UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular III

CARACTERIZACIN FUNCIONAL DE HEMICANALES Y SU IMPLICACIN EN EL MECAMISMO DE SECRECIN DE

INSULINA

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR

Javier Pizarro Delgado

Bajo la direccin del doctor

Jorge Tamarit Rodrguez

Madrid, 2013

Javier Pizarro Delgado, 2013

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE MEDICINA

Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular III

CARACTERIZACIN FUNCIONAL DE HEMICANALES

Y SU IMPLICACIN

EN EL MECANISMO DE SECRECIN DE INSULINA

TESIS DOCTORAL

JAVIER PIZARRO DELGADO

Madrid, 2012

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE MEDICINA

Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular III

CARACTERIZACIN FUNCIONAL DE HEMICANALES

Y SU IMPLICACIN

EN EL MECANISMO DE SECRECIN DE INSULINA

MEMORIA PRESENTADA POR

JAVIER PIZARRO DELGADO

PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

BAJO LA DIRECCIN DEL

Dr. JORGE TAMARIT RODRGUEZ

D. JORGE TAMARIT RODRGUEZ, CATEDRTICO del DEPARTAMENTO de BIOQUMICA

y BIOLOGA MOLECULAR III de la FACULTAD de MEDICINA de la UNIVERSIDAD

COMPLUTENSE DE MADRID,

CERTIFICA:

Que el licenciado JAVIER PIZARRO DELGADO ha realizado el trabajo titulado

CARACTERIZACIN FUNCIONAL DE HEMICANALES Y SU IMPLICACIN EN EL

MECANISMO DE SECRECIN DE INSULINA, bajo mi direccin, en el DEPARTAMENTO de

BIOQUMICA y BIOLOGA MOLECULAR III de la FACULTAD de MEDICINA de la

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID para optar al grado de Doctor.

Y para autorizar su presentacin y evaluacin por el tribunal correspondiente, expide el presente certi-

ficado en Madrid, a 13 de noviembre de 2012.

V B del Director

Fdo: Jorge Tamarit Rodrguez

Agradecimientos

siempre he credo que las cosas no se dicen, sino que se demuestran. Por eso, en estas lneas

quera expresaros mi gratitud por todo lo que me habis demostrado durante todos estos aos,

durante este camino recorrido que acaba aqu, que significa el final de una etapa, pero que dar

paso al comienzo de otra

Al Dr. Jorge Tamarit Rodrguez. Desde el principio me he sentido apoyado tanto profesional

como personalmente. Ms que nada has sido un compaero en este viaje realizado. Nuestras

largas horas al frente del microscopio han dado para muchas conversaciones, para contar mul-

titud de ancdotas y para aprender muchas cosas. Por esa aventura americana que vivimos con

tanta intensidad y que me sirvi para enriquecerme no slo a nivel profesional sino tambin per-

sonal. Slo puedo decirte, GRACIAS.

Al Dr. Rafael Martn Del Ro, por su gran ayuda y por sus consejos que siempre sirvieron

de orientacin para el desarrollo de este trabajo. Al Dr. Luis Carlos Barrio Calvo por su aporta-

cin del modelo animal de ratones transgnicos que han servido para obtener parte de los resul-

tados de este trabajo. A Ins, porque los inicios siempre son difciles y estuviste ah para hacer

que fueran ms fciles.

A todas las personas del Departamento de Bioqumica que de alguna u otra forma me

ayudaron y me mostraron su cario todo este tiempo. En especial a mi paisana Mari ngeles

por esos buenos momentos en el laboratorio y a Ana, por nuestras charlas tanto en la cercana

como en la distancia que me ayudaron a mantener siempre el optimismo.

A mi familia Bostoniana de la BU, al Dr. Jude Deeney, a Laura, Nathan, Thom, Sarah,

Marc, y en especial a la Dra. Barbara Corkey por acogerme en su laboratorio. No olvidar

nunca esos meses

A todos los amigos que afortunadamente me he ido encontrando en las diversas etapas vi-

vidas

De mi primera etapa universitaria, en la Facultad de Qumicas de Ciudad-Real, a Chencho,

Luis, Javi, Marta y de mi segunda etapa en la Universidad Complutense de Madrid, a mis

amigos Zamo y Lagares, por cada momento vivido que nunca olvidar y a Noela, por ser espe-

cial a los que quiero agradecer la amistad que me brindasteis desde el primer da y que, a

pesar de la distancia, os sigo llevando en mi recuerdo.

A mis AMIGOS de siempre, a esa Pea que formamos en ese nuestro pueblo y que a pe-

sar de los aos pasados seguimos juntos. Cada uno con su vida, pero con el recuerdo y la segu-

ridad de que cada instante vivido con vosotros es imborrable. A mi Granao, Tiago, Cheri,

Fran, Ruper, Jauma, Cano, Rafa, Pichi slo puedo expresar la gran suerte que tuve al

conoceros y mi enorme agradecimiento por hacerme sentirme especial. Y como no a mi Sape,

simplemente por ser como eres tu amistad es una de las mejores cosas que me han pasado.

Slo decirte que eres grande chaval!x

Agradecimientos

Aunque normalmente estas palabras van dirigidas a personas, tambin quera agradecer a

mi pueblo todo lo que me ha aportado ese rincn particular en el que me siento importante y

en el que los recuerdos son como fuentes de energa que necesito para afrontar cada etapa

Y por ltimo, a mi familia

A Casti, Antonio y Beatriz, por estar siempre ah y porque ser vuestro hermano es el mejor

tesoro que uno puede tener. A Mariv, por esa energa que nos contagia. A Alberto, porque, ms

que un cuado, eres un amigo para m. A Valeria, mi chiqui, porque tu sonrisa es la mayor

fortuna que te pueden regalar

A Carmen, porque a tu lado soy feliz. Slo recuerda tres letras: TSQ

A mis padres, por aportarme la educacin, el respeto, la responsabilidad, y la humildad

que hay que tener para ser una buena persona No habra hojas suficientes para agradeceros

todo lo que me habis dado y adems s que no llegarais al final as que slo puedo decir

dos palabras: Os quiero!

NDICE

AABBRREEVVIIAATTUURRAASS.... 17

RREESSUUMMEENN..... 21

IINNTTRROODDUUCCCCIINN

1. DIABETES MELLITUS........ 25

1.1. DIABETES MELLITUS TIPO 1...... 27

1.2. DIABETES MELLITUS TIPO 2...... 28

2. ISLOTES DE LANGERHANS..... 30

3. CLULA ....... 31

3.1. Mecanismo de secrecin de insulina. Acoplamiento estmulo-secrecin . 32

3.1.1. Metabolismo de la glucosa .......................................................... 33

3.1.2. Otros nutrientes secretagogos..................................................... 34

3.1.3. Mecanismo de secrecin dependiente de KATP (fase de iniciacin) ............. 35

3.1.4. Mecanismo de secrecin independiente de KATP (fase de amplificacin) ... 36

3.2. Regulacin del mecanismo de secrecin... 38

3.3. Mecanismo de exocitosis de los grnulos de insulina 40

4. MECANISMOS DE COMUNICACIN INTERCELULAR. 42

4.1. Conexinas, conexonas (hemicanales) y gap junctions................. 43

4.2. Comunicacin intercelular en islotes pancreticos. 48

4.2.1. Conexina-36. Generalidades 48

4.2.2. Conexina-36 y su funcin en la clula . Implicacin en la secrecin de insulina...... 49

4.2.3. Conexina-36. Patologas y perspectivas en la Diabetes Mellitus........ 52

OOBBJJEETTIIVVOOSS.. 57

MMAATTEERRIIAALLEESS YY MMTTOODDOOSS

1. AISLAMIENTO DE ISLOTES PANCRETICOS. 61

2. SECRECIN DE INSULINA.. 61

2.1. Perifusin de islotes pancreticos... 61

2.2. Medida de la concentracin de insulina.... 63

2.2.1. RADIOINMUNOENSAYO.... 63

1. Marcaje y purificacin de insulina radioyodada con 125INa 63

2. Preparacin de anticuerpo frente a insulina... 65

3. Preparacin de la solucin con 125I-insulina... 66

4. Preparacin de la curva estndar de insulina........ 66

5. Preparacin de las muestras......... 67

6. Separacin de la insulina libre de la ligada al anticuerpo 67

7. Representacin de la curva estndar y clculo de la concentracin de insulina. 67

2.2.2. FLUORESCENCIA POR TRANSFERENCIA DE ENERGA DE RESONANCIA.. 68

3. ANLISIS DE AMINOCIDOS....... 70

3.1. Incubacin esttica de islotes pancreticos... 70

3.2. Cuantificacin de aminocidos... 70

4. VALORACIN DE DNA........ 71

5. MEDIDA DE LA CONCENTRACIN DE NUCLETIDOS DE ADENINA . 72

5.1. Incubacin esttica y extracin de islotes pancreticos.. 73

5.2. Determinacin del contenido de ATP y ADP en los extractos de islotes.... 73

6. EXPRESIN DE LUCIFERASA RECOMBINANTE EN CLULAS AISLADAS DE

ISLOTES Y EN CLULAS INS-1...

