tema 4 calibraciones y regresión

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA Y CCMM

“Prof. J.C. Vilchez Martín”

TEMA 4 Calibraciones y regresión




Métodos clásicos (vía húmeda)

Métodos Volumétricos

Métodos gravimétricos

VentajasAnálisis de buena precisiónAnálisis de materiales patronesMétodos absolutos

InconvenientesLentosSensibilidad limitada




Métodos instrumentales

Cromatografía de gases (GC)

ICPHPLC

Absorción atómica de llama (AAS)

VentajasGran sensibilidadPotencia de análisisMás rápidosAutomatizaciónControl computarizadoTratamiento de datosDatos gráficosEvaluación estadísticaComparación espectrosControl de parámetros

Técnicas electroquímicas

Algunos ejemplos

Absorción molecular UV-vis (EAM)Espectrometría de masas




¿Qué tienen en común?

Patrones secundarios de concentraciones conocidas oPatrones primarios certificado

Hay que establecer la relación Señal / Concentración

Calibración

Patrón primario certificado




Y en el ensayo…

Muestra

Concentración?

Interpolar la señal en la curva de calibración




Patrones de calibraciónConcentración conocidaCubrir el rango de concentración de las muestras a analizar en los ensayosMismos disolventes y reactivos que en el ensayoMatriz lo más parecida posible que la muestra realIncluir el blanco en la curva (no restar)

Gráfica de calibraciónSeñal instrumental en ordenadaConcentración, cantidad en abcisaHabitualmente lineal y = a + bx (no siempre)

ErroresCoeficiente variación de señal instrumental 2-3%Preparación del patrón < 0,1% (despreciable)Si se realiza varias medidas punto calibración : Distribución gaussiana normal




Centro de gravedad de la calibración(, )

Se establecen pares (xi, yi)

Se incluye el blanco (0, y0)




La calibración es realmente lineal?

Rango de valores -1 r +1+1 Correlación positiva perfecta. Ajuste perfecto-1 Correlación negativa perfecta. Ajuste perfecto 0 No existe correlación




Que valores de r indican una buena calibración?

Se puede realizar un contraste estadístico en función del número de puntos de calibraciónH0 r es pobre, x e y no guardan relación t calc < t crit

H1 r es significativo, buena correlación t calc > t crit

Para t crítica = t n-2, 0.05 (tabla dos colas)

t calc

Generalmente para alrededor de 5 puntos de calibraciónr2 > 0,995 Es aceptable

Asegura una relación lineal? No




Malinterpretaciones de r

Estupendo r2 > 0,995 = Relación lineal

Falso

La relación entre x e y es una función polinómica de segundo grado

y = cx2+bx2+a

2




Malinterpretaciones de r

r =0 No existe relación entre x e y

Falso

Si hay relación entre x e y pero no es lineal sino parabólica




iii eyy ˆResiduos

Para un xi de un patrón, diferencia entre el valor de señal yi y la que le correspondería en la recta de calibración

Correlación linealDistribución de residuos gaussiana y de media 0 (simétricas)

Correlaciones no linealesDistribución de residuos no gaussina normal

Linealidad de la gráfica de control




Homocedasticidad de residuos

HomocedasticidadLa dispersión (desv.std) de la población independiente de x (concentración)

Todos los puntos en calibración igual pesoCalibración no ponderada

HeterocedasticidadLa dispersión (desv.std) de la población depende de x (concentración)

Los puntos en calibración no deben de tener igual peso al realizar la regresión

Calibración ponderada

Calibración ponderada




Ponderar o no ponderar

¿Como podemos evaluar si las desviaciones de la señal a lo largo de las

concentraciones difieren o no?

Repitamos n1 veces un patrón de calibración a baja concentración del rangoCalculemos s1

Repitamos n2 veces un patrón de calibración a alta concentración del rangoCalculemos s2

Dos s, averiguar si son significativamente la misma precisión…¿A que suena esto?

