio efector de muerte (death efector domain)
DISC: Complejo inductor de señales de muerte (death inducing signalling complex) DMEM: Dubelco’s modified Eagle’s medium
DMSO: Dimetilsulfóxido
DEPC: Dietilpirocarbonato
DTT: Ditiotreitol
DXR: dooxorrubicina
Abreviaturas
2
ECL: Reactivo quimioluminiscente (Enhanced chemiluminiscence)
EDTA Etinildiaminotetraacetato
EGF: Factor de crecimiento epidérmico (epidermal growth factor)
FBS: Suero fetal bovino (foetal bovine serum)
HRP: Peroxidasa de rábano (Horseradish peroxidase)
IAP: Proteínas inhibidoras de apoptosis (inhibitor of apoptosis proteins)
IFN: Interferón
KDa: Quilodaltons
mg: miligramo
ml: mililitro
mM: milimolar
NF-κB : Factor nuclear kappa B (Nuclear factor Κappa B)
ng: nanogramo
nm: nanometros
nM:nanomolar
OPG: Osteoprotegerina
PARP: Poli-ADP-ribosa polimerasa
PBS: Tampón fosfato (Phosphate-buffered saline)
PCR: reacción en cadena de la polimerasa
PMSF: Fenilmetil sulfonil fluoruro (Phenylmethyl sulphonyl fluoride)
PS: Fosfatidilserina
rpm: revoluciones por minuto
RT-PCR: Transcripción reversa de ARN y amplificación de ADN por Reacción en Cadena de la Polimerasa shRNA: ARN de bucle corto (Short hairpin RNA)
siRNA : Pequeño ARN de interferencia (Small interfering RNA)
TA: Temperatura ambiente
TE: Tris- DTA
TAE: Tris-acetato-EDTA
Abreviaturas
3
TNF: Factor de necrosis tumoral (Tumor necrosis factor)
TRAIL: Ligando inductor de apoptosis de la familia de ligandos TNF (tumor
necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)
μg: microgramo
μl: microlitro
μM: micromolar
4
II. RESUMEN
Resumen
5
RESUMEN.
TRAIL es un ligando de muerte de la familia de TNF con un gran
potencial terapéutico contra el cáncer, debido fundamentalmente a que es
capaz de inducir apoptosis en células tumorales sin provocar toxicidad en
células normales. Sin embargo, existen algunos tipos de células tumorales,
como las de mama, que presentan resistencia a la apoptosis inducida por
TRAIL por causas no bien conocidas.
En esta tesis se ha estudiado el papel que cFLIP, proteína inhibidora
de la apoptosis inducida por ligandos de muerte, juega en la resistencia de
células tumorales de mama a la apoptosis inducida por TRAIL. Así, hemos
determinado que cFLIP es un componente clave en la resistencia de estas
células a TRAIL, puesto que la inhibición de su expresión mediante
tratamientos como Doxorrubicina (antraciclina muy utlizada en
quimioterapia del cáncer) o SAHA (inhibidor de deacetilasas de histonas),
así como el silenciamiento de su expresión mediante oligonucleótidos de
ARN de interferencia (siRNA) de cFLIP, sensibilizan a todas las células
tumorales de mama testadas a la apoptosis inducida por TRAIL.
Además, hemos demostrado que cFLIP es también una proteína clave
en la viabilidad de las células epiteliales de mama, tumorales o no, puesto
que la inhibición de su expresión induce apoptosis. Esta apoptosis requiere
de los componentes de la señalización apoptótica de TRAIL, como son el
receptor TRAIL-R2, la molécula adaptadora FADD y la caspasa-8, pero es
independiente del propio TRAIL.
Por otra parte, y en vista de la importancia de cFLIP en el control de
la apoptosis, se ha estudiado la participación de cFLIP durante la
morfogénesis de células epiteliales de mama MCF-10A, proceso en el que la
apoptosis tiene un papel fundamental. Así una expresión elevada de cFLIPL
o de cFLIPS inhibe la formación del lumen de los acinos derivados de dichas
Resumen
6
células cuando son cultivadas en presencia de matriz extracelular (cultivos
3D). Por otra parte, la inhibición de la expresión de cFLIP impide el
desarrollo de acinos, debido probablemente a que las células que no
expresan suficientes niveles de cFLIP no son viables.
Por ello, el estudio de la regulación de la expresión de cFLIP ha sido
de gran interés en este trabajo. Así hemos determinado, que la ruta de
señalización PI3K/AKT no es la principal responsable del mantenimiento de
la expresión de cFLIP en células tumorales de mama, y apuntamos a que,
posiblemente, la ruta de NF-kB sea una de las implicadas en ello. Además,
hemos demostrado que el sistema ubiquitina-proteasoma, juega un papel
fundamental en la degradación celular de cFLIP y, actualmente, trabajamos
en la descripción de la proteína E3-ubiquitin ligasa responsable de la
degradación de cFLIP por dicho sistema.
7
III. INTRODUCCIÓN
Introducción
8
INTRODUCCIÓN.
1. MECANISMOS DE MUERTE CELULAR.
La muerte celular puede ser clasificada de acuerdo a sus características
morfológicas (apoptosis, necrosis, muerte celular autofágica o muerte celular
asociada con mitosis), de acuerdo a criterios enzimológicos (con o sin
participación de nucleasas o de diferentes tipos de proteasas como caspasas,
calpainas, catepsinas y transglutaminasas), de acuerdo a aspectos
funcionales (muerte celular programada o accidental, fisiológica o
patológica) o de acuerdo a características inmunológicas ( inmunogénica o
no inmunogénica). Es por ello que el Comité de Nomenclatura de Muerte
Celular (Nomenclature Commitee on Cell Death, NCCD) ha propuesto una
clasificación y definición actualizada de las diferentes modalidades de
muerte celular que se han descrito hasta el momento y que, brevemente, se
describen a continuación [2] [1]:
Apoptosis: muerte celular programada con características morfológicas,
como son el redondeamiento de las células, la retracción de pseudópodos,
reducción del volumen celular y nuclear (pyknosis), fragmentación nuclear
(karyorrhexis), división de la membrana plasmática en vesículas, aunque sin
pérdida de su integridad física (blebbing) y la fagocitosis de la célula, in vivo.
Algunas de sus características bioquímicas son la activación de caspasas, de
proteínas proapoptóticas de la familia de Bcl-2, pérdida de potencial
mitocondrial, fragmentación del ADN y exposición del lípido
fosfatidilserina en la cara externa de la membrana plásmatica, entre otras. La
apoptosis no debe considerarse sinónimo de muerte celular programada,
porque existen otros tipos de muerte celular programada que no tienen las
características morfológicas de la apoptosis. Tampoco debe considerarse
sinónimo de activación de caspasas, ya que la activación de estas también
Introducción
9
puede estar asociada a procesos biológicos no letales, aunque para la
adquisición de las características apoptóticas se requiera de las caspasas.
Muerte celular que cursa con autofagia: morfológicamente se define como
un tipo de muerte celular que ocurre en ausencia de condensación de la
cromatina pero acompañada por una masiva vacuolización autofágica. Al
contrario que las células apoptóticas, las células que mueren con morfología
autofágica, no tienen asociación o muy poca con los fagocitos. Como el
propio nombre indica esta muerte cursa con autofagia y no debe asumirse
que la autofagia es la ejecutora de esta muerte, ya que en principio, la
autofagia es un mecanismo de supervivencia celular, como lo indica el hecho
de que la inhibición de la autofagia acelera el proceso de muerte celular.
Necrosis: muerte celular caracterizada por un aumento de volumen de los
orgánulos y del citoplasma celular, moderada condensación de la cromatina
y rotura de la membrana plasmática con la consecuente pérdida del
contenido intracelular. Muchos orgánulos y procesos celulares se han
descrito como mediadores de la muerte celular necrótica, pero aún no está
muy claro cúal es la relación existente entre unos y otros. Estos fenómenos
incluyen alteraciones mitocondriales (producción de especies reactivas de
oxígeno (ROS), permeabilización de la membrana mitocondrial), cambios
lisosomales (producción de ROS por reacciones Fenton, permeabilización de
la membrana lisosomal), cambios nucleares (hiperactivación de PARP-1),
degradación de lípidos, incremento en la concentración citosólica de calcio
(que provoca la activación de proteasas como las calpaínas y las catepsinas).
La necrosis siempre se ha considerado como una muerte celular accidental
no programada, pero actualmente se están acumulando evidencias de que la
muerte celular necrótica puede estar finamente regulada. Así receptores de
muerte (TNF-R1, Fas, TRAIL-R) y receptores Toll-like, son capaces de
inducir necrosis en presencia de inhibidores de caspasas, principalmente.
Introducción
10
Esta muerte celular inducida por estos receptores parece depender de la
proteína quinasa RIP1, y se puede inhibir con necrostatinas. Por tanto, se ha
propuesto el término de necroptosis para distinguir este tipo de necrosis
regulada de la que no lo está.
Cornificación: es una muerte celular programada, específica de la
epidermis, morfológica y bioquímicamente diferente de la apoptosis. Este
proceso permite la formación de corneocitos, que son queranocitos muertos
con una mezcla de proteínas y lípidos necesarios para la resistencia
mecánica, elasticidad y estabilidad estructural de la epidermis.
Otras modalidades de muerte celular:
Catástrofe mitótica: muerte celular que ocurre durante o justamente
después de una mitosis fallida. Se acompaña de características morfológicas
que incluyen la micronucleación (fragmentos de cromosomas que no han
sido bien repartidos entre las células hijas) o multinucleación, debido a una
incorrecta separación de núcleos. El hecho de que este fenómeno pueda
derivar en apoptosis o necrosis, hace que se recomiende el uso de la
Figura 1. Morfología de la muerte celular. A) Célula epitelial humana en necrosis. Se observa rotura de la membrana plasmática y pérdida de la integridad mitocondrial. B) Células epitelial humana en apoptosis. Se observa condensación de la cormatina e intergridad de la mitocondria. C) Célula epitelial humana en autofagia. Se observa una morfología normal del núcleo y la formación de vesiculas autofágicas con contenido citoplasmático.
D) Amplificación de C) donde se ve la doble membrana característica de las vacuolas de autofagia. Adaptado de Kroemer y El-Deiry, 2005 [1])
Introducción
11
expresión “muerte que ocurre durante la metafase” por ser más preciso e
informativo.
Anoikis: apoptosis inducida por la pérdida de adhesión al sustrato o a otras
células. Sin embargo hay que tener en cuenta que otros procesos de muerte
celular pueden darse tras la pérdida de adhesión al sustrato que no tienen
características apoptóticas.
Entosis: define una modalidad de muerte celular en la que una célula es
internalizada por otra célula vecina y, posteriormente, desparece mediante
degradación lisosomal. La entosisis no es inhibida por Bcl-2 ni por Z-VAD-
fmk. Se ha descrito que células de cáncer de mama MCF-7 sufren entosis
cuando se les priva de adhesión al sustrato.
Paraptosis: este término se introdujo para describir un tipo de muerte
celular programada con características morfológicas y bioquímicas
diferentes de la apoptosis. En muchos tipos celulares la paraptosis se pude
disparar por el IGFR-1 (insulin-like growth factor receptor 1) y cursa con una
extensiva vacuolización citoplasmática y aumento del volumen
mitocondrial. No puede inhibirse por Bcl-2 ni por inhibidores de caspasas y
en su señalización están implicados miembros de la familia de MAPK. En la
actualidad no está muy claro si la paraptosis representa un tipo de muerte
celular realmente diferente a las demás.
Piroptosis: esta forma de muerte celular ha sido descrita principalmente en
macrófagos e implica la activación de la caspasa-1 y la liberación de IL-1β y
de IL-8, citoquinas implicadas en el proceso inflamatorio. Los macrógafos
que sufren piroptosis presentan características morfológicas de la apoptosis
y de la necrosis.
Introducción
12
2. Apoptosis.
La apoptosis tiene un papel fundamental en el desarrollo y en la
homeostasis de todos los organismos multicelulares [3]. Estos dependen de
la apoptosis para eliminar células que deben ser remplazadas, que no se
necesitan más o que están irreparablemente dañados [4]. El término
“apoptosis” fué acuñado por Kerr, Wyllie y Currie en 1972 para describir un
modo de muerte celular con
ciertas características
morfológicas [5], [6]. No fue
hasta los estudios
desarrollados en el nemato C.
elegans cuando se descubrió
que la apoptosis, además, era
un proceso de muerte
controlado genéticamente [7]
[8]. Los principales
componentes de la
maquinaria apoptótica en C.
elegans son tres proteínas
CED (Cell death abnormal)
llamadas CED-3, CED-4 y
CED-9 [9] [10]. El inicio de la
apoptosis se da con el aumento
de expresión génica de egl-1. La unión de EGL-1 a la proteína antiapotótica
CED-9 la libera de la unión a la proteína adaptadora CED-4, quien se une y
activa a CED-3, proteína con actividad proteasa, la cual degrada múltiples
componentes celulares dando lugar a la muerte celular [11] [12]. En
humanos, las proteínas homólogas a las proteínas CED, están presentes en
Figura 2. Expansión evolutiva de la
maquinaria apoptótica. Adaptado de Alexei
Degterv, Nat. Rev. 2008.
Introducción
13
las proteínas de la familia de Bcl-2, proteínas APAF-1/NLR y la familia de
las caspasas. El mecanismo apoptótico es similar al de C.elegans aunque
mucho más complejo (Figura 1). Por ejemplo, aunque el aumento
transcripcional de miembros pro-apoptóticos de la familia de Bcl-2 puede
iniciar la apoptosis [13], muchos otros miembros pueden ser activados por
diferentes mecanismos como rotura, fosforilación, ubiquitinación y
miristoilación [14] [15] [16] [17]. Además, en humanos, la apoptosis también
puede iniciarse por una familia de proteínas denominada receptores de
muerte, que no están presentes en C.elegans [18].
Con todos los datos obtenidos hasta la actualidad se puede hacer una
caracterización secuencial tanto morfológica como bioquímica de los eventos
que se dan durante la apoptosis (Figura 3), que de forma resumida sería: tras
la inducción de apoptosis, se produce la condensación del citoplasma y la
compactación de la cromatina dando lugar a la formación de densos
agregados que se deslocalizan para situarse junto a la membrana nuclear.
Posteriormente, sobre la cromatina actúan las endonucleasas que cortan el
ADN en fragmentos olionucleosomales de 180pb (o múltiplos de estos). Se
produce la dilatación del retículo endoplásmico que origina la formación de
vesículas que tienden a unirse a la membrana plasmática adquiriendo una
forma característica en burbujas (blebbing). Finalmente, la célula se divide
en los llamados cuerpos apoptóticos. Estos, son rápidamente reconocidos y
fagocitados por los macrófagos y otras células vecinas impidiendo una
exposición del material intracelular al sistema inmune, que podría provocar
una respuesta inflamatoria.
Los fagocitos pueden reconocer a las células apoptóticas por diversas
características. El fosfolípido fosfatidilserina (PS), que normalmente se
encuentra en la cara interna de la membrana citoplasmática, se transloca a la
cara externa en la fase temprana de la apoptosis, [19] siendo la exposición de
Introducción
14
la fosfatidilserina esencial para el reconocimiento de la célula apoptótica por
los macrófagos [20] [21] [22]. La anexina I es otra molécula que se expone en
la superficie de la célula apoptótica. También se pueden producir
modificaciones en proteínas de membrana como ICAM-3 y CD31, así como
cambios en la composición de azúcares y en la carga eléctrica de la superfice
celular [23] [24] .
La crítica importancia de la apoptosis para la homeostasis de los tejidos
tiene implicaciones patológicas. Una excesiva apoptosis contribuye en
diferentes enfermedades como el SIDA, Alzheimer, enfermedad de
Huntington, isquemia cardiaca y daños renales. De forma contraria, una
deficiencia en apoptosis es el componente clave en el desarrollo de
enfermedades autoinmunes y cáncer [4]. Por ello, las estrategias terapeúticas
de manipulación de la apoptosis tienen un gran potencial, y unas de las
Figura 3. Fases de la apoptosis
Introducción
15
áreas más prolíficas a este respecto han sido el desarrollo de agentes
antitumorales. Una de las características de la activación de la apoptosis
como herramienta antitumoral es su potencial de inducir regresión del
tumor más que inhibir su crecimiento.
3. Mediadores de la Apoptosis. Caspasas. 3.1. Características y organización estructural.
Las caspasas constituyen una familia de enzimas muy conservadas en
la evolución y son los componentes centrales de la respuesta apoptótica. Las
caspasas son una familia de cistein-proteasas en cuyo sitio catalítico es
esencial un residuo de cisteína y que cortan sus sustratos después de un
residuo de aspártico, de ahí su nombre (cysteine-dependent aspartate
specific protease). En 1993, se demostró que el gen ced-3, esencial en la
apoptosis de C.elegans, codicaba una proteína cistein-proteasa homóloga a la
enzima convertidora de Interleuquina-1β de humanos [25] (Cerretti et al
1992) [26] [27]. La sobrexpresión de esta enzima, renombrada Caspasa-1, era
suficiente para inducir apoptosis en mamíferos [28]. A partir de entonces se
han descrito más miembros homólogos pertencientes a esta conservada
familia de proteínas en organismos como, el díptero Drosophila melanogaster
[29], el lepidóptero Spodoptera frugiperda [30], e incluso la levadura
Saccharomyces cerevisiae [31]. En humanos existen 11 genes que codifican para
11 caspasas, de la caspasa-1 a la 10 y la caspasa 14 (esta sólo se expresa en
queranocitos) [32]. Las caspasas se sintetizan en las células como zimógenos
inactivos que contienen un prodominio N-terminal, una subunidad grande
(p20) y una subunidad pequeña (p10). El centro catalítico se sitúa en la
subunidad p20 y contiene un residuo de cisteína (285), que forma parte de
una secuencia de cinco aminioácidos muy conservados “QACXG” [33]. El
sitio de unión al sustrato lo forman tanto la subunidad p20 como la p10,
Introducción
16
pero el residuo determinante para la especificidad del sustrato lo contiene la
subunidad p10. La activación del zimógeno por proteolisis, separa el
prodominio y la subunidad grande de la pequeña y, posteriormente, el
prodominio es eliminado. La forma activa de las caspasas consiste en un
homodímero formado por dos monómeros que contienen una subunidad
grande y una pequeña y que poseen, por tanto, dos sitios catalíticos. Las
caspasas reconocen en sus sustratos una secuencia de al menos cuatro
aminoácidos P4-P3-P2-P1 y cortan después del aminoácido carboxi-terminal,
el P1, que es un residuo de Aspártico. [6]. El residuo P3 suele ser una
glutamina, y los residuos P2 y P4 son variables, por lo que la secuencia de
especificidad de corte de una caspasa puede ser X-Glu-X-Asp. Los
aminoácidos de la enzima que se unen al sustrato y que, por tanto,
reconocen la secuencia P4-P3-P2-P1 se denomina S4-S3-S2-S1. S1 y S3 son
residuos muy conservados en las diferentes caspasas, al contrario que S2 y
S4, que varían significativamente entre las caspasas y originan las diferentes
especificidades por el sustrato en las posiciones P2 y P4.
3.2 Clasificación.
Tradicionalmente las caspasas humanas se han dividido en dos grupos
bien diferenciados en base a su función: caspasas pro-inflamatorias (caspasa-
1, -4, -5, -11, -12), que regulan la maduración de las citoquinas durante el
proceso inflamatorio y caspasas pro-apoptóticas (caspasa-2, -3, -6, -7, -8, -9, -
10), que son la maquinaria ejecutora de la apoptosis. Sin embargo
actualmente esta clasificación no es del todo exacta ya que la activación de
las caspasas pro-inflamatorias puede derivar en piroptosis, una modalidad
de muerte celular asociada con una masiva activación de células
inflamatorias y, además, recientemente se están describiendo funciones de
las caspasas apoptóticas no relacionadas con la apoptosis sino con
Introducción
17
proliferación, diferenciación y migración celular [34] [6] o incluso como
supresoras de tumores, como es el caso de la caspasa-2 [35].
De igual forma, las caspasas apoptóticas se han divido en dos grupos:
caspasas iniciadoras (-2, -8, -9, -10) y caspasas efectoras (-3, -7,-9) (Figura 4).
Las capasas inicadoras poseen un prodominio largo, de unos 100
aminoácidos, que contiene uno de los dos motivos característicos de
interacción proteína-proteína, como son el dominio efector de muerte (DED)
y el dominio de reclutamiento de caspasas (CARD). Se activan por
dimerización y están implicadas en la activación de las caspasas efectoras.
Las caspasas efectoras poseen un prodominio corto, de menos de 30
aminoácidos, se activan por el corte del sitio catalítico por caspasas
iniciadoras, y están implicadas en la proteolisis de un amplio abanico de
componentes celulares que, en última instancia, derivan en la muerte
celular. Dentro de los sustratos de caspasas se encuentran componentes
estructurales (actina y laminina), proteínas reguladoras (proteinas quinasas
dependientes de ADN), inhibidores de deoxirribonucleasas (como DFF45 o
ICAD) que permiten la liberación de DFF40 o CAD que degradan el DNA
durante la apoptosis [3] y otras proteínas pro-apoptóticas y caspasas. Una
información más detallada sobre los sustratos de caspasas se puede
encontrar en la base de datos “CASBAH” ( http://www.casbah.ie ) [36].
Introducción
18
Caspasa-3
Caspasa-7
Caspasa-6
Caspasa-8
Caspasa-9
Caspasa-10
Caspasa-4
Caspasa-2
Caspasa-13
Caspasa-5
Caspasa-12
Caspasa-11
Caspasa-1
Caspasa-14
Efectoras
Iniciadoras
Inflamatorias y otras
Figura 4. Clasificación de las caspasas en mamíferos. Excepto las caspasas-11 y -12 (ratón) y la -13 (bovina), todas las demás son humanas.La flecha indica el primer sitio de corte en la activación.Las flechas medianas y más finas represenatan sitios adicionales de corte. El residuo de cisteína responsable de la actividad catalítica se representa con una línea roja. Los segmentos de colores representan las las regiones que corresponden a los bucles que constituyen la actividad catalítica. Adaptada de Shi, Mol. Cell, 2002)
Introducción
19
3.3 Activación de las caspasas.
3.3.1 Activación de caspasas iniciadoras.
En estado basal, las caspasas iniciadoras son monómeros inactivos.
Tras un estímulo apoptótico, se induce el ensamblaje de las denominadas
plataformas de activación, que están formadas por las propias caspasas y
por proteínas adaptadoras, y que resulta en la activación de las caspasas
iniciadoras. Las proteínas adaptadoras que forman parte de las plataformas
se unen específicamente a los dominios DED o CARD de las caspasas. Cada
caspasa iniciadora tiene su plataforma de activación: el DISC (Death
Inducing Signalling Complex) recluta y activa a la caspas-8 y -10 [37] [38]. El
apoptosoma activa a la caspasa-9 [39] [40, 41], y el PIDDosoma está
implicado en la activación de la caspasa-2 [42, 43] [44] (Figura 5). Dentro de
las caspasas pro-inflamatorias, se ha descrito el inflamosoma como
plataforma de activación de la caspasa-1.
El mecanismo de activación de las caspasas iniciadoras en las
Figura 5. Plataformas de activación de las caspasas iniciadoras apoptóticas. Se muestran los componentes de las plataformas donde se activan las caspasas apoptóticas iniciadoras: el DISC para la activación de las caspasas-8 y-10, el PIDDosoma para la activación de la caspasa-2 y el apoptosoma para la activación de la caspasa-9 (Adaptado de Po-Ki Ho et al, The FEBS Journal 2005).
Introducción
20
plataformas no está bien definido y se proponen dos modelos
principalmente: 1) Modelo de activación por dimerización inducida por
proximidad: este modelo propone que las caspasas iniciadoras deben
dimerizarse para activarse y que la dimerización es facilitada en las
plataformas de activación. La proteolisis interna no activa a estas caspasas,
sino que es un evento secundario que ayuda a la estabilización del dímero
activo [34]. 2) El modelo de conformación inducida, propone que, en el
apoptosoma, se pueden activar directamente monómeros de caspasa-9 a
través de modificaciones en la conformación de su sitio activo [6].
En algunos casos, las moléculas adaptadoras incorporadas en las
plataformas pueden señalizar hacia diferentes vías, por ejemplo, la caspasa-2
y la -8 pueden señalizar para muerte celular o para supervivencia a través de
NF-kB, aunque poco se conoce aún del mecanismo que subyace dicha
señalización. [45], [46], [34].
3.3.2 Activación de las caspasas efectoras. Activación por proteolisis.
Las caspasas efectoras existen ya como homodímeros y requieren de
proteolisis en el dominio catalítico para activarse (Figura 6). La proteolisis
provoca un correcto posicionamiento del sitio activo y, a su vez, una correcta
alineación de los residuos que interaccionan con los sustratos [47] [48] [6]
[34]
Introducción
21
3.4 Inhibición de las caspasas. IAPs.
Debido a que el proceso de proteolisis es irreversible, la activación de
las caspasas en las células está finamente regulado. Así, en las células xisten
varias estrategias para prevenir la activación de las caspasas: inhibición del
sitio activo, degradación proteasomal y proteínas “decoy”. Un modo básico
de inhibición de las proteasas en general se basa en ocupar el sitio activo con
un segmento proteico que mimetiza a los residuos de unión de los
verdaderos sustratos impidiendo la unión de estos con las proteasas. Así con
Figura 6. Mecanismos de activación de las caspasas. A) Organización estructural de las caspasas. Un pro-dominio precede al dominio catalítico compuesto por dos subunidades unidas covalentemente. Los sitios para la (auto)-proteolisis en los residuos de Aspártico están indicados. B) Mecanismos de activación de las caspasas. Las caspasas iniciadoras son monómeros que se activan dimerización mediada por los predominios. Las caspasas ejecutoras son dímeros que se activan por la rotura entre sus subunidades. Tras la activación, pueden ocurrir adicionales eventos proteolíticos que provocan una mayor estabilidad en la estructura y que pueden estar sujetos a regulación.Adaptado de Cristina POP, et al. JBC, 2009.
Introducción
22
respecto a la inhibición de las caspasas, encontramos este mecanismo en
algunos virus. Dos de los mejores inhibidores virales de caspasas
caracterizados, como son las proteínas CmrA y p35/49, procedentes de
baculovirus, se unen directamente al sitio activo de la mayoría de las
caspasas impidiendo su acción. Un mecanismo de inhibición similar pero
mucho más específico lo encontramos en las proteínas humanas
pertenecientes a la familia de los IAPs. Los IAPs son las únicas proteínas
endógenas que regulan tanto la actividad de las caspasas iniciadoras
(caspasa-9), como efectoras (caspasa-3 y -7). Hasta la fecha se han
identificado ocho miembros: NAIP, XIAP, c-IAP1, c-IAP2, survivina, ML-
IAP, ILP2 y Apollon [49]. Esta familia se caracteriza por poseer uno o más
dominios de 70-80 aminoácidos agrupados alrededor de un átomo de Zinc, a
denominados dominios BIR (Bacuoloviral IAP Reapeat). Dentro de los IAPs
que poseen más de un dominio BIR (XIAP, c-IAP1 y cIAP2), parece que cada
dominio tiene una función diferente. Así en XIAP, el dominio BIR3 inhibe
específicamente a la caspasa-3, mientras que la región existente entre el
dominio BIR1 y BIR2 inhibe específicamente a las caspasas-3 y-7. De los
IAPs que solo contienen un dominio BIR, ML-IAP, por ejemplo, inhibe
caspasa-3 y-9 [49]. Se han descrito proteínas homólogas a los IAPs en
Drosophila pero no en nematodos (Figura 7).
Introducción
23
Las proteínas “decoy”, son proteínas estructuralmente similares a las
caspasas y que compiten con ellas por la unión a las proteínas adaptadoras
en las plataformas de activación. Por tanto, desde un punto de vista
semántico no inhiben a las caspasas sino que previenen su activación. Un
ejemplo de este tipo de proteína es cFLIP, que compite con la caspasa-8 para
unirse a la proteína adaptadora FADD en el DISC y, cuya estructura y
función, se comentan más detalladamente en el apartado 6 de la
Introducción. El tercer mecanismo de regulación de las caspasas implica su
degradación via proteasoma. Las caspasas activas tienen una vida media
muy corta, y se ha propuesto que las proteínas responsables para su
degradación por el proteasoma son los IAPs, de hecho, muchos IAPs,
Figura 7. Esquema de la familia de las proteínas IAPs y su estructura. Se muestran las proteínas pertenecientes a la familia de los IAPS en mamíferos y en D.melanogaster.Adapatado de Stefan Riedl, Mol Cell Biol. 2004.
Introducción
24
además del dominio BIR, contien un dominio RING y UbA implicados en la
ligación de ubiquitina, requisito necesario para la degradación proteasomal
de las proteínas [34].
3.5 Otros mecanismos de regulación de las caspasas:
Regulación génica: aunque en la mayoría de los casos la apoptosis no
requiere la síntesis de novo de caspasas, la regulación de la transcripción de
las caspasas tiene importancia en algunas cirscuntancias. Por ejemplo, los
niveles de expresión de caspasa-11 en ratones sanos o células en reposo es
muy bajo, pero el tratamiento con LPS u otro estímulo patológico, como una
isquemia in vivo, induce un fuerte aumento de la transcripción de esta
caspasa. La bajada de expresión de E2F por el adenovirus E1A, la pérdida de
Rb o una aumentada expresión de E2F1 resulta en la acumulación de
zimógenos de caspasas por una directa regulación génica. Esto puede
explicar por qué las células que expresan oncogenes son más sensibles a
cualquier estímulo apoptótico, que las células que no los expresan, lo que se
está potenciando como terapia antitumoral.
Fosforilación: se ha descrito que, en respuesta a factores de
crecimiento, AKT y ERK/MAPK son capaces de fosforilar a la caspasa-9 e
inhibir su activación y la apoptosis [50] [6]. También se ha descrito que
durante la mitosis, la caspasa-9 puede ser inhibida por fosforilación en el
residuo Treonina125 por CDK1/ciclina B1 para impedir la apoptosis [51]. La
caspasa-2 puede ser fosforilada para inhibir su acción por la calcio-
calmodulina proteína quinasa-2, en respuesta al metabolismo de la glucosa
en oocitos de Xenopus [52]. Recientemente se ha descrito que la caspasa-2
puede ser fosforilada en la Serina122 por la DNA-PK tras un daño al ADN
no letal. Esta fosforilación activaría a la caspasa-2 y mediaría la parada en el
ciclo celular más que apoptosis. Además la activación de la caspasa-2 se
Introducción
25
produciría en un complejo intranuclear, en asociación de la caspasa con
PIDD y la subunidad catalítica de DNA-PK pero sin RAIDD [35]. Esta es la
primera evidencia de una función no apoptótica de caspasa-2. Aún más
reciente es el trabajo de Bouchier-Hayes et al (2009) [43] donde demuestran
mediante una nueva técnica de fluorescencia (BiFC) que la activación de la
caspasa-2 se da en el PIDDosmoa y en el citoplasma incluso tras estímulos
que provocan daño en el ADN como es el inhibidor de la topoisomerasa
etopósido. Tras estos resultados, no queda claro si la fosforilación de la
caspasa-2 media su activación o si por el contrario la fosforilación inhibiría
las funciones apoptóticas de la caspasa-2 e induciría la ejecución de otras
funciones no apoptóticas.
La familia de tirosin quinasas Scr pueden fosforilar a la caspasa-8 en la
Tirosina380 [53]. La fosforilación de la Tirosina380 inhibe la activación de la
caspasa-8 inducida por Fas y media la señalización antiapoptótica en células
estimuladas con EGF y en células de cáncer de colon. Recientes estudios han
sugerido que la fosforilación de la caspasa-8 en la Tirosina380 la dirige a
zonas de la membrana donde actúa como proteína puente en una manera
que no requiere su actividad enzimática [54] [55] [53].
La caspasa-3 puede ser fosforilada por p38 en la Serina150 y esta
fosforilación puede ser inhibida por la asociación de la proteína fosfatasa
2A(PP2a) con la caspasa-3. Por lo que la regulación de la PP2A puede ser un
punto clave en la regulación de la caspasa-3 [56] [53]. PKC también puede
fosforilar a la caspasa-3 aumentando su actividad proteolítica, aunque el
sitio de fosforilación no ha sido determinado.
Ubiquitinación. Hasta el momento, existe una única referencia de
regulación de la actividad caspasa por ubiquitinación [57]. En el trabajo se
demuestra como la caspasa-8 necesita ser ubiquitinada por la E3 ubiquitin
Introducción
26
ligasa Cul-3 para su completa activación tras la inducción apoptosis por el
ligando de muerte TRAIL.
4. Rutas de apoptosis
Las principales causas por las que en las células se induce la respuesta
apoptótica son la activación de los receptores de muerte y la inducción de un
estrés celular causado por la privación de factores de crecimiento en el
medio, pérdida de adhesión al sustrato, daño al ADN, estrés en el retículo
endoplámico, activación de oncogenes, infección viral, radiaciones
ionizantes, radiaciones ultravioleta, etc. En células de mamíferos la
respuesta apoptótica está mediada por dos rutas principales, intrínseca y
extrínseca, dependiendo del origen del estímulo apoptótico (Figura 8).
4.1 Ruta intrínseca o mitocondrial.
4.1.1 Papel de la mitocondria en la apoptosis. La ruta intrínseca de
apoptosis se activa en respuesta a estímulos de muerte inducidos por estrés
o daño celular, como se ha comentado anteriormente. La ruta intrínseca de
apoptosis está mediada por la mitocondria y el evento fundamental es la
permeabilización de su membrana externa (MOMP). En respuesta a
estímulos apoptóticos, se liberan al citosol proteínas mitocondriales como
citocromo C, Smac/Diablo, AIF, Omi/HtrA2 y endonucleasa G [58] [59] [60]
[49]. La principal proteína implicada en la ruta mitocondrial de apoptosis es
el citocromo C. Tras su liberación al citosol, se induce la formación de la
plataforma de activación de caspasas iniciadoras denominado apoptosoma.
Introducción
27
El apoptosoma está compuesto por APAF-1, citocromo C, y ATP/dADP y es
donde se recluta y activa la caspasa-9, iniciando así la ruta de activación de
caspasas [61] [62] [41]. Otra proteína liberada desde la mitocondria durante
la apoptosis es Smac (second mitochondria-derived activator of caspases)
[63] o DIABLO (direct IAP-binding protein with low pI) [64] que actúa
uniéndose a los miembros de la familia de los IAPs y neutralizando su
actividad antiapoptótica, favoreciendo con ello la activación de las caspasas.
Omi/HtrA2, al igual que Smac/Diablo, está implicada en la activación de
caspasas por inhibir a los IAPs, aunque también puede estar implicada en la
muerte independiente de caspasas por su actividad serín proteasa [65]. La
proteína AIF (Factor Inductor de Apoptosis), es una flavoproteína con
actividad NADH oxidasa, capaz de inducir muerte independiente de
caspasas [66] [67] [68] [69]. Tras su liberación al citosol desde la mitocondria,
Introducción
28
se transloca al núcleo y se une al ADN mediante interacciones electrostáticas
y mediante la interacción con endonucleasas, como la endonucleasa G, e
induce la degradación del ADN en fragmentos grandes no
oligonucleosomales de aproximadamente 50 kpb [70] [71]. Tras la inducción
de un estrés a la mitocondria, además de la activación de la ruta intrínseca
de apoptosis, mediada por el Citocromo C y el apoptosoma, y de la muerte
celular independiente de caspasas mediada por AIF, se puede producir la
inducción de necrosis, mediada por la liberación desde la mitocondria de
especies reactivas de oxigeno (ROS) y de Ca2+ [72]. La ruta mitocondrial de
apoptosis está mediada por proteínas de la familia de Bcl-2, que
comentamos más en detalle a continuación.
4.1.2 Proteínas de la familia de Bcl-2. Estas proteínas juegan un papel
central en la regulación de la muerte celular y participan en mecanismos
como apoptosis, necrosis y autofagia [73]. Alteraciones en su expresión y
función contribuyen a la patogénesis y progresión del cáncer, por lo que
constituyen una fuente de dianas terapeúticas que, actualmente, están
siendo exploradas en ensayos clínicos. Bcl-2 fue descrito como un oncogen
que se activaba como resultado de la translocación cromosómica que se da
en linfomas foliculares de células B humanas y que yuxtapone en el
cromosoma 14 el gen de la cadena pesada de las inmunoglobulinas, con el
gen bcl-2 proveniente del cromosoma 18 [74] [75]. Un punto clave en su
descubrimiento fue que la sobreexpresión de Bcl-2 no inducía proliferación
celular, como la mayoría de los oncogenes descritos anteriormente, sino que
la sobreexpresión inhibía la muerte celular [76] [77]. En humanos se han
descrito al menos 20 miembros de esta familia. Todos poseen entre uno y
cuatro dominios de homología con la proteína Bcl-2 (BH1-BH4, Bcl-2
Introducción
29
homology), que corresponden a segmentos α-hélices. Clásicamente se han
divido en tres grupos de acuerdo a su estructura y función (Figura 9):
Clase 1: miembros antiapoptóticos: poseen de tres a cuatro de los llamados
dominios BH y principalmente se encuentran integradas en la membrana
mitocondrial externa, aunque pueden tener una localización citosólica y de
membrana nuclear y del retículo endoplásmico. A este grupo pertenecen las
proteínas Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-w, Mcl-1, Bcl-B/Boo/DIVA y A1/Bfl-1/Bcl-2A1.
La función de estas proteínas en la apoptosis es unir e inhibir directamente a
los miembros pro-apoptóticos de la familia. Los dominios BH1-BH3 forman
un surco hidrofóbico, mientras que el BH4 estabiliza dicha estructura [78].
Este surco hidrofóbico puede unir la α-hélice del dominio BH3 de una
proteína pro-apoptótica de la familia de Bcl-2 [79]. En condiciones basales,
no todas las proteínas con un dominio BH3 pueden interaccionar con el
surco hidrofóbico de los Bcl-2 antiapoptóticos. Es necesario que los
Figura 9. Clasificación de proteínas de la familia de Bcl-2. La familia se compone de proteínas que contienen uno o varios domnio conservados BH. Se dividen en miembros anti-apoptóticos y proapop´tocios. Estos últimos a su vez se dividen en miembros multidominio y miembros con solo el dominio BH3. El dominio transmembrana (TM) puede estar ausente de algunos de los miembros “sólo BH3” (Adaptado de M. Giam et al. Oncogene 2009)
Introducción
30
miembros “sólo BH3” y “tipo Bax” expongan su dominio BH3 tras una
modificación pos-traduccional y/o cambio conformacional [80].
Clase 2: miembros pro-apoptóticos multidominios: en este grupo se incluyen las
proteínas Bax, Bak y Bok que contienen los dominios BH1-BH3. Bax y Bak,
son los responsables de la permeabilización de la membrana mitocondrial
externa porque forman un poro proteolipídico en ella que permite la
liberación de las proteínas residentes en el espacio intermembranoso y la
consecuente inciación de la cascada apoptótica. Células que han perdido la
expresión de Bax y Bak son resistentes a multitud de estimulos apoptóticos.
Para que Bax y Bak induzcan la permeabilización de la membrana
mitocondrial externa deben estar en ella o muy próximos a ella [81] y,
además, la formación del poro implica una oligomerización de proteínas Bax
o Bak [82] [83]. Bax es una proteína citoplamástica que, por lo tanto, debe
translocarse a la membrana mitocondrial tras el estímulo apoptótico. El
mecanismo de translocación no es bien conocido pero se sabe que implica un
cambio conformacional de la proteína [84. Recientes estudios sobre Bak,
determinan que moléculas inactivas de Bak residentes en la membrana
mitocondrial, sufren un cambio conformacional tras el estímulo apoptótico
que les permite asociarse con otras moléculas de Bak para formar el poro
{Dewson, 2008 #87].
Clase 3: miembros pro-apoptóticos “sólo BH3”: estos miembros de la familia Bcl-
2 solamente comparten entre ellos mismos, y con los otros miembros de la
familia, el dominio BH3. Unos diez miembros han sido identificados en
mamíferos, entre ellos las proteínas Bad, Bid, Bim/Bod, Bik/NBK, Bmf,
Hrk/DP5, Noxa y Puma/BBC3 [85] [86]. Las proteínas “sólo BH3” actúan
por encima de los miembros proapoptóticos tipo Bax, ya que no son capaces
de inducir apoptosis en ausencia de estos [87] y han sido descrito como
sensores y mediadores de la apoptosis ya que podrían transmitir señales de
Introducción
31
muerte diferentes y específicas a los miembros de la familia Bcl-2 que poseen
varios domios BH. Por ejemplo, Bim es importante para la muerte de
linfocitos tras la retirada de citoquinas del medio [88], Bmf y Bim son
necesarios en anoikis [89] [90] y Noxa y Puma participan en la apoptosis
mediada por p53 como consecuencia de un daño al ADN [91] [92]. En
células de mamíferos sanas, las proteínas “sólo BH3” se encuentran inactivas
[93] y, en respuesta a un estímulo apoptótico, aumenta su transcripción y/o
se modifican pos-traduccionalmente, o se relocalizan para su activación.
Cómo interaccionan los miembros de la familia para permitir la
permeabilización de la membrana mitocondrial es un tema que provoca una
gran controversia y actualmente existen dos modelos principales para
explicar cómo se activan Bax y Bak:
Modelo de activación indirecta: de acuerdo a este modelo, las proteínas
Bax y Bak están siempre unidas a los miembros antiapoptóticos que inhiben
su activación. Tras un estímulo apoptótico, las proteínas “sólo BH3” se unen
a los miembros antiapoptóticos de la familia liberando a Bax y Bak [94]. Una
predicción que surge de este modelo es que Bax y Bak deben estar siempre
unidos a proteínas antiapoptóticas tales como Bcl-2 o Mcl-1, sin embargo
experimentos de co-inmunoprecipitación de Bax y Bak demuestran que sólo
una minoría de estas proteínas están unidas a las antiapoptóticas en estado
basal. Nuevas aportaciones de este modelo indican que la fracción de
proteínas Bax y Bak que se encuentran unidas a las proteínas
antiapoptóticas, son las que están ya activadas, tal vez de forma espontánea
o tal vez por otros estímulos desconocidos [95] [96].
Modelo de activación directa: según este modelo proteínas “sólo BH3”,
como Bid y Bim directamente interaccionan e inducen cambios
conformacionales en Bax y Bak. Estudios donde se utilizan proteínas
Introducción
32
recombinantes, lípidos de membrana y la técnica de transferencia de
fluorescencia FRET, indican que, efectivamente, estas interacciones se dan y
que provocan la permeabilización de la membrana (Novell et al Cell 2008).
Los miembros de la familia antiapoptóticos, inhibien la muerte celular
porque se unen y secuestran a los miembros “sólo BH3” activadores y
también uniendose a las proteínas Bax y Bak que pueden estar activadas. En
este modelo los miembros “sólo BH3” son divididos en dos categorías,
activadores (Bid y Bim) y sensibilizadores [97]. Los sensiblizadores no
pueden unirse y activar a Bax y Bak, pero si pueden unirse a las proteínas
antiapoptóticas liberando así a los activadores para que ejerzan su función
sobre Bax y Bak. Una predicción que se puede sacar de este modelo es que la
deleccion de los “sólo BH3” activadores debería resultar en la inhibición de
la apoptosis, como ocurre cuando se elimina la expresión de Bax y Bak al
mismo tiempo. Sin embargo, esto no ocurre así, y la inhibición de la
expresión de Bid y Bim afecta mínimamente a la inducción de la apoptosis
[94]. Esto pone de manifiesto que deben existir otras proteínas que actúen
como activadores, de hecho hay datos que asignan esta función a proteínas
como Puma y p53 [98] [99]. Resultados muy recientes apoyan este modelo
de activación directa, ya que se ha conseguido determinar la interacción
entre Bim y Bax, aunque sorprendentemente, la interacción se da en la
superficie de Bax opuesta al bolsillo hidrofóbico formado por los dominios
BH1, BH2 y BH3 [100].
Introducción
33
4.2 Ruta extrínseca o de receptores de muerte.
Ruta extrínseca o de receptores de muerte se activa por la unión de
diferentes ligandos a sus receptores en la membrana plasmática. A los
receptores responsables de transmitir la señal de apoptosis al interior de la
célula se les denomina receptores de muerte y pertenecen a la familia de
receptores del factor de necrosis tumoral (TNF). En humanos se han descrito
seis receptores de muerte que son CD95 (Fas, APO-1), TNFR1 (p55,
CD120Aa), TRAMP (APO-3, DR3, WSL-1,LARD), TRAIL-R1 (DR4), TRAIL-
R2 (DR5, APO-2, KILLER, TRICK2) y DR6 (TR-7) [101]. Los receptores de
muerte son proteínas transmembrana de tipo I, que intracelularmente,
contienen un dominio de interacción con otras proteínas, denominado
Figura 10. Modelos de activación de Bax/Bak. En el modelo de activación directa, proteínas “sólo BH3” activadores como Bim, se mantienen unidas a proteínas anti-apoptóticas, hasta que esta unión es desplazada por proteínas “sólo BH3” sensibilizadores como Bad. Una vez libres, los activadores pueden unirse y activar a las proteínas efectoras como Bax. En el modelo indirecto, las proteínas efectoras activas son inhibidas por las proteínas antiapotóticas, hasta que las proteínas “sólo BH3” neutralizan a las antiapoptóticas (Adaptado de M. Giam et al. Oncogene 2009)
Introducción
34
dominio de muerte (DD) de unos 80 aminoácidos. Este dominio es
fundamental para la transmisión del impulso apoptótico y sirve de anclaje a
una serie de proteínas señalizadoras que también poseen un dominio de
muerte (DD). Extracelularmente poseen entre dos y cuatro dominios
conservados ricos en cisteínas (CRDs) por los que se unen a su ligando
específico. Los ligandos de estos receptores, llamados ligandos de muerte,
son proteínas transmembrana tipo II (extremo c-terminal en el espacio
extracelular) y también pertenecen a la superfamilia ligandos de TNF. Se
unen a sus receptores a través de una región de 150 aminoácidos en el
extremo c-terminal denominada dominio de homología a TNF (THD) [102].
La mayoría de los ligandos pueden existir también en forma soluble y ser
funcionales (Figura 11).
Figura 11. Ligandos y receptores de la familia de TNF. En color morado se representan los dominios ricos en cisteína (CRDs) extracelulares y en verde los dominio de muerte (DD) intracelulares.
Introducción
35
El inicio de la señalización a través de los receptores de muerte,
requiere de la oligomerización de estos y la yuxtaposición de los dominios
de muerte (DD) intracelulares. Inicialmente se pensaba que la unión del
ligando en forma de trímero al dominio extracelular del receptor, provocaba
la trimerización de este [103]. Sin embargo, este concepto ha cambiado ya
que, mediante experimentos de cristalografía de proteínas, se ha establecido
que el ligando trimerizado se une a un pre-emsamblado complejo
oligomérico del receptor. La formación de estos complejos de receptores
independientes de ligando ocurre a través de los dominios ricos en cisteína
de la región extracelular de los receptores, denominada PLAD (preligand
assembly domain) [104]. Aunque esta región no es la implicada en la unión
del ligando, la delección de la misma afecta severamente a la unión de TNF-
α al TNFR-1, sugiriendo que el pre-ensamblaje de los receptores es un
evento crucial en la unión del ligando al receptor. La formación de
complejos de receptores independiente de ligando también se han descrito
para los receptores de FAS y TRAIL [105] [106]. La unión del ligando
provoca un cambio conformacional en el receptor que permite la unión de
proteínas adaptadoras mediante los dominios DD [107]. Las proteínas
adaptadoras, como por ejemplo, FADD y TRADD, no tienen actividad
enzimática por sí mismas sino que sirven como puente para la unión de
caspasas iniciadoras (caspasa-8 y -10), a través de los dominios DED
presentes tanto en las proteínas adaptadoras como en las caspasas. Todo el
conjunto de estas proteínas forman el complejo señalizador de muerte
(DISC, Death-Inducing Signalling Complex) descrito por primera vez para el
receptor de Fas [108], que sirve como plataforma de activación de las
caspasas iniciadoras -8 y -10, lo que a su vez induce la activación de caspasas
efectoras (-3, -6y 7) y el consecuente inicio de la apoptosis. Al DISC también
pueden unirse proteínas inhibidoras de la activación de las caspasas, como
Introducción
36
por ejemplo cFLIP, que inhibe la activación de la caspasa-8 y al que nos
referiremos más en detalle en el apartado 6 de la Introducción.
La ruta extrínseca de apoptosis (principalmente la mediada por los
receptores de muerte Fas y TRAIL-R) está conectada con la intrínseca a
través de la proteína de la familia de Bcl-2, Bid. Tras la activación de la
caspasa-8 en el DISC, ésta puede procesar a Bid dando lugar su forma
truncada, tBid, que es capaz de translocarse a la membrana mitocondrial
externa y junto con Bax y Bak inducir la liberación de citocromo C al citosol
y la consecuente activación de caspasa-9 en el apoptosoma, lo que
provocaría más activación de caspasas efectoras (-3,-6 y -7) (Figura 9).
Que tras la activación de la ruta extrínseca de apoptosis se active la
ruta intrínseca depende del tipo celular y se ha determinado que las células
se clasifiquen en células Tipo I, en las que la activación de caspasa-8 en el
DISC es suficiente para activar directamente a las caspasas efectoras, o
células Tipo II, en las que o la activación inicial de la caspasa-8 en el DISC no
es suficiente para activar a las caspasas efectoras y requiere de la vía
mitocondrial para ello, o bien los niveles de IAPs en estas células son tan
altos que no permiten la activación de las caspasas efectoras tras la
activación de la caspasa-8 en el DISC y requieren de los factores
mitocondriales necesarios para inhibir la función de los IAPs (Smac/Diablo).
4.2.1 Señalización a través de TNFR-1/TNF-α.
El sistema TNF/receptor de TNF consta de dos receptores, TNFR-1 y
TNFR-2 y tres ligandos, TNF-α unido a membrana, TNF-α soluble y TNF-β
(soluble). Sólo el TNFR-1 es considerado como receptor de muerte puesto
que el TNFR-2 carece del dominio de muerte intracelular y, además,
estudios en ratones deficientes para TNFR-1 indican que este receptor es
esencial para la apoptosis inducida por TNF en células infectadas [109] [110].
Introducción
37
El factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) juega un papel fundamental en
inflamación e inmunidad, tanto como en proliferación y diferenciación de
diferentes tipos celulares [111]. Tanto el soluble, como el unido a membrana,
son biológicamente activos y son producidos principalmente por
macrófagos, monocitos y células T en respuesta a infección y condiciones
inflamatorias.
La unión de TNF-α a TNFR-1 permite la formación de dos complejos,
uno inicial (complejo I) que regula la expresión de proteínas antiapoptóticas
y que, por tanto, previene la muerte celular y un segundo complejo
(Complejo II) que dispara la muerte celular [112]. El Complejo I está
formado por el ligando, el receptor, TRADD, RIP, TRAF-2 y c-IAP1/2,
aunque la presencia de la proteína adaptadora TRADD en este complejo es
Figura 12. Señalización mediada por TNFR-1.Modelo de señalización y formación de complejos de señalización mediados por TNF-R1. Para detalles ver el texto (Adaptado de Maria Eugenia Guicciardi et al , The Faseb Journal, 2009)
Introducción
38
objeto de controversia [112] [113]. La formación del complejo I requiere de la
translocación del TNFR-1 a regiones de la membrana plasmática ricas en
colesterol y esfingolípidos (lipid-rafts). Aquí, varias de las proteínas del
complejo pueden sufrir modificaciones pos-traduccionales, por ejemplo, RIP
es poliubiquitinado por cIAP1/2, requisito necesario para la activación de
NF-kB [114] [115]. De la formación del complejo I pueden derivar dos vías
de señalización diferentes. Una de ellas promueve supervivencia celular y
está mediada por la unión de la proteína quinasa TAK1 a RIP ubiquitinado
que resulta en la activación de la quinasa y la consecuente fosforilación y
degradación del inhibidor de NF-kB, IkBα a través del complejo de IKK.
Tras la degradación proteasomal de su inhibidor, NF-kB puede translocarse
al núcleo dando lugar a la transcripción de proteínas implicadas en la
supervivencia celular como TRAF1, TRAF2, cIAP-1, cIAP-2 y cFLIP entre
otros. La otra vía de señalización promovida por el complejo I permite la
activación de la proteína quinasa JNK que puede dar lugar a apoptosis, por
ejemplo, a través de la fosforilación y activación de la proteína E3 ubiquitin
ligasa Itch, la cual promueve la degradación proteasomal de cFLIP,
aumentando la activación de caspasa-8 [116]. El complejo I es rápidamente
internalizado por endocitosis y se ha sugerido, que durante este proceso el
receptor se disocia del resto de proteínas y así el DD de RIP puede
interaccionar con el DD de FADD, lo que conlleva el reclutamiento y
activación de la caspasa-8. Este complejo II (receptosoma) estaría formado,
por tanto, por TRADD, TRAF2, RIP, FADD y caspasas-8/-10 [112]. Sin
embargo, la composición del complejo II ha sido cuestionada tras la
descripción de vesículas endocíticas que contienen el receptor TNFR-1 [113].
Independientemente de su composición, lo que se puede asegurar es que el
complejo II es espacial y temporalmente diferente al complejo I.
Introducción
39
Además de por la inhibición de la actividad transcripcional de NF-kB,
(inhibiendo la síntesis de proteínas con cicloheximida, por ejemplo), la
señalización apoptótica de TNF puede ser facilitada por el uso de moléculas
miméticas de Smac, que inhiben XIAP, cIAP-1 y cIAP-2. Aunque tanto la
cicloheximida como los miméticos de Smac inducen la activación de
caspasa-8, los mecanismos implicados parecen ser diferentes. Así, la
cicloheximida inhibie la síntesis de cFLIP inducida por NF-kB, permitiendo
la activación de caspasa-8 en el complejo II, sin embargo los miméticos de
Smac se unen a cIAP-1 y cIAP-2 promoviendo su actividad E3 ubiquitin
ligasa, lo que les hace autoubiquitinarse y degradarse por el proteasoma.
Esto permite la deubiquitinación de RIP y su liberación del complejo I, lo
que permite su asociación con FADD y el reclutamiento y activación de la
caspasa-8 [46]. Así el estado de ubiquitinación de RIP determinaría la
señalización hacia supervivencia o muerte [117] (O´Donnell MA, Curr. Biol
2007) [118].
4.2.2 Señalización a través de Fas/FasL.
El receptor Fas se expresa en la mayoría de los tejidos humanos (esto
es real?, en tesis de Menchu se dice otra cosa), pero es particularmente
abundante en hígado, corazón, riñón, páncreas, cerebro, timo, tejido linfoide
además de en linfocitos T maduros activados. Se puede encontrar unido a la
membrana plasmática o en forma soluble por la pérdida del dominio
transmembrana por splicing alternativo del ARN mensajero [119].
El ligando de Fas (FasL) se expresa principalmente como estructuras
homotriméricas en la membrana de las células T activadas (mFasL), aunque
de esta puede derivarse una forma soluble (sFasL) cuya actividad biológica
genera controversia [120]. La unión de FasL a complejos preasociados del
receptor, induce la formación de agregados (resistentes a SDS y
Introducción
40
mercaptoetanol) donde se produce la palmitoilación del receptor [121] [122].
Esta es la señal para la localización de los agregados en lipid- rafts.
Posteriormente, los agregados se organizan en otros de mayor peso
molecular, que son microscópicamente detectables a los que se les denomina
SPOTS (signalling protein oligomerization structures) y donde se recluta a
FADD. La interacción entre FADD y el receptor es requisito imprescindible
para la formación de los SPOTS [123 {Siegel, 2004 #130]. La función de los
SPOTS es reclutar suficientes niveles de caspasa-8 para obtener una
completa activación enzimática. Tras la unión de la caspasa-8 se forman
unos mayores agregados en grandes plataformas de lipid-rafts, que inducen
la internalización del receptor por endocitosis dependiente de clatrina. En
los compartimentos endosomales es donde se da una mayor formación del
DISC y activación de caspasa-8 [124]. Recientemente se ha descrito la
formación de un segundo complejo (complejo II) citosólico que estaría
compuesto por FADD, caspasa-8 y cFLIP cuya función sería aumentar la
activación de la caspasa-8 y cuya formación no dependería de la
internalización del receptor [125]. Tras la activación de la caspasa-8 en el
DISC se induciría la activación de caspasas efectoras y, dependiendo del tipo
celular, la activación de la ruta mitocondrial de apoptosis a través del corte
de Bid por la caspasa-8, activándose así toda la maquinaria apoptótica.
En muchos tipos celulares Fas no solo no es citotóxico, sino que
induce proliferación, migración y producción de citoquinas [126] [127].
Ejemplos de estas funciones no apoptóticas pueden ser: la señalización de
ERK inducida por Fas es esencial en regeneración de las neuronas [128]; Fas
puede inducir la regeneración del hígado tras un daño o tras una
hepactetomía parcial [129, 130]; Fas aumenta la proliferación de células T y
timocitos a través de una vía dependiente de FADD y caspasa-8 [131
Introducción
41
{Newton, 1998 #140]; Fas facilita la invasión de células de glioblstoma
resistentes a la apoptosis in vivo por activar la via PI3K-AKT [132].
La compartimentalización del DISC de Fas es critica para determinar
la señalización que se inducirá tras la estimulación ya que si la
internalización del receptor es alterada o la formación del DISC se reduce,
los agregados del receptor señalizan hacia rutas de supervivencia como NF-
kB y ERK [124].
Recientemente se ha descrito en el receptor de Fas un conservado motivo
extracelular de unión a glicoesfingolípidos (GMB, glicosphingolipids-
binding motif) que determina la ruta de internalización. Mutaciones de
pérdida de función en este motivo provocan una formación del DISC
Figura13. Señalización mediada por Fas/FasL. Modelo de la vías apoptótica y no apoptótica de Fas/FasL. Para detalles ver el texto. Adaptado de Maria Eugenia Guicciardi et al. The Faseb Journal, 2009)
Introducción
42
defectuosa y causa una endocitosis independiente de clatrina, lo que
potencia las funciones no apoptóticas de FAS [133]
5. Señalización mediada por TRAIL.
5.1 TRAIL y sus receptores.
TRAIL es una proteína transmembrana tipo II que pertenece a la
familia de citoquinas del factor de necrosis tumoral (TNF). Se identificó por
homología con el dominio c-terminal de FasL (CD95L) [134]. Aunque se
sintetiza como proteína transmembrana puede ser cortado de la superficie
celular mediante proteolisis y liberarse al medio extracelular en una forma
soluble que mantiene su actividad. Las proteínas encargadas de esta
proteolisis pertenecen a la familia de las cistein-proteasas [135]. TRAIL es
activo biológicamente como un homotrímero con el residuo de cisteína 230
unido a un átomo de zinc esencial para su actividad [136] [137]. El ARN
mensajero de TRAIL está presente en la mayoría de los tejidos pero se
expresa principalmente en células del sistema inmune [135], donde juega un
papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis de las células T y en la
muerte mediada por células Natural Killer (NK) y células T Natural Killer
(TNK) de células tumorales o transformadas por infección viral [138, 139]
[140]. Existen grandes esperanzas en el uso de TRAIL como agente contra el
cáncer, ya que se ha visto que es capaz de inducir apoptosis selectivamente
en células tumorales y no en células normales, aunque las razones en esta
diferencia de sensibilidad aún no están bien esclarecidas [134] [141].
