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REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA
FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS
MAESTRÍA EN MICROBIOLOGÍA
SUSCEPTIBILIDAD Y RESISTENCIA A FLUOROQUINOLONAS Y OTROS ANTIMICROBIANOS EN CEPAS DE AEROMONAS AISLADAS
DE PACIENTES PEDIÁTRICOS.
Trabajo de Grado presentado ante la División de Estudios para Graduados de la Facultad Experimental de Ciencias para optar al
grado de Magíster Scientiarum en Microbiología
Autor: Lcda. María Gabriela Matos V.
Tutor: Dra. Zoraida. Medina.
Maracaibo, marzo 2011.
SUSCEPTIBILIDAD Y RESISTENCIA A FLUOROQUINOLONAS Y OTROS ANTIMICROBIANOS EN CEPAS DE AEROMONAS AISLADAS DE PACIENTES PEDIÁTRICOS.
Autor: Lcda. Maria G. Matos V. C.I: 15.009.076
Dirección: Urbanización Rosal Sur, calle 43, Casa Número: 12-70.
Teléfono: 0414-6061506.
Correo electrónico: [email protected] Firma: _______________ Tutor: Dra. Zoraida Medina. CI: 5.713.774
Teléfono: 0414-6192289.
Correo electrónico: [email protected] Firma: _______________
DEDICATORIA
A mis padres por ser los mejores padres del mundo! A mi hermosa familia.
A ti mi amor, mi Esteban!
AGRADECIMIENTOS
A Dios todopoderoso y su Madre por ser la guía en mi camino. A toda mi familia por compartir y apoyar este sueño.
A todo el personal del Centro de Referencia Bacteriológica del Hospital Universitario
de Maracaibo, por brindarme su apoyo cuando más lo necesite.
Al Prof. Armindo Perozo Mena por su excelente tutoría y ayuda incondicional.
Al Prof. Osiris Castejon por sus grandes aportes estadísticos.
A la Dra. Zoraida Medina por su excelente tutoría y apoyo.
A todos mis especiales amigos por siempre compartir todos estos retos!
3
ÍÍNNDDIICCEE DDEE CCOONNTTEENNIIDDOO
Pág.
Dedicatoria 1
Agradecimiento 2
Índice de Contenido 3
Índice de Figuras 5
Índice de Tablas 6
Resumen 8
Abstract 9
Introducción 10
Objetivos 17
Marco Teórico 19
Reseña Histórica 19
Distribución Mundial 20
Descripción General del Género 20
Taxonomía 21
Factores asociados a la Virulencia 25
Proceso de Infección 37
Respuesta Inmunológica 37
Epidemiología y significado clínico de Aeromonas 38
Susceptibilidad antimicrobiana en Aeromonas 44
Mecanismos intrínsecos (cromosómico) y adquiridos de resistencia a
betalactámicos en Aeromonas 45
Mecanismos de resistencia a fluoroquinolonas en Aeromonas 51
Metodología 54
Localización 54
Población 54
Criterios de Inclusión 54
Criterios de Exclusión 55
Muestras 55
Aislamiento e Identificación de Aeromonas 55
Determinación de la Susceptibilidad 61
Detección fenotípica de Betalactamasas de Espectro Extendido (BLEE) 64
Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) para Ácido 67
4
Nalidíxico y Ciprofloxacina por el método de dilución en agar
Análisis Estadístico 76
Resultados y Discusión 77
Conclusiones 94
Recomendaciones 96
Índice de Anexos 97
Anexos 98
Referencias Bibliográficas 105
5
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Estructura de pared celular de Gram. negativo 28
Figura 2. Estructura del flagelo 30
Figura 3. Proceso de Infección asociado a Aeromonas 37
Figura 4. Oxidasa positiva de Aeromonas en agar Nutritivo 57
Figura 5. Tipos coloniales de interés en las placas 58
Figura 6. Combinación de TSI - LIA y Oxidasa positiva en agar nutritivo en
placa de una colonia de interés 58
Figura 7. Combinaciones de interés de TSI y LIA para Aeromonas 59
Figura 8. Pruebas Bioquímicas para la identificación definitiva de especies
de Aeromonas 60
Figura 9. Plantilla para detección de BLEE 64
Figura 10. Betalactamasa de espectro Extendido (BLEE) 65
Figura 11. Preparación del Inoculo para cada cepa de Aeromonas 71
Figura 12. Diluciones 107 UFC/ml de las cepas de Aeromonas 71
Figura 13. Placas inoculadas para las diversas concentraciones de los
antibióticos y sin antibiótico (control de crecimiento) 72
Figura 14. Lectura de la CIM de las cepas de Aeromonas para Ácido
Nalidíxico y Ciprofloxacina 73
Figura 15. Resultados Negativos para el método de sinergia del doble
disco en la detección de BLEE 86
Figura 16. Resultado sugestivo para AmpC inducible 86
6
ÍNDICE DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Eventos significativos en la evolución de Aeromonas como género
relacionado a enfermedad en Humanos 19
Tabla 2. Actuales Genomoespecies y Fenoespecies del Género Aeromonas 23
Tabla 3. Aeromonas asociadas a Enfermedad en Humanos 24
Tabla 4. Patrones de susceptibilidad del género Aeromonas 44
Tabla 5. Esquema de Clasificación Funcional y Molecular de Betalactamasas 47
Tabla 6. Pruebas Bioquímicas empleadas en la identificación definitiva de
especies de Aeromonas de importancia clínica 60
Tabla 7. Antimicrobianos probados para Aeromonas de interés clínico 62
Tabla 8. Halos de Interpretación para los sensidiscos empleados 63
Tabla 9. Halos de Inhibición esperados con las cepas control ATCC. 66
Tabla 10. Puntos de corte en la interpretación de la CIM para Acido
Nalidíxico y Ciprofloxacina 75
Tabla 11. Distribución de especies de Aeromonas aisladas de pacientes
pediátricos con síntomas gastrointestinales únicos y/o cuadros asociados en
el período global de estudio
77
Tabla 12. Distribución de cepas de Aeromonas por edades en el período
global de estudio 79
Tabla 13. Total cepas de Aeromonas aisladas versus síntomas Diciembre
2008- Agosto 2009 80
Tabla 14. Total cepas de Aeromonas aisladas de pacientes pediátricos por
mes en el período de estudio 81
Tabla 15. Susceptibilidad y Resistencia in vitro por especies de Aeromonas
aisladas en el período de estudio 82
Tabla 16. Susceptibilidad y Resistencia in vitro de los 52 aislados clínicos de
las especies de Aeromonas para el período de estudio 84
Tabla 17. Cepas con resistencia a Betalactámicos y Fluoroquinolonas 88
Tabla 18. Porcentaje de la Concentración Inhibitoria Minima para el Ácido
Nalidíxico en las cepas de estudio 89
Tabla 19. Porcentaje de la Concentración Inhibitoria Minima para
Ciprofloxacina en las cepas de estudio 89
Tabla 20. Correlación entre la susceptibilidad cualitativa y cuantitativa para la 92
7
Ciprofloxacina (Fluoroquinolona)
8
Matos Villalobos, María Gabriela. SUSCEPTIBILIDAD Y RESISTENCIA A FLUOROQUINOLONAS Y OTROS ANTIMICROBIANOS EN CEPAS DE AEROMONAS AISLADAS DE PACIENTES PEDIÁTRICOS. Trabajo de Grado presentado para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología. La Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. División de estudios para graduados. Maestría en Microbiología. Maracaibo, Venezuela, 2011. p. 114
RESUMEN
La infección causada por especies del género Aeromonas ha venido en aumento; así mismo han sido considerados como patógenos emergentes sobretodo en pediatría. A pesar de las controversias existentes en cuanto a la capacidad de producir brotes y su correlación con la clínica, se ha podido establecer su importancia a este nivel; aunado a esto se ha estudiado su susceptibilidad antimicrobiana. El objetivo de esta investigación fue estudiar la susceptibilidad y la resistencia a fluoroquinolonas y otros antimicrobianos en cepas de Aeromonas aisladas en muestras fecales de pacientes pediátricos en edades de 0 a 5 años del Hospital Universitario de Maracaibo, Estado Zulia durante el período diciembre 2008 - agosto 2009. Se realizó la identificación microbiológica descrita por Janda y Abbott (1998), Murray y colaboradores (2007); el estudio cualitativo (Kirby-Bauer) y cuantitativo (Método de dilución en agar) de la susceptibilidad según lineamientos del CLSI para este género. Aeromonas se aisló en un 7,6% de las muestras; la especie predominante fue A. caviae (48,1%); el mayor número de aislados se dio en pacientes menores de 1 año (61,5%), en su mayoría con síntomas exclusivamente gastrointestinales (63,5%), a su vez, se obtuvo el mayor porcentaje de aislamientos en el mes de marzo (30,8%). Las cepas fueron sensibles a la mayoría de los betalactámicos, se detecto la presencia sugestiva de una betalactamasa cromosòmica inducida por betalactámicos típica de Aeromonas. La resistencia para ácido nalidíxico por la concentración inhibitoria minima fue 26,9%; mientras que un tanto menor para ciprofloxacina (15,4%), denotándose una posible falla terapéutica del uso de fluoroquinolonas en estos pacientes. Las betalactamasas presentes en Aeromonas determinarán un giro en la terapia empírica para la diarrea de etiología bacteriana. Palabras Claves: Aeromonas, Aeromonas en pediatría, susceptibilidad y resistencia en Aeromonas, resistencia a quinolonas y fluoroquinolonas.
Correo electrónico: [email protected]
9
Matos Villalobos, María Gabriela. SUSCEPTIBILITY AND RESISTANCE TO FLUOROQUINOLONES AND OTHER ANTIMICROBIALS IN AEROMONAS STRAINS ISOLATED FROM PEDIATRIC PATIENTS. Trabajo de Grado presentado para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología. La Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. División de estudios para graduados. Maestría en Microbiología. Maracaibo, Venezuela, 2011. p. 114
ABSTRACT
The infection caused by Aeromonas species has been increasing, they have also been considered as emerging pathogens especially in pediatrics. Despite the controversies regarding the ability to produce outbreak and its correlation with the clinic, its importance has been established at this level, coupled with this has been studied their antimicrobial susceptibility. The objective of this research was to study the susceptibility and resistance to fluoroquinolones and other antibiotics in strains of Aeromonas isolated in fecal specimens from pediatric patients aged 0-5 years of Hospital Universitario de Maracaibo, Zulia State during the period December 2008 - August 2009. Microbiological identification was performed as described by Janda and Abbott (1998), Murray et al (2007), the qualitative study (Kirby-Bauer) and quantity (agar dilution method) of the susceptibility according to CLSI guidelines for this genre. Aeromonas was isolated in 7.6% of samples; the predominant species was A. caviae (48.1%); the largest number of isolates were in patients younger than 1 year (61.5%) mostly with only gastrointestinal symptoms (63.5%), in turn, got the highest percentage of isolated in March (30,8%). The strains were susceptible to most of the beta-lactams, was detected suggesting the presence of a chromosomal beta-lactamase-induced typical Aeromonas. Resistance to nalidixic acid minimum inhibitory concentration was 26.9%, while somewhat lower for ciprofloxacin (15.4%), indicating a possible therapeutic failure of fluoroquinolone use in these patients. The betalactamases found in Aeromonas determine a shift in the empirical therapy of bacterial diarrhea. Keywords: Aeromonas, Aeromonas in pediatrics, Aeromonas susceptibility and resistance, resistance to quinolones and fluoroquinolones. Email: [email protected]
10
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
Las especies del género Aeromonas comprenden organismos Gram
negativos mesofílicos (móviles) e inmóviles (psicrofílicos). Diversos estudios han
demostrado que las especies de Aeromonas se encuentran universalmente
distribuidas en ambientes de agua dulce y han sido ampliamente aisladas de
muestras clínicas, del medio ambiente y de alimentos, en los cuales pueden
sobrevivir y multiplicarse inclusive a bajas temperaturas (Sinha y col., 2004). La
literatura indica que algunas cepas móviles de Aeromonas son emergentes de
productos alimenticios y patógenos de agua dulce e inclusive para consumo. Estos
organismos han sido asociados con varios brotes de origen alimentario (Ghenghesh
y col., 2008).
Las especies de Aeromonas son reconocidas como agentes etiológicos de un
amplio espectro de enfermedades en el hombre y en los animales sobretodo de
sangre fría como ranas y serpientes, también en peces siendo de gran importancia
para la acuicultura; además han sido aisladas como parte de la flora fecal en
animales de consumo como cerdos, vacas, ovejas y aves de corral (Ghenghesh y
col., 2008; Kirov y col., 2004; Wolfgang y col., 1994).
Dentro de los agentes etiológicos de las diarreas, Aeromonas es cada vez
mas reconocido como patógeno entérico en las edades mas tempranas (Kandakai y
col., 2007). Se ha demostrado una fuerte asociación entre las especies del género
en especial Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila y Aeromonas veronii biotipo
sobria y la patología gastrointestinal sobretodo en la población pediátrica (menores
de 5 años), en adultos mayores de 60 años, pacientes inmunocomprometidos y en
viajes a zonas tropicales o subtropicales (diarrea del viajero). Un número de
investigadores han vinculado los aislados de Aeromonas en gastroenteritis en los
picos de verano, con un incremento de estos microorganismos en los suministros de
aguas en los meses mas cálidos (Albarado y col., 2005; Rabaan y col., 2001; Kirov y
col., 2004; Sinha y col., 2004). Las evidencias que relacionan a este género con la
enfermedad diarreica, con la cual ha sido más asociada datan desde principios de
1980 (Frías y Díaz, 2001).
11
En la taxonomía del género existen algunas diferencias en la literatura en
torno a la importancia relativa de las diversas especies en relación con las
infecciones humanas. Algunos informes han atribuido todas las propiedades
patogénicas a una sola especie “Aeromonas hydrophila”. A pesar de esto, la mayoría
de los investigadores convergen en cuanto a que las especies móviles del género,
dentro de estas; Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae y Aeromonas veronii
biotipo sobria son las más implicadas en los hallazgos clínicos; así mismo,
Aeromonas jandaei, Aeromonas schubertii y Aeromonas veronii biotipo veronii son
consideradas patógenos menores. Los hallazgos de otras especies no móviles del
género en muestras de pacientes con cuadros diarreicos han sido poco
documentados; se han encontrado casos aislados mostrando muy baja incidencia
(Figueras y col., 2000; Janda y Abbott, 1998; Wolfgang y col., 1994).
En cuanto a la epidemiología de las diarreas causadas por Aeromonas se ha
visto obstaculizada por falta de buenos marcadores epidemiológicos y una clara
definición de los casos; esto debido al hallazgo rutinario de otras bacterias
enteropatógenas o en coinfección con especies de este género, o al no aislar del
mismo modo a Aeromonas y correlacionarla a la clínica (subregistro de casos). Así
mismo subsiste la duda de que estos microorganismos sean flora normal; sin
embargo, en estudios recientes se han asociado más a estados diarreicos que a
estado de portador (Herrera y col., 2002; Wolfgang y col., 1994).
Estudios efectuados en Australia han indicado una tasa de aislamiento del
10% en pacientes con diarrea, en comparación con ningún aislamiento en individuos
sanos. Un estudio similar efectuado por el CDC (Centro de Control y Prevención de
Enfermedades) en los EEUU demostró la asociación entre aislamiento de
Aeromonas con la presencia de diarrea persistente en pacientes con antecedentes
de ingestión de aguas contaminadas y uso de antibióticos que no fueron efectivos
contra Aeromonas. Sin embargo, los intentos para reproducir la enfermedad en
voluntarios humanos con microorganismos aislados de pacientes con diarrea han
fracasado, por ende se ha asociado la enfermedad al contacto con aguas y
alimentos contaminados. Aun así en los países con baja tasa de colonización
intestinal casi todos los médicos considerarían significativo el aislamiento de
Aeromonas en ausencia de otros patógenos entéricos (Wolfgang y col., 1994).
12
De todos los síntomas gastrointestinales causados por las bacterias
enteropatógenas, en este caso Aeromonas, la diarrea es el común denominador,
según el Fondo de Naciones Unidas para la Infancia (UNICEF) y la Organización
Mundial de la Salud (OMS), las enfermedades diarreicas provocan anualmente casi
dos millones de muertes en los menores de 5 años, esto es unas 6500 muertes por
día, lo que las colocan en el segundo lugar entre las causas principales de
mortalidad infantil a nivel mundial, una enfermedad que mata a más niños que el
SIDA, la malaria y el sarampión combinados. Disponible en: http://www.unicef.org/
La incidencia en las diarreas varía de 3.9 episodios por niño por año en
América Latina a 2.3 episodios por niño por año en Asía. En total se presenta más
de un billón de casos de diarrea en el mundo cada año (Pérez y col., 2003). La
Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que cada año en los países en
desarrollo (África y América Latina) se presentan 1300 millones de episodios de
diarrea en menores de 5 años, las cuales ocasionan 4 millones de decesos, lo que
ubica a las diarreas entre las principales causas de muertes en estos países. En
Venezuela se estima que ocurren 1,32 millones de episodios anuales de diarrea con
una media de 2,2 episodios por niño/año (Urrestarazu y col., 1999). De acuerdo a las
últimas estadísticas nacionales publicadas para el año 2006, el estado Zulia se
encuentra ubicado entre las regiones cuya causa de defunción en niños menores de
5 años son los cuadros diarreicos, situándose en los primeros lugares. Disponible
en: http://www.mpps.gob.ve
Aun cuando los estudios epidemiológicos señalan a los virus en especial
Rotavirus y algunas bacterias enteropatógenas, específicamente Salmonella y
Shigella, como principales agentes diarreogenicos en niños menores de 5 años en
los países en vías de desarrollo, las cifras de Aeromonas como enteropatógeno
asociado a esta población se han venido incrementando; hecho favorecido por
condiciones socioeconómicas bajas y hábitos alimenticios y sanitarios inadecuados
(Pérez y col., 2003; Rincón y col., 2002; Urrestarazu y col., 1999).
En torno a la asociación de Aeromonas con diarreas en la población
pediátrica, estudios realizados en algunos de los países en desarrollo (África, Asía y
América Latina) en niños con y sin diarrea; las tasas de aislamientos de Aeromonas
13
oscilaron entre 1-88% en niños con diarrea, mientras que en los controles (niños sin
diarrea) fueron de 0.0-45%. Algunos de estos estudios encontraron diferencias
estadísticamente significativas entre las tasas de aislamientos de Aeromonas en los
casos de diarrea y en los controles, mientras que otros estudios no la determinaron.
Los estudios realizados en un mismo país mostraron diversos resultados, teniendo
en cuenta que fueron realizados en diferentes ciudades dentro del país y en
diferentes momentos. Similar a lo reportado en los países desarrollados, Aeromonas
caviae, Aeromonas hydrophila y Aeromonas veronii biotipo sobria son las tres
especies dominantes asociadas con diarreas en niños en los países en desarrollo
(Ghenghesh y col., 2008).
El aislamiento de Aeromonas en pacientes pediátricos sin síntomas
diarreicos en los países en desarrollo no es poco común. Por tal motivo, un
adecuado aislamiento y la determinación de los factores de virulencia de estas
especies es de suma importancia tanto en niños sin diarreas como en los pacientes
pediátricos con síntomas gastrointestinales (Ghenghesh y col., 2008).
El estudio de la susceptibilidad antimicrobiana en el género Aeromonas ha
contribuido al conocimiento de la resistencia como un mecanismo de patogenicidad
sobretodo en las especies de interés clínico. La mayoría de las Aeromonas son
resistentes a la ampicilina de manera intrínseca o mediada cromosómicamente.
Ciertos estudios han mostrado una predisposición a infección con Aeromonas al
ingerir ampicilina por otras razones diferentes a la diarrea (otros cuadros
infecciosos), así mismo al ingerir otros antibióticos y aguas no tratadas, el
hospedador susceptible estaría predispuesto de igual manera a la infección con este
y otros microorganismos. Las infecciones gastrointestinales por Aeromonas son por
lo general autolimitadas; aun cuando el tratamiento de pacientes con diarrea
infecciosa permanece controversial, la terapia antimicrobiana debería iniciarse en
casos severos de la enfermedad diarreica y con riesgo de propagación
extraintestinal (Ghenghesh y col., 2008).
La resistencia de Aeromonas a los antimicrobianos puede ser a futuro un
problema sobretodo en las infecciones nosocomiales. Dentro de la resistencia de
bacterias entèricas a los antibióticos betalactámicos, se han estudiado y
14
caracterizado exhaustivamente las enzimas betalactamasas mediadas por
plásmidos. Mientras que los mecanismos que intervienen en la resistencia a dichos
antibióticos en las especies clínicas de Aeromonas han sido elucidados
recientemente. En la actualidad se conoce que las especies de Aeromonas pueden
expresar 3 tipos cromosomales de enzimas β- lactamasas inducidas por β-
lactàmicos, incluyendo: el grupo 1 de clase molecular C (cefalosporinasa), el grupo
2d clase molecular D (penicilinasa) y el grupo 3 clase molecular B metalo- β-
lactamasa (carbapenemasa) (Bush y col., 1995; Murray y col., 2007).
La investigación de la expresión de los genes que codifican para las 3
diferentes betalactamasas es un proceso que podría estar coordinado por un
regulador común. Mutantes desreprimidos que constitutivamente producen estas
enzimas han sido seleccionados in vitro de especies de A. hydrophila, A. caviae y A.
veronii. Por otra parte, se han encontrado plásmidos con resistencia a
betalactámicos (resistencia adquirida) en aislados clínicos y medioambientales,
asimismo en aislados de A. salmonicida que infecta a los peces (Ko y col., 1998).
La evolución de cepas de Aeromonas sensibles a betalactámicos a mutantes
resistentes durante la terapia clínica con estos antibióticos han sido descritas para
aislados de A. caviae y A .hydrophila, donde se menciona que el uso de la
cefotaxima sería un posible promotor del desarrollo de resistencia a betalactámicos
(Ko y col., 1998). En un estudio realizado por Ko y col., (1998), se corroboró la
presencia por primera vez de una cepa de A. hydrophila aislada de un paciente
quemado que adquirió resistencia a un amplio espectro de agentes betalactámicos
durante la terapia antimicrobiana con cefotaxima, pero permaneció susceptible a
aminoglicósidos y fluoroquinolonas. Por ende, los clínicos deberían observar la
respuesta clínica y microbiológica de las cefalosporinas en pacientes infectados con
Aeromonas con posible invasividad, para evitar fallas terapéuticas por la emergencia
de mutantes resistentes a cefalosporinas (Ko y col., 1998).
Se han detectado en la clínica, específicamente en casos de diarreas, cepas
portadoras de resistencia adquirida vía plasmìdica o por elementos móviles. La
importancia potencial de especies de Aeromonas que portan genes de resistencia a
15
antibióticos se debe a la colonización en el humano y ò el desarrollo de un proceso
infeccioso de difícil tratamiento (Libisch y col., 2008).
En la literatura también se han descrito casos de cepas de Aeromonas
portadoras de enzimas betalactamasas de espectro extendido (BLEE), con
resistencia a casi todos los agentes betalactámicos. En un caso de sepsis por A.
hydrophila (BLEE positiva) en un paciente pediátrico que cursaba con neumonía y
diarrea, también en un caso de fascitis necrotizante por A. hydrophila se describió la
probabilidad de transferencia in vivo de una TEM-24 (β-lactamasa de espectro
extendido codificada en un plásmido de la bacteria entérica Enterobacter aerogenes)
transmitida por conjugación (Murray y col., 2007).
