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TEMA 3. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS

Tema 3. REACCIONES INMUNOLÓGICAS Y TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS

Concepto de antígeno y anticuerpo

Reacciones antígeno-anticuerpo

Técnicas inmunoquímicas:

- El anticuerpo como reactivo: reactivos policlonalesreactivos monoclonales

- Título, Afinidad y Especificidad del anticuerpo como reactivo- Reactividad cruzada- El antígeno como variable analítica

Fases de la reacción antígeno-anticuerpo

- Primera fase- Segunda fase o fase indicadora: Inmunoprecipitación

InmunoelectroforesisInmunonefelometríaInmunoanálisis con indicadores marcados

Ensayos de unión competitiva

TEMA 3. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICASCONCEPTO DE ANTIGENO Y ANTICUERPO

ANTÍGENO: Sustancia que induce una respuesta inmune. La respuesta inmunepuede ser un anticuerpo (respuesta humoral) o la generación de células sensibilizadas (respuesta celular).Los HAPTENOS son antígenos incompletos que no producen una respuesta inmune por sí solos, pero sí reaccionan con anticuerpos.El DETERMINANTE ANTIGÉNICO es la porción de antígeno que interviene en la reacción con un anticuerpo.ANTICUERPO: Proteína que se combina específicamente con un antígeno


REACCIONES ANTÍGENO-ANTICUERPO

Afinidad del anticuerpo: Fuerza de unión de un anticuerpo con un único determinante antigénico.

Es función de la suma de fuerzas intermoleculares, no covalentes y de corto alcance (fuerzas electrostáticas, uniones de H2, fuerzas de Van der Waals e interacciones hidrofóbicas.

La unión antígeno-anticuerpo es una reacción reversible:K1

Ag + Ac ↔ Ag.AcK2

[Ag.Ac] K1------------------ = ------ = Ka (cte de asociación)[Ag] [Ac] K2


REACCIONES DE PRECIPITACIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO

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TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS

El anticuerpo como reactivo: reactivos policlonalesreactivos monoclonales

- Título: cantidad de anticuerpo disponible para su reacción en un métodoinmunológico específico. Es la máxima dilución de anticuerpo que da una reacción detectable para un método específico y varía con el procedimiento inmunológico.

- Afinidad: fuerza de unión de un anticuerpo con el antígeno en una reacción antígeno-anticuerpo.

- Especificidad: designa la capacidad del anticuerpo para restringir su reacción a un grupo específicamente definido de moléculas.

- Reactividad cruzada: reacción residual entre el reactivo-anticuerpo y un antígeno no superfluo estrechamente relacionado

El antígeno como variable analítica


FASES DE LA REACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO

- Primera fase

- Segunda fase o fase indicadora:

. Inmunoprecipitación

. Inmunoelectroforesis

. Inmunonefelometría

. Inmunoanálisis con indicadores marcados:

marcadores radiactivos, enzimáticos y fluorescentes


INMUNOELECTROFORESIS


INMUNOELECTROFORESIS

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INMUNOELECTROFORESIS “ROCKET” DE LAURELL


INMUNOELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL


CONTRAINMUNOELECTROFORESIS


INMUNOANALISIS CON INDICADORES MARCADOS

NO COMPETITIVOS. TIPO SANDWICH.

marcadores radiactivos, enzimáticos y fluorescentes*

+ Ag

Ag

Ag **

*Ag

Ag

*

Ag Antígeno (variable analítica)

Anticuerpo unido a una superficie sólida

Anticuerpo marcado [Ag]

Res

pues

ta *

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ENSAYOS DE UNIÓN COMPETITIVA

Métodos analíticos in vitro basados en la unión reversible, no covalente, de una molécula pequeña o ligando con una proteína de unión específica

proteína de unión + ligando ↔ proteína de unión : ligando

anticuerpo-reactivo antígeno (hapteno)

variable analíticaHapteno: molécula pequeña que no puede por sí sola provocar una respuesta inmune, pero puede generar anticuerpos cuando se acopla con moléculas grandes.Suposiciones ideales:

Anticuerpos y Antígenos son homogéneos y su interacción reversible alcanzará el equilibrioEl marcador del antígeno no interfiere en la interacción antígeno-anticuerpoSólo se pueden formar complejos 1:1Los complejos formados se pueden separar físicamente del antígeno libre marcado



Ac + L* + L ↔ AcL + Ac L*

Ac+

L* + L

AcL* + AcL

(50%) (50%)

L* (50%)

Ac+

L* + 2L

AcL* + AcL

(33%) (66%)

L* (66%)

Ac+

L* + 3L

AcL* + AcL

(25%) (75%)

L* (75%)

Ac+

L* + 4 L

AcL* + AcL

(20%) (80%)

L* (80%)

Ac+L*

AcL*

(100%)

L

AcL*

L

L*

CURVA DOSIS-RESPUESTA

Ac = anticuerpoL = Ligando (antígeno)L*= Ligando marcado



Marcadores radiactivos: las marcas radioisotópicas sólo pueden utilizarse en sistemas de inmunoanálisis heterogéneo. El radioisótopo debe acoplarse fácilmente al ligando y su emisión debe ser fácil de detectar. Ejemplos: 125I, 57Co, 14C, titrio.

Enzimas: deben poseer una elevada actividad específica y debe acoplarse fácilmente al ligando sin que haya pérdida significativa de su actividad. Ejemplos: peroxidasa, fosfatasa alcalina, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucosa oxidasa.

Marcadores fluorescentes: pueden unirse al ligando y seguir emitiendo fluorescencia con un mayor grado de eficiencia. Es útil que las λ de excitación y emisión estén bien separadas. Ejemplos: ac. 1-anilino-8-naftalensulfónico, ac. dimetilamino-naftalensulfónico, fluoresceína, rodamina, umbeliferona.

Ensayos heterogéneos: requieren que el ligando marcado unido al anticuerpo (AcL*) sea separado físicamente del ligando marcado libre (L*)

Ensayos homogéneos: no requieren separación física del ligando marcado unido al anticuerpo (AcL*)y el ligando marcado libre (L*)


MARCADORES RADIACTIVOS. RADIOINMUNOANÁLISIS (RIA)

[Ligando]

AcL*

L*

[Ligando]HETEROGÉNEO

Ac + L + L ↔ Ac-L 125I 125IAcL

AcL

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MARCADORES RADIACTIVOS. ENSAYOS INMUNORADIOMÉTRICOS (IRMA)

AcL*

HETEROGÉNEO125I

L + L + Ac ↔ L-Ac + L-Ac125I


MARCADORES ENZIMÁTICOS. ENZIMOINMUNOANÁLISIS CON INMUNOADSORBENTES (ELISA)

HETEROGÉNEO

Ac + L + L ↔ Ac-L

S P

Ac-L

Ac-L


MARCADORES ENZIMÁTICOS. ELISA INMUNOMÉTRICO

L + L + Ac ↔ L-Ac + L-Ac

S P

HETEROGÉNEO


MARCADORES ENZIMÁTICOS. ENZIMOINMUNOANÁLISIS HOMOGENEO (EMIT)

HOMOGÉNEO

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MARCADORES FLUORESCENTES. FLUOROINMUNOANÁLISIS CON SUSTRATO MARCADO (SLFIA)

HOMOGÉNEO


MARCADORES FLUORESCENTES. FLUOROINMUNOANÁLISIS DE POLARIZACIÓN (FPIA)

HOMOGÉNEO


CARACTERÍSTICAS DE LOS ENSAYOS DE UNIÓN COMPETITIVA

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