UNIVERSIDAD POLITECNICA SALESIANA

NOMBRE: Xavier CadenaFECHA: 2014-05-20NIVEL: 6to “A”

El plásmido TiLos plásmidos Ti son plásmidos de DNA circular de doble cadena y de gran tamaño (200-800 Kb).

En un plásmido de este tipo (Figura 1) podemos distinguir:

o Un origen de replicación que le permite mantenerse de forma estable en la bacteria.

o La región vir que está constituida por distintos genes de virulencia (hasta 25 descritos); dos de ellos (virA y virG), de expresión constitutiva y necesaria para la activación transcripcional de otros genes como virB, virC, virD y virE.

o La región de transferencia (T-DNA) delimitada por dos bordes (de 24-25 pares de bases) que se conocen como borde derecho (RD; right border) y borde izquierdo (LD; left border) que están muy conservados entre los distintos plásmidos Ti. En esta región se localizan un grupo de genes (iaaM, iaaH e ipt) que codifican enzimas para la síntesis de auxinas y citoquininas (hormonas vegetales implicadas en la división y otros procesos del desarrollo vegetal) y algún gen de síntesis de opinas como el gen ocs que codifica la octopina-sintasa, el gen nos que codifica la nopalina-sintasa o el gen acs que codifica la agropina-sintasa.

o Genes que codifican enzimas para el catabolismo de las opinas que se sintetizan y que le sirven de alimento a la bacteria.

Figura 1. Estructura de un plásmido Ti

ADN de Transferencia (T-DNA)

La introducción de genes o la modificación de los genes intrínsecos de la planta utilizando métodos de transformación genética se conoce como transformación genética y puede realizarse con distintos fines, entre ellos, la mejora vegetal y el estudio de la función génica.

Entre los métodos de transformación genética disponibles, la transformación mediada por la bacteria A. tumefaciens es el más extendido. A. tumefaciens actualmente clasificada como R. radiobacter, es una bacteria Gram negativa que está en el suelo y que es capaz de infectar a numerosas especies de plantas dicotiledóneas y a algunas monocotiledóneas y gimnospermas. Tras la infección, es capaz de transferir una parte de la información genética que contiene en un plásmido y de integrarla en el genoma de la planta. Al plásmido se le conoce como plásmido Ti (inductor de tumores) y a la región que se transfiere como T-DNA (DNA transferido).

Como consecuencia de la infección por A. tumefaciens se producen en la planta tumores que son consecuencia de la expresión de genes de síntesis de auxinas y citoquininas que están en el T-DNA. Además de estos genes, también se transfieren otros presentes en el T-DNA que codifican la síntesis de opinas (nopalina, octopina, manopina, agropina). Las opinas son el resultado de la condensación de un aminoácido y un cetoácido. Estos compuestos no los metaboliza la planta y sirven a la bacteria como fuente de carbono y nitrógeno.

El hombre ha modificado los plásmidos de esta bacteria patógena de plantas para utilizarlos como vectores de inserción de genes de su interés como por ejemplo, un gen que confiera resistencia a insectos.

La transferencia del T-DNA

La transferencia del T-DNA al genoma de la planta es un proceso complejo conocido sólo en parte. Para que se de este proceso es necesario que estén presentes los bordes flanqueantes del T-DNA, los genes vir (activados) y también otros genes codificados por el cromosoma bacteriano (i.e. ros, ivr) que son necesarios para que se realice la unión de la bacteria a la célula vegetal dañada.

De una manera muy simplificada podemos decir que la transferencia se produce así. Los compuestos fenólicos como por ejemplo la acetosiringona que generalmente exuda la planta como consecuencia de una herida, son reconocidos por virA que se autofosforila en un residuo de histidina específico y que se transmite posteriormente a virG, siendo éste el que activa la transcripción de otros genes vir. Los productos resultantes de la activación del gen virD; VirD1 (topoisomerasa) y VirD2 (endonucleasa), realizan dos muescas en la cadena de DNA en la zona comprendida entre los bordes del T-DNA. Tras el corte, VirD2 permanece covalentemente unida al extremo 5’ de la hebra de DNA impidiendo la delección de este extremo. El DNA de simple cadena que se libera se recubre por proteínas VIRE2, que protegen al DNA de la degradación por nucleasas a la vez que lo dirigen hacia el genoma de la célula vegetal. En el transporte a través de la membrana bacteriana están implicados los productos del operón virB. En algún momento del proceso, el T-DNA es convertido a su forma bicatenaria y el hueco que queda monocatenario en el plásmido Ti es reparado por sistemas celulares. La bacteria produce un pillus (tubo proteico) a través del cual es conducido el T-DNA (“T-strand”) al citoplasma celular. Además de los genes presentes en el plásmido Ti, se han descrito distintos loci cromosómicos que también afectan a la expresión de los genes vir y son partícipes del proceso.