En la revisión de las estadísticas de pediatría (coprocultivos) de la división de
apoyo diagnóstico del Centro de Referencia Bacteriológico del Hospital Universitario
de Maracaibo- Venezuela (H.U.M) de los últimos años en cuanto al aislamiento de
Aeromonas, para el año 2004, se describieron 90 aislamientos del género
predominando la especie A. caviae; en el 2006, dos aislamientos; en el 2007, 39
cepas aisladas con predominio de la misma especie A. caviae (Pineda y col., 2005;
Pineda y col., 2007; Pineda y col., 2009); para el primer trimestre del 2008, 20 cepas
donde en su mayor número se correspondían con A. caviae. En estos aislados se
han observado casos de aparición in vitro de Betalactamasas de espectro extendido
provenientes sobretodo del área de neonatología (datos no publicados).
Las Fluoroquinolonas como otro grupo de antimicrobianos de opción
terapéutica; en cuanto a su empleo, la FDA (Food and Drug Administration) ha
reservado su uso libre en los niños. Sin embargo, son muchos los artículos
publicados en revistas reconocidas que plantean el uso de estas drogas en la
población pediátrica (Valery y Rosas, 2001). En la resistencia a estos fármacos por
Aeromonas, se ha descrito como principal mecanismo: la alteración en el sitio blanco
de acción a nivel de las enzimas encargadas de mantener la topología del DNA
bacteriano; en primer lugar mutaciones en la DNA girasa o Topoisomerasa II y en
segundo lugar en la topoisomerasa IV. Se conoce con certeza que el uso desmedido
e irracional de las quinolonas ha inducido resistencia selectiva por presión a estos
fármacos (Arias y col., 2010; Valery y Rosas, 2001).
16
En la actualidad se reconoce según lo descrito en los estudios que
Aeromonas es un patógeno emergente controversial; a pesar de conocerse muchos
de los factores y estructuras que las convierten en bacterias patógenas, continúan
las investigaciones que establezcan dichos mecanismos. Por otra parte, las
Aeromonas son consideradas multivariables en torno a su aparición y la asociación
con la sintomatología gastrointestinal; además, la gran variabilidad en cuanto a sus
aislamientos inclusive dentro de una misma región, han sido descritos en diversas
fuentes: medioambientales, animales, clínicas; y en lo que a susceptibilidad se
refiere, presentan también variabilidad aun cuando han sido esclarecidos sus
mecanismos de resistencia; así mismo, es conocido que las especies
medioambientales, clínicas y animales pueden portar elevados niveles de resistencia
intrínseca y ó resistencias adquiridas lo cual representaría un foco de diseminación
de la misma.
Aeromonas es un microorganismo que permanece en líneas generales con
baja incidencia en comparación a otros enteropatógenos según las estadísticas de
coprocultivos de pediatría del Centro de Referencia Bacteriológica del Hospital
Universitario de Maracaibo como centro piloto de investigación en la región. En esta
investigación se determinó la susceptibilidad in vitro a betalactámicos y
fluoroquinolonas de las especies de Aeromonas aisladas de pacientes pediátricos
con sintomatología gastrointestinal, a fin de evaluar el comportamiento de las cepas,
detectar mecanismos y niveles de resistencia de las mismas en la población
pediátrica y hacerlos de conocimiento y abordaje, del mismo modo crear conciencia
en una terapia empírica racional para esta población.
17
OOBBJJEETTIIVVOOSS
Objetivo general.
Estudiar los patrones de susceptibilidad y resistencia a Fluoroquinolonas y
otros antimicrobianos en cepas de Aeromonas aisladas de pacientes pediátricos, en
edades comprendidas de 0 a 5 años, del Hospital Universitario de Maracaibo-
Estado-Zulia.
Objetivos específicos.
- Aislar cepas de Aeromonas en muestras fecales de pacientes pediátricos en
edades comprendidas de 0 a 5 años del Hospital Universitario de Maracaibo-Estado
Zulia.
- Establecer las especies de Aeromonas según la edad, sintomatología y período de
estudio.
- Determinar los patrones de susceptibilidad de cepas de Aeromonas aisladas de
muestras fecales diarreicas de pacientes pediátricos, de acuerdo a los lineamientos
del CLSI.
- Detectar mediante métodos fenotípicos la presencia de β-lactamasas de espectro
extendido en las cepas de Aeromonas aisladas. De acuerdo con los lineamientos del
CLSI.
- Determinar las concentraciones inhibitorias mínimas de Ciprofloxacina y Ácido
Nalidíxico como indicadores de resistencia a las Fluoroquinolonas, mediante el
método de dilución en Agar, siguiendo los lineamientos del CLSI.
18
- Correlacionar los perfiles de susceptibilidad cualitativos y cuantitativos a los
antimicrobianos probados.
19
MMAARRCCOO TTEEÒÒRRIICCOO..
Reseña Histórica.
Aun cuando las Aeromonas fueron descubiertas hace mas de 100 años; solo
durante las ultimas 3 décadas se ha demostrado su papel en las diversas
enfermedades humanas (Janda y Abbott, 1998). El primer caso de infección en
humanos por Aeromonas fue reportado de una paciente procedente de Jamaica con
una miosítis en el año de 1954. Desde 1961 cuando la primera cepa fue aislada de
heces humanas, Aeromonas han sido identificados como agentes de la diarrea (Von
Graevenitz, 2007).
Tabla 1. Eventos significativos en la evolución de Aeromonas como género relacionado a
enfermedad en Humanos.
Fecha Autor (es) Evento
1891 Sanarelli Aeromonas vinculados con
bacteriemia "pierna roja" enfermedad en las ranas
1936 Kluyver, van Niel Propuesta del género Aeromonas.
1954 Hill, Caselitz, Moody
Primer caso de enfermedad humana debido a Aeromonas (miositis aguda metastasica
fulminante).
1964 Rosner Primer caso bien descrito debido a Aeromonas con diarrea.
1965 Vèron Propuesta de incluir Aeromonas dentro de la familia Vibrionaceae.
1968 Von Graevenitz, Mensch
Primera serie publicada de infecciones por Aeromonas
asociadas a una variedad de enfermedades.
1976 Popoff, Vèron Género Aeromonas, genéticamente heterogéneo (nivel de especies).
1980 Von Graevenitz
Asociación de Aeromonas con tres principales tipos de infección
(diarreas, infecciones de heridas y gastroenteritis).
1981 Popoff, Coynault, Kiredjian, Lemelin
Género Aeromonas, genéticamente heterogéneo (nivel de especies).
1986 Colwell, MacDonell, De Ley Propuesta de ubicar a Aeromonas en su propia familia.
Fuente: (Janda y Abbott, 1998).
20
Distribución Mundial.
Aeromonas se encuentran mundialmente distribuidas en el medio ambiente,
agua y alimentos especialmente en los meses de verano, así mismo en animales y
humanos (Janda y Abbott, 1998).
Encuestas epidemiológicas basadas en la investigación de Aeromonas
asociadas a diarreas realizadas en África, América del Norte, Europa y Sureste
Asiático, han demostrado una variación geográfica considerable en lo que respecta a
la frecuencia de aislamientos y el grado de asociación con la enfermedad debido a
estos organismos. Así mismo, se han aplicado estos estudios en America del Sur,
encontrándose de igual modo variaciones regionales en cuanto a la prevalencia de
Aeromonas intestinales, las infecciones y la fuerza variable de asociación entre la
infección y la enfermedad diarreica. Mientras que en algunas zonas de América del
Sur, Aeromonas son comúnmente aisladas de heces diarreicas o heces normales,
incluso del medio ambiente, en otras áreas estos organismos parecen ser raros o
ausentes. Aeromonas continúan siendo microorganismos controversiales no solo por
su amplia variabilidad geográfica y la asociación a la enfermedad diarreica, sino por
su presentación en coinfección con otros enteropatógenos. La alta frecuencia de
coinfección sugiere que solo un grupo de cepas pudiesen comportarse como causal
del cuadro intestinal, mientras que la mayoría serian transitorias de baja virulencia
(Ghenghesh y col., 2008; Pazzaglia y col., 1991).
Descripción general del Género.
Los miembros del género Aeromonas son bacilos Gram negativos, anaerobios
facultativos; cuya morfología celular va desde las formas coco-bacilares a bacilares
con extremos redondeados; poseen un diámetro de 0.3-1.0um y de largo 1.0 a
3.5um. En cuanto a su agrupación estos pueden aparecer generalmente solos, en
pares o de manera infrecuente en cadenas cortas. La mayoría de las especies son
móviles debido a un flagelo polar de 1.7um; los flagelos peritricos pueden
desarrollarse en medio sólido en colonias jóvenes y los flagelos laterales aparecen
solo en algunas especies (Castro y col., 2002).
21
Aeromonas son usualmente oxidasa y catalasa positiva y por lo general son
resistentes con 10-150ug de agente vibriostático 2,4-diamino-6,7- diisopropilpteridina
(O/129); mientras que los vibrios son sensibles. Son organismos quimioorganotrófos
al usar variedades de azúcares y ácidos orgánicos como fuente de carbono. Utilizan
la vía oxidativa y fermentativa de la D-glucosa; el ácido obtenido, a menudo con gas
es generado a partir de la fermentación de muchos carbohidratos en especial la D-
glucosa; así mismo producen ácidos a partir de la L-arabinosa, D-sacarosa, D-
manitol, fructosa, maltosa y trealosa, (no sucede así con la lactosa al menos
rápidamente); además, utilizan de manera variable los aminoácidos: L-lisina, L-
ornitina y L-arginina, también pueden o no hidrolizar el glucósido de esculina, no
utilizan el M-inositol ni producen ácido sulfhídrico H2S en el medio de hierro y dos
azúcares de Kliger. Los nitratos los reducen a nitritos. Producen una gran variedad
de exoenzimas: proteasas, DNasas, hemolisinas, arilamidasas, amilasa, esterasas,
peptidasas, proteasas, quitinasas, condroitinasas, elastasas, RNasas, lecitinasas,
gelatinasas, lipasas, entre otras, muchas de estas consideradas factores de
virulencia. Las cepas mesófilas (humanos) crecen entre 10 y 42ºC, en ciertos
ensayos bioquímicos son más activas entre 22 y 25ºC. Las cepas psicrófilas (peces
y medio ambiente) A. popoffii y A. salmonicida pueden crecer a 37ºC, pero lo hacen
preferiblemente entre 22 y 25ºC. En medio cerebro corazón crecen a 28ºC, el
crecimiento ocurre a pH entre 4.5 y 9, pueden crecer en medios con menos de 4%
de cloruro de sodio. La cantidad de Guanina + Citosina en mol% del DNA es de 57 a
63% (Castro y col., 2002; Murray y col., 2007; Rodríguez, 2004).
Taxonomía
Reino: Procariota
Orden XII: Aeromonadales
Familia I: Aeromonadaceae
Género I: Aeromonas
El género Aeromonas esta clasificado en el manual de Bacteriología
Determinativa de Bergey como miembro de la familia Vibrionaceae desde 1965 junto
con los géneros Vibrio y Plesiomonas. Sin embargo, en la taxonomía actual basada
22
en técnicas moleculares, mediante la hibridación del DNA-DNA total bacteriano y el
estudio de las secuencias de los genes de las subunidades ribosomales 16S rRNA y
5S rRNA; la nueva familia Aeromonadaceae la conforman los géneros:
Aeromonas, Oceanimonas, Oceanisphaera y Tolumonas (Martin y Joseph, 2005).
La clasificación de las especies del género ha dependido de una compleja
mezcla de datos fenotípicos y genéticos. Las especies bioquímicamente distintas se
denominan fenoespecies mientras que las genéticamente diferentes son
denominadas grupos de Hibridación (HGs) ó genoespecies y se determinan
mediante pruebas de hibridación de DNA total (Castro y col., 2002).
Los cambios suscitados en la actualidad incluyen: la aparición de subespecies
de A. hydrophila donde se encuentran; A. hydrophila subsp. hydrophila (estricta), A.
hydrophila subsp. dhakensis aislada en un caso de diarrea pediátrica en
Bangladesh, A. hydrophila subsp. ranae aisladas en ranas sépticas en Tailandia.
Además, se adicionan especies como, Aeromonas culicicola aislada de mosquitos y
agua para consumo; A. simiae aislada en heces de monos y A. molluscorum
aisladas de moluscos bivalvos (tabla 2) (Martin y Joseph, 2005; Murray y col., 2007).
23
Tabla 2. Actuales Genomoespecies y Fenoespecies del Género Aeromonas
DNA Grupo de Hibridación
(HG) Cepa tipo Genomoespecie Fenoespecie Observaciones
1 ATCC 7966 A. hydrophila A. hydrophila Aislada de muestras clínicas
1 BCCM/LMG 19562
A. hydrophila subsp. dhakensis
A. hydrophila subsp. dhakensis
Aislada de muestras clínicas
1 BCCM/LMG 19707
A. hydrophila subsp. ranae
A. hydrophila subsp. ranae
Patógena de ranas
2 ATCC 14715 A. bestiarum como A. hydrophila Aislada de muestras clínicas
3 ATCC 33658 A. salmonicida A. salmonicida subsp. salmonicida
Patógena de pez no móvil
3 ATCC 33659 A. salmonicida A. salmonicida subsp. achromogenes
Patógena de pez no móvil
3 ATCC 27013 A. salmonicida A. salmonicida subsp. masoucida
Patógena de pez no móvil
3 ATCC 49393 A. salmonicida A. salmonicida subsp. smithia
Patógena de pez no móvil
3 CDC 0434-84, Popoff C316
Sin nombre como A. hydrophila Aislada de muestras clínicas
4 ATCC 15468 A. caviae A. caviae Aislada de muestras clínicas
5A CDC 0862-83 A. media como A. caviae Aislada de muestras clínicas
5B CDC 0435-84 A. media A. media 6 ATCC 23309 A. eucrenophila A. eucrenophila 7 CIP 7433, NCMB
12065 A. sobria A. sobria
8X CDC 0437-84 A. veronii A. sobria 8Y ATCC 9071 A. veronii A. veronii biovar sobria Aislada de muestras
clínicas 9 ATCC 49568 A. jandaei A. jandaei Aislada de muestras
clínicas 10 ATCC 35624 A. veronii biovar
veronii A. veronii biovar
veronii Aislada de muestras
clínicas. Ornitina positiva
11 ATCC 35941 Sin nombre Aeromonas spp. (ornitina positiva)
12 ATCC 43700 A. schubertii A. schubertii Aislada de muestras clínicas
13 ATCC 43946 Aeromonas Grupo 501 como A. schubertii Aislada de muestras clínicas
14 ATCC 49657 A. trota A. trota Aislada de muestras clínicas. Ampicilina s
15 ATCC 51208, CECT 4199
A. allosaccharophila
A. allosaccharophila
16 ATTC 51020, CECT 4342
A. encheleia
A. encheleia
Patógena de anguilas
17 BCCM/LMG 1754
A. popoffii
A. popoffii
Sin asignar MTCC 3249, NCIM 5147
A. culicicola
A. culicicola
Aisladas de mosquitos
ATCC - American Type Culture Collection, Rockford. MD; BCCM/LGM - Bacteria Collection, Ghent University, Belgium; CDC-Centers for Disease Control and Prevention; CIP- Collection de I’Institut Pasteur, Paris, France; NCMB - National Collection of Marine Bacteria, Aberdeen, Scotland; CECT - Coleccion Española de Cultivos Tipo, University of Valencia, Valencia, Spain; CCUG - Culture Collection, University of Gotenborg, Gotenborg, Sweden; MTCC - Microbial Type Culture Collection, Institute of Microbial Technology, Chandigarh, India; NCIM - National Chemical Laboratory, Pune, India. Fuente: (Martin y Joseph, 2005)
Continua la agrupación a manera de complejos: Complejo A. hydrophila (A.
hydrophila, A. bestiarum y A. salmonicida); Complejo A. caviae (A. caviae, A. media
y A. eucrenophila) y el Complejo Aeromonas veronii donde entran el resto de las
24
especies, y se describe el hecho de que no es necesario separar definitivamente los
miembros del Complejo A. hydrophila del Complejo A. caviae, especialmente cuando
los aislamientos sean provenientes de muestras fecales (Murray y col., 2007).
Existen ciertas controversias aún en estos complejos que datan desde 1998,
específicamente en el complejo A. hydrophila (A. hydrophila, A. bestiarum y A.
salmonicida) por genomo-variaciones pues existen especies que caen justo debajo
del valor cutoff del criterio de hibridación del DNA y una o al menos dos pruebas
diferenciales que han determinado especies que no entran dentro del mismo (Janda
y Abbott, 1998).
A pesar de la aparición de nuevas genoespecies del género Aeromonas, sólo
algunas han sido aisladas hasta la fecha en la clínica, reportándose en forma de
género y especie. Las tres especies más aisladas son: A. caviae; A. veronii bv sobria
y A. hydrophila que representan mas del 85% de los aislados clínicos utilizando
métodos genéticos. Janda y Abbott en 1998 han descrito valores superiores al 85%
para estas especies, describiendo así mismo como especies menos frecuentes: A.
veronii bv veronii, A. jandaei y A. schubertii (tabla 3) (Janda y Abbott, 1998; Figueras
y col., 2000; Castro y col., 2002).
Tabla 3. Aeromonas asociadas a Enfermedad en Humanos
Aeromonas asociadas a enfermedad en Humanos*
Principales patógenos Patógenos menores A. hydrophila (HG1)
A. caviae (HG4)
A. veronii bv sobria
(HG8)
A. veronii bv veronii (HG10)
A. jandaei (HG9)
A. schubertii (HG12)
Especies del medio
ambiente Г
A. salmonicida (HG3)
A. sobria (HG7)
A. media (HG5)
A. eucrenophila (HG6)
A. trota
A. allosaccharophila
A. encheleia (HG11)
A. bestiarum (HG2)
A. popoffii
Fuente: (Janda y Abbott, 1998). Bv: biotipo. * Basado en el aislamiento clínico más que presentación como enfermedad. Г Incluye especies aisladas principalmente de aguas, peces, otros animales y fuentes de industrias.
25
Factores asociados a la virulencia.
Aunque se han realizado numerosos estudios para definir el o los
mecanismos de patogenicidad implicados en las infecciones causadas por
Aeromonas, no se ha logrado la conciliación de los resultados para establecer dicho
mecanismo de forma contundente (Janda, 2001). Sin embargo, se han identificado
un gran número de estructuras y enzimas extracelulares que parecen tener un papel
importante en la patogenicidad de las infecciones intestinales y sistémicas (Murray y
col., 1999; Janda, 2001).
Algunos de los factores asociados a virulencia se han identificado y
caracterizado en estudios in vivo e in vitro, lo que ha permitido conocer su función
biológica y comparar la similitud genómica que pudiera existir con otros factores de
virulencia descritos en otros agentes bacterianos. Los principales factores de
virulencia descritos en Aeromonas spp. son: la capsula, lamina S, adhesinas
filamentosas (fimbrias) y otras adhesinas no filamentosas (lipopolisacárido), la
flagelación polar y lateral, los sistemas de captura de hierro, sistema de secreción y
la secreción de exotoxinas y enzimas extracelulares. A continuación se realiza una
descripción breve de las estructuras asociadas a la virulencia (Castro y col., 2002;
Vilches, 2007).
Cápsula de polisacáridos o Biofilm.
Algunos estudios han demostrado la presencia de cápsula en algunos
serogrupos de A. hydrophila y aunque se cuenta con poca información sobre su
composición y su posible relación con patogenicidad, existen trabajos preliminares
que reportan que las cepas no capsuladas son menos virulentas para el ratón que
las capsuladas; debido la evasión a la fagocitosis (Martínez y col., 1995; Gavin y
col., 2003).
26
Capa S o Lámina S.
Esta estructura de naturaleza proteica o glicoprotèica; se compone de
diversas subunidades de una única proteína las cuales se autoensamblan en una
estructura supramolecular con morfología precisa. Constituye el antígeno superficial
predominante en las células que la poseen. Se involucra en la unión de la bacteria a
los componentes de la célula huésped y confiere resistencia a las propiedades
bactericidas del complemento y menos susceptibles a la opsonofagocitosis; es lugar
de anclaje a exoenzimas hidrolíticas y receptor de bacteriófagos, por lo que se
considera un importante factor de virulencia, ya que estas uniones aumentan la
capacidad de adhesión y colonización de la mucosa intestinal (Vilches, 2007).
Adhesinas filamentosas.
• Pili o fimbrias. Se han descrito tres tipos de Pili: los Pili de tipo I, descritos en
A. hydrophila, con una composición en aminoácidos muy similar a los pilis tipo I de
E.coli; los pilis tipo IV descritos en A. hydrophila, A.caviae y A. veronii bv sobria, que
pueden formar bucles (Bfp) y se expresan conjuntamente con pilis tipo I; y el tercer
tipo se denomina mini-pilis, y está constituido de una pilina que guarda gran
semejanza con la pilina Cep de V. cholerae. La adherencia mediada por estos pilis
se ha ensayado en conejos y en diferentes líneas celulares eucarióticas,
describiéndose que la adhesión mediada por pilis favorece el proceso de
colonización de estas bacterias; además de crear rigidez a una diversidad de
agentes antimicrobianos incluyendo las quinolonas (Castro y col., 2002).
Se han dividido las fimbrias de Aeromonas spp. en diferentes tipos
morfológicos. El tipo de estructura de superficie expresada y/o el número de estas
estructuras por célula varía de acuerdo al origen del aislamiento y a las condiciones
de crecimiento. Se ha determinado que el crecimiento a bajas temperaturas (entre 5
y por debajo de 37ºC) y el medio líquido favorecen la expresión de fimbrias en la
mayoría de cepas sea cual sea su origen, aunque no se cuenta con mucha
información respecto a los factores que influencian la expresión de fimbrias en
Aeromonas spp (Kirov y col., 1995).
27
Los dos grandes grupos de fimbrias de Aeromonas son: fimbria corta y rígida
(S/R del inglés short/rigid), las cuales se encuentran en alto número por célula, y
fimbrias largas y flexibles (L/W del inglés long/wavy), encontrándose pocas por
célula. Ambos tipos se encuentran tanto en aislados clínicos como del medio
ambiente. Las fimbrias S/R poseen epítopes comunes entre las diferentes especies
analizadas y están altamente distribuidas, más del 95% de las cepas estudiadas
poseen este tipo de fimbria. Es además, el tipo expresado más predominante en
Aeromonas fuertemente fimbriadas como algunas cepas medioambientales de A.
veronii bv sobria. Estas fimbrias provocan autoagregación, pero no hemoaglutinan ni
se unen a células intestinales. Las fimbrias L/W muestran un alto grado de
homología entre los dominios aminoacídicos N-terminales de las secuencias de
diferentes cepas; además los análisis de las secuencias N-terminales indican que
son pili de tipo IV, un importante factor de unión a células epiteliales de gran
variedad de patógenos Gram negativos (Kirov y col., 1995). Se trata de pili largos y
finos (de 4 a 7 nm) que además actúan de hemoaglutininas; entre las
hemoaglutininas de Aeromonas spp. algunas han sido asociadas a fimbrias y otras a
proteínas de membrana externa. Las fimbrias L/W son predominantes entre cepas
aisladas de heces, en particular A. veronii bv sobria, a pesar de ser pobremente
fimbriadas (<10 pili por célula). Es importante añadir que las Aeromonas asociadas a
gastroenteritis pueden expresar al menos dos familias distintas de pili de tipo IV.
Entre los aislados fecales de A. veronii bv sobria y A. caviae predomina la familia de
pili Bfp del ingles bundle-forming pilus. La especie menos eficiente a nivel de
adhesión entre las más frecuentes en infecciones humanas es A. hydrophila (Kirov y
Sanderson, 1996; Kirov y col., 1999).
Adhesinas no filamentosas.
Aeromonas spp. Presenta en su superficie macromoléculas que han sido
consideradas adhesinas; como los monómeros de la lamina S, el lipopolisacárido y
diversas proteínas de la membrana externa. Entre estas proteínas de la membrana
externa, las porinas podrían actuar como adhesinas en la unión de la bacteria a
superficies ricas en carbohidratos, como eritrocitos y probablemente las células del
intestino humano (Vilches, 2007).
