FISICOQUIMICA TEORICO 11-11-13

RADICALES LIBRES E� SISTEMAS BIOLOGICOS

Material de estudio

• Radicales libres y Resonancia de espín

electrónico (EPR).

Material de enseñanza complementaria para

el curso de Fisicoquímica.

• Información de las clases teóricas.

¿Qué es un radical libre?

Indique las características de los radicales libres y mencione al menos tres ejemplos de radicales libres generados en sistemas biológicos.

¿Con qué criterio se clasifican?

¿Qué es un radical libre?

� Especie química (átomo ó molécula) con un número impar de electrones de valencia (octeto incompleto). Es decir, un electrón en un orbital.

� Especie química de existencia independiente, con uno o más electrones no apareados en su capa externa

Electrones apareados

(con espines opuestos)

2 electrones apareados

en un orbital

Características de un radical libre

� Paramagnético: Especie atraída por un campo magnético

�Alta reactividad: Tendencia a adquirir un segundo

electrón adquirir e-

deslocalización del e-

X e- + X•+

Y + e- Y•-

�Las especies radicales pueden estar cargadas positivamente, negativamente o neutras

Características de un radical libre

�

�Dan reacciones en cadena:

(1) iniciación

(2) propagación

(3) terminación

� Inespecificidad

Homólisis unimolecular (unión débil)

Fotólisis

Transf. de 1 e- a partir de un metal

Reacción en cadena

PROPAGACIO�

TERMI�ACIÓ�

→+•2BrH

•+ BrH2

→+•2HBr •+ HHBr

•+ BrHBr

→+• HBrH

→+ •• BrBr 2Br

•→ BrBr 22I�ICIACIO�

H2 (g) + Br2 (g) → 2 HBr (g)

hν

→+ •• BrH HBr

Radicales libres: clasificación

Clasificación Ejemplos Símbolo t 1/2 (s)

Centrados en H Atomo de H H• 10-8

Centrados en C Triclorometilo •CCl3 10-4

Ubisemiquinona Q10H• 10-2-1

Melanina - 104

Centrados en S Tiílo /Pertiílo RS•/RSS• 10-5

Centrados en N Oxido nítrico •NO 1

Dióxido de nitrógeno •NO2 1

Centrados en O

Inorgánicos Anión superóxido O2•- 10-4

Hidroxilo HO• 10-9

Orgánicos Alcohoxilos RO• 10-6

Peroxilos RO2• 10-1

Metales de transición Cobre Cu+/Cu2+ 10-8-10-4

Hierro Fe2+/Fe3+ 10-2-10-4

Pryor, 1976

Describa la secuencia de reducción univalente del oxígeno.

Especifique cuáles de dichos productos son radicales libres.

Para el oxígeno en su estado fundamental, el anión superóxido y el ión peróxido, justifique esquematizando la configuración electrónica (últimos orbitales).

Formas en que existe el oxígeno

1. Ozono (O3): principalmente en altitud

2. Oxígeno monoatómico (O): forma transiente reconocida

en química atmosférica

3. Dioxígeno (O2)

Perdiendo e- O2 e- + O2+

dioxigenilo radical

Ganando e- O2- ; H2O2 ; .OH ; H2O

Oxígeno

� Elemento más abundante en la naturaleza (54%)

� Constituye el 21% del aire atmosférico

� Configuración electrónica del O: 1s2 2s2 2px2 2py

1 2pz1

O O

� O2: Birradical (2 electrones no apareados, 1 electrón no

apareado sobre cada átomo de O)

� Estado fundamental: triplete (los 2 electrones tienen igual

número de espín (+1/2), espín paralelos)

� Químicamente estable

O

Estados del oxígeno

El O2 tiene la particularidad de que el estado basal es un triplete, con 2 electrones no apareados y que el estado excitado, altamente reactivo, es un singulete con los electrones apareados

Estado del O2

2o estado excitado

1er estado excitado

Estado basal

Orbital

1O2

Singulete

Triplete

Michaelis, 1946

La reducción parcial, univalente y sucesiva, del oxígeno produce tres

intermediarios, dos de ellos radicales libres.

O2 O2 • - H2O2

•OH H2O

e- e- e- e-

Aniónsuperóxido

Peróxidode hidrógeno

Radicalhidroxilo

Oxígeno Agua

Reducción univalente del oxígeno

σ* 2p

π * 2p

π 2p

σ2p

σ* 2s

σ 2s

σ* 1s

σ 1s

Ground-state O2

(3Σg -O2)

Singlet O2

(1∆g O2)

Estado basal O2 singulete Radicalsuperóxido

Iónperóxido

(O2: 3ΣgO2) (1∆gO2) (O2

-) (O 22-)

Configuración electrónica de las especies del oxígeno

σ2p

*

π2p*

π2p

σ2p

σ2s*

σ2s

σ1s*

σ1s

O2 O2 • - H2O2

• OH H2O

e- e- e- e-

Aniónsuperóxido

Peróxidode hidrógeno

Radicalhidroxilo

Radicales libres

Especie estable no radical

Habilidad para difundir a través de membranas biológicas

¿Qué causa los efectos tóxicos del oxígeno?

