Tema VI

Fotometria d’emissió

Continguts

• Introducció a la fotometria d'emissió

• Descripció d'un fotòmetre de flama

• Interferències

• Exemple: determinació de la litèmia

• Fluorimetria i quimioluminescència. Espectre d'excitació

• Relació entre la intensitat fluorescent i la concentració

• Corba de calibratge

• Descripció d'un fluorímetre

• Immunoassaig per luminescència

Objectius específics

• Realitzar determinacions analítiques mitjançant espectroscòpia d'emissió de flama i de fluorescència

• Identificar les diferències entre absorció i emissió

• Descriure les parts d'un fotòmetre de flama

• Distingir els factors que intervenen en la producció d'interferències

• Descriure el funcionament i les diferències existents entre fluorimetria i quimioluminescència i les seves aplicacions en el camp de la bioquímica.

Introduccióhttp://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/pertab/pertab.html#c1

Introducció

Font energètica

↓ Àtom ==== electrons “canvi d’orbital”

E=h·ν

h = constant de Planckν = freqüència radiació emesa o λ caract.

Fotometria d’emisió

# maneres d’excitar els àtoms# mètodes de processar la radiació emesa

Fotometria de flama: Na+, K+ i Li+

Fluorimetria: fluorescència (quimio)..

LAB

Fotometria de flama

• Es basa en el fenomen de l’emissió de llum

• Quan un àtom en estat fonamental és sotmès a l’energia calorífica d’una flama, els seus electrons s’exciten, passant a nivells superiors d’energia. En aquest estat excitat són inestables, i al tornar al seu estat inicial desprenen l’energia en forma de llum.

• Llum de diferents colors (# λ): Liti (vermell, 670nm), Sodi (groc, 589nm) i Potassi (violeta, 775nm)

• La intensitat lluminosa de la λ és directament proporcional a la quantitat d’àtoms que emeten energia i per tant a la concentració de l’ió en la mostra (excepte mostres molt diluïdes o molt concentrades)

• En una solució d’un ió, només es troben excitats en la flama entre l’1 i el 5%

• La tècnica presenta molta sensibilitat per a la determinació dels metalls alcalins (liti, sodi i potassi)

• Altres metalls(calci, magnesi,..) no són excitats tan fàcilment…

Instrumental (descripció)

Parts fonamentals:

1.Cremador

2.Atomitzador

3.Flama

4.Reguladors de pressió i flux dels gasos

5.Sistema òptic

6.Detector

7.Sistema de registre

Gasos:

1.En general s’utilitza gas natural, acetilè o propà amb aire o oxigen.

2.L’elecció de la flama (gasos) depèn de la temperatura que desitgem. Per a determinacions de sodi i potassi és suficient el propà-aire

3.És essencial que la temperatura de la flama es mantingui constant, per a això hi ha uns reguladors que mantenen el flux del gas constant

Atomitzador:

• Té com a funció disgregar la solució problema en petites gotes, per a que els àtoms absorbeixin l’energia tèrmica de la flama i s’excitin.

• La solució entra a gran velocitat i xoca amb les parets d’una cambra, disgregant-se en fines gotes.

Flama:• La variable més important de la flama és la seva

temperatura (estandardització) ja que el canvis tèrmics afecten a la resposta de l’instrument

• És pràctica comú l’existència d’un període d’escalfament, i l’aspiració d’aigua i solucions estàndard abans de les mesures, fins que s’estableix l’equilibri tèrmic en la flama i en la cambra d’atomització. A més a més, s’introdueixen comprovacions amb estàndards de valor conegut entre les determinacions.

Altres components fotomètrics:

• Les reixetes, monocromadors i detectors tenen la mateixa funció que en l’espectrofotometria d’absorció.