Además, a diferencia de TNF-α y FasL, la administración sistémica de
TRAIL es capaz de inducir apoptosis en células tumorales sin ninguna
toxicidad en órganos o tejidos normales [142] [143]. Aunque se ha descrito
cierta toxicidad en hepatocitos in vitro, ésta depende de la preparación de
TRAIL recombinante utilizada [144].
Introducción
43
TRAIL puede unirse específicamente a cuatro receptores
transmembrana (TRAIL-R1 a –R4) y, con menor afinidad, a un receptor
soluble denominado osteoprotegerina (OPG), aunque en condiciones
fisiológicas esta unión no parece darse [145] [146] (Figura 14).
Los receptores transmembrana de TRAIL son proteínas tipo I que
pertenecen a la familia de receptores de TNF y, al igual que TRAIL, se
expresan constitutivamente en la mayoría de tejidos y tipos celulares
humanos. Dos de estos receptores, TRAIL-R1 (DR4) [147] y TRAIL-R2 (DR5)
[148] [149] poseen en su región intracelular el dominio de muerte (DD)
necesario para la señalización apoptótica y es por eso que se les denomina
receptores pro-apoptóticos de TRAIL. Por otro lado, TRAIL-R3 (DcR1) [150]
[151] y TRAIL-R4 (DcR2) [152] son incapaces de señalizar para apoptosis
porque o bien carecen del dominio citoplasmático y transmembrana como
ocurre con TRAIL-R3, o poseen un DD truncado, como es el caso de TRAIL-
R4, por lo que no es capaz de ensamblar la maquinaria de activación de la
Figura 14. Receptores de ApoL2/TRAIL. Los receptores DR4 y DR5 corresponden a TRAIL-R1 y TRAIL-R2 respectivamente. Los receptores señuelo o Decoy, DcR1 y DcR2 corresponden a TRAIL-R· y TRAIL-R4 respectivamente. La osteoprotegerina (OPG) es un receptore soluble capzar de unir Apo2/TRAIL, aunque el significado biológico de la unión no es conocido. Adpatado de Almasan and Ashkenazi, Citokine and Growth Factor Review, 2003.
Introducción
44
apoptosis. Por eso a estos receptores se les denomina receptores
antiapoptóticos o señuelo, ya que además de no trasmitir las señales
apoptóticas, compiten con los receptores pro-apoptóticos por la unión a
TRAIL.
5.2 Señalización apoptótica mediada por TRAIL.
La unión de TRAIL a sus receptores pro-apoptóticos TRAIL-R1 y
TRAIL-R2 inicia una señalización apoptótica muy similar a la inducida tras
la activación de Fas. Sin embargo, parece que TRAIL-R2 juega un papel más
importante que TRAIL-R1 en la activación de la apoptosis cuando ambos
receptores están expresados en la misma célula [153]. A diferencia de lo que
ocurre con Fas, los receptores de TRAIL no tienen que ser internalizados tras
la unión del ligando para que se forme el DISC y que se transmita la
señalización apoptótica. Tras la unión de ligando y receptor, se reclutan las
proteínas FADD y caspasa-8/-10, dando lugar a la formación del DISC de
TRAIL y su localización en lipid-rafts, donde se activará la caspasa-8. La
caspasa-8 activa puede activar, a su vez, directamente a las caspasas
efectoras (-3,-7) o cortar a Bid para activar la ruta mitocondrial de apoptosis.
Bid cortado (tBid) se transloca a la mitocondria y junto con Bax y/o Bak
induce la permeabilización de la membrana mitocondrial externa. Esto
permite la liberación desde la mitocndria de citocromo C y Smac/Diablo,
entre otras proteínas. En el citosol, el citocromo C formará el apoptosoma
junto con Apaf-1 y caspasa-9 que inducirá la activación de ésta. La caspasa-9
activa puede activar, a su vez, a las caspasas efectoras. Smac/Diablo actúa
como ya se describió anteriormente uniendose a los IAPs y provocando su
autoubiquitinación y degradación por el proteasoma, permitiendo así la
activación de las caspasas.
Introducción
45
Al igual que ocurre con la señalización mediada por Fas, parece que
tras la formación del DISC de TRAIL, se produce el ensamblaje de un
segundo complejo intracelular del que se disocian el ligando y el recptor,
manteniendose FADD y caspasa-8 y al que se le unen moléculas como RIP,
TRAF-2, IKKγ y TRADD y que conduce a la activación de NF-kB y a vías de
las MAPK como JNK y p38 [154].
Aunque TRAIL induce apoptosis en células tumorales y no en células
normales, existen muchos tumores que son resistentes a TRAIL. La
resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL puede darse a diferentes
niveles dentro de su vía de señalización:
Figura 15. Señalización apoptótica y de supervivencia mediada por TRAIL.. Adaptado de Kruyt, Cancer Letters, 2008
Introducción
46
Resistencia a nivel de los receptores de muerte en membrana: disfunciones en
los receptores proapoptóticos así como sobrexpresión de los antiapoptóticos
pueden producir resistencia a TRAIL. La modificación pos-traduccional de
los receptores de TRAIL mediante O-glicosilación permite una mayor
asociación de receptores tras la estimulación con TRAIL que aumenta la
activación de caspasa-8. Parece ser que la expresión de las enzimas o-
glicosiltransferasas, responsables de la o-glicosiliación, se correlaciona con la
sensibilidad a TRAIL en las células tumorales, por lo que puede representar
un marcador a tener en cuenta para el uso terapéutico de TRAIL el
tratamiento del cáncer [155].
Resistencia a nivel del DISC: la mayoría de los componentes del DISC son
esenciales para la apoptosis inducida por TRAIL, y por ello una disfunción en
cualquiera de estos, especialmente FADD, Caspasa-8 y FLIP puede permitir
el desarrollo de resistencias a TRAIL. Además, recientemente se ha descrito
que la ubiquitinación de la caspasa-8 en el DISC es necesaria para una
completa activación enzimática. Esta ubiquitinación está mediada por la
proteína E3 ubiquitin ligasa Cul-3 y es inducida por TRAIL [57].
Resistencia a nivel de las proteínas de la familia de Bcl-2: la sobrexpresión
de Bcl-Xl o Bcl-2 puede proteger de la apoptosis mediada por TRAIL en
algunos tipos celulares, por ejemplo, en líneas celulares de cáncer
pancreático, la expresión de Bcl-xL correlaciona altamente con la sensibilidad
a TRAIL. Asimismo, la inactivación por mutación de Bax o Bak puede
sensibilizar a células resistentes a TRAIL o a drogas genotóxica [156].
Resistencia a nivel de los IAPs y Smac/Diablo: en las células de tipo II,
dependientes de la ruta mitocondrial, la regulación de los IAPs y de
Smac/Diablo es el principal determinante de la sensibilidad a TRAIL. Líneas
celulares tumorales resistentes a TRAIL en comparación con líneas sensibles
muestran una reducida liberación de citocromo C al citosol, sin embargo la
Introducción
47
sobreexpresión de Smac/Diablo por transfección es capaz de restituir la
sensibilidad en estas células [156].
5.3 Señalización no apoptótica mediada por TRAIL.
Además de inducir apoptosis, se ha descrito que TRAIL puede
promover la activación de rutas de supervivencia, como NF-kB, y MAPK.
Así parece que TRAIL-R1, -R2, y –R4 son capaces de activar la ruta de NF-kB
a través de una vía dependiente de TRAF-2-NIK-IKK. TRAIL-R1 también
puede activar JNK a través de un complejo formado por TRAF2-MEKK1-
MEKK2 [157]. Además, TRAIL puede señalizar para la activación de ERK
[158] [159], lo que induce resistencia a la apoptosis por suprimir la activación
de caspasa-8 y el corte de Bid en ciertos tipos celulares [160] [161].
La activación de rutas de supervivencia mediada por TRAIL tiene especial
importancia en su uso como agente antitumoral. Así la activación de NF-kB
por TRAIL puede derivar en proliferación [162], metástasis e invasión [163].
TRAIL, además de inducir la supervivencia celular a través de la activación
de rutas de supervivencia, la puede promover a través de la inducción de
autofagia. La inducción de autofagia mediada por TRAIL en células
epiteliales normales de mama MCF-10A fue descrito por primera vez por
[164]. Más recientemente, se ha descrito la ruta de activación de autofagia
mediada por TRAIL en estas células, donde a partir de la formación del
DISC de TRAIL, se activa la proteína AMPK, a través de la activación de la
proteína quinasa TAK-1, y que deriva en la inhibición de mTOR, señal
inductora de autofagia [165].
5.4 TRAIL y cáncer.
Una de las características más atractivas de la activación de la
apoptosis como terapia antitumoral es su potencial para inducir regresión de
los tumores [4]. Los tratamientos tradicionales contra el cáncer como la
Introducción
48
quimioterapia o radioterapia inducen apoptosis solamente como un efecto
secundario a todos los daños que causan en la célula. Además, estos
tratamientos, afectan a la mayoría de las células en proliferación
independientemente de que sean tumorales o no, y no siempre son capaces
de erradicar las células tumorales, debido en gran parte a la capacidad
adquirida de las células tumorales de bloquear los mecanismos apoptóticos
[166]. Por ejemplo, la proteína supresora de tumores p53 se encuentra
mutada en el 50% de los tumores, lo que provoca la inactivación de ruta
mitocondrial de apoptosis inducida por algún daño al ADN, que es en lo
que se basan los tratamientos antitumorales convencionales [167] [168].
El desarrollo de estrategias que activen la vía extrínseca de apoptosis a
través de los receptores proapoptoticos se presenta como una alternativa
muy atractiva en la terapia antitumoral, por varias razones: los receptores
pro-apoptoticos se encuentran expresados en la mayoria de los tumores,
oncogenes como MYC o Ras parecen incrementar la sensibilidad a la via
extrinseca de apoptosis por facilitar la interacción con la vía intrínseca [169]
[170]. Además, los receptores proapoptóticos pueden activar a las caspasas
independientemente de p53. La estimulación de los receptores de TRAIL
con anticuerpos agonistas o TRAIL recombínante humano, parecen ser los
más óptimos para este propósito, ya que al contrario que TNFR-1 [171] [172]
y Fas [173] que causan citotoxicidad especialmente en hepatocitos en
modelos animales, pueden inducir apoptosis en células tumorales sin afectar
a las células normales [142] [174] [175] [144]. Se han diseñado diferentes
formas de TRAIL humano recombinante, de los cuales el primero y el único
que se ha utilizado en ensayos clínicos ha sido el denominado
Apo2L/TRAIL (AMG-951) [176]. De los anticuerpos agonistas de los
receptores de TRAIL que se han utilizado para ensayos clínicos destacan
Mapatumumab (Anti-TRAIL-R1, Human Genome Sciences-HGS),
Introducción
49
Lexatumumab (Antri-TRAIL-R2, HGS), AMG-655 (Anti-TRAIL-R2, Amgen)
y Apomab (Anti-TRAIL-R2, Genentech). El uso de anticuerpos agonistas
puede presentar, en principio, algunas ventajas sobre el uso del TRAIL
recombínante como, por ejemplo, que tienen una vida media más larga, de
14 a 21 dias frente a los 30-60 minutos del recombinante y que no pueden ser
inhibidos por receptores señuelo al ir dirigidos específicamente contra
TRAIL-R1 o TRAIL-R2 [143]. Debido a la existencia de tumores resistentes a
TRAIL, también se ha ensayado el uso de TRAIL recombínante y
anticuerpos agonistas de los receptores pro-apoptóticos de TRAIL en
combinación con otros agentes antitumorales. Así podemos destacar:
TRAIL y quimioterapia o radioterapia: varias clases de drogas
quimioterapeúticas que incluyen antraciclinas e inhibidores de
topoisomerasas y radiaciones ionizantes sensibilizan a las células tumorales
a la apoptosis inducida por TRAIL [177] [178] [179] (Shamimi-Noori S
Cancer Gene Therapy 2008) [180] [181]. Además, algunos tratamientos de
TRAIL y drogas quimioterapeúticas están en fases tempranas de ensayos
clínicos, por ejemplo, Lexatumumab en combinación con 5-flourouracil o
doxorrubicina entre otros, está en fase clínica 1b [182].
TRAIL e inhibidores de proteasoma: los inhibidores del proteasoma
inducen apoptosis pos sí mismos en células tumorales, pero también se ha
descrito que pueden sensiblizar a la apoptosis inducida por TRAIL [183]
[184]. Recientes estudios in vivo indican una reducción en la metástasis de
cáncer de mama y renal en ratones tratados con Bortezomib y anti-TRAIL-R2
en comparación a los tratados sólo con anti-TRAIL-R2 [185]. Además, el uso
combinado de Bortezomib y Mapatumumb en pacientes de mieloma
múltiple está actualmente en Phase II de ensayos clínicos. TABLA.
TRAIL e inhibidores de histonas deacetilasas: los inhibidores de histonas
deacetilasas incluyen una serie de compuestos que inducen parada del ciclo
Introducción
50
celular, diferenciación y apoptosis en células tumorales y además pueden
sensibilizar a la apoptosis inducida por TRAIL [186] [187]. Recientes
estudios in vivo han mostrado que la combinación de un anticuerpo
monoclonal contra el receptor de TRAIL en ratones y el inhibidor de
histonas deacetilasas Vorinostat, induce regresión de un tumor de mama en
ausencia de toxicidad sistémica en el ratón [188].
TRAIL y miméticos de Smac: los miméticos de Smac tienen como diana a
los inhibidores de caspasas XIAP, c-IAP1 y c-IAP2 y han mostrado tener una
potente actividad antitumoral tanto in vitro como in vivo [189]. Tratamientos
que combinan TRAIL con miméticos de Smac provocan la erradicación de
tumores pancreáticos en ratón [190]. Además, tanto Mapatumumab como
Lexatumumab sinergizan con miméticos de Smac para inducir apoptosis en
células de cancer de ovarios in vitro [191].
TRAIL e inhibidores de PI3K/AKT: dada la importancia de la ruta en la
proliferación celular, su inhibición ha sido foco de estudio en la terapia
antitumoral. Así, se ha descrito que inhibidores de los receptores tirosin-
quinasa como gefitinib o inhibidores específicos de la ruta de mTOR (una de
las principales dianas de la ruta de PI3K/AKT) como rapamicina,
sensibilizan a la apoptosis inducida por TRAIL [192] [193] [194]. Aunque por
ahora no existen datos clínicos, el diseño y desarrollo de inhibidores de la
ruta PI3K/AKT/mTOR constituye un campo de investigación muy atractivo
en terapia antitumoral [195].
TRAIL e inhibidores de NF-kB: se ha descrito que la inhibición de NF-kB
a través del uso de de inhibidores de la quinasa IkB como AS602868 y
BMS3455541, sensibiliza a la apoptosis inducida por TRAIL [196, 197] [198]
por lo que podría convertirse en otra estrategia para el tratamiento del
cáncer, aunque aún se requieren más estudios.
Introducción
51
6. FLIP.
Como se ha comentado anteriormente, la apoptosis es un proceso
fundamental en el mantenimiento de la homeostasis en organismos
multicelulares. Debido a que, en principio, todas las células poseen la
maquinaria necesaria para la ejecución de la apoptosis, deben existir
mecanismos que prevengan la inducción accidental de esta. Por ello, las
células poseen una amplia variedad de proteínas antiapoptóticas como, por
ejemplo, las pertenecientes a la familia de Bcl-2 y los IAPs. Además, la
apoptosis inducida por receptores de muerte está inhibida por la proteína
antiapoptótica cFLIP (FLICE- inhibitory protein) [199] Diversos estudios
sugieren que alteraciones en la expresión de cFLIP pueden estar
relacionadas con cáncer, alteraciones autoinmunes y enfermedes
cardiovasculares [200] [201] [202].
6.1 Estructura molecular de FLIP.
FLIP se identificó originalmente como producto de un gen viral
durante la búsqueda de proteínas con dominios DED que pudiesen
interactuar con las caspasas. FLIP viral (vFLIPS) fue caracterizado en γ-
herpesvirus y moluscipoxvirus [203] [204] [205]. Las proteínas virales de
FLIP contienen dos DED y pertenecen a la familia de proteínas con DED que
incluye a FADD, caspasa-8, caspasa-10 y PEA-15 (phosphoprotein enriched
in astrocytes 15kDa). Su extremo c-terminal puede variar en longitud y
secuencia.
Posteriormente la proteína homóloga en mamiferos fue caracterizada
y nombrada cFLIP [206] aunque también es conocida como CFLAR, CASH,
CLARP, Casper, FLAME1, I-FLICE, MRIT o Usurpina [207] [204] [208] [209]
[210] [211]. Aunque se han identificado hasta 13 isoformas diferentes de
ARNm generadas por splicing alternativo [212], sólo se han detectado tres a
Introducción
52
nivel de proteína, que son cFLIPL de 55 kDa, cFLIPS de 26 kDa y la isoforma
aislada de la línea celular Raji, cFLIPR de 24 kDa [213].
cFLIPL tiene una estructura similar a la caspasa-8 con dos DED en el
extremo amino-terminal y un dominio de actividad proteasa en le extermo c-
terminal, aunque pierde el residuo de cisteína esencial para la actividad
catalítica del motivo Q-A-C-X-G (ya que presenta Q-N-Y-V-V) y el de
histidina del motivo H-G, ambos presente en todas las caspasas [214].
Interesantemente, el gen de cFLIP se localiza en el cromosoma 2 en la región
q33-q34, donde también se localizan los genes de la caspasa-8 y -10 por lo
que es posible que cFLIP provenga de un fenómeno de duplicación del gen
de la caspasa-8 [215].
c-FLIPS sólo contiene los DED y es similar en estructura a los vFLIPS, a
excepción de que cFLIPS contiene una cola de unos veinte aminoácidos tras
los DED que son cruciales para su ubiquitinación y degradación por el
proteasoma (K192 y K195). Estos aminoácidos no están presentes en cFLIPL,
lo que sugiere la existencia de diferentes mecanismos regulatorios [216] .
cFLIPR fue clonado inicialmente por Djerbi et al (2001) y se ha
demostrado su expresión en varias líneas celulares linfocitarias y en células
T primarias [213]. En estructura, cFLIPR es similar a cFLIPS con dos DED
aunque pierde la cola adicional c-terminal. Ambos tienen una vida media
corta, se reclutan de forma similar al DISC de los receptores de muerte con
actividad antiapoptótica comparable, se expresan de forma similar durante
la activación de las células T primarias y ambos se inducen fuertemente
durante la coestimulación de las célula T con CD3/CD28 [213]. La expresión
de cFLIPS y cFLIPR depende del tipo celular pudiendose expresar sólo una
de las dos isoformas o ambas al mismo tiempo. Recientemente se ha descrito
que la expresión de uno u otro viene determinada por el polimorfismo de un
Introducción
53
sólo nucleótido en el sitio 3´ de la región del splicing del intrón 6. La
presencia de una alanina en lugar de una guanina determina la expresión
preferente de cFLIPR. Además podría ser que la expresión de cFLIPR esté
asociada con el desarrollo de linfomas [217].
6.2 Regulación de la expresión de cFLIP .
6.2.1 Regulación de la sínteis de cFLIP.
cFLIP se expresa constitutivamente en diferentes tipos de células
normales como miocitos cardíacos [218], células endoteliales [219],
queranocitos [220, células β pancreáticas {Maedler, 2002 #238], células
dendríticas [221], células madre hematopoyéticas CD34+ [222] (kim et al
2002) y espermatocitos [223]. Además, se ha encontrado una elevada
expresión de cFLIP en células tumorales que, a menudo, suelen ser
resistentes a la apoptosis inducida por receptores de muerte. Entre estas se
incluyen células de carcinoma colorectal [224] [225] [226] [227], carcinoma
Figura 16 . Estructura molecular de vFLIP y cFLIP. Adaptado de Ralph C. Budd et al. Nat. Rev. 2006.
Introducción
54
gástrico [228] [229] [230], carcinoma pancreático [231] [232], linfoma de
Hodgkin [233] [234], leucemias [235], melanoma [206] [236], carcinoma de
ovario [237] [238] [239] y carcinoma de próstata [240].
Se ha descrito que la expresión de cFLIP puede estar regulada por
diferentes vías de señalización que parecen depender del tipo celular. Así, la
vía de señalización de MAPKs/ERK aumenta los niveles de cFLIP, a través
de CREB, en células T [241]. En células de la microglía tratadas con TGF-β,
también se observa un aumento de cFLIP que se puede suprimir por la
inhibición de la ruta de las MAPKs/ERK [242]. En hepatocitos estimulados
con acido biliares y en células de musculatura lisa vascular estimuladas con
Notch3 también aumenta la expresión de cFLIP a través de la ruta de
MAPKs/ERK [243] [244].
La ruta de señalización de PI3K/AKT parece estar implicada en el
mantenimiento de los niveles de expresión de cFLIP en células tumorales, ya
que la inhibición de la ruta provoca una bajada en los niveles de cFLIP [245]
[229]. El factor de transcripción Foxo3A estaría implicado en dicha
regulación. La fosforilación de AKT por PI3K, provocaría, a su vez, la
fosforilación de FoxoA y su localización citoplasmática, impidiendo su
función represora de la trascripción de cFLIP en el núcleo [246]. Factores de
crecimiento como IGF-1 y VEGF (Vascular Endotelial Growth Factor), al
igual que la activación de Notch-1, incrementan los niveles de cFLIP a través
de AKT [247] [248] [249]. En la señalización mediada por receptores de
andrógenos el aumento en los niveles de expresión de cFLIP se ha asociado a
la ruta PI3K/AKT y al factor de transcripción Foxo3A [250] [251] [252] [253].
La expresión de cFLIP también puede aumentar por la activación de
NF-kB por tratamientos como TNF, IL-1, LPS y tras la activación de células
T con anticuerpos específicos CD3 y CD28, o con ésteres de forbol o
ionomicia [254] [255].
Introducción
55
La proteína quinasa C-δ (PKC-δ) puede inducir el aumento de
expresión de cFLIP células de cancer de colon, en un mecanismo que
también implica a NF-kB [256].
Otros factores de transcripción como los pertenecientes a la famalia de
los NFAT (nuclear factor of activated T cells) también pueden aumentar los
niveles de ARNm de cFLIP. De hecho se ha demostrado la unión de NFATc2
al promotor de cFLIP [257] [258]. En queranocitos, p63, un factor de
trascripción miembro de la familia de p53, regula los niveles de expresión de
cFLIP aumentando su transcripción [259]. De igual forma ocurre con p53 en
células DLD-1 [260].
Pero la expresión de cFLIP también pude estar regulada
negativamente a nivel trascripcional. Así, el factor de transcripción cMYC,
disminuye los niveles de cFLIP mediante represión directa del promotor
[261] y cFos/cJun reprimen la expresión de cFLIP tras activación de cFos por
el tratamiento de celulas de próstata de cáncer con el inhibidor del
proteasoma MG132 [262]. La estabilidad del ARNm de cFLIP puede estar
regulada por diferentes proteínas, así la inhibición de la señalización del IFN
regulatory factor 8 (IFR8) aumenta la estabilidad del ARNm de cFLIP en
células STS (Soft Tissue Sarcoma) [263], E2F1 disminuye los niveles de
ARNm de FLIPS específicamente en células de adenocarcinoma de pulmón
[264] y la inhibición de mTOR por rapamicina disminuye la expresión de
cFLIPS por inhibir su traducción a proteína [193].
6.2.2 Regulación de la degradación de cFLIP.
Aunque la importancia de la regulación de la expresión de proteínas
implicadas en apoptosis se ha demostrado en numerosos estudios, las
modificaciones pos-traduccionales como la fosforilación y la ubiquitinación
han emergido como importantes reguladores de la transducción de señales
Introducción
56
apoptóticas. En este sentido se ha demostrado que cFLIP puede ser
fosforilado y ubiquitinado para inducir su degradación por el proteasoma,
principalmente. Así se ha descrito que la proteina quinasa C es capaz de
fosforiliar a cFLIP y esta fosforilación es la encargada de señalizar para la
ubiquitinación y degradación de cFLIPS por el proteasoma [216] [265]. ATM
quinasa es otra proteína quinasa que induce la degradación de cFLIP en
células linfoides, aunque el mecanismo no es conocido [266]. La inhibición
de otra proteína quinasa como es la Casein-quinasa 2, induce un aumento en
la degradación de cFLIP que determina la sensiblidad de células de
carcinoma endometrial a la apoptosis inducida por receptores de muerte
[267]. La degradación proteasomal de cFLIP, además, puede ser inducida
bajo diferentes condiciones como, por ejemplo, tras la generación de especies
reactivas de oxigeno [268], por la activación de p53 tras el tratamiento con
agentes quimioterapeúticos [269] [270] [271], por infección viral [272] o
incluso durante las diferentes fases del ciclo celular [273].
La degradación proteasomal de las proteinas es el principal mecanismo
citosólico de recambio de proteínas. En este proceso participan una serie de
enzimas conjugadoras de ubiqutina denominadas E1, E2 y E3 que, en última
instancia, marcarán con ubiqutina la proteina a degradar. La degración de
las proteínas via el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS-ubiqutin
proteasoma system) tiene vital importancia en procesos celulares como por
ejemplo la regulación del ciclo celular, la inflamación, el control de calidad
de proteínas y la apoptosis (Figura 17). Dado que cFLIP es una proteína
reguladora de la apoptosis inducida por receptores de muerte,
recientemente están emergiendo estudios sobre las proteínas E3-ubiquitin
ligasas que tiene a cFLIP como proteína diana. La primera en describirse fue
la E3-ubiquitin ligasa ITCH, que es capaz de ubiquitinar a cFLIPL en
hepatocitos tratados con TNF [116]. ITCH también puede promover la
Introducción
57
degradación, tanto cFLIPL como de cFLIPS, en células de cáncer de ovario
tratadas con cisplatino, en un mecanismo que implica a la proteína p53 [274]
y que parece estar regulado por AKT [275]. El estado de activación de AKT,
determinado por PTEN, también parece estar implicado en la ubiquitinación
de cFLIPS por la E3-ubiquitin ligasa AIP4 (Atrophin-interacting protein 4) en
células de glioblastoma. Otra E3-ubiquitin ligasa específicia de cFLIPS es c-
Cbl. La interacción entre ambas proteínas se produce tras la fosforilación de
cFLIPS por un mecanismo activado por TNF en macrófagos y que incluye a
las proteínas SK1, p38 y c-Abl [276]. La E3-ubiquitin ligasa Mind-Bom es
capaz de unirse tanto a cFLIPL como a cFLIPS aunque esta interacción no
parece que induzca su degradación, pero si afecta a su actividad
antiapoptótica ya que impide que se una caspasa-8 [277]. Otra proteína con
actividad E3-ubiquitin ligasa capaz de asociarse a cFLIP es TRAF2, aunque
no se ha demostrado que induzca su degradación proteasomal [278].
6.3 Funciones de cFLIP.
6.3.1 Inhibición de la apoptosis inducida por receptores de muerte.
El papel que cFLIP juega como inhibidor de la apoptosis inducida por
receptores de muerte está bien documentado y todas las isoformas descritas
de FLIP (vFLIP, FLPL, FLIPS, FLIPR) protegen de la apoptosis inducida por
diferentes receptores de muerte, incluyendo CD95, TRAIL-R1, TRAIL-R2 y
Figura 17. Sistema de degradación de proteínas mediado por el proteasoma (UPS). Las enzimas conjugadoras de ubiquitina E1, E2 y E3, transfieren moléculas de ubiquitina al sustrato, que ubiquitinado es reconocido por el proteasoma para su degradación.
Introducción
58
TNFR-1 [207] [206] [204] [211] [209]. El mecanismo de inhibición es el
siguiente: tras la unión del ligando de muerte a su receptor se induce la
formación del DISC, como se ha comentado anteriormente, que dará lugar a
la activación de la caspasa-8. Mediante sus DED, cFLIP puede competir con
la caspasa-8 por su unión a FADD en el DISC, impidiendo así la formación
de homodímeros de caspasa-8 necesarios para su activación. La función de
cFLIPS y cFLIPR como proteínas inhibidoras de la activación de caspasa-8 en
el DISC está bien establecida [206] [279] [213], sin embargo, la función de
cFLIPL es mucho más compleja, porque además de inhibir la activación de la
caspasa-8 en el DISC, cFLIPL puede activarla[280, 281] [282] [283]. La
formación de heterodímeros caspasa-8/cFLIPL, provoca una cierta
activación de caspasa-8 por proximidad entre ambas moléculas que, aunque
es insuficiente para la señalización de apoptosis, permite que cFLIP se corte
(por lo que cFLIP se convierte en activador y sustrato de caspasa-8 en el
DISC), generando un fragmento p43, al que se le pueden unir moléculas
implicadas en la activación de NF-kB, como se comenta más adelante. Parece
ser que los niveles de cFLIP son determinantes en la señalización apoptótica
o no apoptótica que se puede derivar de la activación de los receptores de
muerte. Así, en ausencia de cFLIP, la caspasa-8 puede ser completamente
activada y ejercer su función apoptótica. Sin embargo, si la expresión de
cFLIPL es elevada, se podría seguir activando caspasa-8, pero no
completamente por lo que no podría señalizar para apoptosis pero si para
otras rutas no apoptóticas (Figura 18). Al igual que ocurre con la caspasa-8,
se ha descrito que cFLIPL puede activar a caspasa-10 en el DISC [282].
Introducción
59
El reclutamiento de cFLIP al DISC pude estar regulado por diferentes
mecanismos. Así se ha descrito que la fosforilación de cFLIPL por CaMK II
(quiinasa Calmodulina dependiente de Ca2+), promueve su reclutamiento al
DISC [284]. También parece que la proteína chaperona Hsp90 participa en el
reclutamiento de FLIPS al DISC [285].
6.3.2 Proliferación celular. Activación de células T.
La primera vez que se observó que cFLIP podría participar en
procesos no apoptóticos fue durante el estudio de la activación de células T,
a través del TCR, por co-estimulación de CD3 y Fas [286]. Células Jurkat T
que sobrepresaban cFLIPL producían una mayor cantidad de interleuquina-
2 que las células normales tras la activación. Esto se debía a que en las
Figura 18. cFLIP modula la activación de caspasa-8 y NF-kB. Adaptada de Ralph C. Budd et al. Nat. Rev. 2006.
Introducción
60
células que sobrexpresaban cFLIPL había una mayor activación de las rutas
de NF-kB y ERK. Al igual que caspasa-8 y caspasa-10, cFLIPL tiene un
residuo aspártico conservado (Asp376) que forma parte del motivo de corte
por caspasa-8. Tras la formación de heterodímeros de caspasa-8/FLIPL en el
DISC, se produce un corte en este residuo de cFLIPL que provoca la
liberación de un fragmento p10 (10kDa) y genera otro de 43kDa (p43FLIPL).
El fragmento p43 de cFLIPL puede reclutar proteínas señalizadoras como
TRAF2 y RIP1 lo que dará lugar a la activación de la ruta de NF-kB [287]
[288]. FLIPS no puede reclutar a estas proteínas y se sugiere que podría
inhibir la señalización para NF-kB [287]. Sin embargo, posteriormente se
describió otro posible mecanismo de activación de NF-kB por cFLIP que
incluiría también a cFLIPS. Para ello se requiere la formación de un
heterodímero caspasa-8/FLIP, que en principio no se localizaría en el DISC
puesto que sería independiente de la activación de receptores de muerte, en
el que cFLIP es cortado por caspasa-8 en el dominio N-terminal,
concretamente en el residuo Asp198, que está presente en ambas isoformas,
generando un fragmento de 22kDa (p22). p22FLIP es capaz de inhibir el
corte y activación de caspasa-8 en el DISC, pero también es un potente
activador de la ruta NF-kB por interaccionar físicamente con la subunidad
reguladora NEMO (IKKγ) y participa en la proliferación de células T tras la
activación del TCR. p22FLIP también se puede generar a partir de p43FLIP,
lo que sugiere que este fragmento aún necesita de más proteolisis para la
activación de NF-kB [213]. Sin embargo, esto ha generado controversia ya
que p43FLIP es capaz de activar NF-kB aún en presencia de inhibidores de
caspasas como zVAD-fmk, por lo que, en principio no serían necesarios más
procesos de proteolisis para la activación de NF-kB, aunque ésta es menor en
presencia del inhibidor [287] [213].
Introducción
61
Como se ha comentado anteriormente, cFLIP también es capaz de
activar la ruta de ERK durante la activación de células T, mediante la
interacción con RAf-1 [287]. También, cFLIP puede jugar un papel muy
importante en la activación de ERK tras la estimulación con TNF, en algunos
tipos celulares [289]. En este sistema sólo FLIPS y p43FLIP son capaces de
activar a ERK, y además se requiere de la presencia de FADD y caspasa-8.
6.3.3 Adhesión y Migración celular.
Se ha descrito que cFLIP puede promover la movilidad de células
HeLa a través de la activación de FAK (focal adhesion kinase) y ERK,
además de por aumentar la expresión de la Metaloproteasa-9 (MMP-9,
matriz metalloproteinase-9) [290]. Aunque el mecanismo de activación de
FAK y ERK por cFLIP no está determinada, es posible que la caspasa-8
también esté implicada. El hecho de que cFLIP y caspasa-8 puedan estar
implicados en la migración de células tumorales y fibroblastos, es
consistente con los datos que muestran que CD95 puede inducir procesos de
migración e invasión en células tumorales resistentes a la apoptosis [126].
6.3.4 Fenotipo del ratón deficiente en cFLIP.
La deficiencia en ambos alelos de cFLIP es letal al dia 10.5 del
desarrollo embrionario del ratón. Además, estos ratones presentan defectos
en el desarrollo cardíaco debido, al parecer, a un endotelio vascular
deficiente [291]. Este fenotipo coincide con los ratones nulos para caspasa-8
y FADD, lo que sugiere que estas tres proteínas participan en la misma ruta
durante el desarrollo (al menos durante el desarrollo cardíaco). Para poder
realizar estudios de la falta de función en células T, se han generado dos
tipos de ratones deficientes de cFLIP condicionales. Unos tienen una
deficiencia condicional de cFLIP en el compartimento ce células T llamados
tFLIP-/-. Los segundos se han generado por complementación de blastocitos
Introducción
62
deficientes en Rag1 (recombination activating gen 1) con células madre
embrionarias deficientes en cFLIP, llamados blastFLIP-deficientes. En
general presentan una reducción del número de células T periféricas y de
proliferación después de la activación del TCR. También manifiestan una
disminución en la supervivencia tanto espontánea como después de la
estimulación del T CR [291].
6.3.5 Regulación de la autofagia.
Muy recientemente se ha descrito un novedoso papel de cFLIP en la
regulación de la autofagia inducida por rapamicina o privación de
nutrientes [292]. En el estudio se detalla como cFLIP puede interaccionar
físicamente con la proteína Atg-3 implicada en la maduración de los
autofagosmas, impidiendo así su función. En condiciones normales, en una
célula habría un equilibrio entre moléculas de Atg-3 unidas a cFLIP y
moléculas de Atg-3 unidas a LC-3 formando parte del proceso de
maduración del autofagosoma con lo que habría unos niveles basales de
autofagia. Tras un estímulo de inducción de autofagia, como el tratamiento
con rapamicina o la privación de nutrientes, cFLIP sería desplazado por
moléculas de LC3 de su unión a ATG-3 induciendose un aumento en la
autofagia. La sobreexpresión de cFLIP impide la unión LC3 a ATG3,
inhibiendo así la autofagia y también la muerte celular que se deriva de ella.
La regulación de la autofagia por otras proteínas con DED como FADD y
caspasa-8 ha sido descrita anteriormente [293] [294] [295] [296].
6.3.6 FLIP y cáncer.
La expresión de cFLIP es uno de los principales determinantes de la
resistencia a la apoptosis inducida por ligandos de muerte como FasL y
TRAIL y existen numeros estudios que han mostrado que la bajada de
expresión de cFLIP sensibiliza a varios tipos de células tumorales resistentes
Introducción
63
[224] [229] [232] [233] [234] [236] [238] [239] [261] [222]. Por el contrario, la
sobrexpresión de cFLIP confiere resistencia a la apoptosis inducida por Fas o
TRAIL. Estos datos apuntan a que cFLIP puede ser un atractiva diana
terapeutica antitumoral. Hasta la fecha se han descrito muchos tipos de
tratamientos que son capaces de disminuir la expresión de cFLIP y por ello
sensibilizar a las células tumorales a la apoptosis mediada por receptores de
muerte. En estas se incluyen agentes que dañan al DNA (cisplatino y
doxorrubicina), inhibidores de la síntesis de proteína (actinomicina D y
cichoheximida), e inhibidores de histonas deacetilasas (Trichostatin A y
Vorinostat) [297] [188]. Además, inhibidores de algunas proteínas quinasas
como MEK1/2, PKC, y PI3K, también disminuyen los niveles de expresión
de cFLIP por afectar a su ruta de síntesis. Si consideramos que la elevada
expresión de cFLIP en las células tumorales es la causa de la resistencia a
TRAIL, la combinación de algunos de estos agentes con TRAIL puede ser
una atractiva estrategia terapeutica para la eliminación de dichas celulas
tumorales. El desarrollo de pequeñas moléculas inhibidoras de proteínas
antiapoptóticas como por ejemplo Bcl-2 o IAP se encuentra en ensayos
clínicos. Estos inhibidores están diseñados en base a la estructura
cristalográfica de la proteína diana. La reciente descripción de la estructura
cristalográfica de FLIP viral MC159 puede ayudar al desarrollo de
inhibidores específicos dirigidos contra cFLIP. El desarrollo de estos
inhibidores junto con el uso de oligos antisentido dirigidos específicamente
contra cFLIP puede ser uno de los nuevos campos de investigación en
terapia antitumoral. De hecho recientemente se ha descrito que el
silenciamiento de cFLIP mediante oligos antisentido disminuye el tamaño de
tumores in vivo en un modelo de injerto de células tumorales de mama MCF-
7 [298].
Introducción
64
7. Desarrollo morfogenético del epitelio glandular de mama.
En el epitelio glandular se coordina la polaridad de las células
individuales, en espacio y tiempo, con respecto a las células vecinas y la
matriz extracelular (MEC) para dar lugar a organizadas estructuras
tridimensionales que formarán los tejidos y órganos, tales como la
glandalula mamaria, riñón, pulmón, etc. Uno de los eventos clave en este
proceso, denominado morfogénesis, es la distribución asimétrica de las
superficies de la membrana celular. Así se distingue una superficie basal, o
membrana basal, que está en contacto con la matriz extracelular, superficies
laterales que mantienen el contacto con otras células y una superficie apical,
que rodea a un espacio libre denominado lumen, al que se vierten las
secreciones celulares como, por ejemplo, la leche en la glándula mamaria
[299]. Se han descrito dos principales mecanismos de formación de espacios
luminales a partir de células no polarizadas que son la cavitación y el
“hollowing” aunque en algunos modelos se pude producir una mezcla de
ambos [300]. En el proceso de cavitación el lumen se forma por la muerte
apoptótica de las células interiores por la pérdida de adhesión al sustrato, en
este caso la matriz extracelular, proceso que se conoce como anoikis.
Aunque la apoptosis parece ser el principal mecanismo de muerte de estas
células, no se descartan otros mecanismos de muerte celular independientes
de caspasas, ya que la inhibición de la apoptosis no boloquea sino que
retrasa la formación del lumen [301] [302]. En el hollowing, el lumen se
forma por una redistribución de las células interiores que incluye procesos
de separación de membranas y/o repulsión celular. Defectos en la polaridad
celular y en la correcta formación del lumen están asociados con importante
enfermedades humanas tales como el cáncer [299].
La mayoría de los cánceres humanos provienen de células y tejidos
epiteliales. El estudio histológico de tumores primarios humanos y de
Introducción
65
modelos de tumores en ratón han sido cruciales para el entendimiento del
desarrollo del cáncer, sin embrago, resulta muy complicado hacer estudios
bioquímicos y de procesos celulares a partir de ellos. Por eso, los modelos de
cultivos celulares son más apropiados para estudiar las rutas de señalización
implicadas en la trasformación oncogénica. Tales estudios se han realizado
utilizando cultivos de células en monocapa, principalmente, o mediante
ensayos de soft-agar, ninguno de los cuales se asemeja a la organización
estructural o a la diferenciación funcional del epitelio glandular in vivo [303]
[304]. Los sistemas de cultivos tridimensionales (3D) de células epiteliales,
que permiten que las células se reorganicen en estructuras similares a las
que forman in vivo, han emergido como modelos de estudio de las funciones
y rutas de los genes tumorales en un contexto biológico más relevante.
Figura 19. Morfogénesis de los acinos de celulas epiteliales de mama en cultivos 3D. Durante los primeros dias del cultivo tridimensional, tiene lugar una polarización apicobasal. Entre los dias 5 y 8 se distinguen dos poblaciones de células: una situada en el exterior de la estructura acinar y que está en contacto con la matriz extracelular, y otra en el interior del acino que han perdido el contacto con la matriz extracelular.Durante el proceso de morfogéneis, la capa externa de células se mantie polarizada con respecto al centro del acino. Se pueden observa distintas señales dicotómicas entre las dos poblaciones y se activan señales de supervivencia mediada por AKT en las células de la capa externa. A partir del dia 8 las células del centro del acino empiezan a sufrir muerte celular apoptótica caracterizada por un incremento en la actividad caspasa-3. Esta muerte celular contribuye al vaciamiento del acino y a la formación del lumen. Adaptado de Debnath and Brugge Nat. Rev. 2005).
Introducción
66
Bajo las condiciones de cultivo 3D, las células normales epiteliales
proliferan y se organizan formando estructuras esféricas denominadas
comúnmente acinos (Figura 19). Éstos se caracterizan por tener un lumen
central rodeado de una capa de células polarizadas, poseer un preciso
control del crecimiento y la proliferación celular y por el establecimiento de
una membrana basal[305] [306] [307]. Estas características, junto con la
posibilidad de manipulación experimental, así como la facilidad de un
estudio microscópico detallado y análisis bioquímico, diferencian a estos
sistemas de cultivos 3D de los cultivos celulares convencionales en
monocapa (2D) o incluso modelos animales. Existen dos métodos
principales para generar estructuras acinares. En el primero, las células son
introducidas y cubiertas completamente en una capa de matriz extracelular
a la que posteriormente se le añade medio de cultivo complementado con
factores de crecimiento y hormonas necesarias para la superviviencia
celular. En el segundo, las células son sembradas sobre una capa de matriz
extracelular, añadiendoles de igual foma medio de cultivo. La elección de la
matriz extracelular óptima para los cultivos en 3D, depende del tipo celular,
así las células epiteliales de riñón de perro Madin-Darby (MDCK) se
desarrollan correctamente en estructuras tridimesionales con un lumen
central formado por hollowing cuando crecen embebidas en matriz
extracelular que contiene colágeno [308]. Otras células epiteliales, como por
ejemplo la linea epitelial de mama inmortalizada no transformada MCF-
10A, forma estructuras acinares cuando crecen en una matriz extracelular
derivada de los tumores Engelbreth-Holm-Swarm (ESH), comercializado
como MATRIGEL [309] [303].
Los cultivos 3D han permitido abordar importantes cuestiones con
respecto a la arquitectura de epitelios normales frente a los tumorales, como
por ejemplo, cuales son los mecanismos y vías de señalización implicados
Introducción
67
en la correcta organización estructural de los epitelios y si la disrupción de
estas vías influye en la progresión tumoral. Con respecto al cáncer de mama,
se conoce que la sobrexpresión de oncogenes puede dar lugar a fenotipos
morfológicos en células epiteliales cultivadas en 3D que son similares a las
características histológicas que presentan los tumores in vivo, como por
ejemplo el relleno del lumen con células, fenómeno que ocurre tras la
sobrexpresión de ERBB2 [310]. Pero además de un aumento en la
proliferación inducida por la sobreexpresión de oncogenes debe producirse
una inhibición de la muerte celular para que se inhiba la formación del
lumen [303]. En acinos de células epiteliales de mama MCF-10A, el lumen se
forma por un fenómeno de cavitación, en el que las células del interior del
acino mueren por la apoptosis inducida por anoikis o pérdida de adhesión a
la matriz extracelular [301] [303]. En esta apoptosis, la proteína
proapoptótica “solo BH3” de la familia de Bcl-2, Bim parece jugar un papel
fundamental ya que la bajada de su expresión por RNA de interferencia
provoca que el lumen no se vacíe correctamente [311] [90]. También se ha
descrito un papel fundamental de Bim en la formación del lumen durante el
desarrollo de la glándula mamaria en ratones [302]. Además de Bim, otra
proteína pro-apoptótica de la familia de Bcl-2 como es Bmf también ha sido
implicada en el proceso de anoikis durante la morfogénesis de células MCF-
10 en ensayos en 3D [312] y durante la involución de la glándula mamaria en
ratones tras la lactancia [302]. Pero como se comentó anteriormente, la
inhibición de la apoptosis durante la morfogénesis de células MCF-10A en
cultivos en 3D, no inhibe la formación de lumen, sólo la retrasa, por lo que
otros mecanismos de muerte deben estar implicados [301] (Figura 20). Así,
parece que un proceso de muerte celular con autofagia inducido por TRAIL
tendría un papel en la morfogénesis [164]. Estudios más recientes indican
que además de apoptosis, otro de los procesos que se inducen tras pérdida
Introducción
68
de adhesión al sustrato es autofagia. Sin embargo, durante la morfogénesis,
la autofagia inducida por la pérdida de contacto con la matriz extracelular
tendría un papel citoprotector, ya que su inhibición, mediante RNA de
interferencia de proteínas necesaria para la autofagia como Atg-5 o Atg-7,
provoca una mayor rapidez en la formación del lumen [313].
Como se ha comentado anteriormente, la sobreexpresión del oncogen
ERBB2 provoca defectos en la correcta formación del lumen por inducir un
aumento en la proliferación celular y por inhibir la apoptosis. Recientemente
se ha descrito que la inhibición de la apoptosis por la sobreexpresión de
ERBB2 viene determinada por la pérdida de polaridad que sufren estas
células [314]. Por lo que la polarización de las células durante el proceso de
Figura 20. Formación y manteniendo del lumen en acinos epiteliles in Vitro. La figura muestra algunas condicones en las cuales el proceso de formación del lumen está alterado por oncogenes. Además se indican las moléculas implicadas en el proceso.En verde se muestran las proteínas que permiten el vaciamiento del acino y en rojo las que impiden la correcta formación del lumen. Para más detalles consultar el texto. Adpatado de Debnath and Brugge, Nat. Rev. 2005)
Introducción
69
morfogénesis es otro factor determinante en el correcto desarrollo de la
formación del lumen. Además, ERBB2 también puede participar en la
recuperación de los niveles de ATP, que disminuyen drásticamente durante
el proceso de anoikis, lo que permite una mayor supervivencia celular [315].
70
IV. OBJETIVOS
Objetivos
71
OBJETIVOS.
La apoptosis desempeña un papel fundamental en muchos procesos
fisiológicos, desde el desarrollo embrionario hasta el mantenimiento de la
homeostasis de los tejidos en el adulto. Asimismo, la apoptosis también está
implicada en una variedad de situaciones patológicas, entre las que
podemos destacar el cáncer, enfermedades neurodegenerativas,
enfermedades autoinmunes, etc. El mal funcionamiento de los mecanismos
de inducción y regulación de apoptosis contribuye en gran medida a la
transformación neoplásica. Por otra parte, la apoptosis también está presente
en el tratamiento del cáncer, ya que la mayoría de los tratamientos inducen
apoptosis directa o indirectamente.
El descubrimiento del ligando de muerte TRAIL (TNF-Related Apoptosis-
Inducing Ligand), capaz de inducir apoptosis en células tumorales sin
afectar a células no transformadas lo convierte en un agente con potencial
terapéutico. Sin embargo, se ha descrito que muchas células tumorales son
resistentes a dicho ligando de muerte, sobre todo células tumorales de
mama. El estudio de los mecanismos responsables de esta resistencia ha sido
objeto de estudio. En concreto, los objetivos de esta tesis han sido los
siguientes:
1. Estudio de la implicación de la proteína antiapoptótica cFLIP en el
mecanismo de resistencia de células tumorales de mama a la apoptosis
inducida por TRAIL.
2. Análisis de la función de cFLIP como proteína implicada en la
viabilidad tanto de de células epiteliales de mama no trasformadas como de
células tumorales.
Objetivos
72
3. Estudio de la participación de cFLIP en el proceso de morfogénesis
de células epiteliales de mama.
4. Estudio de la regulación de la expresión de cFLIP.
73
V. MATERIALES Y MÉTODOS.
Materiales y Métodos
74
1. MATERIALES.
Cultivos celulares.
Las lineas celulares humanas de cáncer de mama MCF-7 [316], MCF-7-
Bcl-2 que expresan establemente la proteína BCL-2 [317], MCF-7 E6 que
establemente expresan la proteína E6 del papilomavirus humano[318], se
cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal
bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100µg/ml de estreptomicina y 500 U de
penicilina. Las células MCF-7-Bcl-2 y MCF-7E6 fueron ademas
suplementadas con 0,5mg/ml de Geneticina (G418).
Las líneas celulares humanas tumorales de mama MDA-MB231 [319] y
MDA-MB231-FLIPL, que expresa establemente la proteína FLIPL [320] se
cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal
bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100µg/ml de estreptomicina y 500 U de
penicilina.
Las líneas celulares humanas de cáncer de mama BT474 [321] y MDA-
MB435s [322], se cultivaron en medio DMEM igualmente suplementado con
10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100µg/ml de
estreptomicina y 500 U de penicilina. Las células MDA-MB435s fueron
además suplementadas con 10µg/ml de insulina.
Las células MCF-10A son células epiteliales derivadas de tejido
mamario humana normal (Pauley, Soule et al, 1993) y fueron amablemente
cedidas por el Dr. Mauricio Reginato (Drexel University, Filadelfia, USA). Se
cultivaron en medio DMEM F12 (1:1) suplementado con 5% de suero de
caballo inactivado (HS), 10µg/ml de insulina, 20ng/ml de factor de
crecimiento epidermal (EGF), 10ng/ml de toxina colérica, 500ng/ml de
hidrocortisona, 2mM de L-glutamina 100µg/ml de estreptomicina y 500 U
de penicilina. Las células MCF-10A–FLIPL, MCF-10A-FLIPS, MCF-10A–Bcl2
y MCF-10A–dnFADD se crearon mediante infecciones retrovirales como se
especifica en el apartado correspondiente.
Materiales y Métodos
75
Las células HEK293T, son una línea primaria de células embrionarias
de riñón humano, transformadas con ADN de adenovirus humano tipo 5
(AD5) y nos fueron amablemente cedidas por el Dr. Antonio Rodríguez
(CNIO, Madrid). Se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de
suero fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100µg/ml de estreptomicina
y 500 U de penicilina.
Todas las células fueron mantenidas en un incubador humificado a 37ºC, 5%
de CO2 y 95% de aire.
Reactivos.
Los medios RPMI 1640, DMEM y DMEM F12 (1:1), así como el EGF, la
hidrocortisona, la insulina, el suero bovino fetal (FBS), la L-glutamina y los
antibióticos (penicilina/estreptomicina) se obtuvieron de Sigma- Aldrich (St.
Louis, MO, USA). El suero de caballo se obtuvo de Gibco (Invitrogen,
Eugene, Oregon, USA).
El TRAIL recombinante con cola de histidinas, así como el TRAIL
recombinante biotinilado (TRAIL-b) fueron producidos en nuestro
laboratorio como se describe más adelante. El TRAIL-R2/Fc recombinante
humano se adqurió de R&D Systems.
Doxorrubicina, Rapamicina, Cicloheximida, Wortmanina, LY294002,
LY303511, Nocodazol, Roscovitina, TBB, MG132 e Insulina se obtuvieron de
Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). El Vorinostat (SAHA) se obtuvo de
Selleck Chemicals, USA. El Interferón gamma se obtuvo de Peprotech EC
LTD (London, UK). Flavopiridol fue amablemente cedido por Dr. José
Ramón Suarez (Aventis Pharmaceutical, Bridgewater, NJ). El 17-DMAG fue
obtenido de LC Laboratorios (Woburn, USA). BMS fue otenido de
Calbiochem Novabiochem GMBH (Band Soden, Alemania). La epoxomicina
fue obtenida de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). El inhibidor general de
Materiales y Métodos
76
caspasas benzyloxy-carbonyl-Val-Ala-Asp-(OMe) fluoromethylketone (Z-
VAD-FMK) fue proporcionado por Bachem, AG (Bachem, Bubendorf,
Suiza). Las sondas Taqman para la amplificación de mRNA de cFLIPL y
cFLIPS mediante PCR cuantitativa fueron diseñadas por Applied
Biosystems. La sonda Taqman para la amplificación de mRNA de HPRT
como gen endógeno en la RT-PCR Real time se obtuvo de Applied
Biosystems (Número de catálogo 4331182). La Taqman Universal PCR
Master Mix se obtuvo de Applied Byosistems (Número de catálogo
4304437). Las placas de 96 pocillos para la realización de la PCR en tiempo
real se adquirieron de Sorensan TM y el adhesivo para sellar la placa se
obtuvo de Greiner bio-one (Frickenhausen, Alemania).
Anticuerpos.
El anticuerpo anti-FLIP NF6 se obtuvo de Alexis (San Diego, Ca, USA).
Los anticuepos anti-FADD, anti-Bid, anti-XIAP, anti-ITCH y anti-RIP se
obtuvieron de BD Transduction Laboratorios (New Jersey, USA). Los
anticuerpos anti-Bax, anti-TRAF2, anti-Mcl-1, anti-pERK y anti-GAPDH se
obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Los
anticuerpos anti-pIkB, anti-pJNK, anti-pAKT, anti-p-P70SK6, anti-AKT, anti-
p-sustratos de AKT, anti Cul-3 fueron de Cell Signalling Technology; CA,
USA). Los anticuerpos anti-TRAIL-R2 y anti-TRAIL fueron de R&D Systems
(Mn, USA). El anticuerpo anti-Bcl-2 se obtuvo de DAKO (Glostrup,
Dinamarca). El anticuerpo anti-Tubulina se obtuvo de Sigma-Aldrich (St.
Louis, MO, USA). El anticuerpo anti-Citocromo C se obtuvo de Pharmingen
(San Diego, CA, USA). El anticuerpo anti-Caspasa-8 fue amablemente
cedido por el Dr. Gerald Cohen (Leicester University, UK). El anticuerpo
anti-Actina fue amablemente cedido por el Dr. Mauricio Reginato (Drexel
University, Philadelphia, USA). Los anticuerpos frente a los receptores de
Materiales y Métodos
77
TRAIL utilizados para citometría de flujo (TRAIL-R1 (HS101), TRAIL-R2
(HS201), TRAIL-R3 (HS301) y TRAIL-R4 (HS401)) fueron adquiridos de
Alexis Corp. (San Diego, CA, USA).
Los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (HRP) o con
isotiacinato de fluoresceína (FITC) fueron adquiridos de DAKO (Glostrup,
Dinamarca). El reactivo quimioluminiscente ECL se obtuvo de Millipore
(Billerica, MA, USA).
ARN de interferencia (siRNA).
Los siRNA de interferencia utilizados corresponden a las secuencias
de cDNA humano para las siguientes proteínas y se obtuvieron de Sigma-
Proligo (Woodlans, TX, USA).
cFLIP: 5´-GGGACCUUCUGGAUAUUUUdTdT-3´,
cFLIPL (5´-GAGCAUACCUGAAGAGAGAdTdT-3’),
cFLIPS: 5´-CACCCUAUGCCCAUUGUCCTTdTdT-3´,
Caspasa-8: 5´-GGAGCUGCUCUUCCGAAUUdTdT-3´,
FADD: 5´-GAAGACCUGUGUGCAGCAUdTdT-3´,
TRAIL-R2: 5´-GACCCUUGUGCUCGUUGUCdTdT-3´,
Bid: 5´-GAAGACAUCAUCCGGAAUAdTdT-3´,
ITCH-1: 5´-AAGUGCUUCUCAGAAUGAUGAdTdT-3´,
ITCH-2: 5’-AACCACAACACACGAAUUACAdTdT-3’,
XIAP: 5´-GCUGUAGAUAGAUGGCAAUdTdT-3´,
Cul-3: 5´-GUCGUAGACAGAGGCGCAAdTdT-3´,
RIP: 5´-CCACUAGUCUGACGGAUAAdTdT-3´,
TRAF-2#1: 5´-GUGUCGAGUCCCUUGCAGAdTdT-3´,
TRAF-2#2: 5’-UCUGCAAGGGACUCGACACdTdT-3’
MULE: 5´-GAGUUUGGAGUUUGUGAAG-3´,
siRNA Control (Scrambled): 5’-CUUUGGGUGAUCUACGUUAdTdT-3’
Materiales y Métodos
78
2. METODOLOGÍA.
Cuantificación de la viabilidad celular (Cristal Violeta).
La viabilidad celular se determinó por tinción con cristal violeta
(Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, USA) tal y como lo describen Sanchez et al J.
Biol. Chem. 271: 7416-7422. Resumidamente: 35.0000 células fueron
sembradas en placas de 24 pocillos y tras el tratamiento correspondiente, se
retiró el medio de cultivo y se lavaron tres veces con PBS 1X. A
continuación, las células que quedaban adheridas a la placa se tiñieron con
250 µl de una solución de 0.2% de Cristal violeta en etanol al 2%, durante 20
minutos a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo se lavaron los
pocillos con agua, y una vez secos, se lisaron las células con una solución de
SDS al 1%. La densidad óptica de cada pocillo se midió en el lector de placas
Varioskan Flash (Termo Electrón Corporation) a la longitud de onda de 590
nm.
Cuantificación de apoptosis.
La apoptosis se cuantificó por citometría de flujo mediante la detección
de células hipodiploides. Para ello, se sembraron 3x105 células por pocillo y,
tras el tratamiento correspondiente, se recogieron con Tripsina. Se fijaron y
permeabilizaron con 900 µl de una solución de etanol frío al 70%, agitando
suavemente en el vórtex e incubando 5 minutos en hielo. Después de lavar,
se añadieron 250 µl de Solución de Extracción de ADN (0’2M Na 2HPO4,
0’1M ácido cítrico en PBS; pH 7’8) y se incubaron durante 10 minutos a 37ºC.
A continuación y, tras lavarlas, las células se resuspendieron en 250 µl de
Solución PI/RNasa (100 µg/ml RNasa, 40 µg/ml de Yoduro de Propidio en
PBS) y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC en oscuridad. Las células
apoptóticas se detectaron y cuantificaron en la población del ciclo celular
con menor contenido en ADN que las células el pico G1 (SubG1). La
Materiales y Métodos
79
citometría de flujo fue realizada en un citómetro FACScan, utilizando el
programa Cell Queso Pro (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA)
para el análisis de los datos.
En células tumorales de mama MCF-7 la cuantificación de la apoptosis
se realizó mediante el estudio por citometría de flujo de la externalización de
la fosfatidilserina utilizando la proteína Anexina V-FLUOS (Roche), la cual
se une a este fosfolípido en presencia de Ca2+. Las células se resuspendieron
en un tampón de incubación (Hepes NaOH 10mM pH 7’4, NaCl 140 mM,
CaCl2 5mM) con Anexina V-FLUOS a la concentración indicada por el
fabricante durante 15 minutos a temperatura ambiente. El porcentaje de
células positivas para la externalización de la fosfatifilserina se analizó en el
citómetro de flujo por la cuantificación de células postivas para la tinción
con Anexina V-FLUOS.
Inmunodetección de proteínas por western-blot.
Para el análisis de expresión de proteínas, tras recoger las células, estas
se lavaron una vez en PBS 1X y posteriormente se resuspendieron en
tampón de carga Laemli (Sample buffer, 50mM de Tris-HCl pH 6’8, urea 6M,
2-Mercaptoetanol 6%, SDS 3%, 0’003% de Azul de brofofenol).