28
• Lipopolisacárido (LPS). También conocido como endotoxina, es un complejo
glucolipìdico que constituye el componente mayoritario de la capa externa de la
membrana externa de los Gram negativos. Se diferencia en tres regiones: el lípido A,
el núcleo del Lipopolisacárido, a su vez subdividido en núcleo interno y núcleo
externo y el antígeno O o polisacárido O (figura 1). El lípido A es una estructura
altamente conservada y ligada de manera covalente al complejo polisacárido; esta
compuesto de azucares y ácidos grasos y permite el anclaje del LPS en la capa
externa de la membrana externa. Las propiedades endotoxicas (de aquí el nombre
de endotoxina) del LPS son debidas a este lípido A, que liberándose a causa de la
lisis celular, es capaz de provocar una importante inflamación sistémica (shock
séptico o endotòxico). El núcleo se compone de azucares y derivados de estos. El
antígeno O es una estructura que se extiende hacia el exterior celular y se compone
de unidades oligosacarìdicas repetidas, generalmente compuestas por 3 a 6
azucares (unidades O) que se repiten frecuentemente entre 10 y 30 veces. Esta
estructura es altamente polimorfica, debido a la diversidad de monosacáridos que la
pueden formar (Vilches, 2007).
Figura 1. Estructura de la pared celular de Gram Negativo
Fuente: Vilches, 2007.
La tipificación serológica en Aeromonas en base a antígenos somáticos (O);
en el género Aeromonas se conocen 97 serogrupos, 45 serogrupos propuestos por
Sakasaki y Shimada en 1984 las que incluyen cepas obtenidas de Aeromonas
mesófilas y 52 serogrupos de diferentes cepas aisladas de Inglaterra, Perú, Brasil y
Australia (Thomas y col., 1990).
29
De los 97 serogrupos distintos estudiados en Aeromonas hydrophila en base
a los antígenos presentes en la región O del LPS. Se ha demostrado que los
serotipos O: 34 (asociado en infecciones de heridas), O: 11 (relacionado a
infecciones extraintestinales; incluyendo septicemia, meningitis y peritonitis) y O: 16
(relacionado a gastroenteritis) son los más prevalentes en diversas áreas
geográficas (Arteaga y col., 2006; Dooley y col., 1985; Castro y col., 2002;
Rodríguez, 2004).
• Proteínas de membrana externa (OMP). La caracterización de las OPM de
Aeromonas es limitada. La purificación y caracterización parcial de éstas, revela tres
diferentes proteínas y se está investigando la posibilidad de que algunas tengan
propiedades formadoras de canales (porinas). Se ha identificado una OMP de 34
kDa en A. caviae (Castro y col., 2002).
Flagelos en Aeromonas.
Los flagelos son organelos complejos necesarios para la motilidad bacteriana;
estos se componen del filamento flagelar, gancho y cuerpo basal (figura 2). Los
filamentos flagelares pueden ser homopolímeros simples de subunidades únicas de
flagelina (proteína flagelar) o heteropolimeros de múltiples tipos de flagelina. El
filamento flagelar se asocia al gancho a través de proteínas de unión al gancho que
a su vez sirve de anclaje del filamento en el cuerpo basal. El filamento se extiende
desde el gancho hacia el exterior, el cual es un cilindro hueco y rígido constituido por
la polimerización de la flagelina. La biosíntesis de la estructura completa y la rotación
del filamento que es esencial para impulsar la bacteria requiere más de 40 genes.
Diversos investigadores han aislado los flagelos de Aeromonas hydrophila y
Aeromonas veronii bv sobria y han reportado diversos pesos moleculares de
flagelinas sin embargo se conoce muy poco sobre su estructura y su potencial de
virulencia. Lo que si se conoce es que los flagelos son de suma importancia en el
proceso de colonización y en la formación de biofilms (biopeliculas) y en conjunción
con el Lipopolisacárido se han asociado a la adherencia en Aeromonas (Rabaan y
col., 2001).
30
Figura 2. Estructura del flagelo
Fuente: Vilches, 2007
Una propiedad importante en el mecanismo de patogenicidad en este género
esta en la capacidad de invasión o invasividad. Aeromonas spp. son normalmente
móviles mediante un flagelo polar monotrico y sin vaina responsable del movimiento
en medio líquido (swimming). A pesar de que la especie psicrófila A. salmonicida ha
sido definida dentro del género como no flagelada y no móvil, algunos estudios
sugieren que algunas cepas de A. salmonicida expresan con baja frecuencia un
flagelo polar sin vaina. Ciertas cepas de Aeromonas son capaces de producir
muchos flagelos laterales cuando se cultivan sobre superficies sólidas, pero sólo el
50-60% de las especies de Aeromonas mesófilas comúnmente aisladas de diarreas
son capaces de expresar este segundo tipo de flagelo, que además es también sin
vaina y se necesita para la movilidad mediante swarming (desplazamiento colonial
sobre superficies con el fin de colonizarlas y acelerar la producción de biomasa); las
células vegetativas (V) se diferencian en células para el swarming (S),
(hiperflageladas y elongadas); estas se agregan en cuerpos multicelulares para la
migración, que cuando cesa (consolidación) provoca una reversión a células
vegetativas (Vc) (Gavín, 2003; Kirov y col., 2004).
En el 2002 se realizó un estudio en Aeromonas caviae aisladas de muestras
fecales de pacientes pediátricos con síntomas gastrointestinales; es esta
investigación se determino la capacidad de adherencia por el estudio del flagelo
polar; se aisló el locus de flagelinas polares (proteínas flagelares) y se identificaron 5
genes de flagelos polares en el orden de flaA, flaB, flaG, flaH y flaJ. Cada uno de los
cuales se inactivo usando un cartucho de resistencia a kanamicina que aseguro la
31
transcripción de los genes. A los mutantes resultantes se les realizó la prueba de
motilidad, expresión de flagelina y adherencia a células de la línea Hep-2. La
secuenciación de aminoácidos N-terminales, el análisis de mutantes y el Western
blotting, demostraron que Aeromonas caviae posee un filamento flagelar complejo
compuesto por dos subunidades de flagelina codificadas por flaA y flaB. La
aplicación de mutaciones individuales en flaA o flaB no dio lugar a la perdida de
flagelos pero si disminución en la motilidad y adherencia en un 50%. La mutación en
los genes flaH o flaJ o ambos genes de flagelina resulto en la perdida completa de
motilidad, expresión de la flagelina y adherencia. Por otra parte la mutación en flaG
no afecto la motilidad pero redujo significativamente el nivel de adherencia.
Concluyeron que la máxima adherencia de Aeromonas caviae en las células
epiteliales humanas in vitro requiere motilidad y optima funcionabilidad flagelar
(Rabaan y col., 2001).
Sistemas de captación de hierro.
• Sideróforos. Son compuestos con una alta afinidad por el hierro y que son
sintetizados bajo condiciones de estrés por las bacterias, para competir por este
crítico elemento, cuando su concentración está limitada. Algunas cepas de A.
hydrophila y A. caviae sintetizan un sideróforo denominado amonobactina siendo el
sideróforo más predominante, también pueden producir otro tipo denominado
enterobactina encontrado en A. sobria; Sin embargo, no se ha corroborado si lo
producen durante el desarrollo de la infección. Aeromonas, al igual que otras
bacterias patógenas, secretan sideróforos (ligando específicos de Fe (III) de bajo
peso molecular para obtener suplementos del mismo), aunque algunos sideróforos
pueden ser inactivados por diferentes componentes del suero. Algunas Aeromonas
también adquieren hierro in vivo por contacto directo entre proteínas secuestradoras
de hierro del huésped y alguna proteína de unión de la bacteria. Otro mecanismo
alternativo para obtener hierro sin la intervención de sideróforos es el uso del grupo
hemo como fuente de hierro, sobretodo en forma de hemoglobina. Este mecanismo
requiere de la destrucción hemolítica de las células huésped para acceder al hierro
en el grupo hemo, de allí la importancia de las hemolisinas en la virulencia de
Aeromonas spp (Castro y col., 2002; Gavín, 2003).
32
Sistemas de secreción en Aeromonas.
En los Gram negativos existen un número limitado de mecanismos para la
salida de sustancias al exterior de la célula, entre estos sistemas: I, II, III, IV y V
(autotransportadores). Esta clasificación esta basada en el transporte de las
proteínas a través de la membrana externa en los Gram negativos y atiende a su
naturaleza molecular, las maquinarias de transporte y las reacciones que catalizan.
En Aeromonas se ha descrito el tipo II y el tipo III (Vilches, 2007).
El sistema de secreción tipo II (T2SS), también denominado Sistema general
de secreción y rama terminal principal del sistema general de secreción Sec-
dependiente. La maquinaria exporta el sustrato con péptidos señal a través de la
membrana celular interna, la proteína pierde el péptido señal y adquiere su
conformación nativa en el especio periplasmico. Seguidamente un conjunto adicional
de proteínas de membrana interna y externa que forman un complejo denominado
secretòn, dirigen el transporte a través de la membrana externa. Este sistema es
responsable del transporte de una amplia variedad de enzimas hidrolíticas y toxinas.
En el caso de Aeromonas hydrophila se ha asociado con la secreción de proteínas
de tipo aerolisina, amilasa, DNAsa, GCAT (glicerofosfolìpido-colesterol
aciltransferasa) y proteasa. Además se ha hablado de la secreción de enterotoxina
citotóxica (Act) (Erova y col., 2006; Vilches, 2007).
El sistema de secreción tipo III (T3SS): es un complejo sistema formado por
tres tipos de proteínas; componentes estructurales del sistema de inyección,
sustratos de secreción (efectores) y factores reguladores de la expresión de las
proteínas estructurales y efectoras. El aparato de inyección esta formado por
aproximadamente 20 proteínas diferentes que se ensamblan simulando la estructura
de una aguja que permite la translocación de efectores generalmente tras el
contacto con la célula huésped. Se han descrito para Aeromonas salmonicida y para
algunas cepas de Aeromonas hydrophila y ha sido asociado junto a T2SS a
citotoxicidad. En una cepa de Aeromonas hydrophila aislada de un caso de diarrea
se determino un gen (Dam) codificante de una DNA metiltransferasa, dicha enzima,
se encontró como modulador de la función de los sistemas de secreción III y II
33
asociado a Act implicados altamente en la virulencia de Aeromonas (Erova y col.,
2006; Vilches, 2007).
Aeromonas también producen una gran cantidad de enzimas extracelulares
(exoenzimas) que degradan activamente complejos proteicos, polisacáridos,
mucopolisacáridos y moléculas que contienen lípidos. Estas enzimas son útiles en la
identificación de la bacteria, en sus funciones fisiológicas y son consideradas
frecuentemente factores asociados a la virulencia; estas se acumulan en el espacio
periplàsmico de la bacteria y constan de un sistema de transporte específico que las
lleva fuera de la membrana (Castro y col., 2002; Pemberton y col., 1997).
• Hemolisinas. Los principales estudios se han llevado a cabo en Aeromonas
hydrophila. La hemolisina mas intensamente estudiada ha sido la aerolisina
(proteína citolítica de 52Kd) codificada por el gen aerA, dicha proteína es sintetizada
en la célula como una preproaerolisina, la cual posee una secuencia N-terminal de
23 aminoácidos los cuales son removidos al atravesar la membrana citoplasmática,
dejando todavía una proaerolisina inactiva en el espacio periplasmico. Una vez
secretada la proaerolisina es activada por clivaje de 25 aminoácidos del carbono C-
terminal. Ambas proteínas proaerolisina y aerolisina pueden encontrar a su receptor
de glicoforina en la membrana de los eritrocitos, sin embargo solo la aerolisina
puede oligomerizar y formar canales en la membrana celular de estos conduciendo a
su lìsis (Pemberton y col., 1997).
La caracterización de las hemolisinas se ha dificultado por la terminología
múltiple con la que han sido descritas por los distintos autores. Existen diversos tipos
de hemolisinas con diversos nombres y es posible que una cepa posea varios genes
que codifiquen para varias de estas (Sen y Rodgers, 2004). La hemolisina,
originalmente denominada aerolisina, es la beta hemolisina prototipo para el género,
su secuencia de aminoácidos es parcialmente semejante a la de la toxina α (alfa) de
Staphylococcus aureus y a la enterotoxina A. de Clostridium perfringens. La
aerolisina se caracteriza por la formación de poros en la membrana de las células
huésped (efecto citolítico) y por producir acumulación de fluidos en diversos modelos
animales, por lo cual se le asocia con la producción de cuadros de gastroenteritis. La
34
α hemolisina (HlyA), se forma durante la fase estacionaria del crecimiento
bacteriano, se expresa a temperaturas menores de 37ºC, dicha toxina induce una
zona incompleta de hemólisis de glóbulos rojos en agar sangre y tiene un peso
molecular de 65Kd. La toxina beta, conocida como aerolisina, citolisina o
enterotoxina citolítica es termolábil a 56ºC durante 5 minutos, tiene un peso
molecular entre 49 y 53Kd, esta se forma en la fase logarítmica de crecimiento y
produce hemólisis completa en los glóbulos rojos, los efectos de esta hemolisina
parecen ser irreversibles ya que produce un importante daño en el epitelio. En A.
hydrophila los factores de virulencia relacionados a ella son 100% citotoxicidad, 84%
adherencia y 76% de actividad hemolítica (Frías y Díaz, 2001; Castro y col., 2002;
Rodríguez, 2004).
• Enterotoxina citotóxica (Act): la enterotoxina citotóxica codificada en el gen
act de Aeromonas hydrophila, posee actividad multifuncional: tiene actividad
citotóxica y hemolítica, en adición a ello actividad enterotóxica (Albert y col., 2000;
Sen y Rodgers, 2004).
• Enterotoxinas citotónicas. Este tipo de toxinas se distinguen in vitro de las
aerolisinas o β-hemolisinas por su capacidad de producir elongación de las células
pero no lisis, no producen degeneración del epitelio. Se han descrito dos tipos de
actividad citotónica, una asociada al incremento del adenosín monofosfato cíclico
(AMPc) pero que no se parece estructuralmente a la toxina colérica y el segundo tipo
que tiene un mayor grado de homología con la toxina colérica. Estas toxinas se
asocian con la producción de diarrea acuosa (Chopra y Houston, 1999). Pueden
dividirse en dos tipos: Enterotoxina citotónica termolábil (codificada por el gen alt): a
56ºC durante 10 minutos, además de no presentar reactividad cruzada con la
antitoxina colérica. Enterotoxina citotónica termoestable (codificadas en el gen ast):
a 100ºC durante 30 minutos; reaccionan con la antitoxina colérica (Gavin, 2003).
Ambas toxinas citotónicas (Alt y Ast) consisten en cadena sencilla polipeptídica
respectivamente. Alt ha mostrado el aumento de adenosín monofosfato cíclico
(AMPc) y prostaglandinas en estudios realizados en ovario de hámster chino y
células del epitelio intestinal evocando respuesta secretora; Ast también ha
mostrado incrementar los niveles de adenosín monofosfato cíclico (AMPc) en líneas
celulares. Albert y col., 2000, reportaron una correlación significativa entre aislados
35
de Aeromonas portadoras de genes alt y ast y diarrea en niños de donde se aislaron
estas cepas. En su estudio 54% de las Aeromonas hydrophila aisladas de niños con
síntomas diarreicos portaban ambos genes (Albert y col., 2000).
Para las enterotoxinas Act, Alt y Ast consideradas en conjunto factores
importantes en la inducción de gastroenteritis por Aeromonas, su única presencia
parece no ser suficiente para determinar virulencia, ya que estos factores han sido
aislados en humanos sin síntomas (Sen y Rodgers, 2004).
• Proteasas. Éstas son capaces de degradar diferentes compuestos como
albúmina, fibrina, gelatina y elastina. Una misma cepa puede producir diversas
proteasas. Pueden contribuir a la patogenicidad causando lesión directa en el tejido
o mediante la activación proteolítica de toxinas potenciando la invasividad; por otro
lado pueden contribuir al establecimiento de la infección mediante la in activación del
complemento y proporcionando nutrientes para la proliferación celular. Sin embargo,
sólo algunas actividades enzimáticas se han caracterizado y la mayoría de estos
estudios se han realizado en A. hydrophila. Las proteasas pueden jugar un papel
importante en el mantenimiento de las infecciones en heridas de humanos y en las
lesiones de piel de peces. Se han identificado tres tipos: proteasas de serina
termolábil, dos métalo-proteasas sensibles o no al EDTA ácido
etilendiaminotetraacético (Castro y col., 2002; Gavin, 2003; Rodríguez, 2004).
• Amilasas. Cuatro distintas amilasas han sido aisladas de Aeromonas
hydrophila; y han sido clasificadas como endoamilasas, exoamilasas y enzimas
desramificadoras, sus productos son poli y oligosacáridos de diversos pesos
moleculares, su rol clínico todavía no se ha definido, sin embargo se ha relacionado
a la ecología de Aeromonas (Pemberton y col., 1997).
• Quitinasas. La quitina es un polímero de unidades de 1,4-β N-
acetilglucosamina, uno de los polisacáridos más abundantes en la naturaleza.
Principal componente del exoesqueleto de artrópodos, pared celular de hongos,
protozoarios, gusanos. La quitina provee carbono, nitrógeno y energía a los
organismos capaces de degradarla. En Aeromonas se han encontrado 3 grupos de
36
quitinasas, cuyo papel no esta esclarecido en la patología humana (Pemberton y
col., 1997).
• Lipasas. En Aeromonas hydrophila se han encontrado diferentes lipasas
como la Ah65 lipasa/aciltransferasa y otras con elevada homologìa (H3, Ap11 y Lip);
Ap11 ha mostrado actividad fosfolipasa C. En el serogrupo 0:34 de Aeromonas spp
se han descrito las fosfolipasas A1 y C. La fosfolipasa C muestra actividad lecitinasa
y capacidad citotóxica, y se ha demostrado su papel como factor de virulencia. Las
Aeromonas spp también producen la glicerofosfolípido colesterol aciltransferasa
(GCAT) que funcionan como lipasas y pueden provocar lisis de eritrocitos mediante
la digestión de sus membranas plasmáticas (Castro y col., 2002; Rodríguez, 2004;
Vilches, 2007).
• Desoxirribonucleasas. Se han descrito al menos tres de estas proteínas, se
desconoce la función específica que pueden desempeñar en la patogenia de
Aeromonas; sin embargo se ha descrito que podrían ser enzimas nutricionales para
degradar ácidos nucleicos para la obtención de fósforo y hierro para la bacteria; por
otro lado estas nucleasas son una barrera a la entrada de DNA externo a la célula
huésped. En otros géneros como Streptococcus, las nucleasas extracelulares son
consideradas de gran importancia para el establecimiento y desarrollo de la
infección. La función de la enzima es depolimerizar el DNA produciendo una mezcla
de mono y polinucleótidos (Castro y col., 2002; Pemberton y col., 1997; Rodríguez,
2004).
37
Proceso de Infección.
Figura 3. Proceso de Infección asociado a Aeromonas
Fuente: (Gavìn, 2003).
Respuesta Inmunológica.
La respuesta a nivel del tracto intestinal contra Aeromonas parece estar
dirigida contra las exotoxinas producidas por estas. Algunas especies de Aeromonas
producen una toxina que inmunologicamente causa reacción cruzada con la toxina
producida por Vibrio cholerae. La infección intestinal por Vibrio cholerae esta mas
correlacionada con un aumento de anticuerpos contra el antígeno somático (O) que
con una respuesta de antitoxina; lo cual ha sugerido que los estudios de la respuesta
inmune contra Aeromonas también debe considerar la producción de anticuerpos
contra los antígenos somáticos (O) de estas (Kuijper y col., 1990).
La mayoría de los ensayos serológicos que han sido utilizados para la
determinación de anticuerpos contra Aeromonas (aglutinación en tubo, inmunoblot y
ELISA) poseen baja sensibilidad y especificidad, debido a la amplia heterogeneidad
en las especies, por lo cual no es considerado viable. Se ha reportado la existencia
de una inmunoglobulina A (anticuerpo IgA fecal) que responde a los antígenos
somáticos del Lipopolisacárido y a exotoxinas. Se ha descrito la presencia de una
IgA secretora en muestras fecales de pacientes cuando la muestra se preserva con
Jacalina, una lecitina con alta afinidad por IgA humana (Murray y col., 2007).
Aeromonas
Sistema de captura del hierro de alta afinidad (Sideróforos, proteínas de membrana).
Fagocitosis Lámina S, Cápsulas (CPS). Complemento Lipopolisacáridos(LPS), Porinas.
Exotoxinas: enterotoxinas, proteasas, hemolisinas, fosfolipasa C. Endotoxinas: LPS. Complejos tóxicos extracelulares: LPS, CPS-proteínas.
Entrada en el Huésped
Resistencia a las defensas
Multiplicación en los tejidos
Lesión en los tejidos
La entrada en el huésped se da por medio de las fimbrias y adhesinas no filamentosas
38
Epidemiología Y Significado clínico de Aeromonas.
Los datos epidemiológicos para los aislamientos de las especies de este
género revelan su amplia distribución. Se han encontrado en suelos, medio
ambiente marino, sedimentos, estuarios (desembocadura de río sobre mar), agua
dulce, aguas residuales, en aguas potables cloradas y no cloradas, en aguas
embotelladas, se han aislado en aguas en las que no se han detectado coliformes
indicándose en consecuencia que su presencia no se correlaciona con la de estos
indicadores. Algunos autores consideran que Aeromonas podría ser un indicador del
funcionamiento del sistema de tratamiento y potabilización del agua, ya que se han
detectado inclusive en biofilms de los sistemas de distribución de agua potable.
Además Aeromonas se ha encontrado en productos cárnicos, pescado, mariscos,
alimentos preparados, productos de pastelería, verduras, leche y derivados lácteos;
por lo que ciertos autores consideran que debería incluirse en la lista de
microorganismos que pueden actuar como agentes causantes de toxoinfecciones
alimentarias. Así mismo se han aislado de animales de sangre fría, en moscas, en el
tracto intestinal de una amplia variedad de animales (perros, gatos, cerdos, vacas,
caballos, ovejas, aves de corral, aves silvestres) y del tracto intestinal de humanos
con y sin evidencia de enfermedad gastrointestinal (Castro y col., 2002; EPA Office
Of Water, 2006; Ghenghesh y col., 2008).
Se han descrito diversas especies del género Aeromonas asociadas a
numerosas patologías de peces de interés en acuicultura, provocando pérdidas
económicas significativas. A. salmonicida es considerada el principal agente
etiológico de furunculosis en diferentes especies de peces, entre las que se incluyen
salmón, trucha, rodaballo, pez oro, pez blanco y otros, causando una importante
mortalidad, A. hydrophila y A. jandaei son causantes de enfermedad en pez, gato y
anguilas. En un estudio realizado a partir de pescado congelado destinado al
consumo humano en la Ciudad de México las especies más frecuentes tras la
identificación genética fueron A. salmonicida (69%) y A. bestiarum (14%), aunque es
interesante recalcar que entre los demás aislamientos se encontraron cepas de A.
encheleia (4.2%), especie reportada por primera vez en México (Castro y col., 2002).
39
Son muchos los estudios que han sustentado su amplia extensión a nivel
mundial, donde no solo la presencia de este género es importante sino los
mecanismos de resistencia que pueden transportar y llevar hasta el humano.
Balsalobre y col.; (2010) por el método de PCR en un Hospital en Sao Paulo
Brasil; investigaron la presencia de genes portadores de enzimas de tipo
betalactamasas de espectro extendido en aislados ambientales de A. hydrophila y A.
jandaei, donde se verifico la presencia del gen blaTEM-116 en 97,6% y 85% de estos
aislados respectivamente, además se encontraron plásmidos en un 24,4% y 34,9%
por lo cual sugirieron que no había asociación entre la ocurrencia de los plásmidos y
dicho gen. BlaTEM-116 es una variante del blaTEM-1 el cual no posee actividad de
betalactamasa de espectro extendido, dicho gen no mostró actividad de este tipo.