• Els monocromadors seran d’alta qualitat i gran sensibilitat i evitaran la interferència de totes les emissions produïdes en la flama per elements no iònics

• Els detectors més utilitzats i amb millors resultats són els fototubs

Tipus de fotòmetres de flama

Dos tipus:

- Directes: intensitat de llum= [ ]

- Amb estàndard intern: la intensitat de l’emissió de l’element a determinar es compara amb la d’un element agregat com estàndard intern

Fotòmetres de flama amb estàndard intern (FFEI)

• Tots els fotòmetres de flama utilitzats en clínica són d’aquest tipus

• Utilitzem com estàndard intern liti o cesi

• El liti per a determinacions de sodi i potassi

• El cesi per a determinar sodi, potassi i liti

FFEI

• Característiques de l’estàndard intern:

- que estigui absent dels líquids biològics a mesurar

- que emeti a λ suficientment llunyanes dels elements a mesurar, per a no interferir

Altres consideracions

• Les característiques de la flama són elements reproduïbles en cada determinació

• La majoria del processos químics són reaccions d’oxidació

• Les reaccions en la flama poden alterar el nivell d’emissió dels elements que es troben en ella

• La velocitat fins arribar a l’equilibri de les reaccions és molt important (difusió del gasos)

• Les característiques hidrodinàmiques dels gasos(velocitat, pressió, flux ..) afecten a la flama

• Un flux laminar(ordenat, estratificat, suau, de manera que el fluid es mou en làmines paral·leles sense entremesclar ) o un flux turbulenten (forma caòtica, en què les partícules es mouen desordenadament i les trajectòries de les partícules es troben formant petits remolins aperiòdics) condueix a resultats diferents

• Un flux serà laminar o turbulent depenent del nombre de Reynolds

R = V·D /η k η k = η / δ

R = nombre de Reynolds

V = velocitat mitjana de la flama

D = diàmetre del tub

ηk = viscositat cinemàtica del gas

η = viscositat (viscositat dinàmica)

δ = densitat

R = V·D /ηk ηk = η / δ

Si R < 2300 .......Flux Laminar

Si R > 2300....... Flux Turbulent

Interferències(I)

• Interferències de radiació: degudes a elements productors de radiacions amb λ molt similar a la de l’analit. Les evitarem amb monocromadors de banda estreta.

• Interferències d’excitació: per transferència d’energia d’altres àtoms excitats a l’àtom que mesurem. És freqüent l’excitació del sodi transferida al potassi. Les evitem afegint una concentració elevada d’un metall que no es trobi en la mostra, com el liti o el cesi, per a que absorbeixi la radiació

Interferències(II)

• Interferència de fons: presència d’altres components iònics (proteïnes, lípids i carbohidrats) --- la minimitzem fent altes dilucions de la mostra.

• Interferències químiques: per compostos de calci aïllats (fosfat càlcic) que impedeixen que els àtoms de calci s’excitin ---- les minimitzem afegint lantà que reaccionarà amb el fosfat i deixarà lliures els àtoms de calci.

Litèmia(I)

• La fotometria de flama és la millor tècnica: baix cost, alta especificitat i gran reproductibilitat.

• Element psicoactiu, utilitzat en patologia humana des de l’any 1970 en forma de carbonat de liti per al tractament de la PMD (nivell terapèutic entre 0,7 i 1,4 mmol/L)

Litèmia (II)

• Efectes indesitjables entre l’1.4 i 2 mmol/L: irritació gastrointestinal, tremolors, debilitat muscular i poliúria.

• La seva toxicitat (nivells > 2 mmol/L) ocasiona fracàs renal, convulsions, coma, HTA, col·lapse cardiovascular i mort

• Monitorització dels malalts

Exercici

Determinar si el flux de la flama d’un fotòmetre, amb les següents característiques, és de tipus laminar o de tipus turbulent:

Velocitat mitjana de la flama 120 mm/s ; radi del tub 1955 µm ; viscositat dinàmica del combustible (gas natural) 7 mil·lipascals per segon; densitat del gas natural 2566 grams per dm3 .