Al clásico test de FischerH0 Fcal < Fcrit s1=s2 Se asume que la precisión en el rango de concentraciones

de calibración es la misma ( homocedástico, no ponderar)H1 Fcal > Fcrit s1=s2 Son diferentes a lo largo del rango (heterocedástico,

ponderar)

Dos s, averiguar si son significativamente la misma precisión…¿A que suena esto?

Al clásico test de FischerH0 Fcal < Fcrit s1=s2 Se asume que la precisión en el rango de concentraciones

de calibración es la misma ( homocedástico, no ponderar)H1 Fcal > Fcrit s1=s2 Son diferentes a lo largo del rango (heterocedástico,

ponderar)




Condiciones del modeloYa hemos ido viendo algunas1.Calibraciones donde los errores de concentración (cantidad) en la preparación de los patrones (0,1%) es despreciable frente a los errores aleatorios de la señal instrumental

2.La relación con la señal es lineal en el intervalo de concentración considerado

3.Los residuos son homocedásticos, misma precisión independiente de la concentración

4.La distribución de los residuos es normal y su media es cero

No No




Es la recta que minimiza la suma de los cuadrados de los residuos

Se establece una recta lineal que relaciona x e yy = bx + a

Donde

Pendiente/ sensibilidad instrumental

Ordenada en el origen

Ejemplo

La recta pasa necesariamente por (, )Centro de gravedad de la calibración




Recordad condición 1, el error en la preparación de patrones es despreciable (< 0,1%) respecto a la dispersión de la señal (2-3%)

Utilicemos los cuadrados de los residuos para hallar una medida de los errores aleatorios en la ordenada (señal)

Parecida a la desviación estándar de medidas repetidas de una distribución gaussiana excepto que ahora trabajamos con una recta (n-2)




Ahora podemos hallar los errores y límites de confianza de la pendiente y de la ordenada en el origen

Desviación estándar de la pendiente Desviación estándar de la ordenada en el origen

Intervalo de confianza de la pendiente

b ± t(n-2) sb

Intervalo de confianza de la ordenada en el origen

a ± t(n-2) sa

Para n-2 grados de libertad y la confianza/probabilidad deseada (preferiblemente al 95%)




Tenemos la relación lineal entre concentraciones y señal del instrumento

Analicemos una muestra de concentración desconocida

¿ Cual será el error de la medida de concentración interpolada?

Depende de la precisión de la señal instrumental (recuerda que era apreciable)Depende de la incertidumbre/error de la calibración efectuada (sb y sa)Expresión del error global muy compleja !!!




Se utiliza una expresión aproximada

Siendo y0 valor de la señal experimental de la muestran Nº de patrones utilizados en calibraciónxi Concentraciones de patrones de calibración

Que se puede transformar en

Siendo m Repeticiones de la medida de la muestra

Si realizamos más de una medida de la muestra

Intervalo de confianza de la concentración interpolada (x0)

x0 ± t(n-2) sx0

Para n-2 grados de libertad y la confianza/probabilidad deseada (preferiblemente al 95%)




Tiende a 0 cuando la señal se encuentra en la zona central de la calibración

Se minimiza sx0

Se minimiza los errores y la incertidumbre

x0 ± t(n-2) sx0

Los menores errores en el centro de la calibración




Interesa seleccionar bien cual es el rango de concentración que queremos cubrir antes de calibrar

Zona central calibración = Rango de concentración esperado de las muestras

x0 ± t(n-2) sx0 mínimo Medida con bajo error asociado

x0 ± t(n-2) sx0 máximo Medida con alto error asociado




¿Como se calculan?




Definición

“Aquella concentración de analito que proporciona una señal en el instrumento significativamente diferente de la señal de ruido de fondo o señal de un blanco”

¿Donde situar la frontera entre ruido y señal de analito?

