INVESTIGACIONES ORIGINALES '7Revista de 1:1Fncuhad de Medicineljniversidnd Nacionul de Colombia1993 - Vol. 41 W2 (Pugs. 60-69)

Desarrollo y Pruebas de Campo de la Vacuna SinteticaContra la Malaria SPf66

• Ducror es Mauricio Rojas, Roberto Amador, Mario Alberto Posada y Manuel Elkin PatarroyoInstituto de Inmunologia, Hospital San Juan de Dios, Universidad Nacionalde Colombia, Santafe de Bogota.

De acuerdo a estadfsticas recientes de 1a Organizaci6nMundial de la Salud, se estirna que 2100 millones depersonas habitan en cerca de 100 parses donde lamalaria es una enfermedad endernica, afectando cercade 270 millones de individuos anualmente y siendo lacausa directa de par 10 menos dos millones de muer-tos al afio, especial mente de nifios menores de cincoarios de edad. Las medidas de control del vector y delparasiro con insecticidas y quimioterapia parecfan sersuficientes para la erradicacion, pero a 10 largo deltiempo se ha demostrado la poca eficacia de estasmedidas, hacienda que el desarrollo de una vacunasea esencial como un componente efectivo para elcontrol y erradicacion de la malaria especial mente enlos parses del tercer mundo.

Los primeros esfuerzos encaminados al desarrollo deuna vacuna contra la malaria, se Ilevaron a cabo en ladecada de 1940 y por los siguientes 40' ail as se hancentrado en el estudio de una vacuna contra losestadios pre-eritrocfticos del paras ito, especialmenteel esporozoito. Solamente el desarrollo de las tecnicasde cultivo en laboratorio del parasite a mediados delos setentas y a principios de los ochentas permitio elesrudio de los antigenos de los estadfos sanguineosasexuales y recienternente los anngenos de los esta-dios hepaticas, sangumeos sexuales y los mecanismosde interaccion del parasite can el globule rojo (21).

Desafortunadamente el desarrollo de la vacuna anti-malarica ha sido manejado mas par intereses economicas en el desarrollo intelectual que par la necesi-dad real de aquellas poblaciones a las cuales estariadirigida. Es par ella que la mayor parte de la inves-tigacion basica se lIeva a cabo en paises en los cualesla malaria no es un problema de salud. En los paisesdonde la malaria es endemica generalmente se carecede los recursos, la infraestructura y el conocimiento

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en las ciencias basicas para lIevar a cabo un proyectode esta naturaleza. Adicionalmente los escasos recur-sos econornicos, las malas condiciones de vfas e in-fraestructura de cornunicaciones, como 1a condicionesecologicas, hace que los metodos tradicionales dediagnostico y fumigacion no se implementen adecua-damente, 10 que ha lIevado a un aumento de la resis-tencia en las cepas del vector y del parasito a 10 largodel mundo.

Can estas consideraciones en mente, nuestro grupoinicio la mvestigacion en el area de la inmunologfa dela malaria a principios de la decada pasada, la cual haIlevado al desarrollo de la vacuna hfbrida polirnericay sintetica SPf66 cuyos ensayos de campo se hanrealizado en America, Africa y Asia.

La vacuna SPf66 es la primera generacion de vacu-nas, can eficacia demostrada en estudios de campo,que combina el concepto de multiantigenicidad ymultiestadfo,

EI camino para lIegar a estas conclusiones no ha sidofacil; es par eso que en esta corta revision queremoscan tar algunas de nuestras experiencias, que creemosxcon seguridad serviran a grupos futuros que tomeneste mismo camino.

Vacunas antimalartcas

Como es conocido, el parasite de la malaria presentaun cicio de vida muy complejo en dos diferentes hos-pederos, el hombre y el mosquito, en cada uno de loscuales pasa por diferentes estadios can caracterfsticasantigenicas diferentes (15, 16). Existen diferentespuntas en los cuales el sistema inmune puede atacaral paras ito, y cada grupo de investigacion en el mun-do ha centrado sus esfuerzos en uno de los estadospara desarrollar su vacuna.

DESARROLLO Y PRUEBAS DE CAMPO DE LA VACUNA SINTETICA

CONTRA LA MALARIA

Vacunas anti-esporozoito

Los esporozoitos son inyectados en la sangre, can lapicadura de mosquito, permaneeiendo en el torrentecirculatorio par escasos segundos antes de invadir alhepatocito. Los primeros logros para inducir una in-munidad protectiva se llevaron a cabo en los afios 40can la induce ion de proteccion a la infeccion en avesluego de la inmunizacion can esporozoitos irradiadoscan luz ultravioleta. Posterionnente los esposos Nus-sennsweig demostraron la generacion de una inmuni-dad protectiva en ratones luego de la inmunizacioncan esporozoitos irradiados de P. berghei.

Estos ensayos condujeron a la realizacion de los pri-meros ensayos de proteccion en humanos en 1975,lograndose proteccion en seis de los trece participan-tes. Can estos experiment as se hizo evidente que esposible inducir una inmunidad en el individuo suscep-tible, 10 que hace de este un metoda potencialmenteefectivo en el control de la enfermedad.