La integración del T-DNA en el genoma de la planta se realiza aparentemente al azar, aunque parece ser que con mayor probabilidad en aquellas zonas ricas en genes y en regiones transcripcionalmente activas. El proceso de transferencia no es del todo preciso puesto que es frecuente la inserción de la zona que contiene el extremo 5’ pero no es raro encontrar el extremo izquierdo acortado.

Vectores para la transferencia de genes de interés

A partir del plásmido Ti se han desarrollado distintos vectores que permiten su utilización para la transformación de plantas con el fin de introducir genes de nuestro interés.

En general, el primer paso para el desarrollo de estos vectores ha sido la eliminación de los oncogenes (genes responsables de la formación de tumores) de los plásmidos Ti. A los plásmidos resultantes se les denomina desarmados. Normalmente, además de eliminar los genes que codifican enzimas para la síntesis de hormonas vegetales, se eliminan aquellos que codifican opinas.

A partir de los vectores desarmados se pueden construir distintos tipos de vectores que podríamos dividir en dos bloques:

Vectores cointegrados. Se obtienen vía recombinación homóloga entre el plásmido desarmado y otro preparado en el laboratorio (Figura 2A). Este último será el portador de un T-DNA que contendrá el gen de interés (i.e. un gen que codifique una proteína que confiera resistencia a insectos) y, en la mayoría de los casos, otro gen que facilite la selección de las células transformadas (i.e. un gen que confiera resistencia a un antibiótico).

Vectores binarios. En este caso, el plásmido de laboratorio se elabora de manera que contenga una región portadora de los bordes derecho e izquierdo y entre ambos, los genes de interés (como en el caso anterior en la mayoría de construcciones, el gen de interés y otro de selección). Este plásmido se introduce en una cepa de Agrobacterium que contiene un plásmido desarmado es decir, que no contiene los genes de su región de transferencia. De este modo, la bacteria es portadora de dos plásmidos de pequeño tamaño (Figura 2B). Puesto que la transferencia del T-DNA puede realizarse en trans, los genes vir del plásmido desarmado se encargarán de realizar el corte y la transferencia del T-DNA del plásmido elaborado.

Plásmido Ti Plásmido desarmado

Plásmido portador de los genes de interés

A B

Figura 2. Representación esquemática de una bacteria portadora de un plásmido cointegrado (A) y de un plásmido binario (B).

Esquema

Agrobacterium tumefaciens = Rhizobium rizobacter

Plásmidos Ti

Origen de replicación

Región de virulencia

T-DNA:

- Borde derecho y borde izquierdo

- Genes involucrados en la síntesis de hormonas vegetales

- Genes para la síntesis de opinas Genes de

catabolismo de opinas

Plásmido desarmados

Plásmido portadores de los genes de interés

Vectores cointegrados

Vectores binarios

Aplicaciones Del Plásmido Ti

El plásmido Ti ha sido el principal impulsor de la ingeniería genética en plantas. Gracias a su empleó se ha conseguido multitud de variedades transgénicas. Continuamente, se han realizado modificaciones en el plásmido Ti con objeto de mejorar sus características como vector. Habitualmente se añade uno o más genes resistencia a antibióticos, y se elimina el T-DNA no esencial, y los genes que codifican el desarrollo del tumor. Se mantienen genes necesarios para la infección de la célula vegetal. También se ha insertado el T-DNA en el plásmido pBR32 de Escherichia coli y en otros plásmidos para producir vectores de clonación capaces de desplazarse entre bacterias y plantas. El gen o los genes de interés se empalman en el t-DNA entre las repeticiones directas, mediante empleo de enzimas de restricción y ligasas. A continuación, se introduce el plásmido en Agrobacterium tumefaciens, se seleccionan por resistencia a antibióticos las bacterias que incorporan el plásmido, y se infectan con la bacteria células en cultivo de la planta a transformar. La bacteria se elimina empleando una mezcla de antibióticos y se seleccionan los transformantes en función de su resistencia a antibióticos o herbicidas (u otro rasgo codificado por el t-DNA). Finalmente, se regeneran plantas completas a partir de las células en cultivo, mediante la utilización de auxinas y citoquininas que estimulan la producción de callos y brote. El motivo de eliminar el t-DNA no necesario, es porque las fitohormonas para las que codifica, pueden interferir en la regeneración de plantas.