74

A. Aislamiento de islotes mediante gradiente (Histopaque) .. 75

B. Aislamiento de clulas pancreticas por disociacin de islotes... 75

C. Transfeccin con adenovirus expresante de luciferasa...... 75

7. ANLISIS ESTADSTICO..................................................................................... 76

RREESSUULLTTAADDOOSS

1. CARACTERIZACIN FUNCIONAL DE HEMICANALES EN ISLOTES

PANCRETICOS DE RATA 79

1.1. EFECTO DE LA DEPOLARIZACIN EN EL CONTENIDO Y LIBERACIN DE

AMINOCIDOS. ESTUDIO DE LA INHIBICIN CON MEFLOQUINA........... 79

1.2. EFECTO DE LA DEPOLARIZACIN EN EL CONTENIDO DE ATP Y EN EL COCIENTE

ATP/ADP....................................................................................................................... 82

1.2.1. Efecto de la depolarizacin sobre el contenido de ATP producido por glucosa y otros

sustratos metabolizables...................................................... 83

1.2.2. Comparacin del efecto de la glucosa y anlogos no metabolizables sobre la

disminucin del contenido de ATP inducida por depolarizacin. 84

1.2.3. Estudio de la captacin de ATP extracelular en islotes en condiciones depolarizantes 85

1.3. EFECTO DE LA DEPOLARIZACIN SOBRE LA SECRECIN DE INSULINA INDUCIDA

POR NUTRIENTES SECRETAGOGOS. EFECTO DE LA MEFLOQUINA.. 88

1.4. CARACTERIZACIN IN VITRO DE HEMICANALES EN CLULAS AISLADAS.. 92

1.4.1. Efecto de la depolarizacin en clulas aisladas de islotes de rata... 93

1.4.2. Efecto de la depolarizacin en clulas INS-1...... 95

2. CARACTERIZACIN FUNCIONAL DE HEMICANALES EN ISLOTES

PANCRETICOS DE RATONES KNOCK-OUT PARA LA Cx36 (Cx36-KO)... 97

2.1. EFECTO DE LA DEPOLARIZACIN EN EL CONTENIDO Y LIBERACIN DE

AMINOCIDOS............ 97

2.2. EFECTO DE LA DEPOLARIZACIN EN EL CONTENIDO DE ATP Y EN EL COCIENTE

ATP/ADP....................................................................................................................... 98

2.2.1. Comparacin del contenido de ATP y del cociente de ATP/ADP en islotes de ratones

Cx36+/+, Cx36+/- y Cx36-/- en condiciones basales o depolarizantes............. 98

2.2.2. Estudio de la captacin de ATP extracelular en islotes Cx36+/+ y Cx36-/- en condiciones

depolarizantes................... 100

2.2.3. Efecto de G20 y MFQ sobre la prdida de ATP inducida por depolarizacin en islotes

Cx36+/+.... 101

2.2.4. Estudio del efecto de anlogos no metabolizables de glucosa sobre la disminucin del

contenido de ATP inducida por depolarizacin en islotes Cx36+/+. 102

2.3. ESTUDIO DE LA SECRECIN DE INSULINA EN ISLOTES PERIFUNDIDOS DE RATN

Cx36+/+, Cx36+/- y Cx36-/-. 103

2.3.1. Secrecin de insulina inducida por G20 en islotes perifundidos... 103

2.3.2. Efecto de la MFQ sobre la secrecin de insulina en islotes Cx36+/+... 105

2.3.3. Estudio de la secrecin de insulina en islotes expuestos a ATP extracelular en condicio-

nes depolarizantes. Comparacin entre los tres genotipos. 106

3. ESTUDIO DEL ACOPLAMIENTO ENTRE ATP Y SECRECIN DE INSULINA EN

ISLOTES PANCRETICOS DE RATA.. 111

3.1. DOSIS-RESPUESTA DE ATP SOBRE LA SECRECIN DE INSULINA.. 111

3.1.1. Efecto de la MFQ sobre la secrecin de insulina estimulada por ATP extracelular en

islotes depolarizados. 114

3.1.2. Efecto del cociente ATP/ADP sobre la secrecin de insulina estimulada por ATP

extracelular en islotes depolarizados.. 116

3.2. ESTUDIO DE LA RELACIN ENTRE LA GENERACIN CITOSLICA O MITOCON-

DRIAL DE ATP Y LA SECRECIN DE INSULINA ... 117

3.2.1. Estudio de la secrecin de insulina inducida por metabolitos glucolticos... 118

3.2.2. Estudio de la secrecin de insulina inducida por metabolitos mitocondriales. 123

3.2.3. Produccin de ATP inducida por metabolitos glucolticos o mitocondriales... 124

DDIISSCCUUSSIINN

1. IMPORTANCIA FUNCIONAL DE LA COMUNICACIN CELULAR EN ISLOTES. 139

2. MECANISMO DE ACOPLAMIENTO ENTRE ATP Y SECRECIN DE INSULINA... 136

CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS... 145

BBIIBBLLIIOOGGRRAAFFAA.... 149

ABREVIATURAS

Abreviaturas

17

2-OG 2-oxoglutarato

BCAT Transferasa de aminocidos de cadena ramificada

BSA Albmina bovina srica

cAMP AMP cclico

CBX Carbenoxolona

cpm Cuentas por minuto

Cx Conexina

DM Diabetes Mellitus

DPK 1,3-difosfoglicerato quinasa

EDTA cido etilendiaminotetractico

EGTA cido etilenglicol-bis(b-aminoetilter)-N,N,N,N-tetractico

FLU cido flufenmico

FRET Fluorescencia por transferencia de energa de resonancia

G6P Glucosa-6-fosfato

GABA cido -aminobutrico

GABA-T GABA transaminasa

GAD Descarboxilasa del cido glutmico

GAP Gliceraldehdo-3-fosfato

GAPDH Gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa

GDH Glutamato deshidrogenasa

IDDM Insulin Dependent Diabetes Mellitus

KC -cetocaprico

KIC -cetoisocaprico

KMV -cetometilvalrico

KRBH Krebs-Ringer bicarbonato

LDH Lactato deshidrogenasa

MCT Transportador de monocarboxilatos

MFQ Mefloquina

MODY Maturity-Onset Diabetes of the Young

NIDDM Non-Insulin Dependent Diabetes Mellitus

NPPB cido 5-nitro-2-(3-fenilpropilamino)-benzoico

OPA o-ftalaldialdehdo

OAA oxalacetato

PBS Tampn fosfato salino

PCA cido perclrico

Abreviaturas

18

PEP Fosfoenolpiruvato

PEPCK-M Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa mitocondrial

PIR Piruvato

PK Piruvato quinasa

Px Panexina

SSA Semialdehdo succnico

SUCC Succinato

TCA Ciclo de los cidos tricarboxlicos (ciclo de Krebs)

VAMP Protena de membrana asociada a vesculas

VDCCs Canales de calcio dependientes de voltaje

RESUMEN

Resumen

21

La secrecin de insulina es un proceso multicelular que resulta de la activacin coordi-

nada de las clulas que componen los islotes pancreticos. Se ha descrito que las molculas

implicadas en la sincronizacin celular necesaria para una respuesta ptima de la hormona

son protenas de la familia de las conexinas (Cx). Adems, se ha observado que no slo for-

man canales intercelulares (gap junctions) entre clulas vecinas, sino que tambin podran

formar hemicanales (conexonas) que permitiran la comunicacin con el medio extracelu-

lar. Se ha demostrado que alteraciones en esta protena y por lo tanto en la comunicacin

intercelular pueden estar asociadas a procesos diabetognicos.

Para profundizar en el conocimiento de la funcionalidad de estos canales y su implica-

cin en el mecanismo de secrecin de insulina, se ha realizado la caracterizacin funcional de

los hemicanales mediante un modelo experimental de islotes permeabilizados con una

depolarizacin elevada. Por ello, nos propusimos estudiar el efecto que pudieran tener estas

condiciones depolarizantes tanto en la respuesta secretora estimulada por determinados se-

cretagogos, como en la difusin de determinados metabolitos (nucletidos de adenina y

aminocidos). Los resultados obtenidos nos han permitido dilucidar aspectos novedosos en

el funcionamiento de los hemicanales mediante el estudio con inhibidores especficos y

con un modelo knock-out para la Cx36 (isoforma predominante en clula ), destacando el

importante papel de estos hemicanales en el mecanismo de secrecin y resaltando la im-

portancia de la glucosa como posible regulador fisiolgico de stos.

Como segundo objetivo se propuso analizar el mecanismo de acoplamiento entre la ge-

neracin intracelular de ATP y la secrecin de insulina, usando como modelo experimental

los islotes permeabilizados en condiciones depolarizantes. Es sabido que la glucosa es el

principal nutriente estimulador de la secrecin de insulina mediante la produccin de ATP,

pero el proceso metablico (glucolisis u oxidacin mitocondrial) que estara ms ntimamen-

te ligado al proceso secretor es un tema an por esclarecer. As, los resultados obtenidos so-

bre el efecto de concentraciones variables de ATP extracelular en la secrecin y la estimula-

cin inducida por determinados metabolitos (glucolticos o mitocondriales), podran destacar

la importancia del proceso glucoltico sobre la oxidacin mitocondrial en el mecanismo de

secrecin de insulina. Esto podra ayudar a profundizar en el estudio de posibles dianas

para el desarrollo de nuevas estrategias teraputicas antidiabticas.

INTRODUCCIN

Introduccin

25

1. DIABETES MELLITUS

La Diabetes Mellitus (DM) es el desorden endocrino conocido ms comn, registrndose

que en el ao 2010 ms de doscientos millones de personas (aproximadamente el 6% de la

poblacin mundial) padecan severas complicaciones diabticas y estimndose que para el

ao 2025 podran padecerlo unos 300 millones [1]. Segn la Fundacin Espaola de Diabetes,

slo en Espaa se ha descrito que existen en la actualidad ms de dos millones y medio de

personas con esta enfermedad y que podran superar los tres millones en los prximos 15

aos (figura 1).

Esta enfermedad es un desorden metablico que resulta de un defecto en la secrecin de

insulina y/o una accin de sta sobre los tejidos perifricos. Estas deficiencias pueden provo-

car una hiperglucemia crnica y alteraciones en el metabolismo de carbohidratos, cidos gra-

sos y protenas que llevan asociado dao a largo plazo, disfunciones y fallo de varios rga-

nos, especialmente en ojos (retinopata), rin (nefropata) y sistema cardiovascular [2].

Los criterios de diagnosis y la clasificacin de los tipos de DM han sido publicados tanto

por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) como por la Asociacin Americana de Dia-

betes (ADA): los sntomas de la enfermedad pueden ser poliuria, polidipsia, prdida de peso

corporal, etc. Y los umbrales de glucosa en plasma en situacin de ayuno y post-pandrial por

encima de 7.0 mmol/l (126 mg/dl) y 11.1 mmol/l (200 mg/dl), respectivamente y de 200

mg/ml tambin durante el test de tolerancia a la glucosa de dos horas con un aporte de 75 g

de glucosa en agua, podran ser tambin asociados al diagnstico de la enfermedad.

