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Ritmos Circadianos

IFM 2014Nara I. Muraro

1- Qué son? Por que existen?

2- Como se hace un experimento circadiano

3- Donde está el reloj a nivel anatómico

4- Como funciona el reloj a nivel molecular

5- Como se entrena el reloj (como se pone en hora)

6- Hay un solo tipo de reloj circadiano?

7- Relojes en humanos

8-Sueño

Que les voy a contar:

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Ritmos Biológicos, hay muchos tipos!

infradianos

circadianos

ultradianos

hibernación

actividad/reposo

pulso cardíaco

~año

~día

~mseg

tiempo

Tipo de ritmo Período Ejemplo

Ultradiano 0.1 seg Actividad cerebral

1 seg Ritmo cardíaco

6 seg Ritmo respiratorio

60 min Secreciones hormonales

90 min Alternancia de estados de sueño

Circadiano 24 h Actividad- reposoTemperatura corporal

Infradiano 28 días Ciclo menstrual

365 días Hibernación

Los ritmos biológicos ocurren con distintas frecuencias

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Ritmos Circadianos

Circa (alrededor de) diano (día): ritmos de alrededor de 24hs

Permiten anticipar los cambios en la luz y la temperatura generados por la rotación de la Tierra…

Se encuentran en todos los seres vivos, son ubicuos.

Se manifiestan a todo nivel de organización: desde el celular al poblacional.

…y esto permite ajustar la fisiología y el comportamiento a éstos cambios.

Esto confiere un indudable valor adaptativo.

El ABC de los Ritmos Circadianos:

Oscilador central

Osciladores periféricos

Inputs

Otros inputs:TemperaturaMareas Disponibilidad de alimentoActividad social

Outputs

Ciclos de actividad y reposoExpresión génicaActividad neuronalSecreción hormonalPresión ArterialTemperatura Corporal…y muchas mas!!!

Enmascaramiento

e.g.: secreción de melatonina

e.g.: agudeza visual

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Para que un ritmo sea circadiano debe:

-Manifiestarse en ausencia de información del ambiente (ser endógeno)

-Tener la capacidad de responder a una variable externa(zeitgeber), sincronizando las condiciones internas a las del exterior (ser entrenable)

-Manifiestarse con un período cercano al ambiental (~24h)

-No ser afectado por cambios de temperatura (exhibir compensación por temperatura, Q10~1.0) (pero no insensibles a ella)

El primer experimento circadiano:

-De Mairan, astrónomo Francés

-Observa que sus plantas de Mimosa pudicapliegan sus hojas por la noche y diseña el primer experimento circadiano:

Para estudiar el reloj endógeno hay que eliminar las claves ambientales. De esta manera se puede observar el período de curso libre (free running period=FRP).

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Muestreo en oscuridad constante (O:O)

Muestreo en ciclos alternados de luz y oscuridad (L:O)

día 1 día 2día 2día 1

¿Cómo se hace un experimento circadiano?

Entrenamiento o sincronización (L:O)

día subjetivo-noche subjetiva

Medición automatizada de la actividad locomotora

BMoscas:

Actividad de cada individuo por unidad de tiempo

Roedores:

Humanos:

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Período wild type

Cómo se construye un actograma?

Parámetros que se pueden medir:Periodicidad (de cada organismo)

Ritmicidad (de la población)

Períodocorto

Períodolargo

Arrítmico

oscuridad constante

Caracterización de las oscilaciones

A = período

1/ = frecuencia

A = amplitud

= fase

=ángulo de fase

o cambio de fase

El FRP es una característica fija de un individuo.

Los miembros de una misma especie tienden a tener FRPs similares

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Los núcleos supraquiasmáticos del hipotálamo son el marcapasos circadiano de los mamíferos:

Primeras evidencias:

1972: NSQ es necesario

Comportamientode bebida

1972-1990: NSQ es suficiente

-Reimplantes de NSQ en individuos arrítmicos (porque se les había extirpado el NSQ) devuelven los ritmos.

-Cortar los axones que salen del NSQ o agregar TTX con una cánula en el NSQ, producen arritmicidad.

-Reimplantes de NSQ de individuos mutantes con período corto en individuos arrítmicos (porque se les había extirpado el NSQ) devuelven los ritmos con el períodomutante del donante.

Lean el paper!

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El Núcleo Supra Quiasmático (NSQ):

-Recibe input directo del tracto retino-hipotalámico (eso dió la idea inicialmente de que podrían ser el marcapasos central).

-Red de aprox. 10.000 neuronas (ratón).

-Las neuronas del NSQ exhiben patrones rítmicos de actividad (tanto metabólica como neuronal).