En un estudio realizado en la escuela de medicina de la Universidad de
Anáhuac, en México por Vásquez y col., (2009), en el cual se aislaron Aeromonas
hydrophila biotipo 296 a partir de ostiones (fuente importante de infección por
Aeromonas) expendidos en restaurantes de la ciudad y se determino su efecto en
linfocitos humanos de sangre periférica; los resultados mostraron que el
sobrenadante de Aeromonas hydrophila produce in vitro un potente efecto
inmunosupresor dosis-dependiente, pudiendo ser un nuevo mecanismo de
patogenicidad producido por Aeromonas hydrophila. De ocurrir esto in vivo aportaría
valiosos elementos a la fisiopatología de las diferentes enfermedades producidas por
esta bacteria.
Cattoir y col., (2008), estudiaron la resistencia a quinolonas mediada por
plásmidos determinantes de tipo qnr (gen de resistencia a quinolonas) en muestras
de agua de varios recogidos en diversas localidades del río Sena (París- Francia). El
gen qnrS2 fue identificado de Aeromonas punctata y A. media. El gen fue localizado
dentro de plásmidos de ambos aislados, lo cual produjo un incremento de la
concentración inhibitoria minima para quinolonas y fluoroquinolonas una vez
transferidos a Escherichia coli . La identificación de genes qnrS2 en A. punctata fue
parte de una nueva estructura genética que corresponde con la inserción de
elementos cassette. Esta identificación mediada por genes qnr en plásmidos fuera
de la familia Enterobacteriaceae destaca un reservorio en estas especies del
40
medioambiente acuático, además de una posible difusión de esta resistencia dentro
de los bacilos Gram negativos. Es importante mencionar que las quinolonas son
extensamente utilizadas en acuicultura lo que representa una presión selectiva de
resistencia a quinolonas.
Thayumanavan y col., (2003), mostraron la incidencia de Aeromonas
hydrophila en pescados y camarones recién capturados de 4 principales sitios
comerciales de desembarque de la costa sur de India durante un año. De las 514
muestras se aislaron 255 cepas de Aeromonas hydrophila con elevados niveles de
toxina de tipo hemolisina 78,4% y resistencia a antibióticos. Convirtiéndose en un
riesgo potencial a la salud humana.
En una investigación realizada por Schmidt y col., (2001), se encontraron
integrones de clase 1 en 26 de 40 aislados antibiótico-resistentes de Aeromonas
salmonicida patógena de peces del Norte de Europa y Norte America. Dichos
integrones están presentes en un amplio rango de Gram negativos en medio
acuático, y a pesar de no ser móviles por si mismos se han vinculado a plásmidos
conjugativos o transposones; determinándose al parecer que contribuyen
sustancialmente a la propagación horizontal de la resistencia antimicrobiana dentro
de estas especies. La aparición de esta resistencia en peces es de gran
preocupación en la acuicultura, representando perdidas económicas y cuando la
resistencia es generalizada impediría un tratamiento medico eficaz en los brotes
clínicos (Thayumanavan y col., 2003).
En la epidemiología de los brotes nosocomiales por este género, la
información permanece escasa, sin embargo, se han planteado brotes aislados
descritos en publicaciones, tal como lo describe un estudio realizado por el
departamento de microbiología medica de un Centro pediátrico en Chandigarh,
India; donde seis niños ingresados en la unidad de Hematología-Oncología
desarrollaron diarrea aguda por un periodo de 4 semanas de marzo a abril en el año
2001. Aeromonas veronii biovar sobria fue aislada de las muestras fecales de dichos
pacientes. También se analizaron muestras de los diversos sitios y equipos de esta
unidad. Las cepas mostraron biotipos y antibiogramas similares. La diarrea cedió
espontáneamente en dos de los pacientes mientras los demás respondieron a la
41
terapia antimicrobiana. El brote pudo controlarse con las medidas de intervención
aplicadas, dentro de estas: pacientes aislados, sumideros desinfectados, lavado de
manos por parte del personal medico para manipular a los pacientes, a los
cuidadores se les recomendó lavar las manos adecuadamente y limpiar los
utensilios correctamente antes de alimentar a los niños. Desde esa fecha no se
describieron mas aislados (Taneja y col., 2004).
En lo que respecta al significado clínico; Aeromonas mesófilas están
emergiendo como importantes patógenos en humanos bajo la forma de colonizados
o infectados, tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo, causando
gran variedad de infecciones intestinales y extraintestinales. Alrededor del 85% de
los aislamientos clínicos del género Aeromonas se corresponde con tres
genoespecies: A. hydrophila (HG1), A. caviae (HG4) y A. veronii bv sobria (HG8).
Dentro de las infecciones extraintestinales se incluyen: celulitis o infecciones de
heridas, principalmente infecciones cutáneas superficiales; aunque estas pueden
llegar a complicarse y afectar tendones, músculo y hueso; infecciones del tracto
respiratorio, desde epiglotitis a neumonía; infecciones oculares, Síndrome
Hemolítico Urémico o Enfermedad del riñón (este síndrome es una complicación de
la diarrea ocasionada por Aeromonas donde es necesario el transplante renal);
septicemia asociada con la enfermedad subyacente, como la cirrosis, leucemia,
cáncer y diversas infecciones asociadas a la hospitalización como: raras infecciones
del tracto urinario, infecciones de heridas quirúrgicas, meningitis, peritonitis,
endocarditis, u otras infecciones graves (EPA Office of Water, 2006).
Algunas de las condiciones predisponentes para la infección del tracto
gastrointestinal por Aeromonas incluyen: hospitalización, terapia antimicrobiana,
neutralización o baja producción de acido gástrico, enfermedad hepática y
condiciones entéricas subyacentes como: cáncer de estomago o colon, sangrado
gastrointestinal, cirugía de colon o enfermedad inflamatoria intestinal idiopática,
bebes y niños alimentados con fórmula con alteración de la flora intestinal pueden
llegar a ser colonizados por Aeromonas dando lugar a enfermedades diarreicas
crónicas; Aeromonas se han aislado de suministros de agua para consumo cloradas
y no cloradas lo que constituye un factor de riesgo. La infección selectiva entre
personas con exposición común se ha atribuido a las diferencias en la
42
susceptibilidad del huésped, especialmente en los niños, sin embargo, estos factores
determinantes no han sido elucidados. Dentro de los factores predisponentes para
las infecciones extraintestinales están: trauma, cirrosis, diabetes, alcoholismo,
malnutrición severa, fallas renales y enfermedad vascular periférica severa (EPA
Office of Water, 2006).
En lo que se refiere a la enfermedad gastrointestinal Aeromonas han sido
aisladas mas frecuentemente de muestras fecales de niños por debajo de los 5 años
de edad, mientras que el aislamiento de Aeromonas en otros sitios fuera del tracto
intestinal ocurre típicamente en poblaciones de adultos (EPA Office of Water, 2006).
Las Aeromonas son causales de enfermedad diarreica aguda de corta
duración, heces diarreicas crónicas en niños, adultos mayores e
inmunocomprometidos (Albarado y col., 2005; EPA Office of Water, 2006; Rabaan y
col., 2001; Kirov y col., 2004; Sinha y col., 2004).
Existe una fuerte asociación de las especies de Aeromonas con
gastroenteritis en los niños. La enfermedad diarreica parece ser más común en la
población pediátrica por debajo de los 3 años, a su vez los niños menores de dos
años con múltiples complicaciones médicas subyacentes corren riesgo de padecer
sepsis por Aeromonas en el tracto intestinal (Janda y Abbott, 1998).
El poder enteropatogénico de estos microorganismos todavía es controversial,
ya que solo algunas cepas están relacionadas con gastroenteritis en humanos a
pesar de que se pueden ingerir continuamente estas bacterias del agua y alimentos.
Aun cuando han sido demostrados sus factores de virulencia como: enterotoxina,
citotoxinas, hemolisinas, proteasas, entre otros; no ha sido posible predecir
patogenicidad para el tracto gastrointestinal basado solo en la presencia y
producción de dichos factores reconocidos; esto debido a que no siempre
corresponden a la virulencia en humanos. Aunado a ello no se dispone de un
modelo animal adecuado para reproducir la sintomatología diarreica observada en el
ser humano (EPA Office of Water, 2006; Janda y Abbott, 1998; Vilches, 2007).
43
En la actualidad se siguen investigaciones acerca de los soportes suficientes
que expliquen el porque Aeromonas no se ha identificado como causal de brotes de
gastroenteritis; aunque diversos autores en respuesta a ello especulan que la baja
tasa de positividad se debe a técnicas inadecuadas de recolección, almacenamiento
o transporte de las muestras (Ghenghesh y col., 2008; Janda y Abbott, 1998).
El aislamiento de Aeromonas en pacientes pediátricos sin síntomas diarreicos
en los países en desarrollo no es poco común. Por tal motivo, el adecuado
aislamiento y la determinación de los factores de virulencia de estas especies son de
suma importancia tanto en niños sin diarreas como en los pacientes pediátricos con
síntomas gastrointestinales (Ghenghesh y col., 2008).
La diarrea debida a Aeromonas presenta manifestaciones clínicas variadas; la
diarrea aguda acuosa autolimitada es común. El moco y la sangre pueden
observarse en más del 25% de las heces de niños con Aeromonas asociadas a
diarreas y cercano al 35% de estos pacientes exhiben fiebre y vómitos. La presencia
de sangre indica disentería (Ghenghesh y col., 2008).
Aeromonas caviae es la especie que ha sido mas comúnmente asociada a
gastroenteritis en la edad infantil y puede incluso llegar a imitar una enfermedad
inflamatoria intestinal en los niños (Rabaan y col., 2001). A. veronii bv sobria puede
asociarse con una enfermedad tipo cólera caracterizada por dolor abdominal (60%)
fiebre y nausea (20%). En la diarrea disentérica que asemeja a la shigellosis, los
pacientes sufren de dolor abdominal severo y las muestras fecales contienen moco,
sangre y polimorfonucleares, a diferencia de las muestras provenientes de las
diarreas agudas acuosas las cuales no los contienen, los síntomas de las diarreas
agudas son: dolor abdominal (60-70%), fiebre y vómito (20-40%) y nauseas (20%).
De un 10-15% de pacientes con enfermedad tipo cólera ó disentérica se encuentran
co-infectados con otro enteropatógeno (Murray y col., 2007).
44
Susceptibilidad Antimicrobiana en Aeromonas.
En artículos recientes de la susceptibilidad antimicrobiana en Aeromonas
donde se incluyen solo las cepas bien caracterizadas genéticamente, han permitido
generar información y el conocimiento actual de su susceptibilidad (tabla 4) (Murray
y col., 2007).
Tabla 4. Patrones de susceptibilidad del género Aeromonas
Susceptibilidada Agente antibiótico
Resistente Ampicilina( excepto A. trota 100% sensible) y A. caviae 35% susceptible
Variable Ticarcilina o Piperacilina (excepto A. veronii bv. sobria 100% resistente) y A. trota 100% sensible. Cefalotina. Cefazolina. Cefoxitin(excepto A. veronii. bv veronii 100% sensible) Cefuroxima. Ceftriaxona. Cefotaxima.
Susceptible Ciprofloxacinac
Gentamicina. Amikacina. Tobramicina (A. Veronii bv veronii 42% resistente). Imipenem (A. Jandaei 65% resistente; A. veronii bv veronii 67% resistente) Trimetoprim-Sulfametoxazole
a: Resistente o Susceptible, mayor o igual 90% de los aislados son resistentes o susceptibles; variable, 10 al 90% de los aislados son susceptibles.
c: Datos para resistencia al ácido nalidíxico y pipemidico en 20 a 26% de aislados de A. caviae y A. hydrophila
respectivamente, y 88% en cepas clínicas de A. veronii sugieren futura resistencia a Fluoroquinolonas (Murray y col., 2007).
Muchas clases de agentes antimicrobianos como cloranfenicol, tetraciclina,
trimetoprim-sulfametoxazole, aminoglucósidos, cefalosporinas de amplio espectro,
imipenem, meropenem, fluoroquinolonas, han manifestado ser activos contra las
Aeromonas. Hasta ahora no se han diseñado ensayos que delineen con claridad el
tratamiento óptimo de las infecciones invasivas por éstas. La selección de la terapia
óptima se ha basado en los reporte de casos de estudio, la data de susceptibilidad in
vitro y experimentos en animales. Sin embargo, ya se conoce que la lista de terapia
racional para Aeromonas se esta acortando debido al incremento de los
45
mecanismos de resistencia sobretodo en la amplia gama de betalactámicos usados
(Ko y col., 1996; Ko y col., 2003).
Mecanismos intrínsecos (cromosómico) y adquiridos de resistencia a betalactámicos en Aeromonas
Los patrones de susceptibilidad de Aeromonas ante los diferentes grupos de
antimicrobianos han sido en la actualidad bien documentados; del mismo modo se
ha visto como ha evolucionado la resistencia en este género en numerosas
investigaciones. Tal como se ha observado en un grupo de antibióticos usados
ampliamente en las infecciones por estas especies, como son los antibióticos
betalactámicos. La acción de este grupo de antibióticos está a nivel de la pared
celular bacteriana (peptidoglicano), al inhibir su síntesis, principalmente en la fase de
crecimiento o división de la bacteria (Perozo y Castellano, 2005).
El incremento de la resistencia a los antibióticos betalactámicos en
Aeromonas se ha atribuido a enzimas betalactamasas (enzimas que hidrolizan al
anillo betalactámico), las cuales son capaces de hidrolizar a casi todos estos
antimicrobianos inclusive a los carbapenems (betalactámicos de mayor espectro). En
la actualidad se conoce que las especies de Aeromonas pueden expresar 3 tipos
cromosomales de β- lactamasas, inducidas por antibióticos betalactámicos:
incluyendo el grupo 1 de clase molecular C (cefalosporinasa), el grupo 2d clase
molecular D penicilinasa y el grupo 3 clase molecular B métalo- β-lactamasa
(carbapenemasa); este mecanismo de resistencia se ha convertido en el principal
para este género (tabla 5) (Murray y col., 2007; Ko y col., 1998).
Las enzimas betalactamasas se han clasificado en dos sistemas: la
clasificación de Ambler, la cual se basa en la estructura molecular de la
betalactamasa y su secuencia de aminoácidos, donde se reconocen cuatro tipos
moleculares desde la A hasta D. Los tipos A, C y D incluyen grupos de enzimas
relacionados por su evolución que poseen serina en su zona activa. Las
betalactamasas de tipo B tienen una o dos moléculas de zinc en su zona activa y
son inhibidas por EDTA (ácido etilendiaminotetraacético). La clasificación de Bush
se basa en los substratos que la betalactamasa hidroliza y en la inhibición de su
46
actividad por compuestos como el ácido clavulánico, EDTA, y aztreonam u oxacilina.
Este modelo funcional de clasificación de las betalactamasas, propuesto por Bush,
Jacoby y Medeiros en 1995, define los cuatro siguientes grupos de acuerdo a los
substratos hidrolizados y perfiles de inhibición:
• Grupo 1— cefalosporinasas que no son adecuadamente inhibidas por el Ácido
Clavulánico.
• Grupo 2— penicilinasas, cefalosporinasas y carbapenemasas que generalmente
son inhibidas por inhibidores de beta-lactamasas como el ácido clavulánico,
sulbactam y tazobactam. Los subgrupos también se definen de acuerdo a las tasas
de hidrólisis de carbenicilina o cloxacilina (oxacilina) producidas por las penicilinasas
del Grupo 2.
• Grupo 3—metalo-beta-lactamasas que hidrolizan penicilinas, cefalosporinas, y
carbapenems que son inhibidas por EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) y no por
inhibidores estructuralmente relacionados a los betalactámicos.
• Grupo 4—penicilinasas que no son inhibidas adecuadamente por el ácido
clavulánico (Bush y col., 1995).
47
Tabla 5. Esquema de Clasificación Funcional y Molecular de Betalactamasas
Grupo Funcional de Bush, Jacoby-
Medeiros
Tipo Molecular de Ambler
Atributos de las Beta-Lactamasas en el Grupo Funcional
Grupo Subgrupo
1(*) C AmpC beta-lactamasas en bacteria Gram negativa. Los genes a menudo son cromosómicos pero pueden
ser plásmido-codificados. Confiere resistencia a todos los tipos de betalactámicos, excepto los carbapenemes (a menos que se combinen con
cambios en porinas). No son inhibidas por el ácido clavulánico.
2 A, D La mayoría de enzimas del Grupo 2 son inhibidas por el ácido clavulánico (a menos que se indique lo
contrario).
2a A Incluyen penicilinasas estafilococica y enterococica. Confiere alta resistencia a las penicilinas.
2b A Beta-lactamasas de amplio espectro, incluyen TEM-1 y SHV-1, primordialmente de bacterias Gram.
negativas.
2be A Las beta-lactamasas de espectro extendido (BLEEs) confieren resistencia a las penicilinas,
oximinocefalosporinas y monobactàmicos.
2br A Beta-lactamasas tipo TEM (IRT) y una tipo SHV que son resistentes a los inhibidores.
2c A Enzimas que hidrolizan la carbenicilina.
(*) 2d D Enzimas que hidrolizan la cloxacilina-(oxacilina)-; inhibidas
moderadamente por el ácido clavulánico.
2e A Cefalosporinasas
2f A Enzimas que hidrolizan los carbapenemes con serina en la zona activa.
3 (*) 3a, 3b, 3c B Metalo-beta-lactamasas que confieren resistencia a los carbapenemes y todos los tipos de betalactámicos
excepto los monobactamicos (aztreonam). No
inhibidas por el ácido clavulánico.
4 ¿ Penicilinasas misceláneas que no caben en otros grupos.
No son inhibidas por el ácido clavulánico.
Fuente: (Bush y col., 1995). (*) Betalactamasas presentes en Aeromonas.
Mutantes desreprimidos que constitutivamente producen los tres tipos de
betalactamasas cromosòmicas inducibles han sido seleccionados in vitro de las
especies de A. hydrophila, A, caviae y A. veronii. Por otro lado, se han encontrado
plásmidos con resistencia a betalactámicos en aislados clínicos y medioambientales,
asimismo, en aislados de A. salmonicida que infecta a los peces. La evolución de
cepas de Aeromonas sensibles a betalactámicos a resistentes durante la terapia
clínica con estos antibióticos han sido descritas para aislados de A. caviae y A
48
.hydrophila, donde se menciona que el uso de la cefotaxima sería un posible
promotor del desarrollo de resistencia a betalactámicos (Ko y col., 1998).
Los perfiles genéticos en las betalactamasas en A. veronii bv sobria también
han sido bien caracterizados y se corresponden con los 3 tipos de enzimas
cromosomales inducibles por betalactámicos. En otras Aeromonas spp. se han
encontrado que producen múltiples betalactamasas con perfiles bioquímicos
similares a A. veronii (Walsh y col., 1997).
Las betalactamasas de tipo AmpC cromosomales en Aeromonas han sido
determinadas en Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae, Aeromonas veronii bv
sobria, Aeromonas jandaei, Aeromonas salmonicida. Su mecanismo de hidrólisis es
activo sobre las penicilinas, oximino-cefalosporinas como ceftazidima, cefotaxima y
ceftriaxona, cefamicinas como cefoxitin y cefotetan inclusive puede hidrolizar
monobactamicos como el aztreonam (tasa menor 1%); en su fenotipo desreprimido
in vitro puede atacar a todos los betalactámicos (incluso cefalosporinas de cuarta
generación como el cefepime) exceptuando los carbapenemes; la enzima no es
inhibida por el acido clavulánico; cloxacilina, oxacilina y aztreonam son buenos
inhibidores (Jacoby, 2009).
La clase D serina-carbapenemasa en Aeromonas también llamada OXA
Betalactamasas poseen actividad hidrolìtica contra penicilinas, algunas
cefalosporinas e imipenem, son por lo general pobremente inhibidas por el acido
clavulánico y EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) (Queenan y Bush, 2007).
Las metalobetalactamasas en Aeromonas tienen importancia significativa; se
caracterizan por la habilidad de hidrolizar con facilidad a los carbapenemes
sobretodo imipenem y meropenem, por su resistencia a los inhibidores comerciales
de Betalactamasas disponibles y por su susceptibilidad de ser inhibidas por
quelantes de iones metálicos. El espectro de hidrólisis por estas enzimas es muy
amplio, además de los carbapenemes, hidrolizan cefalosporinas y penicilinas pero
carecen de capacidad de hidrolizar el aztreonam. El mecanismo de hidrólisis
depende de la interacción de los betalactámicos con iones de zinc en el sitio activo
de la enzima, resultando un rasgo distintivo su inhibición por el EDTA (quelante de
49
iones Zn+2 y otros cationes divalentes) (Queenan y Bush, 2007). Estas enzimas han
sido agrupadas en 3 subclases: B1, B2 y B3 (tabla 6). En la subclase B1 se incluyen
una variedad de enzimas codificadas a nivel cromosomal, además, se incluyen
metalobetalactamasas transferibles; dentro de las familias mas comunes: VIM, IMP,
GIM, SPM, encontradas en una variedad de integrones donde se han incorporado
como genes cassette. Cuando estos integrones se asocian con plásmidos o
transposones la transferencia entre las bacterias se ve facilitada. La subclase B2
incluye CphA y ImiS (metalobetalactamasas de Aeromonas); en la subclase B3
incluye enzimas de patógenos oportunistas (Morán y col., 2007; Queenan y Bush,
2007).
Los datos recientes indican que las metalobetalactamasas de A. hydrophila y
A. veronii bv sobria tienen similares perfiles. A su vez el gen cphA que codifica para
metalobetalactamasa en A. hydrophila ha mostrado hibridación con un amplio rango
de Aeromonas spp, incluyendo A. veronii bv sobria; homólogos de esta se han
encontrado en A. veronii, A. caviae, A. jandaei, mostrando su amplia ocurrencia en el
género (Walsh y col., 1997; Walsh y col., 1998).
Dentro de la resistencia adquirida en Aeromonas, Neuwirth y col., (2007),
aislaron por primera vez en Francia una metalobetalactamasa tipo IMP-19 en
Aeromonas caviae, ubicada en un gen blaIMP-19, esta fue recuperada de una muestra
de heces de un niño de 8 años hospitalizado por diarrea aguda, el niño no había
estado antes hospitalizado y ni recibido terapia antibiótica en 6 meses anteriores.
Los investigadores concluyeron que aislado no tuvo importancia clínica, sin
embargo, represento el primer aislado de una metalobetalactamasa transferible en
un aislado clínico, además con estos resultaron afirmaron que el reservorio de estos
genes blaIMP se encuentran muy extendidos.
Libisch y col., (2008) aislaron por primera vez en un hospital de Budapest una
metalobetalactamasa trasferible tipo VIM en una cepa de Aeromonas hydrophila
ubicada en un gen blaVIM-4 contenido en un integron, esta fue recuperada de una
muestra fecal de un paciente de 68 años con cirrosis. Concluyeron que las técnicas
convencionales como el E-test no las determinan sino que es necesario su
diagnostico molecular.
50
El origen de estas enzimas adquiridas en patógenos humanos permanece
desconocido. Las especies de Aeromonas portadoras de dichos genes, podrían
representar un vinculo entre sus aislados medio ambientales y patógenos clínicos,
por ende son necesarios estudios moleculares para caracterizar integrones de
fuentes ambientales que compartan los mismos nichos ecológicos de Aeromonas
móviles (Libisch y col., 2008).
