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Tema 5: Protocolos experimentales y rectas de calibrado

Protocolos para obtención de datos, calibrados, uso de hojas

de cálculo

Tema 5


Antecedentes Bibliográficos

Diseño del experimento

Obtención datos, calibrados, etc.

Exploración de datos

Análisis : tests estadísticos, ajuste de curvas , ….

Etapas de una investigación


Diferentes protocolos para diferentes estudios (1/2)

a) Concretar el procedimiento experimental.

b) Preparación de disoluciones y comprobar su estabilidad en el almacenamiento.

c) Rectas de calibrado:

- Diferencia entre precisión y exactitud. Estimación de una media con intervalo de confianza (barras de error)

- Ajuste de una recta a los datos por regresión lineal, bandas de confianza.

- Predicción inversa.

d) Hacer las medidas experimentales del estudio, recopilar los datos en una tabla de EXCEL y hacer una representación inicial de los datos.

1) Estudios experimentales (por ej. : Determinar la Km y Vmax de una enzima usando regresión no lineal):


Diferentes protocolos para diferentes estudios (2/2)

2) Estudio observacionales (por ej. comparación de la eficacia de un nuevo fármaco en pacientes tratados con dicho fármaco frente a placebo (test t de student)):

a) Elegir la población objeto del estudio.

b) Establecer el tamaño de muestra, el tipo de aleatorización, tipo de “ciego”.

c) Elaboración de encuestas o de procedimientos de medida.

d) Hacer las observaciones o medidas.

e) Recopilar los datos en una tabla de EXCEL.

(En lo que sigue nos ocuparemos principalmente de lo estudios experimentales)


a) Establecer primero el protocolo experimentala) Establecer primero el protocolo experimental

Toma de muestra

1) Tiempos ( 1h, 2h, 3h,…24h)

2) 200 L muestra + 400L tampón

Termostatar

Medida de absorbancia

1) 100 L enzima

2) 100 L sustrato

3) 9.6 mL disolvente

4) 0.2 mL agua

10 mL total

Procedimiento


Se suelen hacer réplicas de muestreoSe suelen hacer réplicas de muestreo

Se toman alícuotas

Medida Medida AbsorbanciaAbsorbancia

Enzima

Sustrato

+

Réplicas de muestreo (3 réplicas a cada sustrato)

No suele ser necesario réplicas de técnica

¡CV(%) grande!

¡CV(%) pequeño!


¿Cuántas réplicas se deben hacer?¿Cuántas réplicas se deben hacer?

1) Cuando se desea estimar la media:

2) Cuando se desea estimar la desviación estándar:

X

snº réplicas

CV(%)

1 2 3 4 5

3º réplicasden

nº réplicas

CV(%)

1 2 3 4 5

5º réplicasden

(La media se estabiliza a partir de 3)

(La desviación estándar se estabiliza a partir de 5)


b) Preparación disoluciones en base al protocolo

Se desea en reactor:

[E] = 1 g /mL

1) 100 L enzima

2) 100 L sustrato

3) 9.6 mL disolvente

4) 0.2 mL agua

10 mL total

Procedimiento:A preparar:

[E] = 100 g /mL

[S] = 200 mg /mL[S] = 2 mg /mL

Hacia atrás

1) Tiempos ( 1h, 2h, 3h,…24h)

2) 200 l + 400l tampón

[S] = 0.3 mg/mL

(Multiplicar por 3)Hacia adelante

0.9 mg/mL


• Buenas prácticas experimentales:

• Buenas prácticas numéricas:

Obtener datos sin artefactos

Para cálculos elegir unidades para que los valores sean del orden de “ 1 ” (ej. 3.2 M es mejor que 0.0000032 M o 3.2.10-6 M)

Trabajar con los valores de todas las réplicas (no sus medias), para que los tests estadísticos en el ajuste de curvas tengan los grados de libertad correctos.