EI conocimiento de la biologia del paras ito hizo po-sible disecar al esporozoito en cada uno de sus com-ponentes antigenicos y conocer el papel de cada unode elias dentro de la biologia del parasite, Cerca del30% de la supcrficie del esporozoito esta confarmadopar la protcina CS, una rnolecula que posee una re-gion central inmunodominante que consta de 40 gru-pas de secuencias repetitivas de cuatro aminoacidos(Asn-Ala-Asn-Pro; NANP). Se han lIevado a cabovarios intentos de vacuna con estas secuencias; dosde elias en humanos (6, II, 17). EI primero utilizo larnolecula R32tep2' un antigeno recombinante (4) quecontiene treinta capias de la secuencia NANP acopla-da a la protema para la resistencia a la tetraciclina. EIsegundo ensayo se lIevo a cabo can (NANPb-TT,una molecula sintetica que contiene tres capias de lasecuencia NANP acoplada al toxoide tetanico. Enambos casas, y a pesar de general' una respuesta in-mune contra la molecula en los indi viduos vacunados,no se lagro conferir proteccion (19).

Vacunas contra los estadios hepaticos.

La fase hepatica dentro del desarrollo del parasito,conocido como estadio exoeritrocitico, ha sido pobre-mente caracterizado. Guerin-Marchand (10) ha repor-tado el clonaje del gen de una proteina especifica deeste estadio. Esta proteina contiene varias repeticio-nes compuestas par 17 aminoacidos. En el modelomurino, en los momentos iniciales del estadio hepa-tica se ha demostrado que el gamma interferon y losanticuerpos producen una inhibicion del desarrollodel panlsito dentro del hepatocito. 19ualmente, se hademostrado recientemente que los anlfgenos exoeri-

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trociticos especificos son real mente productos de de-gradacion de la proteina CS del esporozoito (12), Yque la inmunidad citotoxica generada par la inmuni-zacion con esporozoitos irradiados se conserva eneste estadio. En la actualidad se han identifieado lasprotefna LSA-3 y SALSA cuya importaneia biologicaesta siendo estudiada.

Vacunas contra los estadios sanguineosasexuales.

Cuando el merozoito invade al globule rojo se da ini-cio al cicio de replicacion que llevara a la generaci6nde ocho a veinte merozoitos hijos, los cuales even-tualmente Iisaran al globule rojo hospedero para in-vadir a los eritrocitos adyaeentes.

La vacuna contra los estadfos sangufneos asexualespretcnde estimular el control, pOI' parte del sistemainmune de los individuos, del nivel de parasites en lasangre, similar a 10 que ocurre en los habitantes deareas endernicas. Con una inmunidad parcial se lograun control de la parasitemia y a su vez un control dela sintomatologfa. Con la vacuna anti-esporozoito conporceruajes inferiores al 99% de inhibicion del ereci-miento del parasite, unicamente se logra postergarpar algunos dias la aparicion de la enfermedad, perosin lograr una reduccion de la severidad. Una vacunadirigida contra los estadfos sangumeos asexuales, cansolamente un 80% de la inhibicion del creeimiento,prolonga marc ada mente el tiempo de aparicion y laseveridad de la sintomatologia y el curso clfnico de laenfermedad. Can un 95% de inhibicion, se puede 10-grar una progresiva disminuci6n de la parasitemiacon una eventual resolucion de la infecci6n.

EI trabajo desarrollado pOI'Trager y Jensen (42) en eldesarrollo del cultivo continuo para los estadios san-guineos del Plasmodium jaiciparlllil ha permitido elaislamiento de grandes cantidades de merazoitos, per-mitiendo asf disecar los mecanislllos Illoleculares deinteraceion del parasito can el globulo rojo, al igualque ha permitido el aislamiento y purificaeion degran numero de protefnas. Uno de los antfgenos me-jar estudiados es el MSA-I (antigeno mayor de su-perfieie-I), tam bien conocido como la proteina 190kD, glicoprotefna 195, gp 185, PSA Y PMMSA (32)Este antfgeno es procesado durante la maduracion demerozoito a esquizonte, genen'indose asf la mayorcantidad de los antigenos de la superficie del parasito(13, 14). Durante fa invasion uno de los productos dedegradacion de MSA-I, la protefna de 83 kD, es ex-puesta par el parasito en la roptria, que es el elementode contacto del parasito can el globulo rojo. La loca-Iizaeion de la proteina de 83 kD aqui nos indica queesta jugando un papel activo dentro del proceso de

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1\'1.ROJAS Y cots.

intcraccion parasito-globulo rojo previa a la invasiona Ia celula roja. Los micas saimiri han desarrolladoinmunidad protectiva en ensayos en los cuaIes se hautilizado la protein a 195 kD (39). La protefna 83 kDpurificada 0 peptidos sinteticos derivados de la se-cuencia N-terminal, produjeron que los anticuerposespeefficos, detect ados por ELISA E IFI, que indu-jeron una proreccion parcial de los animales rerados(34). Otro de los productos de degradacion es la pro-teina de 19 Kd, cuya secucncia ha demostrado altahomologfa con los factores de crecimiento epidermal,y que en los ensayos iniciales en roedores ha indu-cido niveles de proteccion a Ia infeccion importantes.