Dependiendo de la causa que da lugar a la enfermedad, se pueden distinguir varios ti-

pos [3]:

Diabetes Mellitus Tipo I: Tambin conocida como insulino-dependiente (IDDM, Insu-

lin Dependent Diabetes Mellitus), se presenta principalmente en jvenes, en su mayora, duran-

te la infancia. El pncreas pierde su capacidad de producir insulina por la destruccin de las

clulas productoras de la hormona y por lo tanto se requiere terapia con aporte insulnico

para sobrevivir.

Diabetes Mellitus Tipo II: Tambin conocida como no insulino-dependiente (NIDDM,

Non-Insulin Dependent Diabetes Mellitus), se caracteriza por un dficit relativo de produccin

de insulina y una deficiente utilizacin perifrica por los tejidos de glucosa (resistencia a la

insulina), por lo que es necesario un control de la hormona. Es la ms comn y se desarrolla

Introduccin

26

sobre todo en etapas adultas de la vida, asocindose frecuentemente con la obesidad y el

sedentarismo.

Diabetes Mellitus Gestacional: Es provocada por una alteracin del metabolismo de los

carbohidratos durante la etapa de gestacin, que pueden llegar a provocar complicaciones en

el feto e incluso incrementa el riesgo de padecer DM2 posteriormente tanto en la madre co-

mo en el nio.

Otros tipos de diabetes: Incluyen defectos genticos de las clulas pancreticas o en la

rutas de accin de la insulina, as como patologas del pncreas exocrino (pancreatitis o fibro-

sis cstica), endocrinopatas producidas por excesos de hormonas contrarreguladoras (sn-

drome de Cushing, acromegalia), etc. Adems tambin pueden darse diversos tipos de for-

mas monognicas de DM como la diabetes tipo MODY (Maturity-Onset Diabetes of the

Young), de herencia familiar autosmica que presenta defectos primarios en la secrecin de

insulina.

Figura 1. Prevalencia de la Diabetes Mellitus en el mundo y en Espaa. A pesar de los avances en el tra-tamiento y prevencin, la prevalencia de la diabetes ha aumentado de manera ms drstica de lo esperado: en 1997 haba 120 millones de diabticos en el mundo y se esperaba que la cifra alcanzara a 150 millones en el ao 2000; sin embargo, lleg a 177 millones de personas, lo que proyectado a 2025 dara una estimacin de 333 mi-llones de personas con DM. A menor escala, la evolucin de personas con complicaciones diabticas en Espaa ha incrementado alrededor de doscientas mil personas cada 5 aos, lo que situara el nmero de personas con esta enfermedad en ms de tres millones de personas en el ao 2025.

Introduccin

27

1.1. DIABETES MELLITUS TIPO 1

La Diabetes Mellitus Tipo 1 (DM1) resulta de una destruccin progresiva de las clulas

pancreticas de forma autoinmune mediada por los linfocitos T del sistema inmunitario, lo

que requiere un aporte de insulina para la supervivencia del paciente. Sin embargo, los even-

tos que llevan a esta destruccin celular no estn totalmente esclarecidos en la actualidad.

Diversos autoantgenos contra clulas han sido implicados en el desarrollo de esta autoin-

munidad [4]. Se han identificado tres principales autoantgenos: la descarboxilasa del cido

glutmico (isoforma de 65kDa, identificada en las clulas pancreticas, GAD65), una pro-

tena de la familia de las tirosina-fosfatasas (IA-2) y la propia insulina. Aunque se han descri-

to otros autoantgenos diferentes a stos (el transportador de glucosa GLUT-2, la Carbo-

xipeptidasa H, la protena hsp 65, el receptor de insulina), diversos estudios han determina-

do que alrededor de un 90% de los individuos diagnosticados como Tipo 1, poseen al menos

uno de los tres autoantgenos anteriormente descritos [5].

Sin embargo, existen otros factores que pueden influir en el desarrollo de este tipo de

diabetes, como factores ambientales y genticos que pueden dar lugar a la autoinmunidad

desencadenada que provoca la enfermedad. Mientras que la susceptibilidad gentica a la

DM1 se rige a travs de la regin HLA que codifica para protenas involucradas en el reco-

nocimiento y presentacin del antgeno, la respuesta inmune es lo que explica la etiologa de

la enfermedad. Existen dos hiptesis que explican la destruccin de las clulas pancreti-

cas: una primera en la que se afirma que la presentacin de un antgeno de estas clulas al

receptor CD4-positivo de los linfocitos T en el contexto de una molcula de HLA y la conse-

cuente cascada de eventos, lleva a la destruccin de las clulas que expresan la diana del an-

tgeno y una segunda en la que estn implicados procesos inflamatorios producidos por una

respuesta inmune a un antgeno no propio, pero que contiene una secuencia homloga a uno

que s lo es (mimetismo molecular) [6].

Es sabido que existen dos isoformas del GAD (GAD65 y GAD67) expresadas tanto en c-

lulas del sistema nervioso, como en las clulas de los islotes pancreticos; sin embargo, los

pacientes con un estado pre-diabtico diagnosticado presentaban anticuerpos especficos de

la isoforma GAD65, lo que llev al estudio de sta de una manera ms incisiva [7]. As, en un

estudio publicado por el grupo de Ji-Won Yoon, desarrollaron un modelo de ratones NOD en

los que, a travs de la insercin de un transgn antisentido del GAD, son capaces de blo-

quear la expresin del enzima [4]. Esto inhiba el desarrollo de la enfermedad, suprimiendo

la generacin de clulas T diabetognicas frente a las clulas . Por lo tanto, la demostracin

Introduccin

28

de que la autoinmunidad producida sobre esta protena es la que desarrolla, en su mayor

parte, la diabetes tipo 1, podra tener importantes repercusiones para el desarrollo de estra-

tegias teraputicas en un futuro. Por ejemplo, el transplante de islotes con una expresin del

GAD disminuida por el uso de un transgn antisentido o la expresin de pptidos del propio

autoantgeno del enzima en la mayora de los tejidos, incluido el timo, para potenciar por s

mismo una tolerancia especfica al GAD, podra ser beneficioso para pacientes con este tipo

de diabetes.

Otras patologas como la enfermedad de Grave, Hashimoto (tiroiditis) o Addison podran

estar relacionadas con el desarrollo de DM1, ya que algunos de estos pacientes cursan con

una insulinopenia permanente y cetoacidosis propias de este tipo de diabetes, aunque no ha

sido demostrada la autoinmunidad en estas patologas [8].

1.2. DIABETES MELLITUS TIPO 2

La Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) es la forma de diabetes ms comn y es el resultado

de un dficit en la secrecin de insulina por parte de las clulas y una resistencia a la accin

de la hormona en los tejidos perifricos. Un aporte excesivo de nutrientes podra dar lugar a

una hiperglucemia y una concentracin de cidos grasos libres que impactaran negativa-

mente sobre la funcin celular. Esto puede suceder por diversos mecanismos, que incluyen la

generacin de especies reactivas de oxgeno, alteraciones en rutas metablicas, incremento

de la concentracin de Ca2+ intracelular y la aparicin de mecanismos de estrs. Estos proce-

sos afectaran a las funciones celulares decreciendo la expresin y secrecin de insulina y

causando por lo tanto prdida de masa celular por apoptosis [9].

Normalmente la mayora de los pacientes que sufren DM2 se asocia a la obesidad. In-

cluso el exceso de peso podra provocar por s mismo una resistencia a la insulina, aunque

existen individuos que podran tener una hipersecrecin de insulina compensatoria con el

objetivo de mantener niveles normales de glucemia. Sin embargo, los enfermos de DM2 no

son capaces de tener esta respuesta compensatoria, ya que existe un mal funcionamiento de

las propias clulas , derivando en un progresivo deterioro en la funcin celular [10].

La resistencia a la insulina podra ser parcialmente reducida con una disminucin del

peso y/o con un tratamiento farmacolgico para la hiperglucemia, aunque raramente se con-

sigue una restauracin a valores normales. El riesgo de desarrollar esta enfermedad aumenta

con la edad, con el peso y con la carencia de actividad fsica. Por lo tanto, modificaciones en

la dieta y en el estilo de vida podran servir de prevencin y tratamiento para la DM2. Se ha

Introduccin

29

descrito adems que ocurre ms frecuentemente en mujeres con diabetes mellitus gestacional

y en pacientes con hipertensin y dislipidemia, adems de la diferencia entre razas y que

podra estar tambin asociada a una fuerte predisposicin gentica, aunque todava es un

tema que no est claramente definido [11].

En resumen, en algunos individuos con DM, un control adecuado de la glucemia puede

ser resultado de una reduccin del peso, de un aumento en la actividad fsica y/o de agentes

que disminuyan los niveles de glucosa en sangre. Estos pacientes no requieren tratamiento

con insulina sino simplemente un control de sta (DM2, GDM y otros tipos). Sin embargo,

otros individuos s que requieren una aporte exgeno de insulina para tener controlada la

glucemia (DM1). Adems, el grado de hiperglucemia puede cambiar con el tiempo, depen-

diendo de la amplitud del proceso patolgico asociado. As, la enfermedad puede presentar-

se pero podra no causar una hiperglucemia. Por ejemplo, el mismo proceso patolgico pue-

de causar disminucin de la tolerancia a la glucosa y/o del umbral de glucosa en sangre en

ayuno sin tener un criterio de diagnosis absoluto de la enfermedad. Por lo tanto, el grado de

hiperglucemia refleja la severidad de los procesos metablicos asociados y su tratamiento,

ms que la naturaleza del proceso en s (figura 2) [11].

Figura 2. Alteraciones de la glucemia. Tipos de diabetes y estados. *Incluso despus de padecer cetoacido-sis, estos pacientes (DM1) en ocasiones pueden sufrir el llamado efecto honeymoon, donde retornan por un

espacio corto de tiempo a valores normoglucmicos sin requerir tratamiento insulnico. **Estos pacientes, en raras ocasiones (como la DM1 observada en embarazadas) requieren insulina para sobrevivir.