� Presiones elevadas de O2 (hiperoxia) son tóxicas para los animales

� Los radicales libres de oxígeno son el mecanismo molecular común para la toxicidad del oxígeno y la radiación ionizante

� Un aumento en la presión de oxígeno o una disminución de la defensa antioxidante conducen a un daño celular

� Es un fenómeno continuo Science 119: 623-626 (1954)

La teoría de Gerschman(1954)

Indique (en el caso en que las haya) que enzima metaboliza cada especie reactiva del oxígeno en los sistemas biológicos.

Mecanismos de defensa antioxidante

1. Previniendo la formaciónCitocromo oxidasa

Proteínas quelantes de Fe y Cu (ferritina, transferrina, ceruloplasmina)

Glutatión transferasa

2. Desactivando las especies (Antioxidantes)

Enzimáticos (SOD, catalasa, GPx/GR)

No enzimáticos - hidrosolubles (GSH, vit C)

- liposolubles (vit E, carotenoides, ubiquinoles)

3. Reparando el daño producido

Enzimas reparadoras del ADN

Enzimas lipolíticas

Enzimas proteolíticas

Hidrosolubles

Liposolubles

Glutatión (GSH)

Acido ascórbico

Vitamina E

Coenzima Q10

Carotenoides

Antioxidantes no enzimáticos

• Moléculas que pueden atrapar especies radicales ya

formadas (•OH, ROO•, etc) y/o estados excitados (1O2,

RO*)

• Presentes en concentraciones µM o mM

• Fácilmente oxidables

O2 O2 •••• - H2O2 HO•••• H2O

e- e- e- e-

SOD

Catalasa

GSH GSSG

GPx

GR

Enzimas antioxidantes

Glutatión

Indique los sitios celulares de producción de anión superóxido y de peróxido de hidrógeno.

Anión superóxido (O2••••-)

UQH• + O2 → UQ + H+ + O2•••• -

k = 8 x 103 M-1 s-1

FMNH• + O2 → FMN + H+ + O2•••• -

Complejo I: NADH -ubiquinona reductasa

Complejo III: ubiquinol-citocromo c reductasa

�Auto-oxidación de componentes de cadenas de transporte de electrones

�Auto-oxidación de compuestos de bajo peso molecular

�Reacciones enzimáticas

Peróxido de hidrógeno (H2O2)

2 O2•- + 2 H+ → H2O2 + O2

� Dismutación no enzimática o enzimática de O2• -

� Reacciones catalizadas por enzimas peroxisomales (2 e-)

O2 + 2 H+

Sustrato

reducidoSustrato

oxidado

H2O2

Ej. Glicolato oxidasa, Urato oxidasa, Acil-CoA oxidasa

Reacciones que generan especies activas del oxígeno

I. O2- Autooxidación de moléculas de bajo peso molecular

Reacciones enzimáticas

Transporte mitocondrial de electrones

II. H2O2 Dismutación de O2-

Doble reducción directa de oxígeno molecular

III. •OH Reacción de Haber Weiss

Reacción de Fenton

Sitios subcelulares de generación de especies activas del oxígeno

� Mitocondrias

� Membrana de retículo endotelial

� Membrana nuclear

� Membrana plasmática

� Peroxisomas

� Enzimas citosólicas

Se estima que el 1-3% del O2 consumido, se metaboliza a especies

activas del oxígeno en condiciones fisiológicas

Otras especies activas

• Peróxido de hidrógeno– alta constante de permeabilidad en membranas

biológicas

• Oxígeno singulete, carbonilos excitados– emiten energía al volver al estado fundamental

• complejos ferrilos y perferrilos– pueden intervenir en la iniciación de cadenas de

oxidación lipídica

¿Es el óxido nítrico un radical libre?

¿Cuáles son sus principales características?

Indique vías de formación y degradación en sistemas biológicos.

�itrógeno y óxido nítrico (••••�O)

� N2 constituye el 79% del aire atmosférico

� Configuración electrónica del N: 1s2 2s2 2px1 2py

1 2pz1

(3 electrones no apareados)

� Cuando un átomo de N (3 electrones no apareados) se

combina con un átomo de O (2 electrones no apareados)

forma el óxido nítrico (•NO) con un electrón desapareado

�

O �

Oxido nítrico

�itrosonio (�O+)

�itrosaciónEfectos directos

Anión nitrosilo (�O-)

Efectos indirectos

deaminación

�itrosilación(nitrosotioles)

�itración(nitrotirosinas)

Lipid oxidaciónLipid nitración

D�A oxidaciónD�A nitración

PRODUCCIÓ� BIOLÓGICA DE ÓXIDO �ÍTRICO

En organismos fotosintéticos:

Vias reductivas: Actividad de la enzima nitrato reductasa (NR)

2 NO2- + NAD(P)H + 3 H3O

+ 2 NO + NAD(P)+ + 5 H2O

Producción de �O asociada a membrana plasmática o mitocondrial (sistema NR:NiNOR)

Vías oxidativas: Actividad de la enzima óxido nítrico sintasa-like

(utiliza L-Arginina, poliaminas o hidroxilamina)

Vías no enzimáticas: A partir de nitritos en medio ácido.

