tecnicas array

Tcnica de CGH-array

Mara Rodrguez-Rivera Laboratori de Citogentica Molecular. Servei de Patologia. Hospital del Mar. Programa de Cncer-IMIM. Barcelona

Introduccin a los microarrays

Arrays genmicos

Condiciones del ADN

Tcnica de CGH-array

Aplicaciones

ndice

Introduccin

Qu es un microarray?

Tipos de microarrays

Mikro (del griego,pequeo) y array (del ingls,distribucin ordenada)

Coleccin de biomolculas ordenadas en filas y columnas sobre un soporte slido miniaturizado.

Introduccin: Qu es un microarray?

Introduccin

Que es un microarray?

Tipos de microarrays

Tejido (TMA)

Protenas

Clulas

Genmicos

Expresin

miRNA

Metilacin

Introduccin: Tipos de microarrays

Microarrays genmicos


Coleccin de sondas de ADN dispuestas sobre un soporte slido que permiten detectar alteraciones en el genoma

Tipos de microarrays genmicos:

Arrays de CGH (Comparative Genome Hybridization)

Arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)


Coleccin de sondas de ADN dispuestas sobre un soporte slido que permiten detectar alteraciones en el genoma.




Array de oligos comerciales:

- Oligonucletido: secuencias pequeas de ADN 50pb

- Agilent TechnologiesTM, NimbleGen (RocheTM), BlueGnomeTM

- Diferentes formatos

- Microarrays prefabricados o custom

Array de BACs:

- BAC: Bacterial Artificial Chromosome

- Puede ser casero

- Perkin ElmerTM, BlueGnomeTM

Microarrays genmicos: Arrays de CGH

Microarrays genmicos: Arrays de CGH

Estudio de hibridacin comparativa (ADN tumoral vs ADN control) que permite detectar ganancias y/o prdidas de material gentico

Microarrays de CGH


Coleccin de sondas de ADN dispuestas sobre un soporte slido que permiten detectar alteraciones en el genoma.




Microarrays genmicos: Arrays de SNPs

Contiene adems sondas de oligonucletidos

correspondientes a variantes allicas de SNPs seleccionados

(oligoarray).

SNP ( Single nucleotide polymorphism ):

- Variacin de la secuencia de ADN que afecta a una

sola base

- 1 SNP cada 1000 bases


Permite obtener el nmero de copias de ADN y el

genotipo (seal de fluorescencia para cada alelo)

Hibridacin no competitiva:

- La muestra problema y control (si disponible) se hibridan

en arrays independientes

- Posterior comparacin de resultados

Microarrays de SNP


Prdida de heterocigosidad sin cambio en el nmero de copias (CNN-LOH)

Importancia en genes supresores de tumores:

mutacin heterocigota mutacin homocigota

Genes supresores de tumores: p53

Mutacin p53

Proliferacin clulas anormales

CGH SNP Hibridacin competitiva Hibridacin no competitiva

Muestra y control en Muestra y control se hibridan

un mismo array por separado

Ganancias y prdidas Ganancias y prdidas

LOH

CGH vs SNP

No detecta alteraciones equilibradas

No detecta diferentes clones

>30% clulas tumorales

CGH y SNP:Limitaciones

Protocolo tcnico

arrays CGH

ADN:

Sangre perifrica o mdula sea Separacin de poblaciones celulares (microbeads)

Tejido en fresco

Tejido congelado (OCT) Micro-Macrodiseccin del tumor

Parafina Micro-Macrodiseccin del tumor

Microarrays genmicos: ADN

Extraccin automatizada

Extraccin manual

Kits columnas

Kit manual

ADN: Tipos de extraccin

Preparacin ADN

Marcaje

Hibridacin

Lavados y secado

Escaneado

Anlisis de datos

Cantidad ADN:

500ng

Calidad ADN:

