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Explicación de TP Nº 1-2017
Técnicas de biología molecular
utilizadas en el diagnóstico de
enfermedades hereditarias
Química Biológica Patológica
Conceptos básicos en genética:
Gen
Alelo
Haplotipo
Locus (loci)
Mutación
Genotipo
Fenotipo
Natural, común o salvaje.
Alelos variantes o mutantes.
Desórdenes genéticos
Cromosómicos.
Monogénicos o mendelianos.
Multifactoriales.
Conceptos básicos en genética:
Desórdenes monogénicos:
Homocigotas
Heterocigotas
Heterocigotas compuestos
Formas de herencia de los trastornos monogénicos:
Autosómica. Ligada al cromosoma X.
El gen afectado selocaliza en un autosoma.En general, estostrastornos afectan porigual a hombres ymujeres.
El gen afectado se localiza enel cromosoma X.La incidencia en hombres ymujeres es diferente,dependiendo de si es deherencia recesiva odominante.
Un trastorno monogénico es aquel que está determinado principalmente por los alelos localizados en un único locus.
Mutaciones:
“Cualquier cambio en la secuencia de un nucleótido o en la organización del DNA”
Genómicas
Cromosómicas
Génicas
Mutaciones
“No todas las mutaciones tienen consecuencias
clínicas”
Tipos de mutaciones génicas:
Deleciones e
inserciones
Pequeñas (pueden producircorrimiento del marco delectura).
Grandes (afectan la estructuragénica).
Deleciones e inserciones grandes:
Sustituciones de nucleótidos
(puntuales)
Mutaciones de cambio de sentido
Mutaciones sin sentido
Tipos de mutaciones génicas:
Mutaciones del procesamiento de ARN
Mutaciones de cambio de sentido (missense) y sin sentido(nonsense):
Polimorfismos:
Son aquellas variantes alélicas tan comunes que se encuentran en una frecuencia mayor al 1% en la
población general.
Aplicaciones: ForensesFiliaciónMedicina
Tipos de polimorfismos:
SNPs, Inserción-Deleción (STR, VNTR), RFLP
Tipos de polimorfismos: de longitud de los
fragmentos de restricción (RFLP).
Se deben a cambios en la secuencia del DNA que modifican los patrones de corte de las endonucleasas
de restricción.
Han sido muy utilizados como
marcadores genéticos, es decir para determinar la presencia/ausencia
de una enfermedad/alelo
mutado en individuos .
Conceptos básicos en biología molecular:
Endonucleasas de
restricción
Electroforesis
Sonda
Hibridación
Endonucleasas de restricción:
Son enzimas que cortan la molécula de DNA doble cadena(dsDNA) en lugares definidos por la secuencia de nucleótidos,produciendo fragmentos de DNA definidos.
Endonucleasas de restricción:
Cuando se somete un fragmento de DNA a restricción con unaendonucleasa, esta genera fragmentos definidos, quedependen del patrón de corte de la enzima.
Separación de ácidos nucleicos mediante
electroforesis en gel:
Geles de poliacrilamida
� Alta resolución.� Separan fragmentos de DNA
<500pb.
Geles de agarosa
� Baja resolución.� Separan fragmentos de DNA
de entre 300 a 10000pb.
Sondas de ácidos nucleicos:
Molécula de DNA o RNA marcada, usada para identificar secuencias complementarias mediante
hibridación.
Marcación de sondas
Interna
Externa
Radiactiva
No radiactiva
Hibridación de ácidos nucleicos:
Las hebrascomplementarias deácidos nucleicospueden separarse(desnaturalización) ydadas las condicionesadecuadas pueden reasociarse(hibridación).
Hibridación de ácidos nucleicos:
Factores que afectan la velocidad y especificidad de hibridación:
� Longitud del acido nucleico.� Composición de base.
� Fuerza iónica.� Viscosidad.� Temperatura
� Presencia de agentes desnaturalizantes.� pH
Hibridación con sondas de ácidos nucleicos:
Las reacciones de hibridación con sondas de DNA son tansensibles y selectivas que pueden usarse para detectarsecuencias complementarias cuya concentración sea inclusode 1 sola molécula por célula.
Hibridación:
Rigurosa (bajo condiciones astringentes).
Poco rigurosa (bajo condiciones no astringentes).
Longitud de una sonda:
Desde 5 hasta miles de nucleótidos
Métodos de análisis de ácidos nucleicos
que utilizan sondas.
Transferencia Southern
Transferencia Northern
PCR-ASO (Dot/Slot-Blot)
Análisis de DNA.
Análisis de RNA.
Revelado mediante sondas ASO.
GRANDES DELECIONES
• Southern blot
• PCR Multiplex• GAP-PCR• MLPA
MUTACIONES PUNTUALES Y DELECIONES PEQUEÑAS
• PCR-RFLP (PCR-ER)
• Mutagénesis mediada por PCR
Alelo-Específicas:• PCR-MAS• PCR-ARMS/MARMS• PCR-ASO
Plataformas:
• PCR-OLA
MUTACION O POLIMORFISMO DESCONOCIDO
(Métodos de barrido)
• PCR-SSCP y secuenciación• PCR-DGGE y secuenciación
Técnicas de biología molecular según la
mutación a detectar
Grandes deleciones:
Transferencia Southern
Se utiliza para analizar fragmentos de DNA
generados por digestión con enzimas de
restricción.