La potencial importancia sobre las especies de Aeromonas que cargan con
genes de resistencia a antibióticos se debe a su entrada a la cadena alimentaria y su
posterior infección o colonización en el humano (Libisch y col., 2008). Se han
detectado cassettes portadores de resistencia a diversos antimicrobianos en
Aeromonas en muestras clínicas, como es el caso del Integron de clase 1 aislado en
especies de A. caviae, A. hydrophila, A. veronii de pacientes con cuadros diarreicos
en México, el cual poseía genes de resistencia a trimetoprim, oxacilina, cloranfenicol
y aminoglucósidos como estreptomicina (Pérez y col., 2009). En Taiwán, se han
detectado y caracterizado integrones de clase 1 con predominio en resistencia a
aminoglucósidos en aislados clínicos de Aeromonas spp. (Lee y col., 2008).
Los integrones de clase 1 son comunes en especies del medio acuático
como A. salmonicida de peces, aunque también han sido identificados de A. caviae y
A. veronii bv sobria en carne de consumo animal. Existen al menos tres clases de
integrones de tipo 1 en Aeromonas; su mecanismo molecular continua por ser
elucidado (Lee y col., 2008).
Otro de los hallazgos recientes en Aeromonas ha sido la presencia de
bombas o sistemas de eflujo que expulsan al exterior los agentes antimicrobianos,
contribuyendo a la multidroga-resistencia. Hernould y col., (2008) detectaron en A.
hydrophila ATCC 7966 la bomba de eflujo denominada AheABC (Aeromonas
hydrophila eflujo B, perteneciente a la familia RND Resistencia-nodulación-División celular implicados principalmente en la resistencia de bacilos Gram
negativos del medio ambiente que se podrían convertir en patógenos oportunistas)
estrechamente relacionado con el principal sistema de eflujo en Escherichia coli
(AcrB).
51
En la literatura se ha descrito transferencia de resistencia vía plasmidica a
Aeromonas por enzimas BLEE (betalactamasas de espectro extendido). Las BLEE
en los Gram Negativos principalmente en enterobacterias son enzimas que se han
originado de enzimas β-lactamasas plasmídicas clásicas (TEM-1, TEM-2 o SHV-1)
por mutaciones concretas en los genes que las codifican, originando cambios en su
secuencia de aminoácidos. Estas mutaciones han dado lugar a una gran variedad de
enzimas hasta la actualidad, que le confieren al microorganismo que las produce,
resistencia a un espectro extendido de antibióticos β-lactámicos, usualmente activos
contra bacterias Gram negativas, como cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima,
aztreonam y cefpodoxima, dejando como opción terapéutica solo los carbapenemes
(Perozo y Castellano, 2005).
En un caso de sepsis por A. hydrophila (BLEE positiva) de un paciente
pediátrico que cursaba con neumonía y diarrea se describe la posible transferencia
in vivo de una TEM-24 (β-lactamasa de espectro extendido codificada en un
plásmido de la bacteria entérica Enterobacter aerogenes) transmitida por
conjugación (Murray y col., 2007). De igual modo un caso de una paciente de 87
años de edad con fascitis necrotizante por A. hydrophila con probable transferencia
in vivo de una TEM-24 de Enterobacter aerogenes, a su vez producía
betalactamasas cromosòmicas B, C Y D propias de Aeromonas (Fosse y col., 2004).
En el Centro de Referencia Bacteriológica del Hospital Universitario se han
descrito cepas de Aeromonas aisladas de coprocultivos en pediatría BLEE positivas
(datos no publicados, obtenidos de comunicaciones con el personal).
Mecanismos de resistencia de fluoroquinolonas en Aeromonas
Las quinolonas son antibióticos bactericidas, de amplio espectro
antimicrobiano, su amplio uso en la medicina humana y veterinaria ha dado lugar a
crecientes niveles de resistencia. Los principales mecanismos de resistencia a
quinolonas están codificados cromosómicamente y consisten en: la modificación del
sitio blanco de acción con cambios en la DNA girasa (gyrA/ gyrB) y o topoisomerasa
IV y una disminución de la concentración intracelular del antibiótico debido a
52
impermeabilidad o sobreexpresiòn de sistemas de eflujo. Recientemente la
resistencia a quinolonas mediada por plásmidos ha sido descrita en
Enterobacteriaceae y familias como Aeromonadaceae and Vibrionaceae. Los
plásmidos transportan genes qnr (genes de resistencia a quinolonas), están
comprendidos en la actualidad por 5 familias: qnrA, qnrB, qnrC, qnrD y qnrS que
codifican proteínas pentapeptìdicas repetidas que bloquean la acción de
ciprofloxacina (fluoroquinolona) en la DNA girasa bacteriana y topoisomerasa IV. Lo
cual resulta en una resistencia a quinolonas de bajo nivel y proporciona un fondo
favorable para una mayor resistencia a concentraciones de quinolonas que serian
letales en su ausencia, a través de los cambios secundarios en la DNA girasa,
topoisomerasa IV o eflujo. Existen otros plásmidos que han sido encontrados que
codifican resistencia a quinolonas: aminoglucósido acetiltransferasa AAC (6 ') Ib-cr
(modificación enzimática, acetilación al antibiótico), QepA (Sistema de eflujo) y
recientemente descrito en plásmido la bomba de eflujo OpxAB (Arias y col., 2010).
Las mutaciones que confieren resistencia a fluoroquinolonas alteran
principalmente el sitio blanco de acción (las enzimas diana, topoisomerasas tipo II: la
DNA girasa y topoisomerasa IV), dichas enzimas catalizan cambios topológicos
dependiente de energía ATP en el clivaje de la doble cadena de DNA y su
mecanismo de reincorporación. La DNA girasa tiene como principal función
mantener el superenrrollamiento negativo, por ende la topología del DNA bacteriano.
Ambas enzimas son heterotetrameros que consisten de dos subunidades de GyrA Y
GyrB en la DNA girasa y de sus proteínas homologas ParC y ParE en la
topoisomerasa IV, los genes que codifican para estas subunidades (gyrA, gyrB, parC
y parE se encuentran en una zona llamada región determinante de resistencia a
quinolonas QRDR) (Goñi-Urriza y col., 2002).
La girasa parece ser la diana primaria de quinolonas en Gram negativos,
donde las mutaciones que ocurren principalmente en GyrA han sido suficientes para
la determinación de elevada resistencia; las mutaciones afectan con mayor
frecuencia al codón 83- residuo de serina y en segundo lugar el codón 87 por
cambio de aminoácidos; dobles mutaciones sin sentido en estas posiciones
incrementan la resistencia. Por otro lado, las mutaciones que ocurren en ParC en la
región QRDR son expresadas solo en presencia de mutaciones en GyrA. Dobles
53
mutaciones sin sentido en GyrA y ParC se han asociado a niveles elevados de
resistencia en comparación a mutaciones solo en GyrA. A su vez alteraciones en los
dominios GyrB y ParE las cuales son de escasa frecuencia que interactúan con
GyrA y ParC respectivamente también contribuyen a la resistencia a quinolonas. En
las Aeromonas mesofìlicas, girasa y topoisomerasa IV son las dianas primarias y
secundarias para quinolonas respectivamente (Goñi-Urriza y col., 2002).
Las Aeromonas han mostrado ser altamente sensibles a las fluoroquinolonas
en la mayor parte del mundo. Sin embargo, en ciertos estudios realizados con cepas
clínicas, se ha observado la aparición de resistencia (Ko y col., 1996); además, a
nivel medioambiental, en diversas especies han sido detectados elevados niveles de
resistencia, siendo de gran importancia, ya que las aguas dulces son fuente principal
de infección por estos organismos para el humano (Goñi-Urriza y col., 2002).
Aunque las fluoroquinolonas se han reportado en muchos estudios, inclusive
en pediatría como tratamiento de elección para infecciones por Aeromonas, esta
bien establecido que el ácido nalidíxico (quinolona de primera generación) predice el
desarrollo de posterior resistencia a fluoroquinolonas durante la terapia, por ende
falla terapéutica. Concentraciones Inhibitorias mínimas elevadas para ácido
nalidíxico indican mutación en el sitio blanco de acción (DNA girasa); mientras que
CIM elevadas para ácido nalidíxico y ciprofloxacina (fluoroquinolona de segunda
generación), indican doble mutación y en ambos casos ineficacia con el uso de
fluoroquinolonas (Arias y col., 2010; Murray y col., 2007).
Con el fin de evitar las inadecuadas terapias empíricas, la aparición de la
resistencia a quinolonas al igual que en todos los antimicrobianos empleados en
Aeromonas debería ser monitoreada a través de estudios de vigilancia continua en
las diversas áreas geográficas para los aislados clínicos de las especies de
Aeromonas, donde se evalúe la prevalencia en mutaciones codificadas a nivel
cromosómico y la emergencia de la resistencia mediada en plásmidos (Arias y col.,
2010).
54
MMEETTOODDOOLLOOGGÍÍAA
Localización
El estudio se realizó en el Centro de Referencia Bacteriológica del Servicio
Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo (S.A.H.U.M), Estado Zulia.
Población de estudio
La población en estudio estuvo conformada por pacientes pediátricos en
edades de 0 a 5 años de las diversas áreas de atención del S.A.H.U.M: UCI
pediatría, UCAIEPI (Unidad de Capacitación para la Atención Integrada a las
Enfermedades Prevalentes de la Infancia), reten, triaje de pediatría, observación
pediátrica, hospitalización de pediatría, emergencia pediátrica, neonatología,
oncología pediátrica, consulta de gastroenterología infantil, fundación INNOCENS);
también se incluyeron algunos pacientes referidos de otros hospitales al Hospital
Universitario y externos (cortesías) por contar con los criterios tomados para la
inclusión en este trabajo de investigación. El período de estudio fue: diciembre de
2008 - agosto de 2009 (Anexo A).
Criterios de inclusión
En la investigación se incluyeron los niños con edades comprendidas entre
los 0 y 5 años, atendidos en los diversos servicios del hospital universitario y
referidos de otros hospitales y externos, para el período de estudio, que presentaran
sintomatología diarreica, síntomas gastrointestinales únicos y o asociados a otro
cuadro, pero con base en síntomas digestivos.
Para la selección de la población de estudio no fueron tomados en cuenta: el
sexo ni la condición socioeconómica. A pesar de que el área de atención del hospital
55
abarca a las personas de todos los estratos socio-económicos, la población de
mayor demanda de los servicios del mismo, es la de menor acceso a los servicios
privados de salud.
Criterios de exclusión
El incumplimiento de al menos uno de los criterios mencionados
anteriormente, excluía a los aspirantes para participar en el estudio.
Muestras
Durante el período comprendido entre diciembre de 2008 agosto de 2009, se
tomaron muestras de heces diarreicas de los niños participantes en el estudio. Unas
fueron tomadas con dos hisopos estériles al paciente pediátrico, por parte del
personal de enfermería, las cuales fueron preservadas en el medio de transporte de
Cary and Blair hasta su procesamiento, el cual se llevo a cabo dentro de no mas de
2 horas. De las muestras diarreicas contenidas en los colectores se tomaron con dos
hisopos estériles para la siembra en placas y uno dentro del medio liquido de
enriquecimiento (agua peptonada alcalina), tomando sobretodo de las porciones
muco-sanguinolentas. De igual modo, para las muestras contenidas en el medio
Cary and Blair con los dos hisopos se sembró en placas y uno de estos se almacenó
en el medio líquido de enriquecimiento para su posterior subcultivo a placa.
Aislamiento e identificación de Aeromonas
Para el cultivo y aislamiento de fenoespecies de Aeromonas; se inocularon los
medios de Agar Sangre Ampicilina 20ug/ml (medio selectivo recomendado en la
metodología de Murray y col., 2007); agar Mac Conkey (medio diferencial) y agar
Nutritivo (medio basal); a su vez se colocó un hisopo estéril conteniendo una porción
de la muestra dentro de un tubo con agua peptonada alcalina (pH: 8,4-8,6), como
medio de enriquecimiento.
56
Condiciones de incubación:
Se colocaron las placas en estufa de aerobiosis a 35-37ºC por 24-48h.
Después del período de incubación se realizó la lectura del crecimiento. Las
muestras en agua peptonada alcalina se incubaron en la misma atmósfera entre 6-
8horas a 35ºC.
Subcultivo:
Se realizó a las 6-8h de incubación. Del agua peptonada alcalina a medio
agar Nutritivo en placa con el hisopo contenido en el tubo, luego se hizo el rayado
con el asa. Posterior a ello los caldos fueron descartados. Las placas se incubaron
en aerobiosis 35-37ºC por 24-48h máximo. El procesamiento a partir de estas placas
se siguió igual que la muestra original.
Lectura inicial de los medios y conducta aplicada:
Agar Nutritivo en placa (ANp): el agar nutritivo en placa se utilizó para
determinar la presencia de enzimas oxidasa, típicas en Aeromonas. Se le practicó la
prueba colocando el reactivo de la oxidasa; el más recomendado es la solución
acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs) a
nivel del trazo central y se procedió a realizar en colonias aisladas si en el trazo
central aparecía positiva la prueba; por el método indirecto del papel de filtro; en
donde se colocaron 2 a 3 gotas del reactivo en el centro de un trozo de papel de
filtro colocado sobre una placa de petri; con el asa previamente esterilizada se tomó
la colonia a probar y se extendió sobre el papel impregnado. En los resultados
positivos, se observó un cambio de color gradual de lavanda a púrpura y luego
negruzco intenso tanto en el trazo central de la placa como en las colonias aisladas
(Figura 4). Sospechando así de las familias Vibrionaceae, Aeromonadaceae que
fue la de interés en esta investigación y del género Plesiomonas.
57
Figura 4. Oxidasa positiva de Aeromonas en agar Nutritivo
La prueba del String test (desoxicolato de sodio) o prueba de la formación de
hebra: se le realizó a las cepas oxidasa positiva en un agar nutritivo con crecimiento
de 24 horas. En este estudio las cepas dieron el String test negativo, lo cual es
común para el género Aeromonas y Plesiomonas aunque en ocasiones algunas
Aeromonas dan la prueba positiva con formación de la hebra blanquecina. En la
literatura se describe que esta prueba, aunque no muy especifica, se utiliza para
separar la familia Vibrionaceae (String test positivo) de la familia Aeromonadaceae, a
pesar de que el String test no es 100% negativo en Aeromonas.
Las colonias de interés tomadas como sospechosas en cada placa fueron:
Del agar nutritivo se tomaron colonias aisladas oxidasa positiva. Del agar Mac
Conkey se tomaron colonias fermentadoras o no de la lactosa y del Agar Sangre
Ampicilina (ASA) 20ug/ml: se seleccionaron colonias α y β hemolíticas, a las cuales
se le realizó un extendido y se coloreó según la técnica de Gram; las
correspondientes a formas bacilares se les tomo en cuenta (Figura 5). Cada una de
estas colonias se sembró en medio de TSI y LIA (en la búsqueda de combinaciones
sugestivas del genero Aeromonas) y un nuevo agar Nutritivo en placa para prueba
de oxidasa (Figura 6). De las combinaciones de interés se procesó el TSI para la
identificación definitiva y el agar Nutritivo para la susceptibilidad antimicrobiana.
58
Figura 5. Tipos coloniales de interés en las placas
Agar Nutritivo Agar Mac Conkey Agar sangre Ampicilina
20ug /ml
A cada colonia se le realizó:
TSI, LIA y agar Nutritivo en placa numerados en orden de acuerdo al número
de colonias tomadas (Figura 6).
Figura 6. Combinación de TSI - LIA y Oxidasa positiva en agar nutritivo en placa de una
colonia de interés
Incubación 35-37ºC en aerobiosis. Lectura a las
24h
De las combinaciones de TSI/LIA (enumeradas al igual que en la siembra en el agar Nutritivo) de interés, se descarto el LIA y se procesó el TSI para identificación bioquímica de especie y del
respectivo Agar nutritivo se realizó el antibiograma.
59
Combinaciones de interés del TSI (A) y LIA (B) para Aeromonas: (Figura 7).
(1)- TSI: Ac/Ac gas (+) H2S (-), LIA: Alc/Alc
(2)- TSI: Ac/Ac gas (-) H2S (-), LIA: Ac/Alc.
(3)- TSI: Ac/Alc gas (+) H2S (-), LIA: Alc/Alc.
(4)- TSI: Ac/Alc gas (-) H2S (-), LIA: Alc/Alc.
Figura 7. Combinaciones de interés de TSI y LIA para Aeromonas
(A / B)
(1) (2) (3) (4)
La identificación presuntiva de las colonias, como sospechosas del género
Aeromonas, se basó en una reacción positiva a la prueba de la oxidasa, un string
test negativo (aunque puede dar positivo en algunos casos), y reacciones
bioquímicas características en los medios de Triple Azúcar Hierro (TSI) y Lisina
Hierro Agar (LIA).
La identificación definitiva de la especie de los aislamientos se realizó de
acuerdo al esquema diagnostico convencional, basado en pruebas bioquímicas
descrito por Janda y Abbott, 1998; Murray y col., 2007 con algunas modificaciones
introducidas por el Centro de Referencia Bacteriológica del Servicio Autónomo del
Hospital Universitario de Maracaibo. A partir del TSI de interés, se sembró: agar
Nutritivo, D-manitol, inositol, salicin, arabinosa, gas D-glucosa, sucrosa,
aminoácidos: lisina, arginina y ornitina (decarboxilación), bilis esculina, caldo salado
6.5%, Vogues Proskauer y agar DNasa (hidrólisis del DNA) (Figura 8). La incubación
fue en aerobiosis 35-37ºC por 24h. Se determinó la especie de acuerdo a la Tabla 6.
60
Tabla 6. Pruebas Bioquímicas empleadas en la identificación definitiva de especies de
Aeromonas de importancia clínica
Prueba A. hydrophila
A. caviae
A.veronii bv sobria
A. jandaei
A. schubertii
A. veronii
bv veronii
AN tubo (preservar cepa).
AN placa
D- manitol +95 +100 +100 +100 -0 +100 Inositol -0 -0 -0 -0 -0 -0 Salicin +95 +91 -4 -0 -0 +100
Arabinosa +86 +100 -17 -0 -0 -0 Gas D-glucosa +91 -0 +89 +100 -100 +100
Sucrosa +100 +100 +100 -0 -0 +100 Decarboxilación
lisina +100 -0 +100 +100 +100 +100 Decarboxilación
arginina +100 +100 +100 +100 +86 -0 Decarboxilación
ornitina -0 -0 -0 -0 -0 +100 Bilis esculina +95 +93 -0 -0 -0 +100 Caldo salado
6.5% - - - - - - Vogues
Proskauer +91 -0 +94 +78 -0 +89 Nota: bv: biotipo o biovariedad; + = > 85% positivo; - = <15% positivo. Fuente: (Janda y Abbott, 1998; Murray y col., 2007; Metodología empleada en el Centro de Referencia Bacteriológica del Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo-Estado Zulia).
Figura 8. Pruebas Bioquímicas para identificación definitiva de especies de Aeromonas
61
Determinación de la Susceptibilidad.
A todas las cepas de Aeromonas aisladas se les realizó pruebas de susceptibilidad
a antibióticos por el Método de difusión propuesto por Kirby y Bauer (Bauer y col.,
1966) con sensidiscos de: Cefazolina (30 ug); Ampicilina/Sulbactam (10/10 ug);
Piperacilina/Tazobactam (100/10 ug/ml); Cefoxitin (30 ug); Cefuroxima sódica
parenteral (30 ug); Cefepime (30 ug); Amoxicilina/ Acido Clavulánico (20/10 ug);
Aztreonam (30 ug); Cefotaxima (30 ug); Ceftazidima (30 ug); Ceftriaxona (30 ug);
Gentamicina (10 ug); Amikacina (30 ug); Cloranfenicol (30 ug); Tetraciclina (30 ug);
Trimetoprim/Sulfametoxazol (1.25/23.75 ug); Ciprofloxacina (5 ug); Levofloxacina (5
ug); Imipenem (10 ug); Meropenem (10 ug); Ertapenem (10 ug); siguiendo las
recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards Institute para Aeromonas
(CLSI, 2006).
Procedimiento:
1.- Inoculo: con un hisopo estéril se hizo una suspensión directa de colonias aisladas
del agar Nutritivo (oxidasa +) de 18 a 24h (cultivo joven). Se tomaron entre 3 y 5
colonias del mismo morfotipo y se transfirieron a un tubo que contenía 3 ml de
solución salina fisiológica estéril (0,85%).
2.- Se realizó la suspensión con el hisopo hasta alcanzar una turbidez similar al
estándar 0.5 (108 ufc/ml) de Mac Farland.
3.- Antes de 15 minutos de haber ajustado la turbidez de la suspensión, empleando
un nuevo hisopo estéril se sumergió en el tubo, se roto varias veces y se presionó
contra la paredes internas del mismo sobre el nivel de líquido para eliminar el exceso
de inóculo. Se inoculó por rayado la superficie de la placa de agar Mueller- Hinton
catión ajustado de 4mm de profundidad. Este procedimiento se repitió rayando dos o
mas veces y rotando la placa de agar aproximadamente 60º entre cada inoculación
para garantizar la uniforme distribución del inóculo y el rayado de toda la superficie.
62
4.- Se colocaron los discos a una distancia aproximada de 24 mm de distancia
centro-centro; cada disco fue presionado levemente para asegurar el contacto pleno
con la superficie del agar. En este paso se evito relocalizar los discos una vez que
hubieran tenido contacto con la superficie del agar, así mismo que no pasaran más
de 15 minutos entre la colocación de los discos y la incubación de las placas.
5.- Los discos fueron colocados en orden de 4 grupos, es decir, el grupo 1, 2, 3 y 4
respectivamente en cada placa (Tabla 7).
6.- Las placas fueron invertidas y puestas en un incubador a 35-36ºC en atmósfera
de aerobiosis por 16-20h. En la Tabla 7 se muestran los antibióticos por grupos que
fueron probados.
Tabla 7. Antimicrobianos probados para Aeromonas de interés clínico.
GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4
CZ Cefazolina (centro)
Usar plantilla de enterobacterias
para la detección de BLEE
GM Gentamicina (Centro) LVX Levofloxacina
SAM Ampicilina/Sulbactam
AmC Amoxicilina/
Ácido clavulánico (centro)
AN o Ak Amikacina CIP Ciprofloxacina
TZP Piperacilina/Tazobactam ATM Aztreonam C Cloranfenicol IPM Imipenem
FOX Cefoxitina CTX Cefotaxima Te Tetraciclina MEM Meropenem
CXM Cefuroxima sódica (parenteral) CAZ Ceftazidima SXT
Trimetoprim/Sulfametoxazol ETP Ertapenem
FEP Cefepime CRO Ceftriaxona Fuente: Clinical and Laboratory Standards Institute. (CLSI 2006).
Control del calidad: Escherichia coli ATCC 25922 y E. coli ATCC 35218.
7.- Luego de la incubación, los diámetros de la zona de inhibición fueron medidos en
milímetros, pasando por el centro de los discos.
8.- Los tamaños de las zonas de inhibición fueron interpretados según la tabla Zone
Diameter Interpretative Standards for Aeromonas (incluidas A. caviae, A. hydrophila,
A. jandaei, A. schubertii, A. veronii bv veronii y A. veronii bv sobria) and Plesiomonas
63
shiguelloides Tabla 2 del documento Methods for Antimicrobial Dilution and Disk
Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria; Approved
Guideline; documento M45-A. Vol.26. No.19. (CLSI, 2006). Los halos fueron
informados como susceptible, intermedios o resistentes a los antimicrobianos
probados, según los siguientes patrones: (Tabla 8).