La protein a de 42 Kd se encuentra en la superficie dela celula roja infectada. Existen evidencias que sugie-ren que esta proteina 0 SllS deri vados pueden desa-rrollar una inmunidad protectiva por 10 que han sidoextensamente utilizadas tanto en su forma nat ivacomo mediante la utilizacion de la proteina recorn-binante como con pepridos sinteticos en ensayos enani males induciendose una inmununidad pero estaconfiere proteccion limitada a la infeccion.

EI antigeno parasitario que aparece en la superficiedel eritrocito, "anngeno de superficie del eritrocito in-fectado con an illos" (RESA), ha sido investigado, yaque los anticuerpos dirigidos contra el antigeno, 10-gran prodllcir in vitro un alto porcentaje de inhibiciondel crecimiento del panisito. Se penso que RESA, sepodia lItilizar en el desarrollo de una vacuna, pero enlos ensayos en el modelo animal de los Aotus demos-tro grados parciales de proteccion (7).

Gtros antigenos que han sido candidatos para el de-sarrollo de lIna vacuna contra los estadios sanguineosasexllales, son las proteinas SERP (18) Y SERP-Ham bas de gran homologia y ricas en serina. Estudiosmoleculares adelantados con ambos antigenos sugie-ren que son precursores de proteinasas que son ac-tivadas por clivaje proteolitico. Para la proteina SERPse ha evidenciado el desarrollo de inmunidad protec-tiva en micos Saimiri (9).

Vacunas contra los estadios sanguineossexuales.

Las vacllnas que se desarrollen contra estos estadios,se han Ilamado vacunas bloqueadoras de la transmi-sian, las cuales no tienen ningun valor profilactico enel individuo inmunizado, pero si confieren protecciona la poblacion residente en las zonas endemicas yaque se previene la infeccion del mosquito luego de lapicadura en un individuo infectado, deteniendo asi elciclo de vida del parasito. Los anticuerpos monoclo-nales dirigidos contra las proteinas de los estadios

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sexuales, confieren inmunidad pasiva cuando son in-oculados en ani males infectados.

Otro tipo de vacunas

Las vacunas no-tradicionales estan siendo desarrolla-das en la actualidad, con reportes preliminares de lasprirneras fases de los ensayos clinicos (6). Mediantela rnanipulacion de la estructura terciara de los pep-tidos sinteticos (36) 0 mediante el desarrollo de nue-vos adyuvantes (41), dando la posibilidad de estimu-lar al sistema inmune e induciendo la liberacion dealtos niveles de citoquinas (38), que a Sll vez estirnu-Ian la produccion de 6xido nitrico el cual puede serresponsable de la fisio-patologia sisternica que ocurreen el individuo con malaria. La posibilidad de blo-quear estos exoantigenos con anticuerpos como ocu-rre en el caso de la difteria 0 el tetanos, permitiriadesarrollar una vacuna preventiva de la enfermedad ~mas no de la infeccion, 10que es la base de la vacunaanti-enfermedad como preventiva de la severidad dela infeccion, 0 alternativamente una vacuna contra elTNF.

Como se ve una vacuna contra un antigeno particularde cualquier estadio del parasite confiere solamenteuna proteccion parcial, es por eso que el concepto dela vacuna multiantigenica y multiestadio es necesarioen malaria. La vacuna SPf66 desarrollada por nuestrogrupo es la primera proteina hibrida polimerica y sin-tetica, en la cual se incluyen tres diferentes epitopesde proteinas de merozoitos intercalados con el motivoNANP de la proteina CS del esporozoito.

Desarrollo y pruebas de campo de la vacunaSPf66

Fase 0

Las fases iniciales de la investigacion se centraron enla determinacion de aquellas proteinas importantes enel proceso de desarrollo de una respuesta inmune pro-tectora. Para esto se procedio a partir de cepas deparasitos aisladas de pacientes malaricos, al ais-lamiento y purificacion de las proteinas 195, 155,liS, 112, 105, 97, 96, 95, 90, 83, 63, 60, 55, 54, 50,40, 35, 30 Y de 23 Kd de las cuales se purificaronentre 200 a 400 ug de cada una de ellas.-

En malaria existe el modelo del mico Aotus trivir-gatus el cual es altamente susceptible a la infeccionpor Plasmodium falciparum requiriendo de tratamien-to para sobrevivir a la infeccion. Las protein as ISS,I 15, 105, 90, 83, 60, 55, 50, 40, 35, 30 y 23 Kd,fueron inoculadas cada una en dos 0 tres animales entres ocasiones. Cada lIno de los animales fue retadocon un millon de globulos rojos infectados con mala-

DESARROLLO Y PRUEBAS DE CAMPO DE LA VACUNA SINTETICA

CONTRA LA MALARIA

ria. Luego del reto los animales inmunizados con laproteina 155 y 55 mostraron un retraso signifieativoen la aparicion de las parasiternias, sugiriendo unaproteccion parcial. Los ani males inmunizados con lasproteinas 83 Kd Y 35 Kd, no presentaron parasites ensangre 0 con parasitemias bajas que autocontrolaronla infcccion.