Posteriormente se sonicaron e hirvieron las muestras y las proteínas se
separaron mediante electroforesis en un gel de SDS-poliacrilamida, a un
porcentaje del 7,5%, 10% o 12% dependiendo del peso molecular de la
proteína a detectar. Para la preparación del gel se utilizó Lower Buffer (1),
Upper Buffer (2), Acrimalmida, Agua, APS (ammonium persulfate, Sigma-
Aldrich), TEMED (Sigma-Aldrich). La electroforesis se realizó en Running
Buffer (3), a un voltaje constante de 140 voltios durante 1 hora
aproximadamente. Las proteínas de este gel se transfierieron a una
membrana de PVDF (Immobilon, Millipore), previamente tratadas con
Materiales y Métodos
80
metanol y mantenidas en Buffer de Transferencia (4), mediante la técnica de
transferencia semiseca con el sistema Trans-Blot, SD (Bio-Rad) a 50mA
constantes (por gel a transferir) durante una hora, o a 15 voltios constantes
(independientemente del número de geles a transferir) durante 30 minutos.
La membrana se bloqueó con una solución PBS 0’1% Tween 20 (PBS/Tween)
con 5% de leche en polvo durante una hora a temperatura ambiente.
Posteriormente se lavó la membrana con PBS-Tween y se incubó con el
anticuerpo correspondiente durante 1 hora a temperatura ambiente, o a 4ºC
durante toda la noche en agitación. Tras la incubación con el anticuerpo, se
lavó la membrana 3 veces con PBS-Tween durante cinco minutos cada
lavado, y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con una solución
PBS-Tween 5% de leche en polvo y el anticuerpo secundario
correspondiente, que lleva acoplado la peroxidasa del rábano picante (HRP).
De nuevo se hiceron tres lavados de cinco minutos cada uno con PBS-Tween
y se incubó la membrana con el reactivo ECL (Millipore) durante cinco
minutos, tras lo cual se reveló mediante quimioluminiscencia.
Para el análisis de muestras tras la medida de concentración de
proteínas, las células se lisaron con tampón de lisis (250mM Tris-Hcl pH 7’5,
5mM EDTA, 5nM EGTA, 5% Tritón X-100, 50mM Na-β-glicerofosfato,
250mM NaF, 5mM ortovanadato sódico, 25mM NaPPi, 27mM Sacarosa, 1X
inhibidores de proteasas) y se recogieron con un raspador. Se dejaron 30
minutos en hielo y se centrifugaron a 4ºC durante 10 minutos a 13.000 rmp.
Se recogió el sobrenadante y se le calculó la concentración de proteínas. A la
misma cantidad de proteína se le añadió el volumen correspondiente de
tampón de carga Laemli. Las proteínas se separaron mediante electroforesis
en gel SDS-poliacrilamida como se ha comentado anteriormente.
Bufferes utilizados:
Materiales y Métodos
81
1) Lower Buffer 4X (pH 8’8) 2) Upper Buffer 4X (pH 6’8)
90’85 g Tris-base (Roche) 6’06 g Tris-base
20 ml SDS 10% (Sigma) 4 ml SDS 10%
Agua hasta 500 ml Agua hasta 100 ml
3) Runnig Buffer 5X (pH 8’3) 4) Buffer de Trasferencia 10X
15 g Tris-base 58 g Tris-base
72 g Glicina (Sigma) 29 g Glicina
5 g SDS 3’7 g SDS
Agua hasta 1 litro Agua hasta 1 litro
Medida de la concentración de proteínas.
Con el fin de cuantificar la cantidad de proteínas que se ha obtenido
tras recoger las células, se utilizaron los reactivos de BioRad (Hercules, CA,
USA): Bio-Rad Dc Protein Assay Reagent A, B y S. Para ello se hizo una
curva patrón con BSA desde 1µg/µl hasta 8µg/µl, sobre la cual se
extrapolaron los valores obtenidos de las muestras y se obtuvo la
concentración de proteína. En primer lugar se añadieron 5µl de muestra (o
una cantidad menor, pero siempre completando hasta 5µl con el buffer en
que estuviera diluída la muestra), a cada pocillo de una placa de 96 pocillos
de fondo plano. En el caso del blanco, se añadieron 5µl del buffer. A
continuación se añadieron 25µl de la Solución A´ (1ml de Solución A + 20µl
de solución S). Posteriormente se añadieron 200µl del reactivo B. Se dejó
incubando 15 minutos a temperatura ambiente y se midió la fotometría a
una longitud de onda de 750 nm en el lector de placas Varioskan Flash
(Termo Electron Corporation).
Análisis de los receptores de TRAIL en la superficie celular mediante
citometría de flujo.
Materiales y Métodos
82
Para detectar la expresión de receptores de TRAIL en la superficie
celular, se utilizaron 2x106 células. Se despegaron del sustrato con un
rascador en PBS y, una vez lavadas, se resuspendieron en 100µl de PBS.
Posteriormente se incubaron con el anticuerpo primario correspondiente (5
µg/ml) a 4ºC durante 30 minutos. Después de lavar con PBS para eliminar el
exceso de anticuerpo primario, se incubaron con un anticuerpo secundario
anti-inmunoglobulinas de ratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína
(FITC) en una dilución 1:20 durante 30 minutos a 4ºC en oscuridad. Las
células se volvieron a lavar con PBS y se resupendieron en 200µl de PBS. La
detección de los receptores de muerte se realizó con un citómetro de flujo
FACScan, utilizando el programa Cell Queso Pro (Becton Dickinson,
Mountain View, CA, USA) para el análisis de los datos.
Producción de TRAIL recombinante y TRAIL biotinilado recombínate
(Trail-b).
El TRAIL recombinante, así como el el TRAIL recombinante biotinilado
(TRAIL-b), fueron producidos a partir de una construcción amablemente
cedida por la Dra. Marion MacFarlane (MCR Toxicology Unit. Univerisity of
Leicester, UK) que codifica para TRAIL recombinante (aminoácidos 95-281)
insertada en BamHI/XhoI del vector pET-28b(+) con resistencia a
kanamicina y una cola de seis histidinas para facilitar la purificación de la
proteína recombinante (MacFarlane et al., 1997). Brevemente: se
transformaron bacterias BL21 con 1-2 µg de ADN por choque térmico y se
crecieron en medio LB (Luria-Bertani), con 20mM de glucosa y 30µg/ml de
kanamicina. Cuando el precultivo alcanzó la densidad óptica de 0.6-0.8 a la
longitud de onda de 600nm se indujo la síntesis de la proteína recombinante
añandiendo al cultivo 0.5µM de IPTG (isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido).
Tras tres horas de inducción a temperatura ambiente, las bacterias se
Materiales y Métodos
83
recogieron por centrifugación y se lisaron, tras un lavado con PBS 1X, en un
tampón de lisis que contiene 30mM de Tris-HCl (pH 7,5), 150mM de NaCl,
10% de glicerol, 1% de Triton X-100 e inhibidores de proteasas. Este lisado se
incubó en un rotor circular durante 16 horas a 4ºC, en una columna de
sefarosa quelada con Niquel (Quelatin Sepharose Fast Flow; GE Healthcare
Bio-Sciences AB, Uppsala, Suiza), a la que el TRAIL quedará unido por la
cola de histidinas. Transcurrido este tiempo, se lava la columna seis veces
con PBS frío antes de eluir el TRAIL con una solución 100mM de EDTA en
PBS. Las fracciones más purificadas se titularon en actividad realizando un
ensayo de apoptosis en células HeLa, sensibles a TRAIL y se almacenaron a -
80ºC.
En el caso del TRAIL biotinilado, antes de eluir la proteína de la
columna, se incubó con 50 µg/ml de reactivo de biotinilización (Ácido D-
biotil-ε-aminocaproico N-Hidroxisuccinimida éster; Roche) durante 1 hora a
4ºC, tras lo cual, se eluyó con una solución 150 mM de EDTA en PBS.
Análisis del DISC de TRAIL.
El aislamiento del DISC de TRAIL fue realizado utilizando TRAIL
biotinilado recombínate (TRAIL-b), sintetizado en nuestro laboratorio. Las
células, 20x106 por tratamiento fueron incubadas con o sin doxorrubicina
500ng/ml durante 15 horas. Tras este tiempo, las células se trataron con
1µg/ml de TRAIL-b durante 15, 30 ó 60 minutos. Posteriormente se lavaron
las células con PBS frío tres veces y se lisaron en 3ml de tampón de lisis
(30mM Tris-HCl pH 7’5, 150mM de NACl, 10% de glicerol, 1% de Triton X-
100, 0’1% de deoxicolato, inhibidores de proteasas (Complete Inhibitors de
Roche)) durante 30 minutos en hielo. El lisado se recogió en tubos
eppendorfs y centrifugó en una minifuga durante 30 minutos a máxima
velocidad. Se recogieron los sobrenadantes, guardando 50µl como control
Materiales y Métodos
84
interno (Input). El DISC de TRAIL fue aislado de la misma cantidad de
proteína en cada caso utilizando 30 µl de sterptavidina-agarosa (Sigma)
incubando toda la noche a 4ºC en frío en un rotor circular. Los precipitados
se lavaron 6 veces con 500 µl de tampón de lisis y posteriormente se añadió
30 µl de tampón de carga 1X y se hirvieron a 95ºC durante 5 minutos para su
análisis protéico por western blot.
Fraccionamiento celular.
Para detectar la liberación de citocromo C de la mitocondria al citosol y
la translocación de Bax desde el citosol a la membrana mitocondrial tras un
estímulo apoptótico se separó la fracción mitocondrial (membranosa) de la
citosólica. Para ello se lavaron las células en PBS y se resuspendieron en 30µl
de tampón de lisis frío (80 mM de KCl, 250mM de sacarosa, 100µg/ml de
digitonina (Sigma-Aldrich), 0’1 mM de PMSF (Fenilmetilsulfonil Fluoruro,
Boehringer Ingelheim GmbH; Ingelheim, Alemania), 1mM de DTT (1,4-
Dithiothreitol, Roche) e inhibidores de proteasas en PBS. Tras incubar en
hielo durante 8 minutos (en células MCF-7), se centrifugaron 5 minutos a
10.000 rpm en frío y se recogió el sobrenadante (fracción citosólica). El
sedimento (fracción membranosa) se lavó con PBS y se resuspendió en
Laemli Buffer. Se utilizaron 50 µg de proteína de la fracción citosólica y una
cantidad proporcional de la fracción membranosa para la detección de las
proteínas citocromo C y Bax mediante western blot.
RT-PCR ( Transcripción reversa de ARN y amplificación de ADN por
reacción en cadena de la polimerasa (PCR)).
El ARN total de las células se aisló utilizando el sistema de aislamiento
de ARN, TRIzol (Invitrogen; Eugene, Oregon, USA), siguiendo las
recomendaciones del fabricante. Partiendo de 2 µg de ARN total y utilizando
un kit de transcriptasa reversa M-MLV (Gibco BRL 28025-013) se sintetizó el
Materiales y Métodos
85
ADN complementario. De este ADN se tomaron 4 µl para su amplificación
por PCR. Los cebadores utilizados para la amplicación de mRNAs se
obtuvieron de Sigma-Genosys y las secuencias son:
FLIPL-sentido: 5’-AATTCAAGGCTCAGAAGCGA-3’
FLIPL-antisentido: 5’-GGCAGAAACTCTGCTGTTCC-3’
FLIPS-sentido: 5’-ATGTCTGCTGAAGTCATCCAT-3’
FLIPS-antisentido:5’-TCACATGGAACAATTTCCAAG-3’
Actina-sentido: 5’-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3’
Actina-antisentido: 5’-CATGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3’
Los productos de amplificación que se producen son de 667 pb para
cFLIPS, 230pb para cFLIPL y 661 pb para la actina. Las condiciones de la
PCR fueron las siguientes: 2 minutos a 94ºC, 27 ciclos de: 40 segundos a 94
ºC, 40 segundos a 60ºC y 40 segundos a 72ºC. Se finaliza con 10 minutos a 72
ºC. Los productos amplificados se visualizaron en un gel de agarosa
(AppliChem) a 1% en tampón TAE con 0’5 µg/ml de bromuro de etidio
(Sigma-Aldrich).
Electroporación y sorting.
Los experimentos de electroporación se realizaron basados en el
protocolo descrito por Agami R. et al, Cell, 2000. Brevemente: 1.500.000
células tumorales MCF-7 se resupendieron en 100 µl de tampón de
electroporación que contenía 2mM HEPES (pH 7’2), 15 mM
K2HPO4/KH2PO4, 250mM Manitol y 1mM MgCl2 a un pH final de 7’2.
1µg total de ADN (0’3 µg del plámido que codifica para GFP y 0’7 µg del
plásmido que codifica para una forma constitutivamente activa de AKT
(pcDNA3-Myr-AKT, amablemente cedido por el Dr. Kenneth Wals) o del
plásmido que codifica para una forma dominante negativa de AKT
(pcDNA3-dnAKT, amablemente cedido por el Dr. Kenneth Walsh) fue
Materiales y Métodos
86
añadida a esta suspensión y transferida a una cubeta de electroporación de
0.1 cm (Sigma-Aldrich). Posteriormente las células se electroporaron en el
aparato de electroporación Gene pulser II (BIORAD) con las condiciones 140
voltios, 10 pulsos, 1.5 ms de duración de pulso y un intervalo de tiempo
entre pulsos de 1.5 segundos. 48 horas después de la electroporación, se
seleccionaron las células positvas para GFP utilizando un citómetro
FACSAria Cell Sorter (Becton Dickinson). Las células se tripsinizaron y se
lavaron con PBS antes de resuspenderlas en 1 ml de un tampón que contenía
5mM de EDTA y 25mM de Hepes pH 7 en PBS. Con el objetivo de evitar
agregados, las células se filtraron utilizando filtros de 70 µm. Tras el proceso
de selección, las células recuperadas, se lisaron y se analizaron las proteínas
pertinentes mediante western-blot.
Transfección transitoria con oligos de ARN de interferencia (siRNA).
El silenciamiento transitorio de proteínas celulares mediante siRNA se
llevó a cabo con el reactivo de transfección Dharmafect (Dharmacon,
Colorado, USA). Para ello se sembraron 250.000 células por pocillo en placas
de cultivo de 6 pocillo y en medio completo sin antibiótico. Al dia siguiente,
el medio completo fue sustituído por 2 ml de medio de transfección durante
24, 48 o 72 horas.
El medio de transfección se compone de 10 ó 50nM de oligos, 2’5 µl de
Dharmafect y 2ml de medio Optimen (Gibco-Invitrogen, Grand Island, NY,
USA). La preparación del medio de transfección consta de dos pasos. En
primer lugar se mezclan durante 5 minutos a temperatura ambiente el
Dharmafect con el medio Optimen. Pasado este tiempo, se añade esta mezcla
a los oligos y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente. En ese
tiempo, se lavan los pocillos con medio Optimen y se les añade 1’6 ml del
mismo a cada pocillo. Tras los 20 minutos de incubación, se añaden 400 µl de
la mezcla Optimen/Dharmafect/oligos al pocillo correspondiente.
Materiales y Métodos
87
Producción viral.
Para la producción de retrovirus y lentivirus, se utilizó la línea celular
HEK293T (amblemente cedida por el Dr. Antonio Rodríguez Márquez,
CNIO, Madrid) y los siguientes plásmidos:
Plásmidos retrovirales: el plásmido pCI-VSV-G, que codifica para la
expresión del gen de la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular
(VSV-G), comunmente utilizada para el pseudotipaje de lentivirus y
retrovirus y el plásmido pVpack-GP-dl, que codifica para la expresión de los
genes virales gag, pol, fueron amablemente cedidos por el Dr. Antonio
Rodríguez. El plásmido pBabe.Puro y el plásmido pLPCX, que sirvieron de
base para la contrucción de los plásmidos pBabe-FLIPL, pLPCX-FLIPS, que
codifican para la expresión de las proteínas cFLIPL y cFLIPS, fueron
amablemente cedidos por el Dr. Mauricio Reginato (Drexel University,
Filadelfia). Los plásmidos pBabe-Bcl2 y pBabe-dnFADD, que codifican para
la expresión de la proteína Bcl2 y de una forma negativa de FADD,
respectivamente, fueron amablemente cedidos por el Dr.Mauricio Reginato
(Drexel University, Filadelfia). Para la construcción de los plásmidos pBabe-
FLIPL y pLPCX-FLIPS se siguió la siguiente estrategia: la secuencia de ADN
que codifica para la proteína cFLIPL, se subclonó del vector pCR3.V64-Met-
Flag-Stop (amablemente cedido por el Dr. J. Tschopp) utilizando las dianas
de restricción para XhoI/BamHI, al vector pBabe.Puro utilizando las dianas
de restricción para BamHI/SalI. La secuencia de ADN que codifica para la
proteína cFLIPS, se subclonó del vector pCR3.V62-Met-Flag (amablemente
cedido por el Dr. J. Tschopp) al vector pLPCX utilizando las dianas de
restricción para HindIII/NotI.
Materiales y Métodos
88
Plásmidos lentivirales: el plásmido pMD2.G, que codifica para la expresión
del gen de la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G)
comummente utilizada para el pseudotipaje de lentivirus y retovirus, el
Materiales y Métodos
89
plásmido psPAX2, que codifica para la expresión de los genes virales gag,
pol y rev y el plásmido pLVTHM que codifica para la expresión del shRNA
de interés y que sirvió de base para la construcción de los plásmidos
pLVTHM-shFLIPL y pLVTHM-shScrambled, fueron amablemente cedidos
por la Dra. Rosa Mª Rios (CABIMER). Para la construcción de los plásmidos
pLVTHM-shFLIPL y pLVTHM-shScrambled(Control) se siguió la siguiente
estrategia: la secuencia de ADN correspondiente al shRNA de cFLIPL y del
shRNA-Scrambled se clonaron en las dianas de rescticción para BglII y
HindIII del vector pSUPER.RETRO. Posteriormente la secuencia de ADN
codificante para el promotor HI (incluída en el vecotr pSUPER-RETRO)
unida a la secuencia de los shRNA fue subclonada en el plámido pLVTHM
utilizando las dianas de restricción para EcoRI/CLAI del plásmido
pLVTHM.
La producción de retrovirus y lentivirus se realizó mediante la
transfección, con los plásmidos correspondientes, de las células HEK293T
por el método del fosfato cálcico (Ausubel, F.M. et al. 1994) basado en la
obtención de un precipitado de cloruro cálcico y ADN en una solución salina
de fosfatos. El precipitado forma agregados que pueden ser
endocitados/fagocitados por las células. Brevemente: se sembraron 2x106
células en placas de 90 mm en 10 ml de medio completo, para que al dia
siguiente, al transfectar, tengan una confluencia de entre el 50-80%. 3 horas
antes de la transfección se sustituyó el medio de cultivo por 8 ml de medio
fresco. Las células se transfectaron con 30 µg de ADN total en una
proporción 1:2:3 de plasmido pMD2.G (4’5 µg), plásmido psPAX2 (9 µg) y
plásmido pLVTHM-shFLIPL o pLVTHM-shScrambled (13’5 µg), en el caso
de lentivirus, y 4’5 µg de plásmido pCI-VSV-G, 9 µg de plásmido pVpack-
GP-dl y 13’5 µg de plásmido pBabe-FLIPL, pLPCX-FLIPS, pBabe-Bcl2 o
Materiales y Métodos
90
pBabe-dnFADD según corresponda, en el caso de retrovirus. El ADN de los
tres plásmidos se mezcla suavemente y se añade gota a gota a un tubo con
0’5 ml de HBS 2X. Tras mezclar suavemente, se añaden, despacio y gota a
gota, 30 µl de CaCl2 2’5M y se agita inmediatamente. Se deja incubar a
temperatura ambiente durante 20 minutos y se añaden 0’5 ml de la mezcla a
cada placa de células gota a gota. Las células se dejan en un incubador a
37ºC y 5% de CO2 durante 12 horas. Tras este tiempo se retira el medio de
transfección y se añaden 8 ml de medio fresco, incubandose bajo las mismas
condiciones durante 48 horas más, en el caso de lentrivirus y 72 horas en el
caso de retrovirus. Tras este tiempo, se recoge el medio celular y se
centrifuga 5 minutos a 3000 rpm para eliminar los restos celulares.
Posteriormente, se purifica pasándolo a través de filtros de 0’45 µm. Una vez
filtrado, los virus presentes en el medio celular se concentran mediante
centrifugación en filtros Vivaspin 20 Polyethersulfone 100.000 MWCO
(Sartorius Gropu-DICSA), a una velocidad de 1.800xg y a una temperatura
de 4ºC. Tras la concentración se almacenan a -80ºC. Para conocer el título
viral, se sembraron 80.000 células MCF-10A en pocillos de placas de 6
pocillos. A la mañana siguiente, se añadieron a cada pocillo cantidades
crecientes de virus. Se completó hasta 1ml con medio fresco y se añadió
Polybrene a la concentración de 8 µg/ml. Tras 48 horas, se midió el
porcentaje de células positivas para GFP mediante citometría de flujo y se
obtuvo una curva de infección, mediante la cual podemos conocer la
cantidad de virus obrtenida y el volumen de virus necesarios para infectar a
un determinado número de células.
En el caso de la producción de retrovirus, tras eliminar los restos celulares y
purificar el medio celular con los filtros de 0.45 µm se alícuota el
sobrenadante y se mantiene a -80ºC.
Materiales y Métodos
91
HBS 2X
280 mM NaCl
100mM Hepes
1’5mM Na2HPO4
Ajustar el pH a 7’5.
Infecciones virales.
Infección retroviral:
Para la obtención de células MCF-10A que sobrexpresan cFLIPL,
cFLIPS, Bcl-2 o una forma dominante negativa de FADD, se sembraron
500.000 células en una placa de 90 mm. Al día siguiente se infectaron con
una mezcla de 2 ml de sobrenadante viral obtenido como se comenta en el
apartado anterior, 2 ml de medio fresco y Polybrene a una concentración de
8µg/ml. A las 5-6 horas de la infección se la añaden 6ml de medio freco y se
dejan otras 15-16 horas. Pasado este tiempo, se retira el medio de infección y
se añade medio fresco nuevo. Tras 48 horas, se añade el antibiótico de
selección puromicina a una concentración de 1’5 µg/ml y se seleccionan
durante otras 48 horas.
Infección lentiviral:
Para la obtención de células MCF-10A que expresan el shRNA-FLIPL o
el shRNA-Scrambled se sembraron 80.000 células en pocillos de placas de 6
pocillos. Se infectaron con el volumen adecuado de virus según la titulación
viral, se completó hasta 1 ml con medio completo y se añadió Polybrene a
una concentración de 8µg/ml. Tras 5 horas se le añadió 2 ml de medio freco
al pocillo. Al día siguiente se retira el medio de infección y se añaden 2 ml de
medio freco.
Ensayos de anoikis.
Materiales y Métodos
92
Sembrar en placas de 6 pocillos tratadas con polyHema (SIGMA P3932 Poly
2-hydroxyethyl methacrylate) 400.000 células por pocillo en medio completo
suplementado al 50% con medio completo más Methocel (Sigma/Fluka
BioChemika, 64670). Al mismo tiempo sembrar el mismo número de células
en placas de 6 pocillos sin tratar con polyHema. Tras 24 o 48 horas recoger
las células para western blot.
Para tratar las placas con olyHema, preparar una solución cuya
concentración de polyHema sea 120 mg/ml en etanol absoluto (por ejemplo:
2.5 g Polyhema + 20.75 ml etanol 95%). Dejar en agitación a 37ºC toda la
noche cerrando bien el tubo para evitar la evaporación del etanol.
Centrifugar 30min a 2500rpm a temperatura ambiente. Después de
centrifugar a veces sale un poco turbio, pero dejando el tubo de pie a T.A. se
va quedando translúcido. De la solución stock 120mg/ml se hace una
dilución 1:20 con etanol absoluto para obtener una concentración final de
Polyhema de 6 mg/ml. Al diluir el polyhema suelen formarse algunos
grumos. Dejar de nuevo en agitación a 37ºC con el tubo bien cerrado hasta
que se disuelvan los grumos. Se necesita 1 ml de Polyhema por pocillo
(placa de 6 pocillos). Lavar los pocillos con 2mL/p de PBS estéril 2 veces
antes de sembrar la placa.
Para preparar medio de crecimiento celular con methocel al 1%,
pesamos 5 gramos de methocel y lo añadimos a una botella de 500 ml
esterilizada. Añadimos también a la botella un agitador magnético.
Autoclavamos el methocel durante 20 minutos. Añadimos a la botella con
methocel 500ml de medio de crecimiento de las células MCF-10A y dejamos
agitando a 4ºC durante toda la noche o hasta que el methocel se haya
disuelto.
Estudios de morfogénesis
Cultivos tridimensionales de células epiteliales.
Materiales y Métodos
93
En primer lugar, se repartieron 50 µl de Matrigel (GFR BD; Ref. 354230)
previamente descogelado en hielo, en cada pocillo de la placa (BD
Transduction, Ref. 354118). Se dejó la placa en el incubador celular durante
20 minutos para que el Matrigel gelificase y a continuación se añadieron
5.000 células por pocillo resuspendidas en 400 µl de medio de ensayo 3D, al
que se suplementó con 5ng/ml de EGF (Peprotech) y 2% de Matrigel. Las
células se incubaron a 37ºC y 5% de CO2 durante 7, 10, 15 o 18 días, para el
estudio de formación de acinos. Cada 4 días el medio era sustituido por
otros 400 µl de medio de ensayo 3D, suplementado con 5ng/ml de EGF
(Peprotech) y 2% de Matrigel.
Inmunofluorescencia en 3D.
Para el estudio de la formación de acinos mediante microscopia, los
acinos se fijaron, en la propia placa de cultivo, con 400 µl de una solución al
4% de Formalin (Sigma HT501128) en PBS, durante 20 minutos y a
temperatura ambiente. Después se lavaron 3 veces durante 10 minutos con
400 µl de una solución pBS/Glicina 1X a temperatura ambiente.
A continuación se realizó un primer bloqueo con 400 µl de Buffer IF Wash
1X + 10% de suero de cabra (Sigma, G9023) durante 1 hora a temperatura
ambiente. El segundo bloqueo se realizó con 200 µl de una solución IF Wash
1X + 10% de suero de cabra + 1:100 de F (ab)2 (Jackson Immunoresearch 115-
006-006) durante 30-30 minutos a temperatura ambiente.
A continuación se puede dejar incubando toda la noche en agitación muy
suave a 4ºC con el anticuerpo primario deseado, generalmete caspasa-3
activa para determinar apoptosis, a una concentración de 1:100 en 200 µl de
bloqueo secundario. Al día siguiente se lavan los pocillos 3 veces con 400 µl
de IF Wash 1X a temperatura ambiente, con agitación muy suave durante 20
minutos. Seguidamente se incuban las muestras con el anticuerpo
Materiales y Métodos
94
secundario correspondiente en 200 µl de una solución IF Wash + 10% de
suero de cabra, en oscuridad, a temperatura ambiente y en agitación muy
suave durante 1 hora. Tras la incubación se vuelven a lavar 3 veces durante
20 minutos cada una, con IF Wash 1X, en oscuridad, a temperatura ambiente
y en agitación muy suave. Posteriormente, se incubaron con 20ng/ml de una
solución DAPI (Sigma, D9542) en PBS, durante 15 minutos en oscuridad y
se realizó un último lavado en IF Wash 1X, antes de montar las muestras y
analizarlas en el microscopio.
Si no se van a teñir las muestras con ningún anticuerpo, tras el segundo
bloqueo se puede añadir directamente la solución de DAPI/PBS, y seguir a
partir de ahí.
Análisis de las muestras por microscopia confocal.
El correcto desarrollo de la morfogénesis y formación de lumen, se
analizó en un microscopio confocal espectral (Leica TCS-SP5), utilizando un
objetivo HCXPLAPO con un aumento 20X y una apertura numérica de 0.7
de inmersión. El sofware para la adquisición y análisis de imágenes fue LAS
AF. Se analizaron un mínimo de 100 acinos por muestra, obteniendo el
porcentaje de acinos vacios (4 o menos células en el interior del lumen), en
los diferentes dias del desarrollo morfogénico.
Western blot.
Para el análisis de proteínas a partir de acinos las células se sembraron
en placas de doce pocillos y se siguió el siguiente protocolo: se reparten 150
µl de matrigel en los pocillos de las placas. Se deja gelificar el matrigel a 37ºC
durante 15-20 minutos y se añaden 20.000 células por pocillo. El medio de
los pocillos se debe cambiar cada 4 dias al igual que en los ensayos de
morfogénesis para inmunofluorescencia. El dia deseado de la morfogénesis,
para obtener extractos celulares a partir de los acinos, se aspira el medio de
Materiales y Métodos
95
los pocillo y se lava dos veces con 500 µl de tripsina. Se añaden otros 800 µl
y con la punta de la pipeta se rasca el pocillo y su contenido se vierte en un
tubo de 15 ml. Se deja incubar a 37ºC durante 10 minutos y se centrifuga a
1000 rpm durate 4 minutos. Tras esta centrifugación deberíamos observa un
pellet de células en el fondo del tubo. Si no es así, debemos añadir tripsina
fresca e incubar de nuevo 10 minutos a 37ºC. Lavamos el pellet con PBS 1X,
y volvemos a centrifugar. Aspirar el PBS y añadir entre 100-140 µl de buffer
de lisis. Mantener en hielo durante 15 minutos y centrifugar durante 15
minutos a 4ºC. Medir la concentración de proteína del lisado y realizar una
electoforesis SDS-PAGE como se ha comentado anteriormente.
Medio de ensayo 3D:
DMEM F12 500 ml
Suero de caballo 10 ml
Hidrocortisona (5mg/ml) 50 µl
Toxina colérica (1mg/ml) 50 µl
Insulina (10mg/ml) 500 µl
Glutam/Pen/Strep 5 ml
PBS/Glicina 10X
38 gr NaCl
9’38 gr Na2HPO4
2’07 gr NaH2PO4
37’5 gr Glicina
Hasta 500 ml con agua.
pH 7’4
IF Wash 10X
Materiales y Métodos
96
38 gr NaCl
9’38 gr Na2HPO4
2’07 gr NaH2PO4
2’5 gr NaN3
5 gr BSA
10 ml Triton X-100
2’05 ml Tween 20
Hasta 500 ml con agua
pH 7’4
Análisis estadístico.
La significación estadística se evaluó mediante la aplicación de la
prueba estadística T-Test. Un valor de p menor de 0’05 se consideró
estadísticamente significativo.
97
VI. RESULTADOS
Resultados
98
1. Sensibilización de células de cáncer de mama a la apoptosis
inducida por TRAIL. Papel de cFLIP.
1.1 Doxorrubicina y SAHA sensibilizan a células de cáncer de mama a la
apoptosis inducida por TRAIL.
Aunque muchos tipos de tumores son sensibles a la apoptosis
inducida por TRAIL, existe un importante número de células tumorales como
las de neuroblastoma, cáncer pancreático, melanoma o cáncer de mama,
principalmente, que son resistentes [4, 323, 324]. Más aún, repetidas
aplicaciones de TRAIL a células sensibles, permiten la selección y expansión
de células que han adquirido resistencia [324]. Por ello la caracterización de
los mecanismos de resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL, no sólo es
importante para el estudio de la transducción de señales de muerte, sino que
también es esencial para el diseño de estrategias que ayuden a eliminar esta
resistencia en futuras aplicaciones clínicas. Así, una de estas estrategias
puede ser el uso combinado de TRAIL con agentes quimioterapéuticos que
sensibilicen a la acción de éste.
La doxorrubicina es un antibiótico de la familia de las antraciclinas,
utilizado ampliamente en la quimioterapia del cáncer. El mecanismo de
acción es complejo y aún no está plenamente esclarecido, aunque se piensa
que actúa mediante su intercalación en el ADN. Se sabe que, al intercalarse,
inhibe el avance de la topoisomerasa II en la replicación del ADN. La
doxorrubicina se usa habitualmente en el tratamiento de algunas leucemias y
en el linfoma de Hodgkin, así como en mieloma múltiple, cáncer de vejiga,
pulmón, estómago, ovarios, tiroides y mama, entre otros [325] [326].
El principal inconveniente del uso de la doxorrubicina como
antitumoral es la alta toxicidad cardiaca a dosis elevadas y los múltiples
efectos secundarios que se producen en pacientes. Por ello, las
Resultados
99
investigaciones se han centrado en desarrollar derivados de la doxorrubicina
que tengan los mismos o mejores efectos antitumorales pero con menos
toxicidad. Muchos análogos han sido probados como agentes antitumorales
pero la doxorrubicina sigue siendo la antraciclina más usada y su uso en
combinación con otros fármacos puede ser una alternativa para evitar la
toxicidad de la doxorrubicina por sí misma [326]. Actualmente, en
cotratamiento con TRAIL se encuentra en fase 1B de ensayos clínicos [4]
[323].
Vorinostat o SAHA (suberoylanidile hydroxamic acid) es un miembro
de una gran familia de compuestos inhibidores de las histonas deacetilasas
que, actualmente, se están utilizando como terapia antitumoral. Se ha
demostrado que los inhibidores de las histonas deacetilasas alteran el
crecimiento de ciertos tipos de cánceres [327, 328]. Estas moléculas, muchas
de las cuales han sido aisladas de fuentes naturales, han demostrado
capacidad de inhibir la proliferación, inducir diferenciación y causar
apoptosis en células tumorales.
Una de las características de estas moléculas es la baja toxicidad que
han mostrado en las pruebas preliminares. Aunque muchas de las pruebas
para las potenciales terapias se han realizado sólo en cultivos celulares y
modelos animales, los resultados de estas pruebas han sido muy
prometedoras y varios fármacos ya se encuentran en ensayos clínicos.
También se ha observado que los inhibidores de histonas deacetilasas afectan
varios tipos de cánceres sólidos y hematológicos, incluyendo el
neuroblastoma, el melanoma, leucemias, cáncer de próstata, de pulmón, de
ovarios, de colon y de mama [327]. Los inhibidores de histonas deacetilasas
se encuentran clasificados en categorías basadas en su estructura química. El
mecanismo exacto por la cual estos compuestos funcionan no es todavía bien
entendido y se piensa que cada inhibidor actúa sobre una histona deacetilasa
Resultados
100
en concreto. La verdadera eficacia de los inhibidores de histonas deacetilasas
todavía queda por determinar, pero en las evaluaciones han demostrado el
potencial de ser tratamientos efectivos y selectivos para ciertas formas de
cánceres. Estos compuestos pueden ser a su vez usados en combinación con
otros agentes contra el cáncer [327, 329], como por ejemplo con TRAIL, y
actualmente se encuentra en ensayos clínicos.
Por todos estos antecendentes, decidimos estudiar si la doxorrubicina
y el SAHA en combinación con TRAIL eran capaces de inducir apoptosis en
células de cáncer de mama resistentes a TRAIL y determinar el mecanismo
molecular.
En cáncer de mama, la doxorrubicina es el agente quimioterapéutico
más utilizado y está descrito que puede inducir apoptosis a través de la ruta
mitocondrial en estas células [317]. La doxorrubicina provoca la acumulación
de p53 en las células que deriva en un aumento de los niveles de receptores
de TRAIL TRAIL-R1, R2 y R3. Así, para el estudio, utilizamos diferentes
líneas de células epiteliales de cáncer de mama con diferencias en los niveles
de expresión de p53. Las células MCF-7 que expresan niveles normales de
p53 (MCF-7 C4), células MCF-7 que mantienen unos niveles reducidos de p53
porque sobrexpresan la proteína E6 de papilomavirus humano (MCF-7 E6) y
células MDA-MB231 que expresan una isoforma de p53 mutada. Estas células
fueron pretratadas con doxorrubicina antes de la acción de TRAIL y como se
observa en la Figura 1A, el tratamiento combinado es capaz de inducir
apoptosis, lo que no se da con los tratamientos por separado.
Resultados
101
El aumento de los niveles de TRAIL-R2 tras el tratamiento con DXR
podría explicar la sensibilización de las células de cáncer de mama a TRAIL
Figura 1. Sensibilización de las líneas tumorales de mama por doxorrubicina o SAHA a la apoptosis inducida por TRAIL. A) Las líneas celulares MCF-7 C4, MCF-7 E6 y MDA-MB231 fueron tratadas o no con doxorrubicina 500ng/ml durante 15 horas. Posteriormente se trataron con TRAIL 50ng/ml (MCF-7) o 500ng/ml (MDA-MB231) durante 8 horas. La viabilidad celular (MCF-7) fue determinada mediante el ensayo de cristal violeta y la apoptosis fue determinada mediante citometría de flujo por la cuantificación de SubG1 (MDA-MB231). B) Para el estudio de sensibilización con SAHA, las células fueron tratadas con 5µM de SAHA durante 8 horas y posteriormente tratadas con TRAIL 50ng/ml (MCF-7) o 500ng/ml (MDA-MB231) durante 15 horas. La apoptosis fue determinada mediante citometría de flujo por la cuantificación de SubG1 (MDA-MB231) o la cuantificación de la externalización de la fosfatidilserina mediante tinción con Anexina V FLUOS (MCF-7).
A) B)
Resultados
102
y, por eso, decidimos estudiar cómo se afectaban los niveles de receptores de
TRAIL en membrana tras el tratamiento con DXR. Como se puede observar
en la Figura 2, los niveles de expresión de TRAIL-R2 en membrana tras el
tratamiento con DXR tan sólo aumentan en la línea tumoral MCF-7 C4, sin
que el aumento sea significativo en las línas celulares tumoralels MCF-7 E6 y
MDA-MB231. Estos resultados nos indican que el mecanismo de
sensibilización a TRAIL mediado por DXR es, en primer lugar,
independiente de p53, ya que células tumorales donde los niveles de dicha
proteína se encuentra reducidos (MCF-7 E6), o bien mutados (MDA-MB231)
también se sensibilizan y, en segundo lugar, parece independiente de un
aumento de la expresión del receptor pro-apoptótico TRAIL-R2 en
membrana.
Así, decidimos profundizar en el mecanismo de sensibilización por
doxorrubicina en células MCF-7 a la apoptosis inducida por TRAIL. Para
determinar qué eventos de la ruta de señalización de TRAIL se afectan
durante la sensibilización, decidimos comprobar, en primer lugar, si la
mitocondria participaba en la apoptosis inducida por dicha sensibilización.
Para llevar a cabo este estudio, utilizamos un clon de células MCF-7 que
sobrexpresa la proteína antiapoptótica Bcl-2 (MCF-7 B6) y el clon control
(MCF-7 A1). Como podemos observar en la Figura 3A, el tratamiento con
ambos agentes provoca un aumento en la muerte en la línea celular MCF-7
control (A1), efecto que está completamente bloqueado en la que
sobrexpresan Bcl-2 (B6). Así podemos concluir que la mitocondria juega un
papel importante en la apoptosis inducida tras sensibilizar a las células a la
acción de TRAIL con doxorrubicina, puesto que las células que
sobreexpresan Bcl-2 se ven protegidas de la muerte.
Resultados
103
P
a
Para profundizar aún más en el mecanismo molecular implicado en la
sensibilización y estudiar de qué forma contribuye la mitocondria en este
proceso, decidimos analizar qué ocurría con proteínas implicadas en la vía
mitocondrial de apoptosis, como son citocromo C y Bax, tras el tratamiento
DXR/TRAIL. Para ello, utilizamos células MCF-7 E6 y mediante
experimentos de fraccionamiento celular, analizamos la liberación de
Figura 2. Los niveles de receptores de TRAIL en membrana no aumentan significativamente tras el tratamiento con doxorrubicina. A) Las líneas celulares MCF-7 C4, (B) MCF-7 E6 y (C) MDA-MB231 se trataron con doxorrubicina 500ng/ml durante 15 horas y la expresión de los receptores de TRAIL en membrana fue determinada
mediante citometría de flujo con anticuerpos primarios contra los receptores TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3 y TRAIL-R4 (línea negra) o con un anticuerpo irrelevante (línea gris) tal y como se describe en Materiales y Métodos.
B)
C)
A)
Resultados
104
citocromo C desde la mitocondria al citosol, y la translocación de Bax desde
el citosol a la membrana mitocondrial. Como observamos en la Figura 3B, ya
a las dos horas de tratamiento con TRAIL después de haber pretratado a las
células con DXR, se observa una liberación de citocromo C al citosol, y una
Figura 3. Participación de la mitocondria en el mecanismo de sensibilización por doxorrubicina a la apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer de mama. (A) Células MCF-7 que sobrexpresan la proteína Bcl2 (B6) y sus células controles (A1) fueron tratadas con doxorrubicina (500ng/ml) durante 15 horas. Posteriormente se trataron con TRAIL (50ng/ml) durante 8 horas y la apoptosis se determinó mediante la cuantificación de la externalización de la fosfatidil serina por tinción con Anexina V FLUOS tal y como se describe en Materiales y Métodos. (B) Células MCF-7 E6 se trataron o no con doxorrubicina (500ng/ml) durante 15 horas. Posteriormente se trataron con TRAIL a las dosis indicadas durante 2 horas. Tras el tratamiento se realizó un fraccionamiento celular y por western-blot se analizaron los niveles de citocromo C y Bax en las diferentes fracciones celulares tal y como se describe en Materiales y Métodos. (C) las células MCF-7 E6 se trataron como en (B) y la activación de Caspasa-8 y la pérdida de Bid se determinaron mediante western-blot.
A)
B)
C)
Resultados
105
pérdida de éste en la fracción membranosa. Esto ocurre en menor medida en
las células que han sido tratadas sólo con DXR, y no se da en las que sólo se
han tratado con TRAIL. Con Bax ocurre todo lo contrario, tras el tratamiento
con DXR/TRAIL se ve un aumento de éste en la fracción membranosa y su
pérdida en la fracción citosólica. Esto nos lleva a concluir que tras el
tratamiento con DXR, dos horas con TRAIL son suficientes para que se
observe un sinergismo entre ambos agentes, así que nos planteamos si este
sinergismo podía observarse en eventos anteriores a la activación de la
mitocondria en la vía de señalización apoptótica de TRAIL. Por tanto,
decidimos estudiar la activación de caspasa-8 y el corte de Bid. Para ello
células MCF-7 E6 fueron tratadas con DXR/TRAIL y la activación de
caspasa-8 y de Bid fue analizada mediante western blot. Como se observa
en la Figura 3C, el corte de procaspasa-8 y por lo tanto su activación se ve
aumentada en las células que han sido pretratadas con DXR con respecto a
las que no. Al mismo tiempo se observó un aumento del procesamiento de
Bid.
Estos datos pueden tener una doble interpretación: puede que el
sinergismo actúe a niveles tempranos de la señalización de TRAIL (durante
la formación del DISC), o puede que el aumento de caspasa-8 activa y de
procesamiento de Bid sean consecuencia de la activación de la mitocondria,
puesto que tras la salida de citocromo C desde la misma, éste se agrupa con
caspasa-9 y Apaf-1 para formar el apoptosoma lo que lleva a la activación
de caspasas efectoras como las caspasas 3 y 7 (en estas células no se
produciría activación de caspasa-3 puesto que carecen de ella), y así activar a
la caspasa-8 para potenciar la apoptosis iniciada desde la mitocondria.
Por ello decidimos realizar un estudio de formación del DISC de
TRAIL y activación de la caspasa-8 en el mismo en células MCF-7 E6
tratadas con DXR/TRAIL.
Resultados
106
Como se observa en la Figura 4, en el DISC de células pretratadas
con DXR y posteriormente con TRAIL, se produce un aumento de
procaspasa-8 y se observan los fragmentos resultantes de su activación, así
como también podemos observar un aumento de los niveles de FADD.
Según todos estos datos podemos concluir que la sensibilización a
TRAIL por el tratamiento con DXR, tiene lugar ya desde los eventos más
tempranos de la señalización de TRAIL. En relación al mecanismo que
explique este aumento en la formación del DISC, no podemos descartar que
el aumento de expresión del receptor TRAIL-R2 en membrana que se
produce en algunas de las líneas celulares estudiadas tras el tratamiento con
DXR sea suficiente para disparar este efecto. Pero también pude ocurrir que
la DXR afecte la expresión de proteínas inhibidoras del DISC, como por
ejemplo cFLIP, y una disminución de éste podría aumentar la formación del
DISC y explicar con ello los datos observados.
Así, decidimos estudiar qué ocurre con los niveles de expresión de
cFLIP durante el tratamiento con DXR. Para ello células MCF-7 y MDA-
MB231 se trataron con DXR y la expresión de cFLIP fue analizada por
western blot. Como observamos en la Figura 5, el tratamiento con DXR
Figura 4. Aumento de formación del DISC de TRAIL en células tumorales de mama tratadas con Doxorrubicina. Las células MCF-7 E6 se trataron con doxorrubicina durante 15 horas (500 ng/ml) y posteriormente se trataron con TRAIL-b (biotinilado ,1µg/ml) durante 15, 30 y 60 minutos. El DISC de TRAIL se precipitó con bolitas de streptavidina-agarosa y se analizó por western blot para detectar los niveles de Caspasa-8 y FADD, como está descrito en Materiales y Métodos.
Resultados
107
disminuye los niveles de cFLIPs principalmente, lo que puede facilitar la
activación de caspasa-8 en el DISC de TRAIL. Por tanto, podemos concluir
que el mecanismo de sensibilización a TRAIL por doxorrubicina en células
de cáncer de mama, se debe a un aumento de la activación de caspasa-8 en el
DISC, favorecido por la bajada de expresión de cFLIPs inducida por DXR
(evento común a células MCF-7 y MDA-MB231), además de por un aumento
de expresión de TRAIL-R2 en membrana, también inducido por DXR (en
células MDA-MB 231 principalmente). La mitocondria amplificaría el efecto
apoptótico puesto que, como hemos demostrado, la ruta mitocondrial de
apoptosis está activada en las células sensibilizadas.
Igualmente hemos analizado el mecanismo de la sensibilización a TRAIL por
el inhibidor de histonas deacetilasas, SAHA (Figura 1B). En el tratamiento
con SAHA también se produce una bajada en los niveles de expresión de
cFLIP, lo que podría ser una de las causas de la sensibilización a TRAIL en
células de cáncer de mama. Pero es más, la disminución en los niveles de
expresión de cFLIP se puede extender a diferentes tratamientos
sensibilizadores a la apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer de
Figura 5. Doxorrubicina y SAHA disminuyen los niveles de cFLIP en células de cáncer de mama. Las células MDA-MB231 y MCF-7 fueron tratadas con doxorrubicina (A y B) durante 4, 8 y 15 hora. Posteriormente se determinaron los niveles de cFLIP mediante western blot. (C) Las células se trataron con SAHA (5µM) durante 24 horas y los niveles de cFLIP se determinaron mediante western blot. En la misma membrana, como control de carga, se determinaron los niveles de α-tubulina.
A) B) C)
Resultados
108
mama. Así lo refleja a modo de resumen la Tabla 1.Tanto la deprivación de
glucosa, como el flavopiridol y la roscovitina (inhibidores de ciclinas
dependientes de quinasas), o el nocodazol (inhibidor de la polimerización de
microtúbulos) sensibilizan a la apoptosis inducida por TRAIL afectando de
forma particular a los niveles de la proteína cFLIP, que se ven disminuidos
tras el tratamiento, favoreciendo con ello la proporción caspasa-8/cFLIP en el
DISC. El interferón gamma no disminuye los niveles de cFLIP (datos no
mostrados), pero aumenta los de caspasa-8 con lo que el cociente caspasa-
8/cFLIP en el DISC de nuevo es favorable a la caspasa-8.
Tratamiento Sensibilizacióna TRAIL
Mecanismo
IFN-γ Sí ↑ Formación del
DISC .
↑ Caspasa-8
Ruiz-Ruiz C, et al. (Cancer Research
2000)
Deprivación de glucosa
Sí ↑ Formación del
DISC
↓ FLIP
Muñoz-Pinedo C et
al. (JBC 2003). García-García C et al.
(Biochem. Pharmacol 2009)
Flavopiridol Sí ↑ Formación del
DISC .
↓ FLIP
Palacios C, et al. (Cancer Research
2006)
Roscovitina Sí ↑ Formación del
DISC.
↓ FLIP
Ortiz-Ferrón G, et al. (Cell Research, 2008)
Nocodazol Sí ↓ FLIP Sanchez-Perez et al. (Cell Death and
Differentiation 2009)
Tabla 1. Implicación de cFLIP en el mecanismo molecular de sensibilización a la apoptosis inducida por TRAIL.
Resultados
109
cFLIP actúa a un nivel muy apical de la señalización de TRAIL
impidiendo la completa activación de caspasa-8 en el DISC, por lo que se
podría pensar que constituye un gran freno en la señalización apoptótica y
que, por tanto, su grado de expresión en las células sería un determinante
fundamental de la resistencia de las células a la acción de TRAIL. Es por ello,
que decidimos estudiar más en detalle el papel que esta proteína tiene en la
resistencia de células de cáncer de mama a la apoptosis inducida por TRAIL.
1.2 cFLIP juega un papel fundamental en la resistencia de células
de cáncer de mama a la acción de TRAIL.
cFLIP ha sido descrito como proteína clave en la resistencia de células
de tumorales a la apoptosis inducida por TRAIL. Para determinar la
importancia que cFLIP puede tener en la resistencia a la apoptosis inducida
por TRAIL en células de cáncer de mama, decidimos suprimir los niveles de
la proteína mediante ARN de interferencia (siRNA) y estudiar en estas
condiciones la sensibilidad a TRAIL.
Como se observa en la Figura 6, todas las líneas celulares testadas se
sensibilizan a TRAIL cuando los niveles de cFLIP se han disminuido
mediante la transfección de oligos de siRNA específicos para cFLIP, y no
ocurre lo mismo cuando las células se han transfectado con un oligo control
cuya secuencia consta de la misma composición de nucleótidos que el de
cFLIP pero ordenados de forma aleatoria (oligo scrambled o SC),
corroborándose la importancia de esta proteína en la resistencia a TRAIL en
cáncer de mama.
Resultados
110
Figura 6. La bajada de niveles de cFLIP por RNA de interferencia sensibiliza a la apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer de mama. Células BT474 (A), MDA-MB435s (B) y MDA-MB231 (C) fueron transfectadas con el oligo de RNA de interferencia de cFLIP o el oligo control (scrambled) durante 24 horas como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente las células fueron tratadas con TRAIL durante 15 h a las concentraciones indicadas. La apoptosis de determinó mediante la cuantificación de SubG1 por citometría de flujo.Los resultados muestran la media de tres exprerimentos independientes. Los niveles de cFLIP proteína se determinaron mediante western blot tras 24 horas de transfección con los oligos de RNA de interferencia. En la misma membrana y, como control de carga se determinaron los niveles de α-tubulina.
Resultados
111
Existen, al menos 11 isoformas de ARN mensjero de cFLIP, pero sólo
tres se traducen a proteína. Estas son FLIPL, FLIPS y FLIPR, aunque la
expresión de esta última se ha observado principalmente en células Raji[213].
El papel de FLIPS como inhibidor de la apoptosis inducida por receptores de
muerte está bien descrito pero no sucede lo mismo con el de FLIPL, para el
que hay una mayor controversia y se le atribuyen funciones tanto de
inhibidor como de activador de la caspasa-8 en el DISC. Es por ello que
decidimos estudiar qué papel jugaba cada una de estas isoformas en la
resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer de mama.
Así mediante siRNA suprimimos la expresión de cada una de las
isoformas de cFLIP por separado y como se observa en la Figura 7, el grado
de implicación en la resistencia a TRAIL depende de los niveles basales de
expresión de dichas isoformas en cada una de las líneas celulares testadas.
Así en células donde la expresión de ambas isoformas es similar, como en
MDA-MB231, es necesario suprimir los niveles de ambas para sensibilizar a
TRAIL. Sin embargo en otra línea celular como las BT474, donde predomina
la expresión de cFLIPL, sólo eliminando la expresión de este conseguimos
sensibilizar a TRAIL. Llegados a este punto podemos concluir que cFLIP es
una proteína fundamental en la resistencia a la apoptosis inducida por
TRAIL en células de cáncer de mama, puesto que bajando sus niveles de
expresión conseguimos sensibilizar a las células a la acción de TRAIL, lo que
está en consonancia con lo descrito por otros en líneas celulares tumorales de
diferente origen.
Resultados
112
A) B)
Figura 7. Papel de cada una de las isoformas de cFLIP en la resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer de mama. A) MDA-MB231 y BT474 fueron transfectadas con el oligo de RNA de interferencia de cFLIPL, cFLIPS o el oligo control (scrambled) durante 24 horas como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente las células fueron tratadas con TRAIL 500 ng/ml durante 15 h. La apoptosis de determinó mediante la cuantificación de SubG1 por citometría de flujo. B) Los niveles de proteína de cFLIP se determinaron mediante western blot tras 24 horas de transfección con los oligos de RNA de interferencia y en la misma membrana y como control de carga se determinaron los niveles de α-tubulina.
Resultados
113
1.3 Implicación de la mitocondria en la apoptosis inducida por la
sensibilización de células de cáncer de mama a TRAIL.
Para determinar si la mitocondria participa en la apoptosis que se
produce al sensibilizar las células de cáncer de mama a TRAIL, decidimos
utilizar la herramienta del RNA de interferencia y suprimir los niveles de
una proteína implicada en la activación de la vía mitocondrial de apoptosis
inducida por TRAIL, como es Bid, comprobando si el grado de
sensibilización de las células se afectaba. Como se observa en la Figura 8, la
bajada de niveles de Bid mediante RNA de interferencia, bloquea en gran
medida la sensibilización a TRAIL inducida por IFN gamma, Doxorrubicina
y Flavopiridol. Aunque tambiénhay una disminución en la sensibilización a
TRAIL por Roscovitina, ésta no es tan significativa como en los tratamientos
anteriormente citados. Esto puede ser debido a que la Roscovitina tiene un
efecto más pleitrópico afectando a diferentes componentes celulares en su
mecanismo de sensibilización a TRAIL [320]. Por lo tanto podemos concluir
que la mitocondria participa en la apoptosis derivada de la sensibilización
de las células a TRAIL por estos agentes quimioterapeúticos. Además, la
mitocondria también está implicada en la apoptosis que se da en las células
sensibilizadas a TRAIL por la bajada de expresión de cFLIP mediante RNA
de interferencia, como se observa en la Figura 8F lo que nos demuestra el
papel generalizado que tiene la mitocondria en la apoptosis inducida por
sensibilización a TRAIL en células de cáncer de mama.
Resultados
114
Tras este tiempo, las células fueron tratadas con Interferon gamma (10ng/ml) durante 15horas, Doxorrubicina (500ng/ml) durante 7 horas, flavopiridol (100nM) durante 7 horas o Roscovitina (20µM) durante 7 horas. Posteriormente las células se trataron con TRAIL 500ng/ml durante 15 horas, excepto en el caso del interferón gamma donde el tratamiento con TRAIL fue de 24 horas. La apoptosis se determinó mediante la cuantificación de SubG1 por citometría de flujo. Los datos representan la media de tres experimentos independientes. E) Células tumorales de mama MDA-MB231 fueron transfectadas con el oligo de RNA de interferencia de Bid o scrambled como se determina en Materiales y Métodos durante 48 horas. Pasado este tiempo los niveles de Bid se determinaron por western blot. En la misma membrana y, como control de carga, se determinaron los niveles de α-tubulina.
Figura 8. La ruta mitocondrial de apoptosis participa en los mecanismos de sensibilización a TRAIL en células de cáncer de mama. (A-D) Lás células MDA-MB231 fueron transfectadas con el oligo de RNA de interferencia de Bid o el scrambled como se determina en Materiales y Métodos durante 48 horas.
A) B)
C) D)
E)
Resultados
115
Figura 7. La ruta mitocondrial de apoptosis participa en los mecanismos de sensibilización a TRAIL en células de cáncer de mama. F) Las células BT474 fueron co-transfectadas con los oligos de RNA de interferencia para cFLIP y Bid durante 48 horas como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente las células se trataron con TRAIL (500ng/ml) durante 15 horas y la apoptosis se determinó mediante la cuantificación de SubG1 por citometría de flujo. Los resultados muestran la media de tres experimentos independientes.
F)
Resultados
116
2. Papel de cFLIP en la supervivencia celular.
2.1 La disminución de cFLIP por RNA de interferencia induce apoptosis en
células de cáncer de mama.
Durante la realización de los experimentos de siRNA de cFLIP,
observamos una cierta muerte basal en aquellas células a las que les
suprimíamos los niveles de cFLIP, y no ocurría lo mismo en las células
controles o las transfectadas con un oligo control (scrambled o SC). Así
decidimos prolongar el tiempo de transfección de 24 a 72 horas y ver si esta
muerte basal aumentaba o, por el contrario, se mantenía al mismo nivel, con
lo que asumiríamos que la muerte se debía al propio proceso de
transfección.
Como se observa en la Figura 9A, tras 72 horas de transfección con los oligos
de siRNA, la muerte inducida por la pérdida de cFLIP aumenta
significativamente. Al igual que en el proceso de sensibilización, la
eliminación de la isoforma larga en las células BT474, es suficiente para
provocar esta muerte espontánea, sin embargo en células como las MDA-
MB231, donde ambas isoformas se expresan a niveles similares, es preciso
eliminar las dos para inducir la muerte. Esta muerte es además dependiente
de caspasas, puesto que al tratar las células con el inhibidor general de
caspasas benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-(OMe) fluoromethyl ketone (Z-
VAD-fmk) conseguimos bloquearla completamente (Figura 9C). Además al
sobrexpresar FLIPL, también bloqueamos esta apoptosis (Figuara 9D) con lo
que podemos confirmar que la muerte es debida al silenciamiento de la
expresión de cFLIP y no a efectos inespecíficos de los oligos de siRNA.
Resultados
117
Figura 9. Disminuir los niveles de cFLIP mediante siRNA induce apoptosis en células de cáncer de mama. A) Células MDA-MB231, BT474, y EVSA-T fueron transfectadas con los oligos de RNA de interferencia de cFLIPL, cFLIPS o scrambled como se describe en Materiales y Métodos durante 72 horas. La apoptosis se determinó por citometría de flujo mediante la cuantificación de SubG1. Los resultados muestran la media de tres experimentos independientes. (B) Las células MDA-MB231, BT474 y EVSA-T se trataron como en (A) y los niveles de proteína cFLIP se determiaron mediante western blot. En la misma membrana, y como control de carga se determinaron los niveles de α-tubulina.
A) B)
Resultados
118
La inducción de una apoptosis espontánea independiente de ligando
por la bajada de expresión de cFLIP, ha sido descrito recientemente en
células de cáncer [330] [331], por lo que se le atribuye un papel no sólo
antiapoptótico en la señalización por receptores de muerte sino también
como proteína implicada en la supervivencia celular. Por todo ello, en los
Figura 8. Disminuir los niveles de cFLIP mediante RNA de interferencia induce apoptosis en células de cáncer de mama. C) Células tumorales de mama MDA-MB231 y BT474 fueron transfectadas como se describe en Materiales y Métodos con los oligos de RNA de interferencia de cFLIP en presencia o no del inhibidor general de casapasas Z-VAD (50 uM) durante 72 horas. La apoptosis fue determinada por la cuantificación de SubG1 mediante citometría de flujo. Los resultados muestran la media de tres experimentos independientes.
D) Las células MDA-MB231 que sobrexpresan cFLIPL o células MDA-MB231 control (pBabe) fueron transfectadas con el oligo de RNA de interferencia para cFLIP o con el oligo scrambled durante 72 horas. La apoptosis se cuantificó como en (A). Los datos muestran la media de tres experimentos independientes. Los niveles de cFLIP fueron determinados mediante western blot.