Tabla 8. Halos de Interpretación para los sensidiscos empleados
Antimicrobiano Concentración Sensible Intermedio Resistente
Aztreonam 30 ug ≥ 22 mm 16-21 mm ≤ 15mm
Amikacina 30 ug ≥ 17 mm 15-16 mm ≤ 14 mm
Gentamicina 10 ug ≥ 15 mm 13-14 mm ≤ 12 mm
Tetraciclina 30 ug ≥ 19 mm 15-18 mm ≤ 14 mm
Ciprofloxacina 5 ug ≥ 21 mm 16-20 mm ≤ 15 mm
Levofloxacina 5 ug ≥ 17 mm 14-16 mm ≤ 13 mm
Trimetoprim/Sulfametoxazol 1.25/23.75 ug ≥ 16mm 11-15 mm ≤ 10 mm
Cloranfenicol 30 ug ≥ 18 mm 13-17 mm ≤ 12 mm Amoxicilina/Acido
Clavulánico 20/10 ug ≥ 18 mm 14-17 mm ≤ 13 mm
Ampicilina/Sulbactam 10/10 ug ≥ 15 mm 12-14 mm ≤ 11 mm
Piperacilina/Tazobactam 100/10 ug ≥ 21 mm 18-20 mm ≤ 17 mm
Cefazolina 30 ug ≥ 18 mm 15-17 mm ≤ 14 mm
Cefepime 30 ug ≥ 18 mm 15-17 mm ≤ 14 mm
Cefotaxima 30 ug ≥ 23 mm 15-22 mm ≤ 14 mm
Cefoxitin 30 ug ≥ 18 mm 15-17 mm ≤ 14 mm
Ceftazidima 30 ug ≥ 18 mm 15-17 mm ≤ 14 mm
Ceftriaxona 30 ug ≥ 21 mm 14-20 mm ≤ 13 mm Cefuroxima sódica
(parenteral) 30 ug ≥ 18 mm 15-17 mm ≤ 14 mm
Ertapenem 10 ug ≥ 19 mm 16-18 mm ≤ 15 mm
Imipenem 10 ug ≥ 16 mm 14-15 mm ≤ 13 mm
Meropenem 10 ug ≥ 16 mm 14-15 mm ≤ 13 mm Fuente: Clinical and Laboratory Standards Institute. (CLSI, 2006).
64
Detección fenotípica de Betalactamasas de Espectro Extendido (BLEE).
Las 52 cepas de las diversas especies aisladas de Aeromonas fueron
sometidas dentro del análisis cualitativo de la susceptibilidad a un Screening inicial
de Betalactamasas de espectro extendido para enterobacterias, con la finalidad de
observar una posible resistencia adquirida a antibióticos betalactámicos (Murray y
col., 2007).
Se empleó el método de sinergia del doble disco; el cual se realizó
siguiendo la metodología descrita por Jarlier y cols., (1988) y Peixoto y col., (2003),
aunado a las recomendaciones del CLSI 2011, para detección de BLEE en
enterobacterias. En esta prueba se colocó un disco de Amoxicilina/Acido Clavulánico
(AMC) en el centro de una placa de Mueller-Hinton (MH), y alrededor de este se
colocaron discos de Ceftazidima (CAZ), Ceftriaxona (CRO), Cefotaxima (CTX), y
Aztreonam (ATM) a 20 mm de distancia del disco central. La presencia de BLEE
típicas se manifiesta por el efecto sinérgico del inhibidor (efecto tapón de corcho)
producido por el ácido clavulánico, bajo la forma de ampliación del halo en uno o
varios de los ß-lactámicos probados. En la Figura 9 se muestra la plantilla para la
detección fenotípica de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) y en la Figura
10 se muestra una BLEE típica.
Figura 9. Plantilla para detección de BLEE.
Fuente: CLSI (2011); Jarlier y cols., 1988; Peixoto y col., 2003.
CCTTXX
AAMMCC AATTMM
CCAAZZ
CCRROO
65
Figura 10. Betalactamasa de espectro Extendido (BLEE).
Fuente: Perozo y Castellano, 2009.
Interpretación: Se considero positiva la presencia de Betalactamasas de espectro
extendido al observar el efecto sinérgico (tapón de corcho, distorsión o ampliación
de los halos de inhibición) que se produce entre los discos de ceftriaxona (CRO),
cefotaxima (CTX), ceftazidima (CAZ) y aztreonam (ATM) con el disco central de
amoxicilina/ácido clavulánico (AMC). Si no existía esta ampliación la prueba fue
considerada como negativa.
Control de Calidad: agar Mueller- Hinton, se le aplico al 5% del lote total preparado
la prueba de esterilidad. Incubando las placas a 42ºC por 48 horas en atmosfera de
aerobiosis. Esperando como resultado la ausencia de crecimiento.
Para el control de calidad de los sensidiscos se utilizaron las cepas
Escherichia coli ATCC 25922 y Escherichia coli ATCC 35218 (para combinaciones
de Betalactámicos con inhibidores de Betalactamasas), para un antibiograma por el
método de difusión e interpretando su funcionamiento según la tabla “Aceptable
Limits for Quality Control Strains Use to Monitor Accuracy of Disk Diffusion Testing of
Nonfastidious Organisms (Using Mueller-Hinton Medium Without Blood or Other
Supplements) Tabla 17. CLSI, 2006 (Tabla 9).
66
Tabla 9. Halos de Inhibición esperados con las cepas control ATCC
Antimicrobiano Concentración
Halo esperado con la cepa E.
coli ATCC 25922
Halo esperado con la cepa E.
coli ATCC 35218
Aztreonam 30 ug 28-36 -
Amikacina 30 ug 19-26 -
Gentamicina 10 ug 19-26 -
Tetraciclina 30 ug 18-25 -
Ciprofloxacina 5 ug 30-40 -
Levofloxacina 5 ug 29-37 -
Trimetoprim/Sulfametoxazol 1.25/23.75 ug 23-29 -
Cloranfenicol 30 ug 21-27 -
Amoxicilina/Acido
Clavulánico 20/10 ug 18-24 17-22
Ampicilina/Sulbactam 10/10 ug 19-24 13-19
Piperacilina/Tazobactam 100/10 ug 24-30 24-30
Cefazolina 30 ug 21-27 -
Cefepime 30 ug 31-37 -
Cefotaxima 30 ug 29-35 -
Cefoxitin 30 ug 23-29 -
Ceftazidima 30 ug 25-32 -
Ceftriaxona 30 ug 29-35 -
Cefuroxima sódica 30 ug 20-26 -
Ertapenem 10 ug 29-36 -
Imipenem 10 ug 26-32 -
Meropenem 10 ug 28-34 -
Fuente: CLSI, 2006.
67
Determinación de la Concentración Inhibitoria Minima para Ácido Nalidíxico y Ciprofloxacina por el Método de Dilución en Agar.
Se llevo a cabo según la metodología de Dilución en agar descrita en Pruebas
de Susceptibilidad a los Agentes Antimicrobianos por Perozo y Castellano (2005) y
siguiendo las recomendaciones e interpretación en cuanto a los puntos de corte de
los antibióticos empleados del National Committee for Clinical Laboratory Standards
(NCCLS, 2001); Documento M45-A (CLSI, 2006) y Documento M100-S21 (CLSI,
2011).
Preparación de las diluciones para cada Antibiótico
Diluciones para el Ácido Nalidíxico: se utilizó el antibiótico comercial puro en
polvo de la marca Sigma. Como diluentes y solventes, los recomendados según la
Tabla “Solvents and Diluents for Preparation of Stock Solutions of Antimicrobial
Agents” Tabla 5A del documento Performance Standards for Antimicrobial
Susceptibility Testing; M100-S21, (CLSI, 2011). Medio volumen de agua estéril,
luego Hidróxido de Sodio (NAOH) 1 mol/Lt hasta disolver y completar el volumen de
la Solución A (primera dilución) con agua estéril. Se prepararon las 9 diluciones
seriadas al doble en orden decreciente (256 ug/ml, 128 ug/ml, 64 ug/ml, 32 ug/ml, 16
ug/ml, 8 ug/ml, 4 ug/ml, 2 ug/ml y 1 ug/ml) de la siguiente manera:
1.- Para preparar la solución A (dilución inicial) con un volumen de 3ml; se pesaron
0.768 gr. del antibiótico y se le adicionaron 3ml del diluente, en un tubo de vidrio
estéril de 16 x 150mm. Los 0.768 grs. provienen de la siguiente formula:
256.000 ug x 3ml de diluente= 768.000 ug= 768 mg= 0.768 gr.
0.768 gr + 3 ml del diluente= Sol. A= 256.000ug (primera dilución)
2.- A partir de la primera dilución (Solución A) de 256.000ug, se prepararon
empleando agua destilada estéril las siguientes diluciones seriadas: 128.000 ug,
68
64.000 ug, 32.000 ug, 16.000 ug, 8.000 ug, 4.000 ug, 2.000 ug y 1.000 ug. En tubos
estériles de 16 x 150mm con un volumen final de 2 ml.
Los cálculos de las concentraciones del antibiótico están en base a 1Lt o 1000ml de
medio MH (256.000 ug/ 1Lt de medio Mueller-Hinton); por tanto las diluciones
quedaron finalmente ajustadas a ug/ml al adicionar 100 ul de cada dilución por cada
100ml de medio (256 ug/ml, 128 ug/ml, 64 ug/ml, 32 ug/ml, 16 ug/ml, 8 ug/ml, 4
ug/ml, 2 ug/ml y 1 ug/ml).
Diluciones para la Ciprofloxacina: se utilizó el antibiótico comercial puro en
polvo de la marca Sigma. Como diluentes y solventes los recomendados según la
Tabla “Solvents and Diluents for Preparation of Stock Solutions of Antimicrobial
Agents” Tabla 5A del documento Performance Standards for Antimicrobial
Susceptibility Testing; M100-S21, (CLSI, 2011), en este caso agua destilada estéril.
Se prepararon 10 diluciones seriadas al doble en orden decreciente (64 ug/ml, 32
ug/ml, 16 ug/ml, 8 ug/ml, 4 ug/ml, 2 ug/ml, 1 ug/ml, 0.5 ug/ml, 0.25 ug/ml y 0.125
ug/ml) de la siguiente manera:
1.- Para preparar la solución A (dilución inicial) con un volumen de 3ml; se pesaron
0.192 grs del antibiótico y se le adicionaron 3ml del diluente, en un tubo de vidrio
estéril de 16 x 150mm. Los 0.192 grs. provienen de la siguiente formula:
64.000 ug x 3ml de diluente= 192.000 ug= 192 mg= 0.192 gr.
0.192 gr. + 3 ml del diluente= Sol. A= 64.000ug (primera dilución)
2.- A partir de la primera dilución (Solución A) de 64.000ug, se prepararon
empleando agua destilada estéril las siguientes diluciones seriadas: 32.000 ug,
16.000 ug, 8.000 ug, 4.000 ug, 2.000 ug, 1.000 ug, 500 ug, 250 ug y 125 ug. En
tubos estériles de 16 x 150mm con un volumen final de 2 ml.
69
Los cálculos de las concentraciones del antibiótico están en base a 1Lt o 1000ml de
medio MH (64.000 ug/ Lt de medio Mueller-Hinton); por tanto las diluciones
quedaron finalmente ajustadas a ug/ml al adicionar 100 ul de cada dilución por cada
100ml de medio (64 ug/ml, 32 ug/ml, 16 ug/ml, 8 ug/ml, 4 ug/ml, 2 ug/ml, 1 ug/ml, 0.5
ug/ml, 0.25 ug/ml y 0.125 ug/ml).
Preparación del medio de agar Mueller Hinton: se realizó siguiendo las instrucciones
contenidas en el envase de medio comercial. Se prepararon 2 Litros de medio MH
(1Lt para las diluciones del Acido Nalidíxico y 1 Lt para las diluciones de la
Ciprofloxacina).
Control de calidad de la CIM: se emplearon placas con medio Mueller-Hinton sin
antibiótico como control de crecimiento (0ug/ml). Todas las placas rotuladas se
conservaron en bolsas plásticas en refrigeración 4-8ºC hasta el momento de su uso.
Técnica de la Concentración Inhibitoria Minima (CIM) por el Método de Dilución en Agar
Para comenzar con la ejecución de la CIM, se siguieron los siguientes pasos:
1.- El procedimiento se realizó en dos grupos de 26 cepas cada uno para un total de
52 cepas de estudio (para la CIM por este método de dilución en agar pueden
visualizarse de 20 a 30 cepas por placa). Se repicaron las cepas conservadas en
agar Nutritivo en tubo a Agar Sangre Humana (ASH) para la determinación de la
Concentración Inhibitoria Minima.
2.- El ASH se incubó en la estufa en atmosfera de aerobiosis a 37 ºC por 24horas.
3.- A las 24 horas de incubación, se observó el crecimiento puro de las cepas en
ASH, a partir de los cuales se realizaron las suspensiones para el inoculo de cada
cepa.
70
4.- Antes de la inoculación se sacaron de refrigeración las placas de Mueller-Hinton
a utilizar con las diversas diluciones de los dos antibióticos y las de control de
crecimiento sin antibiótico adicionado; se dejaron por 20 minutos en una estufa vacía
a 37 ºC con la tapa superior un poco levantada para eliminar el agua de
condensación en la superficie de las mismas.
5.- Para el primer grupo de cepas, así como para el segundo, se emplearon dos
placas por cada concentración de antibiótico, con la finalidad de colocar 13 cepas en
cada placa y tener una mejor visualización en la lectura de la CIM.
6.- Las placas se organizaron según las concentraciones de cada antibiótico de
mayor a menor, incluyendo las marcadas como 0 ug/ml (libre de antibiótico, como
control de crecimiento bacteriano y para controlar la posibilidad de contaminación
durante el proceso de inoculación) colocada al inicio y al final de cada serie de
concentraciones para ambos antibióticos. Se procedió a rotular las mismas.
7.- Para rotular cada placa se elaboró una plantilla a mano en papel blanco tomando
como molde la parte posterior de una placa de MH para copiar su forma circular.
Con un marcador fino negro se trazó una cuadricula en centro de la plantilla y se
rellenaron los bordes para evitar errores en la lectura final. Luego se marcó en la
parte superior dentro de cada recuadro en la cuadricula el número de cepas a probar
en orden. Se hicieron fotocopias de acuerdo al número de diluciones y las placas de
control de crecimiento. Se pegó cada plantilla en la parte posterior de cada placa en
el orden que serian probadas las cepas y así mismo seria leída la CIM.
8.- Preparación del Inoculo de cada cepa a probar: el inóculo recomendado para las
pruebas de dilución en agar es de 104
UFC/gota, el cual se preparó tomando con un
hisopo estéril del crecimiento puro en ASH y se colocó dentro de un frasco que
contenía 3ml de solución salina fisiológica estéril para preparar una suspensión
bacteriana estandarizada con el tubo 0.5 de McFarland que contiene
aproximadamente 108
UFC/ml, este procedimiento se realizó en un Densitómetro
(DIRAMIC Mycrob - 1000) comprobando la densidad del estándar 0.5 para así
ajustar la suspensión de cada cepa (Figura 11).
71
Figura 11. Preparación del Inoculo para cada cepa de Aeromonas
9.- Para el ajuste final de cada suspensión se diluyó 1:10 para ajustar la
concentración a 107
UFC/ml; esto se realizó tomando 100 ul de la suspensión
estandarizada preparada para cada cepa y colocándolo en tubos estériles que
contenían 1ml (1000ul) de solución salina fisiológica estéril (Figura 12).
Figura 12. Diluciones 107 UFC/ml de las cepas de Aeromonas
10.- Una vez que las suspensiones bacterianas quedaron ajustadas a una
concentración de 107 UFC/ml, se procedió a la inoculación de las placas.
72
11.- La inoculación se realizó utilizando un asa calibrada estéril, la cual dispensaría
0.001ml ó 1 ul de la suspensión bacteriana 107
UFC/ml (una gota) en la superficie de
las placas de agar. De esta forma, se depositó la milésima parte de esta suspensión
quedando cerca de 1 x 104
UFC por gota aislada sobre la superficie del agar que
contiene las diferentes concentraciones de los agentes antimicrobianos probados.
12.- Se comenzó el proceso de inoculación partiendo de un control sin antibiótico,
utilizando un asa calibrada estéril desechable por cada suspensión ajustada de cada
cepa a probar en orden. Se continuó inoculando a partir de la placa con mayor
concentración de antibiótico de modo decreciente y se finalizó sembrando una nueva
placa de control sin antibiótico. Este paso se realizó de la misma manera para el
Acido Nalidíxico y para la Ciprofloxacina.
13.- Las placas inoculadas se dejaron a temperatura ambiente hasta que las gotas
de inóculo quedaron secas (Figura 13).
Figura 13. Placas inoculadas para las diversas concentraciones de los antibióticos y sin
antibiótico (control de crecimiento).
14. Se incubaron las placas en aerobiosis a 35ºC durante 16-20 horas.
15. Luego de la incubación en condiciones apropiadas, se procedió a la lectura para
cada cepa probada en las placas comenzando nuevamente con la placa de control
de crecimiento, las concentraciones de mayor a menor para cada antibiótico y
finalmente con la placa de control de crecimiento. Los microorganismos se
73
desarrollarían en aquellas placas que no tuviesen suficiente concentración de
antibiótico para inhibir su crecimiento. La CIM es la mínima concentración del
antibiótico que inhibió el crecimiento bacteriano (Figura 14).
Figura 14. Lectura de la CIM de las cepas de Aeromonas para Ácido Nalidíxico y
Ciprofloxacina.
Ácido Nalidíxico
Control NA 256ug/ml NA 128ug/ml NA 64ug/ml
NA 32ug/ml NA 16ug/ml NA 8ug/ml NA 4ug/ml
NA 2ug/ml NA 1ug/ml Control
74
Ciprofloxacina
Control CIP 64ug/ml CIP 32ug/ml CIP 16ug/ml
CIP 8ug/ml CIP 4ug/ml CIP 2ug/ml CIP 1ug/ml
CIP 0.5ug/ml CIP 0.25ug/ml CIP 0.125ug/ml Control
16.- Para la interpretación de la CIM se siguieron las normativas del National
Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2001) para los puntos de
corte del Ácido Nalidíxico; y el documento M45-A (CLSI, 2006) para los puntos de
corte de la Ciprofloxacina.
17. Criterios de Interpretación: para el Acido Nalidíxico una CIM igual o inferior a 16
ug/ml representó sensibilidad; a su vez una CIM igual o superior a 32 ug/ml
representó resistencia. Para la Ciprofloxacina una CIM igual o inferior a 1 ug/ml se
consideró como sensible y una CIM igual o superior a 4 ug/ml se consideró como
resistente (Tabla 10). Las cepas resistentes al Ácido Nalidíxico (Quinolona madre)
se consideraran portadoras de una mutación a nivel de la enzima DNA girasa; si las
cepas además mostraran CIM elevadas a la Ciprofloxacina, se les consideraría
portadoras de una doble mutación a nivel de la DNA girasa y en ambos casos puede
ocurrir ineficacia clínica del tratamiento con Fluoroquinolonas.
75
Tabla 10. Puntos de corte en la interpretación de la CIM para Acido Nalidíxico y Ciprofloxacina
Antimicrobiano Sensible Intermedio Resistente
Acido Nalidíxico ≤ 16 ug/ml - ≥ 32 ug/ml
Ciprofloxacina ≤ 1 ug/ml 2 ug/ml ≥ 4 ug/ml
Fuente: NCCLS, 2001; CLSI, 2006.
76
Análisis Estadístico.
Los datos fueron transcritos, codificados, seleccionados y tabulados en hojas de
Excel del sistema operativo Windows® diseñada para tal fin. Al ser un estudio de tipo
descriptivo se emplearon parámetros estadísticos para este tipo de trabajo, como
distribución de frecuencias y porcentajes en la población de estudio. Con el uso del
programa estadístico Statistix y SPSS versión 11 se realizó la prueba del ji cuadrado
(X2) donde se analizó la significancia estadística (p < 0,05); para evaluar si existía
diferencia entre los datos obtenidos se realizó una prueba de análisis de Varianza de
una vía (ANOVA), y si se observaba diferencia se aplicó la prueba de Tukey para
determinar de donde provenía la variación. Para determinar correlación entre
variables cualitativa y cuantitativa de Susceptibilidad se aplicó la prueba ETA2.
77
RESULTADOS Y DISCUSIÒN
1. Especies de Aeromonas aisladas en el total de la población pediátrica para el periodo de estudio.
En esta investigación se aislaron Aeromonas en 52 (7,6%) de los 687
pacientes pediátricos. La especie mas aislada resultó ser Aeromonas caviae (48,1%)
seguida de Aeromonas veronii bv sobria (30,8%), Aeromonas hydrophila (17,3%),
Aeromonas veronii bv veronii (1,9%) y Aeromonas jandaei (1,9%) (p < 0,05). (Tabla
11).
Tabla 11. Distribución de especies de Aeromonas aisladas de pacientes pediátricos con síntomas gastrointestinales únicos y/o cuadros asociados en el período global
de estudio
Género y especie Frecuencia Porcentaje
A. caviae 25 48,1 A. veronii bv sobria 16 30,8
A. hydrophila 9 17,3 A. veronii bv veronii 1 1,9
A. jandaei 1 1,9 Total 52 100
X2= 22,56; p= 0,0002; gl= 4.
A pesar de que el aislamiento de Aeromonas no es indicativo de una
patología definida se ha relacionado especialmente, en los últimos años, a casos
diarreicos en especial en edades tempranas. Kandakai y col., (2007) menciona en
sus estudios realizados en niños que Aeromonas es cada vez mas reconocido como
agente etiológico de las diarreas colocándolo como un patógeno entérico en dicha
población. Además, reporta que se ha demostrado una fuerte asociación entre las
especies del género en especial Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila y
Aeromonas veronii biotipo sobria y la patología gastrointestinal sobretodo en la
población pediátrica (menores de 5 años), tal como lo refiere Ghenghesh y col.,
(2008). Así mismo, Rabaan y col., (2001) describen que Aeromonas caviae es la
especie que ha sido mas comúnmente asociada a gastroenteritis en la edad infantil y
puede incluso llegar a imitar una enfermedad inflamatoria intestinal en los niños. Por
otra parte, Sinha y col., (2004), en su estudio, aislaron Aeromonas de pacientes
78
hospitalizados con diarrea crónica en Kolkata, India en un período de 2 años; donde
la especie más aislada fue Aeromonas caviae.
Los antecedentes reportados en la literatura científica Internacional se
correlacionan con los resultados obtenidos en esta investigación; Del mismo modo, a
nivel nacional en la región zuliana mostrándose en un estudio realizado por Rincón y
col., (2002) donde determinaron la frecuencia de bacterias enteropatógenas en 366
niños menores de 5 años con cuadros de diarreas agudas; en sus resultados
Aeromonas caviae estuvo en primer lugar. En nuestros resultados Aeromonas
caviae represento el mayor porcentaje de aislamientos (Tabla 11), lo cual coincide a
su vez con las estadísticas reportadas en coprocultivos de pediatría en cuanto a
aislamientos de Aeromonas por la división de apoyo diagnóstico del Centro de
Referencia Bacteriológico del Hospital Universitario de Maracaibo- Venezuela
(H.U.M) de los últimos años. En las mismas se evidencian que para el año 2004, se
describieron 90 aislamientos de A. caviae; en el 2006 dos aislamientos; en el 2007
39 cepas aisladas con predominio de la misma especie A. caviae (Pineda y col.,
2005; Pineda y col., 2007; Pineda y col., 2009); para el primer trimestre del 2008 se
reportaron 20 cepas donde en su mayor número se correspondían con A. caviae
(Datos no publicados).
2. Especies aisladas de Aeromonas por edades, sintomatología y según el período de estudio.
2.1 Total de cepas de Aeromonas por edades:
La mayor recuperación de Aeromonas se correspondió a la población de
menores de 1 año, con un 61,5% (32 cepas) de los aislamientos, distribuidos de la
siguiente manera: (Tabla 12).
79
Tabla 12. Distribución de cepas de Aeromonas por edades en el período global de estudio
Género especie
< de 1 año 1 año 2 años 3 años 4 años 5 años Frecuencia
total A. caviae 16 6 1 0 1 1 25 A. veronii bv sobria 8 2 3 1 0 2 16
A. hydrophila 6 3 0 0 0 0 9 A. veronii bv veronii 1 0 0 0 0 0 1 A. jandaei 1 0 0 0 0 0 1 Frecuencia por edad
(n) 32 11 4 1 1 3 52
Frecuencia por edad
% 61,5 21,2 7,7 1,9 1,9 5,8 100%
Son numerosos son los reportes encontrados en la literatura científica que
coinciden con nuestros resultados, así encontramos que Kandakai y col., (2007),
aislaron Aeromonas en niños con diarrea y niños sin diarrea en un Hospital en Jos,
Nigeria; en sus resultados el mayor número de aislados fue en menores de 1 año.