EI siguiente paso fue la sfntesis de 12 peptidos de laregion aminoterminal de las moleculas 35 Kd Y 55Kd Y diferentes peptidos que correspondieron al 47%de la molecula 83 Kd (20). Estos peptidos se aco-plaron a albumina bovina serica y Iueron utilizadospara inmunizar otro grupo de Aotus en cinco ocasio-nes. Al dia 90 los animales fueron retados con cincomillones de globules rojos infectados. La mayor partede los peptidos utilizados en el ensayo no mostraronninguna proteccion. Los peptidos 83.1, 35.1, 83.2,83.26, 83.18, 83.30 y 83.23 mostraron un retardo im-portante en la aparicion de los parasites en los ani-males inrnunizados, 10 que sugeria que cada uno deestos en forma individual solamente era capaz de ge-nerar una respuesta inrnune parcial (28). EI paso si-guiente fue el tomar un nuevo grupo de ani males einmunizarlos con mezelas de dos 0 tres peptidos quegeneraron una respuesta parcial. De los seis ani malesinmunizados con la cornbinacion de los peptidos 83.1,55.1 y 35.1 tres presentaron parasitemias leves y conun retardo irnportante en la aparicion de la parasite-mia y los tres restantes no desarrollaron ningun nivelde parasitos en sangre (29). Este mismo ensayo fuerepetido en 25 ani males de los cuales 18 fueron in-munizados con la mezela de peptidos y los siete res-tantes sirvieron de controles. De este grupo nuevepresentaron proteccion completa, cinco tuvieron para-sitemias leves que autoeontrolaron y los cuatro res-tantes se comportaron en forma similar a los contro-les.

Con toda esta informacion se disei10 la protein a hfbri-da, polimerica y sintetica SPf 66, la cual esta com-puesta por las secuencias de los peptidos 55.1, 83.1 Y35.1 intercaladas por la secuencia repetitiva deNANP, proveniente de la proteina CS de esporozoito.Su seguridad, inmunigenicidad y protectividad fuerondemostradas en los micos Aoilis donde no se obser-varon alteraciones histopatologicas ni alteraciones enlas pruebas de laboratorio e1inico en ninguno de losani males inmunizados con respecto al grupo control.

Fase 1

EI objetivo de esta fase es evaluar la tolerancia localy sistemica de la vacuna en el humano inmunizado,asi como las caracteristicas de la respuesta inmunegenerada por aquellos antigenos probados durante lafase 0 (43, 44).

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Para la seleccion de aquellos voluntarios que parti-ciparon en esta fase fueron irnportanres las siguientestres consideraciones: primero, la facilidad de la apli-cacion de las tres dosis y su subsecuente monitoreo.Segundo era irnportantc que se tratase de adultosmasculinos sanos y tercero debian provenir de areasno endernicas y sin antecedentes de exposicion al pa-rasito. POl' todas estas razones nuestro grupo decidioiniciar el trabajo con soldados de la Fuerzas Militaresde Colombia. Inicialmente, 109 soldados voluntariosingresaron al estudio, no se ofrecio ningun incentivoecon6mico 0 de promocion. Cad a uno de los vol un-tarios fue examinado por un medico para determinarsu salud ffsica y mental, y determinar los anteceden-tes medicos, quirurgicos 0 familiares de importancia.Quedaron solamente 30 del total de voluntarios parala siguiente fase, que consistio en una serie completade laboratorios que fueron, parcial de orina, quirnicasangumea, reeuento de celulas, determinacion de an-ticuerpos anti-merozoito por IFI (inmuno f1uores-cencia indirecta) y la presencia de autoanticuerpos,Finalmente 9 individuos fueron seleccionados para elreto.

Los voluntarios fueron divididos en cinco grupos:

Dos voluntaries con tres dosis de 2 mg/dosis de Sl'f66 los dias 0, 60 y 80; tres recibieron 2 dosis de 2mg/dosis de la misma molecula los dias 0 y 60, tresvoluntarios que sirvieron de controles se les aplicosolucion salina los dias 0, 20 y 45 Y un voluntariosirvio de receptor nativo para hacer el pase de la cepade P. jalciparllll1 con la cual se efectuo el reto.

Cada uno de los vacunados fue retado can la inocu-lacion intravenosa de un millon de globulos rojos in-fectados con P. falciparulI1 provenientes del volunta-rio en el cual se realizo el pase de la cepa.

Los resultados de esta fase mostraron que la vacunaes bien tolerada, presentandose ocasionalmente algu-nas reacciones locales menores. NillgUI10 de los vo-luntarios presento alteraciones significativas en elcuadro hematico, la quimica sanguinea y el parcial deorina en los dias -I, I, 3 y 5 despues de cadainmunizaci6n. Todas las pruebas de autoinmunidadfueron sistematicarnente negativas (factor reull1atoi-dec, anticuerpos antinueleares, test de Coombs y an-timiocardio).

