técnicas de aislamiento mantenimiento y preservación de cultivos puros
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Técnicas de aislamiento Mantenimiento y preservación de cultivos puros
El cultivo puro representa las condiciones artificiales para el desarrollo de las bacterias y otros microorganismos y las condiciones impuestas a los microorganismos mediante el manejo del laboratorio.
Para determinar las características de especies concretas de microorganismos, es imperativo que el organismo se aislé y se desarrolle en el laboratorio como un cultivo libre de otras especies.
¿Qué condiciones requiere el crecimiento microbiano?medio de cultivo: Una solución acuosa con los nutrientes y factores de crecimiento necesarios.
Los μorganismos crecen en unmedio de cultivo artificial se requieren condiciones como:temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno asi como un grado correcto de acidez o alcalinidad
.
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Según su estado físico LíquidosUsualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientesdisueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevadonúmero de microorganismos. Ej. Caldo nutritivo. SólidosSe pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se lesañaden agentes solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Seutilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de losmicroorganismos en el laboratorio. Ej. Agar nutritivo.
Según la naturaleza de sus constituyentes
Medios naturales o complejos (Indefinidos) Están constituidos por sustancias complejas de origen
animal o vegetal y usualmente se complementan con el añadido de minerales y otras sustancias. No se conocen todos los componentes del medio de cultivo, ni las cantidades exactas en que están presentes.
Ej. Extracto de carne, extracto de levaduras.
Medios sintéticos (químicamente definidos) Se preparan a partir de ingredientes químicamente puros y
por lo tanto, Se puede conocer exactamente su composición cuali y
cuantitativa. Por su costo sólo se emplean en procedimientos
especiales.
E. coli
Medio definido Medio Complejo
K2HPO4 7 g Glucosa 15 g
KH2PO4 2 g Extracto de levadura
5 g
(NH4)2SO4 1 g Peptona 5 g
MgSO4 0.1 g K2HPO4 2 g
CaCl2 0.02 g Agua destilada 1000 ml
Glucosa 4-10 g pH 7
Elementos traza (Fe, Co, Mn, Zn, Cu, Ni, Mo)
2-10 µg
Agua destilada 1000 ml
pH 7
3. Según sus propósitos de uso
Medios de enriquecimiento Al cultivo en medio líquido que resulte en un
incremento en el número de un tipo dado de μorganismo en relación con el número de otros tipos de μorganismos que puedan estar en el inoculo.
Puede contener sustancias que favorezcan el crecimiento del μorganismo que nos interesa o que inhiban el crecimiento de los otros tipos de microorganismos presentes.
La selectividad de un cultivo de enriquecimiento no está determinada únicamente por la composición química, sino que puede ser variada significativamente modificando otros factores tales como: temperatura, pH, fuerza iónica, iluminación, aireación etc.
Adición de sangre, suero o extracto de tejidos de animales y plantas.
Medios selectivos Se diferencian de los enriquecidos por ser medios
sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.
Ej. CO2 como fuente de carbono es selectivo para autótrofos, la adición de cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram+, utilizando maltosa como única fuente solo crecerán los que usen maltosa.
Ej. Caldo tetrationato utilizado para el enriquecimiento de las especies del género Salmonella provenientes de muestras de heces, orina, agua o alimentos
Medios diferenciales Son aquellos destinados a facilitar la
discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios.
contienen indicadores de productos derivados de la actividad metabólica de los μorganismos sobre algunos de los componentes del medio.
Ej.: Agar base rojo fenol utilizado para detectar fermentación de carbohidratos.