η = viscositat dinàmica.............. pascals x segons

ηk = viscositat cinemàtica

δ = densitat .................................. Kg/m3

v = velocitat .................................. m/s

D = diàmetre .................................. m

R = v . D / ηk η / δ = ηk

Fluorimetria

Tècnica de laboratori que calcula la intensitat i el tipus de radiació fluorescent que emet una substància al exposar-se a una radiació incident d’una determinada λ

Determina la classe i la concentració de la substància

És una tècnica qualitativa i quantitativa

El fenomen de fluorescència es troba dins dels fenòmens anomenats de luminescència, que inclouen, a més a més d’aquest, la fosforescència i la quimioluminescència

Tots ells són resultants de la interacció de la llum amb la matèria, que finalitza amb l’emissió d’energia radiant

La fluorescència es produeix quan una molècula absorbeix llum d’una determinada λ (energia) i emet llum d’una λ superior (menor energia)

Quan una molècula és excitada per un feix de llum d’una intensitat i energia determinada, absorbeix energia i es produeix el pas dels seus electrons d’un estat basal a un estat excitat, alliberant aquesta energia en forma de llum, resultant en una emissió fluorescent o fluorescència

La llum emesa en aquest fenomen té sempre menor energia que el feix de llum d’excitació (incident), per això la llum fluorescent emesa és de λ major que la de la radiació absorbida o d’excita-ció

El fenomen de la fluorescència és més lent que el fenomen d’absorció

Entre l’absorció d’energia i l’alliberació en forma de llum fluorescent es produeix un retard comprès entre 10-8 i 10-4 segons (l’absorció es produeix en 10-15 segons)

La llum fluorescent s’utilitza per a quantificar la quantitat de compost fluorescent que l’emet

La relació entre la concentració i la intensitat d’emissió fluorescent es dedueix a partir de la Llei de Beer:

It / I0 = e-ε·b·c

It = Intensitat transmesaI0 = Intensitat incident (excitadora)ε = Coeficient d’extinció molarb = Camí òptic (pas de llum)c = Concentració

S’anomena rendiment quàntic de la fluorescència (φ, lletra fi grega) a la relació entre els fotons emesos (I t) i els absorbits , i varia des de cero, substàncies no fluorescents, fins quasi un 100% (fluorescència òptima)

La fluorescència és una tècnica analítica quantitativa

La intensitat de la radiació fluorescent, F, és proporcional a la intensitat del feix d’excitació que és absorbit per el sistema, i al rendiment quàntic

Relacionant la Llei de Beer:

Si treballem amb solucions diluïdes, de manera que aconseguim que no s’absorbeixi més del 2% de la radiació incident, l’expressió es converteix en:

I la intensitat de la radiació fluorescent serà proporcional a la concentració de substància en solució.

F = φ (I0 – It)

F = φ · I0 (1 – e-εbc )

F = K · c

La fluorimetria combina la simplicitat de la fotometria amb l’alta sensibilitat i especificitat del fenomen fluorescent

Sempre es realitza una corba de calibratge

Al augmentar la concentració, augmenta la intensitat de la llum fluorescent fins arribar a un valor per sobre del qual la recta de la gràfica es transforma en una corba asimptòtica (s'apropa infinitament a una altra sense mai coincidir-hi)

La primera part de la gràfica (recta) acompleix l’equació F = K · c , però la segona part (corba) queda fora de la calibració

Moltes vegades convé relacionar la concentració de la substància, no amb la intensitat de fluorescència en valor absolut, sinó amb el seu valor relatiu a la intensitat màxima de fluorescència emessa (Fm = k1 · I0) obtinguent:

k1 és el coeficient d’eficiència, un factor que agrupa les característiques de la substància i de l’instrument

Instrumentació ( 7 parts)

Font de radiació: làmpades d'arc de Hg o làmpades de Xenó (250-800nm)