Los estudios de la cinetica de la respuesta inmune hu-moral y celular, analizada a partir de muestras de san-gre tomadas los dias -I y 15 y prereto, se realizal'Onmediante la tecnica del ELISA convencional, lItilizan-do como antigeno la mokcula SPf 66 y ensayos deIinfoproliferacion con celulas mononuclares peri fe-

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ricas. Todas las pruebas fueron negativas en eJ pre-inmune y a partir de la prirnera dosis y hasta com-plerar el esquema de vacunacion se observe un in-cremento importante tanto en los utulos de anticuer-pas como en los indices de proliferacion celular (23).

Fase II

Fase IlA. Durante esta fase la eficacia de la inrnu-nidad protectiva conferida par la aplicacion de la mo-lecula SPf 66, fue evidenciada a traves del reto, me-diante la aplicacion de un millen de globules rojosinfectados en individuos sin antecedes de exposici6nal parasite, quienes recibieron el esquema de vacuna-cion. Esta rase del desarrollo de la vacuna se realizebajo una estricta supervision medica que incluia ladisponibilidad de una unidad de cuidados intensivos.Nosotros elegimos el Hospital Militar Central de Bo-gota, 10 cual fue aceptado por las fuerzas militares ypar el cornite de Etica constituido par el ministerio deSalud Publica de Colombia.

Cad a uno de los soldados voluntarios fue inoculadocon un millen de globules rojos infectados can unacepa salvaje de P. faiciparum. Cada una de las for-mas infectantes tiene la capacidad de generar 16 me-rozoitos que son Jiberados al torrente circulatorio. Acada voluntario, para determinar la parasitemia, se Ietom a control de gota gruesa y naranja de Acridinacada 12 horas. Siernpre permanecieron bajo cuidadosmedicos y de enferrnena las 24 horas del dia. Cuandolos niveles de parasitemia subfan por encima 0.5 % seinicio tratamiento igualmente cuando fue por ellossolicitado, como fue el caso de uno de los individuosinmunizado can la molecula SPf 66.

La Tabla I muestra el desarrollo de las parasitemiasde los vacunados. De los cinco vacunados can SPf66,tres se protegieron, uno se retiro en la mitad del es-tudio y solamente uno requirio tratamiento. La efica-cia de la vacuna mostro una tendencia cercana al 75%(30).

Fase lIB. De acuerdo a las guias proporcionadas parla OMS, la eficacia de la vacuna debe ser en say adapar exposicion natural al panisito en areas endemicas.Para esta fase del estudio, 399 voluntarios hombres,entre 18 y 21 arias pertenecientes a la Fuerzas Ar-madas de Colombia, fueron escogidos. De estos, 85fueron vacunados can el poHmero hfbrido sinteticoSPf66 y los restantes, 214 indi vi duos, sirvieron comocontroles. Los soldados, quienes ten ian muy pac a ex-posicion previa al parasito, estaban en misiones depatrullaje en una vasta area endemica en la costaPadfica de Colombia. Esta area presenta un indiceanual parasitologico (API) de 12 +/- 2%, can una in-cidencia de 80 - 90% de P. ji:l!ciparull1.

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Los voluntarios vacunados fueron cuidadosamentemoniroreados, y cualquiera que desarrollara sfntomasfebriles fue evacuado al centro de salud regional paraque se Ie hicieran exarnenes cltnicos y de laboratorio.Las gotas gruesas de estos individuos fueron ciega eindependientemente leidas par los miembros del cen-tro medico de la base de infanteria de marina de Tu-maca y par los microscopistas del servicio de erra-dicacion de la malaria (SEM) de Turnaco. Los resul-tados fueron confirmados par el personal del labora-torio central de control de calidad del SEM enSantafe de Bogota, quienes confirmaron a descartaronel diagn6stico original.

Para evaluar la seguridad de Ia vacuna, a cada uno delos voluntarios se les llevo a cabo un examen clinicodetail ado a la primera hora dcspues de la inmuniza-cion, y luego a las 24 y 48 horas despues de la inmu-nizacion y se realizaron pruebas de autoinmunidad yqufrnica sanguinea, para cada vacunado 10 dfas des-pues de cada inmunizacion, Los resultados demues-tran que no existe ninguna diferencia estadistica cuan-do se comparan los grupos control y vacunados, yque la eficacia de la vacuna fue caJculada en 82.3%contra P.[alciparum y 60.6% contra P. vivax (I).

La cinetica de produccion de anticuerpos IgG contrala vacuna SPf66 fue establecida en un estudio para-lela. Se via que el nivel de estos anticuerpos se in-crementaba 15 a 30 dias despues de la segunda y ter-cera dosis, mostrando claramente un efecto de refuer-zo despues de la tercera dosis. Se demostro tambien,par Western blots, que los anti cuerpos recanodanprotein as nativas del panisito. Sin embargo, la res-puesta no fue igual en todos los individuos. Despuesde la segunda inmunizacion, se observo par FAST-ELISA un patron caracteristico de la respuesta IgG,mediante el cual los vacunados se clasificaron en tresgrupos. EI primer grupo, los altos respondedores, pre-sentaron titulos de anti cuerpos que variaban entreI: 1.600 y I :25.600. Un segundo grupo de responde-dares intermedios presento titulos entre 1:200 y1:800, Y un tercer grupo, los bajos respondedores, endonde se clasificaron todos los individuos can titulosmenores a I: 100 (37).