C)
D)
Resultados
119
últimos años se está proponiendo a cFLIP como diana terapeútica del cáncer,
pero poco se conoce del papel de cFLIP en la supervivencia y como
regulador de la apoptosis en células no transformadas. Cabe destacar que el
ratones deficientes en el gen cFLIP creados por recombinación homóloga,
mueren durante el período embrionario por defectos en el desarrollo del
corazón. También se ha descrito el papel que FLIP tiene en la proliferación y
activación en células no transformadas, principalmente del sistema inmune.
Por todos estos antecedentes, otro de los objetivos de esta tesis ha
sido estudiar si cFLIP regulaba la apoptosis inducida por TRAIL en células
epiteliales de mama no tumorales MCF-10A y si también en estas células se
producía una apoptosis espontánea como consecuencia de la bajada de
expresión de cFLIP, además de profundizar en el mecanismo molecular que
subyace a esta apoptosis y conocer la repercusión biológica de esta pérdida
de expresión.
2.2 La bajada de expresión de cFLIP por siRNA induce apoptosis en
céleulas epiteliales no transformadas de mama MCF-10A.
Como vemos en la Figura 10A, el silenciamiento de cFLIP sensibiliza a
células epiteliales de mama no transformadas, MCF-10A a la apoptosis
inducida por TRAIL. También observamos que estas células expresan
niveles más altos de cFLIPL que de cFLIPS (Figura 10B), con lo que, al igual
que en las tumorales BT474, el sólo hecho de disminuir la expresión de
cFLIPL sensibiliza a TRAIL. Al igual que en las tumorales, que la bajada de
proteína cFLIPL induce una apoptosis espontánea dependiente de caspasas
(Figura 10C-D) y que se inhibe al sobrexpresar cFLIPL (Figura 10E).
Resultados
120
Figura 10. Disminuir los niveles de cFLIP mediante siRNA induce apoptosis en células epiteliales no transformadas de mama. (A) Las células epiteliales de mama normales transformadas MCF-10A se transfectaron con los oligos de RNA de interferencia de cFLIP o el oligo scrambled durante 72 horas como se describe en Materiales y Métodos.Las últimas 24 horas se mantuvieron en presencia de TRAIL 100ng/ml Pasado este tiempo la apoptosis fue determinada por citometría de flujo.
mediante la cuantificación de SubG1. Los datos representan la media de tres experimentos independientes (B) Las células se trataron como en (A) y los niveles de cFLIP se determinaron por western blot. En la misma membrana y como control de carga se determinaron los niveles de α-tubulina. C-D) Las células se trataron como en (A) en presencia o no del inhibidor general de caspasas Z-VAD (50µM). La apoptosis se cuantificó como en (A). Los datos muestran la media de tres experimentos independientes. E) Células MCF-10A que sobrexpresan FLIPL o las células MCF-10A controles (pBabe) se trataron como en (A). La apoptosis también se cuantificó como en (A). Los resultados muestran la media de tres experimentos independientes. Los niveles de cFLIP se determinaron mediante western blot.
D)
A) B)
C)
E)
Resultados
121
Con el objetivo de estudiar más a fondo el mecanismo molecular por
el que se producía esta muerte espontánea, decidimos comprobar si las
proteínas implicadas en la activación de la ruta extrínseca de apoptosis,
también estaban implicadas en esta muerte.
2.3 La apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP por siRNA
requiere del receptor de TRAIL, TRAILR2.
Tanto las células MCF-10A como las tumorales MDA-MB231
expresan TRAIL-R2 principalmente, y éste es el receptor implicado en la
sensibilización a TRAIL de estas células [165]. Así, decidimos reducir los
niveles de proteína de TRAIL-R2 en MCF-10A mediante RNA de
interferencia, al mismo tiempo que bajamos los de cFLIPL, y comprobamos
que la apoptosis inducida por el silenciamiento de la proteína cFLIPL era
significativamente inhibida (Figua 11A). Estos resultados nos indican que la
muerte inducida por siFLIP está mediada por el receptor de TRAIL TRAIL-
R2. Mediante western blot comprobamos la bajada de expresión de TRAIL-
R2 y cFLIPL (Figura 11B). Para determinar si otro receptor de muerte podría
estar implicado en la inducción de apoptosis mediada por la bajada de
expresión de cFLIP por RNA de interferencia, comprobamos que las células
MDA-MB231 no se sensibilizan a TNF al disminuir los niveles de cFLIP
(Figura 11C), aunque éste es capaz de señalizar para activar NF-kB en estas
células (Figura 11D), con lo que en principio se puede descartar la
implicación del receptor de TNF en la apoptosis espontánea inducida por la
bajada de expresión de cFLIP por siRNA.
Resultados
122
Figura 11. El receptor TRAIL-R2 está implicado en la apoptosis inducida por la disminución de los niveles de cFLIP mediante RNA de interferencia. (A) Las células MCF-10A fueron co-transfectadas con los oligos de RNA de interferencia para cFLIP y TRAIL-R2 durante 72 horas como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente se determinó la apoptosis mediante citometría de flujo por cuantificación de SubG1. Los resultados muestran la media representativa de dos experimentos independientes. (B) Las células fueron tratadas como en (A) y mediante western blot se determinaron los niveles de cFLIP y TRAIL-R2. En la misma membrana y como control de carga se determinaron los niveles de GADPH. (C) Las células MDA-MB231 se transfectaron con los oligos de RNA de interferencia de cFLIP durante 24 horas como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente las células se trataron con TRAIL (500ng/ml las MDA-MB231) o TNF 50ng/ml durante 15 horas. La apoptosis se determinó mediante citometría de flujo por cuantificación de SubG1. Los datos muestran la media de tres experimentos independientes. D) Las células MDA-MB231 fueron transfectadas con el plásmido NF-kBLuc o el plásmido control pXP2 durante 24 horas como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente se tratatron con TNF (50ng/ml) durante 15 horas. La actividad transcripcional de NF-kB medida como actividad luciferasa y expresada como unidades relativas de luciferasa (RLUs), se determinó como se describe en Materiales y Métodos. Los datos muestran la media representativa de dos experimentos.
A) B)
C) D)
Resultados
123
2.4 La apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP es
independiente de ligando.
A continuación investigamos si la bajada de expresión de cFLIP por
siRNA inducía la expresión de TRAIL y la activación autocrina o paracrina
de apoptosis en células de mama. Como se observa en la Figura 12A, la
bajada de cFLIP no provoca cambios en la expresión de TRAIL en células
tumorales BT474. Como control positivo de inducción de TRAIL, tratamos
células MCF-7 con interferón gamma que provoca un aumento en los niveles
de expresión de TRAIL [332]. Además, mediante array de ARN
comprobamos que la bajada de expresión de cFLIP no inducía cambios
significativos en la expresión génica de TRAIL ni de otros genes
relacionados con apoptosis en células tumorales BT474. Aunque la bajada de
expresión de cFLIP no provocaba un aumento en los niveles de expresión de
TRAIL, no podíamos descartar un aumento en su secreción al medio. Por
ello, decidimos bloquear la acción de TRAIL extracelular mediante el
tratamiento de la células con una proteína de fusión entre el receptor TRAIL-
R2 y el dominio Fc de las inmunoglobulinas (TRAILR2-Fc) que tiene la
capacidad de unirse al TRAIL del medio impidiendo que éste, a su vez, se
una al receptor TRAIL-R2 de la membrana plasmática, evitando así su
activación.
Así comprobamos que las apoptosis inducida por siFLIP se producia
independientemente del bloqueo de la unión de TRAIL a su receptor en
membrana TRAIL-R2 (Figura 12B). Sin embargo el anticuerpo TRAIL-R2-Fc
era capaz de inhibir la apoptosis inducida por TRAIL cuando éste era
añadido al medio extracelular como se ve en la Figura 12 C.
Estos resultados nos indican que la apoptosis inducida por siFLIP es
independiente del ligando de muerte TRAIL.
Resultados
124
Figura 12. La apoptosis inducida por la bajada de niveles de FLIP por RNA de interferencia es independiente del ligando de muerte TRAIL. (A) Las células BT474 se transfectaron con los oligos de siRNA de cFLIP, cFLIPL o el oligo scrambled durante72 h
B)
C)
A)
como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente mediante western blot se analizaron los niveles de cFLIP y de TRAIL. Como control positivo de inducción de TRAIL, las células MCF-7 fueron tratadas con interferón gamma (10ng/ml) durante 24 horas. En la misma membrana y como control de carga se analizaron los niveles de α-tubulina. B) Las células MCF-10A fueron transfectadas con los oligos de RNA de cFLIPL o el oligo scrambled como se describe en Materiales y Métodos durante 72 horas. A las 24 horas de transfección de trataron con el anticuerpo TRAIL-R2-Fc. La apoptosis se determinó mediante citometría de flujo por cuantificación de SubG1. Los datos muestran la media de tres experimentos independientes. (C) Las células MCF-10A fueron tratadas con TRAIL 100ng/ml en presencia o ausencia de TRAIL-R2-Fc durante 24 horas. Posteriormente la apoptosis se determinó mediante citometría de flujo por cuantificación de SubG1. Los datos muestran la media de tres experimentos independientes.
Resultados
125
2.5 Los componentes del DISC de TRAIL, FADD y Caspasa-8 participan
en la apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP.
La unión de TRAIL a TRAIL-R2 induce la formación del DISC que se
constituye con el propio receptor, la proteína adaptadora FADD y caspasa-8
con la consecuente activación de ésta. Para estudiar si los componentes del
DISC de TRAIL eran necesarios para la apoptosis inducida por siFLIP,
decimos eliminar cada una de estas proteínas por separado y ver el efecto
que esto causaba en la muerte inducida por siFLIP. Para comprobar la
participación de FADD, disminuimos los niveles de la proteína mediante
siRNA y comprobamos que, tanto en células tumorales como en células no
transformadas, FADD participaba en la muerte, porque al reducir sus
niveles la apoptosis inducida por siFLIP se inhibía (Figura 13A). Además, la
sobreexpresión de una forma dominante negativa de FADD mediante
infección retroviral en células MCF-10A también inhibía la apoptosis
inducida por siFLIP (Figura 13 C).
Del mismo modo estudiamos el requerimiento de la caspasa-8.
Mediante siRNA disminuimos la expresión de caspas-8 como se observa en
la Figura 14A y comprobamos que la muerte inducida por la bajada de
expresión de cFLIP por RNA de interferencia se inhibía totalmente tanto en
células MCF-10A como en células tumorales BT474 (Figura 14B).
Resultados
126
Figura 13. FADD participa en la apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP por siRNA. (A) Las células BT474 y MCF-10A fueron co-tansfectadas con los oligos de RNA de interferencia de cFLIP y FADD durante 72 horas como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente se determinó la apoptosis mediante citometría de flujo por cuantificación de células hipodiploides. Los datos muestran la media de tres experimentos independientes. (B) Las células BT474 y MCF-10A se trataron como en (A) y los niveles de proteína de cFLIP y FADD se analizaron mediante western blot. (C) Las células MCF-10A que sobrexpresan una isoforma dominante negativa de FADD (dnFADD) fueron tratadas como en (A) y la apoptosis también fue determinada como en (A). Los datos muestran la media de tres experimentos independientes.
A) B)
C)
Resultados
127
2.6 La muerte inducida por la bajada de expresión de cFLIP siFLIP
requiere la ruta mitocondrial de apoptosis.
A continuación, quisimos comprobar si la mitocondria participaba en
esta apoptosis y para ello disminuimos los niveles de expresión de Bid,
proteína proapoptótica que se procesa por caspasa-8 para dar lugar a su
forma truncada activa y participa en la señalización mitocondrial de
Figura 14. Caspasa-8 es necesaria para la apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP por siRNA. (A) Las células BT474 y MCF-10A fueron co-tansfectadas con los oligos de RNA de interferencia de cFLIP y Caspasa-8 o con el oligo scrambled durante 72 horas como se describe en Materiales y Métodos. Los niveles de proteína de cFLIP y FADD se analizaron mediante western blot. En la misma membrana y como control de carga se analizaron los niveles de GAPDH. B) Las células BT474 y MCF-10A se trataron como en (A) y además las células BT474 fueron tratadas con 500ng/ml de TRAIIL a las 48 horas de transfección. Posteriormente se determinó la apoptosis mediante citometría de flujo por cuantificación de SubG1. Los datos muestran la media de tres experimentos independientes.
A)
B)
Resultados
128
apoptosis inducida por TRAIL. Como se observa en la Figura 15A, la bajada
de expresión de Bid mediante RNA de interferencia, inhibe la apoptosis
inducida por la bajada de expresión de cFLIP. Igualmente comprobamos que
la sobrexpresión de la proteína antiapoptótica Bcl2 en células MCF-10A
mediante infección retroviral también inhibía la apoptosis inducida por la
bajada de expresión de cFLIP (Figura 15C). Estos datos nos indican que la
ruta mitocondrial de apoptosis participa en la apoptosis inducida por la
bajada de expresión de cFLIP mediante RNA de interferencia.
Todos estos datos demuestran que la ruta de apoptosis de TRAIL
está implicada en la apoptosis inducida por siFLIP, aunque como hemos
mostrado parece independiente del ligando TRAIL. Estos resultados
puenden indicar al menos dos posibles mecanismos. Uno, que los
componentes del DISC de TRAIL esten asociados, aún en ausencia del
ligando, y que la unión de TRAIL al receptor o bien una variación en los
niveles de sus componente como, por ejemplo, una bajada en la expresión de
cFLIP, induzca la activación de caspasa-8 y la consecuente cascada
apoptótica. Por otra parte puede ocurrir que al igual que con TNF [104] o Fas
[105], los receptores de TRAIL estén pre-asociados en condiciones basales
[106] y que una bajada en la expresión de cFLIP favorezca la asociación de
FADD y caspasa-8 a este. Por otra parte, se ha descrito que FLIPL se
encuentra asociado al receptor TRAIL-R2 en condiciones normales, y que la
inhibición de esta asociación induce apoptosis independiente de ligando
[333]. Para determinar qué ocurre con los componentes del DISC de TRAIL,
y si hay asociación entre ellos en ausencia de ligando cuando bajamos la
expresión de cFLIP, decidimos inmunoprecipitar TRAIL-R2 en células
donde bajamos los niveles de cFLIPL mediante infección lentiviral de un
shRNA para cFLIPL, o en células infectadas con un shRNA control
(scrambled). Sin embargo no hemos sido capaces de detectar asociación del
Resultados
129
receptor TRAIL-R2 con ninguno de los componentes del DISC de TRAIL en
ausencia de ligando, ni en células infectadas con el shScrambled (Control) ni
en las células infectadas con el shFLIPL. Es importante indicar que la
apoptosis que se induce por la bajada de expresión de cFLIPL es un proceso
lento ya que tras 72 horas de inhibir su expresión el porcentaje de células
apoptóticas que detectamos está en el mejor de los casos en torno al 50%, por
lo que esta aproximación metodológica puede no ser la más adecuada para
detectar asociación entre proteínas. Otra aproximación metodológica más
directa sería la detección de la asociación de los componentes del DISC de
TRAIL mediante inmunofluorescencia, pero en cualquier caso, los datos
obtenidos harían referencia a una co-localización de estos y no asegurarían
una asociación física entre ellos.
Por todo esto sólo podemos concluir que la bajada de expresión de
cFLIP tanto en células tumorales como normales trasformadas de mama,
induce apoptosis. Esta apoptosis requiere de los componentes del DISC de
TRAIL, TRAIL-R2, FADD y Caspasa-8 pero es independiente del ligando
TRAIL. También demostramos que esta apoptosis activa la ruta
mitocondrial, puesto que la inhibición de la expresión de la proteína
proapoptótica Bid, o la sobrexpresión de la antiapoptótica Bcl-2 bloquea
parcialmente dicha apoptosis.
Resultados
130
Figura 15. La ruta mitocondrial de apoptosis participa en la muerte inducida por la bajada de expresión de cFLIP por siRNA. (A) Las células MCF-10A fueron co-tansfectadas con los oligos de RNA de interferencia de cFLIPL y Bid o con el oligo scrambled durante 72 horas como se describe en Materiales y Métodos.
A) B)
C)
Posteriormente se determinó la apoptosis mediante citometría de flujo por cuantificación de células hipodiploides. Los datos muestran la media de tres experimentos independientes. (B) Las células BT474 y MCF-10A se trataron como en (A) y los niveles de proteína de cFLIP y Bid se analizaron mediante western blot. En la misma membrana y como control de carga se analizaron los niveles de GAPDH. (C) Las células MCF-10A que sobrexpresan Bcl-2 se transfectaron con el oligo de RNA de interferencia de cFLIPL o con el oligo scrambled durante 72 horas como se describe en Materiales y Métodos. La apoptosis se determinó como en (A). Los datos muestran la media representativa de dos experimentos Los niveles de expresión de Bcl-2 se determinaron mediante western blot.
Resultados
131
2.7 cFLIP regula la morfogénesis de células epiteliales de mama.
Los sistemas de cultivos tridimensionales (3D) de células epiteliales,
que permiten que las células se reorganicen en estructuras similares a las
que forman in vivo, han emergido como modelos de estudio de las funciones
y rutas de los genes tumorales en un contexto biológico más relevante. Bajo
las condiciones de cultivo 3D, las células normales epiteliales proliferan y se
organizan formando estructuras esféricas denominadas comúnmente acinos.
Éstos se caracterizan por tener un lumen central rodeado de una capa de
células polarizadas, poseer un preciso control del crecimiento y la
proliferación celular y por el establecimiento de una membrana basal [303].
Está descrito que las células de cáncer de mama no forman acinos cuando
crecen en 3D, sino que se desarrollan como estructuras de células no
polarizadas y con una limitada diferenciación [303]. Estos experimentos
muestran las diferencias fenotípicas del desarrollo de células epiteliales
normales y tumorales en 3D, diferencias que no se aprecian en los cultivos
en 2D. El uso de los sistemas 3D ha permitido conocer múltiples procesos y
moléculas reguladoras que están implicadas en la formación y el
mantenimiento del espacio luminal. Recientemente se ha descrito un papel
para TRAIL en la formación de lumen de células epiteliales no
transformadas MCF-10A [164].
Por todo ello, y conociendo la importancia de cFLIP en la ruta de
señalización de TRAIL, así como por su implicación en la supervivencia de
células epiteliales de mama, decimos estudiar si cFLIP participaba en el
proceso de morfogénesis de células MCF-10A.
Lo primero que quisimos determinar fue si los niveles de proteína de cFLIP
variaban durante el proceso de morfogénesis. Para ello, células MCF-10A se
sembraron en medio con Matrigel y se recogieron muestras a diferentes días
del proceso para analizar por western-blot los niveles de cFLIP. Cómo se
Resultados
132
observa en la Figura 16A, los niveles de cFLIP van aumentando a medida
que aumenta el tiempo de cultivo en 3D.
La formación del lumen durante la morfogénesis de estructuras
acinares implica la muerte celular por anoikis de las células que pierden la
adhesión al sustrato [301]. Esta muerte por anoikis se puede reproducir en
experimentos de cultivo celular en placas recubiertas del polímero poli-
HEMA. En estas condiciones existe una muerte celular dependiente del
tiempo de incubación. De esta forma, el cultivo de células MCF-10A en
suspensión es una metodología que se ha utilizado frecuentemente para
determinar los cambios bioquímicos que sufren las células del lumen
durante el desarrollo de la morfogénesis y que determinan su muerte. Por
ello, decimos cultivar las células MCF-10A en suspensión y comprobar si los
niveles de expresión de cFLIPL variaban. Como se observa en la Figura 16B,
los niveles de proteína de cFLIPL aumentan tras 24 ó 48 en suspensión.
A) B)
Figura 16. Los niveles de cFLIPL aumentan durante la morfogénesis de células epiteliales de mama MCF-10A. (A) Lisados celulares procedentes de acinos a los días indicados se prepararon como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente por western blot se analizaron los niveles de cFLIPL. En la misma membrana y como control de carga se analizaron los niveles de actina. (B) Las células MCF-10A se mantuvieron en suspensión durante 24 y 48 horas como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente los lisados celulares fueron analizados mediante western blot para determinar los niveles de las proteína indicadas.
Resultados
133
También se puede observar un aumento en la expresión de la proteína
“BH3-only” Bim, al mismo tiempo que disminuye los niveles de p-ERK
como está descrito que ocurre en este proceso [90].
Como se ha demostrado en esta tesis, cFLIP es una proteína necesaria
para la supervivencia de células MCF-10A y además inhibe la señalización
apoptótica de TRAIL que, como hemos comentado anteriormente, parece
tener un papel en la morfogénesis en 3D de estas células. Por todo ello
decidimos sobrexpresar cFLIP en células MCF-10A, y comprobar mediante
ensayos en 3D, si el aumento en la expresión de cFLIP afecta al proceso de
formación del lumen durante la morfogénesis. Así, células MCF-10A que
sobrexpresan FLIPL (pBabe-FLIPL), FLIPS (pLPCX-FLIPS) o el vector vacío
(pBabe), se sembraron en medio con Matrigel y se determinó el porcentaje
de acinos que mantenían células en el lumen durante el proceso de
morfogéneisis. Como se observa en la Figura 17, las células que
sobrexpresan alguna de las isoformas de cFLIP desarrollan acinos que tienen
un retraso en el vaciamiento de lumen, comparados con las acinos
desarrollados a partir de células control. Esto nos indica que la
sobrexpresión de cFLIP afecta al correcto vaciamiento del lumen durante el
proceso de morfogénesis de células MCF-10A.
Resultados
134
Datos de array de ARN no mostrados, indican que la sobrexpresión
de cFLIPL no afecta a la transcripción génica generalizada por lo que un
aumento de actividad NF-kB y, por tanto, de genes de supervivencia
mediado por un aumento en la expresión de FLIPL no parece ser la causa de
que las células del lumen sean más resistente a la muerte por anoikis.
Mediante western blot también hemos determinado que las células que
Figura 17. La sobrexpresión de cFLIP impide el correcto vaciamiento del lumen durante la morfogénesis de células epiteliales de mama MCF-10A. Células MCF-10A que sobrexpresan establemente cFLIPL( pBabe-FLIPL) , cFLIPS (pLPCX-FLIPS) o las células controles (pBabe) se utilizaron para ensayos de morfogénesis en 3D como se describe en Materiales y Métodos (A). (B) El porcentaje de acinos con 4 o menos núcleos de células en el lumen fue medido a los tiempos indicados durante la morfogénesis. Los datos muestran la media de tres experimentos independientes. En cada experimento se analizaron al menos 100 acinos.
Resultados
135
sobrexpresan cFLIPL (Figura 18), no tienen aumentada la señalización de
NF-kB o ERK. Por otra parte está descrito que cFLIP participa en la
resistencia de las células a la muerte por anoikis [334] [335], pero nosotros no
hemos sido capaces de determinar experimentalmente si las células MCF-
10A que sobrexpresan cFLIPL son más resistentes a la apoptosis inducida
por anoikis que las células control, debido a que durante el periodo en
suspensión estas células también sufren otro tipo de muerte celular
independiente de caspasas denominado entosis [336], que ocurre al mismo
tiempo que la apoptosis y que puede enmascarar el fenómeno apoptótico,
dificultando con ello la cuantificación de la apoptosis que se da en estas
células en suspensión.
TRAIL induce autofagia en células MCF-10A [164] [165] y cFLIP
inhibe la señalización apoptótica de TRAIL pero no la autofágica [165]. Por
otra parte, las células de lumen durante la morfogénesis sufren autofagia
como mecanismo de supervivencia ante la muerte inducida por anoikis. Si la
sobreexpresión de cFLIP está favoreciendo que, además de esta autofagia
Figura 18. La sobrexpresión de cFLIP impide el correcto vaciamiento del lumen durante la morfogénesis de células epiteliales de mama MCF-10A. La expresión de p-AKT, p-ERK y p-NF-kB fue determinada por western blot en células MCF-10A que sobrexpresan cFLIPL (pBabe-FLIPL) o en células controles (pBabe). En la mima membrana y como control de carga se determinaron los niveles de GAPDH.
Resultados
136
inducida por la perdida de adhesión a la matriz extracelular, se favorezca la
inducida por TRAIL y estos efectos pueden resultar en un aumento de la
supervivencia de las células del lumen y por tanto en un retraso del
vaciamiento luminal, es un tema que requiere de un estudio más detallado y
en profundidad.
De manera inversa, decidimos estudiar el efecto de la supresión de la
expresión de cFLIPL en células MCF-10A tenía sobre la morfogénesis de
dichas células en cultivos 3D. Por los datos mostrados en esta tesis sabemos
que suprimir la expresión de cFLIPL en estas células induce apoptosis, pero
todos estos experimentos han sido realizados en cultivos en monocapa, así
que no sabíamos si al realizar los experimentos en cultivos 3D ocurriría lo
mismo o, por el contrario, al estar las células en un medio rico en factores de
crecimiento y matriz extracelular este efecto se suprimiría. Así, disminuimos
la expresión de cFLIPL mediante infección lentiviral de un shRNA de
cFLIPL. El vector lentiviral codifica igualmente para la proteína fluorescente
GFP, por lo que la expresión de esta sería indicativa a su vez de la expresión
del shRNA. Así tras 48 horas de infección de células MCF-10A en monocapa,
nos quedamos con las células viables que aún seguían adheridas al sustrato.
En esta población celular cuantificamos el porcentaje de células apoptóticas
y el porcentaje de expresión de GFP. Además realizamos un análisis por
western blot de la expresión de cFLIPL en estas células (Figura 19A-C). Tras
determinar que estas células expresaban niveles muy resucidos de cFLIPL y
el porcentaje de apoptosis era menor del 5%, procedimos a realizar el cultivo
en 3D y estudiar la morfogénesis. Como se puede observar en la Figura 19
(D-E), en el dia 10 del proceso, el número de acinos positivos para GFP y por
tanto que expresan el shRNA era claramente menor en las células que
expresaban el shFLIPL que las que expresaban el shScrambled (Control),
probablemente debido a que las células que expresan el shFLIPL mueren por
Resultados
137
apoptosis no pudiendo proliferar para desarrollar los acinos. Estos datos nos
indican que al igual que ocurre en cultivo en monocapa, las células MCF-
10A requieren de la expresión de cFLIP para su supervivencia,
independientemente de que en cultivos en 3D las células tengan un mayor
aporte de factores de crecimiento que puedan activar rutas de
supervivencia para inhibir la apoptosis inducida por la bajada de
expresión de cFLIP.
Figura 19. cFLIPL es necesario para la supervivencia de células epiteliales de mama MCF-10A no solo en cultivos en monocapa (2D) sino también en cultivos en 3D. Células MCF-10A se infectaron con un shRNA para cFLIPL (pLVTHM-FLIPL) o con un shRNA control (pVLTHM-Scrambled) durante 48 horas como se describe en Materiales y Métodos.
Pasado este tiempo, se utilizaron las células que aún estaban adheridas al sustrato para determinar la apoptosis por citometría de flujo mediante cuantificación de SubG1(A), analizar el porcentaje de expresión de GFP mediante citometría de flujo (B), analizar por western blot los niveles de expresión de cFLIP (C) o realizar un ensayo de morfogénesis en 3D (D) como se describe en Materiales y Métodos.
A) B)
C)
Resultados
138
Puesto que la apoptosis inducida por la bajada de expresión de cFLIP
también se da en células tumorales de mama, resultados mostrados en esta
tesis y [330], decidimos extender el estudio de morfogénesis de células que
Figura 19. cFLIPL es necesario para la supervivencia de células epiteliales de mama MCF-10A no solo en cultivos en monocapa (2D) sino también en cultivos en 3D. (E) El porcentaje acinos con expresión positivos para la expresión de GFP fue analizado en el dia 10 de la morfogénesis. Los resultados muestran la media representativa de dos experimentos independientes. En cada experimento al menos 100 acinos fueron analizados.
D)
E)
Resultados
139
no expresana cFLIP a las células tumorales MCF-7. Las células tumorales de
mama MCF-7 cuando crecen en matrigel no desarrollan acinos, sino unas
estructuras esferoides de células no polarizadas sin lumen central y sin
inhibición de la proliferación [337]. Como se observa en la Figura 20, al
igual que en las células MCF-10A, la expresión de cFLIPL es necesaria para
la proliferación y formación de las estructuras esferoides, ya que hay una
disminución significativa de estas estructuras en células GFP positivas que
expresan el shFLIP.
Figura 20. cFLIPL es necesario para la supervivencia de células de cáncer de mama MCF-7 no solo en cultivos en monocapa (2D) sino también en cultivos en 3D. Células MCF-7 se infectaron con un shRNA para cFLIPL (pLVTHM-FLIPL) o con un shRNA control (pVLTHM-Scrambled) durante 48 horas como se describe en Materiales y Métodos. Pasado este tiempo, se utilizaron las células que aún estaban adheridas al sustrato para determinar la apoptosis por citometría
A) B)
C)
de flujo mediante cuantificación de la externalización de la fosfatidilserina mediante tinción con Anexina V FLUOS (A), analizar el porcentaje de expresión de GFP mediante citometría de flujo (B), analizar por western blot los niveles de expresión de cFLIP (C) o realizar un ensayo de morfogénesis en 3D (D) como se describe en Materiales y Métodos
Resultados
140
Figura 20. cFLIPL es necesario para la supervivencia de células de cáncer de mama MCF-7 no solo en cultivos en monocapa (2D) sino también en cultivos en 3D.. (E) El porcentaje acinos con expresión positivos para la expresión de GFP fue analizado en el dia 10 de la morfogénesis. Al menos 100 acinos fueron analizados.
D)
E)
Resultados
141
3. Regulación de la expresión de cFLIP.
Todos los datos mostrados en esta tesis nos llevan a la conclusión
general del importante papel de cFLIP en células epiteliales de mama,
tumorales o no, en cuanto a la supervivencia celular y como regulador de la
apoptosis mediada por el ligando de muerte TRAIL. Por ello es de gran
relevancia conocer los mecanismos de regulación de los niveles basales de
expresión de cFLIP. Está descrito que cFLIP es una proteína de vida media
corta, cuya degradación está mediada por el sistema
ubiquitinación/proteasoma [216]. Por todos estos antecedentes y para
profundizar en el mecanismo que mantiene los niveles basales de cFLIP en
las células, decidimos estudiar, por una parte, cómo se regula la degradación
de cFLIP y por otra, cómo se regula su síntesis.
3.1 Regulación de la degradación de cFLIP.
Para determinar si el proteasoma está implicado en la degradación
de cFLIP en células de mama, tratamos células MCF-10A y MDA-MB231
con el inhibidor de la síntesis de proteína cicloheximida y, al mismo
tiempo, tratamos con el inhibidor del proteasoma MG-132. Como se
observa en la Figura 21, tras tres horas de tratamiento con cicloheximida se
ha perdido casi la totalidad de la proteína, y esta pérdida se ve bloqueada
en presencia del inhibidor de proteasoma. Estos resultados se confirmaron
utilizando epoxomicina como inhibidor del proteasoma.
Resultados
142
El mecanismo de degradación de proteínas por el proteasoma implica
la ubiquitinación previa de las proteínas a degradar. Esto significa que cFLIP
debe ubiquitinarse, lo cual ha sido descrito [216] y para ello requiere de una
proteina E3-ubiquitin ligasa específica. Se conocen pocas proteínas con
actividad E3-ubiquitin ligasas que puedan tener como proteína diana a
cFLIP. Recientemente se ha descrito a ITCH como la E3-ubiquitin ligasa de
cFLIPL que promueve la degradación proteasomal de éste tras el
tratamiento con TNF [116]. Por ello decidimos comprobar si esta proteína
era también la E3-ubiquitin ligasa de cFLIP en condiciones basales. Así,
inhibimos la síntesis de cFLIP mediante cicloheximida, cuando los niveles de
ITCH estaban reducidos por siRNA (utilizamos dos siRNA diferentes) y
comprobamos si en estas condiciones la degradación de cFLIP se bloqueaba.
Figura 21. La degradación de los niveles basales de cFLIP es mediada por el proteasoma. Células MCF-10A (A) o MDA-MB231 (C) se trataron con el inhibidor del proteasoma MG-132 a las dosis indicadas una hora antes del tratamiento con el inhibidor de la síntesis de proteína cicloheximida (5µg/ml). La cicloheximida se mantuvo durante 3 horas y posteriormente los niveles de cFLIP se analizaron mediante western blot. En la misma membrana y como control de carga se analizaron los niveles de GAPDH (A) y α-tubulina (C). (B) células MCF-10A se trataron con los inhibidores del proteasoma MG-132 (50µM) y Epoxomicina (200nM) una hora antes del tratamiento con cicloheximida (5 µg/ml). La cicloheximida se mantuvo durante 3 horas y posteriormente los niveles de cFLIP se analizaron mediante western blot. En la misma membrana y como control de carga se analizaron los niveles de GAPDH.
A) B) C)
Resultados
143
Como se observa en la Figura 22 A-B, aunque los niveles de ITCH están muy
reducidos, cFLIP sigue degradándose. Esto nos lleva a la conclusión de que
ITCH no es probablemente la proteína E3-ubiquitin ligasa responsable de
mantener los niveles basales de expresión de cFLIP en estas células.
Dado este inesperado resultado, decidimos estudiar si alguna de las
proteínas con actividad E3-ubiquitin ligasas que en la literatura se asocian a
cFLIP o a proteínas relacionadas con este, podrían ser la responsable de la
ubiquitinación para la degradación de cFLIP en condiciones basales. Por ello
decidimos testar si Cul-3 (E3-ubiquitin ligasa de caspasa-8), MULE (E3-
ubiquitin ligasa de Mcl-1), XIAP (recientemente se han descrito funciones
Figura 22. Estudio de la implicación de la proteína E3-ubiquitin ligasa ITCH en la degradación proteasomal de cFLIP. Células MCF-10A fueron transfectadas con oligos de siRNA para ITCH, o con el oligo scrambled (A-B) durante 48 horas como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente las células se trataron con cicloheximida (5µg/ml) durante 3 horas y los niveles de cFLIP se determinaron por western blot. De igual modo se comprobó que los niveles de ITCH. Como control de carga se midieron los niveles de GAPDH.
A) B)
Resultados
144
ubiquitin ligasa para los IAPs durante la señalización por receptores de
muerte [338] [118]), y TRAF2 (se ha descrito que puede unirse cFLIP y
además tiene actividad E3-ubiquitin ligasa) [278], podrían tener como
proteína diana de ubiquitinación a cFLIP. Así, disminuimos los niveles de
dichas proteínas mediante siRNA y comprobamos si al inhibir la síntesis de
cFLIP, su degradación se bloquea. Como se observa en la Figura 23, la
degradación de cFLIP no es bloqueada por la bajada en la expresión de
Figura 23. Estudio de la implicación de diferentes proteínas con actividad E3-ubiquitin ligasa en la degradación proteasomal de cFLIP. Las líneas celulares indicadas en la figura, se transfectaros con oligos de siRNA para Cul-3 (A), XIAP (B), RIP, TRAF2 (C), Mule (D,E,F,) o el oligo scrambled durante 48 horas como se describe en Materiales y Métodos. Tras este tiempo, las células se trataron con cicloheximida (5µg/ml) durante 3 horas y los niveles de cFLIP se determinaron por western blot. Como control de carga se midieron los niveles de GAPDH. F) Para comprobar si los nivles de MULE disminuían con el siRNA, realizamos un ensayo funcional donde células MDA-MB 231 fueron trasfectadas con oligos de siRNA para MULE o con el oligo scrambled durante 48 horas como se describe en Materiales y Métodos. Pasado este tiempo se trataron con Nocodazol (400ng/ml) durante 24 horas. Los niveles de cFLIP y MCL1 se analizaron por western blot, ya que está descrito que MULE es la ubiquitin ligasa de MCL1, por lo tanto una bajada de expresión de MULE provoca una acumulación de MCL1 o una no degradación de esta por Nocodazol.
A) B) C)
D) E) F)
Resultados
145
ninguna de las proteínas testadas, lo que nos indica que en principio,
ninguna de estas proteínas con actividad E3-ubiquitin ligasa responsable de
la degradación de cFLIP por el proteasoma en condiciones basales.
3.2 Regulación de la síntesis de cFLIP.
Se ha descrito que la expresión inducible de cFLIP en células de
cáncer de mama está regulada principalmente por la ruta de PI3K/AKT, a
través del factor de trascripción FOXO3A [246]. Por ello decidimos estudiar
si el RNA mensajero de cFLIP (cFLIPL y cFLIPS) se afectaba al inhbir la ruta
de PI3K-AKT con el inhibidor específico LY294002. Como se observa en la
Figura 24A, en diferentes líneas celulares de cáncer de mama, la inhibición
de la ruta PI3K-AKT induce una bajada en los niveles de ARN mensajero de
FLIPS, pero no de cFLIPL que tras 8 horas de tratamiento incluso parece que
aumentan. Con estos datos sobre el efecto de la inhibición de la ruta de
PI3K-AKT sobre el ARN mensajero de cFLIP, decidimos analizar cómo se
afectaba la proteína. Como se observa en la Figura 24B, tras 4 horas de
tratamiento con diferentes dosis de LY294002, se induce una bajada de los
niveles de proteína cFLIPS, lo que se corresponde con la bajada del ARN
mensajero. Sin embargo y, aunque es más leve, también se produce una
disminución en los niveles de proteína cFLIPL, lo que no tiene relación con
los efectos observados sobre el ARN mensajero. Además resulta bastante
sorprendente, que a la dosis de LY294002 de 10µM en la que la ruta de PI3K-
AKT se encuentra inhibida, esto es, se inhibe la fosforilación de AKT, los
niveles de proteína no se vean afectados.
Resultados
146
Por ello, y para determinar si el efecto del LY294002 sobre cFLIP era
específico o no de la inhibición de la ruta PI3K-AKT, decidimos utilizar otro
inhibidor de la ruta como es wortmanina. En este caso (Figura 25A), los
niveles de proteína de cFLIP no se afectan como con LY294002, aunque en
ambos casos la ruta PI3K/AKT está inhibida como se determina por la
bajada de fosforilación de AKT. Estos resultados se confirmaron utilizando
un compuesto análogo estructuralmente al LY294002, el LY303511 con una
reducida actividad como inhibidor de la fosforilación de AKT.
Figura 24. LY294002 regula los niveles de ARN mensajero y proteína de cFLIP en células de cáncer de mama. A) Diferentes líneas celulares de cáncer de mama fueron tratadas con LY294002 (50 µM) durante los tiempos indicados. Los niveles de ARN mensajero de cFLIPL y cFLIPS se determinaron mediante RT-PCR y RT-PCR cuantitativa como se describe en Materiales y Métodos. B) Células MDA-MB231 se trataron con las dosis indicadas de LY294002 durante 4 horas y los niveles de cFLIP y p-AKT se determinaron por western blot.
A)
B)
Resultados
147
Como se observa en la Figura 25B, aunque LY303511 es capaz de inhibir
parcialmente la fosforilación de AKT, no consigue el grado de inhibición de
la ruta como LY2094002 y sin embargo el efecto sobre cFLIP es el mismo.
Con estos datos confirmamos que el efecto del LY294002 sobre los niveles de
cFLIP es independiente de su actividad como inhibidor de la ruta PI3KAKT.
Por tanto, para corroborar la no participación de la ruta PI3K/AKT en la
regulación de la síntesis de cFLIP, decidimos sobrexpresar en las células una
proteína AKT constitutivamente activa (Myr-AKT) que mantiene la ruta
activada, o una proteína dominante negativa de AKT (dnAKT) que, por el
contrario, inhibe la ruta. Como se observa en la Figura 26A activando la ruta
de PI3-K/AKT mediante la transfección de la proteína constitutivamente
activa de AKT, no conseguimos aumentar los niveles de cFLIP. Por el
contrario, la transfección de las células con la proteína dominante negativa
Figura 25. La disminución de los niveles de proteína de cFLIP por LY294002 es independiente de la inhibición de la ruta PI3K-AKT. (A) Células MDA-MB231 fueron tratadas con los inhibidores de PI3K-AKT a las dosis indicadas durante 4 horas y los niveles de proteína cFLIP y p-AKT se determinaron por western blot. (B) Células MDA-MB231 se trataron con LY294002 (50µM), LY303511 (50µM ) y wortmanina (100nM) durante 4 horas. Los niveles de proteína de cFLIP y p-AKT se determinaron por western blot.
A) B)
Resultados
148
de AKT no consigue bajar los niveles de cFLIP (Figura 26B), aunque la ruta
se encuentra inhibida, como lo muestra la bajada de sustratos fosforilados de
AKT tras el tratamiento con insulina en células donde se expresa el
dominante negativo.
Así concluimos que la ruta PI3-K/AKT no participa en la regulación
de los niveles basales de cFLIP en células de cáncer de mama.
Figura 26. La regulación de cFLIP en células tumorales de mama es independiente de la actividad PI3K/AKT. Células MDA-MB231 fueron electroporadas con construcciones constitutivamente activa (A) y dominante negativa (B) de AKT como se describe en Materiales y Métodos. Los niveles de cFLIP y el estado de fosforilación de AKT se determinó mediante western blot.
A) B)
Resultados
149
Por otra parte, la activación de la ruta de NF-kB puede derivar en el
aumento de expresión de cFLIP [254] [255]. En estos trabajos se describe
cómo el aumento de actividad de NF-kB mediante TNF o LPS aumentan los
niveles de cFLIP y con ello la resistencia de las células a la apoptosis
inducida por TRAIL o Fas ligando. En células de glioblastoma, la resistencia
a la apoptosis inducida por TRAIL está determinada por el aumento de
cFLIPS mediado por mTOR [193]. La inhibición de la ruta por rapamicina,
provoca una bajada en los niveles de cFLIPs, al no permitir la traducción del
ARN mensajero de cFLIPS a proteína, permitiendo la sensibilización de estas
células a la apoptosis inducida por TRAIL. La caseina quinasa 2, también
controla la sensibilidad de células de carcinoma endometrial a la apoptosis
inducida por TRAIL o Fas ligando, por regular los niveles de cFLIP [267].
Con estos antecedentes decidimos utilizar inibidores estas rutas y
comprobar si alguna era la responsable del mantenimiento de los niveles
basales de expresión de cFLIP en células de cáncer de mama. Así utilizamos
BMS 345541 como inhibidor de NF-kB, rapamicina como inhibidor de m-
TOR y TBB como inhibidor de la caseina quinasa 2. Como se ve en la Figura
27, sólo el BMS 345541 parece tener un claro efecto sobre los niveles de
cFLIP. Si este efecto se da también a nivel del ARNm y si es un efecto
específico de inhibir la ruta y no un efecto inespecífico del inhibidor, necesita
de un estudio más detallado.
Resultados
150
Figura 27. Regulación de los niveles de expresión de cFLIP por los inhibidores de diferentes rutas de señalización. A) Células MDA-MB231 se trataron con rapamicina (100nM) durante los tiempos indicados. Los niveles de cFLIP se analizaron mediante western blot. (B) Células MDA-MB231 se trataron con rapamicina (100nM) 30 minutos, 4 horas o 8 horas antes de tratar con insulina (10µg/ml) durante 30 minutos. Los niveles de p-p70SK6, p-AKT y AKT se determinaron por western blot. Como control de carga se analizó la expresión de α-tubulina. (C) Células MDA-MB231 se trataron con las dosis indicadas de BMS345541 durante 6 horas y los niveles de cFLIP y p-NF-kB se determinaron por western blot. (D) Células MDA-MB231 fueron tratadas con DRB (40µM) o con las dosis indicadas de TBB durante 6 horas y los niveles de cFLIP se analizaron por western blot.
A) B)
C) D)
151
VII. DISCUSIÓN
Discusión
152
DISCUSIÓN.
El cáncer de mama es una de las neoplasias más comunes en mujeres
de todo el mundo. Por eso, es de enorme interés para la sociedad encontrar
tratamientos efectivos para combatirlo. Tanto la terapia con fármacos
genotóxicos, como la radioterapia son ampliamente utilizadas para combatir
estos tumores [339] [340]. En estos tratamientos, una acumulación de la
proteína supresora de tumores p53 es generalmente necesaria para una
efectividad positiva de estos tratamientos ya que esta acumulación
provocaría una activación de la vía intrinseca de apoptosis. Sin embargo, en
células de cáncer de mama, las mutaciones en p53, que hacen que la proteína
sea inactiva, son muy frecuentes [341] [342]. Por ello, el desarrollo de
estrategias que activen la vía extrínseca de apoptosis a través de los
receptores proapoptóticos, se presenta como una alternativa muy atractiva
en la terapia antitumoral. El hecho de que TRAIL sea un ligando de muerte
que induce apoptosis en células tumorales sin afectar a las células normales
lo convierte en un buen candidato para su uso en terapia antitumoral. Sin
embargo, el hecho de que existan muchas células tumorales de diferente
origen que son resistentes a TRAIL, hace que el uso de TRAIL recombinante
o de anticuerpos agonistas de los receptores de TRAIL en combinación con
otros agentes antitumorales, sea mucho más efectivo como terapia
antitumoral. Así, tratamientos quimioterapeúticos convencionales pueden
sinergizar con la señalización de los receptores de TRAIL e inducir apoptosis
en celulas tumorales, aunque los mecanismos de sensibilización a TRAIL
aún no están totalmente definidos. Este es el caso de la doxorrubicina, una
antraciclina comunmente utilizada en la terapia antitumoral y, que en
combinación con el anticuerpo agonista de TRAIL-R2 Lexatumumab, se
encuentra en fase 1b de ensayos clínicos [4] [323]. Además, en estudios in
vivo, se ha demostrado la eficacia del tratamiento conjunto en la regresión
Discusión
153
del tamaño de tumores de próstata [177]. A su vez, en los últimos años, el
tratamiento combinado de SAHA, miembro de un grupo de compuestos
inhibidores de histonas deacetilasas, con TRAIL, parece representar una
gran promesa en la terapia antitumoral [343] [188] [344] [345].
Por todos estos antecedentes, decidimos estudiar la eficacia de
combinación de estos agentes con TRAIL para la inducción de apoptosis en
células de cáncer de mama resistentes al ligando de muerte. Así, durante el
desarrollo de este trabajo se ha demostrado que ambos agentes en
combinación con TRAIL son capaces de sensibilizar a células tumorales de
mama resistentes a la acción de TRAIL y, además, se ha profundizado en el
mecanismo molecular que subyace dicha sensibilización. En estos estudios
hemos observado que el tratamiento con doxorrubicina o SAHA comparten,
como evento clave en el mecanismo de sensibilización a la apoptosis
inducida por TRAIL, la disminución de los niveles celulares de proteína
cFLIP. cFLIP es una proteína cuya principal función descrita en las células es
inhibir la activación de la caspasa-8 durante la apoptosis inducida por
receptores de muerte. En el caso de la doxorrubicina, el mecanismo de
sensibilización de células de cáncer de mama a la apoptosis inducida pr
TRAIL, además, es independiente de la proteína supresora de tumores p53,
lo que hace que el cotratamiento sea aún más atractivo, ya que esta proteína
se encuentra mutada en el 50% de los tumores.
Como se muestra en los resultados, la doxorrubicina disminuye los
niveles de cFLIPS específicamente sin afectar a los niveles de cFLIPL. Este
efecto puede ser debido a una regulación diferencial del splicing alternativo
que sufre el ARNm de cFLIP y que dará lugar a ambas isoformas, o bien, a
una regulación diferencial de la degradación específica de cFLIPS por el
proteasoma. Se requieren más estudios para poder verificar cualquiera de
las dos posibilidades.
Discusión
154
Con respecto al efecto que el SAHA tiene sobre los niveles de
proteínas de cFLIP, la expresión de cFLIPL y cFLIPS disminuye y esta
disminución se bloquea si inhibimos el proteasoma con el compuesto MG132
(datos no mostrados). Esto nos indica que el SAHA induce una degradación
proteasomal de cFLIP. Este fenómeno no sólo ocurre con estos dos agentes,
sino, que tras el tratamiento de células de cáncer de mama con compuestos
como Flavopiridol y Roscovitina (inhibidores de ciclinas dependientes de
quinasas), Nocodazol y Taxol (agentes que afectan a los microtúbulos) y
AICAR (activador directo de AMPK), todos capaces de sensiblizar a la
apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer de mama, observamos
que los niveles de cFLIP se encuentran disminuídos [346] [320] [347] [348].
Por ello y para corroborar el papel fundamental que cFLIP parece
tener en el mecanismo de sensibilización a TRAIL en células tumorales de
mama, decidimos utilizar la herramienta del ARN de interferencia (siRNA)
para eliminar específicamente los niveles de proteína de cFLIP, evitando así
efectos secundarios que se puedan derivar de los tratamientos
farmacológicos. Así, tras los resultados obtenidos con el siRNA,
comprobamos que efectivamente, la bajada de niveles de proteína de cFLIP
es un evento clave en la sensibilización de las células de cáncer de mama a
TRAIL. Además los niveles basales de cada una de las isoformas
determinarán la sensibilización de las células a la apoptosis inducida por
TRAIL. Es decir, en células tumorales de mama que expresen niveles
similares de ambas isoformas, como es el caso de las células MDA-MB231, se
requiere del silenciamiento de ambas isoformas de cFLIP para que se
sensibilicen a la acción de TRAIL. Sin embargo, en una línea celular tumoral,
como las células BT474, que expresa principalmente la isoforma cFLIPL, el
silenciamiento específico de estra isoforma predominante de cFLIP es
suficiente para obtener una clara sensibilización a la apoptosis tras el
Discusión
155
tratamiento con TRAIL. Así pues, en células tumorales de mama, podemos
confirmar los datos obtenidos en otras líneas tumorales de diferente origen,
donde cFLIP es el principal determinante de la sensibilización a la apoptosis
inducida por TRAIL, de forma particular, y por ligandos de muerte de forma
más general [207] [206] [204] [211] [209].
Además, la sensibilización de células tumorales de mama a la
apoptosis inducida por TRAIL, ya sea con tratamientos farmacológicos como
Doxorrubicina, Flavopiridol, Interferón gamma o Roscovitina, o bien por el
silenciamiento de la expresión de cFLIP, activa una ruta mitocondrial de
apoptosis, como se demuestra por los resultados en los que si suprimimos la
expresión de la proteína Bid, implicada en la activación de la ruta
mitocondrial de apoptosis. La sensilibilización de las células por dichos
tratamientos se encuentra significativamente afectada en la mayoría de los
casos.
Tras los datos obtenidos en este trabajo, podemos indicar que cFLIP
no sólo es una proteína fundamental en la resistencia que las células
tumorales de mama presentan al tratamiento con TRAIL, sino que esta
proteína es además clave en la superviencia de dichas células. Si inhibimos
la expresión de cFLIP mediante siRNA, las células tumorales de mama
mueren por apoptosis. Esta apoptosis “espontánea” debido al silenciamiento
de la expresión de cFLIP requiere de los componentes del DISC de TRAIL: el
receptor TRAIL-R2, la proteína adaptadora FADD, y la caspasa-8, pero es
un fenómeno independiente del ligando TRAIL. Esto nos indica que el papel
que cFLIP tiene como proteína que favorece la supervivencia celular, es
como inhibidor de una apoptosis independiente de ligando de muerte, que,
a priori, podría producirse en las células, más que como regulador positivo
de rutas de supervivencia. Además, cabe destacar, que mediante la
realización de experimentos de expresión génica por array de ARN, hemos
Discusión
156
determinado que tras el silenciamiento de cFLIP, no se produce en las
células tumorales de mama un cambio en el patrón de expresión de genes
implicados en supervivencia celular ni de genes proapoptóticos (datos no
mostrados).
Estos resultados nos hacen plantearnos varias posibles hipótesis para
explicar lo que puede estar ocurriendo. Una de ellas implicaría la posibilidad
de que los componentes del DISC de TRAIL estén pre-asociados, aún en
ausencia del ligando en la membrana plasmática (en zonas de lipid-rafts) y
que la unión de TRAIL al receptor o bien una variación en los niveles de sus
componentes como, por ejemplo, una bajada en la expresión de cFLIP,
induzca la activación de caspasa-8 y la consecuente cascada apoptótica. Por
otra parte puede ocurrir que al igual que con TNF [104] o Fas [105], los
receptores de TRAIL estén pre-asociados en condiciones basales [106] y que
una bajada en la expresión de cFLIP favorezca la asociación de FADD y
caspasa-8. Por otra parte, se ha descrito que FLIPL se encuentra asociado al
receptor TRAIL-R2 en condiciones normales, y que la inhibición de esta
asociación induce apoptosis independiente de ligando [333]. Para
determinar qué ocurre con los componentes del DISC de TRAIL, y si hay
asociación entre ellos en ausencia de ligando cuando bajamos la expresión
de cFLIP, decidimos inmunoprecipitar TRAIL-R2 en células donde
silenciamos la expresión de cFLIPL mediante infección lentiviral de un
shRNA para cFLIPL, o en células infectadas con un shRNA control
(scrambled). Sin embargo no hemos sido capaces de detectar asociación del
receptor TRAIL-R2 con ninguno de los componentes del DISC de TRAIL en
ausencia de ligando, ni en células infectadas con el shScrambled ni en las
células infectadas con el shFLIPL. Es importante indicar que la apoptosis que
se induce por la bajada de expresión de cFLIPL es un proceso lento ya que
tras 72 horas de inhibir su expresión el porcentaje de células apoptóticas que
Discusión
157
detectamos está, en el mejor de los casos, en torno al 50%, por lo que esta
aproximación metodológica puede no ser la más adecuada para detectar
asociación entre proteínas. Otra aproximación metodológica más directa
sería la detección de la asociación de los componentes del DISC de TRAIL
mediante inmunofluorescencia, pero en cualquier caso, los datos obtenidos
harían referencia a una co-localización de estos y no asegurarían una
asociación física entre ellos.
La inducción de una apoptosis independiente de ligando ha sido
descrito para tipos celulares como células tumorales de colon [331] y más
recientemente también se ha descrito en células tumorales de mama [330].
Pero el mecanismo que subyace esta apoptosis aún no se ha determinado, y
actualmente es objeto de estudio en nuestro laboratorio.
Nuestros resultados, junto con otros descritos en bibliografía donde
se demuestra la importacia de cFLIP en la resistencia a la apoptosis inducida
por receptores de muerte en células tumorales, o incluso el hecho de que el
simple silenciamiento de la expresión de cFLIP provoque la muerte celular,
convierten a esta proteína en una interesante diana terapeútica del cáncer.
De hecho, durante los últimos años, muchos han sido los trabajos donde esta
posibilidad ha sido propuesta e incluso, recientemente, se han realizado
ensayos in vivo donde mediante oligos de siRNA de cFLIP inyectados en
modelos tumorales de mama en ratón se ha conseguido reducir el tamaño
del tumor [298] .
Sin embargo, el papel que cFLIP juega en el control de la apoptosis en
células epiteliales de mama no tumorales, aspecto muy importante a la hora
de diseñar estrategias antitumorales es bastante desconocido. Por ello, otro
de los objetivos de esta tesis ha sido determinar si cFLIP, al igual que ocurre
en las células tumorales de mama, ejerce un papel fundamental como
inhibidor y regulador de la apoptosis en células epiteliales de mama no
Discusión
158
tumorales y, si ese papel, afecta al correcto desarrollo de la mama mediante
estudios en cultivos tridimensionales. Así, tras los resultados obtenidos en la
línea epitelial de mama inmortalizada no tumoral MCF-10A, podemos
concluir, que el silenciamiento de cFLIP, sensibiliza a la apoptosis inducida
por TRAIL y, además, provoca, al igual que en las líneas tumorales, una
apoptosis independiente de ligando, que requiere los componentes del DISC
de TRAIL. Las células MCF-10A, al igual que la células tumorales BT474,
expresan principalmete la isoforma cFLIPL, y el silenciamiento de esta
isoforma es suficiente para sensibilizarlas a la apoptosis inducida por TRAIL
y para inducir la apoptosis independiente de ligando, con mayor eficacia
incluso que en las células tumorales.
Además, hemos demostrado que cFLIP juega un papel en el
desarrollo de los acinos durante el proceso de morfogénsesis de células
epiteliales MCF10A. Bajo las condiciones de cultivo 3D, las células normales
epiteliales proliferan y se organizan formando estructuras esféricas
denominadas comúnmente acinos. Estos se caracterizan por tener un lumen
central rodeado de una capa de células polarizadas, poseer un preciso
control del crecimiento y la proliferación celular y por el establecimiento de
una membrana basal [305] [306] [307]. En acinos de células epiteliales de
mama MCF-10A, el lumen se forma por un fenómeno de cavitación, en el
que las células del interior del acino mueren por la apoptosis inducida por
anoikis o pérdida de adhesión a la matriz extracelular [301] [303]. En esta
apoptosis, la proteína proapoptótica “solo BH3” de la familia de Bcl-2, Bim
parece jugar un papel fundamental ya que la bajada de su expresión por
RNA de interferencia provoca que el lumen no se vacíe correctamente. Sin
embargo, la inhibición de la apoptosis durante la morfogénesis de células
MCF-10A en cultivos en 3D, no inhibe la formación de lumen, sólo la retrasa,
por lo que otros mecanismos de muerte parecen estar implicados [301]. Así,
Discusión
159
se ha descrito que un proceso de muerte celular con autofagia inducido por
TRAIL tendría un papel en la morfogénesis [164] ya que, sólo tras bloquear
la apoptosis con la sobreexpresión de la proteína antiapoptotica Bcl-xL y la
señalización de TRAIL mediante formas dominantes negativas de FADD o
receptores de TRAIL truncados, se consigue inhibir completamente el
vaciamiento del lumen. Durante la morfogénesis se pueden distinguir dos
tipos celulares bien diferenciados, las células de la capa exterior que están en
contacto directo con la matriz extracelular, y las células del interior del acino,
que son la que sufren los procesos de muerte, favoreciendo la formación del
lumen central. La expresión de TRAIL aumenta a los largo del proceso
morfogenético,lo que nos lleva a pensar que debe ser en las células de la
capa externa donde se induzca su expresión puesto que la inducción
comienza el dia 10 de la morfogénsis y tiene un pico máximo a dias 22- 27
donde el lumen ya se encuentra formado y sólo queda una capa de células
recubriendolo. Este aumento en la expresión de TRAIL es el que parece estar
implicado en la muerte con autofagia observada durante la morfogénesis
[164]. En esta tesis se ha demostrado que la expresión de cFLIP también
aumenta durante el proceso de morfogénesis de las células MCF-10A. Si este
aumento de cFLIP se produce para inhibir la señalización apoptótica que
TRAIL pueda tener en las células de la capa externa, que de hecho son
resistentes a TRAIL puesto que en condiciones normales el acino se
desarrolla correctamente y las células de la capa externa no mueren, es una
posibilidad que requiere de un estudio más en profundidad. Otra opción
que se nos plantea para explicar el aumento de expresión de cFLIP durante
la morfogénesis de células epiteliales de mama, es que este aumento
provenga de las células del interior del acino puesto que se ha descrito que
el durante el proceso de anoikis (muerte por pérdida de adhesión al
sustrato) las células MCF-10A ven aumentada su actividad NF-kB [349]. El
Discusión
160
aumento de actividad NF-kB, parece ser una respuesta celular de
supervivencia ante la pérdida de adhesión al sustrato que, de no corregirse,
lleva a la muerte celular mediada por la pérdida de señalización de
receptores de EGF, con la consecuente bajada de actividad de ERK y el
aumento de la proteína proapoptótica Bim[90, 311]. Está descrito que cFLIP
es un gen susceptible de regulación por NF-kB [255] [254], por lo que puede
que el aumento en los niveles de cFLIPL en células en suspensión sea
consecuencia de un aumento en la actividad NF-kB y que ocurra lo mismo
durante el proceso de morfogénesis con las células del interior del acino.