Medio de cultivo Tipo de medio Agente bacteriostático
Azúcar fermentable
Sistema Indicador
ALRF (agar lactosa rojo fenol)
diferencial (no selectivo)
----- lactosa rojo fenol
Agar Cetrimide selectivo bromuro de cetiltrimetil amonio
------- --------
Agar Mac Conkey
selectivo y diferencial
cristal violeta, sales biliares
lactosa rojo neutro
SS agar (Salmonella Shigella)
selectivo y diferencial
verde brillante, sales biliares
lactosa rojo neutro, citrato férrico
VRBA (violeta rojo bilis agar)
selectivo y diferencial
cristal violeta, sales biliares
lactosa rojo neutro
Manitol Salt Agar (Chapman)
selectivo y diferencial
cloruro de sodio manitol rojo fenol
EMB agar (eosin methylen blue)
selectivo y diferencial
eosina y azul de metileno
lactosa eosina y azul de metileno
XLD agar (xilosa lisina desoxicolato)
selectivo y diferencial
desoxicolato de sodio
lactosa, xilosa, sacarosa
rojo fenol, citrato férrico amónico y tiosulfato de sodio
BiS agar (bismuto sulfito)
selectivo y diferencial
verde brillante, sulfito de bismuto
glucosa indicador de sulfito de Bi y sulfato ferroso
Baird Parker agar selectivo y diferencial
Cloruro de litio y telurito de potasio
------ yema de huevo, telurito de potasio
TSB + 10% NaCl enriquecimiento selectivo
cloruro de sodio ------ -------
Caldo Tetrationato
enriquecimiento selectivo
Tetrationato, sales biliares
------ ------
CLBVB (caldo lactosa bilis verde brillante)
enriquecimiento selectivo
verde brillante, sales biliares
lactosa producción de gas
Medios de mantenimientoSuelen ser distintos a los de crecimiento
óptimo ya que el crecimiento y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células.
Ej. Añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos, acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento
• Métodos especiales de cultivoSiembra en superficie sobre medio sólidoSiembra en profundidad (vertido en placa)Dilución y solidificación en tuboCultivo en células vivasCultivo en animales Mycobacterium leprae
Importancia del cultivo de microorganismos:
•Obtención de cultivos puros.
•Análisis morfológico, fisiológico, genético y otras características.
•Producción.
•Conteo de colonias (UFC)
Siembra por estrías
Dilución en serie
Técnica de las diluciones en serie
Dilución Tipo de microorganismo
10-1 a 10-3 Hongos
10-4 a 10-6 Levaduras
10-7 a 10-10 Bacterias
Para el aislamiento de microorganismos se puede aplicar la técnica de aislamiento por estría o por extensión en superficie (se trasfiere de 0.1 a 0.5 ml.)
Mantenimiento y preservación de cultivos puros.
- Resiembra periódica en medios frescos. Depende de el medio de cultivo Temperatura propia para mantener los
cultivos El tiempo de resiembra.
- Preservación de cultivos con una capa de aceite mineral. Para cultivos en agar inclinado el aceite
deberá cubrir mas o menos 1.5 cm. Del pico de flauta del agar inclinado.
Mantenimiento y preservación de cultivos puros.
- Liofilización. Proceso utilizado para la eliminación de agua, mediante desecación al vacío y a muy bajas temperaturas.
- Almacenamiento a temperaturas
muy bajas en presencia de agentes estabilizantes como glicerol, dimetilsulfóxido, nitrógeno líquido (-196ºC)
CONTROL MICROBIANO
MÉTODOS DE CONTROL
Son técnicas para destruir microorganismos y se dirige hacia la destrucción completa de cualquier área donde puedan hacer daño.
MÉTODOS FÍSICOS Y MÉTODOS
QUÍMICOS
ESTERILIZACIÓN MEDIANTE PRINCIPIOS FÍSICOS
TEMPERATURA: Influyen directamente sobre el metabolismo celular, las proteínas se desnaturalizan al romperse los enlaces de H y S en sus estructuras secundarias y terciarias, bajo estas circunstancias se pierden las actividades funcionales de dichas proteínas como la funcionalidad enzimática .
Mesofílicas: 25ºC – 37ºC
Psicrofílicas: 4ºC – 10ºC
Termofílicas: 80ºC
Clostridium botulinum
endosporas
Clostridium tetani
La aplicación de calor representa uno de los mecanismos más importantes para producir esterilidad.
El ambiente es un factor importante para la destrucción de μorganismos, el calor debe alcanzar al μorganismos. Calor Húmedo: 1.- Desnaturalización de proteínas
2.- Oxidación de proteínas Calor Seco: 1.- desnaturalización de proteínas
2.- Daño oxidativo
3.- Efecto tóxico por alta concentración de
electrolitos.
Efecto del calor
Daño en el inicio de la síntesis de proteínas.
Salida de aa y de iones K+ Autodegradación de ácidos nucleicos Daño en la membrana celular afectando
el paso de solutos al interior y la salida de estos.
Daño en la respiración, el mecanismo reside en la membrana.