Un estudio posterior mostro una distribucion bimodalde estos anti cuerpos en la poblacion vacunada, sugi-riendo un control genetic a de la respuesta inmune aesta proteina. Par esta razon se lIevo a cabo la tipifi-cacion de los alelos HLA A, B, DR Y DQ de 105individuos vacunados y 47 controles (31). La distri-bucion de los aiel as DQ y DR de los altos respon-dedores fue similar a la del grupo control. Sin embar-go, la poblacion de indi viduos HLA DR4 dentro del

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CONTRA LA MALARIA

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Desarrollo de las Parasitemias Post-Reto en Voluntarios Vacunados(Porcentaje de Parasitemias en los Dias Post-Reto)

Voluntaries Vacunados con Srf66

5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

W.B. 0 0 .007 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0W.G. .036 .(l02 .289 0 .368 .006 .120 .166 .094 .072 .001 0 .020 .030 0 .020 0L.C .034 0 .142 .002 .465 006 .175 .013 .242 NO .020 .116 .064 0 0 0 0O.A. .010 .011 .400 .007 0 .014 - - - - - -J.C .(l06 0 .171 .002 2.150* - - - - - - -

Controles

A.C .032 .007 .270 0 1.600*J.D. .033 .005 .870 .017 4.260*CB. .120 0 2.300*J.E. .100 .010 3.600'

* Voluntarios tratados con droga antimalarica

Tabla 1. Parasitemias de voluntarios vacunados can tres dosis de la vacuna SPj66. EI dia del reto los volun-tarios fueron inoculados par via intravenosa can una cepa silvestre de P. [alciparum. Los globulos rojos injec-tados fueron obtenidos de un voluntario control en quien la cepa habra sido previamente inoculada. £1 inoculainyectado consistia en un milton de eritrocitos infectodos can anillos del panisito diluidos en 4 1111de solucionsalina. Las parasitemias se determinaron cada 12 horas a partir del tercer dfa par gota gruesa teiiidas C017

coloraciones de Giemsa, Field y Naranja de Acridina. s/oluntarios C017 parasitemias mayo res al 0.5%recibieron tratamiento inmediato can cloroquina, seguida de sulfadoxina y pirimetamina. Debido a su excelentecondicion clinica, J.D. no fue tratado sino 24 horas despues que el nivel de parasitemia alcanzo el 0.5%.

grupo de los bajos respondedores (68%) se incrernen-t6 significativamente cuando se compare con el grupocontrol (36.2%) y el grupo de los altos respondedores(25%). Utilizando metodos de oligotipificacion des-pues de la amplificacion del exon DR4 B-1, se pro-cedio a la subtipificacion de 20 voluntarios DR4 cla-sificados como altos, intermedios 0 bajos responde-dores. No se hallo correlacion entre el subtipo DR4 yla respuesta inmune de los vacunados (24).

Por 10 tanto, nuestro grupo decidio investigar si laresrriccion generica a la vacuna se encontraba pre-sente a nivel del receptor de celulas T (RCT). Veinreclones de celulas T fueron analizados, 12 de los cua-les correspondian a voluntarios clasificados como al-tos respondedores, y los ocho restantes como bajosrespondedores. Se encontraron preferencias especifi-cas y para los arreglos Variable Beta (VB) del RCTen cada uno de los grupos. EI VB ha sido asociadocon el proceso de reconocimiento del antfgeno, y va-rios reportes han demostrado asociaciones preferen-ciales de ciertos genes VB como respuesta a antfge-nos especificos. Nuestros resultados muestran que losclones de celulas T de los altos respondedores se aso-cian preferiblemente con los rearreglos VB 8, aunquetambien con los genes 2, 5, 6 y 7. En contraste, losclonos de c.olulas T de los bajos respondedores no in-volucran ninguno de los genes asociados con los altos

respondedores. Se encontro que expresaban principal-mente los genes VB 10, y con una frecuencia masbaja, los genes VB 3 y II (25). Los mecanismos mo-leculares involucrados en esta restriccion genetica es-tan siendo actual mente estudiados por nuestro grupo(5, 22).

Los siguientes ensayos de fase lIB fueron nuevamen-te lIevados a cabo por nuestro grupo en soldados jo-venes y voluntarios provenientes de zonas no ende-micas, quienes fueron Ilevados a patrullar areas ende-micas despues de inrnunizacion. EI objetivo de estosestudios fue definir el numero de dosis requeridas, elintervalo entre las aplicaciones de cada dosis, la con-centracion de la vacuna y el adyuvanle a utilizar. Losresultados de los ensayos de Tumaco A, B, C Y 0muestran que, en nuestras manos, el mejuf esquemade inmunizaci6n para los adultos consistfa en tres do-sis de la vacuna (en los dias 0, 30 y 180), cad a unocon 2 mg del polimero sintetico SPf66 absorbido a Img de hidroxido de aluminio (35).