Otra técnica consiste en emplear un sistema binario con dos plásmidos. Uno de los plásmido porta las secuencias necesarias para la integración al genoma se encuentran en los bordes del T-DNA, pudiendo ser reemplazado el resto de la secuencia del T-DNA. El otro plásmido. Denominado Helper, porta los genes de virulencia (vir) responsables de la transferencia del T-DNA, actúan en trans, por lo que no tienen que estar situados en el mismo plásmido que el T-DNA, por lo que no es oncogénico pero es capaz de transferir el T-DNA presente en otro plásmido.

Un plásmido vector que contiene los bordes del T-DNA. Este plásmido es pequeño y de fácil manipulación en E. coli para el clonado de secuencias. No presenta los genes para la producción de fitohormonas ni opinas. Presenta sitios de restricción múltiples dentro de los bordes del T-DNA para el clonado de secuencias. Contiene también un marcador para la selección de las células transformadas, como por ejemplo, resistencia a kanamicina, herbicida o marcador metabólico.

Independientemente de emplear uno o dos plásmidos, se suelen construir genes en tándem con la información deseada, precedidos de un promotor. Fraley y col, en 1993, trabajando para Monsanto, usaron como marcadores genes que otorgaban resistencias a determinadas sustancias. Estos genes se introducían en el ADN-T, junto con los genes deseados para la planta transgénica. Así, podían ver cuales eran las células transformadas. Destacan los genes de resistencia a kanamicina, carbenicilina y a higromicina. Las células vegetales que sobrevivían al ataque de estas sustancias, eran en las que se confirmaba una transformación.

Uno de los marcadores más usados hoy en día, es el gen β-glucuronidasa (GUS). Se extrae de Escherichia coli. Dicho gen codifica para una enzima que, al degradar un galactósido, aporta pigmentación azul. Las células que experimenten el cambio de color, serán las transformadas.

Otro ejemplo de marcador que induce cambios de color, es la proteína fluorescente verde. Se obtiene de la medusa Aequorea victoria. Esta proteína se codifica en presencia de oxígeno, lo que hace bastante sencilla la identificación de los vegetales transformados.

El uso de discos foliares se volvería un método estandarizado. Fue diseñado en 1985, por Horsch, para la compañía Monsanto. Consiste en introducir discos de hojas de tabaco en un cultivo con Agrobacterium tumefaciens en un medio LB (caldo Luria Bertoni). Se agita para asegurar la infección. Después los discos se colocan en medios de cultivo que sustancias que estimulan la aparición de brotes. Luego se exponen los discos a un medio selectivo, para eliminar las plantas no transformadas.

De todos modos, no se puede afirmar al 100% que todas las plantas resistentes, han sido transformadas. Cabe la posibilidad de que la planta ya fuese resistente per se al agente elegido como marcador. Las pruebas genéticas serán las encargadas de desvelar cuales de las plantas resistentes son realmente transgénicas. Para confirmarlo, se emplean Southern, Northern y Western. Así se confirma que hay ADN, ARN y proteína, producto de la inserción. El uso de GUS como marcador, si garantiza que los discos que tornan su coloración a azul, son realmente transgénicas.

Cromosomas Artificiales Bacterianos BACs

El cromosoma artificial bacteriano, o BAC (bacterial artificial chromosome), es un vector usado para clonar fragmentos de ADN de 300 kb de tamaño medio. Se distinguen dos tipos:

Los BACs propiamente dichos, están basados en el plásmido factor-F (factor de fertilidad) encontrado de modo natural en la bacteria Escherichia coli. Este factor es un episoma que puede integrarse en el cromosoma bacteriano y es responsable de la conjugación bacteriana.