1. Extracción de ADN
2. Digestión con la Enzima de
Restricción apropiada
3. Separación de los
fragmentos por
electroforesis,
desnaturalización del ADN y
transferencia a membrana
(Southern Blotting)
4. Hibridación con la sonda
especifica y revelado.
5. Análisis de los resultados
Transferencia Southern:
Principales usos:
� Detección de secuenciasrelacionadas ( ej. familias de genes).
� Detección de deleciones einserciones grandes causantes deenfermedades (ej. Distrofiamuscular de Duchenne).
� Identificación de individuosmediante VNTR.
� Detección de RFLP.
Se utilizan sondas de gran tamaño, con grados de actividad variable, dependiendo del uso.
Tipos de polimorfismos: de longitud de los
fragmentos de restricción (RFLP).
Se deben a cambios en la secuencia del ADN que modifican los patrones de corte de las endonucleasas
de restricción.
Han sido muy utilizados como marcadores genéticos, es decir para determinar la presencia/ausencia de una
enfermedad/alelo mutado en individuos .
RFLP: detección mediante Southern Blotting
Utiliza una sonda que hibrida en una región conocida, pero no tienerelación con la mutación que produce el trastorno.De gran utilidad cuando no se conoce la mutación que produce eltrastorno.Permite el seguimiento de alelos mutados dentro de una misma familia.Para su utilización, el polimorfismo y el gen a estudiar deben estarligados (separados por una distancia no mayor a 106 pb).
RFLP
Mutaciones puntuales:
PCR-RFLP (PCR-ER)
• Más simple yeconómico que el RFLPtradicional.• Se requiere mayorinformación de la zonadonde ocurre lamutación.• Generalmente es lamutación que genera eltrastorno la que da lugaral polimorfismo.
RFLP
RFLP: PCR-RFLP
1. Extracción de ADN
2. Amplificación por PCR
3. Digestión con la Enzima de
Restricción apropiada
4. Separación de los fragmentos
por electroforesis y
visualización de los resultados
(Tinción con Gel Red)
Mutaciones puntuales:
PCR-ASO: Dot Blot
Se utiliza para detección de mutaciones puntuales,principalmente aquellas que no modifican el patrón derestricción de una secuencia de nucleótidos.
Revelado: Sondas ASO
Condiciones de hibridación de elevada astringencia.
Consiste en el análisis de mutacionespuntuales utilizando la hibridación desondas ASO. Se basa en el principio de quela presencia de UN SOLO ERROR DEAPAREAMIENTO entre un nucleótido de lasonda y el ADN blanco es suficiente paradesestabilizar el híbrido.
Se trata de una de las primeras técnicasutilizadas para el análisis de mutacionespuntuales CONOCIDAS sobre fragmentosamplificados de ADN.
PCR-ASO
2. Dot Blot: desnaturalización y transferencia de los productos
amplificados a una membrana.El producto de PCR se
desnaturaliza (NaOH
2N y 95 °C). Se añade
a los pocillos donde
el vacío impulsa el
pasaje de la solución
a través de la
membrana (nylon o
nitrocelulosa).
La membrana se seca
entre filtros durante
una hora a 80° C en
estufa (o por cross –
linker).
PCR-ASO (PCR-Sondas Alelo Específicas)
3. Hibridación de las sondas ASO marcadas, específicas y
complementarias para la secuencia de interés.
Pre-hibridación: solución de SDS y ADN de
esperma de salmón desnaturalizado.
Bloquea la membrana para evitar
reacciones inespecíficas (2h a 37°C).
Hibridación: sonda normal y mutada (8h
a 37°C).
PCR-ASO (PCR-Sondas Alelo Específicas)
4. Revelado: dependiente de la marcación utilizada.
Interpretación e informe:
Individuo 1: +/- : Heterocigota para la mutación.
Individuo 2:-/- : No presenta la mutación.
Individuo 3:+/+: Homocigota para la mutación.
Individuo 4:+/- : Heterocigota para la mutación.
Individuo 5:-/- : No presenta la mutación.
Individuo 6:+/+: Homocigota para la mutación.
Individuo 7:-/- : No presenta la mutación.
Individuo 8:+/+: Homocigota para la mutación.
5. Interpretación e informe.
PCR-ASO (PCR-Sondas Alelo Específicas)
PCR-OLA (PCR-Ensayo de Ligamiento de
Sondas)
1. Amplificación por PCR del fragmento de interés.
2. Desnaturalización del producto de PCR doble cadena.
3.Hibridación de las sondas marcadas (sondas alelo específicas
marcadas con biotina y sonda común marcada con fluoresceína)
PCR-OLA (PCR-Ensayo de Ligamiento de
Sondas)
Estreptavidina
tapizando los wells
Sonda capturada
Ac acoplado a la
enzima+ sustrato
WT M
GRANDES DELECIONES
• Southern blot
• PCR Multiplex• GAP-PCR• MLPA
MUTACIONES PUNTUALES Y DELECIONES PEQUEÑAS
• PCR-RFLP (PCR-ER)
• Mutagénesis mediada por PCR
Alelo-Específicas:• PCR-MAS• PCR-ARMS/MARMS• PCR-ASO
Plataformas:
• PCR-OLA
MUTACION O POLIMORFISMO DESCONOCIDO
(Métodos de barrido)
• PCR-SSCP y secuenciación• PCR-DGGE y secuenciación
Técnicas de biología molecular según la
mutación a detectar