Debido a que los estudios de campo previos habfansido lIevados a cabo con numeros pequenos de in-dividuos originarios de areas no endemicas, se planeoun estudio bajo condiciones nub representativas, conindividuos residentes en areas endemicas. Se escogioel municipio de Majadas, en el estado de Bolivar, en

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el oriente de Venezuela, para este estudio. EI area esendemica para P . [alciparuni, can un IPA de 22%, yuna formula parasitaria de 55% para P. [alciparum.Siguiendo las consideraciones eticas, se decidio noexcluir ningun individuo mayor de II afios (exceptolas mujeres embarazadas) que manifestara el deseo derecibir la vacuna. 976 habitantes fueron inmunizadostres veces con la vacuna SPf66, y el resto de la po-blacion (938) se tomo como un grupo control. EI ob-jetivo inicial era evaluar cualquier cambia en las ea-ractcristicas epidemiol6gicas de la poblacion vaeuna-da al compararla con el grupo control, y describir ladiferencia en los efectos de la vacunaci6n. Ningiinotro grupo de investigacion habfa reportado un estu-dio de campo tan grande utilizando peptidos sinteti-cos como vacunas, y como consecueneia no existfanexperieneias previas, salvo 1a nuestra, y muy pocasgufas internacionales de etica medica para vacunascontra la malaria. sobre las cuales disefiar un proto-colo de vacunacion. Los resultados prelirninares in-dican que la vacuna es, como esperado, atoxica e in-rnunogenica para la mayorfa de la poblacion y al rea-lizar un analisis estadfstico de casos y controles seobserva una proteccion contra la infeccion por P. [al-ciparum de 60% (datos sin publicar).

Antes de poder aplicar la vacuna indiscrirninadamentea individuos de cualquier edad, se llevo a cabo unestudio en ninos entre I y 14 anos, habitantes de lazona rural de Tumaco, Colombia (27). 94.6% de losninos que recibieron las tres dosis de la vacuna nomostraron ningun tipo de reaccion secundaria atribu-fble a la vacuna. EI resto, 12 ninos, presentaron reac-ciones locales leves que no persistieron en chequeossubsecuentes. No se detecto ninguna reaccion adversaen los 62 ninos que se evaluo un ano despues de laprimera dosis. EI suero obtenido de estos ninos 20dfas despues de la tercera inmunizacion muestra queel 93.7% desarrollo altos tftulos contra la vacuna, va-riando entre I: I00 Y I en 12:800. En ambos estudios,la reactividad a las protefnas nativas fue alta, como sepresencia por Western Blot, especialmente contra lasprotein as de 135, 115 Y 83 kDa. Los resultados deestos estudios establecen, fuera de toda duda, la in-munogenicidad y seguridad de la vacuna SPf66. Caneste resultado, el grupo se sintio confiado en lIevar acabo un estudio grande con una vacunacion uni versal,aunque se excluyo a las mujeres embarazadas. 9.957personas, todas elias mayores de un ano, habitantesde la municipalidades de Tumaco y Francisco Piza-rro, fueron vacunadas con tres dosis de la vacuna ba-jo el esquema previamente establecido. 95.7% de losvacunados no presento reacciones adversas a la va-cuna. En el restante 4.3% la induracion local y eleritema fueron las reacciones mas frecuentes. De un

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grupo de vacunados escogidos al azar, los tftulos deanticuerpos anti-SPf66 fueron medidos por FAST-ELISA, demostrando que el 55% de estos individuospresento titulos por encima de I: 1.600. Es interesanteanotar que en este estudio las mujeres de edad fenilmostraron el mas alto mirnero de reacciones adversas.Nosotros creemos que una cornbinacion entre los sis-temas inmune y endocrino en las mujeres causa estosefectos indeseados (2). Este aspecto necesita ser me-jor esrudiado en futuros ensayos.

Fase III

Como resultado de una reunion celebrada en Bogota,Colombia, entre nuestro grupo de investigacion y elgrupo consultor de la OMS (40), se via la necesidadde iniciar ensayos doble ciego placebo bajo diferentescondiciones epiderniologicas de malaria. Estos se es-tan lIevando a cabo en conjunto con otros grupos deinvestigacion internacionalmente reconocidos, en Co-lombia, Venezuela, Ecuador, Brasil, Tanzania, Gam-bia y las Filipinas, los cuales involucran entre 500 y30.000 personas. Se observa una eficacia de la vacu-na cercana al 70% aplicada a diferentes poblaciones,e inclusive a subgrupos distintos dentro de una mismapoblacion, debido a las inherentes diferencias en elestado inmune de cada individuo, el mecanismo detransrnision e intensidad de la enferrnedad, las dife-rentes cepas del parasite, etc. Por esta razon es esen-cial Bevar a cabo estudios duplicados bajo diferentescondiciones epidemiologicas.

Algunos de los aspectos de la manera como se hanconducido estos estudios, y que son el resultado denuestra previa experiencia en ensayos de campo,merece ser mencionada.