El hecho de que la sobreexpresión de cFLIP retrase la formación del
lumen y de que el silenciamiento de cFLIPL mediante shRNA impida incluso
la formación acinos, seguramente porque las células que expresan niveles
reducidos de cFLIP no son viables, nos indica la importancia de la
regulación de los niveles de expresión de cFLIP durante el proceso de
morfogénesis. Aunque no hemos determinado el mecanismo molecular por
el que los acinos derivados de células MCF-10A que sobreexpresan cFLIPL o
cFLIPS presentan un retraso en el proceso de formación de lumen, este hecho
se podría explicar mediante el planteamiento de varias hipótesis. Una de
ellas podría ser que tanto cFLIPL como cFLIPS inhiban la muerte con
autofagía inducida por TRAIL durante la morfogénesis. Como se ha
comentado anteriormente, parece que TRAIL juega un papel como inductor
autofagia durante el proceso de morfogénesis de célula epiteliales de mama
y parece que esta autofagia desencadena en muerte porque, como se ha
comentado anteriormente, sólo tras bloquear la apoptosis con la
sobreexpresión de la proteína antiapoptotica Bcl-xL y la señalización de
TRAIL, se consigue inhibir completamente la formación del lumen.
Recientemente se ha descrito que tanto la sobreexpresión de cFLIPL como de
cFLIPS son capaces de inhibir la muerte que cursa con autofagia inducida
Discusión
161
por privación de nutrientes o rapamicina, por impedir la unión de la
proteína ATG3 con la proteína LC3, impidiendo así el proceso de elongación
de los autofagosomas [292]. Por lo tanto, en principio, la sobreexpresión de
cFLIP también podría inhibir la elongación de los autofagosomas inducidos
por la señalización autofágica de TRAIL. TRAIL induce autofagia en células
MCF-10A [164] [165] y además la sobreexpresión de cFLIP no impide dicha
señalización [165] por lo que la sobreexpresión de cFLIP no impediría la
activación de autofagia mediada por TRAIL, sino que estaría bloqueando a
nivel de la formación de los autofagosomas. Sin embargo, existen datos
contradictorios a cerca de la finalidad de la inducción de autofagia durante
el proceso de morfogénesis y de la inducción de autofagia mediada por
TRAIL. Esto es: la autofagia mediada por TRAIL en células epiteliales de
mama MCF-10A, tiene un papel citoprotector, puesto que su inhibición
desecadena en apoptosis [165]. Si bien estos experimentos se han realizado
en cultivos 2D, que como sabemos pueden dar lugar a resultados muy
diferentes a lo que ocurre en los sistemas tridimiensionales. Además, se ha
descrito que durante la formación del lumen, también se desencadena un
proceso de autofagia inducido por la pérdida de adhesión al sustrato de las
células, cuyo papel también sería citoprotector, puesto que la inhibición de
esta autofagia mediante el silenciamiento de genes como ATG-5 o ATG-7,
desencadena una formación más rápida del lumen de los acinos [313]. Pero
como hemos comentado, esta autofagia citoprotectora está inducida por falta
de adhesión al sustrato, por lo que en realidad la posibilidad de que TRAIL
sea capaz de inducir muerte que cursa con autofagia durante el proceso de
morfogénesis puede ser plausible, aunque para demostrarlo se requieren
más estudios. Otra posibilidad, que podría darse si se demostrase que cFLIP
no inhibe la formación de los autofagosomas tras la inducción de autofagia
mediada por TRAIL sería la siguiente: TRAIL induce autofagia en células
Discusión
162
MCF-10A [164] [165] y cFLIP inhibe la señalización apoptótica de TRAIL
pero no la autofágica [165]. Por otra parte, las células de lumen durante la
morfogénesis sufren autofagia como mecanismo de supervivencia ante la
muerte inducida por anoikis. Si la sobreexpresión de cFLIP está
favoreciendo que, además de esta autofagia inducida por la perdida de
adhesión a la matriz extracelular, se favorezca la inducida por TRAIL y estos
efectos pueden resultar en un aumento de la supervivencia de las células del
lumen y por tanto en un retraso del vaciamiento luminal, es un tema que
requiere de un estudio más detallado y en profundidad.
Recientemente también se ha descrito que la aparición de especies
reactivas de oxígeno es un fenómeno que ocurre durante la formación del
lumen y que deriva en muerte celular [315]. Se ha descrito que la bajada de
niveles de proteína cFLIP provoca una acumulación de especies reactivas de
oxigeno, otorgando un papel a cFLIP semejante al de los antioxidantes. Por
tanto podría ocurrir que la sobreexpresión de cFLIP estuviese provocando
una eliminación de las especies reactivas de oxígeno que se desencadenan
durante el proceso de morfogénesis favoreciendo así la supervivencia celular
retrasando de esta forma la formación del lumen.
Durante el desarrollo de este trabajo hemos demostrado que cFLIP es
un regulador fundamental de la apoptosis, y no sabemos si de otros
procesos de muerte celular, tanto en células epiteliales tumorales como en
células epitiliales no tumorales de mama, y que una variación en su
expresión puede repercutir en el correcto desarrollo del epitelio glandular de
mama, efectos a tener en cuenta a la hora del diseño de terapias
antitumorales que tengan como posible diana la proteína cFLIP.
Por todo ello, el estudio de la regulación de la expresión de cFLIP en
células epiteliales de mama cobra aún si cabe más importancia. Se ha
descrito que cFLIP es una proteína de vida media corta, que se sintetiza y
Discusión
163
degrada por el proteasoma constantemente. [216] Conocer tanto la
señalización que media para su síntesis como la que está implicada en su
degradación se presenta como un aspecto clave para el estudio de los
mecanismos de control de la apoptosis en estas células. Se ha descrito que la
expresión inducible de cFLIP en células de cáncer de mama está regulada
principalmente por la ruta de PI3K/AKT, a través del factor de trascripción
FOXO3A [246]. Por ello, decidimos abordar el estudio la regulación de la
expresión basal de cFLIP en células de cáncer de mama por esta ruta de
señalización. Tras los resultados obtenidos, en los que diferentes inhibidores
farmacológicos de la ruta no se consigue el mismo efecto de bajada de
expresión, y tras los experimentos con formas constitutivamente activas y
dominantes negativas de AKT, donde no se aprecia una variación en los
niveles de expresión de cFLIP, llegamos a la conclusión de que la ruta de
señalización de PI3K/AKT no es la responsable absoluta de la expresión
basal de cFLIP. Tras estos resultados decidimos bloquear la rutas de
señalización que, a priori, se habían relaciónado con la regulación a nivel
transcripcional de cFLIP. Así hemos llegado a la conclusión de que tras la
inhibición de la ruta de NF-kB con el inhibidor específico BMS, los niveles
de cFLIP se reducen. Pero se requieren más estudios para realmente
confirmar si la bajada en los niveles de expresión de cFLIP se deben a una
inhibición transcripcional por el bloqueo de la ruta de NF-kB.
Como se ha comentado anteriormente, se ha descrito que cFLIP es
una proteína de vida media corta, cuya degradación está mediada por el
sistema ubiquitinación/proteasoma. Esto significa que cFLIP debe
ubiquitinarse [216], y para ello requiere de una proteina E3-ubiquitin ligasa
específica. Se conocen pocas proteínas con actividad E3-ubiquitin ligasas que
puedan tener como proteína diana a cFLIP. Recientemente se ha descrito a
ITCH como la E3-ubiquitin ligasa de cFLIPL que promueve la degradación
Discusión
164
proteasomal de éste tras el tratamiento con TNF [116] en hepatocitos. ITCH
también puede promover la degradación, tanto cFLIPL como decFLIPS, en
células de cáncer de ovario tratadas con cisplatino, en un mecanismo que
implica a la proteína p53 [274] y que parece estar regulado por AKT [275]. El
estado de activación de AKT, determinado por PTEN, también parece estar
implicado en la ubiquitinación de cFLIPS por la E3-ubiquitin ligasa AIP4
(Atrophin-interacting protein 4) en células de glioblastoma. Otra E3-
ubiquitin ligasa específicia de cFLIPS es c-Cbl. La interacción entre ambas
proteínas se produce tras la fosforilación de cFLIPS por un mecanismo
activado por TNF en macrófagos y que incluye a las proteínas SK1, p38 y c-
Abl [276]. Sin embargo, poco se conoce sobre el mecanismo de la
degradación proteasomal de cFLIP en células de mama. En este trabajo se ha
demostrado que el preteasoma desempeña un importante papel en el
mantenimiento de los niveles basales de proteína cFLIP, puesto que al
inhibir su síntesis con cicloheximida, los niveles de cFLIP disminuyen
drásticamente y, esta pérdida puede evitarse si bloqueamos el proteasoma
con el inhibidor MG132. Hemos demostrado que la proteína E3-ubiquitin
ligasa ITCH, no es la implicada en la degradación de los niveles basales de
cFLIP, y que otras proteínas con actividad E3-ubiquitin ligasa relacionadas
de algún modo con cFLIP como TRAF2, Cul-3 o incluso XIAP tampoco son
indispensables para dicha degradación.
Es por ello, y en vista de la importancia del conocimiento de los
mecanismo y/o proteínas implicadas en la regulación del mantenimiento de
los niveles basales de expresión de cFLIP, que hemos decido abordar el
estudio de la caracterización de la proteína E3-ubiquitin ligasa implicada en
la ubiquitinación y degradación de cFLIP en condiciones basales. Para ello,
hemos hecho uso de la metodología de estudio de interacción entre
proteínas mediante ensayos Phage-display, para determinar las
Discusión
165
interacciones que tiene una proteína cFLIPL recombinante con las proteínas
expresadas en la envuelta de fagos generados a partir de una genoteca de
cáncer de mama clonada en el fago T7. Principalmente estamos interesados
en proteínas que interaccionen con cFLIPL y que tengan actividad E3-
ubiquitin ligasa.
Sin embargo, y dada la importacia de cFLIP en control de la
apoptosis y por lo tanto en la superviviencia celular, es posible que tanto su
síntesis como su degradación no se encuentren reguladas exclusivamente
por una determinada vía de señalización, en el caso de la síntesis, y que no
exista una única proteína con actividad E3-ubiquitin ligasa implicada en su
degradación, pudiendose dar fenómenos de redundancia funcional.
Por todo lo expuesto anteriormente, el estudio de la regulación de la
expresión de cFLIP en células epiteliales de mama, tumorales o no,
representa un objetivo fundamental a resolver para el conocimiento de los
procesos que regulan el desarrollo de la mama y toda la repercusión que ello
puede tener,a su vez, en el conocimiento del desarrollo de tumores, así como
para el diseño de estrategias antitumorales eficaces contra el cáncer de
mama.
166
VIII. CONCLUSIONES
Conclusiones
167
CONCLUSIONES. 1. Tratamientos farmacológicos como Doxorrubicina o SAHA sensibilizan a células epiteliales de cáncer de mama a la apoptosis inducida por TRAIL. 2. La disminución de cFLIP por tratamientos farmacológicos o por el silenciamiento de su expresión mediante siRNA es un evento fundamental en la sensibilización de células epiteliales de cáncer de mama a la apoptosis inducida por TRAIL. 3. El silenciamiento de la expresión de cFLIP mediante siRNA induce apoptosis tanto en células epiteliales de mama normales como en tumorales. 4. La apoptosis inducida por el silenciamiento de la expresión de cFLIP requiere los componentes de la vía extrínseca de apoptosis inducida por TRAIL (TRAIL-R2, FADD y caspasa-8), pero es independiente del ligando de muerte TRAIL. 5. La activación de la ruta mitocondrial es necesaria para la inducción de apoptosis por tratamientos farmacológicos o silenciamiento de cFLIP en combinación con TRAIL. 6. La sobreexpresión de cFLIP, así como el silenciamiento de su expresión, afectan a la correcta formación del lumen durante la morfogénesis de células epiteliales de mama MCF-10A en cultivos 3D. 7. La degradación de cFLIP en células tumorales y no tumorales de mama está mediada por el sistema ubiquitina-proteasoma, independientemente de la ligasa E3 Itch. 8. El nivel basal de expresión de cFLIP en células epiteliales de mama está mantenido por la señalización de la ruta de NF-kB y es independiente de la actividad de la ruta PI3K/Akt.
168
IX. BIBLIOGRAFÍA
Bibliografía
169
BIBLIOGRAFÍA. 1. Kroemer, G., et al., Classification of cell death: recommendations of the
Nomenclature Committee on Cell Death. Cell Death Differ, 2005. 12 Suppl 2: p. 1463-7.
2. Kroemer, G., et al., Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death Differ, 2009. 16(1): p. 3-11.
3. Shi, Y., Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis. Mol Cell, 2002. 9(3): p. 459-70.
4. Ashkenazi, A., Directing cancer cells to self-destruct with pro-apoptotic receptor agonists. Nat Rev Drug Discov, 2008. 7(12): p. 1001-12.
5. Kerr, J.F., A.H. Wyllie, and A.R. Currie, Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer, 1972. 26(4): p. 239-57.
6. Li, J. and J. Yuan, Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene, 2008. 27(48): p. 6194-206.
7. Ellis, H.M. and H.R. Horvitz, Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell, 1986. 44(6): p. 817-29.
8. Ellis, R.E. and H.R. Horvitz, Two C. elegans genes control the programmed deaths of specific cells in the pharynx. Development, 1991. 112(2): p. 591-603.
9. Hengartner, M.O., R.E. Ellis, and H.R. Horvitz, Caenorhabditis elegans gene ced-9 protects cells from programmed cell death. Nature, 1992. 356(6369): p. 494-9.
10. Metzstein, M.M., et al., Transcriptional regulator of programmed cell death encoded by Caenorhabditis elegans gene ces-2. Nature, 1996. 382(6591): p. 545-7.
11. Conradt, B. and D. Xue, Programmed cell death. WormBook, 2005: p. 1-13.
12. Metzstein, M.M., G.M. Stanfield, and H.R. Horvitz, Genetics of programmed cell death in C. elegans: past, present and future. Trends Genet, 1998. 14(10): p. 410-6.
13. Hofmann, E.R., et al., Caenorhabditis elegans HUS-1 is a DNA damage checkpoint protein required for genome stability and EGL-1-mediated apoptosis. Curr Biol, 2002. 12(22): p. 1908-18.
14. Tait, S.W., et al., Apoptosis induction by Bid requires unconventional ubiquitination and degradation of its N-terminal fragment. J Cell Biol, 2007. 179(7): p. 1453-66.
15. Konishi, Y., et al., Cdc2 phosphorylation of BAD links the cell cycle to the cell death machinery. Mol Cell, 2002. 9(5): p. 1005-16.
Bibliografía
170
16. Zha, J., et al., Posttranslational N-myristoylation of BID as a molecular switch for targeting mitochondria and apoptosis. Science, 2000. 290(5497): p. 1761-5.
17. Li, H., et al., Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell, 1998. 94(4): p. 491-501.
18. Schulze-Osthoff, K., et al., Apoptosis signaling by death receptors. Eur J Biochem, 1998. 254(3): p. 439-59.
19. Fadok, V.A., et al., Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J Immunol, 1992. 148(7): p. 2207-16.
20. Schlegel, R.A. and P. Williamson, Phosphatidylserine, a death knell. Cell Death Differ, 2001. 8(6): p. 551-63.
21. Fadok, V.A., et al., The role of phosphatidylserine in recognition of apoptotic cells by phagocytes. Cell Death Differ, 1998. 5(7): p. 551-62.
22. Fadok, V.A., et al., Loss of phospholipid asymmetry and surface exposure of phosphatidylserine is required for phagocytosis of apoptotic cells by macrophages and fibroblasts. J Biol Chem, 2001. 276(2): p. 1071-7.
23. Grimsley, C. and K.S. Ravichandran, Cues for apoptotic cell engulfment: eat-me, don't eat-me and come-get-me signals. Trends Cell Biol, 2003. 13(12): p. 648-56.
24. Henson, P.M., D.L. Bratton, and V.A. Fadok, Apoptotic cell removal. Curr Biol, 2001. 11(19): p. R795-805.
25. Cerretti, D.P., et al., Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme. Science, 1992. 256(5053): p. 97-100.
26. Thornberry, N.A. and S.M. Molineaux, Interleukin-1 beta converting enzyme: a novel cysteine protease required for IL-1 beta production and implicated in programmed cell death. Protein Sci, 1995. 4(1): p. 3-12.
27. Yuan, J., et al., The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Cell, 1993. 75(4): p. 641-52.
28. Miura, M., et al., Induction of apoptosis in fibroblasts by IL-1 beta-converting enzyme, a mammalian homolog of the C. elegans cell death gene ced-3. Cell, 1993. 75(4): p. 653-60.
29. Kumar, S. and J. Doumanis, The fly caspases. Cell Death Differ, 2000. 7(11): p. 1039-44.
30. Ahmad, M., et al., Spodoptera frugiperda caspase-1, a novel insect death protease that cleaves the nuclear immunophilin FKBP46, is the target of the baculovirus antiapoptotic protein p35. J Biol Chem, 1997. 272(3): p. 1421-4.
31. Madeo, F., et al., A caspase-related protease regulates apoptosis in yeast. Mol Cell, 2002. 9(4): p. 911-7.
Bibliografía
171
32. Pistritto, G., et al., Expression and transcriptional regulation of caspase-14 in simple and complex epithelia. Cell Death Differ, 2002. 9(9): p. 995-1006.
33. Fuentes-Prior, P. and G.S. Salvesen, The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition. Biochem J, 2004. 384(Pt 2): p. 201-32.
34. Pop, C. and G.S. Salvesen, Human caspases: activation, specificity, and regulation. J Biol Chem, 2009. 284(33): p. 21777-81.
35. Shi, M., et al., DNA-PKcs-PIDDosome: a nuclear caspase-2-activating complex with role in G2/M checkpoint maintenance. Cell, 2009. 136(3): p. 508-20.
36. Luthi, A.U. and S.J. Martin, The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ, 2007. 14(4): p. 641-50.
37. Juo, P., et al., Essential requirement for caspase-8/FLICE in the initiation of the Fas-induced apoptotic cascade. Curr Biol, 1998. 8(18): p. 1001-8.
38. Varfolomeev, E.E., et al., Targeted disruption of the mouse Caspase 8 gene ablates cell death induction by the TNF receptors, Fas/Apo1, and DR3 and is lethal prenatally. Immunity, 1998. 9(2): p. 267-76.
39. Li, P., et al., Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell, 1997. 91(4): p. 479-89.
40. Liu, X., et al., Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome c. Cell, 1996. 86(1): p. 147-57.
41. Zou, H., et al., An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem, 1999. 274(17): p. 11549-56.
42. Tinel, A. and J. Tschopp, The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science, 2004. 304(5672): p. 843-6.
43. Bouchier-Hayes, L., et al., Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Mol Cell, 2009. 35(6): p. 830-40.
44. Ho, P.K. and C.J. Hawkins, Mammalian initiator apoptotic caspases. Febs J, 2005. 272(21): p. 5436-53.
45. Tinel, A., et al., Autoproteolysis of PIDD marks the bifurcation between pro-death caspase-2 and pro-survival NF-kappaB pathway. Embo J, 2007. 26(1): p. 197-208.
46. Wang, L., F. Du, and X. Wang, TNF-alpha induces two distinct caspase-8 activation pathways. Cell, 2008. 133(4): p. 693-703.
47. Chai, J., et al., Crystal structure of a procaspase-7 zymogen: mechanisms of activation and substrate binding. Cell, 2001. 107(3): p. 399-407.
48. Riedl, S.J., et al., Mechanism-based inactivation of caspases by the apoptotic suppressor p35. Biochemistry, 2001. 40(44): p. 13274-80.
Bibliografía
172
49. Riedl, S.J. and Y. Shi, Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol, 2004. 5(11): p. 897-907.
50. Allan, L.A., et al., Inhibition of caspase-9 through phosphorylation at Thr 125 by ERK MAPK. Nat Cell Biol, 2003. 5(7): p. 647-54.
51. Allan, L.A. and P.R. Clarke, Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell, 2007. 26(2): p. 301-10.
52. Nutt, L.K., et al., Metabolic regulation of oocyte cell death through the CaMKII-mediated phosphorylation of caspase-2. Cell, 2005. 123(1): p. 89-103.
53. Kurokawa, M. and S. Kornbluth, Caspases and kinases in a death grip. Cell, 2009. 138(5): p. 838-54.
54. Senft, J., B. Helfer, and S.M. Frisch, Caspase-8 interacts with the p85 subunit of phosphatidylinositol 3-kinase to regulate cell adhesion and motility. Cancer Res, 2007. 67(24): p. 11505-9.
55. Barbero, S., et al., Identification of a critical tyrosine residue in caspase 8 that promotes cell migration. J Biol Chem, 2008. 283(19): p. 13031-4.
56. Alvarado-Kristensson, M. and T. Andersson, Protein phosphatase 2A regulates apoptosis in neutrophils by dephosphorylating both p38 MAPK and its substrate caspase 3. J Biol Chem, 2005. 280(7): p. 6238-44.
57. Jin, Z., et al., Cullin3-based polyubiquitination and p62-dependent aggregation of caspase-8 mediate extrinsic apoptosis signaling. Cell, 2009. 137(4): p. 721-35.
58. Newmeyer, D.D. and S. Ferguson-Miller, Mitochondria: releasing power for life and unleashing the machineries of death. Cell, 2003. 112(4): p. 481-90.
59. Adams, J.M., Ways of dying: multiple pathways to apoptosis. Genes Dev, 2003. 17(20): p. 2481-95.
60. van Gurp, M., et al., Mitochondrial intermembrane proteins in cell death. Biochem Biophys Res Commun, 2003. 304(3): p. 487-97.
61. Hengartner, M.O., Apoptosis. CED-4 is a stranger no more. Nature, 1997. 388(6644): p. 714-5.
62. Cain, K., et al., Caspase activation involves the formation of the aposome, a large (approximately 700 kDa) caspase-activating complex. J Biol Chem, 1999. 274(32): p. 22686-92.
63. Du, C., et al., Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. Cell, 2000. 102(1): p. 33-42.
64. Verhagen, A.M., et al., Identification of DIABLO, a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins. Cell, 2000. 102(1): p. 43-53.
Bibliografía
173
65. Wolf, B.B. and D.R. Green, Apoptosis: letting slip the dogs of war. Curr Biol, 2002. 12(5): p. R177-9.
66. Susin, S.A., et al., Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor. Nature, 1999. 397(6718): p. 441-6.
67. Daugas, E., et al., Mitochondrio-nuclear translocation of AIF in apoptosis and necrosis. Faseb J, 2000. 14(5): p. 729-39.
68. Loeffler, M., et al., Dominant cell death induction by extramitochondrially targeted apoptosis-inducing factor. Faseb J, 2001. 15(3): p. 758-67.
69. Susin, S.A., et al., Two distinct pathways leading to nuclear apoptosis. J Exp Med, 2000. 192(4): p. 571-80.
70. Wang, X., et al., Mechanisms of AIF-mediated apoptotic DNA degradation in Caenorhabditis elegans. Science, 2002. 298(5598): p. 1587-92.
71. Cande, C., et al., AIF and cyclophilin A cooperate in apoptosis-associated chromatinolysis. Oncogene, 2004. 23(8): p. 1514-21.
72. Schulze-Osthoff, K., et al., Cytotoxic activity of tumor necrosis factor is mediated by early damage of mitochondrial functions. Evidence for the involvement of mitochondrial radical generation. J Biol Chem, 1992. 267(8): p. 5317-23.
73. Yip, K.W. and J.C. Reed, Bcl-2 family proteins and cancer. Oncogene, 2008. 27(50): p. 6398-406.
74. Bakhshi, A., et al., Cloning the chromosomal breakpoint of t(14;18) human lymphomas: clustering around JH on chromosome 14 and near a transcriptional unit on 18. Cell, 1985. 41(3): p. 899-906.
75. Tsujimoto, Y., et al., Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the t(14;18) chromosome translocation. Science, 1984. 226(4678): p. 1097-9.
76. Vaux, D.L., S. Cory, and J.M. Adams, Bcl-2 gene promotes haemopoietic cell survival and cooperates with c-myc to immortalize pre-B cells. Nature, 1988. 335(6189): p. 440-2.
77. Youle, R.J. and A. Strasser, The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death. Nat Rev Mol Cell Biol, 2008. 9(1): p. 47-59.
78. Petros, A.M., et al., Solution structure of the antiapoptotic protein bcl-2. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001. 98(6): p. 3012-7.
79. Sattler, M., et al., Structure of Bcl-xL-Bak peptide complex: recognition between regulators of apoptosis. Science, 1997. 275(5302): p. 983-6.
80. Conus, S., et al., Bcl-2 is a monomeric protein: prevention of homodimerization by structural constraints. Embo J, 2000. 19(7): p. 1534-44.
81. Nechushtan, A., et al., Bax and Bak coalesce into novel mitochondria-associated clusters during apoptosis. J Cell Biol, 2001. 153(6): p. 1265-76.
82. Wei, M.C., et al., Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science, 2001. 292(5517): p. 727-30.
Bibliografía
174
83. Eskes, R., et al., Bid induces the oligomerization and insertion of Bax into the outer mitochondrial membrane. Mol Cell Biol, 2000. 20(3): p. 929-35.
84. Nechushtan, A., et al., Conformation of the Bax C-terminus regulates subcellular location and cell death. Embo J, 1999. 18(9): p. 2330-41.
85. Huang, D.C. and A. Strasser, BH3-Only proteins-essential initiators of apoptotic cell death. Cell, 2000. 103(6): p. 839-42.
86. Giam, M., D.C. Huang, and P. Bouillet, BH3-only proteins and their roles in programmed cell death. Oncogene, 2008. 27 Suppl 1: p. S128-36.
87. Zong, W.X., et al., BH3-only proteins that bind pro-survival Bcl-2 family members fail to induce apoptosis in the absence of Bax and Bak. Genes Dev, 2001. 15(12): p. 1481-6.
88. Bouillet, P., et al., Proapoptotic Bcl-2 relative Bim required for certain apoptotic responses, leukocyte homeostasis, and to preclude autoimmunity. Science, 1999. 286(5445): p. 1735-8.
89. Puthalakath, H., et al., Bmf: a proapoptotic BH3-only protein regulated by interaction with the myosin V actin motor complex, activated by anoikis. Science, 2001. 293(5536): p. 1829-32.
90. Reginato, M.J., et al., Bim regulation of lumen formation in cultured mammary epithelial acini is targeted by oncogenes. Mol Cell Biol, 2005. 25(11): p. 4591-601.
91. Oda, E., et al., Noxa, a BH3-only member of the Bcl-2 family and candidate mediator of p53-induced apoptosis. Science, 2000. 288(5468): p. 1053-8.
92. Nakano, K. and K.H. Vousden, PUMA, a novel proapoptotic gene, is induced by p53. Mol Cell, 2001. 7(3): p. 683-94.
93. Cory, S. and J.M. Adams, The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer, 2002. 2(9): p. 647-56.
94. Willis, S.N., et al., Apoptosis initiated when BH3 ligands engage multiple Bcl-2 homologs, not Bax or Bak. Science, 2007. 315(5813): p. 856-9.
95. Fletcher, J.I., et al., Apoptosis is triggered when prosurvival Bcl-2 proteins cannot restrain Bax. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(47): p. 18081-7.
96. Letai, A., Puma strikes Bax. J Cell Biol, 2009. 185(2): p. 189-91. 97. Letai, A., et al., Distinct BH3 domains either sensitize or activate
mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics. Cancer Cell, 2002. 2(3): p. 183-92.
98. Chipuk, J.E., et al., Direct activation of Bax by p53 mediates mitochondrial membrane permeabilization and apoptosis. Science, 2004. 303(5660): p. 1010-4.
99. Pagliari, L.J., et al., The multidomain proapoptotic molecules Bax and Bak are directly activated by heat. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005. 102(50): p. 17975-80.
Bibliografía
175
100. Gavathiotis, E., et al., BAX activation is initiated at a novel interaction site. Nature, 2008. 455(7216): p. 1076-81.
101. Papenfuss, K., S.M. Cordier, and H. Walczak, Death receptors as targets for anti-cancer therapy. J Cell Mol Med, 2008. 12(6B): p. 2566-85.
102. Bodmer, J.L., P. Schneider, and J. Tschopp, The molecular architecture of the TNF superfamily. Trends Biochem Sci, 2002. 27(1): p. 19-26.
103. Banner, D.W., et al., Crystal structure of the soluble human 55 kd TNF receptor-human TNF beta complex: implications for TNF receptor activation. Cell, 1993. 73(3): p. 431-45.
104. Chan, F.K., et al., A domain in TNF receptors that mediates ligand-independent receptor assembly and signaling. Science, 2000. 288(5475): p. 2351-4.
105. Siegel, R.M., et al., Fas preassociation required for apoptosis signaling and dominant inhibition by pathogenic mutations. Science, 2000. 288(5475): p. 2354-7.
106. Clancy, L., et al., Preligand assembly domain-mediated ligand-independent association between TRAIL receptor 4 (TR4) and TR2 regulates TRAIL-induced apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005. 102(50): p. 18099-104.
107. Chan, F.K., et al., Fluorescence resonance energy transfer analysis of cell surface receptor interactions and signaling using spectral variants of the green fluorescent protein. Cytometry, 2001. 44(4): p. 361-8.
108. Kischkel, F.C., et al., Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. Embo J, 1995. 14(22): p. 5579-88.
109. Pfeffer, K., et al., Mice deficient for the 55 kd tumor necrosis factor receptor are resistant to endotoxic shock, yet succumb to L. monocytogenes infection. Cell, 1993. 73(3): p. 457-67.
110. Zhao, Y.X., et al., Tumor necrosis factor receptor p55-deficient mice respond to acute Yersinia enterocolitica infection with less apoptosis and more effective host resistance. Infect Immun, 2000. 68(3): p. 1243-51.
111. Wajant, H., K. Pfizenmaier, and P. Scheurich, Tumor necrosis factor signaling. Cell Death Differ, 2003. 10(1): p. 45-65.
112. Micheau, O. and J. Tschopp, Induction of TNF receptor I-mediated apoptosis via two sequential signaling complexes. Cell, 2003. 114(2): p. 181-90.
113. Schneider-Brachert, W., et al., Compartmentalization of TNF receptor 1 signaling: internalized TNF receptosomes as death signaling vesicles. Immunity, 2004. 21(3): p. 415-28.
114. Li, H., et al., Ubiquitination of RIP is required for tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappaB activation. J Biol Chem, 2006. 281(19): p. 13636-43.
Bibliografía
176
115. Ea, C.K., et al., Activation of IKK by TNFalpha requires site-specific ubiquitination of RIP1 and polyubiquitin binding by NEMO. Mol Cell, 2006. 22(2): p. 245-57.
116. Chang, L., et al., The E3 ubiquitin ligase itch couples JNK activation to TNFalpha-induced cell death by inducing c-FLIP(L) turnover. Cell, 2006. 124(3): p. 601-13.
117. O'Donnell, M.A., et al., Ubiquitination of RIP1 regulates an NF-kappaB-independent cell-death switch in TNF signaling. Curr Biol, 2007. 17(5): p. 418-24.
118. Bertrand, M.J., et al., cIAP1 and cIAP2 facilitate cancer cell survival by functioning as E3 ligases that promote RIP1 ubiquitination. Mol Cell, 2008. 30(6): p. 689-700.
119. Cascino, I., et al., Three functional soluble forms of the human apoptosis-inducing Fas molecule are produced by alternative splicing. J Immunol, 1995. 154(6): p. 2706-13.
120. Schneider, P., et al., Conversion of membrane-bound Fas(CD95) ligand to its soluble form is associated with downregulation of its proapoptotic activity and loss of liver toxicity. J Exp Med, 1998. 187(8): p. 1205-13.
121. Chakrabandhu, K., et al., Palmitoylation is required for efficient Fas cell death signaling. Embo J, 2007. 26(1): p. 209-20.
122. Feig, C., et al., Palmitoylation of CD95 facilitates formation of SDS-stable receptor aggregates that initiate apoptosis signaling. Embo J, 2007. 26(1): p. 221-31.
123. Henkler, F., et al., The extracellular domains of FasL and Fas are sufficient for the formation of supramolecular FasL-Fas clusters of high stability. J Cell Biol, 2005. 168(7): p. 1087-98.
124. Lee, K.H., et al., The role of receptor internalization in CD95 signaling. Embo J, 2006. 25(5): p. 1009-23.
125. Lavrik, I.N., et al., CD95 stimulation results in the formation of a novel death effector domain protein-containing complex. J Biol Chem, 2008. 283(39): p. 26401-8.
126. Barnhart, B.C., et al., CD95 ligand induces motility and invasiveness of apoptosis-resistant tumor cells. Embo J, 2004. 23(15): p. 3175-85.
127. Wajant, H., K. Pfizenmaier, and P. Scheurich, Non-apoptotic Fas signaling. Cytokine Growth Factor Rev, 2003. 14(1): p. 53-66.
128. Desbarats, J., et al., Fas engagement induces neurite growth through ERK activation and p35 upregulation. Nat Cell Biol, 2003. 5(2): p. 118-25.
129. Reinehr, R., A. Sommerfeld, and D. Haussinger, CD95 ligand is a proliferative and antiapoptotic signal in quiescent hepatic stellate cells. Gastroenterology, 2008. 134(5): p. 1494-506.
130. Desbarats, J. and M.K. Newell, Fas engagement accelerates liver regeneration after partial hepatectomy. Nat Med, 2000. 6(8): p. 920-3.
Bibliografía
177
131. Kennedy, N.J., et al., Caspase activation is required for T cell proliferation. J Exp Med, 1999. 190(12): p. 1891-6.
132. Kleber, S., et al., Yes and PI3K bind CD95 to signal invasion of glioblastoma. Cancer Cell, 2008. 13(3): p. 235-48.
133. Chakrabandhu, K., et al., The extracellular glycosphingolipid-binding motif of Fas defines its internalization route, mode and outcome of signals upon activation by ligand. Cell Death Differ, 2008. 15(12): p. 1824-37.
134. Wiley, S.R., et al., Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis. Immunity, 1995. 3(6): p. 673-82.
135. Mariani, S.M. and P.H. Krammer, Differential regulation of TRAIL and CD95 ligand in transformed cells of the T and B lymphocyte lineage. Eur J Immunol, 1998. 28(3): p. 973-82.
136. Bodmer, J.L., et al., Cysteine 230 is essential for the structure and activity of the cytotoxic ligand TRAIL. J Biol Chem, 2000. 275(27): p. 20632-7.
137. Trabzuni, D., K.S. Famulski, and M. Ahmad, Functional analysis of tumour necrosis factor-alpha-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL): cysteine-230 plays a critical role in the homotrimerization and biological activity of this novel tumoricidal cytokine. Biochem J, 2000. 350 Pt 2: p. 505-10.
138. Hayakawa, Y., et al., NK cell TRAIL eliminates immature dendritic cells in vivo and limits dendritic cell vaccination efficacy. J Immunol, 2004. 172(1): p. 123-9.
139. Janssen, E.M., et al., CD4+ T-cell help controls CD8+ T-cell memory via TRAIL-mediated activation-induced cell death. Nature, 2005. 434(7029): p. 88-93.
140. Smyth, M.J., et al., Nature's TRAIL--on a path to cancer immunotherapy. Immunity, 2003. 18(1): p. 1-6.
141. Pitti, R.M., et al., Induction of apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family. J Biol Chem, 1996. 271(22): p. 12687-90.
142. Ashkenazi, A., et al., Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand. J Clin Invest, 1999. 104(2): p. 155-62.
143. Walczak, H., et al., Tumoricidal activity of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in vivo. Nat Med, 1999. 5(2): p. 157-63.
144. Lawrence, D., et al., Differential hepatocyte toxicity of recombinant Apo2L/TRAIL versions. Nat Med, 2001. 7(4): p. 383-5.
145. Almasan, A. and A. Ashkenazi, Apo2L/TRAIL: apoptosis signaling, biology, and potential for cancer therapy. Cytokine Growth Factor Rev, 2003. 14(3-4): p. 337-48.
146. Truneh, A., et al., Temperature-sensitive differential affinity of TRAIL for its receptors. DR5 is the highest affinity receptor. J Biol Chem, 2000. 275(30): p. 23319-25.
Bibliografía
178
147. Pan, G., et al., The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL. Science, 1997. 276(5309): p. 111-3.
148. Schneider, P., et al., Characterization of two receptors for TRAIL. FEBS Lett, 1997. 416(3): p. 329-34.
149. Walczak, H., et al., TRAIL-R2: a novel apoptosis-mediating receptor for TRAIL. Embo J, 1997. 16(17): p. 5386-97.
150. Degli-Esposti, M.A., et al., Cloning and characterization of TRAIL-R3, a novel member of the emerging TRAIL receptor family. J Exp Med, 1997. 186(7): p. 1165-70.
151. MacFarlane, M., et al., Identification and molecular cloning of two novel receptors for the cytotoxic ligand TRAIL. J Biol Chem, 1997. 272(41): p. 25417-20.
152. Degli-Esposti, M.A., et al., The novel receptor TRAIL-R4 induces NF-kappaB and protects against TRAIL-mediated apoptosis, yet retains an incomplete death domain. Immunity, 1997. 7(6): p. 813-20.
153. Kelley, R.F., et al., Receptor-selective mutants of apoptosis-inducing ligand 2/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand reveal a greater contribution of death receptor (DR) 5 than DR4 to apoptosis signaling. J Biol Chem, 2005. 280(3): p. 2205-12.
154. Varfolomeev, E., et al., Molecular determinants of kinase pathway activation by Apo2 ligand/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand. J Biol Chem, 2005. 280(49): p. 40599-608.
155. Wagner, K.W., et al., Death-receptor O-glycosylation controls tumor-cell sensitivity to the proapoptotic ligand Apo2L/TRAIL. Nat Med, 2007. 13(9): p. 1070-7.
156. Zhang, L. and B. Fang, Mechanisms of resistance to TRAIL-induced apoptosis in cancer. Cancer Gene Ther, 2005. 12(3): p. 228-37.
157. Falschlehner, C., et al., TRAIL signalling: decisions between life and death. Int J Biochem Cell Biol, 2007. 39(7-8): p. 1462-75.
158. Soderstrom, T.S., et al., Mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase signaling in activated T cells abrogates TRAIL-induced apoptosis upstream of the mitochondrial amplification loop and caspase-8. J Immunol, 2002. 169(6): p. 2851-60.
159. Tran, S.E., et al., MAPK/ERK overrides the apoptotic signaling from Fas, TNF, and TRAIL receptors. J Biol Chem, 2001. 276(19): p. 16484-90.
160. Lee, T.J., et al., Acquired TRAIL resistance in human breast cancer cells are caused by the sustained cFLIP(L) and XIAP protein levels and ERK activation. Biochem Biophys Res Commun, 2006. 351(4): p. 1024-30.
161. Guicciardi, M.E., et al., cFLIPL prevents TRAIL-induced apoptosis of hepatocellular carcinoma cells by inhibiting the lysosomal pathway of apoptosis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2007. 292(5): p. G1337-46.
Bibliografía
179
162. Ehrhardt, H., et al., TRAIL induced survival and proliferation in cancer cells resistant towards TRAIL-induced apoptosis mediated by NF-kappaB. Oncogene, 2003. 22(25): p. 3842-52.
163. Ishimura, N., et al., Trail induces cell migration and invasion in apoptosis-resistant cholangiocarcinoma cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2006. 290(1): p. G129-36.
164. Mills, K.R., et al., Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is required for induction of autophagy during lumen formation in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(10): p. 3438-43.
165. Herrero-Martin, G., et al., TAK1 activates AMPK-dependent cytoprotective autophagy in TRAIL-treated epithelial cells. Embo J, 2009. 28(6): p. 677-85.
166. Mollinedo, F. and C. Gajate, Microtubules, microtubule-interfering agents and apoptosis. Apoptosis, 2003. 8(5): p. 413-50.
167. Lee, J.M. and A. Bernstein, Apoptosis, cancer and the p53 tumour suppressor gene. Cancer Metastasis Rev, 1995. 14(2): p. 149-61.
168. Pommier, Y., et al., Apoptosis defects and chemotherapy resistance: molecular interaction maps and networks. Oncogene, 2004. 23(16): p. 2934-49.
169. Gerl, R. and D.L. Vaux, Apoptosis in the development and treatment of cancer. Carcinogenesis, 2005. 26(2): p. 263-70.
170. Nieminen, A.I., et al., c-Myc primed mitochondria determine cellular sensitivity to TRAIL-induced apoptosis. Embo J, 2007. 26(4): p. 1055-67.
171. Hersh, E.M., et al., Phase II studies of recombinant human tumor necrosis factor alpha in patients with malignant disease: a summary of the Southwest Oncology Group experience. J Immunother (1991), 1991. 10(6): p. 426-31.
172. Grunhagen, D.J., et al., Outcome and prognostic factor analysis of 217 consecutive isolated limb perfusions with tumor necrosis factor-alpha and melphalan for limb-threatening soft tissue sarcoma. Cancer, 2006. 106(8): p. 1776-84.
173. Ogasawara, J., et al., Lethal effect of the anti-Fas antibody in mice. Nature, 1993. 364(6440): p. 806-9.
174. Chuntharapai, A., et al., Isotype-dependent inhibition of tumor growth in vivo by monoclonal antibodies to death receptor 4. J Immunol, 2001. 166(8): p. 4891-8.
175. Ichikawa, K., et al., Tumoricidal activity of a novel anti-human DR5 monoclonal antibody without hepatocyte cytotoxicity. Nat Med, 2001. 7(8): p. 954-60.
176. Kelley, S.K. and A. Ashkenazi, Targeting death receptors in cancer with Apo2L/TRAIL. Curr Opin Pharmacol, 2004. 4(4): p. 333-9.
177. El-Zawahry, A., J. McKillop, and C. Voelkel-Johnson, Doxorubicin increases the effectiveness of Apo2L/TRAIL for tumor growth inhibition of prostate cancer xenografts. BMC Cancer, 2005. 5: p. 2.
Bibliografía
180
178. Shankar, S., T.R. Singh, and R.K. Srivastava, Ionizing radiation enhances the therapeutic potential of TRAIL in prostate cancer in vitro and in vivo: Intracellular mechanisms. Prostate, 2004. 61(1): p. 35-49.
179. Shankar, S., X. Chen, and R.K. Srivastava, Effects of sequential treatments with chemotherapeutic drugs followed by TRAIL on prostate cancer in vitro and in vivo. Prostate, 2005. 62(2): p. 165-86.
180. Ray, S. and A. Almasan, Apoptosis induction in prostate cancer cells and xenografts by combined treatment with Apo2 ligand/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand and CPT-11. Cancer Res, 2003. 63(15): p. 4713-23.
181. Shamimi-Noori, S., et al., Cisplatin enhances the antitumor effect of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand gene therapy via recruitment of the mitochondria-dependent death signaling pathway. Cancer Gene Ther, 2008. 15(6): p. 356-70.
182. Sikic, B.I., R. Tibshirani, and N.J. Lacayo, Genomics of childhood leukemias: the virtue of complexity. J Clin Oncol, 2008. 26(27): p. 4367-8.
183. Sayers, T.J., et al., The proteasome inhibitor PS-341 sensitizes neoplastic cells to TRAIL-mediated apoptosis by reducing levels of c-FLIP. Blood, 2003. 102(1): p. 303-10.
184. Hallett, W.H., et al., Sensitization of tumor cells to NK cell-mediated killing by proteasome inhibition. J Immunol, 2008. 180(1): p. 163-70.
185. Shanker, A., et al., Treating metastatic solid tumors with bortezomib and a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonist antibody. J Natl Cancer Inst, 2008. 100(9): p. 649-62.
186. Guo, F., et al., Cotreatment with histone deacetylase inhibitor LAQ824 enhances Apo-2L/tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand-induced death inducing signaling complex activity and apoptosis of human acute leukemia cells. Cancer Res, 2004. 64(7): p. 2580-9.
187. Rosato, R.R., et al., Simultaneous activation of the intrinsic and extrinsic pathways by histone deacetylase (HDAC) inhibitors and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) synergistically induces mitochondrial damage and apoptosis in human leukemia cells. Mol Cancer Ther, 2003. 2(12): p. 1273-84.
188. Frew, A.J., et al., Combination therapy of established cancer using a histone deacetylase inhibitor and a TRAIL receptor agonist. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(32): p. 11317-22.
189. Wu, H., J. Tschopp, and S.C. Lin, Smac mimetics and TNFalpha: a dangerous liaison? Cell, 2007. 131(4): p. 655-8.
190. Vogler, M., et al., Targeting XIAP bypasses Bcl-2-mediated resistance to TRAIL and cooperates with TRAIL to suppress pancreatic cancer growth in vitro and in vivo. Cancer Res, 2008. 68(19): p. 7956-65.
Bibliografía
181
191. Petrucci, E., et al., A small molecule Smac mimic potentiates TRAIL-mediated cell death of ovarian cancer cells. Gynecol Oncol, 2007. 105(2): p. 481-92.
192. Shrader, M., et al., Gefitinib reverses TRAIL resistance in human bladder cancer cell lines via inhibition of AKT-mediated X-linked inhibitor of apoptosis protein expression. Cancer Res, 2007. 67(4): p. 1430-5.
193. Panner, A., et al., mTOR controls FLIPS translation and TRAIL sensitivity in glioblastoma multiforme cells. Mol Cell Biol, 2005. 25(20): p. 8809-23.
194. Garcia-Echeverria, C. and W.R. Sellers, Drug discovery approaches targeting the PI3K/Akt pathway in cancer. Oncogene, 2008. 27(41): p. 5511-26.
195. McCubrey, J.A., et al., Alteration of Akt activity increases chemotherapeutic drug and hormonal resistance in breast cancer yet confers an achilles heel by sensitization to targeted therapy. Adv Enzyme Regul, 2008. 48: p. 113-35.
196. Ravi, R., et al., Regulation of death receptor expression and TRAIL/Apo2L-induced apoptosis by NF-kappaB. Nat Cell Biol, 2001. 3(4): p. 409-16.
197. Romagnoli, M., et al., Canonical nuclear factor kappaB pathway inhibition blocks myeloma cell growth and induces apoptosis in strong synergy with TRAIL. Clin Cancer Res, 2007. 13(20): p. 6010-8.
198. Roue, G., et al., Selective inhibition of IkappaB kinase sensitizes mantle cell lymphoma B cells to TRAIL by decreasing cellular FLIP level. J Immunol, 2007. 178(3): p. 1923-30.
199. Goltsev, Y.V., et al., CASH, a novel caspase homologue with death effector domains. J Biol Chem, 1997. 272(32): p. 19641-4.
200. French, L.E. and J. Tschopp, Defective death receptor signaling as a cause of tumor immune escape. Semin Cancer Biol, 2002. 12(1): p. 51-5.
201. Igney, F.H. and P.H. Krammer, Death and anti-death: tumour resistance to apoptosis. Nat Rev Cancer, 2002. 2(4): p. 277-88.
202. Thome, M. and J. Tschopp, Regulation of lymphocyte proliferation and death by FLIP. Nat Rev Immunol, 2001. 1(1): p. 50-8.
203. Thome, M., et al., Viral FLICE-inhibitory proteins (FLIPs) prevent apoptosis induced by death receptors. Nature, 1997. 386(6624): p. 517-21.
204. Hu, S., et al., I-FLICE, a novel inhibitor of tumor necrosis factor receptor-1- and CD-95-induced apoptosis. J Biol Chem, 1997. 272(28): p. 17255-7.
205. Bertin, J., et al., Death effector domain-containing herpesvirus and poxvirus proteins inhibit both Fas- and TNFR1-induced apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997. 94(4): p. 1172-6.
206. Irmler, M., et al., Inhibition of death receptor signals by cellular FLIP. Nature, 1997. 388(6638): p. 190-5.
Bibliografía
182
207. Han, D.K., et al., MRIT, a novel death-effector domain-containing protein, interacts with caspases and BclXL and initiates cell death. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997. 94(21): p. 11333-8.
208. Inohara, N., et al., CLARP, a death effector domain-containing protein interacts with caspase-8 and regulates apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997. 94(20): p. 10717-22.
209. Rasper, D.M., et al., Cell death attenuation by 'Usurpin', a mammalian DED-caspase homologue that precludes caspase-8 recruitment and activation by the CD-95 (Fas, APO-1) receptor complex. Cell Death Differ, 1998. 5(4): p. 271-88.
210. Shu, H.B., D.R. Halpin, and D.V. Goeddel, Casper is a FADD- and caspase-related inducer of apoptosis. Immunity, 1997. 6(6): p. 751-63.
211. Srinivasula, S.M., et al., FLAME-1, a novel FADD-like anti-apoptotic molecule that regulates Fas/TNFR1-induced apoptosis. J Biol Chem, 1997. 272(30): p. 18542-5.
212. Djerbi, M., et al., Characterization of the human FLICE-inhibitory protein locus and comparison of the anti-apoptotic activity of four different flip isoforms. Scand J Immunol, 2001. 54(1-2): p. 180-9.
213. Golks, A., et al., c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. J Biol Chem, 2005. 280(15): p. 14507-13.
214. Cohen, G.M., Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J, 1997. 326 ( Pt 1): p. 1-16.
215. Budd, R.C., W.C. Yeh, and J. Tschopp, cFLIP regulation of lymphocyte activation and development. Nat Rev Immunol, 2006. 6(3): p. 196-204.
216. Poukkula, M., et al., Rapid turnover of c-FLIPshort is determined by its unique C-terminal tail. J Biol Chem, 2005. 280(29): p. 27345-55.
217. Ueffing, N., et al., A single nucleotide polymorphism determines protein isoform production of the human c-FLIP protein. Blood, 2009. 114(3): p. 572-9.
218. Davidson, S.M., A. Stephanou, and D.S. Latchman, FLIP protects cardiomyocytes from apoptosis induced by simulated ischemia/reoxygenation, as demonstrated by short hairpin-induced (shRNA) silencing of FLIP mRNA. J Mol Cell Cardiol, 2003. 35(11): p. 1359-64.
219. Bouchet, D., et al., Differential sensitivity of endothelial cells of various species to apoptosis induced by gene transfer of Fas ligand: role of FLIP levels. Mol Med, 2002. 8(10): p. 612-23.
220. Marconi, A., et al., FLICE/caspase-8 activation triggers anoikis induced by beta1-integrin blockade in human keratinocytes. J Cell Sci, 2004. 117(Pt 24): p. 5815-23.
221. Ashany, D., et al., Dendritic cells are resistant to apoptosis through the Fas (CD95/APO-1) pathway. J Immunol, 1999. 163(10): p. 5303-11.
Bibliografía
183
222. Kim, H., et al., Human CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells express high levels of FLIP and are resistant to Fas-mediated apoptosis. Stem Cells, 2002. 20(2): p. 174-82.
223. Giampietri, C., et al., FLIP is expressed in mouse testis and protects germ cells from apoptosis. Cell Death Differ, 2003. 10(2): p. 175-84.
224. Hernandez, A., et al., Sensitization of human colon cancer cells to TRAIL-mediated apoptosis. J Gastrointest Surg, 2001. 5(1): p. 56-65.
225. Ryu, B.K., et al., Increased expression of cFLIP(L) in colonic adenocarcinoma. J Pathol, 2001. 194(1): p. 15-9.
226. Korkolopoulou, P., et al., c-FLIP expression in colorectal carcinomas: association with Fas/FasL expression and prognostic implications. Histopathology, 2007. 51(2): p. 150-6.
227. Ullenhag, G.J., et al., Overexpression of FLIPL is an independent marker of poor prognosis in colorectal cancer patients. Clin Cancer Res, 2007. 13(17): p. 5070-5.
228. Lee, S.H., et al., Increased expression of FLIP, an inhibitor of Fas-mediated apoptosis, in stomach cancer. Apmis, 2003. 111(2): p. 309-14.
229. Nam, S.Y., et al., Upregulation of FLIP(S) by Akt, a possible inhibition mechanism of TRAIL-induced apoptosis in human gastric cancers. Cancer Sci, 2003. 94(12): p. 1066-73.
230. Zhou, X.D., et al., Overexpression of cellular FLICE-inhibitory protein (FLIP) in gastric adenocarcinoma. Clin Sci (Lond), 2004. 106(4): p. 397-405.
231. Elnemr, A., et al., Human pancreatic cancer cells disable function of Fas receptors at several levels in Fas signal transduction pathway. Int J Oncol, 2001. 18(2): p. 311-6.
232. Mori, T., et al., Regulation of the resistance to TRAIL-induced apoptosis as a new strategy for pancreatic cancer. Surgery, 2005. 138(1): p. 71-7.
233. Dutton, A., et al., Expression of the cellular FLICE-inhibitory protein (c-FLIP) protects Hodgkin's lymphoma cells from autonomous Fas-mediated death. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(17): p. 6611-6.
234. Mathas, S., et al., c-FLIP mediates resistance of Hodgkin/Reed-Sternberg cells to death receptor-induced apoptosis. J Exp Med, 2004. 199(8): p. 1041-52.
235. MacFarlane, M., et al., Mechanisms of resistance to TRAIL-induced apoptosis in primary B cell chronic lymphocytic leukaemia. Oncogene, 2002. 21(44): p. 6809-18.
236. Griffith, T.S., et al., Intracellular regulation of TRAIL-induced apoptosis in human melanoma cells. J Immunol, 1998. 161(6): p. 2833-40.
237. Xiao, C.W., et al., Resistance of human ovarian cancer cells to tumor necrosis factor alpha is a consequence of nuclear factor kappaB-mediated induction of Fas-associated death domain-like interleukin-1beta-converting enzyme-like inhibitory protein. Endocrinology, 2003. 144(2): p. 623-30.
Bibliografía
184
238. Abedini, M.R., et al., Possible role of FLICE-like inhibitory protein (FLIP) in chemoresistant ovarian cancer cells in vitro. Oncogene, 2004. 23(42): p. 6997-7004.
239. Mezzanzanica, D., et al., CD95-mediated apoptosis is impaired at receptor level by cellular FLICE-inhibitory protein (long form) in wild-type p53 human ovarian carcinoma. Clin Cancer Res, 2004. 10(15): p. 5202-14.
240. Zhang, X., et al., Persistent c-FLIP(L) expression is necessary and sufficient to maintain resistance to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-mediated apoptosis in prostate cancer. Cancer Res, 2004. 64(19): p. 7086-91.
241. Yeh, J.H., et al., Mitogen-activated protein kinase kinase antagonized fas-associated death domain protein-mediated apoptosis by induced FLICE-inhibitory protein expression. J Exp Med, 1998. 188(10): p. 1795-802.
242. Schlapbach, R., et al., TGF-beta induces the expression of the FLICE-inhibitory protein and inhibits Fas-mediated apoptosis of microglia. Eur J Immunol, 2000. 30(12): p. 3680-8.
243. Qiao, L., et al., Bile acid regulation of C/EBPbeta, CREB, and c-Jun function, via the extracellular signal-regulated kinase and c-Jun NH2-terminal kinase pathways, modulates the apoptotic response of hepatocytes. Mol Cell Biol, 2003. 23(9): p. 3052-66.
244. Wang, W., et al., Notch3 signaling in vascular smooth muscle cells induces c-FLIP expression via ERK/MAPK activation. Resistance to Fas ligand-induced apoptosis. J Biol Chem, 2002. 277(24): p. 21723-9.
245. Panka, D.J., et al., Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt activity regulates c-FLIP expression in tumor cells. J Biol Chem, 2001. 276(10): p. 6893-6.
246. Skurk, C., et al., The Akt-regulated forkhead transcription factor FOXO3a controls endothelial cell viability through modulation of the caspase-8 inhibitor FLIP. J Biol Chem, 2004. 279(2): p. 1513-25.
247. Suhara, T., et al., Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling controls endothelial cell sensitivity to Fas-mediated apoptosis via regulation of FLICE-inhibitory protein (FLIP). Circ Res, 2001. 89(1): p. 13-9.
248. Poulaki, V., et al., Regulation of Apo2L/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis in thyroid carcinoma cells. Am J Pathol, 2002. 161(2): p. 643-54.
249. Sade, H., S. Krishna, and A. Sarin, The anti-apoptotic effect of Notch-1 requires p56lck-dependent, Akt/PKB-mediated signaling in T cells. J Biol Chem, 2004. 279(4): p. 2937-44.
250. Gao, S., et al., The androgen receptor directly targets the cellular Fas/FasL-associated death domain protein-like inhibitory protein gene to promote the androgen-independent growth of prostate cancer cells. Mol Endocrinol, 2005. 19(7): p. 1792-802.
Bibliografía
185
251. Gao, S., et al., Androgen receptor and prostate apoptosis response factor-4 target the c-FLIP gene to determine survival and apoptosis in the prostate gland. J Mol Endocrinol, 2006. 36(3): p. 463-83.
252. Nastiuk, K.L., et al., Androgen regulation of FLICE-like inhibitory protein gene expression in the rat prostate. J Cell Physiol, 2003. 196(2): p. 386-93.
253. Cornforth, A.N., et al., FOXO3a mediates the androgen-dependent regulation of FLIP and contributes to TRAIL-induced apoptosis of LNCaP cells. Oncogene, 2008. 27(32): p. 4422-33.
254. Micheau, O., et al., NF-kappaB signals induce the expression of c-FLIP. Mol Cell Biol, 2001. 21(16): p. 5299-305.
255. Kreuz, S., et al., NF-kappaB inducers upregulate cFLIP, a cycloheximide-sensitive inhibitor of death receptor signaling. Mol Cell Biol, 2001. 21(12): p. 3964-73.
256. Wang, Q., et al., PKCdelta-mediated regulation of FLIP expression in human colon cancer cells. Int J Cancer, 2006. 118(2): p. 326-34.
257. Rao, A., C. Luo, and P.G. Hogan, Transcription factors of the NFAT family: regulation and function. Annu Rev Immunol, 1997. 15: p. 707-47.
258. Ueffing, N., et al., Up-regulation of c-FLIP short by NFAT contributes to apoptosis resistance of short-term activated T cells. Blood, 2008. 112(3): p. 690-8.
259. Borrelli, S., et al., p63 regulates the caspase-8-FLIP apoptotic pathway in epidermis. Cell Death Differ, 2009. 16(2): p. 253-63.
260. Bartke, T., et al., p53 upregulates cFLIP, inhibits transcription of NF-kappaB-regulated genes and induces caspase-8-independent cell death in DLD-1 cells. Oncogene, 2001. 20(5): p. 571-80.
261. Ricci, M.S., et al., Direct repression of FLIP expression by c-myc is a major determinant of TRAIL sensitivity. Mol Cell Biol, 2004. 24(19): p. 8541-55.
262. Li, W., X. Zhang, and A.F. Olumi, MG-132 sensitizes TRAIL-resistant prostate cancer cells by activating c-Fos/c-Jun heterodimers and repressing c-FLIP(L). Cancer Res, 2007. 67(5): p. 2247-55.
263. Yang, D., et al., IFN regulatory factor 8 sensitizes soft tissue sarcoma cells to death receptor-initiated apoptosis via repression of FLICE-like protein expression. Cancer Res, 2009. 69(3): p. 1080-8.
264. Salon, C., et al., E2F1 induces apoptosis and sensitizes human lung adenocarcinoma cells to death-receptor-mediated apoptosis through specific downregulation of c-FLIP(short). Cell Death Differ, 2006. 13(2): p. 260-72.
265. Kaunisto, A., et al., PKC-mediated phosphorylation regulates c-FLIP ubiquitylation and stability. Cell Death Differ, 2009. 16(9): p. 1215-26.