-Este patrón rítmico de actividad persiste en células aisladas del NSQ.

-Si se impide la comunicación entre las diferentes neuronas se pierde la sincronización entre ellas (se desfasan).

-El período que se ve en el comportamiento de un animal, corresponde al del período de la oscilación de la actividad del NSQ.

Como se puede medir la actividad del NSQ?

días

Electrofisiológicamente

Reportero: gen reloj::luciferasa

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- No está muy claro como es la comunicación dentro de NSQ.

Neurotransmisión en el NSQ

- El tracto RHT libera Glutamato en la zona ventral del NSQ.

- Una proporción de neuronas del NSQ ventral producen VIP (péptido vasoactivo intestinal), el VIP sirve para sincronizar las oscilaciones entre neuronas.

- La información viaja desde el NSQ ventral hacia el dorsal vía transmisión peptidergica (VIP, AVP (Arginina Vasopresina), GRP (Gastrin Releasing Peptide) y más! (quizás mas de 100)

- También vía neurotransmisores clásicos en particular casi todas las neuronas del NSQ producen GABA, pero en algunas es excitatorio y en otras inhibitorio!- También cumplen un rol las uniones estrechas y la glia (la glia del NSQ tiene relojes!).

Al NSQ le gustan los neuropéptidos

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Propiedades del NSQ dependen de la red neuronal

Welsh et al (2010)

-El NSQ esta compuesto por osciladores que son autónomos de célula.

- Aisladamente las neuronas del NSQ oscilan, pero se desfasan entre sí y su amplitud es menor.

-Es la sincronización entre sus diferentes neuronas lo que le permite tener oscilaciones con una fase coherente entre ellas y una amplitud considerable.

-La variabilidad entre los diferentes osciladores le daría plasticidad a la red para adaptarse a diferentes situaciones.

-La sincronización se lograría mediante transmisión neuropeptidérgica y circuitos neuronales (que no se conocen!).

Como dirige el NSQ los ritmos circadianos de los diferentes parámetros fisiológicos?

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Outputs del NSQ son una combinación de:- Conexiones sinápticas- Regulación homonal (melatonina/cortisol)- Regulación mediada por el sistema autónomo

Challet (2007)

Melatonina = Noche

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- Correlaciona con la fase nocturna tanto en especies diurnas como en especies nocturnas.

Melatonina

- Se libera de la glándula pineal al torrente sanguíneo.

- Sirve para conferir información de la hora del día a órganos periféricos y sincronizarlos.- En algunas aves la glándula pineal es el marcapasos central (no el NSQ) y recibe directamente claves ambientales de luz (está bien pegada al techo del cráneo y hay un adelgazamiento óseo justo en esa región).- El receptor de melatonina (un R acoplado a proteína G) se expresa en la periferia y también en el NSQ (feedback loop)

- La oscilación de la secreción de melatonina se debe a la expresión circadiana de las enzimas que la producen.

Como se logran los ritmos endógenos en las neuronas marcapasos?

Existe un reloj molecular!!!

El reloj molecular circadiano está establecido por ciclos de feedback negativo de transcripción y traducción de genes y proteínas reloj que son autosostenidos, cada ciclo dura ~24hs.

, 2008

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En los años ’70 Seymour Benzer cambia radicalmente el uso de Drosophila como organismo experimental

-Antes, Drosophila era usada mayoritariamente en estudios de desarrollo y genética.

-El objetivo de Benzer era encontrar una conexión entre genes individuales y comportamientos “simples”, concepto revolucionario 1gen = 1comportamiento

-Usaron genética directa para encontrar mutantes deficientes en diferentes comportamientos como fototaxis, locomoción, aprendizaje y memoria y ritmos circadianos.

-En 1971 Benzer y su estudiante Ron Konopka descubren el gen period, un trabajo fundacional en el descubrimiento de los mecanismos moleculares que dirigen los ritmos circadianos.

Para ver que quiero decir con genética directa y contarles lo genial que es la mosca…

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Genética Directa vs Genética inversa

Y después encuentro cual es el gen que causa el fenotipo

Gen favorito

Y después busco si la modificación de la expresión de mi gen favorito produce un fenotipo anteriormente hipotetizado

Que hace que Drosophila sea un organismo modelo tan útil?