De igual modo Guerra y col., (2007), aislaron 27 (6,6%) Aeromonas de 408
pacientes pediátricos con gastroenteritis aguda de dos hospitales al sur de Brasil por
un período de 2 años; el mayor número de aislados ocurrió en lactantes menores de
1 año. Krejci y col., (2006), en la República Checa aislaron repetidamente
Aeromonas de la especie caviae en niños menores de 1 año con diarreas. Guevara
y col., (2002), en Lima, Perú; determinaron Aeromonas como agente causal de
diarreas en niños menores de 5 años. Analizaron 258 muestras de heces de niños
con diarrea aguda de 5 centros hospitalarios en un período de 2 años; en sus
resultados Aeromonas fue aislada sobretodo en niños menores de 2 años y en
verano; a su vez A. caviae fue la especie mas frecuente.
2.2 Total de cepas de Aeromonas vs. Síntomas:
Cada uno de los aislamientos positivos (52 cepas) dentro de esta
investigación provenía de pacientes con síntomas gastrointestinales únicos (dentro
de ellos: diarrea aguda, diarrea persistente o crónica con sus grados de
deshidratación, disentería, enteritis, enterocolitis, enterocolitis necrotizante, entre
80
otros) y/o asociados a otros cuadros o enfermedad (sepsis, neumonía, otitis,
conjuntivitis, anemia, HIV, entre otros).
El 63,5% de las Aeromonas (33 cepas) se aislaron de pacientes pediátricos
que cursaban con sintomatología netamente gastrointestinal y el 36,5% (19 cepas)
restante, además, de la sintomatología intestinal presentaba otra condición como se
describe a continuación: (Tabla 13).
Tabla 13. Total cepas de Aeromonas aisladas versus síntomas Diciembre 2008-
Agosto 2009.
Género especie Síntomas gastrointestinales(* )
Síntomas gastrointestinales
con cuadros asociados (**)
Frecuencia
A. caviae 18 7 25 A. veronii bv
sobria 11 5 16
A. hydrophila 3 6 9 A. veronii bv
veronii 0 1 1
A. jandaei 1 0 1 Total 33 19 52
Porcentaje 63,5% 36,5% 100% (*)Síntomas gastrointestinales (diarrea aguda, diarrea persistente o crónica con sus grados de deshidratación, disentería, enteritis, enterocolitis, enterocolitis necrotizante, otros.) (**)Síntomas intestinales con cuadros asociados (sepsis, neumonía, otitis, conjuntivitis, anemia, HIV, entre otros)
En cuanto a la asociación de Aeromonas a síntomas gastrointestinales o
diarreas, se ha visto como se ha presentado una elevada variabilidad o
heterogeneidad; puesto que en muchas investigaciones se describen el mayor
número de aislamientos en pacientes sintomáticos diarreicos; mientras que otros
trabajos han encontrado mayor recuperación de Aeromonas en los grupos control
(pacientes aparentes sanos) (Ghenghesh y col., 1999; Ghenghesh y col., 2008;
Longa y col., 2005).
Hasta la fecha no se ha descrito el rol protagónico total de Aeromonas como
patógeno bien establecido en cuadros intestinales, lo que si es un hecho, es que son
conocidos su factores de virulencia, se han establecido sus mecanismos de
resistencia antimicrobiana, además, se conoce las propiedades de invasividad de las
81
especies mesófilas y las complicaciones en el tratamiento cuando hay condiciones
subyacentes o inmunosupresión.
2.3 Total cepas de Aeromonas aisladas vs. Período de estudio (diciembre
2008 – agosto 2009).
El mayor número de aislamiento de Aeromonas se obtuvo en el mes de marzo
(16 cepas). Resultados reportados en la Tabla 14.
Tabla 14. Total cepas de Aeromonas aisladas de pacientes pediátricos por mes en el período de estudio
Mes A. caviae
A. veronii
bv sobria
A. hydrophila
A. veronii
bv veronii
A. jandaei Frecuencia Porcentaje
Diciembre 3 5 2 0 1 11 21,1 Enero 1 2 0 0 0 3 5,8
Febrero 2 0 1 0 0 3 5,8 Marzo 9 4 2 1 0 16 30,8 Abril 1 2 0 0 0 3 5,8 Mayo 3 1 0 0 0 4 7,7 Junio 0 1 1 0 0 2 3,8 Julio 4 1 2 0 0 7 13,4
Agosto 2 0 1 0 0 3 5,8 Total 25 16 9 1 1 52 100
Este hallazgo, a pesar de que en nuestro país no ocurre el fenómeno de las 4
estaciones, coincide con los resultados de otros autores, como es el caso de
Pazzaglia y col., (1991), quienes en Perú, realizaron una investigación en 391
hisopados de niños menores de 1 año½, hospitalizados por diarrea aguda, además
estudiaron un grupo control de 138 niños aparentemente sanos. Aeromonas se aisló
en 52,4% de los pacientes con diarrea y en 8,7% del grupo control. Su período de
estudio fue de un año con un máximo aislamiento en el mes de marzo, con lo cual
concluyeron que las Aeromonas parecen colonizar tanto a niños aparentes sanos
como a niños con estados diarreicos de manera más frecuente, durante los meses
mas calurosos del año.
82
3. Patrones de Susceptibilidad por especies de Aeromonas aisladas en el período de
estudio (Tabla 15).
A continuación se detallan los porcentajes obtenidos para la sensibilidad y
resistencia por especies de Aeromonas:
Tabla 15. Susceptibilidad y Resistencia in vitro por especies de Aeromonas aisladas en el período de estudio
A. caviae
(n:25) A. veronii bv sobria
(n: 16) A. hydrophila
(n:9) Sensibilidad Resistencia Sensibilidad Resistencia Sensibilidad Resistencia
Atb n % n % n % n % n % n % 1-SAM 0 0 25 100 0 0 16 100 0 0 9 100 2-AMC 5 20 20 80 4 25 12 75 0 0 9 100 3-ATM 24 96 1 4 16 100 0 0 9 100 0 0 4-CZ 0 0 25 100 5 31,2 11 68,8 1 11,2 8 88,8
5-FOX 6 24 19 76 8 50 8 50 3 33,3 6 66,7 6-CXM 21 84 4 16 15 93,8 1 6,2 8 88,8 1 11,2 7-CTX 21 84 4 16 15 93,8 1 6,2 8 88,8 1 11,2 8-CRO 21 84 4 16 15 93,8 1 6,2 8 88,8 1 11,2 9-CAZ 21 84 4 16 15 93,8 1 6,2 8 88,8 1 11,2 10-FEP 24 96 1 4 15 93,8 1 6,2 8 88,8 1 11,2
11-C 24 96 1 4 16 100 0 0 9 100 0 0 12-AK 23 92 2 8 16 100 0 0 9 100 0 0 13-GM 25 100 0 0 16 100 0 0 9 100 0 0 14-TE 19 76 6 24 13 81,3 3 18,7 9 100 0 0
15-SXT 21 84 4 16 15 93,8 1 6,2 8 88,8 1 11,2 16-CIP 21 84 4 16 15 93,8 1 6,2 8 88,8 1 11,2 17-LVX 21 84 4 16 15 93,8 1 6,2 8 88,8 1 11,2 18-IMP 23 92 2 8 9 56,3 7 43,7 5 55,6 4 44,4
19-MEM 25 100 0 0 12 75 4 25 9 100 0 0
20-ETP 13 52 12 48 2 12,5 14 87,5 0 0 9 100 21-TZP 22 88 3 12 13 81,3 3 18,7 9 100 0 0
Fuente: datos obtenidos P > 0.05
Los resultados obtenidos en este estudio sobre la susceptibilidad cualitativa a
los antimicrobianos por especies de Aeromonas aisladas, no presentaron diferencias
estadísticamente significativas (p>0.05). Es decir, no hubo efecto de los antibióticos
por especie, los mismos presentaron un comportamiento similar para todas las
cepas. Por otra parte, las especies: Aeromonas veronii biovar veronii y Aeromonas
jandaei a pesar de mostrar un patrón similar fueron resistentes a las
83
fluoroquinolonas probadas, esto teniendo en cuenta que fue el único aislamiento
dado para cada una de estas especies, como se muestra en el Anexo C.
4. Susceptibilidad por el total de aislados clínicos de Aeromonas en el período de estudio.
Las Aeromonas mostraron los siguientes patrones: en torno a los
betalactámicos: monobactamico: sensibles al aztreonam; cefalosporinas de primera
generación: resistentes a cefazolina; cefalosporinas de segunda generación:
resistentes a cefoxitin y sensibles a cefuroxima; cefalosporinas de tercera
generación: sensibles a cefotaxima, ceftriaxona y ceftazidima; cefalosporinas de
cuarta generación: sensibles a cefepime. En cuanto a los betalactámicos con
inhibidores de betalactamasas: la ampicilina/sulbactam fue resistente en el total de
las cepas, la amoxicilina/acido clavulánico mostró de igual modo elevada resistencia,
mientras que la piperacilina/tazobactam mostró sensibilidad. En los carbapenemes:
las cepas fueron sensibles a imipenem y meropenem y resistentes a ertapenem. En
cuanto a las fluoroquinolonas: las cepas en su mayoría fueron sensibles a
ciprofloxacina y levofloxacina. Dentro de los otros antimicrobianos; fueron sensibles
a cloranfenicol, amikacina, gentamicina, tetraciclina y trimetoprim/sulfametoxazol.
Como se detalla en la Tabla 16.
84
Tabla 16. Susceptibilidad y Resistencia in vitro de los 52 aislados clínicos de las especies de Aeromonas para el período de estudio
Sensibilidad Resistencia Atb n % n %
1-SAM 0 0 52 100 2-AMC 10 19,2 42 80,8 3-ATM 51 98,1 1 1,9 4-CZ 6 11,5 46 88,5
5-FOX 18 34,6 34 65,4 6-CXM 46 88,5 6 11,5 7-CTX 46 88,5 6 11,5 8-CRO 46 88,5 6 11,5 9-CAZ 46 88,5 6 11,5 10-FEP 49 94,2 3 5,8
11-C 50 96,2 2 3,8 12-AK 50 96,2 2 3,8 13-GM 52 100 0 0 14-TE 42 80,8 10 19,2
15-SXT 46 88,5 6 11,5 16-CIP 44 84,6 8 15,4 17-LVX 44 84,6 8 15,4 18-IMP 39 75 13 25
19-MEM 48 92,3 4 7,7 20-ETP 16 30,8 36 69,2 21-TZP 46 88,5 6 11,5
(F= 51; P= 0,0019 < 0.05).
Los estudios estadísticos realizados arrojaron diferencias significativas
(p<0.05) en el total de cepas aisladas entre los diferentes grupos antimicrobianos
probados. Seguido de ello se aplicó la prueba Tukey para observar de donde
provenía esta variación por diferencia entre las medias; su resultado mostró la
aparición de 5 grupos de antimicrobianos (A, B, C, D y E), desde el mas efectivo
(x=1=Sensible) al menos efectivo, donde la media se aleja de valor 1 tomado como
sensible, acercándose a 0 (tomado como Resistente) en la prueba estadística. En
los grupos arrojados por la prueba de Tukey se ubicaron en orden de efectividad los
antibióticos empleados en esta investigación desde el más sensible (grupo A) hasta
el menos efectivo in vitro (grupo E). Tal que en el grupo A se encontró: Gentamicina,
Aztreonam, Cloranfenicol, Amikacina, Cefepime, Meropenem, Cefuroxima,
Cefotaxima, Ceftriaxona, Ceftazidima, Trimetoprim/Sulfametoxazol,
Piperacilina/Tazobactam, Ciprofloxacina, Levofloxacina, Tetraciclina. Dentro del
grupo B: Imipenem. En el grupo C: Cefoxitin, Ertapenem, Amoxicilina/Ácido
85
Clavulánico. En el grupo D: Cefazolina y en el grupo E la Ampicilina/Sulbactam sin
sensibilidad in vitro (Tabla 16).
Los resultados obtenidos en nuestro trabajo son similares a los reportados por
Guerra y col., (2007), en su estudio en pacientes pediátricos con gastroenteritis
agudas al Sur de Brasil, donde sus 27 cepas mostraron patrones de susceptibilidad:
resistencia a: ampicilina/sulbactam, amoxicilina/acido clavulánico, cefazolina;
sensibilidad a: aztreonam, cefuroxima, cefalosporinas de tercera y cuarta
generación, amikacina, gentamicina, cloranfenicol, ciprofloxacina y levofloxacina. Sin
embargo, difieren en nuestro estudio a la resistencia mostrada para tres antibióticos:
imipenem (77,8%), tetraciclina (51,8%) y casi un 50% de resistencia a
trimetoprim/sulfametoxazol. En un estudio realizado por Turnidge y col., (2003),
evaluaron el comportamiento en cuanto a patrones de resistencia de especies
clínicas de Aeromonas en niños a nivel mundial (Asia Pacifico, Europa, Latino
América y Norte América) por un período de 5 años; en sus resultados se mostraron
del mismo modo, patrones semejantes a los encontrados en nuestra investigación:
elevadas resistencias a amoxicilina/ácido clavulánico, tendencia al aumento de
resistencia en cefoxitin, sensibilidad a: cefalosporinas de tercera generación,
cefepime, aztreonam, piperacilina/tazobactam, meropenem, gentamicina,
trimetoprim/sulfametoxazol.
5. Detección fenotípica de Betalactamasas de espectro extendido (BLEE).
No se detectaron fenotipos típicos de betalactamasas de espectro extendido
(BLEE); las cepas en su mayoría mostraron fenotipos sugestivos para (AmpC) una
betalactamasa de origen cromosómico típica de Aeromonas (Datos no publicados)
(Figura 15). El resultado de AmpC inducible se interpretó entre el disco de cefoxitin y
el disco de cefuroxima colocada a 24mm de distancia dentro del primer grupo de
antibióticos; si el halo de inhibición del cefoxitin estaba dentro del rango de
resistente, mientras que el disco de cefuroxima aparecía sensible, además de
observarse un aplanamiento en el halo de inhibición de este disco (Figura16)
(González y col., 2006).
86
Figura 15. Resultados Negativos para el método de sinergia del doble disco en la
detección de BLEE.
Figura 16. Resultado sugestivo para AmpC inducible
Se detectaron fenotipos sugestivos de betalactamasas cromosomales de tipo
AmpC típicas de Aeromonas, tal como se describe en la literatura (Bravo y col.,
2003; Murray y col., 2007; Ko y col., 1998). Por otra parte, en esta investigación, se
detectaron 6 cepas con resistencia a la mayoría de los betalactámicos; dos de estas
a su vez con resistencia a fluoroquinolonas (Tabla 17). En cuanto a la fuente de
estas cepas resistentes; en su mayoría se trataba de pacientes pediátricos
hospitalizados. Las dos cepas con resistencia a betalactámicos y fluoroquinolonas
se correspondieron de un paciente hospitalizado y uno proveniente de la UCI de
pediatría (Anexo D).
En nuestro estudio la baja resistencia encontrada a los betalactámicos (6
cepas, dos a su vez resistentes a fluoroquinolonas) es un hecho debido quizás a la
procedencia de los pacientes (en su mayoría externos provenientes del servicio de
87
emergencia de pediatría del S.A.H.U.M) (Anexo A y B), a diferencia de otro estudio
descrito por Subashkumar y col., (2007), donde determinaron los patrones de
resistencia a Aeromonas en 239 muestras provenientes de niños con diarreas
agudas de hospitales de la India en un período de 1 año; en sus resultados
encontraron elevada resistencia a todos los betalactámicos exceptuando imipenem.
Concluyeron que la elevada resistencia, conociendo sus betalactamasas
cromosomales inducibles, se debe al uso extensivo de estos y otros antimicrobianos
sobre todos a nivel hospitalario conllevando a la multirresistencia.
Es importante mencionar en nuestra investigación, que algunos de estos 6
pacientes con aislamientos resistentes, estaban recibiendo terapia con
betalactámicos como droga de elección; asimismo, uno de los dos pacientes
(hospitalizado) con resistencia a betalactámicos y fluoroquinolonas estaba
recibiendo terapia con ambos tipos de antibióticos (Anexo D). Por lo que se hace
necesario reevaluar por parte del clínico de modo continuo la terapia empírica
aplicada en las diarreas, sobretodo en estos pacientes pediátricos hospitalizados; ya
que se encuentran en continuo contacto con microorganismos hospitalarios y sus
resistencias y donde además se encuentra comprometido su estado de inmunidad.
88
TABLA 17. CEPAS CON RESISTENCIAS A BETALACTÁMICOS Y FLUOROQUINOLONAS
Cepa Nro
Género especies Edad SAM AMC ATM CZ FOX CXM CTX CRO CAZ FEP CIP LVX IMP MEM ETP TZP
3677 A. caviae RN R R S R R S S S S S R R S S S S
3678 A. veronii bv sobria 4m R R S R R S S S S S R R R R R S
3694 A. jandaei 1m R R S R S S S S S S R R S S S S
3697 A. hydrophila 1ª R R S R R R R R R R S S R S R S
160 A. caviae 3m R R S R R R R R R S S S S S S S 478 A. caviae RN R R S R R R R R R S R R R S R R 520 A. caviae 5ª R R S R R R R R R S S S S S R R
770 A. veronii bv veronii 7m R S S R R S S S S S R R S S R S
1049 A. hydrophila 1m R R S R R S S S S S R R S S R S
1300 A. caviae 2m R R R R R R R R R R R R S S S R 1914 A. caviae 1ª 6m R S S R R S S S S S R R S S S S
2019 A. veronii bv sobria 7m R R S R R R R R R R S S R R R R
89
6. Concentración Inhibitoria Minima para Ácido Nalidíxico y Ciprofloxacina
6.1 CIM para Ácido Nalidíxico:
Los resultados arrojados en el cálculo de la CIM para el Ácido Nalidíxico de
acuerdo a los criterios de interpretación fueron los siguientes (Tabla 18):
Tabla 18. Porcentaje de la Concentración Inhibitoria Minima para el Ácido Nalidíxico en las cepas de estudio.
CIM Frecuencia Porcentaje
<1 ug/ml 31 59,6 2 ug/ml 1 1,9 8 ug/ml 1 1,9 16 ug/ml 5 9,6 64 ug/ml 1 1,9
128 ug/ml 6 11,5 256 ug/ml 6 11,5
> 256 ug/ml 1 1,9 Total 52 100,0
6.2 CIM para Ciprofloxacina:
Los resultados arrojados en la CIM de acuerdo a los criterios de interpretación
para la Ciprofloxacina fueron (Tabla 19):
Tabla 19. Porcentaje de la Concentración Inhibitoria Minima para Ciprofloxacina en las cepas de estudio.
CIM Frecuencia Porcentaje
<0,125 ug/ml 34 65,4 0,25 ug/ml 2 3,8
1 ug/ml 8 15,4 4 ug/ml 4 7,7 16 ug/ml 3 5,8 32 ug/ml 1 1,9
Total 52 100,0
90
En el estudio de la CIM para el Ácido Nalidíxico (como predictor de resistencia a
fluoroquinolonas) y ciprofloxacina; en esta investigación se encontró resistencia al ácido
nalidíxico en 14/52 (26,9%) (Tabla 18). Lo cual se traduciría en la detección del principal
mecanismo de resistencia a fluoroquinolonas, que es la modificación mutacional de la
bacteria en el sitio blanco de acción de estos antibióticos. Para la ciprofloxacina se
obtuvo elevada CIM en 8/52 (15,4%) (Tabla 19), porcentaje que concuerda con el
obtenido para su susceptibilidad cualitativa.
Al comparar nuestros resultados con los reportados por otros autores; algunos de
ellos han encontrado elevadas resistencia para ácido nalidíxico, como es el caso de
Sinha y col., (2004), quienes evidenciaron resistencias del ácido nalidíxico superiores al
50% en su estudio con Aeromonas aisladas de pacientes hospitalizados por diarrea
crónica en Kolkata, India. Mientras que, Turnidge y col., (2003), en el Centro de
vigilancia global de resistencias del Hospital de madres y niños en Australia; estudiaron
el comportamiento de las especies clínicas de Aeromonas (A. hydrophila, A. caviae, A.
veronii bv sobria, A. veronii bv veronii, Aeromonas sp) en cuanto a sus patrones de
resistencias durante un periodo de 5 años (1997-2001), en el estudio participaron 57
laboratorios de 24 países. Se aislaron 258 cepas de diversas muestras clínicas de niños
incluyendo fecales. En sus resultados mostraron el comportamiento a nivel mundial:
Asia Pacifico, Europa, Latino América y Norte América reflejando patrones similares a
los obtenidos en nuestra investigación. Las resistencias a quinolonas por CIM, en
América latina, para el ácido nalidíxico fueron de 27,8% y 10,3% para ciprofloxacina, y
este trabajo fueron de 26,9% y 15,4%, respectivamente, cifras similares para un número
menor de cepas. El comportamiento en el resto de los países fue semejante aunque
con cifras menores de resistencia a ciprofloxacina.
Los resultados obtenidos para las CIM de ambos antibióticos (Anexo E) en este
estudio, apoyan la teoría de que CIM elevadas para el ácido nalidíxico, indican que ha
ocurrido un cambio o mutación en el sitio blanco de acción del fármaco (DNA girasa);
mientras que CIM elevadas para ambos antibióticos indicarían doble mutación y falla
terapéutica en ambas situaciones (Arias y col., 2010; Goñi-Urriza y col., 2002; Murray y
col., 2007)
91
7. Correlación entre la susceptibilidad cualitativa y cuantitativa (CIM) para la Ciprofloxacina (Fluoroquinolona).
En la siguiente tabla se muestran las cepas en orden de los aislamientos con su
sensibilidad (Kirby y Bauer) y su respectiva CIM para Ciprofloxacina (Tabla 20).
92
Tabla 20. Correlación entre la susceptibilidad cualitativa y CIM para la Ciprofloxacina.
ESPECIE Susceptibilidad a CIP CIM-CIP A. veronii bv sobria S <0,125 ug/ml A. veronii bv sobria S <0,125 ug/ml A. veronii bv sobria S 1 ug/ml
A. caviae S <0,125 ug/ml A. caviae S <0,125 ug/ml A. caviae R 16 ug/ml
A. veronii bv sobria R 16 ug/ml A. jandaei R 16 ug/ml
A. hydrophila S <0,125 ug/ml A. veronii bv sobria S <0,125 ug/ml
A. hydrophila S <0,125 ug/ml A. veronii bv sobria S <0,125 ug/ml
A. caviae S 1 ug/ml A. veronii bv sobria S <0,125 ug/ml
A. caviae R 32 ug/ml A. caviae S 1 ug/ml
A. hydrophila S <0,125 ug/ml A. hydrophila S <0,125 ug/ml
A. caviae S <0,125 ug/ml A. caviae S <0,125 ug/ml A. caviae S <0,125 ug/ml
A. veronii bv sobria S <0,125 ug/ml A. veronii bv sobria S <0,125 ug/ml A. veronii bv veronii R 4 ug/ml
A. caviae S <0,125 ug/ml A. caviae S <0,125 ug/ml A. caviae S <0,125 ug/ml A. caviae S 0,25 ug/ml A. caviae S 1 ug/ml
A. veronii bv sobria S <0,125 ug/ml A. caviae S <0,125 ug/ml
A. veronii bv sobria S <0,125 ug/ml A. hydrophila R 4 ug/ml
A. caviae R 4 ug/ml A. veronii bv sobria S 1 ug/ml A. veronii bv sobria S 0,25 ug/ml
A. caviae S 1 ug/ml A. caviae S <0,125 ug/ml A. caviae R 4 ug/ml
A. veronii bv sobria S <0,125 ug/ml A.hydrophila S <0,125 ug/ml
A. veronii bv sobria S <0,125 ug/ml A. caviae S 1 ug/ml A. caviae S <0,125 ug/ml A. caviae S <0,125 ug/ml
A. hydrophila S <0,125 ug/ml A. hydrophila S <0,125 ug/ml
A. caviae S <0,125 ug/ml A. veronii bv sobria S <0,125 ug/ml
A. hydrophila S <0,125 ug/ml A. caviae S 1 ug/ml A. caviae S <0,125 ug/ml
Fuente: datos obtenidos en orden de aislamientos en el periodo de estudio. Eta2= 0.926 según el baremo de interpretación dado por Cohen indica que existe correlación alta entre las variables, dependiente (cualitativa) y la independiente (CIM del antibiótico).