Introduccin

30

2. ISLOTES DE LANGERHANS

Los islotes pancreticos son asociaciones de clulas que conforman la parte endocrina

del pncreas. Estas agrupaciones fueron descubiertas por Langerhans (de ah su nombre) a

mediados del siglo XVIII, pero no fue hasta finales de este mismo siglo cuando fue descu-

bierta su funcin endocrina [12].

La regulacin de la glucemia por parte del islote depende principalmente de la funcin

individual de las diferentes poblaciones celulares que lo integran y de la interaccin entre

stas. En humanos, alrededor de un milln de estos islotes constituyen el rgano pancretico.

La masa de clulas endocrinas apenas supera el 1% del total del rgano y se agrupan en po-

blaciones de 1000-3000 clulas llamadas islotes. El tipo celular predominante corresponde a

la clula pancretica, responsable de la secrecin de insulina, mientras que la clula se-

cretora de glucagn y la clula secretora de somatostatina estn representadas en una me-

nor proporcin. Si bien en ratn la clula constituye alrededor del 70-80% del islote y la

clula en torno al 20%, estudios recientes en humano han demostrado una presencia mayor

de clulas (55% de clulas frente a un 40% de ). En el caso de las clulas , pueden llegar

a constituir el 10% del total del islote [12] (figura 3).

Existen adems otros tipos celulares minoritarios como las clulas PP productoras del

polipptido pancretico, clulas productoras de grelina, algunos fibroblastos, linfocitos y

macrfagos que constituyen menos del 1% [12].

As, un gran nmero de trabajos cientficos han sido dirigidos al estudio de la clula y

el mecanismo de secrecin de insulina, de manera que hoy en da se tiene un gran conoci-

miento de la regulacin de este tipo celular.

Si bien los estudios en lneas celulares y en clulas del islote aisladas aportan informa-

cin relevante sobre la respuesta especfica de una clula o tipo celular, sera preciso estudiar

tambin esta respuesta en el islote intacto, pues es en este escenario donde se integran los

diferentes mecanismos de comunicacin clula-clula, aproximndose en mayor medida a la

realidad fisiolgica [12].

Introduccin

31

Figura 3. Microscopa confocal de secciones de islotes pancreticos de humano (A), mono (B), ratn (C) y cerdo (D), tratados inmunoqumicamente con anticuerpos anti-insulina (color rojo, clulas ), anti-glucagn (color verde, clulas ) y anti-somatostatina (color azul, clulas ) [13].

3. CLULA

En general, prcticamente todas las clulas del organismo poseen lo que se llama un

potencial de membrana en reposo, generado por la existencia de un trasiego de iones a

travs de una serie de canales inicos que se encuentran en la membrana plasmtica. Este

flujo de iones genera una diferencia de potencial a ambos lados de la membrana, el cual,

cuando se ve modificado por la llegada de un estmulo (impulso elctrico como en el caso de

las clulas del sistema nervioso, un estmulo metablico como consecuencia de la generacin

de ATP, etc.), se produce la activacin de la clula y por consiguiente el desarrollo de las

funciones celulares determinadas.

Es una idea universalmente aceptada que en el grupo de clulas que poseen una seali-

zacin y activacin metablica se encuentran las clulas . Como cualquier tipo de clula,

poseen un potencial de membrana en reposo que est generado por la existencia en su mem-

brana de diferentes tipos de canales que regulan el flujo de iones a travs de sta y que de-

terminan esta sealizacin y activacin de una manera metablica. En este caso, el principal

estmulo que permite desarrollar la principal funcin de este tipo de clula (secrecin de in-

sulina) es el metabolismo de la glucosa [14].

Las clulas pancreticas son capaces de ajustar la secrecin de insulina segn los nive-

les prevalecientes de glucosa en sangre, siendo esta hormona sumamente importante para la

captacin de glucosa por parte de los tejidos para su utilizacin como fuente de energa y

para su almacenamiento en forma de glucgeno. Este tipo de clulas se comportan como

verdaderos sensores de glucosa, ya que su funcin es esencial para el mantenimiento de la ho-

Introduccin

32

meostasis del azcar (el nivel plasmtico de la glucosa es uno de los parmetros ms regula-

dos en humanos, debido, principalmente, al equilibrio entre la liberacin de insulina, por un

lado y a la accin de otras hormonas contrarreguladoras, por otro). Esto se demuestra, por

ejemplo, por el papel que estas clulas juegan en la patognesis de la DM2, ya que un defecto

relativo en la respuesta de insulina a glucosa es la causa principal para el desarrollo de la

resistencia a la hormona que se experimenta en esta enfermedad [14].

3.1. Mecanismo de secrecin de insulina. Acoplamiento estmulo-secrecin

Como se ha comentado anteriormente, el principal estmulo que desencadena la secre-

cin de insulina por parte de las clulas es el metabolismo de la glucosa. Los mecanismos

que componen el esquema de acoplamiento estmulo-secrecin estn ampliamente aceptados

y, en general, se dividen en dos grupos: primero estn los mecanismos proximales que

engloban la entrada y metabolismo de la glucosa y segundo los mecanismos distales don-

de entran en juego la generacin de la seal mitocondrial y la iniciacin de la actividad elc-

trica que desemboca en la secrecin de los grnulos de insulina [14] (ver esquema siguiente).

Estimulacin

por glucosa

Excitabilidad de

la membrana

plasmtica

SECRECIN DE

INSULINA

Entrada de glucosa a travs de

transportadores de baja afinidad y

alta capacidad (GLUT-2)

Glicolisis y metabolismo mitocondrial

Generacin de la seal mitocondrial

Aumento del

Ca2+

intracelular Reclutamiento y

exocitosis de los

grnulos de insulina

MECANISMOS

PROXIMALES

MECANISMOS

DISTALES

Introduccin

33

3.1.1. Metabolismo de la glucosa

Principalmente son tres las caractersticas que determinan el metabolismo de la glucosa

en las clulas . En primer lugar, el equilibrio de la concentracin de glucosa a ambos lados

de la membrana por la entrada de sta al interior celular a travs del transportador de gluco-

sa GLUT-2 (un transportador de baja afinidad y alta capacidad) [15]. Segundo, la fosforila-

cin de la glucosa por parte de la glucoquinasa (GK, hexoquinasa IV) de alta Km con el consi-

guiente gasto de ATP. Esto constituye lo que se denomin el sistema glucosensor, que permite

a la clula detectar las variaciones de glucosa en plasma y responder fisiolgicamente [16]. Y

tercero, el desarrollo de los siguientes pasos enzimticos de la gluclisis para producir piru-

vato, NADH, ATP y otros mediadores.

A pesar de que es sabido que el piruvato por s solo (y su forma permeable de membra-

na, metil-piruvato) no son estimuladores de la secrecin de insulina [17], s que se ha sugeri-

do que el metabolismo mitocondrial del piruvato es importante en el mecanismo de secre-

cin de insulina estimulada por glucosa. Las clulas podran expresar niveles bajos de la

lactato deshidrogenasa (enzima que cataliza la conversin de piruvato a lactato) [18, 19] y

esto impide el desvo del piruvato de las rutas metablicas mitocondriales [20], aunque esto

es todava un tema de debate. El piruvato entrara en la mitocondria (a travs del transporta-

dor de monocarboxilatos (MCT) [21] y activara el ciclo de los cidos tricarboxlicos (TCA o

ciclo de Krebs) generando ATP y poder reductor (NADH y FADH2). El NADH generado en

el citosol mediante la gluclisis sera transportado a la mitocondria por medio de los deno-

minados sistemas lanzaderas (lanzadera glicerol-fosfato y malato-aspartato), las cuales podran

jugar un papel importante en la regulacin de la secrecin de insulina, ya que el bloqueo de

ambas inhibe la respuesta celular a glucosa [22]. Tanto el poder reductor generado en el cito-

sol (NADH) y transportado al interior mitocondrial, como el generado en la mitocondria en

el ciclo de Krebs (NADH y FADH2) entran en la cadena respiratoria mitocondrial y activan el

transporte de electrones en los diferentes complejos que la conforman. A partir de ah se crea

un gradiente de H+ a ambos lados de la membrana mitocondrial interna que es aprovechado

por la ATP sintasa para generar ATP. Adems, la hiperpolarizacin de la membrana mito-

condrial interna por el bombeo de H+ fuera de la matriz mitocondrial estimula el uniporter de

Ca2+ dependiente de potencial que incrementara la concentracin de Ca2+ intramitocondrial;

esto podra favorecer el transporte de ATP hacia el citosol, aumentando as la concentracin

de ATP y el cociente ATP/ADP [23].

Introduccin

34

3.1.2. Otros nutrientes secretagogos

Existen evidencias experimentales que indican que no slo el metabolismo de la glucosa

es capaz de inducir una respuesta secretora, sino que otros nutrientes tambin poseen esta

capacidad.

As, se le llam nutriente secretagogo a aquella sustancia capaz de, a travs de su meta-

bolismo, generar suficiente energa como para estimular la secrecin de insulina. En 1981,

Malaisse y cols postularon la hiptesis del combustible, donde sealan que la respuesta se-

cretora de insulina a determinados nutrientes depende de su capacidad para aumentar la

produccin de ATP en las clulas [24]. Por lo tanto, adems de la glucosa, existen otras sus-

tancias que son capaces de inducir una respuesta secretora.

En este sentido, es sabido que algunos aminocidos juegan un papel importante en la re-

gulacin de la secrecin de insulina en las clulas pancreticas, aunque hoy da no est del

todo claro cul es el mecanismo molecular por el cual estos aminocidos ejercen este papel

[25]. Por ejemplo, existen aminocidos como la leucina capaces de inducir una curva mono-

fsica de secrecin de insulina, la cual se convierte en bifsica si se suministra simultnea-

mente con glutamina [26]. Esta estimulacin por parte de la leucina podra ser por dos meca-

nismos diferentes: el primero a travs de la transaminacin de la propia leucina para dar -

cetoisocaproato (KIC) y la consiguiente oxidacin mitocondrial de este ltimo y el segundo a

travs de una activacin alostrica de la glutamato deshidrogenasa (GDH), causando la

desaminacin del glutamato para dar el -cetoglutarato (intermediario del ciclo de Krebs). A

este segundo mecanismo se le dio una gran importancia por el descubrimiento de una forma

dominante de hiperinsulinismo congnito asociado a mutaciones en la GDH, donde la sensi-

bilidad a ser inhibido por GTP o ATP estaba disminuida [27].