-Ciclo de vida corto

-Barata de mantener en el laboratorio

-Y por lo tanto se pueden mantener una gran cantidad de animales: es posible realizar screens genéticos a gran escala

-Tiene solo 4 cromosomas y tiene la posibilidad de “balancear” las mutaciones con cromosomas especiales para mantenerlas

-Genoma secuenciado

-Existen herramientas genéticas que permiten la manipulación de casi todos los genes en patrones espaciotemporales definidos

-Existen centros repositores que mantienen y distribuyen mutantes

-La comunidad mosqueril tiende a compartir reactivos

-60% de los genes humanos relacionados a patologías tienen ortólogos en Drosophila

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Pero…

…la mayoría de los genes centrales del reloj han sido descriptos primero en Drosophila

y luego se encontraron los genes homólogos de mamífero

Alto grado de conservación en los genes reloj de animales!

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El reloj molecular “TTFL” (simplificado) …

minutosa

pocas horas!

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Algo clave para que el ciclo dure ~24hs:

-Retardos dados por las fosforilaciones y ubiquitinaciones de PER y TIM

-Esto regula la acumulación y localización intracelular de PER/TIM:

13hs 19hs 1hs 7hs

Fernandez et al (2007)

Entonces, los componentes básicos del reloj molecular son:

-Dos factores de transcripción del tipo basic Helix Loop Helix que se unen a la secuencia consenso: CACGTG (E-box) (CLK y CYC,CLK y BMAL)

-Dos proteínas que inhiben la acción de CLK y CYC y cuyos genes tienen promotores que contienen E-boxes (PER y TIM, PER1,2,3 y CRY1,2)

-Una serie de kinasas y ubiquitin-ligasas que retrasan el ciclo ajustándolo a ~24hs, esto lo hacen regulando la localización intracelular y estabilidad de PER y TIM

-Proteínas que conforman un segundo ciclo estabilizador que ayudan a dar robustez al primero

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Gallego and Virshup Nature Reviews Molecular Cell Biology 8, 139–148 (February 2007) | doi:10.1038/nrm2106

Como se pone en hora el reloj?

Reppert and Weaver (2002)

Diferentes de otras células ganglionares en que detectan luz directamente, tienen fotopigmento: Melanopsina

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En la mosca la luz afecta al reloj directamente:

Como se construye una curva de respuesta de fase

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Distintas claves ambientales pueden sincronizar diferentes osciladores

OsciladorMarcapasos

OsciladorEsclavo o Periférico

Reppert and Weaver (2002)

Se refiere a que no es el marcapasos, no a que está en la periferia!

Silver et al (2011)

Distintas claves ambientales pueden sincronizar diferentes osciladores

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Es el NSQ el único reloj????????

Silver et al (2011)

Existe un reloj circadiano independiente del NSQ!

MASCO: Methanphetamine Sensitive Circadian Oscilator

Honma and Honma (2009)

Rata ciega y sin NSQ

-La administración crónica del psicoestimulante metanfetamina induce la aparición de ritmos circadianos en animales sin NSQ.

-La metanfetamina aumenta la neurotransmisión mediada por Dopamina, Noradrenalina y Serotonina ya que inhibe su transporte presináptico.

-Los genes canónicos del reloj molecular no están involucrados en el MASCO.

-Es posible que los ritmos inducidos por restricción de comida y de metanfetamina estén relacionados.

-El período del ritmo correlaciona con la dosis de metanfetamina.

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No todos los relojes funcionan igual!

Como empezaron? Que presión de selección había?

Teoría del “escape de la luz”:como no había atmósfera y la luz UV daña al DNA se favoreció la evolución de un reloj circadiano, de hecho…

…los mecanismos de reparación de DNA exhiben oscilaciones diarias!

Y, después? Great Oxidation Event

- Aparición de organismos fotosintéticos crea atmósfera oxidativa.

- El ozono protege de una parte importante de la radiación UV.

- Reloj circadiano: útil para regular el momento de dos procesos incompatibles, la fotosíntesis durante el día y la fijación de nitrógeno durante la noche.

- Que sabemos del reloj circadiano de las cianobacterias?

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Synechococcus elongatusPCC7942

-Exhiben ritmos circadianos en diferentes parámetros incluso en condiciones en las que la división celular es menor a 24hs! (5-6hs)

- En 1995, Liu y col. hacen un screen para encontrar mutantes arrítmicos o con período anormal usando un reportero de luciferasa sin promotor.

- Descubren los genes kaiA, kaiB y kaiC. Que constituyen el reloj central de las cianobacterias.

- Sin embargo pasa algo raro: la inhibición de la transcripción y traducción no alteran la ritmicidad!

- 2005: Nakajima y col. mezclan KaiA, KaiB y KaiC purificadas y agregan ATP y obtienen oscilación in vitro!

- KaiC: proteína que forma hexámeros y tiene un dominio de unión a ATP. KaiA y KaiB interactúan físicamente con KaiC.

TTFL vs PTOPost Translational Oscillator

TranscriptionalTranslational FeedbackLoopsOscillator

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TTFL + PTO

En cianobacterias: se pudo comprobar directamente que el reloj circadiano confiere un

valor adaptativo!