266. Stagni, V., et al., ATM kinase activity modulates Fas sensitivity through the regulation of FLIP in lymphoid cells. Blood, 2008. 111(2): p. 829-37.
Bibliografía
186
267. Llobet, D., et al., CK2 controls TRAIL and Fas sensitivity by regulating FLIP levels in endometrial carcinoma cells. Oncogene, 2008. 27(18): p. 2513-24.
268. Wang, L., et al., The Fas death signaling pathway connecting reactive oxygen species generation and FLICE inhibitory protein down-regulation. J Immunol, 2008. 180(5): p. 3072-80.
269. Fukazawa, T., et al., Accelerated degradation of cellular FLIP protein through the ubiquitin-proteasome pathway in p53-mediated apoptosis of human cancer cells. Oncogene, 2001. 20(37): p. 5225-31.
270. Chandrasekaran, Y., et al., Influence of TRP53 status on FAS membrane localization, CFLAR (c-FLIP) ubiquitinylation, and sensitivity of GC-2spd (ts) cells to undergo FAS-mediated apoptosis. Biol Reprod, 2006. 74(3): p. 560-8.
271. Chandrasekaran, Y. and J.H. Richburg, The p53 protein influences the sensitivity of testicular germ cells to mono-(2-ethylhexyl) phthalate-induced apoptosis by increasing the membrane levels of Fas and DR5 and decreasing the intracellular amount of c-FLIP. Biol Reprod, 2005. 72(1): p. 206-13.
272. Perez, D. and E. White, E1A sensitizes cells to tumor necrosis factor alpha by downregulating c-FLIP S. J Virol, 2003. 77(4): p. 2651-62.
273. Algeciras-Schimnich, A., et al., Cell cycle-dependent regulation of FLIP levels and susceptibility to Fas-mediated apoptosis. J Immunol, 1999. 162(9): p. 5205-11.
274. Abedini, M.R., et al., Cisplatin induces p53-dependent FLICE-like inhibitory protein ubiquitination in ovarian cancer cells. Cancer Res, 2008. 68(12): p. 4511-7.
275. Abedini, M.R., et al., Akt promotes chemoresistance in human ovarian cancer cells by modulating cisplatin-induced, p53-dependent ubiquitination of FLICE-like inhibitory protein. Oncogene, 2009.
276. Kundu, M., et al., A TNF- and c-Cbl-dependent FLIP(S)-degradation pathway and its function in Mycobacterium tuberculosis-induced macrophage apoptosis. Nat Immunol, 2009. 10(8): p. 918-26.
277. Zhang, L. and P.J. Gallagher, Mind bomb 1 regulation of cFLIP interactions. Am J Physiol Cell Physiol, 2009. 297(5): p. C1275-83.
278. Park, S.J., et al., Alternative splicing variants of c-FLIP transduce the differential signal through the Raf or TRAF2 in TNF-induced cell proliferation. Biochem Biophys Res Commun, 2001. 289(5): p. 1205-10.
279. Krueger, A., et al., Cellular FLICE-inhibitory protein splice variants inhibit different steps of caspase-8 activation at the CD95 death-inducing signaling complex. J Biol Chem, 2001. 276(23): p. 20633-40.
280. Chang, D.W., et al., c-FLIP(L) is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. Embo J, 2002. 21(14): p. 3704-14.
Bibliografía
187
281. Micheau, O., et al., The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. J Biol Chem, 2002. 277(47): p. 45162-71.
282. Boatright, K.M., et al., Activation of caspases-8 and -10 by FLIP(L). Biochem J, 2004. 382(Pt 2): p. 651-7.
283. Yu, J.W., P.D. Jeffrey, and Y. Shi, Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009. 106(20): p. 8169-74.
284. Yang, B.F., et al., Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II regulation of c-FLIP expression and phosphorylation in modulation of Fas-mediated signaling in malignant glioma cells. J Biol Chem, 2003. 278(9): p. 7043-50.
285. Panner, A., et al., Heat shock protein 90alpha recruits FLIPS to the death-inducing signaling complex and contributes to TRAIL resistance in human glioma. Cancer Res, 2007. 67(19): p. 9482-9.
286. Kataoka, T., et al., The caspase-8 inhibitor FLIP promotes activation of NF-kappaB and Erk signaling pathways. Curr Biol, 2000. 10(11): p. 640-8.
287. Kataoka, T. and J. Tschopp, N-terminal fragment of c-FLIP(L) processed by caspase 8 specifically interacts with TRAF2 and induces activation of the NF-kappaB signaling pathway. Mol Cell Biol, 2004. 24(7): p. 2627-36.
288. Dohrman, A., et al., Cellular FLIP (long form) regulates CD8+ T cell activation through caspase-8-dependent NF-kappa B activation. J Immunol, 2005. 174(9): p. 5270-8.
289. Luschen, S., et al., The Fas-associated death domain protein/caspase-8/c-FLIP signaling pathway is involved in TNF-induced activation of ERK. Exp Cell Res, 2005. 310(1): p. 33-42.
290. Park, D., et al., C-FLIP promotes the motility of cancer cells by activating FAK and ERK, and increasing MMP-9 expression. Mol Cells, 2008. 25(2): p. 184-95.
291. Yeh, W.C., et al., Requirement for Casper (c-FLIP) in regulation of death receptor-induced apoptosis and embryonic development. Immunity, 2000. 12(6): p. 633-42.
292. Lee, J.S., et al., FLIP-mediated autophagy regulation in cell death control. Nat Cell Biol, 2009. 11(11): p. 1355-62.
293. Thorburn, J., et al., Selective inactivation of a Fas-associated death domain protein (FADD)-dependent apoptosis and autophagy pathway in immortal epithelial cells. Mol Biol Cell, 2005. 16(3): p. 1189-99.
294. Bell, B.D., et al., FADD and caspase-8 control the outcome of autophagic signaling in proliferating T cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(43): p. 16677-82.
295. Yu, L., et al., Regulation of an ATG7-beclin 1 program of autophagic cell death by caspase-8. Science, 2004. 304(5676): p. 1500-2.
Bibliografía
188
296. Pyo, J.O., et al., Essential roles of Atg5 and FADD in autophagic cell death: dissection of autophagic cell death into vacuole formation and cell death. J Biol Chem, 2005. 280(21): p. 20722-9.
297. Kataoka, T., The caspase-8 modulator c-FLIP. Crit Rev Immunol, 2005. 25(1): p. 31-58.
298. Day, T.W., et al., c-FLIP gene silencing eliminates tumor cells in breast cancer xenografts without affecting stromal cells. Anticancer Res, 2009. 29(10): p. 3883-6.
299. Martin-Belmonte, F. and A.E. Rodriguez-Fraticelli, Chapter 3: acquisition of membrane polarity in epithelial tube formation patterns, signaling pathways, molecular mechanisms, and disease. Int Rev Cell Mol Biol, 2009. 274: p. 129-82.
300. Martin-Belmonte, F., et al., Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis. Curr Biol, 2008. 18(7): p. 507-13.
301. Debnath, J., et al., The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell, 2002. 111(1): p. 29-40.
302. Mailleux, A.A., et al., BIM regulates apoptosis during mammary ductal morphogenesis, and its absence reveals alternative cell death mechanisms. Dev Cell, 2007. 12(2): p. 221-34.
303. Debnath, J. and J.S. Brugge, Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nat Rev Cancer, 2005. 5(9): p. 675-88.
304. Hanahan, D. and R.A. Weinberg, The hallmarks of cancer. Cell, 2000. 100(1): p. 57-70.
305. Streuli, C.H. and M.J. Bissell, Expression of extracellular matrix components is regulated by substratum. J Cell Biol, 1990. 110(4): p. 1405-15.
306. Petersen, O.W., et al., Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. 89(19): p. 9064-8.
307. Debnath, J., S.K. Muthuswamy, and J.S. Brugge, Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods, 2003. 30(3): p. 256-68.
308. Wang, A.Z., G.K. Ojakian, and W.J. Nelson, Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium. II. Disassembly and assembly of plasma membrane domains during reversal of epithelial cell polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. J Cell Sci, 1990. 95 ( Pt 1): p. 153-65.
309. Roskelley, C.D., P.Y. Desprez, and M.J. Bissell, Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells
Bibliografía
189
requires both physical and biochemical signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994. 91(26): p. 12378-82.
310. Muthuswamy, S.K., et al., ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol, 2001. 3(9): p. 785-92.
311. Reginato, M.J., et al., Integrins and EGFR coordinately regulate the pro-apoptotic protein Bim to prevent anoikis. Nat Cell Biol, 2003. 5(8): p. 733-40.
312. Schmelzle, T., et al., Functional role and oncogene-regulated expression of the BH3-only factor Bmf in mammary epithelial anoikis and morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(10): p. 3787-92.
313. Debnath, J., Detachment-induced autophagy during anoikis and lumen formation in epithelial acini. Autophagy, 2008. 4(3): p. 351-3.
314. Aranda, V., et al., Par6-aPKC uncouples ErbB2 induced disruption of polarized epithelial organization from proliferation control. Nat Cell Biol, 2006. 8(11): p. 1235-45.
315. Schafer, Z.T., et al., Antioxidant and oncogene rescue of metabolic defects caused by loss of matrix attachment. Nature, 2009. 461(7260): p. 109-13.
316. Soule, H.D., et al., A human cell line from a pleural effusion derived from a breast carcinoma. J Natl Cancer Inst, 1973. 51(5): p. 1409-16.
317. Ruiz de Almodovar, C., et al., The differential sensitivity of Bc1-2-overexpressing human breast tumor cells to TRAIL or doxorubicin-induced apoptosis is dependent on Bc1-2 protein levels. Oncogene, 2001. 20(48): p. 7128-33.
318. Ruiz de Almodovar, C., et al., Transcription initiation sites and promoter structure of the human TRAIL-R3 gene. FEBS Lett, 2002. 531(2): p. 304-8.
319. Cailleau, R., et al., Breast tumor cell lines from pleural effusions. J Natl Cancer Inst, 1974. 53(3): p. 661-74.
320. Ortiz-Ferron, G., et al., Roscovitine sensitizes breast cancer cells to TRAIL-induced apoptosis through a pleiotropic mechanism. Cell Res, 2008. 18(6): p. 664-76.
321. Lasfargues, E.Y., W.G. Coutinho, and A.S. Dion, A human breast tumor cell line (BT-474) that supports mouse mammary tumor virus replication. In Vitro, 1979. 15(9): p. 723-9.
322. Cailleau, R., M. Olive, and Q.V. Cruciger, Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization. In Vitro, 1978. 14(11): p. 911-5.
323. Johnstone, R.W., A.J. Frew, and M.J. Smyth, The TRAIL apoptotic pathway in cancer onset, progression and therapy. Nat Rev Cancer, 2008. 8(10): p. 782-98.
324. Yoshida, T., et al., Repeated Treatment with Subtoxic Doses of TRAIL Induces Resistance to Apoptosis through Its Death Receptors in MDA-MB-231 Breast Cancer Cells. Mol Cancer Res, 2009.
Bibliografía
190
325. Tan, M.L., P.F. Choong, and C.R. Dass, Review: doxorubicin delivery systems based on chitosan for cancer therapy. J Pharm Pharmacol, 2009. 61(2): p. 131-42.
326. Patil, R.R., S.A. Guhagarkar, and P.V. Devarajan, Engineered nanocarriers of doxorubicin: a current update. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 2008. 25(1): p. 1-61.
327. Marks, P.A. and W.S. Xu, Histone deacetylase inhibitors: Potential in cancer therapy. J Cell Biochem, 2009. 107(4): p. 600-8.
328. Witt, O., et al., HDAC family: What are the cancer relevant targets? Cancer Lett, 2009. 277(1): p. 8-21.
329. Emanuele, S., M. Lauricella, and G. Tesoriere, Histone deacetylase inhibitors: apoptotic effects and clinical implications (Review). Int J Oncol, 2008. 33(4): p. 637-46.
330. Day, T.W., S. Huang, and A.R. Safa, c-FLIP knockdown induces ligand-independent DR5-, FADD-, caspase-8-, and caspase-9-dependent apoptosis in breast cancer cells. Biochem Pharmacol, 2008. 76(12): p. 1694-704.
331. Wilson, T.R., et al., c-FLIP: a key regulator of colorectal cancer cell death. Cancer Res, 2007. 67(12): p. 5754-62.
332. Ruiz de Almodovar, C., A. Lopez-Rivas, and C. Ruiz-Ruiz, Interferon-gamma and TRAIL in human breast tumor cells. Vitam Horm, 2004. 67: p. 291-318.
333. Jin, T.G., et al., Fas-associated protein with death domain (FADD)-independent recruitment of c-FLIPL to death receptor 5. J Biol Chem, 2004. 279(53): p. 55594-601.
334. Efklidou, S., et al., vFLIP from KSHV inhibits anoikis of primary endothelial cells. J Cell Sci, 2008. 121(Pt 4): p. 450-7.
335. Mawji, I.A., et al., Critical role for Fas-associated death domain-like interleukin-1-converting enzyme-like inhibitory protein in anoikis resistance and distant tumor formation. J Natl Cancer Inst, 2007. 99(10): p. 811-22.
336. Overholtzer, M., et al., A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell, 2007. 131(5): p. 966-79.
337. Lee, G.Y., et al., Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat Methods, 2007. 4(4): p. 359-65.
338. Gyrd-Hansen, M., et al., IAPs contain an evolutionarily conserved ubiquitin-binding domain that regulates NF-kappaB as well as cell survival and oncogenesis. Nat Cell Biol, 2008. 10(11): p. 1309-17.
339. Fisher, D.E., Apoptosis in cancer therapy: crossing the threshold. Cell, 1994. 78(4): p. 539-42.
340. McCloskey, D.E., et al., Programmed cell death in human breast cancer cells. Recent Prog Horm Res, 1996. 51: p. 493-508.
341. Bartek, J., et al., Genetic and immunochemical analysis of mutant p53 in human breast cancer cell lines. Oncogene, 1990. 5(6): p. 893-9.
Bibliografía
191
342. Forrester, K., et al., Effects of p53 mutants on wild-type p53-mediated transactivation are cell type dependent. Oncogene, 1995. 10(11): p. 2103-11.
343. Butler, L.M., et al., The histone deacetylase inhibitor, suberoylanilide hydroxamic acid, overcomes resistance of human breast cancer cells to Apo2L/TRAIL. Int J Cancer, 2006. 119(4): p. 944-54.
344. Carlisi, D., et al., The histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid sensitises human hepatocellular carcinoma cells to TRAIL-induced apoptosis by TRAIL-DISC activation. Eur J Cancer, 2009. 45(13): p. 2425-38.
345. Shankar, S., et al., Suberoylanilide hydroxamic acid (Zolinza/vorinostat) sensitizes TRAIL-resistant breast cancer cells orthotopically implanted in BALB/c nude mice. Mol Cancer Ther, 2009. 8(6): p. 1596-605.
346. Palacios, C., R. Yerbes, and A. Lopez-Rivas, Flavopiridol induces cellular FLICE-inhibitory protein degradation by the proteasome and promotes TRAIL-induced early signaling and apoptosis in breast tumor cells. Cancer Res, 2006. 66(17): p. 8858-69.
347. Sanchez-Perez, T., G. Ortiz-Ferron, and A. Lopez-Rivas, Mitotic arrest and JNK-induced proteasomal degradation of FLIP and Mcl-1 are key events in the sensitization of breast tumor cells to TRAIL by antimicrotubule agents. Cell Death Differ, 2009.
348. Garcia-Garcia, C., et al., AMPK-independent down-regulation of cFLIP and sensitization to TRAIL-induced apoptosis by AMPK activators. Biochem Pharmacol, 2009.
349. Yan, S.R., et al., Activation of NF-kappaB following detachment delays apoptosis in intestinal epithelial cells. Oncogene, 2005. 24(43): p. 6482-91.
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X. ANEXO
Anexo
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Publicaciones relacionadas con la Tesis
Artículo en revisión en The Journal of Biological Chemistry
1Cellular FLIPL plays a survival role and regulates morphogenesis in breast epithelial cells Short title: Regulation of spontaneous apoptosis by cFLIP in normal cells Rosario Yerbes1, Mauricio J. Reginato2 and Abelardo López-Rivas1@
1Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), Consejo Superior de Investigaciones Cientificas (CSIC), Sevilla, Spain. 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Drexel University College of Medicine, Philadelphia, USA. @Address correspondence to: Abelardo López-Rivas, Ph.D., Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), CSIC, Avda Américo Vespucio s/n, 41092 Sevilla, Spain. Phone: 34954467997; Fax: 34954461664; e-mail: [email protected]
2
Summary Strong evidences support the inhibitory activity of cellular FLICE-inhibitory protein (cFLIP) in the apoptotic signaling by death receptors in tumor cells. However, little is known about the role of cFLIP in the regulation of apoptosis in normal cells. In this report, we demonstrate that cFLIPL plays an important role both as a survival protein and an inhibitor of TRAIL-induced apoptosis in normal breast epithelial cells. Silencing of cFLIPL by siRNA methodology induces a caspase-dependent, ligand-independent cell death process in breast epithelial cells. This cell death requires the expression of TRAIL-R2, FADD and procaspase-8 proteins. A mitochondria-operated apoptotic pathway is partially required for cFLIPL siRNA-induced apoptosis. Interestingly, cFLIPL silencing markedly abrogates formation of acinus-like structures in a
three-dimensional basement membrane culture model (3D) of the human mammary MCF-10A cell line. Furthermore, over-expression of either FLIPL or FLIPS in MCF-10A cells delayed lumen formation in 3D cultures. Our results highlight the central role of cFLIP in maintaining breast epithelial cell viability and suggest that the mechanisms regulating cFLIP levels should be finely controlled to prevent unwanted cell demise. Key words: Apoptosis, TRAIL, cFLIP, morphogenesis Abbreviations: TRAIL, tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand; TNF, tumor necrosis factor; DISC, death-inducing signalling complex; FADD, Fas-associated death domain; z-VAD.FMK, benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-(OMe) fluoromethyl ketone
3Introduction
Apoptosis is a highly regulated cell death process that is required for integrity and homeostasis of multicellular organisms and is also important in embryonic development (1). Deregulation of apoptosis contributes to different pathological states (2,3). Moreover, defects in the apoptosis machinery can result in drug resistance by tumor cells (4). The past decade has witnessed an enormous progress in our knowledge of the pathway for the execution of apoptotic cell death and both mitochondria-dependent and –independent mechanisms have been involved in the induction of apoptosis by different treatments (5). By exploiting this knowledge base, a number of innovative strategies for treating cancer have been implemented (4). In contrast to many therapeutic drugs that induces apoptosis by acting at the mitochondrial level, the so-called extrinsic pathway of apoptosis utilises membrane-localized “death receptors” to activate the caspase cascade and apoptosis upon ligand binding. These receptors are members of TNF receptor superfamily (6). Amongst their ligands, TRAIL (APO-2 ligand), a member of the TNF family, is a type II transmembrane protein with important functions as an apoptosis inducer in the immune system (7). Moreover, TRAIL selectively induces apoptosis in many tumor cells while leaving normal cells intact and thus is an attractive candidate for antitumor therapies (8), although resistance to TRAIL has been reported in certain tumor cells (9,10).
Activation of TRAIL receptors leads to the formation of a DISC, which includes the receptor itself, the adapter molecule FADD and procaspase-8 (11). Processing and activation of caspase-8 at the DISC leads to a cascade of apoptotic events which results in the death of the cell. At the DISC level, the apoptotic signal may be inhibited by cFLIP, the homologue of vFLIP in vertebrate cells (12). In most cells, cellular FLIP exists as two alternative spliced isoforms: cFLIPL, a homologue of caspase-8, which lacks critical amino acids for proteolytic caspase activity, and cFLIPS, consisting only of two death effector domains (DED) [Irmler, 1997 #30]. A third 23 kDa recently identified form, called cFLIPR with properties similar to those of cFLIPS is also expressed in some cells (13). FLIP expression fluctuates in a cell-type-specific manner and in response to various stimuli, transcriptionally through the NF-κB pathway (14), and at the protein level via altered rates of proteasomal degradation (15), which makes it a versatile inhibitor of apoptotic responses mediated by death receptors. Accumulating evidence indicates an anti-apoptotic function for cFLIPL in many types of human cancer cells (16,17), although it could also play a pro-apoptotic role under certain conditions (18).
In non-transformed cells, cFLIP is an important regulator of cell proliferation, particularly in the immune system (19). However, little is known about the role of cFLIP as an inhibitor of apoptosis in normal cells. In this study, we examined the importance of cFLIP as a survival factor for normal breast epithelial cells in conventional cultures of cells in monolayers as well as in three-dimensional (3D) cultures that better resemble the in vivo architecture of a glandular epithelium (20). We show that knockdown of cFLIPL in normal breast epithelial cells by RNA interference induces spontaneous apoptosis through a ligand-independent TRAIL receptor-mediated pathway. We also demonstrate that in 3D cultures, cFLIPL regulates the formation of acini-like structures.
4Experimental Procedures Reagents and Antibodies –Soluble human His-tagged recombinant TRAIL (residues 95-281) was produced as described (21). Anti-cFLIP monoclonal antibody (NF6) was from Alexis Corp. (San Diego, CA). Anti-caspase 8 was generously provided by Dr. Gerald Cohen (Leicester University, UK). Antibody anti-FADD and Growth factor reduced Matrigel were obtained from BD Bioscience (Erembodegem, Belgium). Monoclonal antibody to alpha-tubulin and puromycin were purchased from Sigma Chemical Corp. Antibody anti-GAPDH was from Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Anti-Bid was generously provided by Dr. X Wang (Howard Hughes Institute, Dallas, Texas). Antibodies against TRAIL-R2/DR5 and TRAIL were from R&D Systems (Minneapolis, USA). Anti-cleaved caspase-3 was from Cell Signalling (MA, USA). Anti-Bcl2 and Horseradish peroxidase conjugated secondary antibodies were obtained from DAKO (Cambridge, United Kingdom). benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-(OMe) fluoromethyl ketone (zVAD-fmk) was purchased from Bachem AG (Bachem, Bubendorf, Switzerland). Cell Lines. Cell lines were either maintained in RPMI medium (MDA-MB231) or in DMEM medium (HEK293-T and BT-474) containing 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine, 50 U of penicillin/ml, and 50 µg of streptomycin/ml. MCF-10A cells were maintained in DMEM/F12 supplemented with 5% donor horse serum, 2 mM L-glutamine, 20 ng of epidermal growth factor (EGF)/ml, 10 µg of insulin/ml, 100 ng of cholera toxin/ml, 0.5 µg of hydrocortisone/ml, 50 U of penicillin/ml, and 50 µg of streptomycin/ml. All cell lines were maintained at 37°C in a humidified 5% CO2, 95% air incubator. siRNA: siRNA against cFLIP (5’-GGGACCUUCUGGAUAUUUUdTdT-3’), cFLIPL (5’-GAGCAUACCUGAAGAGAGAdTdT-3’), cFLIPS (5`-CACCCUAUGCCCAUUGUCCdTdT-3’), Caspase-8 (5’-GGAGCUGCUC UUCCGAAUUdTdT-3’), FADD (5’-GAAAGACCUGUGUGCAGCAUdTdT-3’), DR5 (5’-GACCCUUGUGCUCGUUGUCdTdT-3’), Bid (5’-GAAGACAUCAUCCGGAAUAdTdT-3’), Scrambled (5’-GAGCGCUAGACAAUGAAGdTdT-3’) were from SIGMA-Proligo (Boulder, CO). Cells were transfected with siRNAs using DharmaFECT 1 (Dharmacon, Lafayette, CO) as described by the manufacturer. Retroviral and lentiviral vectors and virus production cFLIPL and cFLIPS (in pCR3.V64 vector, a kind donation of Dr. J. Tschopp, University of Lausanne) were cloned into BamHI/SalI sites of pBabepuro and HindIII/NotI sites of pLPCX, respectively. pBabe-dnFADD and pBabe-Bcl2 vectors have been previously described (22). Retroviruses for protein overexpression were produced by transfection of HEK293-T cells with the corresponding retroviral vectors. Retrovirus-containing supernatants were collected at days 5–7 after transfection and were stored at –80ºC. shRNA against FLIPL in a pSUPER vector (OligoEngine) was digested and cloned between EcoR1 and Cla1 into a H1 promoter-driven pLVTHM lentiviral vector (23). Lentiviruses were produced by transient cotransfection of 293T cells with the corresponding lentiviral vector, packaging plasmid psPAX2 and envelope plasmid pMD2.G. Lentivirus-containing supernatants were collected at day 3 after transfection by centrifugation.
5Generation of MCF-10A Cell Lines MCF-10A cells were plated at 5×105 cells per 10-cm dish and infected with the retroviruses mentioned above. Stable populations were obtained by selection with 2 µg/ml puromycin. MCF-10A cells were plated at 8x104 cells per 35-mm dish and infected with the lentiviruses during 48 hours. Then the cells were used for 3D morphogenesis assays. Morphogenesis assay. Assays were performed as previously described (24,25). Briefly, MCF-10A cells were resuspended in assay medium (DMEM/F12 supplemented with 2% donor horse serum, 10 µg of insulin/ml, 100 ng of cholera toxin/ml, 0.5 µg of hydrocortisone/ml, and 5 ng of EGF/ml). Eight-well RS glass slides (BD Falcon) were coated with 40µl of Matrigel per well. Then, 5x103 cells were plated per well in assay medium containing a final concentration of 2% Matrigel. Assay medium containing 2% Matrigel was replaced every 4 days. Immunofluorescence and image acquisition. Structures were prepared as previously described (24,25). Briefly, acini were fixed in 4% formalin for 25 min at room temperature. Fixed structures were washed with PBS-glycine (130 mM NaCl, 7mM Na2HPO4, 100 mM glycine) three times for 15 min each time. The structures were then blocked in IF buffer (130 mM NaCl, 7 mM Na2HPO4, 3.5 mMNaH2PO4, 7.7 mM NaN3, 0.1% bovine serum albumin, 0.2% Triton X-100,0.05% Tween 20) plus 10% goat serum for 1 to 2 h, followed by 2% blocking buffer (i.e., IF buffer containing 10% goat serum and 20 µg of goat anti-mouse F(ab)2/ml) for 40 min. Primary antibodies were diluted in 2% blocking buffer, followed by incubation overnight at 4°C. Structures were washed three times in IF buffer for 15 min each. Anti-mouse or anti-rabbit secondary antibodies coupled with Alexafluor dyes (Molecular Probes) were diluted in IF buffer containing 10% goat serum, followed by incubation for 60 min. After a wash with IF buffer as described above, structures were incubated with 0.5 ng of DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole; Sigma)/ml before being mounted with the antifade agent Prolong (Molecular Probes). Confocal analysis was performed in a Leica TCS-SP5 laser microscope. Analysis of Apoptosis - Hypodiploid apoptotic cells were detected by flow cytometry according to published procedures (Gong, J et al. Anal. Biochem. 218, 314-319). Immunoblot analysis of proteins - Proteins were resolved on SDS-polyacrylamide minigels and detected as described previously (26). Statistical analysis - Data are presented as mean ± S.E.M. of at least three independent experiments. Differences between treatment groups were determined by using Student's test. Statistical significance was evaluated by calculating P values. P values below 0.05 were considered significant.
6Results Dual role of cFLIP as inhibitor of TRAIL-induced apoptosis and survival protein in breast epithelial cells Recent results from our laboratory have demonstrated the existence of intracellular mechanisms of resistance to TRAIL-induced apoptosis in a variety of breast tumor cell lines. Our data indicated that treatments like IFN gamma, glucose deprivation and inhibitors of cyclin-dependent kinases sensitize breast tumor cells to TRAIL-induced apoptosis (27-29). This sensitization process involves the increased formation of the death-inducing signalling complex (DISC), mediated by regulating the expression of DISC proteins. To understand the mechanism underlying the resistance of breast tumor cells to TRAIL we determined the role of cFLIP isoforms by siRNA methodology. Results shown in figure 1 demonstrate that simultaneous silencing of both cFLIPL and cFLIPS isoforms resulted in an increased sensitivity to TRAIL-induced apoptosis in the cell lines studied. We next examined the role of individual cFLIP isoforms in the sensitivity of breast tumor cells to TRAIL. In BT474 cells, knockdown of cFLIPL was sufficient to markedly sensitize these cells to TRAIL-induced apoptosis. In contrast, silencing of cFLIPL expression did not sensitize MDA-MB231 cells to TRAIL. A likely explanation for these results may be the different levels of cFLIPS isoform between these two cell lines (Fig. 1), with MDA-MB231 cells expressing higher levels of cFLIPS than BT-474 cells. On the other hand, cFLIPS knockdown did not induce sensitivity to TRAIL in any of the cell lines tested, all of them expressing elevated levels of cFLIPL isoform. These results suggest that cFLIPL levels are important determinants of breast tumor cells sensitivity to TRAIL-induced apoptosis. We also examined the role of cFLIP isoforms in the sensitivity of MCF-10A normal breast epithelial cells to TRAIL-induced apoptosis. Silencing expression of either isoform markedly sensitized these cells to TRAIL-induced apoptosis (Fig. 2a). Interestingly, we observed that knockdown of cFLIPL caused spontaneous apoptosis in the absence of TRAIL. In contrast, silencing cFLIPS expression by siRNA did not induce apoptosis in MCF-10A cells (Fig. 2a). We then studied the mechanism of apoptosis induced by cFLIPL knockdown. Spontaneous apoptosis following cFLIPL knockdown was completely inhibited by the pan-caspase inhibitor Z-VAD-fmk (Fig. 2b), demonstrating the participation of caspases in this cell death process. Over-expression of cFLIPL with a retroviral vector clearly inhibited spontaneous apoptosis in MCF-10A cells (Fig. 2c), further indicating that knockdown cFLIPL by siRNA is responsible for the observed apoptosis and is not due to off-target effects of this oligonucleotide. Ligand-independent activation of TRAIL-R2-mediated apoptosis in normal breast epithelial cells by cFLIPL knockdown We next determine the requirements for the activation of apoptosis by cFLIPL siRNA in MCF-10A cells and whether the extrinsic pathway is involved in this process. MCF-10A cells mainly express TRAIL-R2/DR5 and this receptor is responsible for the apoptosis observed in sensitized cells treated with TRAIL (30). To find out whether the apoptosis induced by cFLIPL knockdown requires the expression of TRAIL-R2/DR5, MCF-10A cells were incubated with siRNAs to TRAIL-R2/DR5 and cFLIPL and apoptosis was then measured. Results shown in figure 3a indicate that silencing TRAL-R2/DR5 expression significantly reduces spontaneous apoptosis caused by cFLIPL knockdown. Activation of the extrinsic pathway upon engagement of the pro-apoptotic TRAIL receptors by TRAIL requires the formation of a death-inducing signaling
7complex (DISC), which includes the receptor itself, the adapter molecule FADD and procaspase-8 (11). To determine the role of FADD in the apoptosis induced by cFLIPL silencing in normal breast epithelial cells, we used two different experimental approaches. In the first place, FADD expression was reduced in MCF-10A cells by a specific siRNA (Fig. 3b) and the effect on spontaneous apoptosis by cFLIPL silencing was determined. Results shown in figure 3b indicate that FADD knockdown partially inhibited apoptosis induced by cFLIPL siRNA. Residual FADD present in cells incubated with FADD siRNA may explain the finding that only partial inhibition of apoptosis was observed. To further explore the role of FADD in spontaneous apoptosis by cFLIPL siRNA, we performed some experiments in MCF-10A cells over-expressing a dominant negative form of FADD (DN-FADD). Data shown in figure 3c demonstrate that DN-FADD markedly reduced apoptosis induced by silencing cFLIPL expression in normal breast epithelial cells. We next assessed whether caspase-8 was required for the apoptotic process induced by cFLIPL silencing in MCF-10A cells. To this end, caspase-8 expression was reduced by RNA interference and apoptosis induced by cFLIPL knockdown was determined (Fig. 3d). Our results demonstrate that caspase-8 silencing completely abrogated the apoptosis mediated by cFLIPL knockdown in these cells. Taken together, these data point out to a role of the TRAIL DISC components in spontaneous apoptosis induced upon a reduction in cFLIPL levels in normal breast epithelial cells. TRAIL DISC formation is normally triggered by binding of trimeric ligand to specific death receptors (11,31). We then analyzed whether cFLIPL knockdown induced the expression of TRAIL in MCF-10A cells. However, we could not detect TRAIL protein in cells in which cFLIPL has been silenced by siRNA (results not shown). Furthermore, a recombinant TRAIL-R2/Fc chimeric protein did not inhibit apoptosis mediated by the cFLIPL knockdown whereas it completely prevented TRAIL-induced apoptosis (Fig. 3e). Ligand-independent assembly of the DISC has been demonstrated in the TNF family of death receptors (32), most likely due to the homotypic association of receptors mediated by the pre-ligand-binding assembly domain (PLAD) (33). We are currently investigating whether cFLIPL knockdown induces ligand-independent DISC formation and the mechanisms regulating this process in normal breast epithelial cells. Ligation of pro-apoptotic TRAIL receptors by their ligand activates both mitochondria-dependent and independent mechanisms of apoptosis in various cell types (34,35). We then asked whether ligand-independent, TRAIL-R2-dependent apoptosis induced by cFLIPL silencing required the activation of a mitochondria-operated pathway. For this purpose, we used MCF-10A cells over-expressing Bcl-2 as described in Materials and Methods. Knockdown of cFLIPL expression induced apoptosis in cells infected with an empty retrovirus (Fig. 4a). In contrast, in cells over-expressing Bcl-2 apoptosis induced by cFLIPL siRNA was partially inhibited, which suggested a role of mitochondria in this apoptotic pathway. To further confirm these results, we silenced the expression of the BH3-only protein Bid, a protein substrate of caspase-8 involved in the mitochondrial pathway activated by death receptors and determined apoptosis in MCF-10A cells. Results shown in figure 4b demonstrate that Bid is at least partially involved in the apoptosis induced by cFLIPL knockdown, which supports a role of the mitochondria in this apoptotic pathway. Role of cFLIPL in morphogenesis of acinar structures in 3D cultures of MCF-10A cells
8 MCF-10A is a nontransformed human mammary epithelial cell line which shows many features of normal breast epithelium, including dependence on growth factors and hormones for proliferation and survival, lack of anchorage-independent growth and lack of tumorigenicity in nude mice (36). Interestingly, when grown in a matrix of reconstituted basement membrane components, MCF-10A cells form acinar structures that retain many characteristics of a glandular epithelium in vivo (37). Although it has been reported that TRAIL may play a role during morphogenesis in vitro (22), nothing is known about the role of cFLIP in the formation of acinar structures in 3D cultures. We then examined whether cFLIPL silencing may affect acini development in MCF-10A cells cultured in matrigel. To stably silence the expression of cFLIPL we generated lentiviral vectors expressing GFP and either short hairpin RNA (shRNA) against cFLIPL or an irrelevant shRNA. As shown in figure 5a, after 48 hours in culture cFLIP expression was drastically reduced in viable MCF-10A cells infected with lentiviral shRNA-cFLIPL as compared to a control shRNA. At this time, viable cells were seeded in matrigel dishes to allow the formation of acinar structures. Interestingly, after nine days in culture, the percentage of GFP-expressing acini was markedly reduced in 3D cultures of MCF-10A infected with cFLIPL shRNA lentivirus as compared to cultures of MCF-10A cells infected with control shRNA lentiviral particles (Fig. 5b). These results indicate that down-regulation of cFLIPL expression impedes the development of acini-like structures and suggest that cFLIPL plays a survival role not only in monolayers cultures but also in 3D cultures of normal breast epithelial cells by preventing the onset of an apoptotic cell death process mediated by TRAIL receptors. When cultured on Matrigel, MCF-10A cells undergo a series of proliferative and morphogenetic events resulting in the formation of growth-arrested acini-like spheroids, composed of a single layer of polarized epithelial cells surrounding a hollow lumen. In this cell system, lumen formation requires the activation of an apoptotic process together with the inhibition of proliferation (37). As we have demonstrated in this work that cFLIPL is a survival factor for MCF-10A cells and it could also transmit proliferative signals in certain cell types (19), we asked whether over-expressing it could have an effect in the morphogenesis of acinar structures in 3D cultures of MCF-10A cells. Cells were retrovirally transduced to express either cFLIPL or cFLIPS (Fig. 6a) before culturing then in matrigel containing-medium to investigate morphogenesis. Luminal clearing was determined after staining the acini with DAPI and counting the number of intact nuclei in the lumen. As shown in figure 6b and c, cFLIPL overexpression in MCF-10A cells significantly delayed lumen formation when compared to cells infected with a control pBabe retrovirus. We also investigated morphogenesis in MCF-10A cells overexpressing the short form of cFLIP (cFLIPS). Similarly to cFLIPL-overexpressing cells, cells with elevated levels of cFLIPS also showed a delay in the formation of the lumen (Fig. 6b and c). Our findings that constitutive expression of cFLIP isoforms delays luminal clearing in 3D cultures suggest that the anti-apoptotic properties and perhaps the proliferative potential of these proteins may play a relevant role in the regulation of the morphogenetic process during acini formation.
9
Discussion In tumor cells, cellular FLIP is
an important modulator of procaspase-8 activation and thereby controls induction of apoptosis mediated by death receptors. As an important regulator of caspase-8, cFLIP is responsible for the resistance to death receptor-mediated apoptosis in many types of tumor cells and has been proposed as a potential target for therapeutic intervention (38). At the protein level, of the three expressed forms of cFLIP, cFLIPS is clearly an antiapoptotic molecule with potent activity as inhibitor of caspase-8 at the DISC (12). cFLIPR has been also reported to inhibit death receptor-induced apoptosis when overexpressed in cells (13) although its physiological functions are yet not fully understood. In contrast, the role of cFLIPL in apoptosis regulation has been rather controversial, with studies indicating an antiapoptotic function (12,39) and others reporting an allosteric activation of procaspase-8 and enhancement of apoptosis following death receptor activation (18,40). Despite these conflicting data, available evidences suggest that cFLIPL can either promote or inhibit death receptor-mediated apoptosis depending on its expression levels in the cell.
In normal cells, cFLIP has been shown to exert other functions related to cell activation and proliferation (41-44). In this respect, mice embryos deficient in cFLIP exhibit impaired heart development independently of its antiapoptotic function (45). However, little is known about the role of cFLIP as a survival factor and regulator of apoptosis in normal cells. Our data indicate that cFLIP levels are important determinants of the resistance of normal breast epithelial cells to TRAIL-induced
apoptosis since a reduction in the cellular levels of cFLIP by RNA interference markedly sensitizes these cells to apoptosis. On the other hand, we have recently reported that activation of autophagy by TRAIL is a requirement for the observed resistance of normal epithelial cells to TRAIL (30). Whether cFLIP is inhibiting apoptosis in normal cells by its direct action on procaspase-8 activation or through the regulation of cytoprotective autophagy is unknown at present and we are currently investigating this issue in nontransformed human epithelial cells.
Interestingly, our data demonstrate for the first time that cFLIPL knockdown in normal breast epithelial cells is sufficient to induce apoptosis in a ligand-independent TRAIL-R2/DR5-dependent manner. This cell death mechanism requires the DISC components FADD and procaspase-8 and is partially inhibited by interfering with the mitochondria-operated apoptotic pathway. These results either suggest that a TRAIL DISC is formed in breast epithelial cells when the cellular concentration of cFLIPL protein decreases below a threshold level or that an inactive, preformed DISC is activated as a consequence of the drop in cFLIPL levels in the cell. Our attempts to demonstrate which of these possibilities is correct have failed as we have not been able to detect the TRAIL DISC in the absence of ligand, due perhaps to the slow kinetic of DISC formation and spontaneous cell death in cFLIPL knockdown cells. Activation of spontaneous apoptosis upon silencing of cFLIP has been reported in various tumor cells and these findings have led to propose that cFLIP could be a potential target for antitumor therapy
10(17,39,46). However, our results imply that targeting cFLIP could also affect viability of normal cells and hence this therapeutic strategy may not be acceptable.
Development and involution of the mammary gland are prototypical examples of the importance of apoptosis in morphogenesis and function of this organ (47). Thus, the mammary gland provides an interesting model to characterise the control mechanisms of apoptosis in a physiological system that are disrupted during the pathogenesis of epithelial tumours (20). The mammary gland, a glandular epithelium, is formed by units called acini with a central cavity, the lumen surrounded by polarised epithelial cells. Apoptosis accompanies clearing of the terminal end buds in the developing mammary gland and lumen formation. Many types of early breast cancer lesions such as ductal carcinoma in situ are characterized by loss of acinar organization and filling of the luminal space (48). In culture, MCF-10A cells retain many characteristics of normal breast epithelium and form acinar structures when grown in Matrigel. Our results demonstrate that cFLIPL knockdown with lentiviral vectors expressing shRNA markedly reduces the number of acini in 3D cultures of MCF-10A cells, which suggests that maintenance of cFLIPL levels may have an important role in the control of morphogenesis in the mammary gland. In this respect, it has been reported that TRAIL is up-regulated during morphogenesis of MCF-10A mammary epithelial cells in 3D basement-membrane cultures and inhibition of TRAIL signalling during morphogenesis delays lumen formation (22). Our data in cells over-expressing cFLIP further support the role of this caspase inhibitor in regulating lumen
formation during morphogenesis in 3D cultures. Moreover, we have recently described that TRAIL induces cytoprotective autophagy in monolayer cultures of MCF-10A cells through the activation of a novel signalling pathways that involves TAK1, AMPK and mTOR (30). In these cells, down-regulation of cFLIPL expression by siRNA abrogates TRAIL-induced autophagy and promotes TRAIL-induced apoptosis (our unpublished observations). Thus, cFLIPL may be playing a central role in the morphogenetic process by regulating the outcome of TRAIL receptor activation. On the other hand, it has been recently reported that matrix detachment induces autophagy in breast epithelial cells and inhibition of autophagy in MCF-10A enhances anoikis and luminal apoptosis during morphogenesis (49), further indicating that autophagy plays a cytoprotective role in these processes. Moreover, the DISC components FADD and caspase-8 have been involved in matrix detachment-induced apoptosis in a ligand independent manner (50). Our unpublished observations demonstrate that cFLIP levels are up-regulated following detachment from the extracellular matrix and during morphogenesis. Increased cFLIP levels in the cell may presumably prevent epithelial cells from undergoing anoikis following ECM detachment (51), allowing them to survive provided that they reattach in a timely manner. Therefore, cFLIP levels may be controlling not only TRAIL-induced apoptosis but also anoikis during morphogenesis of the mammary gland.
11References 1. Danial, N. N., and Korsmeyer, S. J. (2004) Cell 116, 205-219 2. Bredesen, D. E., Rao, R. V., and Mehlen, P. (2006) Nature 443, 796-802 3. Green, D. R., and Evan, G. I. (2002) Cancer Cell 1, 19-30 4. Reed, J. C. (2006) Nat Clin Pract Oncol 3, 388-398 5. Green, D. R., and Kroemer, G. (2004) Science 305, 626-629 6. Ashkenazi, A., and Dixit, V. M. (1998) Science 281, 1305-1308 7. Lamhamedi-Cherradi, S. E., Zheng, S. J., Maguschak, K. A., Peschon, J., and
Chen, Y. H. (2003) Nat Immunol 4, 255-260 8. Johnstone, R. W., Frew, A. J., and Smyth, M. J. (2008) Nat Rev Cancer 8, 782-
798 9. Fulda, S., Wick, W., Weller, M., and Debatin, K. M. (2002) Nat Med 8, 808-815 10. Keane, M. M., Ettenberg, S. A., Nau, M. M., Russell, E. K., and Lipkowitz, S.
(1999) Cancer Res 59, 734-741 11. Sprick, M. R., Weigand, M. A., Rieser, E., Rauch, C. T., Juo, P., Blenis, J.,
Krammer, P. H., and Walczak, H. (2000) Immunity 12, 599-609 12. Irmler, M., Thome, M., Hahne, M., Schneider, P., Hofmann, K., Steiner, V.,
Bodmer, J. L., Schroter, M., Burns, K., Mattmann, C., Rimoldi, D., French, L. E., and Tschopp, J. (1997) Nature 388, 190-195
13. Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., and Lavrik, I. N. (2005) J Biol Chem 280, 14507-14513
14. Kreuz, S., Siegmund, D., Scheurich, P., and Wajant, H. (2001) Mol Cell Biol 21, 3964-3973
15. Fukazawa, T., Fujiwara, T., Uno, F., Teraishi, F., Kadowaki, Y., Itoshima, T., Takata, Y., Kagawa, S., Roth, J. A., Tschopp, J., and Tanaka, N. (2001) Oncogene 20, 5225-5231
16. Krueger, A., Schmitz, I., Baumann, S., Krammer, P. H., and Kirchhoff, S. (2001) J Biol Chem 276, 20633-20640
17. Wilson, T. R., McLaughlin, K. M., McEwan, M., Sakai, H., Rogers, K. M., Redmond, K. M., Johnston, P. G., and Longley, D. B. (2007) Cancer Res 67, 5754-5762
18. Chang, D. W., Xing, Z., Pan, Y., Algeciras-Schimnich, A., Barnhart, B. C., Yaish-Ohad, S., Peter, M. E., and Yang, X. (2002) Embo J 21, 3704-3714
19. Thome, M., and Tschopp, J. (2001) Nat Rev Immunol 1, 50-58 20. Debnath, J., and Brugge, J. S. (2005) Nat Rev Cancer 5, 675-688 21. MacFarlane, M., Ahmad, M., Srinivasula, S. M., Fernandes-Alnemri, T., Cohen,
G. M., and Alnemri, E. S. (1997) J Biol Chem 272, 25417-25420 22. Mills, K. R., Reginato, M., Debnath, J., Queenan, B., and Brugge, J. S. (2004)
Proc Natl Acad Sci U S A 101, 3438-3443 23. Wiznerowicz, M., and Trono, D. (2003) J Virol 77, 8957-8961 24. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., and Brugge, J. S. (2001)
Nat Cell Biol 3, 785-792 25. Reginato, M. J., Mills, K. R., Becker, E. B., Lynch, D. K., Bonni, A.,
Muthuswamy, S. K., and Brugge, J. S. (2005) Mol Cell Biol 25, 4591-4601 26. Ruiz-Ruiz, C., and Lopez-Rivas, A. (2002) Biochem J 365, 825-832 27. Munoz-Pinedo, C., Ruiz-Ruiz, C., Ruiz de Almodovar, C., Palacios, C., and
Lopez-Rivas, A. (2003) J Biol Chem 278, 12759-12768 28. Palacios, C., Yerbes, R., and Lopez-Rivas, A. (2006) Cancer Res 66, 8858-8869
1229. Ruiz-Ruiz, C., Ruiz de Almodovar, C., Rodriguez, A., Ortiz-Ferron, G.,
Redondo, J. M., and Lopez-Rivas, A. (2004) J Biol Chem 279, 19712-19720 30. Herrero-Martin, G., Hoyer-Hansen, M., Garcia-Garcia, C., Fumarola, C., Farkas,
T., Lopez-Rivas, A., and Jaattela, M. (2009) Embo J 28, 677-685 31. Bodmer, J. L., Holler, N., Reynard, S., Vinciguerra, P., Schneider, P., Juo, P.,
Blenis, J., and Tschopp, J. (2000) Nat Cell Biol 2, 241-243 32. Beltinger, C., Fulda, S., Kammertoens, T., Meyer, E., Uckert, W., and Debatin,
K. M. (1999) Proc Natl Acad Sci U S A 96, 8699-8704 33. Chan, F. K., Chun, H. J., Zheng, L., Siegel, R. M., Bui, K. L., and Lenardo, M.
J. (2000) Science 288, 2351-2354 34. Ruiz de Almodovar, C., Ruiz-Ruiz, C., Munoz-Pinedo, C., Robledo, G., and
Lopez-Rivas, A. (2001) Oncogene 20, 7128-7133 35. Walczak, H., Bouchon, A., Stahl, H., and Krammer, P. H. (2000) Cancer Res
60, 3051-3057 36. Soule, H. D., Maloney, T. M., Wolman, S. R., Peterson, W. D., Jr., Brenz, R.,
McGrath, C. M., Russo, J., Pauley, R. J., Jones, R. F., and Brooks, S. C. (1990) Cancer Res 50, 6075-6086
37. Debnath, J., Mills, K. R., Collins, N. L., Reginato, M. J., Muthuswamy, S. K., and Brugge, J. S. (2002) Cell 111, 29-40
38. Wajant, H. (2003) Mol Interv 3, 124-127 39. Sharp, D. A., Lawrence, D. A., and Ashkenazi, A. (2005) J Biol Chem 280,
19401-19409 40. Yu, J. W., Jeffrey, P. D., and Shi, Y. (2009) Proc Natl Acad Sci U S A 106,
8169-8174 41. Dohrman, A., Kataoka, T., Cuenin, S., Russell, J. Q., Tschopp, J., and Budd, R.
C. (2005) J Immunol 174, 5270-5278 42. Kataoka, T., Budd, R. C., Holler, N., Thome, M., Martinon, F., Irmler, M.,
Burns, K., Hahne, M., Kennedy, N., Kovacsovics, M., and Tschopp, J. (2000) Curr Biol 10, 640-648
43. Lens, S. M., Kataoka, T., Fortner, K. A., Tinel, A., Ferrero, I., MacDonald, R. H., Hahne, M., Beermann, F., Attinger, A., Orbea, H. A., Budd, R. C., and Tschopp, J. (2002) Mol Cell Biol 22, 5419-5433
44. Screpanti, V., Wallin, R. P., Ljunggren, H. G., and Grandien, A. (2001) J Immunol 167, 2068-2073
45. Yeh, W. C., Itie, A., Elia, A. J., Ng, M., Shu, H. B., Wakeham, A., Mirtsos, C., Suzuki, N., Bonnard, M., Goeddel, D. V., and Mak, T. W. (2000) Immunity 12, 633-642
46. Day, T. W., Huang, S., and Safa, A. R. (2008) Biochem Pharmacol 76, 1694-1704
47. Humphreys, R. C. (1999) J Mammary Gland Biol Neoplasia 4, 213-220 48. Jacks, T., and Weinberg, R. A. (2002) Cell 111, 923-925 49. Fung, C., Lock, R., Gao, S., Salas, E., and Debnath, J. (2008) Mol Biol Cell 19,
797-806 50. Rytomaa, M., Martins, L. M., and Downward, J. (1999) Curr Biol 9, 1043-1046 51. Mawji, I. A., Simpson, C. D., Hurren, R., Gronda, M., Williams, M. A., Filmus,
J., Jonkman, J., Da Costa, R. S., Wilson, B. C., Thomas, M. P., Reed, J. C., Glinsky, G. V., and Schimmer, A. D. (2007) J Natl Cancer Inst 99, 811-822
13Figure legends Figure 1. Knockdown of endogenous cFLIP sensitizes breast tumor cells to TRAIL-induced apoptosis. a) MDA-MB231 and b) BT474 cells were transfected with siRNA oligonucleotides targeting both cFLIP isoforms (FLIP), FLIP long (FLIPL) or FLIP short (FLIPS) as described in materials and methods. A scrambled RNA was also used as non-targeting control oligonucleotide. After 24 h cells were treated with TRAIL 50 ng/ml (MDA-MB231) or 500ng/ml (BT474) for 24h. Apoptosis was measured as percentage of cells with sub-G1 DNA content. Results show the average and S.E.M. of three different experiments. *P <0.05, **P<0.01. We also verified protein knockdown by immunoblot analysis. Cells were harvested prior to the addition of soluble recombinant TRAIL. Tubulin was used as a protein loading control. Figure 2. Knockdown of endogenous cFLIPL induced apoptosis in MCF-10A breast epithelial cells. a) MCF-10A cells were transfected with siRNA oligonucleotides targeting both cFLIP isoforms (FLIP), FLIP long (FLIPL) or FLIP short (FLIPS) for 48h as described in materials and methods. Then TRAIL (100ng/ml) was added for a further 24h period. Apoptosis and protein knockdown were determined as in figure 1. Results show the average and range (apoptosis analysis) or a representative experiment (protein silencing) from of two different experiments. b) MCF-10A cells were transfected either with a siRNA oligonucleotide targeting the long isoform of cFLIP or a scrambled RNA oligonucleotide, as described in materials and methods. At the same time, cells were treated with or without z-VAD-fmk (50µM). After 72 h apoptosis was measured as in figure 1. Results show the average and S.E.M. of three different experiments. **P<0.01. c) MCF-10A cells over-expressing FLIPL or control MCF-10A (pBabe) were transfected with siRNA for FLIPL or a scrambled RNA. After 72h apoptosis was measured as in figure 1. Results show the average and S.E.M. of three different experiments. *P <0.05. Figure 3. TRAIL-R2, FADD and Caspase-8 but not TRAIL are involved in siRNA FLIPL-induced apoptosis in MCF-10A breast epithelial cells. a) MCF-10A cells were transfected with siRNA for FLIPL or TRAIL-R2, or both of them at the same time. After 72 h apoptosis was measured as in figure 1. Results show the average and range of two different experiments. For immunoblot analysis to verify protein knockdown, cells were harvested 72h after transfection. b) MCF-10A cells were transfected with siRNA for FLIPL or FADD, or both of them at the same time. After 72 h apoptosis was measured as in figure 1. Results show the average and S.E.M. of three different experiments. *P<0.05. Protein knockdown was determined by immunoblot analysis 72h after transfection. c) MCF-10A cells over-expressing a dominant negative form of FADD (DN-FADD) or control MCF-10A cells (pBabe), were transfected either with siRNA for FLIPL or scrambled RNA oligonucleotide. After 72h apoptosis was measured as in figure 1. Results show the average and S.E.M. of three different experiments. *P<0.05. Western blot shows the level of FADD in both control MCF-10A cells and cells over-expressing DN-FADD. d) MCF-10A cells were transfected with siRNA for FLIPL or Caspase-8, or both of them at the same time. After 72h apoptosis was determined. Results show the average and S.E.M. of three different
14experiments. **P<0.01. For immunoblot analysis to verify protein knockdown, cells were harvested 72h after transfection. e) MCF-10A cells were transfected either with siRNA for FLIPL or scrambled RNA oligonucleotide (left panel). At the same time, cells were treated with or without a recombinant human TRAIL-R2/Fc chimeric protein (TR2-Fc, 150ng/ml) (RD systems) to block TRAIL signalling. After 72 h apoptosis was measured. Results show the average and S.E.M. of three different experiments. **P<0.01. In right panel MCF-10A cells were treated with TRAIL for in the presence or absence ofTRAIL-R2/Fc and apoptosis was determined as described. Figure 4. The mitochondria-regulated pathway is partially involved in siRNA FLIPL-induced apoptosis. a) MCF-10A cells over-expressing Bcl2 protein or MCF-10A control (pBabe) were transfected either with siRNA for FLIPL or scrambled RNA oligonucleotide. After 72h, apoptosis was measured. Results show the average and range of two independent experiments. Western blot shows Bcl2 levels if control (pBabe) and Bcl2 cells. b) MCF-10A cells were transfected either with siRNA for FLIPL or Bid, or both of them at the same time. After 72 h apoptosis was determined. Results show the average and S.E.M. of three different experiments. *P<0.05. For immunoblot analysis to verify protein knockdown, cells were harvested 72h after transfection. Figure 5. FLIPL is required for MCF-10A cells survival in 3D cultures. MCF-10A cells were infected with lentiviral vectors for the expression of shRNA FLIPL or shRNA scrambled as described in Materials and Methods. After 48 h cells were harvested to verify protein knockdown (a) or for 3D morphogenesis assay (b). For morphogenesis assays cells were cultured for 9 days in matrigel, and then the percentage of GFP-positive acini was determined. Data show the average and range of two independent experiments. Figure 6. Over-expression of cFLIP delays luminal clearing in MCF-10A morphogenesis assay. MCF-10A cells stably over-expressing either FLIPL or FLIPS, or MCF-10A control cells (pBabe, pLPCX) (a) were used for 3D morphogenesis assay (b). The percentage of acini containing four or less intact nuclei in lumen was measured at the indicated time points during morphogenesis. At least 100 acini were counted in each experiment. Values represent the mean and the S.E.M of three independent experiments. *P<0.05.
15Acknowledgements This work was supported by grants from Ministerio de Educación y Ciencia (SAF2006-00633), Red Temática de Investigación Cooperativa en Cáncer (RTICC) (RD06/0020/0068) and Junta de Andalucía (CTS-211) to AL-R. RY was supported by a contract from Instituto de Salud Carlos III. We are grateful to Dr. Didier Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne) for donation of pLVTHM vector. We thank Ana Isabel López-Pérez for excellent technical assistance.