93
En la correlación de la susceptibilidad cualitativa (Kirby y Bauer) y cuantitativa
(CIM) para la ciprofloxacina, se aplicó la prueba estadística de correlación ETA2 =
0,926, cuyo resultado fue interpretado por el Baremo de Cohen, citado por (Solanas,
2005), donde describe (R< 0,3 =baja correlación; R 0,30 a 0,5 correlación moderada y R
> 0,5 correlación alta) arrojando en la investigación asociación y elevada correlación
entre las variables dependiente (susceptibilidad cualitativa de ciprofloxacina) e
independiente (CIM de ciprofloxacina) tomadas así para la prueba. Por tanto, las cepas
resistentes mostraron CIM elevadas y las sensibles CIM bajas.
En el Hospital Universitario de Maracaibo, Venezuela (centro de estudio de la
investigación) la terapia empírica que se lleva a cabo en caso de diarreas en pacientes
pediátricos emplea betalactámicos como la cefotaxima (información obtenida por
clínicos pediatras y en las boletas médicas). Hecho que resulta de interés, al conocer
que Aeromonas posee mecanismos de resistencia inducidos por el uso de los mismos.
Además, Aeromonas se ha encontrado en niños asintomáticos y niños con síndrome
diarreico de modo heterogéneo, por otra parte se puede encontrar Aeromonas en
coinfección con otros enteropatógenos mas comúnmente aislados, en donde esta
terapia resultaría favorecedora en el desarrollo de los mecanismos resistencia de
Aeromonas y por ende fallas en el tratamiento clínico.
En cuanto al uso de las fluoroquinolonas, a pesar de sus restricciones en la
población pediátrica, son muchos los estudios en donde se recomienda su uso en los
casos de infecciones severas por Aeromonas a dosis-peso controlado sin mostrar
efectos adversos (Ghenghesh y col., 1999; Valery y Rosas., 2001).
Hasta el momento, a pesar de consensos de clínicos en el país y de la existencia
de guías base internacionales y nacionales para los tratamientos en pediatría, no se
han encontrado estudios que revelen la terapia antimicrobiana empírica idónea en las
diarreas bacterianas extensible en modo especial a Aeromonas como patógeno
emergente, aunado a la necesidad imperante de conocer por parte del clínico los
mecanismos de resistencia en los patógenos intestinales y controversiales como
Aeromonas.
94
CONCLUSIONES
• El porcentaje de aislamientos de Aeromonas representó un 7,6% para el
período de estudio; la especie predominante fue Aeromonas caviae, seguida
de Aeromonas veronii bv sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii
bv veronii y Aeromonas jandaei. Aeromonas caviae, siguió el patrón de
especie más aislada dentro de las Aeromonas en coprocultivos de pediatría
de los últimos años publicado en los boletines del Centro de Referencia
Bacteriológica del Hospital Universitario de Maracaibo, Venezuela.
• El mayor número de aislados de las cepas de Aeromonas se sucedió en la
población pediátrica de menores de un año; en su mayoría con síntomas
exclusivamente gastrointestinales, a su vez, se obtuvo el mayor porcentaje de
aislamientos en el mes de marzo.
• En el estudio de la susceptibilidad cualitativa con énfasis en betalactámicos y
fluoroquinolonas, las 52 cepas estudiadas mostraron patrones elevados de
sensibilidad a cefalosporinas de tercera y cuarta generación y carbapenemes
exceptuando el ertapenem, teniendo en cuenta el principal mecanismo de
resistencia a los betalactámicos en Aeromonas. De igual modo, se
comportaron con alta sensibilidad a las fluoroquinolonas probadas.
• No se detectaron dentro del estudio de la susceptibilidad (Kirby-Bauer)
fenotipos típicos de Betalactamasas de espectro extendido (BLEE). Se
observaron patrones fenotípicos sugestivos de Betalactamasas
cromosòmicas inducibles (AmpC) por betalactámicos típicas en Aeromonas.
Se encontró resistencia en 6 cepas a casi todos los betalactámicos; dos de
estas inclusive mostraron resistencia a las fluoroquinolonas, relacionadas a
su procedencia (pacientes hospitalizados).
95
• Los porcentajes encontrados por la CIM de resistencia a quinolonas fueron
bajos pero considerados de importancia, teniendo en consideración que la
investigación se limito a un solo centro hospitalario de la región y a un período
de estudio no tan extenso.
• Se evidenció elevada correlación entre los resultados obtenidos para la CIM
de la ciprofloxacina y lo reflejado en su comportamiento en la susceptibilidad
cualitativa (Kirby-Bauer).
96
RECOMENDACIONES
• Establecer programas periódicos de Investigación dentro del Hospital
Universitario de Maracaibo en el equipo de salud, para abordar patógenos
controversiales como Aeromonas, además, de hacer de conocimiento los
patrones de susceptibilidad y los mecanismos de resistencias de este género,
y así evitar la multirresistencia sobretodo a nivel hospitalario.
• Incentivar el adecuado aislamiento tanto en los laboratorios clínicos y
hospitalarios de Aeromonas, con énfasis en el estudio de la susceptibilidad,
como apoyo en la epidemiología de los casos.
• Evaluar por parte del clínico, de modo continuo el comportamiento
microbiológico y de susceptibilidad para establecer una terapia racional en los
pacientes pediátricos infectados con Aeromonas.
• Incentivar los estudios moleculares de resistencia en Aeromonas en el país a
fin de crear bases para su comportamiento epidemiológico y ecológico.
• Crear un diseño de terapia empírica racional extendida a Aeromonas para
evitar fallos terapéuticos y multirresistencia con la ayuda de la vigilancia de
los mecanismos de resistencia en los diversos centros.
• Fomentar conductas preventivas y lactancia materna para evitar diarreas y
muertes por ellas en la población infantil.
97
INDICE DE ANEXOS
Anexo A. Total población pediátrica por edad y servicio solicitante con síntomas gastrointestinales únicos y/o asociados a otras enfermedades Diciembre 2008-Agosto 2009.
Anexo B. Total cepas de Aeromonas aisladas de pacientes pediátricos por servicio solicitante para el periodo de estudio.
Anexo C. Antibiogramas de las cepas de Aeromonas aisladas en la población pediátrica para el periodo de estudio. Anexo D. Terapia antibiótica en los pacientes pediátricos con aislados de las especies de Aeromonas en el periodo de estudio.
Anexo E. Concentración Inhibitoria Mínima para Acido Nalidíxico y Ciprofloxacina de las cepas aisladas en la población pediátrica para el período de estudio.
98
Anexo A. Total población pediátrica por edad y servicio solicitante con síntomas
gastrointestinales únicos y/o asociados a otras enfermedades Diciembre 2008-Agosto
2009.
Servicio Solicitante
< de 1 año
1 año
2 años
3 años
4 años
5 años
Frecuencia total
Porcentaje (%)
Emergencia pediatría 199 90 23 18 8 6 344 50.1
Hospitalización pediatría 63 11 9 4 2 3 92 13,4
Referidos otros Hospitales (*)
52 11 7 1 2 2 75 10,9
Ucaiepi 47 14 5 5 1 1 73 10,7 Triaje pediatría 26 16 7 0 2 1 52 7,7 Observación pediatría 19 2 3 0 1 0 25 3,6
Neonatología 12 0 0 0 0 0 12 1,7 Cortesía 1 2 1 0 1 0 5 0,7 UCI pediatría 3 1 0 0 0 0 4 0,6 Oncología pediátrica 1 0 0 0 1 0 2 0,3
Reten 1 0 0 0 0 0 1 0,1 Consulta Gastro infantil 0 0 0 0 0 1 1 0,1
Fundación Innocens 0 1 0 0 0 0 1 0,1
Total 424 148 55 28 18 14 687 100% (*) Hospital de niños de Veritas, Raúl Leoni, Chiquinquirá, General del Sur, Especialidades pediátricas, Maternidad Castillo Plaza.
99
Anexo B. Total cepas de Aeromonas aisladas de pacientes pediátricos por servicio solicitante para el periodo de estudio.
Servicio solicitante
A. caviae
A. veronii
bv sobria
A. hydrophila
A. veronii
bv veronii
A. jandaei Frecuencia Porcentaje
Emergencia pediatría 17 9 4 1 0 31 59,6
Hospitalización pediatría 3 3 2 0 0 8 15,4
Triaje pediatría 2 1 0 0 1 4 7,7 Ucaiepi 1 0 2 0 0 3 5,8
Referidos otros
hospitales(*) 1 2 0 0 0 3 5,8
UCI pediatría 1 0 0 0 0 1 1,9 Observación
pediatría 0 0 1 0 0 1 1,9
Cortesía 0 1 0 0 0 1 1,9 Total 25 16 9 1 1 52 100
100
Anexo C. Antibiogramas de las cepas de Aeromonas aisladas en la población pediátrica para el periodo de estudio.
Cepa Nro
Género especies Edad
SAM
AMC
ATM
CZ
FOX
CXM
CTX
CRO
CAZ
FEP C A
K Gm
TE
SXT
CIP
LVX
IMP
MEM
ETP
TZP
3548 A. veronii bv sobria 9m R R S S S S S S S S S S S S S S S S S R S
3583 A. veronii bv sobria 2ª R R S S S S S S S S S S S R S S S S S R S
3594 A. veronii bv sobria 5ª R R S S S S S S S S S S S S S S S R S R S
3635 A. caviae 1ª R R S R R S S S S S S S S S R S S S S S S 3644 A. caviae 4m R R S R R S S S S S S S S S S S S S S S S 3677 A. caviae RN R R S R R S S S S S S S S S S R R S S S S
3678 A. veronii bv sobria 4m R R S R R S S S S S S S S S S R R R R R S
3694 A. jandaei 1m R R S R S S S S S S S S S S S R R S S S S 3697 A. hydrophila 1ª R R S R R R R R R R S S S S S S S R S R S
3707 A. veronii bv sobria 2ª R R S S S S S S S S S S S R S S S S S S S
3708 A. hydrophila 1ª R R S R R S S S S S S S S S S S S S S R S
20 A. veronii bv sobria RN R R S R S S S S S S S S S S S S S R R R R
160 A. caviae 3m R R S R R R R R R S S S S S S S S S S S S
315 A. veronii bv sobria RN R R S R R S S S S S S S S S S S S R S R S
478 A. caviae RN R R S R R R R R R S S R S S S R R R S R R 520 A. caviae 5ª R R S R R R R R R S S S S R S S S S S R R 552 A. hydrophila 6m R R S R S S S S S S S S S S S S S R S R S
679 A. hydrophila 1ª 10m R R S R S S S S S S S S S S S S S R S R S
707 A. caviae 2 m R R S R R S S S S S R S S S S S S S S R S 713 A. caviae 4ª R R S R R S S S S S S S S S S S S S S R S 721 A. caviae 1ª R S S R R S S S S S S S S R S S S S S S S
729 A. veronii bv sobria 1ª R S S S S S S S S S S S S S S S S R S R S
766 A. veronii bv sobria 2ª R S S R S S S S S S S S S S S S S S S R S
770 A. veronii bv veronii 7m R S S R R S S S S S R S S R S R R S S R S
101
788 A. caviae 2m R S S R R S S S S S S S S S S S S S S R S 858 A. caviae 1ª R S S R S S S S S S S S S S R S S S S S S 907 A. caviae 1m R R S R R S S S S S S S S S S S S S S S S 947 A. caviae 5m R R S R S S S S S S S S S R R S S S S R S 957 A. caviae 1m R R S R R S S S S S S S S R S S S S S S S
987 A. veronii bv sobria 3ª R R S R R S S S S S S S S S S S S S S R S
1022 A. caviae 1ª R R S R R S S S S S S S S S R S S S S R S
1029 A. veronii bv sobria RN R R S R R S S S S S S S S S S S S S S R S
1049 A. hydrophila 1m R R S R R S S S S S S S S S R R R S S R S
1300 A. caviae 2m R R R R R R R R R R S R S S S R R S S S R
1358 A. veronii bv sobria 6m R S S R R S S S S S S S S S S S S S S S S
1635 A. veronii bv sobria
1ª 11m R R S R R S S S S S S S S S S S S R R R R
1771 A. caviae 1ª R R S R R S S S S S S S S R S S S S S S S
1909 A. caviae RN R R S R R S S S S S S S S S S S S S S S S
1914 A. caviae 1ª 6m R S S R R S S S S S S S S R S R R S S S S
2019 A. veronii bv sobria 7m R R S R R R R R R R S S S S S S S R R R R
2337 A. hydrophila RN R R S R R S S S S S S S S S S S S R S R S
2521 A. veronii bv sobria 5ª R S S R S S S S S S S S S S S S S S S R S
2619 A. caviae 1m R R S R S S S S S S S S S S S S S S S R S
2672 A. caviae 2ª 11m R R S R R S S S S S S S S S S S S S S S S
2692 A. caviae 1m R R S R S S S S S S S S S S S S S S S R S 2747 A. hydrophila RN R R S R R S S S S S S S S S S S S S S R S 2759 A. hydrophila RN R R S R R S S S S S S S S S S S S S S R S 2925 A. caviae 6m R S S R R S S S S S S S S S S S S S S R S
2982 A. veronii bv sobria 4m R R S R R S S S S S S S S R R S S S S R S
3198 A. hydrophila RN R R S S S S S S S S S S S S S S S S S R S 3427 A. caviae 10m R R S R S S S S S S S S S S S S S S S R S 3487 A. caviae RN R R S R S S S S S S S S S S S S S R S R S
102
Anexo D. Terapia antibiótica en los pacientes pediátricos con aislados de las especies de Aeromonas en el periodo de estudio.
Cepa/Procedencia Género especies Edad Diagnostico Antibiótico(s) 3548- Triaje pediatría
A. veronii bv sobria 9m Proyecto diarrea Sin tratamiento
3583- Referido al hospital
A. veronii bv sobria 2ª Disentería mixta Metronidazol +
Amikacina 3594- Referido al hospital
A. veronii bv sobria 5ª Intoxicación alimentaria,
diarrea aguda Sin tratamiento
3635- Ucaiepi A. caviae 1ª Diarrea persistente Cefotaxima 3644- Emergencia pediatría A. caviae 4m Diarrea aguda Sin tratamiento
3677- Emergencia pediatría A. caviae RN Diarrea + celulitis Cefotaxima + Ampicilina
3678- Hospitalización
A. veronii bv sobria 4m Diarrea aguda Meropenem +
Vancomicina 3694- Triaje pediatría A. jandaei 1m Diarrea aguda febril sin
deshidratación Sin tratamiento
3697- Ucaiepi A. hydrophila 1ª Diarrea aguda Cefotaxima 3707- Emergencia pediatría
A. veronii bv sobria 2ª Diarrea aguda febril Sin tratamiento
3708- Ucaiepi A. hydrophila 1ª Diarrea persistente Cefotaxima 20- Emergencia pediatría
A. veronii bv sobria RN Sepsis + diarrea Sin información(***)
160- Emergencia pediatría A. caviae(*) 3m Diarrea Sin información(***)
315- Emergencia pediatría
A. veronii bv sobria RN Diarrea Sin información(***)
478- UCI pediatría A. caviae RN Diarrea aguda + sepsis
neonatal Meropenem,
Vancomicina, Fluconazol 520- Hospitalización A. caviae 5ª Diarrea aguda +
leishmaniasis Sulperazona
552- Emergencia pediatría A. hydrophila 6m Sepsis neonatal tardía +
diarrea Sin información(***)
679- Emergencia pediatría A. hydrophila 1ª
10m Diarrea aguda + neumonía Sin información(***)
707- Emergencia pediatría A. caviae 2 m Diarrea aguda con
deshidratación grave Cefotaxima
713- Emergencia pediatría A. caviae 4ª Diarrea aguda + neumonía Cefotaxima
721- Emergencia pediatría A. caviae 1ª Síndrome diarreico Sin tratamiento
729- Hospitalización
A. veronii bv sobria 1ª Diarrea aguda + Síndrome
nefrótico Sin tratamiento
766- Emergencia pediatría A. veronii bv
sobria 2ª
Diarrea persistente sin deshidratación,
desequilibrio hidroelectrolítico,
hipocalcemia
Sin información(***)
770- Emergencia pediatría
A. veronii bv veronii 7m Diarrea aguda + adenitis
cervical Sin información(***)
788- Emergencia pediatría A. caviae 2m Diarrea aguda febril sin
deshidratación Sin tratamiento
858- Triaje pediatría A. caviae 1ª Disentería Sin información(***)
103
907- Emergencia pediatría A. caviae 1m Disentería aguda Sin información(***)
947- Emergencia pediatría A. caviae 5m
Diarrea aguda + Infección en el Sistema Nervioso
Central en estudio Sin tratamiento
957- Emergencia pediatría A. caviae 1m Diarrea Sin tratamiento
987- Emergencia pediatría
A. veronii bv sobria 3ª Síndrome diarreico Sin información(***)
1022- Triaje pediatría A. caviae 1ª Diarrea Sin tratamiento
1029- Hospitalización
A. veronii bv sobria RN Diarrea Sin tratamiento
1049- Hospitalización A. hydrophila 1m Síndrome diarreico Sin tratamiento
1300- Hospitalización A. caviae 2m Diarrea aguda Levofloxacina +
Ceftriaxona 1358- Cortesía A. veronii bv
sobria 6m Diarrea aguda con deshidratación Sin tratamiento
1635- Emergencia pediatría A. veronii bv
sobria 1ª
11m
Diarrea aguda febril con algún grado de deshidratación
Sin tratamiento
1771- Emergencia pediatría A. caviae 1ª Diarrea aguda sin
deshidratación Sin información(***)
1909- Emergencia pediatría A. caviae RN Diarrea Sin información(***)
1914- Emergencia pediatría A. caviae 1ª 6m Disentería aguda Longacef(Cefixime)
2019- Emergencia pediatría
A. veronii bv sobria 7m Enterocolitis necrotizante +
sepsis Sin información(***)
2337- Hospitalización A. hydrophila RN Diarrea + sepsis Levofloxacina +
Targocid(Teicoplanina) 2521- Emergencia pediatría
A. veronii bv sobria 5ª Diarrea + sepsis Sin información(***)
2619- Hospitalización A. caviae 1m Diarrea + Neumonía
nosocomial + Sepsis Meropenem + Vancomicina
2672- Emergencia pediatría A. caviae 2ª
11m Diarrea febril Sin tratamiento
2692- Referido al hospital A. caviae 1m Síndrome diarreico Sin tratamiento
2747- Emergencia pediatría A. hydrophila RN Diarrea + sepsis Sin tratamiento
2759- Observación pediatría
A. hydrophila RN Diarrea + sepsis Cefotaxima + Ampicilina
2925- Emergencia pediatría A. caviae 6m Diarrea aguda Cefotaxima + Amikacina
2982- Emergencia pediatría
A. veronii bv sobria 4m Diarrea aguda sin
deshidratación Sin tratamiento
3198- Emergencia pediatría A. hydrophila RN Diarrea + sepsis Cefotaxima + Amikacina
3427- Emergencia pediatría A. caviae 10m Diarrea Sin tratamiento
3487- Emergencia pediatría A. caviae RN Diarrea + sepsis Cefotaxima + Amikacina
(***) Sin información suministrada en la boleta por el clínico.
104
Anexo E. Concentración Inhibitoria Mínima para Acido Nalidíxico y Ciprofloxacina de las cepas aisladas en la población pediátrica para el período de estudio.
ESPECIE CIM-NA CIM-CIP
A. veronii bv sobria <1 ug/ml <0,125 ug/ml A. veronii bv sobria <1 ug/ml <0,125 ug/ml
(a) A. veronii bv sobria 128 ug/ml 1 ug/ml A. caviae <1 ug/ml <0,125 ug/ml A. caviae <1 ug/ml <0,125 ug/ml
(b) A. caviae 128 ug/ml 16 ug/ml (b) A. veronii bv sobria 128 ug/ml 16 ug/ml
(b) A. jandaei 64 ug/ml 16 ug/ml A. hydrophila <1 ug/ml <0,125 ug/ml
A. veronii bv sobria <1 ug/ml <0,125 ug/ml A. hydrophila <1 ug/ml <0,125 ug/ml
A. veronii bv sobria <1 ug/ml <0,125 ug/ml (a) A. caviae 256 ug/ml 1 ug/ml
A. veronii bv sobria <1 ug/ml <0,125 ug/ml (b) A. caviae 256 ug/ml 32 ug/ml (a) A. caviae 128 ug/ml 1 ug/ml A. hydrophila <1 ug/ml <0,125 ug/ml A. hydrophila 8 ug/ml <0,125 ug/ml
A. caviae <1 ug/ml <0,125 ug/ml A. caviae <1 ug/ml <0,125 ug/ml A. caviae <1 ug/ml <0,125 ug/ml
A. veronii bv sobria <1 ug/ml <0,125 ug/ml A. veronii bv sobria <1 ug/ml <0,125 ug/ml
(b) A. veroni ibv veronii >256 ug/ml 4 ug/ml A. caviae <1 ug/ml <0,125 ug/ml A. caviae <1 ug/ml <0,125 ug/ml A. caviae <1 ug/ml <0,125 ug/ml A. caviae 16 ug/ml 0,25 ug/ml
(a) A. caviae 256 ug/ml 1 ug/ml A. veronii bv sobria <1 ug/ml <0,125 ug/ml
A. caviae <1 ug/ml <0,125 ug/ml A. veronii bv sobria <1 ug/ml <0,125 ug/ml
(b) A. hydrophila 128 ug/ml 4 ug/ml (b) A. caviae 128 ug/ml 4 ug/ml
A. veronii bv sobria 16 ug/ml 1 ug/ml A. veronii bv sobria 16 ug/ml 0,25 ug/ml
(a) A. caviae 256 ug/ml 1 ug/ml A. caviae <1 ug/ml <0,125 ug/ml
(b) A. caviae 256 ug/ml 4 ug/ml A. veronii bv sobria <1 ug/ml <0,125 ug/ml
A.hydrophila 2 ug/ml <0,125 ug/ml A. veronii bv sobria <1 ug/ml <0,125 ug/ml
(a) A. caviae 256 ug/ml 1 ug/ml A. caviae <1 ug/ml <0,125 ug/ml A. caviae 16 ug/ml <0,125 ug/ml
A. hydrophila <1 ug/ml <0,125 ug/ml A. hydrophila <1 ug/ml <0,125 ug/ml
A. caviae <1 ug/ml <0,125 ug/ml A. veronii bv sobria <1 ug/ml <0,125 ug/ml
A. hydrophila <1 ug/ml <0,125 ug/ml A. caviae 16 ug/ml 1 ug/ml A. caviae <1 ug/ml <0,125 ug/ml
Fuente: datos obtenidos en orden de aislamientos en el periodo de estudio. (a): cepas con una mutación a nivel de la diana de quinolonas (DNA girasa). (b): cepas con más de una mutación. En ambos casos posible falla terapéutica con fluoroquinolonas.
105
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