As, algunos autores atribuyeron a la GDH un papel esencial en la secrecin de insulina

estimulado por glucosa y asumen que la enzima cataliza la reaccin enzimtica en el sentido

de produccin del glutamato, el cual fue propuesto como un mensajero mitocondrial que

asociaba el metabolismo celular con la secrecin de insulina [28]. Adems, estos mismos au-

tores en otro estudio sugirieron que los bajos niveles de GDH existentes en islotes de ratn

deberan explicar la no existencia de la segunda fase de secrecin de insulina comparado con

la predominante segunda fase observada en islotes tanto de humanos como de rata [29]. Esta

teora, sin embargo, ha sido rebatida en aos posteriores por otros trabajos, indicando que,

Introduccin

35

aunque la GDH s es capaz de trabajar en el sentido de produccin de glutamato, la direccin

predominante en condiciones fisiolgicas es la de oxidacin del mismo [27].

Por otra parte, tambin se ha demostrado que algunos -cetocidos como el -

cetoisocaproico (KIC), el -cetometilvalrico (KMV) o el -cetocaproico (KC), pueden actuar

como nutrientes segretagogos estimulando una secrecin bifsica de insulina [24]. En un tra-

bajo publicado por nuestro grupo [30], se demostr que estos -cetocidos de cadena ramifi-

cada inducan una respuesta secretora mediante la reaccin de transaminacin con el gluta-

mato catalizada por la BCAT (transferasa de aminocidos de cadena ramificada) para dar 2-

oxoglutarato (2-OG). Este 2-OG era a su vez transaminado por la GABA-T (GABA transami-

nasa) resultando en un incremento en el metabolismo del GABA, entrando de nuevo al ciclo

de Krebs mediante el semialdehdo succnico (SSA) y manteniendo as la generacin de ATP

necesaria para la estimulacin de la secrecin de insulina.

3.1.3. Mecanismo de secrecin dependiente de KATP (fase de iniciacin)

Se ha demostrado que la seal por la cual una concentracin de nutriente estimulante

incrementa la secrecin de insulina vendra dada por el metabolismo en las clulas y que

los canales de K+ dependientes de ATP (KATP) podran ser el nexo entre el metabolismo y la

actividad elctrica de estas clulas [31]. As, la elevacin de los niveles de ATP y como conse-

cuencia del cociente ATP/ADP, da lugar al cierre de los canales KATP que se encuentran en la

membrana plasmtica de las clulas , provocando una depolarizacin de sta y desencade-

nando la apertura de los canales de calcio dependientes de voltaje (VDCCs). La entrada de

Ca2+ aumenta la concentracin intracelular del catin, provocando la fusin de las vesculas

de insulina a la membrana y la consecuente secrecin de la hormona [32] (figura 4). Final-

mente, la apertura de los canales de potasio dependientes de voltaje (Kv) restablece los po-

tenciales de accin hasta su estado basal, limitando la entrada de calcio y cesando la libera-

cin de insulina [33].

Sin embargo, ha sido aceptado que un bloqueo de los canales KATP con sulfonilureas, as

como una depolarizacin de las clulas con una concentracin elevada de K+ que provoque

la apertura de los canales de Ca2+, sera suficiente para iniciar una respuesta secretora de in-

sulina [34]. Por lo que el aumento de la concentracin intracelular de Ca2+ es esencial para

que tenga lugar la fase de iniciacin de la respuesta y el responsable de la generacin de la

primera fase de secrecin.

Introduccin

36

Adems, es sabido que la prdida de la respuesta secretora en esta 1 fase parece jugar

un papel importante en la patognesis de la diabetes tipo 2 y por lo tanto el estudio de los

mecanismos que dan lugar a esta respuesta podran tenerse en cuenta para una posible res-

tauracin de tipo farmacolgico [35].

Figura 4. Esquema bsico del mecanismo de secrecin de insulina. El aumento del cociente ATP/ADP mediante el metabolismo de la glucosa tanto en el citosol (glucolisis) como en la mitocondria (oxidacin mitocon-drial) provoca el cierre de los KATP (canales de K+ dependientes de ATP) que da lugar a una depolarizacin de la membrana plasmtica. La apertura de los VCCD (canales de Ca2+ dependientes de voltaje) da lugar a la entrada de Ca2+ que provoca la exocitosis de las vesculas de insulina. GLUT-4 (transportador de glucosa), GK (gluco-quinasa) RE (retculo endoplasmtico).

3.1.4. Mecanismo de secrecin independiente de KATP (fase de amplificacin)

Se ha demostrado desde hace tiempo que la glucosa y determinados nutrientes a concen-

traciones estimulantes, son capaces de inducir una secrecin de insulina que muestra una

curva bifsica de liberacin (1 y 2 fase). Como se ha explicado anteriormente, una depolari-

zacin de las clulas de manera dependiente de los canales KATP mediante el metabolismo

de la glucosa, da lugar a una iniciacin de la respuesta secretora (1 fase). Sin embargo, la

Introduccin

37

aparicin de una segunda fase de secrecin ha sido un tema bastante estudiado por diversos

autores.

El trmino fase de amplificacin fue propuesto por Henquin [36] donde explicaba que,

adems de una fase de iniciacin, exista una fase que era independiente de los canales KATP

y que haba diversos mecanismos que relacionaban el metabolismo de ciertos nutrientes con

la regulacin de la secrecin de insulina sin que hubiera ms cambios en la actividad elctri-

ca de las clulas. Se ha estudiado la influencia de la glucosa sobre la secrecin independien-

temente de los canales KATP y se ha demostrado su capacidad para incrementar la secrecin

de insulina en islotes de ratn y rata depolarizados con KCl en presencia de diazxido y en

los cuales los canales KATP se mantenan abiertos farmacolgicamente [37, 38]. Adems, en

otro trabajo se demostr que la glucosa estimulaba la secrecin de insulina en islotes de ratn

que tenan noqueado el gen que codificaba para la expresin de los canales KATP, lo que indi-

caba la existencia de un mecanismo de secrecin independiente de estos canales [39].

Tambin se ha publicado que la glucosa potenciaba la secrecin de insulina inducida por

secretagogos no metabolizables (como la arginina o la tolbutamida) mediante dos mecanis-

mos: un aumento inicial del Ca2+ citoslico y una amplificacin de la respuesta al propio Ca2+

[41]. Y por lo tanto, el entendimiento de este mecanismo de potenciacin de la glucosa podra

ayudar a dilucidar las razones de las alteraciones en la secrecin de insulina en pacientes

diabticos tipo 2.

Ms recientemente, se ha descrito que la fase de amplificacin podra darse por dos me-

canismos diferentes: bien una amplificacin metablica en la que estaran implicados el ATP

u otros mensajeros como el cAMP, el NADPH, intermediarios del ciclo del cido ctrico, etc.,

bien una amplificacin neurohormonal mediante la activacin de la PKC o PKA por ACh

(acetilcolina) o GLP-1 (pptido similar al glucagn tipo 1) [40] (figura 5).

Introduccin

38

Figura 5. Representacin esquemtica de las fases de iniciacin y amplificacin de la secrecin de insulina. Curvas de secrecin de islotes de rata expuestos a KCl 70 mM o glucosa 20 mM. KATP: canales de K+ dependientes de ATP, VCCD: canales de Ca2+ dependientes de voltaje. : depolarizacin, PKC: protena quinasa C, PKA: protena quinasa A, ACh: acetilcolina, GLP-1: glucagn like peptide 1 (pptido anlogo al glucagn tipo 1) (adaptado de [40]).

3.2. Regulacin del mecanismo de secrecin

Como se ha explicado anteriormente, el ATP es el principal factor que desencadena el

cierre de los KATP y como consecuencia final, la liberacin de insulina. Sin embargo, el papel

exacto del ATP citoslico o mitocondrial en la regulacin de la secrecin de la hormona ha

sido todava un tema controvertido. En este sentido, se propusieron diversas hiptesis. Al-

gunos autores sugeran que las oscilaciones del Ca2+ que daban lugar a la secrecin de insuli-

na se deban a la produccin de ATP mitocondrial, ya que la elevacin del Ca2+ estimulaba el

metabolismo por activacin de las enzimas mitocondriales [42]. Sin embargo, otros trabajos

dieron ms importancia a la produccin de ATP en la glucolisis, ya que demostraban que

algunas de las enzimas glucolticas a partir de las cuales se genera ATP, podran modular la

Introduccin

39

actividad de los canales KATP necesarios para la respuesta secretora, probablemente por la

regulacin de los niveles de ATP localmente cercanos a estos canales [43].

Por otro lado, se han aportado datos que sealan que la produccin de ATP es insufi-

ciente por s sola para la regulacin fisiolgica de la secrecin insulnica y que la generacin

de otras seales mitocondriales podra ser importante para la respuesta celular a glucosa. En

este sentido se ha publicado que diversos productos anaplerticos (generados en la mitocon-

dria) como el malato, el citrato o el -cetoglutarato, podran ser exportados al citosol y po-

tenciar o mantener la respuesta secretora, aunque su mecanismo de accin es poco conocido

[44].

Se propuso adems que el glutamato podra ser un mensajero en las clulas , donde ac-

tuara como una seal de activacin de la secrecin insulnica [28], pero esta teora fue con-

trarrestada por otros trabajos que indicaban que algunos secretagogos (glucosa, leucina, me-

til ster del cido succnico, etc.) estimulaban la secrecin de insulina pero no aumentaban

los niveles intracelulares de glutamato. Adems, el incremento de la concentracin de dicho

aminocido por adicin de glutamina no incrementaba la respuesta insulnica [45].