MDA-MB231
a
0
20
40
60A
popt
otic
cel
ls (%
) No TRAILTRAIL
BT474
0
20
40
60
siRNA SC FLIP FLIPL FLIPS
Apo
ptot
ic c
ells
(%) No TRAIL
TRAIL
siRNA SC FLIP FLIPL FLIPS
SC F FL FS
Tubulin
FLIPS
FLIPL
siRNA
FLIPS(Long exposure)
MDA-MB231b
Figure 1
Tubulin
FLIPL
FLIPS
SC F FL FSsiRNA
***
Figure 2
a
siRNA SC FLIP FLIPL FLIPS
FLIPS
Tubulin
FLIPL
0
20
40
60
80
100
Apo
ptot
ic c
ells
(%)
No TRAILTRAIL
Figure 2
b
0
20
40
60
80
100
siRNA SC FLIPL
Apo
ptot
ic c
ells
(%)
NT
Z-VAD
0
20
40
60
siRNA SC FLIPLA
popt
otic
cel
ls (%
)
c
pBABE
FLIPLFLIPL
Actin
pBABE FLIPL
***
Figure 3
FLIPL
GAPDH
TR2
0
20
40
60
siRNA SC FLIPL TR2 FLIPLTR2
Apo
ptot
ic c
ells
(%)
a
Figure 3
0
20
40
60
siRNA SC FLIPL FADD FLIPLFADD
Apo
ptot
ic c
ells
(%)
0
20
40
60
siRNA SC FLIPL
Apo
ptot
ic c
ells
(%)
pBABEDN-FADD
b c
pBabe DN-FADD
FADD
GAPDH
**
Figure 3
0
20
40
60
siRNA SC FLIPL C8 FLIPLC8
Apo
ptot
ic c
ells
(%)
d**
0
20
40
60
siRNA SC FLIPL FLIPL+ TR2-Fc
Apo
ptot
ic c
ells
(%)
Figure 3
e
0
20
40
60
80
100
Control TRAIL
Apo
ptot
ic c
ells
(%) No TR2-Fc
TR2-Fc
**
Figure 4
FLIPL
Bid
GADPH
a b
0
20
40
60
siRNA SC FLIPL
Apo
ptot
ic c
ells
(%) pBabe
Bcl2
0
20
40
60
siRNA SC FLIPL Bid FLIPLBid
Apo
ptot
ic c
ells
(%)
pBabe Bcl2
Bcl-2
GAPDH
*
Figure 5
pLVTHM FLIPL SC
FLIPL
FLIPS
GAPDH
a
pLVTHM-SC pLVTHM-FLIPL
Figure 5
0
20
40
60
80
100
siRNA SC FLIPL
GFP
pos
itive
aci
ni(%
)
b
Figure 6
apLRCX pLRCX/
FLIPS
FLIPL
FLIPS
Actin
pBABE pBABE/FLIPL
pBABE FLIPL FLIPs
Figure 6Morphogenesis
0
20
40
60
80
100
Day 7 Day 10 Day 15 Day 18
Aci
niw
hith
4 or
mor
e ce
lls in
lum
en (%
)
pBabeFLIPLFLIPS
b
c
*
Roscovitine and TRAIL-induced apoptosis664npg
Cell Research | Vol 18 No 6 | June 2008
ORIGINAL ARTICLE
Roscovitine sensitizes breast cancer cells to TRAIL-induced apoptosis through a pleiotropic mechanismGustavo Ortiz-Ferrón1, Rosario Yerbes1, Adriana Eramo2, Ana I López-Pérez1, Ruggero De Maria2, Abelardo López-Rivas1
1Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa, Consejo Superior de Investigaciones Cientificas (CSIC), Avda Américo Vespucio s/n, 41092 Sevilla, Spain; 2Department of Hematology, Oncology and Molecular Medicine, Istituto Superiore di Sanità, Rome, Italy
Correspondence: Abelardo López-RivasTel: +34-95-446-7997; Fax: +34-95-446-1664 E-mail: [email protected] 17 October 2007; revised 3 December 2007; accepted 11 December 2007; published online 6 May 2008Abbreviations: tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL); tumor necrosis factor (TNF); death-inducing signaling complex (DISC); Fas-associated death domain (FADD); cyclin-dependent kinase (CDK); FLICE-inhibitory protein (FLIP); benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-(OMe) fluoromethyl ketone (z-VAD.FMK); poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)
npgCell Research (2008) 18:664-676.© 2008 IBCB, SIBS, CAS All rights reserved 1001-0602/08 $ 30.00 www.nature.com/cr
The tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL/APO2L) is a member of the TNF gene superfamily that induces apoptosis upon engagement of cognate death receptors. While TRAIL is relatively non-toxic to normal cells, it selectively induces apoptosis in many transformed cells. Nevertheless, breast tumor cells are particu-larly resistant to the effects of TRAIL. Here we report that, in combination with the cyclin-dependent kinase inhibitor roscovitine, exposure to TRAIL induced marked apoptosis in the majority of TRAIL-resistant breast cancer cell lines examined. Roscovitine facilitated TRAIL death-inducing signaling complex formation and the activation of caspase-8. The cFLIPL and cFLIPS FLICE-inhibitory proteins were significantly down-regulated following exposure to roscovitine and, indeed, the knockdown of cFLIP isoforms by siRNA sensitized breast tumor cells to TRAIL-induced apoptosis. In addition, we demonstrate that roscovitine strongly suppressed Mcl-1 expression and up-regulated E2F1 protein levels in breast tumor cells. Significantly, the silencing of Mcl-1 by siRNA sensitized breast tumor cells to TRAIL-induced apoptosis. Furthermore, the knockdown of E2F1 protein by siRNA reduced the sensitizing effect of roscovitine in TRAIL-induced apoptosis. In summary, our results reveal a pleitropic mechanism for the pro-apoptotic influence of roscovitine, highlighting its potential as an antitumor agent in breast cancer in combination with TRAIL.Keywords: apoptosis, roscovitine, CDK, TRAIL, DISC, FLIP, Mcl-1, E2F1Cell Research (2008) 18:664-676. doi: 10.1038/cr.2008.54; published online 6 May 2008
Introduction
The tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL/APO-2L), a member of the TNF gene superfamily, induces apoptosis upon binding to the death domain (DD)-containing receptors TRAIL-R1/DR4 and TRAIL-R2/DR5 [1]. However, TRAIL can also bind to the decoy receptors TRAIL-R3/DcR1 and TRAIL-R4/DcR2, which do not transduce apoptotic signals [2]. Since
TRAIL induces apoptosis selectively in transformed cells of diverse origin but not in most normal cells in vitro, it is an attractive candidate for antitumor therapies [2-4]. However, some cancer cells show either partial or complete resistance to the apoptotic effects of TRAIL [3], although it appears that in certain instances this resistance can be overcome by combining TRAIL with chemotherapeutic drugs [5-7].
In the western world, breast cancer is the most common neoplasia amongst women, emphasizing the importance of developing effective treatments. Recently, different com-bined strategies have been studied to improve the effects of chemo- and radiotherapy. Indeed, we and others have reported that interferon-gamma, DNA-damaging drugs and ionizing radiation can sensitize breast cancer cells to TRAIL-induced apoptosis [8-10].
Upon binding to its proapoptotic receptors TRAIL induces the formation of the death-inducing signaling complex (DISC), recruiting the dual adaptor Fas-associ-ated death domain (FADD) molecule through its DD. In turn, this complex recruits the initiator caspase-8 through
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its death effector domain (DED) [11], which is activated at the DISC by oligomerization. The processing and activation of caspase-8 at the DISC stimulates an apoptotic cascade that provokes cell death. The apoptotic signal from the DISC may be inhibited by the cellular FLICE-inhibitory protein (FLIP) [12]. In most cells, two alternatively spliced isoforms of cFLIP exist: a caspase-8 homologue cFLIPL that lacks the amino acids critical for proteolytic caspase activity; and cFLIPS, which is comprised of the two death effector domains alone [12]. Although the role of cFLIP in apoptotic signaling remains controversial, there is strong evidence that it displays antiapoptotic activity [13-15]. The expression of cFLIP varies in a cell type-specific manner and it fluctuates in response to various stimuli. While it can be transcriptionally controlled by the nuclear factor-κB (NF-κB) pathway [16], altered rates of proteasomal degradation also regulate its protein activity [17], making it a versatile inhibitor of the apoptotic responses mediated by death receptors.
Cyclin-dependent kinases (CDKs) are serine/threonine kinases that play a crucial role in regulating both the cell cycle and transcription, through the phosphorylation of transcription factors and tumor suppressor proteins in-volved in DNA replication and cell division [18]. Therefore, CDKs are attractive therapeutic targets for cancer therapy. Roscovitine (CYC202, Seliciclib) is a purine analogue that competes with ATP for binding to the active site of CDKs and it displays a potent in vitro activity against CDK1, CDK2, CDK5, CDK7 and CDK9 [19]. The growth of a wide range of tumor cell types is inhibited by roscovitine in vitro and, likewise, it inhibits the growth of human tumor xenografts in nude mice [20, 21]. Roscovitine causes not only cell cycle arrest but also apoptosis in cancer cells [22] and, accordingly, it is currently being evaluated in phase II clinical trials [23].
While the mechanism by which CDK inhibitors induce apoptosis remains unclear, the CDK inhibitor flavopiridol, a semisynthetic flavone, reduces the levels of antiapop-totic proteins such as XIAP, Mcl-1 or cFLIP [24-26] and up-regulates the transcription factor E2F1, known to be involved in apoptosis [27]. Roscovitine may also down-regulate Mcl-1 or XIAP [28] and it could sensitize glioma cells to TRAIL-induced apoptosis by reducing the levels of survivin and XIAP. However, the down-regulation of these factors may not be sufficient to trigger the activation of caspases [6].
Here we report that TRAIL-resistant human breast can-cer cell lines can be sensitized to TRAIL-induced apoptosis by exposure to roscovitine. The molecular mechanisms underlying the effects of roscovitine involve an increase in the formation of the TRAIL DISC, the down-regulation of cFLIP and Mcl-1, and the up-regulation of the transcrip-
tion factor E2F1.
Results
Roscovitine sensitizes human breast tumor cell lines to TRAIL-induced apoptosis
To analyze whether roscovitine sensitizes breast tumor cells to the apoptotic ligand TRAIL, the breast tumor cell line MDA-MB231 was treated with different concentra-tions of roscovitine to determine the sub-toxic dose capable of sensitizing them to TRAIL-induced apoptosis (Figure 1A). Subsequently, six more breast tumor cell lines were tested to determine whether similar doses also induced roscovitine sensitization to TRAIL-induced apoptosis (Fig-ure 1B). In all the cell lines tested, roscovitine alone induced little cell death at the concentration indicated. However, if the cells were exposed to roscovitine for 7 h before adding TRAIL overnight, apoptotic cell death was significantly increased in all the cell lines tested, even in the highly resistant BT474 and SKBr3 cell lines that over-express the ErbB2/Her-2/neu oncogene. Proteolytic processing of the caspase substrate poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), a hallmark of apoptosis, was observed in the cells treated with roscovitine and TRAIL (Figure 2A). These results demonstrate that the combined treatment with roscovitine and TRAIL induces significant apoptotic cell death in these breast tumor cell lines.
Roscovitine enhances TRAIL-induced activation of cas-pase-8 without affecting the cell surface expression of TRAIL receptors
To elucidate the mechanism underlying the sensitization to TRAIL-induced apoptosis promoted by roscovitine in breast tumor cells, we examined different biochemical events that occur upon TRAIL binding to its receptors at the cell surface. TRAIL initiates apoptosis by induc-ing the recruitment of the adapter molecule FADD to the apoptotic TRAIL receptors and the subsequent engagement and activation of procaspase-8 [29, 30]. We determined whether caspase-8 was activated in MDA-MB231 cells by analyzing the processing of the pro-caspase to the 43/41 kDa intermediate proteolytic fragments, and through the generation of the mature p18 caspase-8 subunits upon TRAIL stimulation. Accordingly, TRAIL-induced activa-tion of caspase-8 was clearly enhanced by pre-treatment with roscovitine (Figure 2A).
Several treatments have been shown to up-regulate the expression of the TRAILR1 (DR4) or TRAILR2 (DR5) death receptors, resulting in enhanced TRAIL-induced apoptosis [31]. We therefore examined the effect of rosco-vitine on the surface expression of TRAIL death and decoy receptors by flow cytometry (Supplementary information,
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Figure 1 Roscovitine sensitizes breast tumor cell lines to TRAIL-induced apoptosis. (A) MDA-MB231 cells were incubated with the indicated concentrations of roscovitine for 7 h prior to the addition of TRAIL. Apoptosis was measured 15 h after the addi-tion of TRAIL (500 ng/ml) as the percentage of cells with sub-G1 DNA content, as described in Materials and Methods. Error bars represent S.D. from three independent experiments. ** P<0.0001. (B) Different breast tumor cell lines were incubated in the presence or absence of roscovitine (20 µM) and subsequently exposed to TRAIL (500 ng/ml) in the same culture media. Alternatively, the MDA-MB435-S and MCF-7 cells were treated with 25 and 50 ng/ml TRAIL, respectively. In all cell lines with the exception of MCF-7, apoptosis was measured as in (A). In MCF-7 cells apoptosis was determined by measuring PS exter-nalization by flow cytometry as described in Materials and Methods.
A
B
–TRAIL+TRAIL
100
80
60
20
0
Apo
ptos
is (%
)
0 5 10 20 40
**
**
Roscovitine (µM)
Apo
ptos
is (%
)A
popt
osis
(%)
Control
Roscovitine
TRAIL
Roscovitine + TRAIL
BT 474 EVSA-T MCF-7
MDA-MB-231 SKBr-3 MDA-MB-435-S
60
40
20
0
60
40
20
0
60
40
20
0
60
40
20
0
60
40
20
0
60
40
20
0
Figure S1). MDA-MB231 cells only express TRAIL-R2 and R4 on the cell surface and, furthermore, the expression of these TRAIL receptors at the cell membrane was not significantly altered by exposure to roscovitine (Supple-
mentary information, Figure S1). Hence, roscovitine does not appear to sensitize MDA-MB231 cells to TRAIL-in-duced apoptosis by modulating the surface expression of TRAIL receptors.
40
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Recruitment of caspase-8 and FADD to the TRAIL DISC is augmented in MDA-MB231 cells exposed to roscovitine
TRAIL binding to its receptors provokes the formation of the DISC, which contains FADD and caspase-8, the main proximal initiators of apoptosis. Therefore, roscovitine may render cells more susceptible to apoptosis by enhancing
the formation of the TRAIL DISC. Using biotinylated TRAIL (TRAIL-b), we could monitor DISC formation by precipitating it from MDA-MB231 cell lysates with streptavidin-agarose beads. We found an increase in the recruitment of procaspase-8 and FADD into the DISC of roscovitine-treated cells (Figure 3). Furthermore, there was an increase in the cleavage of procaspase-8 to the p43/41 intermediate fragments and to the p18 subunit following ex-posure of the cells to roscovitine. The levels of cFLIPL and cFLIPS recruited to the TRAIL DISC were slightly lower in the cells treated with roscovitine (Figure 3, compare lanes 3-4, 5-6 and 7-8). In addition, in both the control and pre-treated cells, cFLIPL was cleaved by caspase-8 to a 43 kDa fragment (FLIPC), which probably represents the product obtained by removal of the C-terminal p10 fragment. Thus, we observed an increase in the caspase-8/FLIP ratio in the DISC of roscovitine-treated cells, suggesting that this ratio may influence the sensitivity to TRAIL-induced apoptosis as indicated previously [32].
Roscovitine treatment induces the redistribution of TRAIL DISC components to lipid rafts and enhances the redistri-bution after TRAIL treatment
As we indicated previously, the induction of apoptosis by TRAIL can be regulated at different levels. Indeed, it was recently shown that lipid rafts may also be involved in signaling through TRAIL and other death receptors [33,
TRAILRoscovitine
PARPp85
Casp 8
p43/41
α-Tubulin
– – + + – + – +
Figure 2 Roscovitine enhances the caspase-8 activation and PARP cleavage induced by TRAIL without affecting the expression of TRAIL receptor at the cell membrane. MDA-MB231 cells were incubated with roscovitine (20 µM) for 7 h prior to the addition of TRAIL (500 ng/ml) for 15 h. Caspase-8 activation and PARP-1 cleavage were assessed by immunoblotting.
u/s 15 30 60 u/s 15 30 60
– – + + + + – + – – + – +
– – + + + + + – + – + – + – +
Time (min)
TRAIL-bRoscovitine
FADD
Casp 8p43/41
FLIPL
FLIPLs
Lysates DISC
Figure 3 The recruitment of caspase 8 and FADD to the TRAIL DISC is enhanced after roscovitine treatment. MDA-MB231 cells incubated in the presence or absence of roscovitine (20 µM, 15 h) were treated with biotinylated-TRAIL (TRAIL-b, 1 µg/ml) for the times indicated. TRAIL receptor complexes were collected with streptavidin-conjugated agarose beads and analyzed by Western blotting for the TRAIL DISC components FADD, caspase-8, FLIPL and FLIPS. Unstimulated receptor controls (u/s) represent the addition of biotinylated-TRAIL to an equivalent volume of lysate isolated from unstimulated cells. Lysates are included as a positive control for the expression of these proteins in MDA-MB231 cells. The data shown are representative of three independent experiments.
p18
p18
FLIPc
+ ++
+
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Cell Research | Vol 18 No 6 | June 2008
34]. Accordingly, the redistribution of death receptors to lipid rafts facilitates the emission of signals that induce apoptosis. To determine whether lipid rafts are involved in the roscovitine sensitization to TRAIL apoptosis, MDA-MB231 cells were incubated with roscovitine for 15 h, treated with TRAIL for 5 min, and lipid rafts were then isolated by sucrose density gradient centrifugation as described in Materials and Methods (Figure 4A). Rosco-vitine treatment caused a redistribution of procaspase-8, FADD and TRAIL R2 to rafts (I fraction), and, although exposure to TRAIL alone also induced a redistribution of these proteins into rafts, pre-treatment with roscovitine enhanced this redistribution. However, the disruption of lipid rafts using methyl-β-cyclodextrin (MBCD) or Imip-ramine (Supplementary information, Figure S2), did not prevent the sensitization of tumor cells to TRAIL apoptosis promoted by roscovitine, suggesting that the localization to lipid rafts does not play a significant role in roscovitine sensitization.
Treatment with roscovitine impairs cFLIPL and cFLIPS mRNA and protein expression
Several studies have suggested that a decrease in cFLIP, a short-lived protein, sensitizes cells to death receptor-in-duced apoptosis. Although this is somewhat controversial [13, 35], the antiapoptotic activity of this protein is clearly supported by data obtained from cells stably over-express-ing cFLIP, from mice deficient in cFLIP and from the selective knockdown of cFLIP [13, 14].
When protein synthesis was inhibited in breast tumor cells with cycloheximide (CHX) before exposure to TRAIL (Figure 5A), all tumor cell lines tested were sensitized to the effects of TRAIL. Hence, short-lived inhibitory proteins
appear to play an important role in preventing TRAIL-in-duced apoptosis. Thus, we investigated whether roscovitine treatment affected the levels of cFLIPL and cFLIPS protein in MDA-MB231 cells. The protein levels of both cFLIPL and cFLIPS decreased in these cells following exposure to roscovitine (Figure 5B). The main decrease was found after 15 h of treatment and partial recovery of cFLIPL was observed after 24 h of treatment. To determine whether cas-pases were required for the roscovitine-mediated decrease in cFLIP expression, MDA-MB231 cells were treated with the pancaspase inhibitor benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-(OMe) fluoromethyl ketone (z-VAD.FMK) for 1 h prior to the addition of roscovitine (20 µM). Inhibition of caspase activity did not prevent the decline of either cFLIPL or cFLIPs levels upon roscovitine treatment, indicating that a caspase-independent mechanism was involved in reducing cFLIP expression (Figure 5C).
Post-translational regulation of cFLIP protein can occur through proteasome-mediated degradation [17, 24, 36]. Hence, we determined whether the reduction of cFLIP after roscovitine treatment was due to protein degradation through the proteasome machinery. In the presence of the proteasome inhibitors MG132 or epoxomicin, there was an increase in the accumulation of cFLIP protein (Figure 5D). Nevertheless, despite the inhibition of cFLIP degradation by the proteasome, roscovitine treatment still caused a de-crease in the levels of cFLIP protein when compared with cells exposed to proteasome inhibitor alone, suggesting that roscovitine may down-regulate cFLIP at the mRNA level. Indeed, roscovitine diminishes the endogenous levels of cFLIPL and cFLIPS mRNA in MDA-MB231 cells (Figure 5E and 5F). Moreover, there was a correlation between the cFLIP protein and mRNA levels following roscovitine treatment (Figure 5B and 5E) which suggests that rosco-vitine mainly down-regulates cFLIP at the mRNA level. However, we cannot completely exclude that treatment with roscovitine is also affecting cFLIP protein degradation by the ubiquitin/proteasome pathway.
Knockdown of endogenous cFLIPL and cFLIPS with siRNA oligonucleotides promotes apoptosis induced by TRAIL in breast tumor cells
Our data clearly show that roscovitine decreases cFLIP expression and sensitizes breast tumor cells to TRAIL-induced apoptosis. Thus, we tested whether the specific silencing of cFLIP expression by siRNA has a similar ef-fect on TRAIL-induced apoptosis. In MDA-MB231 cells, the levels of both cFLIPL and cFLIPS were substantially reduced by a specific siRNA (Figure 6A), whereas a similar concentration of a scrambled control siRNA did not modify cFLIP protein expression. Transfection with cFLIP siRNA had no effect on the expression of procaspase-8, a struc-
NT Roscovitine TRAILRoscovitine
TRAILI S I S I S I S Fraction
Casp 8
FADD
DR5
Actin
Figure 4 Roscovitine redistributes the TRAIL receptor-2 into lipid rafts. MDA-MB231 cells maintained in the presence or absence of roscovitine (20 µM) for 15 h were stimulated with TRAIL-b (500 ng/ml) for 5 min. The cells were then lysed in buffer containing 1% Triton; the detergent-soluble (S) and insoluble (I) fractions were isolated as described in Materials and Methods, and the expres-sion of the indicated proteins was analyzed by western blotting.
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Figure 5 Exposure to roscovitine reduces cFLIP protein and mRNA levels. (A) Different breast tumor cell lines were incubated for 1 h in the presence or absence of cycloheximide (CHX, 5 µg/ml) and then treated with TRAIL at 500 ng/ml (BT-474, SKBr-3, EVSA-T, MDA-MB231), 50 ng/ml (MCF-7) or 25 ng/ml (MDA-MB435S), for a further 15 h period. Apoptosis was assessed as in Figure 1B. (B) Cells were incubated with roscovitine (20 µM) or CHX (5 µg/ml) for the times indicated. Levels of cFLIP protein were determined by western blotting as described in Materials and Methods. Densitometric analysis of cFLIP levels is presented as percentages of control (time 0), using tubulin levels as an internal control for normalization. (C) Cells were treated with roscovitine (20 µM) for 15 h, and then exposed to TRAIL 500 ng/ml for 7 h in the presence or absence of Z-VAD (50 µM) added 1 h before TRAIL. The cells were then processed as in (A) to detect cFLIP protein levels. (D) MDA-MB231 cells were treated with roscovitine (20 µM) for 24 h in the presence or absence of the proteasome inhibitors MG132 (25 µM) or epoxomicin (100 nM). Proteasome inhibitor was added 30 min before roscovitine and the cFLIP protein levels were analyzed by western blotting as in (A). (E) Cells were treated as in (B); the total RNA was isolated and cFLIPL and cFLIPS mRNA transcripts were analyzed by RT-PCR as described in Materials and Methods. PCR amplification of β-actin was used as a control of the input RNA. (F) MDA-MB231 cells were treated with roscovitine (20 µM) for 15 h and cFLIPL and cFLIPS mRNA levels were deter-mined by real time RT-PCR as described in Materials and Methods. Results are the average and range of two independent experiments in triplicate.
A
B C
ED
F
BT 474
MDA-MB-231
EVSA-T
SKBr-3 MDA-MB-435-S
MCF-7A
popt
osis
(%)
Apo
ptos
is (%
)100806040200
100806040200
100806040200
100806040200
100806040200
100806040200
ControlCycloheximideTRAILCycloheximide + TRAIL
Roscovitine CHX
0 8 15 24 0 8 15 24 Time (h)FLIPL
FLIPS
FLIPL 100 53 35 68 100 55 32 40FLIPL 100 50 44 54 100 19 2 12
α-Tubulin
FLIPS
α-Tubulin
FLIPL
α-Tubulin
– – + MG132– – + Roscovitine
– – + Epoxomicin– + – + Roscovitine
Roscovitine CHX
– – + + TRAIL
– – + – + – + RoscovitineFLIPL
FLIPC
FLIPS
α-Tubulin
0 8 15 24 Time (h)8 15 24
FLIPL
FLIPS
cFLIPL cFLIPs1.21
0.80.60.40.2
0Control Roscovitine
1.21
0.80.60.40.2
0Control Roscovitinem
RN
A ex
pres
sion
(frac
tion
of c
ontro
l)
ZVAD
+
++
–
+
+– +
FLIPS
FLIPL
Actin
Roscovitine and TRAIL-induced apoptosis670npg
Cell Research | Vol 18 No 6 | June 2008
turally related proapoptotic protease (Figure 6A). Most importantly, silencing of cFLIP expression resulted in a clear sensitization to TRAIL-induced apoptosis (Figure 6B). These data correlated well with the effects of rosco-vitine and support the hypothesis that down-regulation of cFLIP expression by this CDK inhibitor is critical for the sensitization to TRAIL-induced apoptosis in breast tumor cells. To further substantiate the role of cFLIP in the sensitization observed, we generated MDA-MB231 cells over-expressing cFLIPL and determined the effect of roscovitine treatment on apoptosis by TRAIL. Results shown in Figure 6C demonstrate that cells over-expressing cFLIPL were clearly more resistant to roscovitine-induced
sensitization to TRAIL apoptosis than cells expressing normal cFLIP levels.
Down-regulation of antiapoptotic Mcl-1 protein expres-sion by roscovitine contributes to sensitization to TRAIL-induced apoptosis
Roscovitine alters the expression of different proteins involved in apoptosis [6, 28] and these modifications are associated with the induction of apoptosis by CDK inhibi-tors. On the other hand, it is known that the antiapoptotic Bcl-2 family member Mcl-1 protects cells from apoptosis and that it is up-regulated in different types of cancer [37, 38]. Furthermore, Mcl-1 down-regulation induces apoptosis
A B
C
– Scrb FLIP siRNA
FLIPL
FLIPS
Casp8
no siRNAscrambled
FLIP
50
40
20
10
0
Apo
ptos
is (%
)
**
Control TRAIL
80
60
40
20
0
Apo
ptos
is (%
)
Control R T R/T
MDA-MB231/mock
MDA-MB231/FLIPL
*
Mock FLIPL
FLIPL
GAPDH
Figure 6 Knockdown of endogenous cFLIPL and cFLIPS enhances the apoptosis induced by TRAIL in MDA-MB231 cells. (A) MDA-MB231 cells were transfected with either a siRNA oligonucleotide targeting both cFLIP isoforms, or a scrambled RNA oligonucleotide, as described in Materials and Methods. After 24 h, the cells were harvested for immunoblot analysis to verify protein knockdown using Tubulin as a protein loading control. The results are representative of three independent experiments. (B) MDA-MB231 cells were transfected as in (A), and after 24 h TRAIL (500 ng/ml) was added to the cultures. Apoptosis was measured 24 h after the addition of TRAIL as described in Figure 1. Error bars represent S.D. from three independent experi-ments. ** P<0.0001. (C) Mock-transfected and MDA-MB231 cells transfected with the pCR3.V64-Met-Flag-FLIPL vector were treated with roscovitine (R) (20 µM) for 7 h prior to the addition of TRAIL (T) (500 ng/ml). Apoptosis was measured 15 h after the addition of TRAIL as the percentage of cells with sub-G1 DNA content, as described in Materials and Methods. The inset shows western blot analysis of FLIPL expression in mock and FLIPL transfected cells. GAPDH was used as an internal protein loading control. Error bars represent S.D. from three independent experiments.* P<0.005.
100
30
α-Tubulin
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[39] or sensitizes tumor cells to the apoptosis induced by different stimuli, including TRAIL [40-42]. Exposure to roscovitine markedly down-regulated Mcl-1 protein levels in MDA-MB231 cells (Figure 7A, top panel), suggesting that the decline in Mcl-1 may be a key event by which roscovitine sensitizes cells to TRAIL-induced apoptosis. In this respect, knockdown of Mcl-1 expression by siRNA (Figure 7A, bot-tom panels) significantly sensitized MDA-MB231 cells to TRAIL-induced apoptosis.
E2F1 plays a significant role in roscovitine sensitization to TRAIL-induced apoptosis
The transcription factor E2F1 is involved in the induction of apoptosis and its over-expression in various cell types sensitizes cells to apoptosis induced by ionizing radiation, chemotherapeutic drugs or death receptors [43, 44]. Here we show that roscovitine clearly up-regulates E2F1 protein levels (Figure 7B) in breast tumor cells. Interestingly, E2F1 has also been associated with the regulation of different apoptotic proteins including Mcl-1 and cFLIPS [44, 45]. By transfecting small specific interference RNAs, we disrupted E2F1 expression in MDA-MB231 cells to determine if the up-regulation of E2F1 induced by roscovitine affects
Mcl-1 and/or cFLIP expression. The transfected cells were exposed to roscovitine (for 15 h) 24 h after siRNA trans-fection and the levels of the different apoptotic proteins were evaluated by immunoblotting. Knockdown of E2F1 did not alter the response of MDA-MB231 to roscovitine in terms of the expression of Mcl-1, cFLIP, XIAP, BID or Caspase-2 (Supplementary information, Figure S3), BAX and Apaf-1 (not shown) protein. However, although these protein levels remained unperturbed, there was a reversion of the roscovitine sensitization to TRAIL apoptosis when E2F1 was silenced (Figure 7C), demonstrating the impor-tance of E2F1 in this sensitization process.
Discussion
Antitumor therapy based on the apoptosis-inducing properties of TRAIL and agonistic TRAIL receptor an-tibodies is currently under consideration [46]. However, despite the fact that TRAIL induces selective cell death in human tumor cells, sparing most untransformed cells, resistance to TRAIL is not uncommon in certain tumor cell lines. Furthermore, TRAIL might also promote cell migration and invasion in some apoptosis-resistant cells
Figure 7 Down-regulation of Mcl-1 and up-regulation of E2F1 protein levels after roscovitine treatment in MDA-MB231 cells. MDA-MB231 cells were treated with roscovitine (20 µM) for the times indicated and then Mcl-1 (A) or E2F1 (B) protein levels were analyzed by immunoblotting. The results are representative of at least three independent experiments. In A (bottom panel, left) cells were transfected with either a siRNA oligonucleotide targeting Mcl-1, or a scrambled RNA oligonucleotide, as described in Materials and Methods. After 48 h, the cells were collected and Mcl-1 protein expression was analyzed by western blotting. In A (bottom panel, right) cells were siRNA transfected as in the left panel, and after 48 h TRAIL was added to the cul-tures. Apoptosis was measured 15 h after the addition of TRAIL as described in Figure 1. Error bars represent S.D. from three independent experiments. * P<0.005. (C) Cells were transfected and treated with roscovitine as in Supplementary information, Figure S3 following prior treatment with TRAIL for 2 h. Apoptosis was determined as the percentage of subG1 cells. Error bars represent S.D. from three independent experiments. * P<0.005.
A
BC
Mcl-1
α-Tubulin
E2F1
α-Tubulin
Mcl-1
α-Tubulin
– + Roscovitine (15h)siRNA Scrb Mcl-1
Scrambled Mcl-1 siRNA
UntreatedTRAIL
Apo
ptos
is (%
)252015
10
5
0
*
4 8 15 24 Time (h)Roscovitine– + – + – + – +
30
20
10
0
Apo
ptos
is (%
)
CTRL E2F1 Scrambled siRNA
UTRoscovitineTRAILRoscovitineTRAIL
*
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[47]. Hence, sensitization of cells to TRAIL-induced apoptosis through different strategies would augment the therapeutic potential of TRAIL against its capacity to stimulate invasion, resolving the potential risk to patients with TRAIL-resistant cancers. Combination strategies have been implemented to facilitate TRAIL apoptotic signaling [48], and we have been investigating the resistance of hu-man breast tumor cells to TRAIL and on how to overcome it. We previously indicated that the formation of the DISC is a common target for different sensitizing regimes [24, 49]. Indeed, CDK inhibitors have been reported to down-regulate the expression of antiapoptotic proteins and to up-regulate the levels of pro-apoptotic regulatory proteins [24-27, 50]. The apoptosis-inducing potential of the CDK inhibitor roscovitine led us to investigate its effects on the resistance of breast tumor cells to TRAIL. We found that roscovitine sensitizes different breast tumor cell lines to TRAIL, including the highly resistant cell lines BT474 and SkBr3 that over-express the ErbB2 receptor. Indeed, roscovitine sensitizes breast tumor cell lines to TRAIL irre-spective of their p53 status (see Table 1). While roscovitine did not alter surface expression of TRAIL receptors, the step(s) involved in the sensitization to TRAIL may reside downstream of ligand binding.
A DISC is formed upon TRAIL binding to its pro-apoptotic receptors [11]. In breast tumor cells treated with roscovitine, an increase in the recruitment of procaspase-8 and FADD to the TRAIL DISC was observed, together with the complete activation of caspase-8. Whether or not rosco-vitine treatment induces post-translational modifications of FADD or TRAIL receptors that affect the binding affinities of the DISC components [51] remains to be ascertained. In this respect, it is noteworthy that treatments such as glucose deprivation, inhibition of CDKs and histone deacetylase (HDAC) inhibitors, all seem to enhance the formation of the TRAIL DISC in the absence of TRAIL receptor up-regulation [24, 49, 52]. The localization of death receptors and other DISC components into lipid rafts may play a role in mediating sensitization to apoptotic stimuli [33, 53]. Indeed, roscovitine itself caused a redistribution of DISC proteins into lipid rafts fractions and facilitated that induced by TRAIL in breast tumor cells. However, the disruption
of either cholesterol or ceramide-enriched lipid rafts by specific inhibitors did not prevent roscovitine-induced sensitization to TRAIL in breast tumor cells. Hence, the redistribution of DISC components to membrane lipid rafts is not absolutely necessary to induce apoptosis by TRAIL in these cells. In this respect, the treatment of cells with MBCD failed to block CD95-mediated apoptosis in the B-lymphoblastoid cell line SKW6.4 [35]. Furthermore, it has been demonstrated that acid sphingomyelinase-deficient hepatocytes and mice are protected from CD95-induced apoptosis or death. In contrast, acid sphingomyelinase-deficient and wild-type thymocytes, or Concanavalin- or lipopolysaccharide-pre-stimulated lymphocytes, were equally sensitive to CD95-induced apoptosis [54]. Together these results suggest that the requirement for death receptor localization in lipid rafts to activate apoptosis may be cell type dependent.
Since a protein synthesis inhibitor could restore the sen-sitivity of various breast tumor cell lines to TRAIL-induced apoptosis, short-lived inhibitory proteins are likely to be im-portant to prevent TRAIL-induced signaling and apoptosis. We analyzed the expression of several antiapoptotic pro-teins such as cFLIP, Mcl-1 and XIAP, known to have a short half-life [55-57]. In cells treated with a sensitizing dose of roscovitine cFLIPL, cFLIPS and Mcl-1 were markedly down-regulated. Moreover, the down-regulation of cFLIP protein was associated with a decrease in the mRNA levels for both cFLIPL and cFLIPS in cells treated with roscovitine. These results are in agreement with other data indicating that CDK inhibitors regulate transcription through the po-tent inhibition of positive transcription elongation factor b (P-TEFb), comprised of CDK9 and cyclin T1, thereby controlling the elongation phase of transcription by RNA polymerase II [58]. However, whereas flavopiridol has been shown to reduce global mRNA levels, at the doses used here roscovitine mostly affects a subset of cellular genes resulting in down-regulation of several short-lived proteins, including Mcl-1 [23, 59, 60]. In contrast, despite reports that roscovitine treatment down-regulates XIAP expression in glioma cells [6], we did not observe a decrease in XIAP protein levels in breast tumor cells treated with roscovitine. This is consistent with our previous results indicating that specific siRNA knockdown of XIAP did not sensitize breast tumor cells to TRAIL-induced apoptosis [24].
The importance of cFLIP down-regulation by roscovitine in the sensitization process was supported by the finding that siRNA silencing of cFLIP was sufficient to sensitize breast tumor cells to TRAIL-induced apoptosis. Competi-tion between FADD and cFLIPL for the DD of TRAIL receptor DR5 [61] could also modulate DISC formation. The decrease in cFLIPL levels upon roscovitine treatment observed in our work could favor binding of FADD and pro-
Table 1 p53 status in breast tumor cell lines
p53MDA-MB231 mutatedMCF-7 normalMDA-MB435-S mutatedSKBr-3 mutatedBT-474 mutated
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caspase-8 to the TRAIL DISC. The increased recruitment of FADD and caspase-8 to the TRAIL DISC observed in roscovitine-treated cells, together with a decrease in cFLIP levels, resulted in an elevation of the caspase-8/cFLIP ra-tio in the DISC of roscovitine-treated cells, which should facilitate caspase-8 activation and promote apoptosis [32]. In breast tumor cells, TRAIL has been reported to induce apoptosis through a mitochondrial pathway, involving the translocation of truncated Bid and Bax to the mitochon-dria followed by the release of cytochrome c from this organelle [62]. The anti-apoptotic Bcl-2 family member Mcl-1 has recently been reported to bind truncated Bid and to prevent death-receptor mediated apoptosis [40, 63]. Furthermore, Mcl-1 down-regulation by siRNA has also been demonstrated to restore the sensitivity of tumor cells to TRAIL-induced apoptosis [26]. Our results also demonstrate that silencing of Mcl-1 expression by siRNA partly sensitizes breast tumor cells to TRAIL-induced apoptosis. Based on these evidence, it seems very likely that Mcl-1 down-regulation upon exposure to roscovitine could cooperate with cFLIP depletion to facilitate TRAIL-induced release of apoptotic factors from the mitochondria in breast tumor cells.
Our data show that treatment with a sensitizing dose of roscovitine caused a marked increase in E2F1 protein ex-pression in breast tumor cells. The role played by E2F1 in the sensitization process was evaluated by siRNA silencing, indicating that the knockdown of E2F1 expression signifi-cantly reduced roscovitine-induced sensitization to TRAIL. A previous report has demonstrated that over-expression of E2F1 in human lung adenocarcinoma cell lines caused the down-regulation of cFLIPs expression and sensitized these cells to death receptor-induced apoptosis [44]. Furthermore, E2F1 directly represses Mcl-1 expression by binding to the Mcl-1 gene promoter. Together, these data suggest that the roscovitine-induced depletion of both cFLIP and Mcl-1 in breast tumor cells may be mediated by E2F1 up-regulation. However, we failed to observe reversal of cFLIP and Mcl-1 down-regulation in cells that were depleted of E2F1 by siRNA silencing. Clustering of the death receptor CD95/Fas and formation of the DISC in the absence of ligand have been also reported in cells over-expressing E2F1 [44]. Whether the increased recruitment of procaspase-8 and FADD to the TRAIL DISC observed in roscovitine-treated breast tumor cells is mediated by up-regulation of E2F1 is an issue that requires further study.
In conclusion, roscovitine can induce apoptosis in differ-ent tumor cell lines and causes regression of human xeno-graft tumors in mice [20]. Since it also seems less toxic for normal cells than other CDK inhibitors [28], it might be a good candidate to use in combined strategies against breast cancer. In fact, treatment with CDK inhibitors sensitizes
tumor cells to apoptosis induced by different anti-tumor agents [64, 65]. In the present study, we show that rosco-vitine treatment sensitizes human breast tumor cell lines to TRAIL-induced apoptosis, independent of the p53 and ErbB-2 receptor status, through a pleiotropic mechanism that involves increased DISC formation, cFLIP and Mcl-1 down-regulation, and E2F1 up-regulation. The present findings provide further support for the general strategy of combining TRAIL and CDK inhibitors in anti-cancer regimens against TRAIL-resistant tumor cells.
Materials and Methods
Reagents and antibodiesRoscovitine, MBCD, Imipramine, streptavidin-agarose beads, and
MG 132 were obtained from SIGMA Chemical Corp. (St Louis, MO). Soluble human His-tagged recombinant TRAIL and biotin-labeled recombinant TRAIL (bTRAIL) were generated in our laboratory as described [66]. Anti-human TRAIL-receptor R1, R2, R3 and R4 antibodies and anti-cFLIP monoclonal antibody (NF6) were from Alexis Corp. (San Diego, CA). Anti-caspase 8 was a gift from Dr Gerald Cohen (Leicester University, UK). Bax, XIAP FADD and RIP antibodies were from BD Bioscience (Erembodegem, Belgium). The PARP polyclonal antiserum was from Roche Molecular Biochemicals (Germany). The monoclonal antibody to alpha-tubulin was purchased from Sigma Chemical Corp. Antibodies against GAPDH, Mcl-1 (S-19), E2F1 (KH95), DR5 (N19) and Caspase-2-L were from Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA). Horseradish peroxidase or FITC conjugated, goat anti-mouse and goat anti-rabbit secondary antibodies were obtained from DAKO (Cambridge, UK). zVAD-fmk was from Bachem AG (Bachem, Bubendorf, Switzerland).
Cell cultureThe human tumor cell lines MDA-MB231 and EVSA-T were
maintained in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 2 mM l-glutamine, and 40 µg/ml gentamycin. MDA-MB468, SKBr-3, MDA-MB435-S and BT-474 were maintained in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum, 2 mM l-glutamine, and 40 µg/ml gentamycin. MDA-MB435-S was also supplemented with insulin (10 µg/ml). The cells were maintained at 37 °C in a humidified 5% CO2, 95% air incubator. A stable cell line over-expressing cFLIPL was generated upon transfection of MDA-MB231 cells with pCR3.V64-Met-Flag-FLIPL (a kind donation of Dr J Tschopp, University of Lausanne) by electroporation. Mock-transfected cells and cells over-expressing FLIPL were selected in culture medium with 1 mg/ml G418 (Sigma Chemical Co.) and analyzed for the expression of cFLIPL by Western blot.
Analysis of apoptosisHypodiploid apoptotic cells were detected by flow cytometry
according to published procedures [10]. Phosphatidylserine (PS) exposure on the surface of apoptotic cells was detected by flow cytometry after staining with Anexin-V-FLUOS (Roche Molecular Biochemicals).
Immunoblot analysis of proteinsThe assay for measurements of cytochrome c and Bax was
Roscovitine and TRAIL-induced apoptosis674npg
Cell Research | Vol 18 No 6 | June 2008
performed as described previously [49]. Proteins were resolved on SDS-polyacrylamide minigels and visualized as described previ-ously [10].
Analysis of TRAIL receptors by flow cytometryMDA-MB231 cells were detached with RPMI 1640/EDTA,
washed in ice-cold PBS, and resuspended in PBS. Cells were then labeled with anti-TRAIL receptor antibodies (5 µg/ml) or no antibody (negative control), and then incubated with goat anti-mouse FITC-conjugated antibody F(ab´)2 fragment. Labeled cells were analyzed by flow cytometry using the CellQuest software (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
Isolation of the TRAIL DISCDISC precipitation was performed using biotin-tagged recombi-
nant TRAIL (bio-TRAIL) [66]. MDA-MB231 cells were incubated for 15 h in the presence or absence of 20 µmol/l roscovitine and they were then exposed to bio-TRAIL for the times indicated in Figure 3. DISC formation was determined as reported previously [66].
Reverse transcriptase (RT) and PCR assaysTotal RNA was isolated from MDA-MB231 cells with the Trizol
reagent (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) as recommended by the supplier. Total RNA (2 µg) was used as a template for cDNA synthesis using a RT-PCR kit (Perkin-Elmer). PCRs were carried out using specific primers for cFLIPL and cFLIPS as described previously [24].
Real-time RT-PCR MDA-MB231 cells were treated with roscovitine (20 µM) for 15
h. Total RNA was isolated from cells as described before. Total RNA (1 µg) was used as a template for cDNA synthesis using a RT-PCR kit (Perkin-Elmer) with the supplied random hexamers and under the conditions described by the manufacturer. mRNA expression was analyzed in triplicate by quantitative RT-PCR on the ABI Prism 7500 sequence detection system using predesigned Assay-on-demand primers and probes (Applied Biosystems). mRNA expression was determined by the comparative cycle threshold (Ct) method (∆∆Ct). Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase was used as an internal control and mRNA expression levels of cFLIPL and cFLIPS were given as fraction of mRNA levels in control cells.
TRAIL stimulation and isolation of lipid rafts Sixty million cells were left untreated or stimulated for the indi-
cated time points with 1 µg/ml TRAIL-biotinylated after pre-incuba-tion with Roscovitine (20 µM, 15 h) where indicated. Treated samples were routinely collected to subsequently evaluate cell viability as described [67]. Lipid raft extraction was performed according to standard protocols [68]. Briefly, the cell pellet was dissolved in 750 µl of 1% Triton X-100/25 mM MES/150 mM NaCl buffer at 4 °C. After homogenization, the cell lysates were subjected to sucrose gradient centrifugation at 45 000 rpm for 16 h in an SW60 rotor (Beckman Instruments). Twelve 375-µl fractions were collected from the top to the bottom of each gradient. For cholesterol depletion studies, cells were treated with 10 mM MBCD for 30 min at 37 °C in serum-free medium before lipid raft isolation.
Statistical analysis All data are presented as the mean ± SE of at least three in-
dependent experiments. The differences among different groups were determined by the Student’s t test. P < 0.05 was considered significant.
References
1 Ashkenazi A, Dixit VM. Death receptors: signaling and modula-tion. Science 1998; 281:1305-1308.
2 Sheridan JP, Marsters SA, Pitti RM, et al. Control of TRAIL-induced apoptosis by a family of signaling and decoy receptors. Science 1997; 277:818-821.
3 Ashkenazi A, Pai RC, Fong S, et al. Safety and antitumor ac-tivity of recombinant soluble Apo2 ligand. J Clin Invest 1999; 104:155-162.
4 Reed JC. Drug insight: cancer therapy strategies based on res-toration of endogenous cell death mechanisms. Nat Clin Pract Oncol 2006; 3:388-398.
5 El-Zawahry A, McKillop J, Voelkel-Johnson C. Doxorubicin increases the effectiveness of Apo2L/TRAIL for tumor growth inhibition of prostate cancer xenografts. BMC Cancer 2005; 7:2-5.
6 Kim EH, Kim SU, Shin DY, Choi KS. Roscovitine sensitizes glioma cells to TRAIL-mediated apoptosis by downregulation of survivin and XIAP. Oncogene 2004; 23:446-456.
7 Lashinger LM, Zhu K, Williams SA, Shrader M, Dinney CP, McConkey DJ. Bortezomib abolishes tumor necrosis factor-re-lated apoptosis-inducing ligand resistance via a p21-dependent mechanism in human bladder and prostate cancer cells. Cancer Res 2005; 65:4902-4908.
8 Chinnaiyan AM, Prasad U, Shankar S, et al. Combined effect of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand and ionizing radiation in breast cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97:1754-1759.
9 Ohtsuka T, Buchsbaum D, Oliver P, Makhija S, Kimberly R, Zhou T. Synergistic induction of tumor cell apoptosis by death receptor antibody and chemotherapy agent through JNK/p38 and mitochondrial death pathway. Oncogene 2003; 22:2034-2044.
10 Ruiz-Ruiz C, Lopez-Rivas A. Mitochondria-dependent and -independent mechanisms in tumour necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-induced apoptosis are both regulated by interferon-gamma in human breast tumour cells. Biochem J 2002; 365:825-832.
11 Sprick MR, Weigand MA, Rieser E, et al. FADD/MORT1 and caspase-8 are recruited to TRAIL receptors 1 and 2 and are es-sential for apoptosis mediated by TRAIL receptor 2. Immunity 2000; 12:599-609.
12 Irmler M, Thome M, Hahne M, et al. Inhibition of death receptor signals by cellular FLIP. Nature 1997; 388:190-195.
13 Krueger A, Schmitz I, Baumann S, Krammer PH, Kirchhoff S. Cellular FLICE-inhibitory protein splice variants inhibit differ-ent steps of caspase-8 activation at the CD95 death-inducing signaling complex. J Biol Chem 2001; 276:20633-20640.
14 Sharp DA, Lawrence DA, Ashkenazi A. Selective knockdown of the long variant of cellular FLICE inhibitory protein augments death receptor-mediated caspase-8 activation and apoptosis. J Biol Chem 2005; 280:19401-19409.
15 Yeh WC, Itie A, Elia AJ, et al. Requirement for Casper (c-FLIP) in regulation of death receptor-induced apoptosis and embryonic development. Immunity 2000; 12:633-642.
www.cell-research.com | Cell Research
Gustavo Ortiz-Ferrón et al.675npg
16 Kreuz S, Siegmund D, Scheurich P, Wajant H. NF-κB inducers upregulate cFLIP, a cycloheximide-sensitive inhibitor of death receptor signaling. Mol Cell Biol 2001; 21:3964-3973.
17 Fukazawa T, Fujiwara T, Uno F, et al. Accelerated degradation of cellular FLIP protein through the ubiquitin-proteasome pathway in p53-mediated apoptosis of human cancer cells. Oncogene 2001; 20:5225-5231.
18 Grana X, Reddy EP. Cell cycle control in mammalian cells: role of cyclins, cyclin dependent kinases (CDKs), growth suppressor genes and cyclin-dependent kinase inhibitors (CKIs). Oncogene 1995; 11:211-219.
19 Meijer L, Borgne A, Mulner O, et al. Biochemical and cellular effects of roscovitine, a potent and selective inhibitor of the cyclin-dependent kinases cdc2, cdk2 and cdk5. Eur J Biochem 1997; 243:527-536.
20 McClue SJ, Blake D, Clarke R, et al. In vitro and in vivo antitu-mor properties of the cyclin dependent kinase inhibitor CYC202 (R-roscovitine). Int J Cancer 2002; 102:463-468.
21 Whittaker SR, Walton MI, Garrett MD, Workman P. The Cyclin-dependent kinase inhibitor CYC202 (R-roscovitine) inhibits retinoblastoma protein phosphorylation, causes loss of Cyclin D1, and activates the mitogen-activated protein kinase pathway. Cancer Res 2004; 64:262-272.
22 Mgbonyebi OP, Russo J, Russo IH. Roscovitine induces cell death and morphological changes indicative of apoptosis in MDA-MB-231 breast cancer cells. Cancer Res 1999; 59:1903-1910.
23 MacCallum DE, Melville J, Frame S, et al. Seliciclib (CYC202, R-Roscovitine) induces cell death in multiple myeloma cells by inhibition of RNA polymerase II-dependent transcription and down-regulation of Mcl-1. Cancer Res 2005; 65:5399-5407.
24 Palacios C, Yerbes R, Lopez-Rivas A. Flavopiridol induces cel-lular FLICE-inhibitory protein degradation by the proteasome and promotes TRAIL-induced early signaling and apoptosis in breast tumor cells. Cancer Res 2006; 66:8858-8869.
25 Rosato RR, Dai Y, Almenara JA, Maggio SC, Grant S. Potent an-tileukemic interactions between flavopiridol and TRAIL/Apo2L involve flavopiridol-mediated XIAP downregulation. Leukemia 2004; 18:1780-1788.
26 Taniai M, Grambihler A, Higuchi H, et al. Mcl-1 mediates tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand resistance in human cholangiocarcinoma cells. Cancer Res 2004; 64:3517-3524.
27 Ma Y, Cress WD, Haura EB. Flavopiridol-induced apoptosis is mediated through up-regulation of E2F1 and repression of Mcl-1. Mol Cancer Ther 2003; 2:73-81.
28 Hahntow IN, Schneller F, Oelsner M, et al. Cyclin-dependent kinase inhibitor Roscovitine induces apoptosis in chronic lym-phocytic leukemia cells. Leukemia 2004; 18:747-755.
29 Bodmer JL, Holler N, Reynard S, et al. TRAIL receptor-2 signals apoptosis through FADD and caspase-8. Nat Cell Biol 2000; 2:241-243.
30 Kischkel FC, Lawrence DA, Chuntharapai A, Schow P, Kim KJ, Ashkenazi A. Apo2L/TRAIL-dependent recruitment of endog-enous FADD and caspase-8 to death receptors 4 and 5. Immunity 2000; 12:611-620.
31 Gibson SB, Oyer R, Spalding AC, Anderson SM, Johnson GL. Increased expression of death receptors 4 and 5 synergizes the apoptosis response to combined treatment with etoposide and TRAIL. Mol Cell Biol 2000; 20:205-212.
32 MacFarlane M, Harper N, Snowden RT, et al. Mechanisms of resistance to TRAIL-induced apoptosis in primary B cell chronic lymphocytic leukaemia. Oncogene 2002; 21:6809-6818.
33 Delmas D, Rebe C, Micheau O, et al. Redistribution of CD95, DR4 and DR5 in rafts accounts for the synergistic toxicity of resveratrol and death receptor ligands in colon carcinoma cells. Oncogene 2004; 23:8979-8986.
34 Vanoosten RL, Moore JM, Ludwig AT, Griffith TS. Depsipep-tide (FR901228) enhances the cytotoxic activity of TRAIL by redistributing TRAIL receptor to membrane lipid rafts. Mol Ther 2005; 11:542-552.
35 Chang DW, Xing Z, Pan Y, et al. c-FLIP(L) is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO J 2002; 21:3704-3714.
36 Kim Y, Suh N, Sporn M, Reed JC. An inducible pathway for degradation of FLIP protein sensitizes tumor cells to TRAIL-induced apoptosis. J Biol Chem 2002; 277:22320-22329.
37 Michels J, O’Neill JW, Dallman CL, et al. Mcl-1 is required for Akata6 B-lymphoma cell survival and is converted to a cell death molecule by efficient caspase-mediated cleavage. Oncogene 2004; 23:4818-4827.
38 Zhou P, Levy NB, Xie H, et al. MCL1 transgenic mice exhibit a high incidence of B-cell lymphoma manifested as a spectrum of histologic subtypes. Blood 2001; 97:3902-3909.
39 Zhang B, Gojo I, Fenton RG. Myeloid cell factor-1 is a critical survival factor for multiple myeloma. Blood 2002; 99:1885-1893.
40 Clohessy JG, Zhuang J, de Boer J, Gil-Gomez G, Brady HJ. Mcl-1 interacts with truncated Bid and inhibits its induction of cytochrome c release and its role in receptor-mediated apoptosis. J Biol Chem 2006; 281:5750-5759.
41 Han J, Goldstein LA, Gastman BR, Rabinowich H. Interrelated roles for Mcl-1 and BIM in regulation of TRAIL-mediated mi-tochondrial apoptosis. J Biol Chem 2006; 281:10153-10163.
42 Wirth T, Kuhnel F, Fleischmann-Mundt B, et al. Telomerase-dependent virotherapy overcomes resistance of hepatocellular carcinomas against chemotherapy and tumor necrosis factor-re-lated apoptosis-inducing ligand by elimination of Mcl-1. Cancer Res 2005; 65:7393-7402.
43 Nip J, Strom DK, Fee BE, Zambetti G, Cleveland JL, Hiebert SW. E2F-1 cooperates with topoisomerase II inhibition and DNA damage to selectively augment p53-independent apoptosis. Mol Cell Biol 1997; 17:1049-1056.
44 Salon C, Eymin B, Micheau O, et al. E2F1 induces apoptosis and sensitizes human lung adenocarcinoma cells to death-re-ceptor-mediated apoptosis through specific downregulation of c-FLIP(short). Cell Death Differ 2006; 13:260-272.
45 Croxton R, Ma Y, Song L, Haura EB, Cress WD. Direct repres-sion of the Mcl-1 promoter by E2F1. Oncogene 2002; 21:1359-1369.
46 Fesik SW. Promoting apoptosis as a strategy for cancer drug discovery. Nat Rev Cancer 2005; 5:876-885.
47 Trauzold A, Siegmund D, Schniewind B, et al. TRAIL promotes metastasis of human pancreatic ductal adenocarcinoma. Onco-gene 2006; 25:7434-7439.
48 Held J, Schulze-Osthoff K. Potential and caveats of TRAIL in cancer therapy. Drug Resist Updat 2001; 4:243-252.
49 Munoz-Pinedo C, Ruiz-Ruiz C, Ruiz de Almodovar C, Palacios C, Lopez-Rivas A. Inhibition of glucose metabolism sensitizes
Roscovitine and TRAIL-induced apoptosis676npg
Cell Research | Vol 18 No 6 | June 2008
tumor cells to death receptor-triggered apoptosis through en-hancement of death-inducing signaling complex formation and apical procaspase-8 processing. J Biol Chem 2003; 278:12759-12768.
50 Mihara M, Shintani S, Kiyota A, Matsumura T, Wong DT. Cyclin-dependent kinase inhibitor (roscovitine) suppresses growth and induces apoptosis by regulating Bcl-x in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Oncol 2002; 21:95-101.
51 Harper N, Hughes MA, Farrow SN, Cohen GM, MacFarlane M. Protein kinase C modulates tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis by targeting the apical events of death receptor signaling. J Biol Chem 2003; 278:44338-44347.
52 Inoue S, MacFarlane M, Harper N, Wheat LM, Dyer MJ, Cohen GM. Histone deacetylase inhibitors potentiate TNF-related apop-tosis-inducing ligand (TRAIL)-induced apoptosis in lymphoid malignancies. Cell Death Differ 2004; 11(Suppl 2):S193-206.
53 Gajate C, Mollinedo F. Edelfosine and perifosine induce selective apoptosis in multiple myeloma by recruitment of death receptors and downstream signaling molecules into lipid rafts. Blood 2007; 109:711-719.
54 Lin T, Genestier L, Pinkoski MJ, et al. Role of acidic sphingo-myelinase in Fas/CD95-mediated cell death. J Biol Chem 2000; 275:8657-8663.
55 Nijhawan D, Fang M, Traer E, et al. Elimination of Mcl-1 is required for the initiation of apoptosis following ultraviolet ir-radiation. Genes Dev 2003; 17:1475-1486.
56 Poukkula M, Kaunisto A, Hietakangas V, et al. Rapid turnover of c-FLIPshort is determined by its unique C-terminal tail. J Biol Chem 2005; 280:27345-27355.
57 Yang Y, Fang S, Jensen JP, Weissman AM, Ashwell JD. Ubiq-uitin protein ligase activity of IAPs and their degradation in proteasomes in response to apoptotic stimuli. Science 2000; 288:874-877.
58 Chao SH, Price DH. Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo. J Biol Chem 2001; 276:31793-31799.
59 Lam LT, Pickeral OK, Peng AC, et al. Genomic-scale mea-
surement of mRNA turnover and the mechanisms of action of the anti-cancer drug flavopiridol. Genome Biol 2001; 2:RESEARCH0041.
60 Alvi AJ, Austen B, Weston VJ, et al. A novel CDK inhibitor, CYC202 (R-roscovitine), overcomes the defect in p53-dependent apoptosis in B-CLL by down-regulation of genes involved in transcription regulation and survival. Blood 2005; 105:4484-4491.
61 Jin TG, Kurakin A, Benhaga N, et al. Fas-associated protein with death domain (FADD)-independent recruitment of c-FLIPL to death receptor 5. J Biol Chem 2004; 279:55594-55601.
62 Ruiz de Almodovar C, Ruiz-Ruiz C, Munoz-Pinedo C, Robledo G, Lopez-Rivas A. The differential sensitivity of Bc1-2-overex-pressing human breast tumor cells to TRAIL or doxorubicin-in-duced apoptosis is dependent on Bc1-2 protein levels. Oncogene 2001; 20:7128-7133.
63 Certo M, Del Gaizo Moore V, et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members. Cancer Cell 2006; 9:351-365.
64 Dai Y, Grant S. Cyclin-dependent kinase inhibitors. Curr Opin Pharmacol 2003; 3:362-370.
65 Edamatsu H, Gau CL, Nemoto T, Guo L, Tamanoi F. Cdk inhibi-tors, roscovitine and olomoucine, synergize with farnesyltransfer-ase inhibitor (FTI) to induce efficient apoptosis of human cancer cell lines. Oncogene 2000; 19:3059-3068.
66 Harper N, Farrow SN, Kaptein A, Cohen GM, MacFarlane M. Modulation of tumor necrosis factor apoptosis-inducing ligand- induced NF-κ B activation by inhibition of apical caspases. J Biol Chem 2001; 276:34743-34752.
67 De Maria R, Lenti L, Malisan F, et al. Requirement for GD3 ganglioside in CD95- and ceramide-induced apoptosis. Science 1997; 277:1652-1655.
68 Parolini I, Sargiacomo M, Lisanti MP, Peschle C. Signal trans-duction and glycophosphatidylinositol-linked proteins (lyn, lck, CD4, CD45, G proteins, and CD55) selectively localize in Triton-insoluble plasma membrane domains of human leukemic cell lines and normal granulocytes. Blood 1996; 87:3783-3794.