Hacer bien referencias en la técnica analítica Analizar bien controles o blancos.Comprobar exactitud y línea base de aparatos


Recordatorio de cifras significativas

Dado un número, se entiende por cifra significativa cualquier dígito no nulo (1 al 9), cualquiercero situado entre dígitos no nulos y cualquier cero situado a la derecha del número.

Ejemplos:

0.0000689 = 6.89 · 10-5 3 cifras significativas0.00208 = 2.08 · 10-3 3 cifras significativas0.002080 = 2.080 · 10-3 4 cifras significativas

Concepto de cifra significativa :


Recordatorio de reglas para los cálculos

4105.3

2) Si se quiere redondear un número que tiene cifras significativas superfluas, auméntese enuna unidad la última cifra retenida si la primera cifra desechada es 5 o mayor.

3) Cuando se suman o se restan números, el resultado se da con tantas cifras decimales comotenga el número con menor número de decimales.

Ejemplo: 0.12 + 12.2324 + 1.568 = 13.9204 (mal)

= 13.92 (bien)

4) Al multiplicar y dividir números, el resultado se da con las cifras significativas necesariaspara que su incertidumbre sea semejante a la incertidumbre relativa del factor que menos

cifras significativas tenga. En la práctica viene a ser equivalente a expresar el resultado con el

mismo numero de cifras significativas que las que tenga el factor con menos cifrassignificativas. (Obsérvese que este criterio se refiere a las cifras significativas, no a los decimales de los

números).

Ejemplo: imaginemos el siguiente cálculo

(¿Por dónde cortar?)1.578 0.0182

81 = ¿ 3.54562963.10 4 ?

1) Al registrar el valor numérico de una magnitud, se escriben sólo las cifras significativas

adecuadas (se supone que la incertidumbre en la medida es de en la última cifra 1significativa dada). Ej: con un termómetro de décimas se anotaría 25.2 ºC (no 25 ni 25.20).


Diferencia entre precisión y exactitud.

PrecisiónHace referencia a la repetitibilidad de una medida. Así, se dice que unas medidas

repetidas son precisas cuando presentan pequeñas diferencias entre si y son

reproducibles. La precisión de unas medidas repetidas se cuantifica con los

procedimientos de la Estadística Descriptiva, principalmente con la llamada

desviación estándar de la muestra.

ExactitudHace referencia a la concordancia de la medida con el valor verdadero o exacto. Se

dice que una medida es tanto más exacta cuanto más se acerca a su valor

verdadero. La exactitud de una medida se cuantifica en base a “patrones” y “curvas

de calibrado”.


Simil para diferencia entre precisión y exactitud.

Imaginemos el tiro con carabina a una diana:

Error absoluto y error relativo

Error absoluto:

Error relativo:


Población: niños españoles al nacer

Estimación de una media por intervalo de confianza

???μVariable: Peso en kg

Intervalo de confianza Límites de confianza

)%( confianzadealICμ 95

Muestra grande3.5

3.7

2.8

3.3

…..

43.x ???

Población: células en un cultivo

Variable: nº células/mL

Réplicas

6.2 106

6.8 106

5.9 106

61036 .x ???

Muestra pequeña


222

21

)(

x

exf

Normal:

2

2

21

)(z

ezf

Normal estandarizada:

)( i

i

xz

:adosestandariz valores

Recordatorio de la distribución normal

2μ : en veces las de 95%caerá individuo unpara obtenidovalor cualquier tantopor

Basado en J.P. Domènech (Bioestadística)


Población origen (x)

Se toman infinitas muestras al azar de tamaño “n”

Población medias x

2

varianza

media:normal Dist.

:sigue x variableLa

nmediaesterr

n

..

2varianza

media

:normal Dist.