Definición abierta a interpretación

Situémoslo en Lc para α (p.e. 0,05) distribución normal de la señal de ruido o blanco (yb) Imaginemos que son 2 ppb

Cualquier señal que de una concentración > 2 ppm se debe al analito y no a ruido

Podemos cometer error !!! Hay ocasiones (α) en las que damos por señal de analito lo que es ruido




Estamos diciendo que nuestro técnica ve a partir de 2 ppb pero…

¿Qué pasa con los valores de señal y concentración < 2 ppb que se deben a analito?

Erróneamente decimos que es ruido cuando es señal de analito

No podemos definir LOD de esta forma, demasiado error




Debemos aumentar el límite de detección para tener menos errores α y β

Si distancia LD – YB = 3 Sblanco Se demuestra que los errores α y β < 7%Error razonable que es asumible

σ0 = σD Recuerda !!! que s es igual en todo el rango de concentración calibradoHOMOCEDASTICIDAD




Hemos definido LOD

YLOD = YB + 3 SBlanco

También se utiliza LOQ

YLOQ = YB + 10 SBlanco

El criterio de utilización es puramente arbitrario, pero hay que indicar el

método utilizado

Interpolar en recta calibrado para averiguar

concentraciones LOD o LOQ




Recuerda!!! HOMOCEDASTICIDAD de residuos

Obtención del valor de YBlanco

Podemos tomar el valor a (ordenada en el origen) de la calibración

Podemos pasar 10 veces un disolución blanco y realizar promedio de señal

Obtención del valor de SBlanco

S es igual en todo el rango de concentración calibrado

Podemos tomar S Blanco = S y/x de los puntos de calibración

Podemos realizar la S de las 10 medidas de señal de blanco




Interpolar en recta calibrado para

averiguar concentraciones

LOD o LOQ




La adición de patrón es apropiada cuando la composición de la muestra es desconocida o compleja y afecta a la señal analítica

No siempre podemos aislar el analito de interés del resto de componentes que lo

acompañan en la muestra

¿Influirán en la señal del analito?

ICP




¿Influirán en la señal del analito?

La respuesta es posiblemente sí

En función deTécnica analítica empleadaNaturaleza de componentes que acompañanConcentración de estos componentes

pueden influir en la señal del analito:

Interfiriendo directamente la señal de analito

Inhibiendo/activando el proceso fisico-químico que produce la señal




Si realizamos calibración con disoluciones puras de Zn (II) en agua destilada estaríamos cometiendo un error ya que la relación Señal/concentración Zn(II) nada tiene que ver el de las muestras reales (interferidas por Na+)

Queremos analizar Zn en agua de marAlrededor de 11000 ppm Na+

SoluciónReproduzcamos lo mejor posible

condiciones de salinidad de muestras añadiendo 11000 ppm de Na+ a cada patrón




Ahora queremos analizar Zn en agua de ría¿ppm Na+?

En función de las mareas y entrada de agua de mar a la ríaRango desde unos pocos ppm hasta 11000 ppm

SoluciónMétodo de adición de patrón

No podemos realizar unas condiciones de calibración que reproduzca el número infinito de posibilidades de concentración en Na+ en

muestras a distinta salinidad

No podemos realizar unas condiciones de calibración que reproduzca el número infinito de posibilidades de concentración en Na+ en

muestras a distinta salinidad




¿En que consiste?

Adición de cantidades conocidas (excepto a una) de concentración de analito de interés a volúmenes iguales de la muestra a analizar

¿Concentración en Zn de la muestra analizada?

Extrapolar




ExtrapolaciónSxE algo diferente a la expresión para una calibración normal por interpolación

¿Cómo mejorar la precisión?

Aumentando en número de adiciones n (al menos n=6)

Maximizando (xi- )2, Deben cubrir un intervalo suficientemente grande

Si No

Intervalo de confianza de la concentración extrapolada (xE)

xE ± t(n-2) sxE




Cantidad de muestra disponible grande

Cada muestra requiere su propia gráfica de calibración

La extrapolación es menos precisa que interpolación

¿Cómo comprobar si existe efecto matriz y si debemos realizar adición patrón?