(Supplementary Information is linked to the online version ofthe paper on the Cell Research website)
Flavopiridol Induces Cellular FLICE-Inhibitory Protein Degradation
by the Proteasome and Promotes TRAIL–Induced Early
Signaling and Apoptosis in Breast Tumor Cells
Carmen Palacios, Rosario Yerbes, and Abelardo Lopez-Rivas
Centro Andaluz de Biologıa del Desarrollo, Consejo Superior de Investigaciones Cientıficas-Universidad Pablo de Olavide, Sevilla, Spain
Abstract
The cyclin-dependent kinase inhibitor flavopiridol is under-going clinical trials as an antitumor drug. We show here thatpretreatment of different human breast cancer cell lines withflavopiridol facilitates tumor necrosis factor–related apopto-sis-inducing ligand (TRAIL)–induced apoptosis. In breasttumor cells, apoptosis induction by TRAIL is blocked at thelevel of apical caspase-8 activation. Flavopiridol treatmentenhances TRAIL-induced formation of death-inducing signal-ing complex and early processing of procaspase-8. Subse-quently, a TRAIL-induced, mitochondria-operated pathwayof apoptosis is activated in cells treated with flavopiridol.Down-regulation of cellular FLICE-inhibitory proteins (c-FLIP;c-FLIPL and c-FLIPS) is observed on flavopiridol treatment.c-FLIP loss and apoptosis sensitization by flavopiridol are bothprevented in cells treated with an inhibitor of the ubiquitin-proteasome system. Furthermore, targeting c-FLIP directlywith small interfering RNA oligonucleotides also sensitizesvarious human breast tumor cell lines to TRAIL-inducedapoptosis. Our results indicate that flavopiridol sensitizesbreast cancer cells to TRAIL-induced apoptosis by facilitatingearly events in the apoptotic pathway, and this combinationtreatment could be regarded as a potential therapeutic toolagainst breast tumors. (Cancer Res 2006; 66(17): 8858-69)
Introduction
Flavopiridol is a semisynthetic flavone with potent inhibitoryeffects on cell proliferation in cultured tumor cell lines (1). Thiseffect has also been observed in vivo , xenografting different humantumor cell lines in nude mice (2). The antitumor activity offlavopiridol has been related not only to cell cycle arrest but also toinduction of apoptosis (3–6) and antiangiogenic activity (7). Inclinical trials of flavopiridol as a single agent and in drugcombinations, evidence of antitumor activity has been observedat plasma concentrations that inhibit cyclin-dependent kinase(CDK)–related functions (8).Tumor necrosis factor (TNF)–related apoptosis-inducing ligand
(TRAIL) is a ligand of the TNF family capable of inducing apoptosisin a wide variety of cancer cells on binding to the proapoptoticreceptors TRAIL-R1 and TRAIL-R2 but with no effect in themajority of normal human cells tested. However, despite theubiquitous expression of TRAIL receptors, some cancer cells show
either partial or complete resistance to TRAIL (9). Resistance oftumor cells to TRAIL can be overcome by treatment with proteinsynthesis inhibitors, which suggests the presence of apoptosisinhibitors in those cell lines (10).Activation of TRAIL receptors leads to the formation of the
death-inducing signaling complex (DISC), which includes thereceptor itself, the adapter molecule Fas-associated death domain(FADD), and procaspase-8 (11). Processing and activation ofcaspase-8 at the DISC leads to a cascade of apoptotic events thatresults in the death of the cell. Inhibition of this cascade may occurat different stages in tumor cells (12). At the DISC level, theapoptotic signal may be inhibited by cellular FLICE-inhibitoryproteins (c-FLIP), the homologue of viral FLIP in vertebrate cells(13). In most cells, c-FLIP exists as two alternative spliced isoforms:c-FLIPL, a homologue of caspase-8, which lacks critical amino acidsfor proteolytic caspase activity, and c-FLIPS, consisting only of twodeath effector domains (13). A third 23-kDa recently identifiedform called c-FLIPR, with properties similar to those of c-FLIPS, isalso expressed in some cells (14). Although the role of c-FLIPin apoptotic signaling has been controversial, data obtainedfrom cells stably overexpressing c-FLIP and from mice deficientin c-FLIP clearly support an antiapoptotic function ( for review, seeref. 15). c-FLIP expression fluctuates in a cell type–specific mannerand in response to various stimuli: transcriptionally through thenuclear factor-nB (NF-nB) pathway (16) and at the protein level viaaltered rates of proteasomal degradation (17), which makes it aversatile inhibitor of apoptotic responses mediated by deathreceptors.To induce apoptosis in tumor cells through activation of death
receptors represents a new therapeutic strategy against differenttypes of cancer. However, whereas agonistic antibodies thatactivate death receptor CD95/Fas are very toxic for liver cells(18), TRAIL and agonistic antibodies that trigger TRAIL receptorsmay be considered as more suitable tools (19). TRAIL does notshow toxic effects in preclinical studies with mice and nonhumanprimates when given at doses that inhibit the growth of tumorxenografts (20). Although it has been reported that a particularform of human recombinant TRAIL may be toxic for humanhepatocytes (21), more recent data have shown that differentrecombinant versions of TRAIL vary considerably in toxicitytoward normal human cells while maintaining their antitumorproperties (22).Recent reports have described that the combination of
flavopiridol and TRAIL induces apoptosis in various cancer cells,although the molecular mechanism of this synergistic actionremains unclear. Flavopiridol has been reported to sensitize humannon–small cell lung carcinoma (NSCLC) and colon cancer cells toTRAIL-induced apoptosis by inhibiting NF-nB (23). A reduction inthe cellular levels of XIAP has been suggested to be responsible forthe antileukemic effects of flavopiridol and TRAIL (24). On the
Requests for reprints: Abelardo Lopez-Rivas, Centro Andaluz de Biologıa delDesarrollo, Consejo Superior de Investigaciones Cientıficas-Universidad Pablo deOlavide, Carretera de Utrera km. 1, 41013 Sevilla, Spain. Phone: 34-954-348396; E-mail:[email protected].
I2006 American Association for Cancer Research.doi:10.1158/0008-5472.CAN-06-0808
Cancer Res 2006; 66: (17). September 1, 2006 8858 www.aacrjournals.org
Research Article
other hand, it was reported that flavopiridol down-regulates Mcl-1expression in human cholangiocarcinoma cells (25). Despitethe fact that many cancer cells are sensitive to TRAIL-inducedapoptosis, a number of them, in particular breast cancer cells, areresistant to this death ligand (26). In these cells, resistance toTRAIL seems to reside in the initial activation of caspase-8 (27).Taken together, these results prompted us to investigate whetherflavopiridol could abrogate the resistance to TRAIL-inducedapoptosis observed in breast tumor cells and, if so, elucidate themechanisms of this sensitization.In this study, we show that flavopiridol sensitizes all human
breast cancer cell lines examined to a mitochondria-operated,TRAIL-induced apoptotic process. In the highly resistant to TRAIL,ErbB2-overexpressing cell line SKBR-3, flavopiridol facilitates DISCformation and caspase-8 activation at the DISC on TRAIL receptorligation, without altering the levels of TRAIL receptors, FADD orcaspase-8. In these cells, flavopiridol markedly down-regulates thelevels of c-FLIPL and c-FLIPS proteins by a mechanism involvingthe proteasome. Moreover, we show that knocking down c-FLIPproteins with specific small interfering RNA (siRNA) oligonucleo-tides is sufficient to sensitize various breast tumor cell lines toTRAIL-induced apoptosis.
Materials and Methods
Reagents and antibodies. Flavopiridol was kindly provided by Dr. JoseRamon Suarez (Aventis Pharmaceuticals, Bridgewater, NJ). MG-132,streptavidin-agarose beads, and mouse anti-a-tubulin antibody were
obtained from Sigma Chemical Corp. (St. Louis, MO). Recombinant human
TRAIL (residues 95-281) was produced as described previously (28).Caspases inhibitor benzyloxy-carbonyl-Val-Ala-Asp-(OMe) fluoromethyl
ketone (Z-VAD-FMK) was from Enzyme System, Inc. (Dublin, CA). Anti-
human caspase-8 monoclonal antibody was purchased from Cell Diag-
nostica (Munster, Germany). Anti-FADD monoclonal antibody was from BDTransduction Laboratories (Heidelberg, Germany). Anti-poly(ADP-ribose)
polymerase (PARP) monoclonal antibody was from Roche Molecular
Biochemicals (Monza, Italy). Anti-c-FLIP monoclonal antibody (NF6) and
anti-TRAIL-R1, anti-TRAIL-R2, anti-TRAIL-R3, and anti-TRAIL-R4 anti-bodies were from Alexis Corp. (Lausen, Switzerland). Anti-cytochrome c ,
Bax, and XIAP monoclonal antibodies were from Biosciences PharMingen
(San Jose, CA). Anti-cyclooxygenase IV (COX IV) rabbit polyclonal antibodywas from Abcam (Cambridge, United Kingdom). Horseradish peroxidase–
or FITC-conjugated secondary antibodies, goat anti-mouse and goat anti-
rabbit, were obtained from DAKO (Cambridge, United Kingdom). Rabbit
anti-Bid polyclonal antibody was generously provided by Dr. X. Wang(Howard Hughes Medical Institute, Dallas, TX).
Cell lines. Stable MCF-7 cell line overexpressing human Bcl-2 proteinhas been described previously (27). The cell lines were either maintained in
RPMI 1640 (MCF-7, MDA-MB-231, EVSA-T, and Jurkat) or in DMEM (MDA-MB-468, SKBR-3, and BT474) containing 10% fetal bovine serum, 1 mmolL-glutamine, and gentamicin in a 5% CO2 humidified atmosphere. Culture
medium of MDA-MB-435S cells was also supplemented with insulin
(10 Ag/mL).Determination of cell viability and apoptosis. Cell viability was
determined by the crystal violet method as described (27). Hypodiploid
apoptotic cells were assessed by flow cytometry according to publishedprocedures (29).
Immunoblot analysis of proteins. The assay for measurements ofcytochrome c and Bax was done as described (29). Proteins were resolved
on SDS-polyacrylamide minigels and detected as described previously (27).Isolation of the TRAIL DISC. DISC precipitation was done using biotin-
tagged recombinant TRAIL (bio-TRAIL; ref. 30). SKBR-3 cells were
incubated for 16 hours in the presence or absence of 100 nmol/L
flavopiridol. After this incubation, cells were treated with bio-TRAIL for
the times indicated in the figure legends. DISC formation was determinedas reported (29).
Analysis of TRAIL receptors by flow cytometry. SKBR-3 cells weredetached with RPMI 1640/3 mmol/L EDTA, washed in ice-cold PBS, and
resuspended in PBS. Cells were then labeled with anti-TRAIL receptorantibodies (5 Ag/mL) or no antibody (negative control) and then incubatedwith goat anti-mouse FITC-conjugated antibody F(ab¶)2 fragment. Labeledcells were analyzed by flow cytometry using the CellQuest software.
siRNA. siRNAs against c-FLIP (5¶-GGGACCUUCUGGAUAUUUUtt-3¶ and5¶-AAAAUAUCCAGAAGGUCCCtg-3¶) and XIAP (5¶-GCUGUAGAUAGAUGG-CAAUtt-3¶ and 5¶-AUUGCCAUCUAUCUACAGCtg-3¶) were synthesized by
Ambion, Inc. (Austin, TX). Nontargeting scrambled siRNAs were synthesized
by Proligo LLC (Boulder, CO). Cells were transfected with either c-FLIP,XIAP, or scrambled siRNAs (50 nmol/L for SKBR-3 cells or 10 nmol/L
for MDA-MB-231, BT474, and MDA-MB-435S cells) using DharmaFECT
1 (Dharmacon, Lafayette, CO) as described by the manufacturer. After48 (SKBR-3) or 24 (MDA-MB-231, BT474, and MDA-MB-435S) hours of trans-
fection, medium was replaced with regular medium before further analysis.
Cell transfections and luciferase assays. Cells were cotransfected with0.7 Ag of a NF-nB luciferase reporter plasmid (pKBF-Luc; Dr. J.M.Redondo, Centro de Biologia Molecular, Madrid, Spain) and 0.25 Ag h-galactosidase expression plasmid using Fugene reagent (Roche Applied
Science, Mannheim, Germany). After transfection, cells were harvested,
and luciferase activity was measured in an FB12 luminometer (BertholdDetection Systems, Pforzheim, Germany) according to the instructions of
the Luciferase system kit (Promega, Madison, WI). Transfection experi-
ments were done in duplicate. NF-nB activity was always normalized bymeasuring h-galactosidase activity and expressed as relative luciferase
units.
Reverse transcription-PCR. Total RNA was isolated from cells with
Trizol reagent (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) as recommendedby the supplier. cDNA was synthesized from 2 Ag total RNA using a RNAPCR kit (Perkin-Elmer, Indianapolis, IN) with the supplied random
hexamers under conditions described by the manufacturer. PCRs were
done using specific primers for c-FLIPL and c-FLIPS as described pre-viously (31).
Statistical analysis. All data are presented as mean F SE of at
least three independent experiments. The differences among differentgroups were determined by the Student’s t test. P < 0.05 was considered
significant.
Results
Flavopiridol sensitizes human breast tumor cells to TRAIL-induced apoptosis. To investigate the mechanism of flavopiridol-induced sensitization to TRAIL, we initially used the human breastcarcinoma cell line SKBR-3 that express elevated levels of ErbB2and is markedly resistant to TRAIL-induced apoptosis (32). Cellswere first incubated with different flavopiridol doses andsubsequently treated with TRAIL, and apoptosis was determinedas percentage of sub-G1 population. Results shown in Fig. 1A showthat these cells are very resistant to TRAIL-induced apoptosis and amarked sensitization to apoptosis by TRAIL can be observed in therange between 50 and 500 nmol/L flavopiridol. In subsequentexperiments, we normally used 100 to 200 nmol/L flavopiridolbecause these concentrations produced almost maximal sensitiza-tion and were not toxic for the cells.We next examined the effect of different TRAIL concen-
trations in SKBR-3 cells preincubated with 200 nmol/Lflavopiridol. As can be seen in Fig. 1B , flavopiridol promotedTRAIL-induced apoptotic cell death at the lowest concentrationof TRAIL used (50 ng/mL) and a maximal effect was observed atdoses between 250 and 500 ng/mL TRAIL. The later TRAILconcentration was subsequently used in the experiments donein SKBR-3 cells.
Flavopiridol Promotes Caspase-8 Activation by TRAIL
www.aacrjournals.org 8859 Cancer Res 2006; 66: (17). September 1, 2006
Sensitization to TRAIL-induced apoptosis by flavopiridol was ageneral phenomenon of breast tumor cells. In a panel of breasttumor cell lines (BT474, MDA-MB-231, MCF-7, MDA-MB-468, andEVSA-T) differing in variables, such as expression of ErbB2,presence of estrogen receptors, p53 status, or sensitivity to TRAIL,flavopiridol markedly sensitized all of them to TRAIL-inducedapoptosis (Fig. 1C ; data not shown).Down-regulation of XIAP or abrogation of NF-KB activity by
flavopiridol is not sufficient to promote TRAIL-inducedapoptosis in breast tumor cells. Down-regulation of XIAP byflavopiridol has been reported to be responsible for the antileu-kemic effects of flavopiridol and TRAIL (24). We have examined therole of XIAP in the resistance of breast tumor cells to TRAIL-induced cell death and the sensitization to TRAIL observed onflavopiridol treatment. Flavopiridol caused a marked decrease inXIAP protein levels in SKBR-3 cells in a dose-dependent manner(Fig. 2A), with maximal effects being observed at doses thatinduced a clear sensitization to TRAIL (Fig. 1A). We nextdetermined whether specific down-regulation of XIAP by siRNAmethodology could be sufficient to abrogate resistance to TRAIL inSKBR-3 cells. Results shown in Fig. 2B show that a siRNA targetedagainst XIAP efficiently down-regulated XIAP protein to levels
similar to those achieved on flavopiridol treatment (Fig. 2A).However, in contrast to the sensitization observed with flavopiridol,down-regulation of XIAP with siRNA failed to promote sensitiza-tion to TRAIL-induced apoptosis (Fig. 2C).Flavopiridol inhibits NF-nB activity in tumor cells and sensitizes
NSCLC and colon cancer cells to TRAIL-induced apoptosis (23). Wehave studied the role of NF-nB in the regulation of TRAIL-inducedapoptosis by flavopiridol in breast tumor cells. In SKBR-3 cells,flavopiridol caused an important inhibition of NF-nB activity asmeasured with a NF-nB promoter-driven luciferase reporterplasmid (Fig. 2D). In these experiments, the specific inhibitor ofNF-nB activation Bay 11-7085 decreased NF-nB promoter activityto a similar extent as observed for flavopiridol. Although it hasbeen reported that TRAIL can stimulate the NF-nB pathway invarious human tumor cell lines (33), in SKBR-3 cells, TRAIL failedto induce NF-nB promoter activity (Fig. 2D). Similar results wereobtained in other breast tumor cell lines (data not shown).Furthermore, in the presence of TRAIL, both flavopiridol and Bay11-7085 reduced NF-nB activity to a similar extent (Fig. 2D).However, in contrast to the sensitization observed with flavopiridol,Bay 11-7085 was not able to promote TRAIL-induced apoptosis inSKBR-3 breast tumor cells (Fig. 2E), which suggests that inhibition
Figure 1. Flavopiridol sensitizes human breast tumor cell lines to TRAIL-induced apoptosis. A, SKBR-3 cells were incubated with the indicated flavopiridolconcentrations for 7 hours before the addition of soluble recombinant TRAIL. Apoptosis was measured 17 hours after the addition of TRAIL as percentage of cells withsub-G1 DNA content as described in Materials and Methods. B, SKBR-3 cells were treated with flavopiridol for 7 hours before the addition of soluble TRAIL at theindicated concentrations. Apoptosis was measured 17 hours after the addition of TRAIL as in (A). C, cells were incubated with the indicated flavopiridol concentrationsfor 7 hours before the addition of soluble TRAIL at the concentrations shown in the different panels. Apoptosis was assessed 17 hours after the addition of TRAIL.Columns, average of three different experiments; bars, SE. *, P < 0.005; **, P < 0.0001.
Cancer Research
Cancer Res 2006; 66: (17). September 1, 2006 8860 www.aacrjournals.org
of NF-nB by flavopiridol is not sufficient to cause sensitization toTRAIL-induced apoptosis.Treatment with flavopiridol enhances TRAIL-induced acti-
vation of caspase-8 and the mitochondrial apoptotic pathway.To further establish the mechanism of flavopiridol-promoted,TRAIL-induced cell death, we examined the caspase dependencyof this cell death process. We found that the generation of sub-G1cells induced by the combination of flavopiridol and TRAIL wasdependent on caspase activation as it was completely prevented bythe general caspase inhibitor Z-VAD-FMK (Fig. 3A).During TRAIL-induced apoptosis, procaspase-8 is recruited and
processed at the DISC in a FADD- and TRAIL receptor–dependentmanner (34). Procaspase-8 is first cleaved to the p43/p41
intermediate fragments releasing the small subunit p12 and thensubsequently processed to generate the large catalytically activep18 subunit (11). To test if caspase-8 activation by TRAIL wasblocked in the TRAIL-resistant cell line SKBR-3, processing ofprocaspase-8 was determined by Western blotting in cells treatedwith TRAIL following incubation in the absence or presence offlavopiridol. As shown in Fig. 3B , TRAIL-induced processing ofprocaspase-8 to its 43- to 41-kDa intermediate fragments wasobserved only in the cells previously treated with flavopiridol.Activation of caspase-8 leads to the processing of its substrate
Bid generating a 15-kDa fragment, which translocates tomitochondria (35). Moreover, on death receptor activation, thecytoplasmic protein Bax migrates to the mitochondria where it
Figure 2. Down-regulation of endogenous XIAP and abrogation of NF-nB activity by flavopiridol are not sufficient to promote apoptosis induced by TRAIL. A, SKBR-3cells were not treated or treated with the indicated concentrations of flavopiridol for 24 hours. XIAP levels were analyzed by Western blotting. Tubulin was usedas a protein loading control. Results are representative of two independent experiments. B, SKBR-3 cells were transfected either with siRNA oligonucleotide targetingXIAP or with a scrambled RNA oligonucleotide as described in Materials and Methods. After 72 hours, cells were harvested for immunoblot analysis to verifyprotein knockdown. Tubulin was used as a protein loading control. Results are representative of three independent experiments. C, SKBR-3 cells were transfectedas in (B ), and after 72 hours, TRAIL was added to the cultures. Apoptosis was measured 24 hours after the addition of TRAIL as described in Fig. 1. Columns, averageof two different experiments; bars, range. D, SKBR-3 cells were transfected with a NF-nB reporter plasmid, and 6 hours later, some of the transfected cultureswere treated with flavopiridol for 17 hours. Next day, another set of transfected cells were treated with Bay 11-7085 (Bay ) 1 hour before the addition of TRAIL. Luciferaseactivity was determined 6 hours after the addition of TRAIL and normalized to the h-galactosidase activity. Columns, average of three different experiments; bars, SE.*, P < 0.005. E, SKBR-3 cells were incubated either with flavopiridol for 7 hours or with Bay 11-7085 for 1 hour before the addition of soluble recombinant TRAIL.Apoptosis was measured 17 (flavopiridol pretreatment) or 24 (Bay 11-7085 pretreatment) hours after the addition of TRAIL as described in Fig. 1. Columns, averageof three different experiments; bars, SE. **, P < 0.001.
Flavopiridol Promotes Caspase-8 Activation by TRAIL
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cooperates with truncated Bid in the release of cytochrome c (36).Thus, we examined the activation of the mitochondria-controlledapoptotic pathway by TRAIL in flavopiridol-treated SKBR-3 cellsby determining the loss of intact Bid, Bax translocation fromcitosol to mitochondria, and the release of cytochrome c frommitochondria. Results shown in Fig. 3C indicate that the amountof intact Bid was clearly diminished in the cells treated withflavopiridol and TRAIL in comparison with the cultures treatedonly with TRAIL. We next analyzed the loss of Bax and thepresence of cytochrome c in cytosolic extracts from SKBR-3 cellson TRAIL receptor ligation. We observed that pretreatment withflavopiridol highly enhanced both events (Fig. 3D). These effectswere associated with the increase of Bax and the loss of
cytochrome c levels in the mitochondria-containing membranefraction of lysed SKBR-3 cells.To confirm that the apoptosis cascade was fully active in SKBR-3
cells treated with both flavopiridol and TRAIL and that caspaseactivation was involved in the process, we analyzed the proteolyticdegradation of the nuclear protein PARP, a substrate of effectorcaspases. As shown in Fig. 3E , PARP cleavage was only clearlyinduced in cells pretreated with flavopiridol and subsequentlytreated with TRAIL.To get further insight into the importance of mitochondria-
mediated events in flavopiridol-induced sensitization to TRAILin breast cancer and because it is difficult to obtain stabletransfectants of SKBR-3 cells overexpressing Bcl-2 protein, we
Figure 3. Apoptosis induced by the combination of flavopiridol and TRAIL requires caspase activation and involves activation of caspase-8 and the mitochondrialpathway of apoptosis. A, SKBR-3 cells were pretreated with flavopiridol (200 nmol/L) for 7 hours before the addition of soluble TRAIL (250 ng/mL) for 17 hours;Z-VAD-FMK (50 Amol/L) was added 2 hours before TRAIL. Apoptosis was measured as percentage of sub-G1 cells. Columns, average of three different experiments;bars, SE.**, P < 0.001. B, SKBR-3 cells were treated with 100 nmol/L flavopiridol for 16 hours before 8 hours of incubation with 500 ng/mL TRAIL. Activation ofcaspase-8 was assessed by Western blotting as described in Materials and Methods. Results are representative of three independent experiments. C, SKBR-3 cellswere treated as in (B ). Loss of Bid was assessed by Western blotting. Results are representative of two independent experiments. D, SKBR-3 cells were treatedas in (B ). Translocation of cytosolic Bax and release of cytochrome c from mitochondria were assessed by Western blotting. Results are representative of twoindependent experiments. COX IV was used as a mitochondrial loading control. E, SKBR-3 cells were treated as in (B). PARP degradation was assessed by Westernblotting. Results are representative of three independent experiments. In all the previous experiments, tubulin was used as a protein loading control. F, MCF-7pc
and MCF-7Bcl-2 were pretreated or not with 100 nmol/L flavopiridol during 6 hours before the addition of 50 ng/mL TRAIL. After 18 hours, cellular viability was measuredby crystal violet staining. Columns, average of three different experiments; bars, SE. **, P < 0.001.
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Cancer Res 2006; 66: (17). September 1, 2006 8862 www.aacrjournals.org
studied whether TRAIL-induced apoptosis was facilitated byflavopiridol in a clone of MCF-7Bcl-2 cells, which we have describedpreviously as resistant to TRAIL (37). As shown in Fig. 3F,flavopiridol failed to promote TRAIL-induced loss of cell viability inMCF-7Bcl-2 cells, in contrast to what was observed in cultures ofcells transfected with an empty vector (MCF-7pc). In these experi-ments, Bcl-2 overexpression did not affect caspase-8 activation bythe combination of TRAIL and flavopiridol (data not shown).Treatment with flavopiridol does not affect the expression
levels of TRAIL receptors but increases DISC formation onTRAIL treatment in SKBR-3 cells. To investigate the possibilitythat flavopiridol treatment might change TRAIL receptor levels atthe cell surface, SKBR-3 cells were cultured in the presence orabsence of 100 nmol/L flavopiridol for 16 hours, and the expressionof both proapoptotic and antiapoptotic receptors was analyzed byflow cytometry. Results in Fig. 4A show that SKBR-3 cells expressthe proapoptotic receptors TRAIL-R1 and TRAIL-R2 and theantiapoptotic receptor TRAIL-R4. Expression of the antiapoptoticreceptor TRAIL-R3 was not detected in these cells. Results shownin this figure show that flavopiridol treatment did not change theexpression of either proapoptotic or antiapoptotic TRAIL receptorsin SKBR-3 cells.As the resistance to TRAIL occurred at a step before caspase-
8 activation in SKBR-3 cells, it was possible that these cells werenot able to form a functional DISC. In SKBR-3 cells incubated inthe absence of flavopiridol, TRAIL induced the formation of aDISC with maximal recruitment of procaspase-8 and FADD in30 minutes (Fig. 4B). Within the DISC, procaspase-8 was processedto its p43 and p41 forms at the different times tested, with maximalprocaspase-8 processing at 30 minutes after TRAIL addition.Interestingly, pretreatment with flavopiridol clearly promoted anincrease in TRAIL DISC formation and procaspase-8 processingwhen compared with cells cultured in the absence of flavopiridol asindicated by the higher amounts of procaspase-8 and FADD in theDISC. Most importantly, in flavopiridol-treated cells but not inuntreated cells, activation of procaspase-8 processing at the DISCfollowing TRAIL addition proceeded to completion as determinedby the appearance of the p18 subunit of mature caspase-8 at 30 and90 minutes on TRAIL stimulation.Flavopiridol induces down-regulation of c-FLIP proteins in
breast tumor cells. Because flavopiridol did not alter the levels ofTRAIL receptors (Fig. 4A) but promoted TRAIL DISC formationand caspase-8 activation in SKBR-3 cells (Fig. 4B), we hypothesizedthat the mechanism of action of this CDK inhibitor could involveeither the up-regulation of other proapoptotic DISC components orthe down-regulation of intracellular inhibitory proteins. In thisrespect, we observed that FADD and procaspase-8 levels were notaltered by flavopiridol treatment (Fig. 4C). One of the antiapoptoticproteins acting at the level of death receptors is c-FLIP, a short-lived protein with homology to caspase-8 that lacks caspaseactivity and inhibits death receptor–mediated activation ofcaspase-8 (13). Two alternatively spliced forms of c-FLIP, c-FLIPLand c-FLIPS, exist in different cell types (13). To investigate whetherthese short-lived proteins could be involved in the sensitizationprocess induced by flavopiridol in SKBR-3 cells, we examined theeffect of flavopiridol in c-FLIP protein levels in SKBR-3 cells. Cellswere treated with 100 nmol/L flavopiridol for different periods andthe levels of c-FLIP isoforms in cell lysates were analyzed byWestern blotting. As shown in Fig. 4C , treatment with flavopiridolcaused a marked decrease in the levels of both c-FLIP isoforms at8 hours, and down-regulation of the short form of c-FLIP was
complete after 16 hours of treatment. Down-regulation of c-FLIPisoforms by flavopiridol was dose dependent (Fig. 4D) andcorrelated well with the flavopiridol concentrations that promotedTRAIL-induced apoptosis in SKBR-3 cells (Fig. 1A). Moreover,down-regulation of c-FLIP isoforms by flavopiridol was observed inall the human breast cancer cell lines tested (Fig. 4E).Studies with metabolic inhibitors acting on either transcription
or translation have indicated that these drugs sensitize resistantcells to death receptor–mediated apoptosis by down-regulatingc-FLIP protein expression (38). We have examined in SKBR-3 cellswhether the protein synthesis inhibitor cycloheximide could renderthese cells sensitive to TRAIL. Data not shown indicate thattreatment of SKBR-3 cells with TRAIL in the presence ofcycloheximide resulted in a marked induction of apoptosis. Bothc-FLIP isoforms were lost on incubation of the cells withcycloheximide (data not shown).A proteasome inhibitor blocks down-regulation of c-FLIP by
flavopiridol and apoptosis induced by the combination offlavopiridol and TRAIL in SKBR-3 cells. It has been shown thatflavopiridol down-regulates gene expression broadly (39), possiblythrough its inhibitory action on the positive transcriptionelongation factor b (P-TEFb; cyclin T1/CDK9) complex (40). Onthe other hand, it has been described previously that c-FLIP levelscan be modulated through a ubiquitin-proteasome pathway (17).We first examined by reverse transcription-PCR (RT-PCR) whetherSKBR-3 cells express mRNA for both c-FLIPL and c-FLIPS isoformsusing the human leukemic T-cell line Jurkat as a positive controland specific oligonucleotide primers for c-FLIPL and c-FLIPS asdescribed in Materials and Methods. Results are shown in Fig. 5A ,where it can be seen that breast tumor SKBR-3 cells only havemRNA for c-FLIPL, whereas Jurkat cells express both mRNAs. Inagreement with these data, we have observed that the short c-FLIPisoform present in SKBR-3 cells is slightly smaller than c-FLIPS(Fig. 5A). In this respect, a third splice isoform of c-FLIP namedc-FLIPR has been described recently in certain cell types (14).Whether the short c-FLIP isoform present in SKBR-3 cells corres-ponds to c-FLIPR is an issue that requires further investigation.To test whether modulation of c-FLIP expression by flavopiridolin SKBR-3 cells occurred at the mRNA level, we did RT-PCRanalysis of c-FLIPL mRNA in cells treated for different times with100 nmol/L flavopiridol. Results shown in Fig. 5B indicate that, incontrast to the observed down-regulation by flavopiridol of c-FLIPLprotein levels, treatment with flavopiridol did not change thelevels of c-FLIPL mRNA at any of the time points examined. Higherdoses of flavopiridol (1 Amol/L) strongly reduced c-FLIPL mRNAexpression (data not shown) as reported previously (39).To assess the role of the proteasome in the down-regulation of
c-FLIP protein levels on flavopiridol treatment, SKBR-3 cells weretreated with the proteasome inhibitor MG-132 before the additionof 100 nmol/L flavopiridol. After different periods, the levels ofc-FLIP in cell lysates were analyzed by Western blotting. As shownin Fig. 5C , treatment with MG-132 blocked flavopiridol-induceddown-regulation of both c-FLIP isoforms at all the times tested. Incontrast, a general caspase inhibitor (Z-VAD-FMK) did not preventflavopiridol-induced loss of c-FLIP expression (Fig. 5D). Then, wedetermined whether the proteasome inhibitor could abrogateflavopiridol-induced sensitization to TRAIL-induced apoptosis.MG-132 markedly inhibited the apoptosis induced by thecombination of flavopiridol and TRAIL in SKBR-3 cells(Fig. 5E), under the same conditions that blocked c-FLIP degra-dation by flavopiridol. These data indicate that c-FLIP protein is
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Figure 4. Treatment with flavopiridol does not affect the expression levels of TRAIL receptors in SKBR-3 cells but enhances DISC formation and inducesdown-regulation of c-FLIPL and c-FLIPS proteins in several breast tumor cell lines. A, SKBR-3 cells cultured in six-well plates were incubated either with or withoutflavopiridol (100 nmol/L) for 16 hours. Cells were then harvested, and cell surface receptor expression was assessed by flow cytometry using monoclonalantibodies to TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, or TRAIL-R4 as described in Materials and Methods. Discontinuous line, cells labeled with secondary antibody alonewere used as a control for background fluorescence. Data are representative of two independent experiments. B, SKBR-3 cells were either treated or not with100 nmol/L flavopiridol for 16 hours before the incubation with bio-TRAIL (1 Ag/mL) for the indicated times. Unstimulated receptor controls (u/s ) are the additionof bio-TRAIL to an equivalent volume of lysate isolated from unstimulated cells. DISC was isolated as described in Materials and Methods, and its componentscaspase-8 and FADD were analyzed by Western blotting. Lysates are included as a positive control for the expression of these proteins in SKBR-3 cells.Two different exposures of the caspase-8 DISC Western blot are presented to clearly show the differences in procaspase-8 recruitment and processing in the DISCbetween untreated or flavopiridol-treated cells. Data are representative of four independent experiments. C, analysis by Western blotting of c-FLIPL, c-FLIPS,caspase-8, and FADD in SKBR-3 cells treated or not with 100 nmol/L flavopiridol for the indicated times. a-Tubulin was blotted to show equal loading. Dataare representative of three independent experiments. D, SKBR-3 cells were treated or not with the indicated concentrations of flavopiridol for 24 hours. c-FLIPL andc-FLIPS levels were analyzed by Western blotting. Tubulin was used as a protein loading control. Results are representative of two independent experiments.E, analysis by Western blotting of c-FLIPL and c-FLIPS in the indicated cells treated or not with 100 nmol/L flavopiridol during 17 hours. a-Tubulin was blotted to showequal loading. Data are representative of three independent experiments.
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Cancer Res 2006; 66: (17). September 1, 2006 8864 www.aacrjournals.org
Figure 5. A proteasome inhibitor, but not Z-VAD-FMK, prevents down-regulation of c-FLIPL and c-FLIPS by flavopiridol. A, top, c-FLIP mRNA was analyzedby RT-PCR (40 cycles) in Jurkat and SKBR-3 cells using specific primers for c-FLIPL and c-FLIPS. h-Actin was included as a control for mRNA input. Data arerepresentative of two independent experiments. Bottom, c-FLIPL and c-FLIPS isoforms were analyzed in cell extracts from Jurkat and SKBR-3 cells. B, c-FLIPL proteinand mRNA levels were analyzed by Western blotting (WB ) and RT-PCR in SKBR-3 cells after incubation with or without 100 nmol/L flavopiridol for the indicatedtimes. RT-PCR was done using c-FLIPL primers for 27 cycles. RT-PCR product of h-actin was used as a control for mRNA input. Data are representative of twoindependent experiments. C, SKBR-3 cells were pretreated or not with 25 Amol/L MG-132 for 30 minutes before culturing them in the presence or absence of100 nmol/L flavopiridol for the indicated periods. c-FLIPL and c-FLIPS levels were analyzed by Western blotting. Arrow, c-FLIPS band; asterisks, two protein bands thatare up-regulated by MG-132. Tubulin was used as a protein loading control. Results are representative of two independent experiments. D, SKBR-3 cells werepretreated or not with either 25 Amol/L MG-132 or 50 Amol/L Z-VAD-FMK for 30 minutes before culturing them in the presence or absence of 100 nmol/L flavopiridolduring 17 hours. c-FLIPL and c-FLIPS levels were analyzed by Western blotting. Arrow, c-FLIPS band; asterisks, two protein bands up-regulated by MG-132.Tubulin was used as a protein loading control. Results are representative of two independent experiments. E, SKBR-3 cells were treated or not with 25 Amol/L MG-132for 30 minutes before culturing them with or without flavopiridol for 7 hours. TRAIL was then added to the cultures and apoptosis was measured 16 hours afterthe addition of TRAIL as described in Fig. 1. Columns, average of three different experiments; bars, SE. **, P < 0.001.
Flavopiridol Promotes Caspase-8 Activation by TRAIL
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down-regulated in SKBR-3 cells treated with flavopiridol through aproteasome-mediated pathway and that this decrease in c-FLIPprotein levels could be responsible for the apoptosis induced byflavopiridol and TRAIL in these breast tumor cells.Knockdown of endogenous c-FLIPL and c-FLIPS with siRNA
oligonucleotides promotes apoptosis induced by TRAIL inseveral breast cancer cell lines. Our data indicate thatflavopiridol decreases c-FLIP expression and sensitizes breasttumor cells to TRAIL-induced apoptosis. Next, we tested thepossibility that specific ablation of c-FLIP expression by siRNA hasa similar effect on TRAIL-induced apoptosis. In SKBR-3 cells, thelevels of both c-FLIPL and c-FLIPS were substantially reducedwith a specific siRNA (Fig. 6A), whereas a similar concentration ofscrambled siRNA did not modify c-FLIP protein expression.Transfection with c-FLIP siRNA had no effect on the expressionof procaspase-8, a structurally related proapoptotic protease(Fig. 6A). Most importantly, silencing of c-FLIP expression resultedin a clear sensitization to TRAIL-induced apoptosis (Fig. 6B). Thesedata correlate well with the effect of flavopiridol and supportthe hypothesis that down-regulation of c-FLIP expression by thisCDK inhibitor is critical for the induced sensitization to TRAILin breast tumor cells. To further substantiate the role of c-FLIP inthe resistance of breast tumor cells to TRAIL, we conducted siRNAexperiments in other breast tumor cell lines. Results shown inFig. 6C show that c-FLIP siRNA specifically knocked down theexpression of both c-FLIP isoforms in different breast tumor celllines. Furthermore, silencing of c-FLIP proteins caused a markedsensitization to TRAIL-induced apoptosis in the various cell linesanalyzed (Fig. 6D), a further indication of the relevance of c-FLIPproteins in contributing to the resistance of breast tumor cells toTRAIL. These results also point to the importance of c-FLIP down-regulation by flavopiridol in the mechanism of sensitization toTRAIL-induced apoptosis by this CDK inhibitor.
Discussion
TRAIL has emerged recently as a potential anticancer agent dueto its ability to induce apoptosis in numerous tumor cells, althoughnormal cells are not killed by this death ligand (9, 22). However,despite the fact that many cancer cells are sensitive to TRAIL-induced apoptosis, a number of them, in particular breast cancercells, are resistant to TRAIL (26). In these cases, a combinationtherapy using chemotherapeutic agents and TRAIL may be moresuitable than using TRAIL as a single agent, and in fact, severalstudies in this direction have been conducted (reviewed in ref. 41).In our study, we show that pretreatment of human breast cancer
cells with flavopiridol, a potent inhibitor of CDKs undergoingclinical trials (42, 43), promotes the activation by TRAIL of acaspase-dependent mechanism of apoptosis in these cells. Weshow that sensitization to TRAIL-induced cell death by flavopiridolis a general phenomenon occurring in all human breast cancer celllines examined. Our results also show for the first time that, inbreast tumor SKBR-3 cells treated with TRAIL, full activation ofapical caspase-8 at the DISC is blocked. When resistant cells weretreated with flavopiridol, we detected an increased recruitment ofboth procaspase-8 and FADD to the TRAIL DISC and completeactivation of caspase-8 as the earliest event occurring in thesensitization process. Because there are not changes in the levels ofTRAIL receptors, FADD or procaspase-8, on flavopiridol treatmentof SKBR-3 cells, one possibility to explain the increased recruitmentof FADD to the DISC could be that post-translational modifications
of either FADD or TRAIL receptors that reduce the binding affinityof the DISC components (30) are affected by flavopiridol treatment.Alternatively, competition between FADD and c-FLIPL for the deathdomain of TRAIL receptor DR5 (44) could also modulate DISCformation. A reduction in c-FLIPL levels on flavopiridol treatment,as observed in our work, would favor binding of FADD andprocaspase-8 to the TRAIL DISC.The hypothesis that short-lived inhibitory protein(s) may be
involved in the resistance of SKBR-3 cells to TRAIL was confirmedby our data using the protein synthesis inhibitor cycloheximide,which rendered SKBR-3 cells sensitive to TRAIL, as has been shownin other systems (10). In this regard, a potential mechanisminvolved in the regulation of TRAIL sensitivity is the modulation ofthe expression of the death receptor inhibitors c-FLIPL and c-FLIPS(13), proteins with a very short half-lives (17) that are expressed athigh levels in breast tumors (45). Metabolic inhibitors, such ascycloheximide or actinomycin D, sensitize cells to death receptor–induced apoptosis by strongly down-regulating c-FLIP expression(38). Although enhancement of TRAIL-induced caspase-8 activationand apoptosis does not always correlate with c-FLIP levels (29), ithas been shown that different treatments can induce down-regulation of c-FLIP and subsequent sensitization to TRAIL-induced apoptosis (46, 47). In our study, treatment of differentbreast tumor cells with flavopiridol induced a marked down-regulation of both c-FLIPL and c-FLIPS, which suggests that loss ofc-FLIP expression may underlie the observed sensitization toTRAIL. It has been described that flavopiridol could inhibit NF-nBactivation (23), and it is well documented that TRAIL can alsoactivate this pathway (48), modulating the sensitivity to TRAIL. Onthe other hand, because c-FLIP can be transcriptionally regulatedthrough the NF-nB pathway (16), it is plausible to think thatflavopiridol could inhibit c-FLIP expression through NF-nBinhibition. However, we did not observe a decrease in c-FLIPmRNA in SKBR-3 cells treated with flavopiridol concentrations thatcaused maximal sensitization to TRAIL, therefore excluding thetranscriptional regulation of c-FLIP as the target for the inhibitoryaction of flavopiridol. Furthermore, the NF-nB inhibitor Bay 11-708at a dose that inhibits NF-nB activation failed to down-regulatec-FLIP expression (data not shown).It has been reported that c-FLIP protein levels can be down-
regulated by proteasomal degradation (17) and this modulationmay lead to TRAIL sensitization (49). In this respect, our resultsshow that, in breast tumor cells, flavopiridol treatment leads to theproteasome-mediated degradation of both c-FLIP isoforms, and aproteasome inhibitor abolishes the sensitization by flavopiridol toTRAIL-induced apoptosis. At present, we do not know themechanism by which flavopiridol induces the proteasomaldegradation of c-FLIP proteins. Flavopiridol has been reported toactivate the c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) pathway (50). On theother hand, JNK activation by TNF-a reduces c-FLIPL stability by amechanism involving JNK-mediated phosphorylation and activa-tion of the E3 ubiquitin ligase Itch, which ubiquitinates c-FLIPL andinduces its proteasomal degradation (51). Whether a similarmechanism is responsible for the flavopiridol-induced proteasomaldegradation of c-FLIP in breast tumor cells is an issue that requiresfurther investigation.It has been shown recently that flavopiridol induces apoptosis in
combination with TNF-a or TRAIL in some human cancer cell lines(23). It was proposed that inhibition by flavopiridol of TNF-a-induced NF-nB activation was responsible for the observedsynergism on apoptosis. However, the mechanism involved in the
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sensitization to TRAIL was not elucidated. More recently, areduction of XIAP or Mcl-1 levels by flavopiridol has been alsosuggested to be involved in the sensitization to TRAIL-inducedapoptosis (24, 25). In our work, we have assessed the role of NF-nBand XIAP on flavopiridol-promoted, TRAIL-induced apoptosis inbreast tumor cells. Our data clearly show that, in these cells, TRAILdoes not stimulate NF-nB activity. Furthermore, although flavopir-idol reduced basal NF-nB activity, this effect was not sufficient toexplain the sensitization of breast tumor cells to TRAIL-induced
apoptosis because a more specific NF-nB inhibitor did not exhibit asimilar sensitizing effect. On the other hand, we have evaluated therole of XIAP in TRAIL resistance in breast tumor cells. Experimentswith siRNA oligonucleotides clearly showed that elimination ofXIAP protein did not abrogate resistance to TRAIL. Therefore, thedown-regulation of XIAP levels observed in cells treated withflavopiridol is not sufficient to explain the sensitization observed.Besides its effects on the cell cycle (52), flavopiridol regulatestranscription due to the potent inhibition of P-TEFb, composed of
Figure 6. Knockdown of endogenousc-FLIPL and c-FLIPS in several breastcancer cell lines enhances apoptosisinduced by TRAIL. A, SKBR-3 cellswere transfected with either a siRNAoligonucleotide targeting both c-FLIPisoforms or scrambled RNAoligonucleotide as described inMaterials and Methods. After72 hours, cells were harvested forimmunoblot analysis to verify proteinknockdown. Tubulin was used as aprotein loading control. Results arerepresentative of two independentexperiments. B, SKBR-3 cells weretransfected as in (A ), and after48 hours, TRAIL was added to thecultures. Apoptosis was measured24 hours after the addition of TRAILas described in Fig. 1. Columns,average of two independentexperiments; bars, range. C, BT474,MDA-MB-435S, and MDA-MB-231cells were transfected with either asiRNA oligonucleotide targeting bothc-FLIP isoforms or a scrambled RNAoligonucleotide as described inMaterials and Methods. After24 hours, cells were harvested forimmunoblot analysis to verify proteinknockdown. Tubulin was used as aprotein loading control. Results arerepresentative of two independentexperiments. D, BT474, MDA-MB-435S, and MDA-MB-231 cells weretransfected as in (C ), and after24 hours, TRAIL was added to thecultures. Apoptosis was assessed24 hours after the addition of TRAILas described in Fig. 1. Columns,average of two different experiments;bars, range.
Flavopiridol Promotes Caspase-8 Activation by TRAIL
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CDK9 and cyclin T1, which controls the elongation phase oftranscription by RNA polymerase II (40). In this respect, it has beenreported that flavopiridol decreases the mRNA levels of theantiapoptotic proteins XIAP, cIAP-2, Mcl-1, Bcl-x(L), and survivinin breast cancer cells (5). However, because all these proteins blockTRAIL-induced apoptosis downstream caspase-8 activation, theirdown-regulation by flavopiridol does not explain the earlysensitization induced by this flavonoid in SKBR-3 cells.The mechanism underlying prevention of initiator procaspase-
8 activation by c-FLIP within the DISC is still unclear. Althoughc-FLIPS seems to inhibit the activation of this initiator caspase,the role of c-FLIPL as an antiapoptotic protein is more contro-versial. c-FLIPL is processed within the DISC to a 43-kDa subunitthat remains at the DISC and a 12-kDa fragment that is released(53). In the presence of c-FLIPL, procaspase-8 is partially cleavedto its p43/p41 fragments within the DISC, and the cleavageintermediates of both caspase-8 and c-FLIPL remain bound to thereceptor, preventing further recruitment of procaspase-8 to replacethe processed caspase-8 at the DISC. On the contrary, recent datahave indicated that heterodimerization of caspase-8 with c-FLIPLleads to increased proteolytic activity of caspase-8 (54). Our resultsare compatible with the presence of c-FLIPL at the DISC of SKBR-3cells treated with TRAIL, where we detect the initial processing ofprocaspase-8. In cells pretreated with flavopiridol, there is fullactivation of caspase-8, which could correspond to a decreasedc-FLIP/caspase-8 ratio within the DISC. In this respect, a high
c-FLIP/caspase-8 ratio has been observed in B-cell chroniclymphocytic leukemia, which is highly resistant to TRAIL (55). Inour studies with siRNA methodology, we have shown clearly theimportant role of c-FLIP levels in the resistant of different breasttumor cells to TRAIL. These results, in conjunction with the dataindicating that flavopiridol markedly reduces c-FLIP expressionand potently sensitizes breast tumor cells to TRAIL, further supportthe hypothesis that activation of the proteasome-mediateddegradation of c-FLIP by flavopiridol is responsible for theelimination of resistance to TRAIL. Flavopiridol can be a usefulapproach in tumor therapy because it is able to modulate thesensitivity of tumor cells to other therapeutic strategies. In thisrespect, our data indicate that the sensitizing effects of flavopiridolto nontoxic death receptor ligands, such as TRAIL, could havetherapeutic potential in the treatment of human breast cancer.
Acknowledgments
Received 3/3/2006; revised 5/25/2006; accepted 7/11/2006.Grant support: Ministerio de Educacion y Ciencia grant SAF-2003-00402
and Association for International Cancer Research (AICR) grant AICR-03-031(A. Lopez-Rivas), AICR contract (C. Palacios), and Junta de Andalucıa and Ministeriode Educacion y Ciencia contract (R. Yerbes).The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page
charges. This article must therefore be hereby marked advertisement in accordancewith 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.We thank Gema Robledo for her excellent technical assistance and Drs. Jose Ramon
Suarez, C. Ruiz-Ruiz, C. Ruiz de Almodovar, and G. Ortiz-Ferron for critical readingof the article.
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Cancer Res 2006; 66: (17). September 1, 2006 8868 www.aacrjournals.org
References
1. Kaur G, Stetler-Stevenson M, Sebers S, et al. Growthinhibition with reversible cell cycle arrest of carcinomacells by flavone L86-8275. J Natl Cancer Inst 1992;84:1736–40.2. Arguello F, Alexander M, Sterry JA, et al. Flavopiridolinduces apoptosis of normal lymphoid cells, causesimmunosuppression, and has potent antitumor activityin vivo against human leukemia and lymphomaxenografts. Blood 1998;91:2482–90.3. Konig A, Schwartz GK, Mohammad RM, Al-Katib A,Gabrilove JL. The novel cyclin-dependent kinase inhib-itor flavopiridol downregulates Bcl-2 and inducesgrowth arrest and apoptosis in chronic B-cell leukemialines. Blood 1997;90:4307–12.4. Wall NR, O’Connor DS, Plescia J, Pommier Y, AltieriDC. Suppression of survivin phosphorylation on Thr34
by flavopiridol enhances tumor cell apoptosis. CancerRes 2003;63:230–5.5. Wittmann S, Bali P, Donapaty S, et al. Flavopiridoldown-regulates antiapoptotic proteins and sensitizeshuman breast cancer cells to epothilone B-inducedapoptosis. Cancer Res 2003;63:93–9.6. Patel V, Senderowicz AM, Pinto D, et al. Flavopiridol,a novel cyclin-dependent kinase inhibitor, suppressesthe growth of head and neck squamous cell carci-nomas by inducing apoptosis. J Clin Invest 1998;102:1674–81.7. Rapella A, Negrioli A, Melillo G, Pastorino S, Varesio L,Bosco MC. Flavopiridol inhibits vascular endothelialgrowth factor production induced by hypoxia orpicolinic acid in human neuroblastoma. Int J Cancer2002;99:658–64.8. Senderowicz AM. Inhibitors of cyclin-dependentkinase modulators for cancer therapy. Prog Drug Res2005;63:183–206.9. Ashkenazi A, Pai RC, Fong S, et al. Safety andantitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand.J Clin Invest 1999;104:155–62.10. Wajant H, Haas E, Schwenzer R, et al. Inhibition ofdeath receptor-mediated gene induction by a cyclohex-
imide-sensitive factor occurs at the level of or upstreamof Fas-associated death domain protein (FADD). J BiolChem 2000;275:24357–66.11. Sprick MR, Weigand MA, Rieser E, et al. FADD/MORT1 and caspase-8 are recruited to TRAIL receptors1 and 2 and are essential for apoptosis mediated byTRAIL receptor 2. Immunity 2000;12:599–609.12. Ashkenazi A, Dixit VM. Apoptosis control by deathand decoy receptors. Curr Opin Cell Biol 1999;11:255–60.13. Irmler M, Thome M, Hahne M, et al. Inhibition ofdeath receptor signals by cellular FLIP. Nature 1997;388:190–5.14. Golks A, Brenner D, Fritsch C, Krammer PH, LavrikIN. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-inducedapoptosis. J Biol Chem 2005;280:14507–13.15. Krueger A, Baumann S, Krammer PH, Kirchhoff S.FLICE-inhibitory proteins: regulators of death receptor-mediated apoptosis. Mol Cell Biol 2001;21:8247–54.16. Kreuz S, Siegmund D, Scheurich P, Wajant H. NF-nBinducers upregulate cFLIP, a cycloheximide-sensitiveinhibitor of death receptor signaling. Mol Cell Biol 2001;21:3964–73.17. Fukazawa T, Fujiwara T, Uno F, et al. Accelerateddegradation of cellular FLIP protein through theubiquitin-proteasome pathway in p53-mediated apo-ptosis of human cancer cells. Oncogene 2001;20:5225–31.18. Ogasawara J, Watanabe-Fukunaga R, Adachi M, et al.Lethal effect of the anti-Fas antibody in mice. Nature1993;364:806–9.19. Reed JC. Apoptosis-targeted therapies for cancer.Cancer Cell 2003;3:17–22.20. Walczak H, Miller RE, Ariail K, et al. Tumoricidalactivity of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in vivo . Nat Med 1999;5:157–63.21. Jo M, Kim TH, Seol DW, et al. Apoptosis induced innormal human hepatocytes by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand. Nat Med 2000;6:564–7.22. Lawrence D, Shahrokh Z, Marsters S, et al. Differen-tial hepatocyte toxicity of recombinant Apo2L/TRAILversions. Nat Med 2001;7:383–5.
23. Kim DM, Koo SY, Jeon K, et al. Rapid induction ofapoptosis by combination of flavopiridol and tumornecrosis factor (TNF)-a or TNF-related apoptosis-inducing ligand in human cancer cell lines. Cancer Res2003;63:621–6.24. Rosato RR, Dai Y, Almenara JA, Maggio SC, Grant S.Potent antileukemic interactions between flavopiridoland TRAIL/Apo2L involve flavopiridol-mediated XIAPdownregulation. Leukemia 2004;18:1780–8.25. Taniai M, Grambihler A, Higuchi H, et al. Mcl-1mediates tumor necrosis factor-related apoptosis-in-ducing ligand resistance in human cholangiocarcinomacells. Cancer Res 2004;64:3517–24.26. Keane MM, Ettenberg SA, Nau MM, Russell EK,Lipkowitz S. Chemotherapy augments TRAIL-inducedapoptosis in breast cell lines. Cancer Res 1999;59:734–41.27. Ruiz-Ruiz C, Lopez-Rivas A. Mitochondria-dependentand -independent mechanisms in tumour necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-in-duced apoptosis are both regulated by interferon-gin human breast tumour cells. Biochem J 2002;365:825–32.28. MacFarlane M, Ahmad M, Srinivasula SM, Fernandes-Alnemri T, Cohen GM, Alnemri ES. Identification andmolecular cloning of two novel receptors for thecytotoxic ligand TRAIL. J Biol Chem 1997;272:25417–20.29. Munoz-Pinedo C, Ruiz-Ruiz C, Ruiz de Almodovar C,Palacios C, Lopez-Rivas A. Inhibition of glucose metabo-lism sensitizes tumor cells to death receptor-triggeredapoptosis through enhancement of death-inducingsignaling complex formation and apical procaspase-8 processing. J Biol Chem 2003;278:12759–68.30. Harper N, Hughes MA, Farrow SN, Cohen GM,MacFarlane M. Protein kinase C modulates tumornecrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-in-duced apoptosis by targeting the apical events of deathreceptor signaling. J Biol Chem 2003;278:44338–47.31. Nam SY, Jung GA, Hur GC, et al. Upregulation ofFLIP(S) by Akt, a possible inhibition mechanism ofTRAIL-induced apoptosis in human gastric cancers.Cancer Sci 2003;94:1066–73.
Flavopiridol Promotes Caspase-8 Activation by TRAIL
www.aacrjournals.org 8869 Cancer Res 2006; 66: (17). September 1, 2006
32. Cuello M, Ettenberg SA, Clark AS, et al. Down-regulation of the erbB-2 receptor by trastuzumab(herceptin) enhances tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand-mediated apoptosis in breastand ovarian cancer cell lines that overexpress erbB-2.Cancer Res 2001;61:4892–900.33. Muhlenbeck F, Schneider P, Bodmer JL, et al. Thetumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligandreceptors TRAIL-R1 and TRAIL-R2 have distinct cross-linking requirements for initiation of apoptosis and arenon-redundant in JNK activation. J Biol Chem 2000;275:32208–13.34. Bodmer JL, Holler N, Reynard S, et al. TRAILreceptor-2 signals apoptosis through FADD and cas-pase-8. Nat Cell Biol 2000;2:241–3.35. Luo X, Budihardjo I, Zou H, Slaughter C, Wang X. Bid,a Bcl2 interacting protein, mediates cytochrome crelease from mitochondria in response to activation ofcell surface death receptors. Cell 1998;94:481–90.36. Desagher S, Osen-Sand A, Nichols A, et al. Bid-induced conformational change of Bax is responsible formitochondrial cytochrome c release during apoptosis.J Cell Biol 1999;144:891–901.37. Ruiz de Almodovar C, Ruiz-Ruiz C, Munoz-Pinedo C,Robledo G, Lopez-Rivas A. The differential sensitivity ofBc1-2-overexpressing human breast tumor cells toTRAIL or doxorubicin-induced apoptosis is dependenton Bc1-2 protein levels. Oncogene 2001;20:7128–33.38. Fulda S, Meyer E, Debatin KM. Metabolic inhibitorssensitize for CD95 (APO-1/Fas)-induced apoptosis bydown-regulating Fas-associated death domain-like in-terleukin 1-converting enzyme inhibitory protein ex-pression. Cancer Res 2000;60:3947–56.
39. Lam LT, Pickeral OK, Peng AC, et al. Genomic-scalemeasurement of mRNA turnover and the mechanisms ofaction of the anti-cancer drug flavopiridol. Genome Biol2001;2:RESEARCH0041.1–0041.11.40. Chao SH, Price DH. Flavopiridol inactivates P-TEFband blocks most RNA polymerase II transcriptionin vivo . J Biol Chem 2001;276:31793–9.41. Held J, Schulze-Osthoff K. Potential and caveats ofTRAIL in cancer therapy. Drug Resist Updat 2001;4:243–52.42. Shapiro GI, Supko JG, Patterson A, et al. A phase IItrial of the cyclin-dependent kinase inhibitor flavopir-idol in patients with previously untreated stage IV non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2001;7:1590–9.43. Schwartz GK, O’Reilly E, Ilson D, et al. Phase I studyof the cyclin-dependent kinase inhibitor flavopiridol incombination with paclitaxel in patients with advancedsolid tumors. J Clin Oncol 2002;20:2157–70.44. Jin TG, Kurakin A, Benhaga N, et al. Fas-associatedprotein with death domain (FADD)-independent re-cruitment of c-FLIPL to death receptor 5. J Biol Chem2004;279:55594–601.45. Conticello C, Pedini F, Zeuner A, et al. IL-4 protectstumor cells from anti-CD95 and chemotherapeuticagents via up-regulation of antiapoptotic proteins.J Immunol 2004;172:5467–77.46. Kim Y, Suh N, Sporn M, Reed JC. An induciblepathway for degradation of FLIP protein sensitizestumor cells to TRAIL-induced apoptosis. J Biol Chem2002;277:22320–9.47. Hietakangas V, Poukkula M, Heiskanen KM, KarvinenJT, Sistonen L, Eriksson JE. Erythroid differentiationsensitizes K562 leukemia cells to TRAIL-induced
apoptosis by downregulation of c-FLIP. Mol Cell Biol2003;23:1278–91.48. Hu WH, Johnson H, Shu HB. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptors signalNF-nB and JNK activation and apoptosis throughdistinct pathways. J Biol Chem 1999;274:30603–10.49. Zhang S, Shen HM, Ong CN. Down-regulation ofc-FLIP contributes to the sensitization effect of 3,3¶-diindolylmethane on TRAIL-induced apoptosis in can-cer cells. Mol Cancer Ther 2005;4:1972–81.50. Gao N, Dai Y, Rahmani M, Dent P, Grant S.Contribution of disruption of the nuclear factor-nBpathway to induction of apoptosis in human leukemiacells by histone deacetylase inhibitors and flavopiridol.Mol Pharmacol 2004;66:956–63.51. Chang L, Kamata H, Solinas G, et al. The E3 ubiquitinligase itch couples JNK activation to TNFa-induced celldeath by inducing c-FLIP(L) turnover. Cell 2006;124:601–13.52. Carlson BA, Dubay MM, Sausville EA, Brizuela L,Worland PJ. Flavopiridol induces G1 arrest with inhibitionof cyclin-dependent kinase (CDK) 2 and CDK4 in humanbreast carcinoma cells. Cancer Res 1996;56:2973–8.53. Scaffidi C, Schmitz I, Krammer PH, Peter ME. Therole of c-FLIP in modulation of CD95-induced apoptosis.J Biol Chem 1999;274:1541–8.54. Chang DW, Xing Z, Pan Y, et al. c-FLIP(L) is a dualfunction regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO J 2002;21:3704–14.55. MacFarlane M, Harper N, Snowden RT, et al.Mechanisms of resistance to TRAIL-induced apoptosisin primary B cell chronic lymphocytic leukaemia.Oncogene 2002;21:6809–18.