Métodos por CALOR SECO: estufas de aire caliente. Estas constan de
una doble cámara, el aire caliente generado por una resistencia eléctrica circula por la cavidad principal y por el espacio entre ambas cámaras, a temperaturas variables, entre 180ºC – 250ºC, ciclos de 1-2 h.
Indicador Biológico: B. Subtilis var. Niger
Tipo de material:• Instrumental quirúrgico (metálico)• Material de vidrio, porcelana y metal• Polvos termoestables• Grasas, aceites, parafinas, ceras....
Llama directa Consiste en colocar el material
directamente al fuego hasta que éste se ponga al rojo vivo. De esta forma se queman los contaminantes hasta reducirlos a cenizas.
microbiología para esterilizar el asa con la llama del mechero..
IncineraciónEl material a esterilizar se coloca en cámaras
especiales que alcanzan elevadas temperaturas. Con este método se queman los contaminantes hasta reducirlos a cenizas.
Es una forma efectiva de esterilizar el material contaminado a descartar tales como
bolsas, papel, uniformes desechables, cadáveres de animales,
CALOR HÚMEDO – Elementos autoclave El vapor bajo presión
es el agente de esterilización más eficiente confinamiento de vapor en un recipiente cerrado, la presión se eleva y la temperatura aumenta en forma correspondiente. Con una presión de 1.05 Kg/cm3, la temepartura del vapor alcanza 121ºC, con una atmósfera libre de aire.
Elementos del autoclave: • Sistemas control de presión y válvulas seguridad• Llave de purga para eliminar el aireIndicador Biológico: Bacillus sterothermophillus
Ventajas Rápido calentamiento y penetración Destrucción de bacterias y esporas en
corto tiempo No deja residuos tóxicos Hay un bajo deterioro del material
expuesto Económico Desventajas No permite esterilizar soluciones que
formen emulsiones con el agua Es corrosivo sobre ciertos instrumentos
metálicos
Agua en ebullición. El efecto letal aumentará si se le
adiciona carbonato de sodio al 2% o detergentes, las esporas que son resistentes al agua en ebullición x + de 2 h, pueden morir a 98ºC en 10 a 30 min. En sol. De carbonato de sodio al 2%.
PASTEURIZACIÓN
Pasteurización Lenta: 62.9ºC por 30 min., seguido de un enfriamiento rápido a 4ºC.
Pasteurización Rápida: 71.6ºC – 80ºC durante 15 segundos y rápidamente refrigerarla.
Ultrapasteurización: 100 ºC durante fracciones de segundos procediendo a la inmediata refrigeración.
Principales μorganismos patógenos que provocan tuberculosis, brucelosis, fiebre de tifoidea, difteria, escarlatina y la fiebre Q, como la mayor parte de los μorganismos que provocan que la leche se agrie.
Tyndalización: Esterilización por acción discontinua del vapor de agua,
se basa en el principio de Tyndall.
Las bacterias que resisten una sesión de calefacción, hecha en determinadas condiciones, pueden ser destruidas cuando la misma operación se repite con intervalos separados y en varias sesiones.
Se efectúa por medio del autoclave de Chamberland, dejando abierta la válvula de escape, o sea funcionando a la presión normal. Puede también realizarse a temperaturas más bajas, 56º u 80º para evitar la descomposición de las sustancias a esterilizar, por las temperaturas elevadas.
FILTRACIÓN
Este procedimiento es aplicable a la esterilización de líquidos y gases, especialmente los primeros. Cuando el líquido a filtrar no puede resistir, sin descomponerse , la acción del calor, se aplica la técnica de filtración, la que puede efectuarse mediante presión o aspiración.
filtros de porcelana "de Chamberland" y los de tierras infusorias calcinadas "Berkefield"
Esponjas de asbesto “filtros de Sietz” Membrana de ester de celulosa de 8 – 0.25 μ Ej. Vacunas, cuantificación bacterias en agua y
aire, separar toxinas de las bacterias, antibióticos, proteínas, cateter,
RADIACIÓN
Como la transmisión de energía a través del espacio.
Radiaciones ionizantes: ( rayos x, rayos gamma y rayos catódicos) y rayos ultravioleta,
Ej. Artículos farmacéuticos, plásticos como cajas de petri, jeringas, catéteres.
Rayos x para preservar frutas, vegetales y carne de cerdo.