Otros moduladores propuestos han sido: los acil-CoA de cadena larga, que podran po-

tenciar la secrecin de insulina a travs de la acilacin de protenas reguladoras o bien por

formacin de otros metabolitos como el diacilglicerol (DAG), implicado en la activacin de la

PKC, participando en la potenciacin de la segunda fase de secrecin [46]; el NADPH, equi-

valente formado en la reaccin de formacin de piruvato a partir de malato (por el enzima

mlico), donde la inhibicin de la formacin de este intermediario, reduca la secrecin de

insulina estimulada por glucosa [47]; el cAMP, que incrementara la secrecin en presencia

de glucosa a travs de la activacin de la PKA y cuyas oscilaciones modulaban la magnitud y

la cintica de la exocitosis de los grnulos [48].

Por lo tanto, existen mltiples evidencias que indican la implicacin de seales metab-

licas independientes de ATP que controlaran la secrecin de insulina. Es sabido adems que

una desregulacin de la respuesta secretora marcara la transicin de un estado pre-diabtico

a un estado hiperglucmico (diabtico), por lo que el entendimiento de los mecanismos de

regulacin dependientes o independientes de ATP facilitara el estudio y el desarrollo de

nuevas terapias para intentar paliar esta enfermedad.

Introduccin

40

3.3. Mecanismo de exocitosis de los grnulos de insulina

La activacin y consecuente apertura de los canales de Ca2+ dependientes de voltaje que

viene precedida de la depolarizacin de la membrana resulta en un aumento del Ca2+ intra-

celular que estimulara la exocitosis de los grnulos de insulina. Mientras que las variaciones

en el potencial de membrana estn claramente controladas por glucosa, la distribucin y exo-

citosis de dichos grnulos tambin estaran igualmente modulados por una respuesta a glu-

cosa fisiolgicamente apropiada [14].

Los grnulos de insulina, al igual que las vesculas secretoras de otros numerosos tipos

de clulas, se dividen en varios grupos (pool) funcionales dentro de las clulas , entre los

que se encuentran: un pool de reserva intracelular (90%), un pool anclados a la membrana

(docked- pool) (alrededor de un 10%) y un pool de liberacin rpida (RRP, readily releasable

pool) (0.3-0.2%), los cuales estn preparados para ser liberados [49]. El tamao de estos RPP

es el mayor determinante de la magnitud de la iniciacin de la respuesta secretora. Mientras

que a corto plazo, el cebado de los grnulos ya anclados acontecera en la liberacin de los

RPP, a largo plazo se dara una movilizacin de los grnulos de reserva desde el interior ce-

lular hasta su anclaje a la membrana. La respuesta exocittica inicial (primera fase de secre-

cin) se podra dar por un aumento del Ca2+ intracelular provocada por cualquier estmulo,

llevando a la liberacin de las vesculas ancladas a la membrana y las que estn ya prepara-

das. Seguidamente, se producira la fase de amplificacin (segunda fase de la secrecin) en la

que estaran involucrados nicamente nutrientes secretagogos metabolizables y que sera

dependiente de la movilizacin de los grnulos de reserva hacia la membrana plasmtica

[14].

Movilizacin de los grnulos de secrecin: Existen estudios de microscopa de fluorescen-

cia que demuestran que la segunda fase de secrecin de insulina resulta de la exocitosis de

los grnulos de insulina reclutados a la membrana plasmtica [50]. El movimiento de estos

grnulos puede ser estimulado por glucosa o por el propio ATP y por agentes que incremen-

ten los niveles de cAMP, donde se observa un aumento de la secrecin estimulada por gluco-

sa a partir de un mecanismo dependiente de la PKA (figura 6). Los mecanismos moleculares

por los que la PKA es capaz de acelerar la movilizacin de las vesculas hacia la membrana

plasmtica no estn del todo esclarecidos, pero se han aportado datos que indican que puede

ejercer una accin similar al que ejerce la protena sinapsina-1, controlando las interacciones

entre las vesculas y los microtbulos del citoesqueleto [51]. De hecho, es sabido que el des-

ajuste en la red que forman los microtbulos en el citosol puede interferir negativamente en

Introduccin

41

el movimiento de los grnulos y por tanto en el inicio de la respuesta exocittica [52]. En otro

trabajo publicado, se propone que los grnulos de insulina son transportados a lo largo de la

red microtubular de manera dependiente de ATP, probablemente por una protena motor

como es la miosina 5A, la cual a su vez es reclutada a los grnulos por protenas de unin a

GTP, como son las protenas Rab; por lo que estas protenas dependientes de GTP podran

tambin jugar un papel importante en la movilizacin de los grnulos a la membrana plas-

mtica [53].

Exocitosis de los grnulos de insulina: La regulacin de la maquinaria exocittica ha sido

estudiada extensamente en muchos trabajos. En general, se ha demostrado que la fusin de

las vesculas con la membrana plasmtica est mediada por las protenas SNARE (figura 6).

Estas protenas son complejos formados por las protenas de membrana SNAP-25 y sintaxina

y por la protena vesicular VAMP (sinaptobrevina). Adems, existe otra protena, la sinapto-

tagmina, que acta como un sensor de Ca2+ para que tenga lugar la exocitosis [54], por lo que

la interaccin de estas protenas SNARE con los canales de Ca2+ dependientes de voltaje es lo

que media un fino acoplamiento entre la entrada de Ca2+ y la exocitosis del pool de vescu-

las de liberacin rpida (RRP) [55].

Antes de que tenga lugar la exocitosis mediada por las protenas SNARE, se debe dar el

cebado y el anclaje de los grnulos de secrecin. Este cebado (priming) estara mediado por

variaciones de ATP y ADP (figura 6). Se ha descrito que el ATP sera esencial para el cebado

de estos grnulos antes de ser exocitados, aunque tambin las variaciones de ADP parecan

modular este proceso, implicadas en la activacin de la protena quinasa para el fosfatidili-

nositol-4-fosfato y en efectos sobre protenas activadoras de la secrecin dependientes de

Ca2+ [56]. Por otra parte, existen evidencias que demuestran que la acidificacin intravesicu-

lar por la ATPasa de protones tipo V (V-ATPasa H+) podra estar implicada de alguna manera

en el proceso de cebado de los grnulos. Mientras que las vesculas que estaban listas para

ser liberadas son capaces de ser exocitadas, la inhibicin de la acidificacin de los grnulos

podra impedir el relleno de los RRP y por lo tanto la exocitosis de dichas vesculas [57].

Por lo tanto, cambios en el cociente ATP/ADP generados metablicamente modularan

el tamao de los RRP, regulando etapas entre el anclaje de las vesculas a la membrana plas-

mtica y el cebado de los grnulos necesarios para la liberacin de insulina [14] (figura 6).

Cuando ya ha tenido lugar la exocitosis de las vesculas y por tanto, la secrecin de la in-

sulina, se lleva cabo el proceso de endocitosis de la membrana de dichas vesculas, que son

Introduccin

42

reabsorbidas por la clula. Se han descrito tres tipos de endocitosis que se podran dar des-

pus del proceso exocittico: la endocitosis kiss-and-run, donde el contenido de los grnu-

los es liberado a travs de un poro de fusin que es abierto reversible y transitoriamente du-

rante el proceso de exocitosis; la endocitosis de fusin completa, en la que la membrana de los

grnulos est integrada en la membrana completa y la membrana extra es recapturada a con-

tinuacin por un proceso endocittico mediado por clatrina; la endocitosis de semifusin,

donde se establece una apertura entre el lumen del grnulo y el espacio extracelular, conser-

vndose la estructura de dicho grnulo [58].

Figura 6. Mecanismo de exocitosis de insulina. El anclaje/fusin, cebado (priming) (mediado por varia-ciones en el cociente ATP/ADP) y la liberacin (mediada por Ca2+ y protenas SNARE) del pool de vesculas de liberacin rpida (RRP) determinara la fase de iniciacin de la respuesta (1 fase de secrecin de insulina). El pool de vesculas de reserva y su movilizacin (mediada por ATP, cAMP, protenas de unin a GTP, etc.) hacia la membrana dara lugar a la fase de amplificacin (2 fase de secrecin de insulina).

4. MECANISMOS DE COMUNICACIN INTERCELULAR

Desde hace millones de aos, los sistemas multicelulares han estado implicados en el

desarrollo de mecanismos de comunicacin clula-clula tanto de tipo elctrico como de tipo

qumico, donde las clulas individuales eran sensibles a la actividad de clulas adyacentes a

ellas y que con el tiempo fueron evolucionando a complejos que estaban regulados por sea-

les que difundan entre ellas [59]. As, en los mamferos, la mayora de las funciones endocri-

nas vitales son ahora dependientes de una funcionalidad propia de organismos multicelula-

res, donde existe un sistema de seales que se inicia presumiblemente por la difusin a tra-

vs de la membrana celular de pequeas seales moleculares mediante varios mecanismos

Introduccin

43

de comunicacin (dependientes de molculas de adhesin, integrinas, receptores, neuro-

transmisores, hormonas, iones, nucletidos, etc.) [60, 61].

Se ha publicado que las protenas transmembrana que podran estar implicadas en este

sistema de comunicacin podran ser de tres tipos. Conexinas, consistentes en 4 dominios

transmembrana unidos a dos loops extracelulares (con tres residuos de cistena bastante

conservados) y a uno intracelular y donde el dominio C-terminal y el N-terminal se encuen-

tran orientados hacia el citoplasma [62]. Inexinas, con una estructura similar a las conexinas,

salvo en la secuencia primaria de aminocidos y slo dos residuos de cistena en los loops

extracelulares [63]. Panexinas, similares a las inexinas, pero con una secuencia sensible a gli-

cosilacin en uno de los loop extracelular [64].

En varios estudios ha sido establecido que las conexinas pueden oligomerizar en forma

de hexmero formando lo que se ha denominado conexona, que podra acoplarse a otra clu-

la adyacente y permitir el paso de mltiples tipos de molculas citoslicas [62]. En el caso de

las inexinas, tambin podran oligomerizar para formar canales intercelulares [65], mientras

que las panexinas, aunque s oligomerizaran para dar panexonas, usualmente no formaran

estos canales, probablemente por la glicosilacin del residuo situado en el loop extracelular

[66]. Sin embargo, la formacin de los hexmeros en los tres tipos podran permitir la entrada

y salida de molculas citoslicas (sobre todo iones, aminocidos y nucletidos de adenina) al

medio extracelular, que podra ser esencial para la funcionalidad de las clulas [67].