� Las óxido nítrico sintetasas (�OS) producen �O a partir de Arginina, �ADPH2 y O2.

� Hay cuatro �OS: I, nNOS (neuronal)

II, iNOS (macrófagos)

III, eNOS (endotelio)

IV, mtNOS (mitocondria)

Arg + �ADPH2 + O2 => Cit + H20 + �O

�ADPHFADFM�CaM

AlternativeSplicing

En organismos no fotosintéticos:

k = 1.9 x 1010 M -1 s -1

(Peroxinitrito)

O2 ••••- ••••�O

O�OO-

Reacción entre el O2 ••••- y el ••••�O

� Reacción de terminación entre 2 especies radicales:

se forma el anión (no radical) peroxinitrito

� Reacción muy rápida, controlada por difusión

Potente oxidante

Utilizando un diagrama relacione la generación de especies activas del oxígeno y del nitrógeno.

Defina el concepto de estrés oxidativo

Reacciones

fotoquímicasPolimorfonucleares

Intracelular

Concentraciones celulares en estado estacionario

����ón superóxido 10-11 M

�Peróxido de hidrógeno 10-7-10-9 M

�Radical hidroxilo 10-18 M

�Oxido �ítrico 10-7 M

�Peroxinitrito 10-9 M

� Estrés oxidativo como un desbalance.Un aumento de oxidantes o una disminución

de antioxidantes llevan igualmente al estrés oxidativo.

ESTRÉS OXIDATIVO

• Estrés oxidativo como un aumento de las concentraciones en estado estacionario de las especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno. La concentración intracelular aumentada, de por lo menos una, de las especies reactivas del oxígeno o del nitrógeno es la base química del estrés oxidativo.

[O2- ]ss [H2O2 ]ss [HO·]ss

[ROO·]ss [1O2 ]ss

[�O ]ss [O�OO -]ss

Daño causado por radicales libres y otras especies activas

D�A

Oxidación/Nitración

Proteínas

Modificaciones

conformacionales

Lipídos

PeroxidaciónMutaciones

¿Cuál es la importancia de ciertos metales de transición (por ejemplo, Fe) en la bioquímica de los radicales libres?

Fe2+ + H2O2 → •••• OH + HO- + Fe3+

� Reacción del H2O2 con Fe2+ (o Cu+ )

Reacción de Fenton

Reacción de Haber-Weiss

Fe3+ + O2•- → Fe2+ + O2

Fe2+ + H2O2 → •••• OH + HO- + Fe3+

H2O2 + O2•- → •••• OH + HO- + O2

Muy reactivo

Distribución celular del Fe no hemínico

- Pool de Fe lábil: Fe unido a compuestos de bajo

peso molecular (citrato, ATP, pirofosfato, ácido

ascórbico).

- Ferritina: Es la proteína intracelular más

importante en el almacenamiento de Fe.

- Hemosiderina

Peroxidación lipídica

Definición:

Deterioro oxidativo de lípidos poliinsaturados

¿Cuáles son los indicadores más empleados para evaluar daño por radicales libres a lípidos, proteínas y AD�.

Metodología

Utilizada en el estudio de la bioquímica de especies

activas del oxígeno y nitrógeno

Métodos indicadores de estrés oxidativo in vivo

Detección de especies activas del oxígeno y del

nitrógeno

Detección de antioxidantes

Detección de daño a macromoléculas/estructuras

celulares

�Relación GSSG/GSH (espectrofotometría y HPLC)

�Relación ascorbilo/ascorbato (EPR)

�Quimioluminiscencia in vivo

Métodos indicadores de estrés oxidativo in vivo

�Velocidad de producción (espectroscopía y espectrofluorometría)

�Cálculo de estados estacionarios

Detección de especies activas específicas

�Actividad de enzimas antioxidantes (espectrofotometría)

�Antioxidantes (HPLC)

Detección de antioxidantes específicos

�Lípidos

�Proteínas

�DNA

Carbonilos (espectrofotometría y Western Blot)

Nitrotirosina (Western Blot y HPLC)

8-hidroxi-2´-deoxiguanosina (Western Blot y HPLC)

Hidroperóxidos lipídicos (espectroscopía y

espectrofluorometría)

Lípidos nitrados (Espectrometría de masa)

Detección de daño a macromoléculas/estructuras celulares