Se representa calibración normal (disoluciones de analito puro) y adición de patrón sobre una muestraNo hay efecto matrizPendientes iguales (líneas paralelas)Hay efecto matrizPendientes desiguales

Desventajas de adición de patrón




Útil para la calibración de impurezas de disolvente orgánico

Cromatografía de gases (GC)

Queremos calibrar las impureza DAA y otras de la acetona

Utilizamos patrones en acetona (idéntica matriz que muestras) añadiendo

concentraciones conocidas de DAA y demás impurezas

ProblemaNo existe una acetona perfectamente pura, siempre tiene DAA y demás impurezas




Obtendremos una curva de calibración similar a las de adición de patrón (igual para resto de impurezas)DAA

En este tipo de casos no hay mayor efecto matriz una vez los patrones se preparan en el propio disolvente

Misma pendiente de respuesta que si la acetona para preparar patrones de calibración fuera totalmente pura

Se le descuenta la señal en el origen que pertenece a la concentración de DAA que lleva la acetona con la que se prepararon los patrones

DAA

y = a + bx

y = bx

Nos quedamos con el factor de respuesta

instrumental respecto a la DAA




HeterocedásticoLa desviación estándar aumenta con la concentración

Los puntos de calibración a baja concentración son más de fiar que los de alta

Debemos darle más peso en la calibraciónPONDERAR

¿Como lo haremos?Aplicando un factor de peso inversamente proporcional a desviación estándar de cada punto

Necesitamos más información (s en cada punto)

Cálculos más complicados




¿Como cambian las parámetros de recta de calibración?

Siendo ahora los valores del centro de gravedad

¿Y el error de concentración en la interpolación sobre la recta de calibración?

En la dirección y En la concentración tras interpolación




Los valores de centro gravedad en calibración ponderada más próximos a valores bajos

(w, w)

En la práctica para simular el efecto de ponderación en regresiones no ponderadas se suelen utilizar concentraciones que no varían de forma uniforme forzando la recta a ajustarse a valores bajos de concentración




¿Qué es un patrón interno?

Compuesto que no pertenece ningún componente de la muestra a analizar que se añade siempre en la misma cantidad a todas los patrones y muestras a analizar

Patrón Interno

+ 10 ppm P.I.

¿Para qué?Para corregir la fluctuación de señal de respuesta del equipo, especialmente en aquellas técnicas con un Sy/x alto

Errores aleatorios de detectorErrores de caudal de líquidos/gases portadoresErrores aleatorios de control de parámetros de

equipoFluctuaciones de tensión eléctrica, etc.




¿Cómo?

El P.I. se añade siempre en la misma cantidad, debe dar siempre misma señal YLas variaciones de Y del P.I. serán las mismas que sufran las de nuestros analitosCon esta información se realiza corrección

¿Mala calibración debido a la mala precisión de la señal del equipo?

Añadamos P.I. a cada patrón de calibración

ppm analito

Área pico




Área pico Analito / Área P.I.

ppm analito

Se divide el área de pico del analito por el área de pico del P.I. cancelándose mutuamente las fluctuaciones del equipo en un nuevo índice “libre” de ellas

La precisión de la calibración mejora enormemente

Se procede igual para muestras (añadiendo la misma cantidad de P.I.), ahora la señal de interpolación será

Área analito muestra/ Área P.I.

+ 10 ppm P.I.




Requisitos patrón interno

No debe ser un componente de la muestra

Zona de señal libre de interferencias de los componentes de la muestra

Con características fisico-químicas similares a los analitos que se analizanDeben sufrir con la misma intensidad las fluctuaciones de señal del equipoEn ocasiones se utilizan más de 1 patrón interno para cubrir distintas zonas del espectro o cromatograma

No reactivos con ninguno de los componentes de la muestra

Estables

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