Determinacion de la poblacion a estudiar: Inicial-mente, varias localidades son escogidas en las coalesse puede conducir los estudios, de acuerdo a criteriostales como el comportamiento de la enfermedad du-rante los anos previos, los indices malariometricos(IPA para P. falciparllm y P. vivax), los coales nece-sitan ser suficientemente altos para que se pueda ob-servar una diferencia entre los grupos vacunados ycontrol, la infraestructura de la localidad, el acceso, eldeseo de la comunidad de panicipar en un ensayo deesta naturaleza, etc. Es un hecho ampliamente cono-cido que, para muchas areas remotas en los paises deSur America, los casos de malaria son altamente sub-registrados. Por esta razon, en muchos casos nuestrogrupo, a el grupo que Beva a cabo la vacunacion,escogio la localidad que mejores registros Bevara, conel animo de determinar una linea de base epidemio-logica adecuada. Sin embargo, como en algunos casosesta informacion no se encontraba disponible, nos

DESARROLLO Y PRUEBAS DE CAMPO DE LA VACUNA SINTETICA

CONTRA LA MALARIA

vimos obligados a hacer proyecciones que semejaranla realidad basad os en esta informacion incompleta.

Con los Ifderes de la comunidad nosotros determina-mos la importancia que los habitantes daban a la en-fermedad. Debe notarse que Colombia es Ifder en losprogram as ampliados de inmunizacion (PAl) organi-zados por la OMS, y por 10 tanto la vacunacion esvista por la mayoria de las comunidades de manerapositiva. Una vez que alguna de las localidades se se-leccionaba, los trabajadores sociales, en contacto es-trecho con los Ifderes de la comunidad, lograban laparticipacion de la comunidad entera. La importanciade los trabajadores sociales y su interaccion con lacomunidad no debe ser subestimada. Estos indivi-duos, habian tenido entrenamiento extensivo en mala-ria, al igual que en las caracterfsticas socioeconorni-cas.

Para el estudio de La Tola en el departamento de Na-rifio, se tornaron ocho localidades, en la rivera del rioLa Tola. Para Agosto de 1990 se deterrnino la pobla-cion en 2942 habitantes (mujeres el 52.2%). Los in-dicadores malariornetricos mostraban un IPA de 19.2x 1000 habitantes desde 1984 con un incremento para1989 de 130.4 x 1000 habitantes.

EI estudio fue aleatorizado, doble ciego placebo. Losvoluntarios recibieron las tres dosis los dias 0, 30 y180. Cada dosis era de 2 mg de la rnolecula SPf66absorbida a I mg de gel de hidroxido de aluminio, enun volumen final de 0.5 ml. EI grupo control recibioen la primera dosis toxoide retanico y en las siguien-tes hidroxido de aluminio en solucion salina.

La deteccion de los casos se realizo en forma con-tinua durante un afio luego de la adrninistracion de latercera dosis, mediante la combinacion de biisquedapas iva y biisqueda activa. La busqueda activa fue rea-lizada por el personal del estudio mediante la visita acada una de las casas mensual mente y una verifica-cion visual de cada uno de los individuos vacunadosy la toma de la temperatura para la deteccion de uncaso febril. Se tomo gota gruesa a cada individuo contemperatura igual 0 mayor a 37.5'C

Rev Fac Med UN Col 1993 Vol41 N° 2

La deteccion de casos en forma pasiva se realiz6 atraves de cuatro puestos de control local izados en elarea de estudio. estos puestos son atendidos por cola-boradores voluntarios de la comunidad. EI episodiode malaria se definio entre la asociacion de signosc1inicos unidos al diagnostico rnicroscopico de lasformas asexuales de P. [alciparum 0 P. vivax.

EI total de laminas positivas para P. [alciparum fuede 168 dentro de los 738 vacunados y de 297 en los810 del grupo control. EI estimativo crudo de la efi-cacia fue de 38.8%. Las eficacias variaron segun elgrupo de edad de uno a cuatro anos 77 .2, de cinco anueve 23.9, de 10-1423.5, de 15-4421.8, de mas de45 fue de 67.

Un segundo estudio fase III que ya se finalize, se rea-lizo en la localidad de la T, una comunidad rural, al-tamente endernica para malaria en la provincia de Es-meraldas, al nor-oriente del Ecuador. Para este estu-dio fueron inmunizados aleatoriamente 468 indivi-duos de ambos sexos mayores de un afio, con la rno-lecula SPf66 y con solucion salina, con el esquema 0,30 y 180, quedando final mente 230 con la moleculaSPf66 y 237 del grupo control. La deteccion de loscasas se realize en forma similar a la realizada en laTola, Tumaco. La proteccion a la infeccion por P.[alciparum para este estudio dio una eficacia de66.8% (3).

Con los resultados obtenidos en estos estudios decampo se confirmo que la molecula SPf66 es pro tee-tiva contra la malaria producida por P. [alciparum. enuna poblacion seminmune de una area malarica. Poresto la vacuna SPf 66 es la primera generacion de lasvacunas rnultiantigenicas, multiestadio y sinreticacontra la malaria e igualmente la primera para con-trolar una infeccion parasitaria en los humanos, 10que constituye en una nueva herramienta para lascarnpaiias de control y erradicacion de la malaria denuestros parses del tercer mundo e igualmente seconstituye en un ejemplo de las capacidades can quecontamos para solucionar nuestros propios problemas.

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