Espectofotmetro

ADN: Criterios de calidad

Espectofotmetro: NanoDrop 1000


Ratio ADN/ARN (A260/280) > 1.80

Ratio ADN/alcoholes, fenoles (A260/230) > 1.80

Concentracin

Integridad ADN


ADN no degradado ADN degradado (smear)

Preparacin ADN

Marcaje

Hibridacin

Lavados y secado

Escaneado

Anlisis de datos

Marcaje del ADN

ADN tumoral

ADN control

Desnaturalizacin

Marcaje

Cy5 -dUTP Cy3 -dUTP

Marcaje del ADN

Marcaje aleatorio (Random Priming)

Preparacin del array e hibridacin (muestra y control)

Hibridacin

Muestra (Cy5)

Control (Cy3)

Hibridacin

Unimos el mixer con el array

Hibridacin: Preparacin del array

Pipeteamos la muestra dentro del mixer

Hibridacin

Horneado

Hibridacin

48-72h

Preparacin ADN

Marcaje

Hibridacin

Lavados y secado

Escaneado

Anlisis de datos

Lavados de astringencia

Lavados y secado

Secado

Preparacin ADN

Marcaje

Hibridacin

Lavados y secado

Escaneado

Anlisis de datos

Plataforma MS200 NimbleGen, ROCHE TM

Escaneado del array

Preparacin ADN

Marcaje

Hibridacin

Lavados y secado

Escaneado

Anlisis de datos

Se obtiene una imagen con la lectura de los dos fluorocromos (Cy3 y Cy5)

Se genera un archivo por cada fluorocromo para poder analizar en forma de datos

Visualizacin de datos

Anlisis

ADN tumoral > ADN control

Ganancia

ADN tumoral < ADN control

Prdida

ADN tumoral = ADN control

Normal

Software para la visualizacin de los datos

Anlisis paralelo con tablas de datos

Anlisis de datos

Anlisis de datos: Principios

Sonda

Cromosoma Ideograma Cariotipo molecular

Anlisis visual: Ejemplos

DEVA


Nexus


Nexus

Ganancia

Prdida

Software para la visualizacin de los datos

Anlisis paralelo con tablas de datos

Anlisis de datos

Anlisis datos: Ejemplos

N sondas: > 5 Log2 Ratio: < - 0.2 (Prdidas) > 0.2 (Ganancias)

Aplicaciones arrays genmicos

Oncohematologa Diagnstico

Pronstico

Investigacin

Post-natal y Pre-natal Sndromes asociados a ganancias/prdidas de material gentico:

Deleciones: ej sndrome de Cri-du-chat (5p-)

Aneuploidias: +21 (Sd.Down), +13 (Sd.Patau), +18 (Sd.Edwards), +X/Y (Sd.Turner, )

Alteraciones en genes asociados a retraso mental y autismo

Nuevos sndromes

Aplicaciones arrays genmicos

Estudio de carcinomas de clulas renales (CCR) mediante arrays de CGH y cariotipo N=24

16 CCR de clulas claras

5 CCR papilares

2 CCR cromfobos

1 Oncocitoma

Tejido fresco: Estudio citogentico

Extraccin ADN

Aplicaciones arrays genmicos: Ejemplos

Poster SEAP- 081. M.Salido

CCR-CC: Citogentica

45,X,add(X)(p28),der(1)t(1;1)(p36;q12),del(3)(p14),-14

CCR-CC: CGH-arrays

CCR-CC: CG vs CGH-arrays

Buena herramienta complementaria

Diferentes formatos

Limitaciones

Coste cada vez menor

Resumen

Laboratori de Citogentica Molecular. Servei de Patologia. Hospital del Mar. Programa de Cncer-IMIM. Barcelona

Agradecimientos: Dra.Blanca Espinet Dra.Marta Salido Dra.Anna Puiggros Carme Melero Dra.Silvia de Muga Dra.Nuria Juanpere Dr.Josep Lloreta Dr.Josep M Corominas Prof.Sergi Serrano

Agradecimientos:

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