Luz ultravioleta, longitud de onda corta cubre un espectro que va desde una manera parcial visible hasta una totalmente obscura, longitud de onda desde 390 a 40 nm, con un efecto letal máximo a 260 nm
MÉTODOS QUÍMICOS
AGENTES QUÍMICOS
Son agentes que matan o inhiben el crecimiento de los μorganismos.
Antiséptico Desinfectante Conservadores
ANTISÉPTICO
Agentes microbicidas que pueden aplicarse sobre la piel y mucosas, pero no pueden usarse internamente.
Desinfectantes
Agentes que matan μorganismos pero no necesariamente sus esporas y no deben aplicarse sobre tejidos sino sobre objetos inanimados como mesas, pisos, utensilios, etc.
Ejemplos: cloro, hipoclorito, compuestos clorados, soda, sulfato de cobre, compuestos de amonio cuaternario, etc.
Conservadores
Agentes usados frecuentemente en alimentos pero también en productos farmacéuticos para inhibir el crecimiento de μorganismos Por consiguiente al ser ingeridos no deben ser tóxicos.
Ej: propionato de calcio, benzoato de sodio, formaldehído, nitrato, dióxido de azufre.
Etanol (50-70%)Desnaturaliza proteínas y solubiliza lípidos
Isopropanol (50-70%) Desnaturaliza proteínas
y solubiliza lípidos
Formaldehído (8%) Reacciona con grupos-NH2, -SH y -COOH Desinfectante, mata endosporas
Cloro (Cl2) gas .Forma ácido hipocloroso (HClO), un fuerte agente oxidante Desinfección en general y en particular para agua potable
Detergentes (ej. amonios cuaternarios). Ruptura de membranas celulares Desinfectantes y antiséptico de piel
Conservadores
Ácido propionico y propionatos0,32% Agente antifúngico en panes, quesos
Acido sórbico y sorbatos0,2% Agente antifúngico en quesos, mermeladas, jugos
Acido benzoico y benzoatos 0,1% Agente antifúngico en margarina, sidra, bebidas gaseosas.
Acido láctico variable Agente antimicrobiano en queso, manteca, yogur.
Dióxido de azufre, sulfitos 200-300 ppm Agente antimicrobiano en frutas secas, uvas.
Nitrito de sodio 200 ppm Agente antimicrobiano en alimentos curados, pescado
Cloruro de sodio variable Previene el deterioro microbiano en carnes, pescado, etc.
Azúcar variable Previene el deterioro microbiano en mermeladas, jugos, jaleas, etc.
Agentes biológicos son sustancias sintéticas,
semisintéticas o producidas por μorganismos capaces de matar o inhibir el desarrollo de otros μorganismos.
Los agentes antivirales, antibacterianos y antifúngicos, se definen como aquellos agentes biológicos capaces de inactivar virus, bacterias y hongos, respectivamente.
pueden variar según la toxicidad selectiva que presenten, los antibióticos no actúan de manera similar en todos los tipos celulares -por el contrario- presentan una toxicidad selectiva y según se trate de una agente antifúngico o uno antibacteriano, inactivará células fúngicas o bacterianas.
Para el control de las enfermedades infecciosas en plantas, animales y humanos es indispensable el uso de antibióticos con la capacidad para inhibir las bacterias u otros m.o. sin causar daño al huésped.
Mecanismos de acción 1- Inhibición de la síntesis de peptidoglicano a- Antibióticos beta-lactámicos naturales y semisintéticos
(penicilinas, cefalosporinas, carbapenems, monobactam) b- Vancomicina (natural) c- Bacitracina (natural) 2- Alteración de la membrana citoplasmática a- Polimixina B (natural)
b- Anfotericina B (natural) c- Nistatina (natural) d- Imidazoles (natural)
3- Inhibición de la síntesis proteica Bloqueo de la transcripción (prevención de la síntesis de ARN) a- Rifampicina (natural)
b- Etambutol (no natural) Bloqueo de la traducción (alteración de ribosomas bacterianos) a- aminoglicósidos (natural)
b- tetraciclinas (natural) c- Lincosamina y clindamicina (natural) d- macrólidos (naturales y semisíntéticos)
4- Interferencia con la síntesis de ADN a- Fluoroquinolonas (no natural, Ej: ciprofloxacina)
b- Sulfonamidas y trimetroprim (no naturales)