Adems, la expresin de estas protenas sera fundamental para la mayora de los tipos

celulares, ya que han sido encontradas diversas mutaciones y polimorfismos (al menos en

cuanto a las conexinas) en los genes que codifican para dichas protenas que estaran asocia-

das a ciertas patologas [68].

4.1. Conexinas, conexonas (hemicanales) y gap junctions

Las conexinas son una familia de protenas que forman una serie de canales intercelula-

res permeoselectivos agrupados en dominios de membrana denominados gap junctions,

que median la difusin y el intercambio de iones y molculas citoslicas entre clulas adya-

centes, importante para el acoplamiento inico y metablico, respectivamente [69]. Estas pro-

tenas podran desempear adems otras funciones no requeridas en la comunicacin clula-

clula e implicadas en la formacin de hemicanales (conexonas) fuera de los dominios gap

junctions, en la regulacin especfica de expresin de determinados genes y/o en la interac-

cin con otras protenas tanto citoslicas como de membrana [70].

Introduccin

44

CONEXINAS:

Han sido encontrados 20 y 21 genes que codifican para las conexinas del genoma de ra-

tn y humano, respectivamente estando distribuidas en varios cromosomas. La nomenclatu-

ra usada las distingue en base a la especie de origen (m = mouse; h = human) adjuntado al

nombre de la familia proteica (Cx) y la masa molecular determinada por secuencias de

cDNA clonado. Por ejemplo, las protenas de 36 40 kDa, se nombraran Cx36 y Cx40, res-

pectivamente [71].

Son protenas altamente conservadas tanto en su secuencia polipeptdica como en su

topografa. Constan de cuatro dominios transmembrana unidos a dos loops extracelulares y

uno citoslico, que da lugar a una localizacin citoplasmtica de las dos regiones terminales

(-NH2 y COOH) y con tres residuos de cistena (Cys) en los loops extracelulares (figura 7).

Los cuatros dominios transmembrana estn tambin bastante conservados y forman -

hlices que contribuyen a la formacin de hexmeros y de un espacio hidroflico central que

formara el hemicanal. Adems, la regin NH2-terminal es similar en todas las Cxs y la

COOH-terminal difiere en la longitud y en la secuencia aminoacdica, lo que facilitara la

sntesis de anticuerpos especficos de isoforma [72].

Figura 7. Representacin bsica de la estructura molecular de las conexinas. Est compuesta por cuatro dominios transmembrana, tres loops (dos extracelulares con tres residuos de cistena (Cys) en cada uno y uno citoplasmtico que unen dichos dominios) y los extremos N-terminal y C-terminal con orientacin citoplasmti-ca (adaptado de [71]).

Se ha descrito que estas protenas pueden ser reguladas mediante fosforilacin por pro-

tenas quinasa (PKA o PKC) o fosfatasas, aunque existen Cxs que no son fosforiladas (Cx26)

y otras que son slo modificadas post-transduccionalmente bajo ciertas condiciones (Cx36)

Introduccin

45

[73]. Estas modificaciones estn a menudo asociadas a cambios en la conductancia y permea-

bilidad de los canales formados variando de forma dependiente de isoforma. Adems, estos

cambios podran afectar al ensamblaje, degradacin proteoltica y biosntesis de las conexi-

nas [74]. Por lo tanto, la fosforilacin de estas protenas podra contribuir a la regulacin de

su vida media, la cual se ha demostrado que es bastante corta comparada con la de otras pro-

tenas integrales de membrana [71].

CONEXONAS (HEMICANALES):

Durante el trfico a travs del retculo endoplasmtico y el aparato de Golgi, seis unida-

des de conexinas oligomerizan alrededor de un espacio hidroflico para formar una estructu-

ra tubular llamada conexona, de un modo que parece ser especfico de isoforma. Estos he-

xmeros de conexinas pueden ser homomricos (formados por un solo tipo de conexina) o

heteromricos (formados por varios tipos de conexinas) [75]. Una vez constituidos estos he-

xmeros, seran trasportados hacia la membrana plasmtica de la clula mediante vesculas

derivadas del aparato de Golgi a travs de los microtbulos, aunque se ha descrito que po-

dra ser tambin por fusin del retculo endoplasmtico con la membrana plasmtica [76].

Cuando estos hexmeros se insertan en la membrana celular y no se anclan con los de

otra clula adyacente, quedando expuestos al medio extracelular, se formaran los llamados

hemicanales (figura 8) [71]. Se ha demostrado que estas estructuras podran permitir el

intercambio de molculas citoslicas con el medio extracelular, sobre todo aminocidos, io-

nes y nucletidos de adenina (ATP y ADP) (figura 8), as como la captacin de marcadores

impermeables a la membrana [77]. Este flujo de molculas ha podido ser inhibido por drogas

bloqueantes de estos canales, por lo que podran ser una gran herramienta para estudiar su

mecanismo [78].

Aunque hoy da, la formacin de hemicanales funcionales de Cxs es un tema contro-

vertido, ya que existen trabajos que indican que ha sido difcil probar claramente su funcio-

nalidad [79], s que ha habido evidencias de que algunas isoformas de Cxs podran formar

estas estructuras en algunos tipos celulares como los oocitos de Xenopus Laevis a partir de

Cx46 y Cx50 [80] y otras variedades de clulas a partir de varias isoformas (Cx23, Cx26,

Cx30, Cx32, Cx35, Cx36, Cx37, Cx45 y Cx56) [71].

Introduccin

46

Figura 8. Representacin esquemtica de los hemicanales (conexonas) y movimiento de molculas citoslicas a travs de ellos. Oligomerizacin de seis unidades de conexinas (hexmero) alrededor de un espa-cio hidroflico central y anclaje en la membrana citoplasmtica. Cuando las conexonas se anclan a la membrana y no forman un canal intercelular con otra clula adyacente, se forman los hemicanales, que seran permeables a la difusin de ciertas molculas como iones, ATP, ADP o aminocidos.

Las propiedades biofsicas de los hemicanales han mostrado que adems de tener una

permeabilidad a ciertas molculas citoslicas, tambin la tienen para ciertos colorantes como

el ioduro de propidio, el Lucifer Yellow o la 6-carboxifluoresceina [81]. Su apertura es induci-

da por una depolarizacin de la membrana a niveles suprafisiolgicos (V > 40-60mV) y en

algunos casos adems activada por concentraciones bajas de iones divalentes (Ca2+, Mg2+) o

bajo condiciones isqumicas, lo que originara una prdida de molculas citoslicas [82, 83].

Por lo tanto, estas propiedades de los hemicanales podran servir como herramienta

de estudio para comprobar la relevancia de estas estructuras sobre las funciones celulares.

GAP JUNCTIONS:

Una vez formadas las conexonas y ancladas a la membrana plasmtica, cuando se pro-

duce una interaccin mediada por molculas de adhesin dependientes de Ca2+ con otra co-

nexona de otra clula adyacente, se forma un canal hidroflico intercelular que conectara los

citoplasmas de dos clulas y donde el espacio intercelular quedara reducido a un hueco me-

nor de 2-3 nm. La asociacin de varias de estos canales intercelulares forman las regiones

denominadas gap junctions [71] (figura 9).

Ha sido descrito que estos canales intercelulares son permeables, no slo a iones y nu-

cletidos, sino tambin a molculas ms grandes como metabolitos, cofactores, pequeos

pptidos, segundos mensajeros y hasta fragmentos de cidos nucleicos (molculas de hasta

Introduccin

47

1kDa de tamao), lo que sugerira un papel importante de estos canales en las demandas

metablicas de las clulas [84].

La difusin de las distintas molculas a travs de estos canales intercelulares suele ser

bidireccional y controlado por gradientes electroqumicos. Adems, su apertura podra estar

regulada, aunque todava no est del todo esclarecido su mecanismo [62]. No obstante, es

sabido que estn implicados en multitud de funciones, tales como el desarrollo embrionario,

la diferenciacin celular, el control de la migracin y divisin de clulas adultas, la transmi-

sin hormonal y sinptica, la sincronizacin mecnica y elctrica de las clulas, etc. [79].

Por otra parte, tambin existen evidencias de la existencia de una variedad de drogas

que son capaces de bloquear estos canales, la mayora mediante la incorporacin a la bicapa

lipdica de la membrana para actuar desde ah como un desacoplador qumico, as como mo-

lculas que potenciaran su funcionalidad.

Figura 9. Representacin esquemtica de las regiones gap junctions y movimiento de molculas citoslicas a travs de los canales intercelulares. La formacin de los canales intercelulares formados por la interaccin de las conexonas de dos clulas adyacentes y la asociacin de varios de ellos daran lugar a las llama-das regiones gap junctions Difusin de ciertas molculas como iones, ATP, metabolitos, pptidos, etc. (molcu-las con tamao menor de 1kDa) a travs de estos canales.

Introduccin

48

4.2. Comunicacin intercelular en islotes pancreticos

Est establecido que cada tipo celular que conforma los islotes de Langerhans tiene un

papel particular en relacin a la regulacin de la glucemia en sangre. Sin embargo, la funcin

de los islotes depende de la integracin de las respuestas de cada tipo celular y sus interac-

ciones y otros mecanismos de control [12].

Los islotes pancreticos poseen un sistema de seales de coordinacin inter e intracelu-

lar. Con el tiempo, este sistema ha evolucionado en una red compleja en la que las seales

difunden al espacio extracelular de stos e interactan con cascadas de sealizacin que de-

penden de protenas de membranas que se concentran en los contactos entre clulas [86].

Estos mecanismos median las comunicaciones islote-islote y clula-clula directas (depen-

dientes de molculas de adhesin, integrinas, receptores, etc.) e indirectas (dependientes de

neurotransmisores, hormonas, iones, nucletidos, etc.), imprescindibles para la correcta fun-

cionalidad de las clulas pancreticas [87].