Filtre primari: filtres d'interferència o monocromadors d’excitació

Cubeta per a mostres: quars o sílica fosa (UV) Filtres secundaris: són monocromadors

d’emissió davant dels tubs fotomultiplicadors per a evitar les radiacions reflectides i dispersades. Així només transmeten la radiació fluorescent produïda

Instrumentació (II)

Tubs fotomultiplicadors (detectors) a 90º amb la direcció de la radiació excitadora

Solució estàndard: en dilucions seriades per a ajustar i calibrar l'instrument

Pantalla d'absorció: opaca i en la mateixa direcció que la radiació excitadora. Absorbeix tota la radiació transmesa

Monocromador d’emissió

Tub fotomultiplicador

Fluorímetres de doble feix

Un feix travessa la mostra i l'altra travessa la solució estàndard

La làmpada de Hg emet radiació excitadora alternativament cap a la mostra o cap el patró

El fotoreceptor captarà el feixos també de manera alternativa, comparant-los

No els hi afecten el canvis de temperatura ni les radiacions reflectides ni difractades sobre les cares de la cubeta.

Quimioluminescència

Fenomen luminescent ocasionat per a una energia d’excitació produïda en el curs d’una reacció química

A vegades no és l’analit el que experimenta el procés l’excitació-relaxació sinó una espècie formada per la reacció de l’analit i els reactius químics utilitzats en la prova, freqüentment una espècie oxidada

Mètode d’elevada sensibilitat Utilitza luminògens (substàncies com l’acridina,

fenantridina, ABEI.. que absorbeixen la llum de la reacció química i la transformen en llum visible entre 400 i 650nm),

Ex: l’èster d’acridina + H2O2 → N-metilacridina (alta energia) → Producte final (baixa energia) + llum (445nm)

Flash de llum de màxima energia als pocs segons i posteriorment disminueix de manera exponencial

El senyal lluminós es detecta mitjançant un tub fotomultiplicador i es transmet a un amplificador molt sensible (registre intensitats lluminoses molt petites)

Tipus d’assaigs luminescents:

• LIA (Assaig immunoluminescent , ↑Pm)

• ILMA (Assaig immuno-lumino-mètric, ↓Pm)

LIA

Immunoassaig tipus sandvitxS’utilitzen dos tipus diferents d’ anticossos

monoclonalsUn es fixa de manera irreversible a la

paret interna d’un tub de disseny especial “cel·les”, i reacciona específicament amb una regió de la molècula de l’element problema (ex: TSH)

El segon està unit a una molècula luminògena (actua com marcador o market) i reacciona específicament amb una regió diferent de la molècula de l’element, formant el complex tipus sandvitx

Després rentem els elements no fixatsI finalment es mesura l’emissió

quimioluminescent (tub fotomultiplicador)

ILMA

• Utilitza un traçador (tracer) format per la unió de l’analit i el marcador

• Hi ha una competitivitat entre una quantitat coneguda de traçador i una quantitat desconeguda de l’element problema, deguda al limitat nombre d’anticossos específics fixats irreversiblement a la paret interna del tub

Metodologia LIA ≠ Etapes (Seccions)

1. Pipetejar (màxim 300 tubs)2. Incubació o de reacció amb

un agitador per a minimitzar el temps de reacció. Generalment a temperatura ambient i en cambra fosca

3. Rentat amb aigua destil·lada o NaCl 0,14M

4. Mesura de la intensitat lluminosa emesa en el luminòmetre (un segon per mostra)

5. Registre amb un microprocessador amb el soft adequat

•

Aplicacions Quimioluminescència

TSHT4T3T4 lliureFerritinaβ2 MicroglobulinaProlactinaLHFSHTeofil·linaDigoxinaMarcadors Tumorals (CEA, PSA, PSA lliure, CA125, CA19.9….)Fàrmacs (Antibiòtics, Antitumorals, Antiepilèptics…)Drogues….