:siguen x medias Las

)( nμ : en veces 95%caerá muestralmedia cualquier tantopor 2

Comportamiento de las medias de diferentes muestras sacadas de una población (Teorema del límite central)

Adaptado de J.P. Domènech (Bioestadística)


Puntualizaciones acerca de la varianza y desviación estándar

1

2

2

n

xxsnza)cuasivaria (o muestralVarianza i:

En la población

En un muestra (se hace la corrección de Bessel y en vez de n se pone n-1)

n

xlpoblacionaVarianza i

2

2 )(:

n

x:lpoblacionaestándar Desviación i

2

2 )(

1

2

n

xxssestándar) desviacióncuasi (o muestralestándar Desviación i:


:, luegon

μ intervalo en veces 95% elcaía muestra cualquier demedia la que vimos

2

n

szx

En general la estima de de la población desde una muestra grande:

Donde:

zdesvío para riesgo normalmente:

2961 .z

Donde:

),( t “t” Student con grados de libertad y riesgo

n

n

stx ),(

La estima de de población desde una muestra pequeña:

Generalización para la estimación de una media por intervalo


Ejemplo: estimación de medias con intervalos al 95%

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

Muestra 83Muestra 3

5 %


Simulamos al azar: 7 muestras de 10 datos:

2620509 .).,(

),(

tn

stx

Ejemplo: simulación de medias con intervalos al 95%

5010 .

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

Muestra 4Muestra 6

Muestra 5

Muestra 7


n

stx

n

stx

n

stxsx

3 datos LC 95%

3 datos barras 1s

sx sx

7 datos LC 95%

7 datos barras 1s

30 datos LC 95%

30 datos barras 1s

Otros tipos de límites de confianza (barras de error)


Cálculo de límites de confianza (SIMFIT)

Statistics > Statistical calculations > Estimate parameter confidence limits


Cálculo de límites de confianza (SIMFIT)

Número de sujetos: n = 20

Media en la muestra:

Desviación estandar muestra:

% de confianza: 95

Ejemplo:

15x4s

13.1-------15.0------16.9 15.0 1.9O también:


Ajuste de una recta por regresión lineal simple y bandas de confianza

El llamado método de Allen se utiliza para medir concentraciones de fosfato en base a una reacción coloreada con molibdato. Para ello hay que hacer primero la recta de calibrado o ley de Beer a partir de unos patrones de fosfato.

c) Rectas de calibrado y predicción inversa

Predicción inversa

Evaluación

SIMFIT


Evaluación y predicción inversa

c) Rectas de calibrado y predicción inversa.

0.2310.472

Evaluación: Se introduce la “x” y se desea la “y” (no suele tener interés)

Predicción inversa: Se introduce la “y” y se desea la “x” (es lo que interesa, medir la absorbancia de una muestra y estimar la [fosfato])

SIMFIT


d) Hacer las medidas experimentales del estudio de que se trate, recopilar los datos en una tabla de EXCEL y hacer una representación inicial de los datos.


Manejar bien hoja de cálculo Excel

1) Combinar celdas: Inicio > Combinar y centrar > Ajustar texto

2) Insertar gráficos, por ejemplo línea recta ajustada por regresión lineal

Seleccionar celdas > Insertar > Dispersión > primer estilo > se despliega una barra herramientas > Deplegar tipos con y seleccionar cuadro con fx (aparece la recta de ajuste y su R2 .

3) Introducir una fórmula sencilla, por ejemplo: (celda1 + celda 2)*7/100

Excel 2007

=(A1+B1)*7/100

4) Opción autocompletar : se propagan los cálculos de una fórmula si uno arrastra la celda con la fórmula estirando con el cursor en la esquina derecha).

5) Utilización de funciones: por ej. función SI……

Fórmulas > Insertar función > SI (Prueba_lógica; valor_si_verdadero; valor_si_falso)


Existen muchas funciones en ExcelExcel 2007


Otras herramientas de Excel

1) Ordenar y filtrar:

Ordenar de menor a mayor, ordenar de mayor a menor, ordenar de A a Z, ordendar de Z a A.

Ordenar:

2) Tablas dinámicas para resumir datos:

Insertar > tabla dinámica

Filtrar:

Ej: Seleccionar la columna deseada > ordenar y filtrar > filtrar > Se despliega arriba en la columna una flecha > filtros de número > inferior al promedio


Abble bits (Merge Tables wizard)

Aspectos avanzados de la hoja de cálculo Excel: uso de macros

SIMFIT6.XLS

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