Ha sido documentado en roedores y humanos que las protenas encargadas de la mayo-

ra de los acoplamientos celulares que tienen lugar en los islotes pancreticos son las conexi-

nas y que el establecimiento de las comunicaciones clula-clula sera esencial en el control

de la secrecin de insulina [88, 89].

En el contexto de las clulas pancreticas, diversos trabajos han identificado a la iso-

forma de 36 kDa (Cx36) como la protena predominante que forma los hemicanales y los

canales intercelulares que luego agrupados dan lugar a los dominios gap junctions [89].

4.2.1. Conexina-36. Generalidades

La Cx36 (el gen en humanos y en ratn est en los cromosomas 15q14 y Gjd2, respecti-

vamente) es una protena de 321 aminocidos con un largo loop citoplasmtico (99 aas) que

contiene 10 residuos de glicina (Gly) y una regin C-terminal que posee sitios de reconoci-

miento para protenas quinasas (casenas I y II, dependiente de cAMP y la dependiente de

calmodulina), indicando que esta conexina podra estar regulada por fosforilacin [71].

Adems, los canales formados por Cx36 podran estar regulados por pH, donde su actividad

sera inhibida por alcalosis ms que por acidosis en oocitos que expresan Cx36 [90].

Se ha descrito que la Cx36 no formara canales con otras isoformas de Cxs (canales hete-

rotpicos) pero s que lo hara de manera homotpica, permitiendo un acoplamiento metab-

Introduccin

49

lico entre las clulas pancreticas demostrado por el intercambio de molculas endgenas

como metabolitos fosforilados y nucletidos [91]. Existen adems evidencias que en clulas

neuronales y de la gla, las Cx36 podran formar hemicanales funcionales por los que se

podra liberar ATP al medio extracelular mediante una depolarizacin con una concentra-

cin de KCl 100 mM. Esta prdida puede prevenirse por bloqueantes de conexinas como el

cido flufenmico o derivados de la quinina, pero no por bloqueantes de panexinas como la

carbenoxolona. Adems, la reduccin de la expresin de Cx36 por siRNA (RNA silenciador)

reduca la cantidad de ATP liberado durante la depolarizacin [83].

Adems de la localizacin en islotes pancreticos, la Cx36 tambin se expresa en neuro-

nas del hipotlamo y la retina, donde estara implicada en el acoplamiento neuronal y la

transmisin sinptica y en clulas de la glndula adrenal, en las que la comunicacin interce-

lular sera necesaria para que tenga lugar la secrecin de hormonas endocrinas como las ca-

tecolaminas (norepinefrina y epinefrina) [71].

Existen evidencias de la importancia funcional de la Cx36, ya que se han identificado en-

fermedades genticas (sobre todo en humanos) asociadas con mutaciones y polimorfismos

de esta protena y con patologas adquiridas en las que estaba implicada. Por ejemplo, se ha

descrito que un polimorfismo simple en un nucletido de Cx36 puede estar asociado a la

epilepsia mioclnica juvenil [92] y que fenotipos de ratones KO o mutados podran dar lugar

alteraciones en la secrecin de insulina, en la transmisin retinal y en el acoplamiento inter-

neuronal en el sistema nervioso central [93].

4.2.2. Conexina-36 y su funcin en la clula . Implicacin en la secrecin de insulina

La secrecin de insulina y la mayora de las funciones de los islotes pancreticos son

procesos multicelulares que permiten una rpida regulacin hormonal necesaria para contra-

rrestar los cambios metablicos, particularmente con respecto a la regulacin de la homeos-

tasis de la glucosa. Por lo tanto, un control metablico apropiado implica una fina coordina-

cin de las funciones de la mayora de los islotes que forman el pncreas, as como de las

numerosas clulas (sobre todo las clulas ) que forman dichos islotes. Adems, la coordina-

cin entre clulas est implicada en una variedad de mecanismos de comunicacin clula-

clula tanto directa como indirectamente [88].

Como se ha comentado anteriormente, se ha identificado a la Cx36 como la principal

protena implicada en la formacin de los canales intercelulares que median la comunicacin

clula-clula en los islotes pancreticos [94, 95] (figura 10).

Introduccin

50

Figura 10. Cx36 expresada en islotes pancreticos de ratn. Deteccin inmunofluorescente de la Cx36 a partir del marcaje con un anticuerpo anti-Cx36 (C-terminal) policlonal de conejo. (Life Technologies cat. No. 36-4600).

Se ha descrito desde hace tiempo que las clulas pancreticas poseen muchas caracte-

rsticas similares a las neuronas como por ejemplo, la expresin de algunas molculas neuro-

especficas como el GAD o el GLUT-2, la respuesta a glucosa, la estimulacin por hormonas

o su excitabilidad. Estas similitudes han sugerido la participacin de los dominios gap jun-

ctions formados por Cx36 en la funcionalidad de las clulas al igual que en la clulas neu-

ronales [89]. Sin embargo, aunque en neuronas s que se ha comprobado la existencia de

hemicanales funcionales que podran estar implicados en la liberacin de ATP y aminoci-

dos como el glutamato, no hay evidencia de que la Cx36 forme estos hemicanales en clu-

las [96], aunque en este tema son escasos los trabajos publicados que puedan dilucidar la

existencia o no de este tipo de comunicacin entre el interior y el exterior celular y su impli-

cacin en el mecanismo de secrecin de insulina.

Diversos estudios han documentado que clulas aisladas poseen una liberacin de in-

sulina basal incrementada, una pobre o nula respuesta a glucosa, una expresin basal dismi-

nuida del gen de la insulina y una biosntesis de pro-insulina tambin disminuida. El resta-

blecimiento de los contactos entre clulas recuperaba parcialmente estas funciones [98, 99].

Similares conclusiones se observaron en islotes aislados expuestos a drogas bloqueantes de

los canales formados por Cxs, los cuales volvieron a mostrar una alteracin en la secrecin de

insulina inducida por glucosa que fue recuperada rpidamente despus del lavado de la

droga [100] (figura 11).

En un estudio realizado sobre ratones transgnicos knock out para el gen de la Cx36 [97],

sealan que los islotes pancreticos eran totalmente normales, pero sin embargo se caracteri-

zaban por su carencia de gap junctions en las clulas . Estas clulas no mostraban una sin-

cronizacin intercelular normal del Ca2+ intracelular propia de la estimulacin por glucosa en

Introduccin

51

B

las clulas que expresan la Cx36. As, los islotes carentes de esta protena tenan defectos en

la liberacin de insulina estimulada por glucosa y mostraban una liberacin basal de insulina

incrementada. Esta excesiva secrecin basal de insulina la argumentaban por el hecho de que

estas clulas desacopladas no podan ser inhibidas por clulas adyacentes mediante corrien-

tes inhibitorias, evento que s es observado en clulas acopladas de ratones control [101]. Sin

embargo, en un trabajo ms reciente se observa que esta secrecin basal de insulina es similar

en islotes de ratones KO-Cx36 y los ratones control [102], lo que podra sugerir futuros expe-

rimentos que pudieran aclarar esta controversia.

Figura 11. Efecto de la Cx36 en la funcionalidad de las clulas pancreticas. (A) Propiedades de las clulas cuando existe un acoplamiento dependiente de Cx36. (B) La delecin de la Cx36 o el bloqueo de los canales intercelulares conlleva alteraciones en la expresin y secrecin de insulina, en la sincronizacin del Ca2+, en la difusin de seales y una disminucin en la resistencia a condiciones citotxicas, incluyendo la posible exposicin de citoquinas diabetognicas.

Tambin se ha demostrado que un tipo de lnea celular tumoral secretora de insulina (c-

lulas MIN6, similares a las clulas pancreticas) expresan espontneamente la Cx36. En un

ensayo de transfeccin con un RNA antisentido de la Cx36, se inhibi la expresin de la pro-

A

Introduccin

52

tena y se produjo una disminucin de la respuesta a glucosa y a otros segretagogos, sugi-

riendo un papel importante de la Cx36 en la modulacin de la respuesta secretora. Adems,

en ensayos de oscilacin del Ca2+ citoslico se demuestra que la Cx36 no es necesaria para la

generacin del Ca2+ en clulas individuales, pero sin embargo s que es requerida para la

sincronizacin de estas oscilaciones a travs de toda la poblacin de clulas [103].

Por lo tanto, estos datos indicaran que las gap junctions formadas por estas conexinas

podran jugar un papel esencial en los mecanismos de control del acoplamiento entre el es-

tmulo y la secrecin inducida por glucosa y que la expresin de la Cx36 y la formacin de

los canales intercelulares debera ser un prerrequisito para una secrecin ptima de insulina.

Adems de la importancia de esta protena en la modulacin de la secrecin de insulina,

recientes observaciones han identificado seales dependientes de Cx36 que estaran implica-

das en la proteccin de las clulas contra diversos daos, como la apoptosis inducida por

citoquinas en el comienzo de la autoinmunidad de los islotes propia de la diabetes tipo 1

[104]. Esto podra sugerir que la Cx36 podra adems contribuir a la regulacin de la masa

celular, ya que se ha visto que el acoplamiento entre clulas est aumentado en periodos

prenatales, condicin asociada a un incremento en la proliferacin celular y una reduccin en

la apoptosis [105].

4.2.3. Conexina-36. Patologas y perspectivas en la Diabetes Mellitus

Como se ha comentado anteriormente, se ha atribuido un papel importante a la Cx36 en

la funcin de la clula , aumentado las posibilidades de que alteraciones en esta protena y

por lo tanto en la comunicacin intercelular, pudieran estar implicadas en la patognesis de

las disfunciones que dan lugar a la diabetes [88]. Datos experimentales en roedores han indi-

cado una plausible participacin de la Cx36 tanto en diabetes tipo I como tipo II.

Est descrito que la Diabetes Mellitus tipo I es una enfermedad autoinmune directamen-

te sobre las clulas y que resulta en un incremento desmedido de los niveles de citoquinas

pro-inflamatorias en el entorno de los islotes pancreticos. Existen experimentos in vitro e in

vivo que han comprobado que la Cx36 podra tener