Los PACs (P1-derived artificial chromosome), son cromosomas artificiales

bacterianos derivados del fago P1, alojan menos cantidad de ADN pasajero que los BACs.

Un PAC típico consta de:– Dos secuencias pac, son secuencias repetidas protuberantes que permiten el

empaquetamiento in vitro. – Dos secuencias lox que intervienen en la circularización del vector. – Un origen de replicación (ori). – Un gen marcador de resistencia a la canamicina (kanr). – Un gen marcador sac implicado en el metabolismo de la sacarosa, que está

interrumpido con un sitio de clonaje múltiple (MCS).

De forma natural el bacteriófago P1 sólo presenta un sitio lox, pero en el PAC se han insertado dos regiones lox. En el interior de E. coli, la enzima recombinasa reconoce los sitios lox y produce la circularización del ADN situado entre éstos.

Para la selección de las moléculas PAC recombinantes se usan cepas de E. coli sac–, es decir, cepas que no pueden crecer en presencia de sacarosa. Esto es debido a que en el metabolismo de la sacarosa se produce un levano, que resulta tóxico para estas bacterias. Dentro del gen sac se encuentra un polylinker con dianas de restricción. Cuando se introduce una molécula de ADN recombinante el gen sac queda interrumpido, las bacterias no sintetizan el levano tóxico y pueden crecer con normalidad. Pero aquellas bacterias que no poseen vectores recombinantes mueren, puesto que, el gen sac se expresa con normalidad y se produce el compuesto tóxico.

Para el empaquetamiento in vitro de los PACs se usan extractos de empaquetamiento del fago P1 y enzima pacasa. La pacasa reconoce los extremos pac y permite el empaquetamiento del vector en las partículas fágicas. Dentro de la cápside del fago el vector se encuentra en forma lineal, pero cuando se introduce en la bacteria, ésta sintetiza recombinasa, y se circulariza la molécula.

Un BAC propiamente dicho incorpora insertos, normalmente, de 300 kb, pero se ha conseguido clonar fragmentos de hasta 1 Mb. Presenta genes procedentes del plásmido F:

– oriS: origen de replicación. – rep: control de la replicación del plásmido. – parA, parB, parC: genes implicados en el mantenimiento de un número bajo

de copias (1 o 2) del plásmido en la bacteria. Fundamentos de Genética Aplicada 27

Además, tiene otros genes que no proceden del factor-F:– cmr: gen de resistencia al cloranfenicol. – Minigen lacZ con un polylinker (MCS) en

su interior. Se usa para el ensayo de alfa-complementación, del mismo modo que ocurre en el plásmido pBluescript. A ambos lados del minigen lacZ hay una diana de restricción de la enzima NotI, esta restrictasa se usa para desinsertar el ADN pasajero.

– lox: sitio reconocido por la enzima recombinasa, permite linealizar el vector.

Procedimiento de clonación: en primer lugar, se corta el vector con BamHI para linealizarlo, y se añade fosfatasaalcalina para desfosforilar los extremos 5' del vector, y evitar autoligación. Después, se hace una digestión parcial del ADN que se quiere clonar con la enzima Sau3A, la cual genera extremos compatibles a los de la enzima BamHI, y se lleva a cabo la reacción de ligación de ambas moléculas de ADN. Para la transformación de las bacterias se emplea la electroporación. Este método consiste en la aplicación de un campo eléctrico que produce poros transitorios en la membrana citoplasmática de la bacteria, a través de los cuales puede introducirse el BAC.

La selección de los clones se hace en un medio con cloranfenicol, con IPTG y con

X-gal. Las bacterias que resisten el antibiótico son las que han incorporado el BAC, las colonias que presentan color azul son aquellas cuyo vector no tiene ADN exógeno, y las colonias blancas tienen BACs recombinantes.

Bibliografía

http://www.porquebiotecnologia.com.ar/?action=cuaderno&opt=5&tipo=1&note=18

http://www.agro.uba.ar/users/jgori/Clases/IG.pdf

PERERA, J., TORMO, A., GARCÍA, J.L. “Ingeniería Genética” Vol.II. EditorialSíntesis, Madrid 2002.