Ouyang et al (1998)

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Un reloj común a todos?- Los eucariotas no tenemos proteínas Kai.

- Existe algún reloj común conservado en todos los organismos vivos?

- Ni las bacterias tienen Per, Tim, etc…

- Esto esta recién salidito del horno! En 2011/2012:

- Las peroxiredoxinas son proteínas presentes en virtualmente todos los organismos y muy conservadas.

- Su estado de oxidación oscila circadianamente desde las cianobacterias hasta los humanos.

- Aunque el reloj TTFL y el ritmo de las peroxiredoxinas están relacionados (por ejemplo, mutaciones que dan período largo también producen oscilaciones de peroxiredoxinas con período largo) también pueden ser independientes, evidencias:

O’Neill and Reddy (2011) Edgar et al. (2012)

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Loudon (2013)

Relación entre los Ritmos Circadianos y la Salud Humana

-Trabajo a contraturno-Cambios frecuentes de huso horario

-Mutaciones en genes reloj -Síndrome de fase de sueño avanzada/retrasada

-Cáncer -Enfermedades cardiovasculares-Obesidad-Depresión

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Relación entre los Ritmos Circadianos y la Salud Humana

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-Diferentes tipos de disrupción del sueño

-Parkinson-Huntington-Alzheimer-Depresión-Esquizofrenia

-Envejecimiento

Los humanos tenemos relojes!

Bunker en Andechs

- En los años ’60 experimentos de libre curso en humanos comprueban que también nosotros, como era de esperarse, tenemos un oscilador circadiano.

- Con la industrialización y la electricidad las condiciones de vida humanas cambiaron radicalmente, de trabajar en el campo y estar expuesto al ciclo de luz-oscuridad a vivir en grandes ciudades y exponernos a una gran cantidad de luz artificial.

- Qué sincroniza a los relojes humanos? Qué es más fuerte, la luz (como en otros mamíferos) o las pautas sociales?

- En humanos se habla de diferentes cronotipos: sos alondra o lechuza?

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http://www.thewep.org/chronotype-study

Estudio de los ritmos circadianos humanos en condiciones de entrenamiento.

La clave para estudiar el comportamiento humano en la vida diaria: hacer la pregunta adecuada.

Cronotipo: Mid-sleep onfree days (MSF)

Validado con otros parámetros fisiológicos.

Sigue una distribución normal en la población:

Cuestionario:

n=60.000

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El cronotipo cambia con la edad:

hombres

mujeres

Alemania se extiende en 9 grados de latitud, hay 36min de diferencia entre la puesta del sol entre el este y el oeste, pero un solo huso horario!

n=21.600

<300.000 hab

>500.000 hab

300.000-500.000 hab

La luz es el principal sincronizador de nuestro reloj circadiano, y no la

pautas sociales.

Jet lag

- Cuando uno se des-sincroniza con el ambiente (jet-lag) uno se siente mal.

- Estudios poblacionales demuestran que la mayor parte de la población sufre jet-lag social crónico:

-Sufrir jet-lag social correlaciona con el consumo de tabaco/ alcohol/cafeína y obesidad.

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Ritmos circadianos en humanos

- Concientización en la escolaridad.

- Concientización en el ámbito hospitalario.

- La administración de drogas terapéuticas es mas efectiva en momentos del día específicos: cronofarmacología.

- Concientización en el ámbito laboral.

Sueño

- Aumento del umbral de respuesta a estímulos externos.

- Regulado Circadianamente (C).

- Acompañando de un estado de quiescencia.

- Regulado Homeostáticamente (S).

Como definirlo?

Por que dormimos?

- No se sabe.

- Vital.

- Hipótesis de la homeostasis sináptica.

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Mensaje para llevar a casa:

-Existen diferentes modelos de relojes.

-Probablemente todas las funciones celulares estén en mayor o menor medida reguladas circadianamente (ténganlo en cuenta para su próximo experimento!).

-Los ritmos circadianos son oscilaciones de alrededor de 24hs endógenas, autosostenidas e independientes de la temperatura.

-Son sincronizables por diferentes claves ambientales (zeitgebers).

-Molecularmente algunos dependen mayoritariamente de loops de transcripción y traducción de genes que inhiben su propia expresión (TTFL) y otros de ciclos de fosforilación y desfosforilación de proteínas (PTO). La oscilación del estado de oxidación podría constituir otro tipo de reloj.

-En mamíferos el oscilador central se encuentra en el NSQ, en otros animales en la glándula pineal, o en circuitos neuronales en el cerebro o el ojo.

Gracias!